Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы молекулярно-генетического контроля секреции у бацилл - продуцентов ферментов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы молекулярно-генетического контроля секреции у бацилл - продуцентов ферментов"

на правах рукописи

Ж

ШЕВЕЛЕВ Алексей Борисович

МЕХАНИЗМЫ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ СЕКРЕЦИИ У БАЦИЛЛ - ПРОДУЦЕНТОВ ФЕРМЕНТОВ

03.00.03 - «Молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Н.К. Янковский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.И. Нетрусов доктор биологических наук, A.C. Карягина-Жулина доктор биологических наук, профессор С.П. Синеокий

Ведущая организация:

Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится "7" июня 2006 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.027.01 по адресу: Москва, Тимирязевская ул., 42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии

Автореферат разослан "20" апреля 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

С.А. Меликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Достигнутый в последние десятилетия стремительный прогресс биотехнологии, в частности, микробиологического производства промышленных ферментов сделал бациллы одним из наиболее значимых для человека объектов живой природы, поставив их в один ряд с сельскохозяйственными животными и растениями, пекарскими дрожжами, мицелиальнымн грибами и актиномицетами. Иллюстрируя экономическую значимость бацилл, достаточно сказать, что объем мирового производства только препаратов а-амилазы, синтезируемых штаммами Bacillus amyloliquefaciens, в 2003 г достиг 800 тыс. тонн. Рыночная стоимость этого продукта составляет около 20 млрд. долл. Этот фермент, бесспорно, играет ключевую роль в решении проблемы разработки экономически оправданного способа синтеза топливного этанола, что в свою очередь, способно снизить зависимость экономически развитых стран от импорта нефти, решить множество глобальных социально-экономических, политических и экологических проблем. Наряду с а-амилазой, бациллы являются основными продуцентами щелочной и нейтральной протеаз, которые служат основой десятков наиболее современных технологий глубокой переработки сырья в пищевой промышленности, при синтезе моющих средств и получении новых материалов.

Уникальной особенностью бацилл с точки зрения биотехнологии является их непревзойденная способность к секреции белка во внешнюю среду в сочетании с эффективной утилизацией дешевых низкоочищенных полимерных субстратов, таких, как зерновая мука, растительная и дрожжевая биомасса в сочетании с минеральными источниками азота. Бациллы обладают мощным потенциалом аэробного метаболизма в сочетании с экзогидролазной активностью, позволяющим им стремительно расти, без потерь конвертируя субстраты в целевой продукт. Биотехнология не знает других объектов, способных в течение 30 часовой ферментации накапливать в среде до 40 г/л целевого белка.

По мере развития технологии рекомбинантных продуцентов различных белков высокая способность бацилл к секреции белка стимулировала попытки конструирования на их основе продуцентов ценных биоактивных белков и пептидов: проинсулина, интерферонов, соматотропина, сывороточного альбумина, вакцинирующих вирусных антигенов и других. Однако, все эти попытки закончились неудачно. Более того, было установлено, что бациллярные клетки неспособны к секреции даже собственных секреторных белков, подвергнутых более или менее значительным модификациям. В частности, не удалось заставить бациллы секретировать экзогидролазы, неспособные к естественному фолдингу, или лишенные ферментативной активности. Таким образом, можно сделать вывод о

способности секреторного аппарата бацилл, в отличие от секреторного аппарата дрожжей, мицелнальных грибов и клеток высших эукариот, избирательно распознавать дефектные неактивные молекулы и не допускать их транспорта во внешнюю среду.

Еще одной уникальной особенностью бацилл, важной в технологическом отношении, является их способность к образованию эндоспор. С одной стороны, это делает бациллярные культуры неприхотливыми при культивировании и хранении, с другой - осложняет процесс управления ферментацией. Последнее обстоятельство обусловлено тем, что синтез секреторных ферментов бациллярными клетками . жестко сопряжен со стадиен предшествующей переходу к спорообразованию. Таким образом, функционирование аппарата синтеза целевого белка в ходе ферментации бациллярного штамма-продуцента происходит в течение короткого периода, соответствующего переходу от стадии вегетативного роста культуры к формированию спор.

Цель н задачи исследовании

Целью данной работы являлось изучение молекулярно-генетическнх особенностей бактерий рода Bacillus, обусловливающих их принципиальную с технологической точки зрения черту: способность к сверхэффективному синтезу и секреции собственных секреторных гидролаз, но не гетерологичных или дефектных гомологичных белков.

В ходе исследований решались следующие задачи:

Разработка экспериментального метода, позволяющего направленно вносить геном бациллярных штаммов необходимые стабильно наследуемые перестройки, инактивируя или вводя в него дополнительные копии различных генов.

Изучение организации сопряженной со спорообразованием высокоэффективной экспрессии генов на примере параспоральных кристаллических белков Bacillus thuringiensis.

Исследование распространенности в природных штаммах бацилл генов различных секреторных экзогидролаз. сопоставление особенностей их структуры и регуляции экспрессии.

Разработка метода получения интактных предшественников секреторных протеаз бацилл, изучение механизма их косекреторпой активации.

Построение обобщенной модели регуляции синтеза и секреции ферментов клетками бацилл. Применение разработанной модели для получения промышленных продуцентов ферментов: нейтральных протеаз Bacillus megaterium и Bacillus amyloliquefaciens, щелочной протеазы Bacillus licheniformis и мезофильной а-амилазы В. amyloliquefaciens.

г

Научная понизил н практическая ценность работы

В настоящей работе сформулирована концепция о наличии у бацилл генетического аппарата, осуществляющего косекреторный контроль фолдинга белков. Разработана методология, позволяющая исследовать этот аппарат, сочетающая методы направленного воздействия на геном бацилл с физико-химическими экспериментами ш vivo. Продуктивность разработанной концепции подтверждена фактом создания высокостабильных промышленных продуцентов, пригодных для непосредственного использования в тоннажном производстве протеаз и а-амилазы.

По ходу достижения поставленных целей работы успешно решены следующие методические задачи:

• Разработан метод сайт-направленной интеграции линейных кассет в форме ПЦР-продуктов в геном бацилл. Предложен новый маркер лекарственной устойчивости к эритромицину на основе мини-гена orfE, кодирующего пятичленный пептид. Практически подтверждена возможность использовния однокопийных векторов сайт-направленной интеграции при исследовании регуляторных механизмов и создания штаммов-продуцентов промышленного. назначения.

• Клонирован ряд новых генов секреторных ферментов бацилл: глутамилэндопептндаз В. licheniformis, В. intermedius, В. cereus, wprA В. licheniformis и В. amyloliquefaciens, пуллуланаз и нкйтряпкнпй прптепзи R licheniformis. Изучены особенности их структуры и регуляции^ потенциально важные с точки зрения обеспечения секреции. Проведена оценка частоты встречаемости генов секреторных ферментов у штаммов бацилл нескольких видов.

• Разработаны новые методы получения интактных предшественников секреторных ферментов бацилл, в том числе, с использованием бактериальных L-форм, лишенных клеточной стенки. Показана способность предшественников секреторных протеиназ бацилл к мультимеризации. Выдвинута гипотеза о взаимодействии клеточной стенки бацилл с предшественниками секреторных белков в форме линейных полимеров. Впервые экспериментально показана роль клеточной стенки в запуске аутопроцессинга предшественников секреторных ферментов бактерий семейства Bacillaceae.

• Показано существование отрицательной обратной связи, запускающей механизм генерализованного ответа типа heat-shock в результате инактивации гена WprA, кодирующего субтилизиноподобную протеиназу, прочно связанную с клеточной стенкой. Разработана векторная система для замещения природного гена wprA интегративными кассетами, несущими регуляторные гены.

Разработанный методический аппарат успешпо зарекомендовал себя при ——■—■ ■ 1 --•-—--—----

конструировании продуцентов щелочной и нейтральной протеаз на основе бациллярных штаммов. Достигнутый уровень продуктивности и стабильности новых штаммов позволил успешно внедрить их в производство на Ладыжинском и Ефремовском биохимических заводах.

Созданная методическая база значительно расширяет возможности планирования и осуществления дальнейших экспериментов по генетической характеристике секреторного аппарата бацилл, в том числе, с использованием мощных современных подходов на основе биоинформатики, функциональной геномики и протеомики.

Результаты работы были представлены на IV Симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, Россия, 1997), II Биохимическом съезде России (Москва, 1997 г.) и V Научной Конференции ГосНИИгенетика (Москва, Россия, 1997 г.), Конференции памяти В.II. Ореховнча «Структура и функция протеолитических ферментов», Москва, 2000, Конференции «Химия белка и протеолитических ферментов», Москва, март 2002, международных конференциях «Molecular responses to biotic and abiotic stresses, Хельсинки, Финляндия 1994 и 1996 г.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работ состоит из введения и разделов «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», выводов и списка использованной литературы, включающего 154 библиографической ссылки. Работа изложена на 195 машинописных страницах, содержит 22 рисунка и 24 таблицы.

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в формировании концепции аппарата косекреторного контроля фолдинга белков у бацилл, в разработке оригинальных методов введения и модификации генетического материала бацилл, в создании экспериментального метода получения предшественников секреторных ферментов бацилл, а также в представлении и публикации полученных результатов. Весь основной экспериментальный материал получен автором и руководимыми им сотрудниками, аспирантами и студентами Лаборатории химии белка им. В.М. Степанова ФГУП ГосНИИгенетика A.B. Серкиной, A.M. Савиловой, Г.Е. Константиновой, С.И. Новиковой, Д.В. Ребриковым, А.Э. Грановским и Я.Н. Коганом. При исследовании предшественника металлоэндопептидазы Brevibacillus brevis использованы результаты, предоставленные д.б.н. Г.Г. Честухинон, д.б.н. A.B. Сорокиным и к.б.н. Т.Ф. Горожанкиной. При разработке системы экспрессии на основе L-форм

использованы лабораторные технологии, созданные в секторе клеточной биологии прокариот института Молекулярной биологии (г. Иена, Германия) под руководством проф. И. Гумперта. Цикл работ по разработке маркерной системы на основе мини-гена устойчивости к эритромицину проведен в сотрудничестве с лабораторией под руководством проф. А. Манькина (Университет Иллинойса, Чикаго, США). Исходный материал для конструирования вектора pLFI4 и вектор рСВ20 получен автором от к.б.н. В.В. Лившица и к.б.н. В.В. Алешина. Исходные материалы для проведения экспериментов по изучению карбоксипептидазы Т предоставлены А.Л. Остерманом, О.П. Загнитько и М.В. Матцем.

При исследовании 8-эндотоксинов Bacillus thuringiensis использованы материалы, полученные А.Л. Остерманом, А.И. Карасиным, C.B. Смулевичсм и P.M. Кадыровым.

Исследования глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius проводились совместно с сотрудниками Казанского университета (руководитель проф. И.Б. Лещинская), Института Молекулярной Генетики РАН (руководитель проф. C.B. Костров) и института Кристаллографии РАН им. В.В. Шубникова (руководитель проф. И.П. Куранова).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка векторных систем для клонирования в бациллах

1.1. Системы сайт-направленной интеграции на базе линейных продуктов, получаемых методом ПЦР

В литературе имеется много примеров генноинженерного конструирования штаммов бацилл различных видов, преимущественно, мезофильных штаммов, имеющих промышленное значение: В. subtilis, В. licheniformis, В. amyloliquefaciens, В. megaterium. Есть также примеры направленного изменения генома бацилл группы сибирской язвы: В. anthracis, В. thuringiensis и В. cereus. При этом большинство авторов стремится адаптировать для работы со штаммами бацилл методологию, зарекомендовавшую себя в случае Е. coli и других грам-отрицательпых микроорганизмов: введение исследуемого генетического материала в составе стабильных высококопийных (реже малокопийных) плазмидных векторов. В случае В. anthracis, В. thuringiensis и В. cereus эта методология дополняется конъюгативным переносом крупных резидентных плазмид из одного исследуемого штамма в другой. Определенную роль в развитии генной инженерии мезофильных бацилл сыграла транедукция с использованием умеренных фагов ф29 и ф105.

Распространенные интегративные векторы для работы со штаммами бацилл основаны на использовании термочувствительных по репликации мутантиых вариантов рЕ194 и родственных ей плазмид. Имеется также ряд работ о создании интегративных векторов для введения ДНК в определенные хромосомные сайты, в частности, в структурный ген а-амилазы. Однако, судя по последним публикациям, этот принцип не нашел широкого применения в практике. Необходимо отметить, что в большинстве опубликованных работ авторы упоминают о неудовлетворительной стабильности рекомбинантных штаммов, полученных по всем известным технологиям. Косвенным доказательством этого является и непрекращающиеся попытки создания новых систем для клонирования в бациллах, несмотря на наличие множества опубликованных вариантов. Перечисленный набор разрабатываемых методов в незначительной мере использует уникальную особенность генетической организации бацилл: повышенную по сравнению с другими организмами частоту гомологичной рекомбинации и эффективность репарации ДНК.

Первым этапом нашей работы по усоврешенствованию методологии генноинженерного конструирования бациллярных штаммов стало тестирование эффективности введения интегративных конструкций с помощью регенерации протопластов в тех случаях, котогда трансформации по методу Спнцайзена оказывалась недоступной. В качестве источника тестерной конструкции использовалась тотальная геномная ДНК, выделенная их штамма В. subtilis AJ73, ранее отобранного при трансформации конструкцией со случайными плечами и маркером устойчивости к апрамицину. Результаты измерения эффективности трансформации бацилл различных видов по методу регенерации протопластов представлены в Таблице 1.

Таблице 1. Результаты измерения эффективности трансформации бацилл различных видов по методу регенерации протопластов тестерной тотальной геномной ДНК В. subtilis AJ73, несущей конструкцию со случайными плечами и маркером устойчивости к апрамицину (AraR). ___

Штамм Число устойчивых колоний (на мкг вводимой ДНК)

В. amyloliquefaciens ВКПМ B-U50 10J

В. amyloliquefaciens А50 2x102

В. megaterium ВКПМ В-3937 104

В. thuringiensis ssp. tenebrionis 12

В. thuringiensis ssp. israelensis 7

В. thuringiensis ssp.galleriae B-l 167 6

B. cereus В 5370 2x102

Сделанные наблюдения позволили сформулировать гипотезу о целесообразности разработки метода получения и применения линейных конструкций, фланкированных плечами для интеграции в определенный геномный сайт за счет гомологичной рекомбинации. К преимуществам линейных интегративных конструкций, получаемых с помощью ПЦР, можно отнести:

1) возможность сборки in vitro с помощью ПЦР в течение одного рабочего дня по сравнению с несколькими неделями, необходимыми для получения и проверки конструкций на базе челночных плазмид;

2) более высокая по сравнению с плазмидными вариантами адресность доставки, обусловленная высокой рекомбинационной активностью свободных концов «плечей», снижение доли неспецифических интеграций, облегчение ПЦР-картирования интегрированных вариантов за счет уменьшения размера конструкции, сокращение объема балластной ДНК, вводимой в хромосому бациллярного штамма за счет устранения служебных элементов конструкций, необходимых для поддержания в Е. coli;

3) высокая генетическая стабильность однокопийпых конструкций по сравнению с многокопийными плазмидными в условиях интенсивной гомологичной рекомбинации;

4) невозможность реверсии введенной рецессивной мутации к дикому типу в отсутствие фенотипической селекции: в отличие от интеграции кольцевых плазмидных вариантов по Кэмпбеллу, линейные конструкции замещают собой ген дикого типа, исключая возможность его реинтеграции.

5) Возможность использования эндогенных хромосомных промоторов для транскрипции элементов кассеты.

Предложенная методология в дальнейшем широко применялась для создания бациллярных штаммов с направленно измененным геномом, в том числе, продуцентов промышленных ферментов: нейтральной и щелочной протеазы, а-амнлазы, глутамилэндопептидаз и пуллуланаз.

2. Геномная организация и механизм экспрессии генов 5-эндотоксинов В. thuringiensis

2.1. Гены энтомоцидных 5-эндотоксинов В. thuringiensis (cry), как модель природной суперэкспрессии, сопряженной со споруляцией

Энтомоцидпые 8-эндотоксины В. thuringiensis (Cry) представляют интересный с технологической точки зрения пример суперпродукции одного или нескольких белков природными штаммами бактерий. Особенностью всех белков Cry является способность в процессе споруляции хозяина формировать нерастворимые в воде параспоральные кристаллы. Важной особенностью геномной организации генов cry, отличающей их от генов мажорных секреторных белков, является их высокая множественность, полиморфизм и преимущественная локализация на крупных природных трансмиссивных и мобилизуемых плазмидах. Набор генов cry, как правило, уникален для каждого природного штамма В. thuringiensis, причем в природных изолятах этой бактерии обнаружено более 200 вариантов генов cry, разделяемых на 36 структурных групп. В рамках представленной работы гены cry рассматривались преимущественно в качестве модели, позволяющей наиболее полно отделить проблемы, связанные с ограничениями аппарата транскрипции и трансляции у бацилл от механизмов контроля секреции, что особенно важно при изучении таких массово синтезируемых белков, как а-амилаза и щелочная протеаза.

2.2. Исследование геномных генов cry В. thuringiensis подвида galleriae штамма 11-67с помощью универсальной системы ПЦР-клонирования

Как упоминалось выше, штамм 11-67 В. thuringiensis подвида galleriae содержит большое число индивидуальных генов cry, многие из которых удалось идентифицировать

путем иммунологического скрининга банка генов или по наличию продуктов в кристаллах. Тем не менее, к моменту настоящей работы не было проведено исчерпывающей полногеномпой характеристики генов cry этого штамма. Для проведения такой характеристики была предложена универсальная схема ПЦР-клонирования, предназначенная для первичного обнаружения и предварительной идентификации генов cry из различных источников, в первую очередь, природных изолятов, В. thuringiensis. Ее главным преимуществом является возможность идентифицировать большую область известных cry генов, используя одну пару вырожденных праймсров, что делает данный метод существенно более быстрым по сравнению с аналогичными, предложенными ранее. Полученный гетерогенный продукт ПЦР был охарактеризован путем клонирования и выборочного секвепирования клонов, что показало присутствие в его составе копий генов cry 1 Gal, cry ID, cry 1F, cry9Aa, cry9Ba. Продукт ПЦР использовался также в качестве гибридизационного зонда (Рис. I). Этот эксперимент показал наличие в геноме не менее четырех генов, по размеру гибрндизующегося рестриктного HindIII-фрагмента ндентифицировнных как crylGal, crylF, сг>9Ла и сгу9Ва, Ген cryl F в виде отдельного рестриктного фрагмента идентифицирован не был, однако, последовательности фланкирующих областей crylF не опубликованы, поэтому можно предполагать, что соответствующий этому гену рестриктный фрагмент в точности совпал с одним из других четырех.

В литературе не сообщалось о существовании основанной на ПЦР универсальной системы для подобных целей, которая позволяет ие только обнаруживать, но и классифицировать гены в природном материале. Таким образом, разработанная методика может рассматриваться как оригинальная. Специфичность подобранных праймеров к высоко консервативной части гена, кодирующую С-концевую половину белка, позволяет обнаружить не только близко родственные производные известных генов, но и найти новые прототипы.

тч'г i,4i.Hi»'',/ /<'•' ¡1

•1НЮ№Щ!>1"<1 ■ ■'»'. '1

I, I , „>,!• 1 1 <

■mtitfh:. warn rtnfiti'i, . uiiitihk

Зонд cryl А Зонд сгуЭА

-6—cryl Са ■«—новый ген -t—cry 9 А <—сгуЭВ

универсальным ПЦР-продукт

Рисунок 1. Тестирование специфичности системы ПЦР-клонирования на основе вырожденных праймеров СиР1/СиР2 методом Саузерн-блот гибридизации. Па дорожки 0.8% агарозного геля нанесена геномная ДНК В. (/шлл£1е7ш'£ подвида £аИепае, расщепленная рсстриктазой НтйШ. Панель 1 - гибридизация с зондом на основе консервативной области со^Аа, панель 2 - гибридизация с зондом на основе консервативной области сгу9Ла, панель 3 - гибридизация с продуктом ПЦР, полученным при амплификации с праймерами СиР1/СиР2 на матрице геномной ДНК В. 1/гиг1п81еги1.1 подвида цаИепае.

Метод PCR, обладая высокой чувствительностью, позволяет детектировать гены cry в биологическом материале различного происхождения, таком как природные изоляты В. thuringiensis, генно-инженерные конструкции, трансгенные растения, несущие сгу-гепы. Последняя проблема становится актуальной, так как трансгенные растения, несущие гены cry, получили широкое распространение. Поэтому контроль распространения cry-генов в природных и сельскохозяйственных популяциях растений требует быстрого метода обнаружения и идентификации их ДНК.

Гибридизационная стадия предложенной схемы позволяет с высокой достоверностью определить число cry-генов в исследуемом геноме. Эта процедура заменяет громоздкий ряд дополнительных реакций ПЦР, которые необходимы для идентификации генов стандартным способом. Предложенная процедура приобретает ряд преимуществ ввиду большого числа известных генов cry. Она позволяет определить и первоначально оценить число копий сгу-генов, если они представлены в образце в виде смеси.

В результате проведенных экспериментов было показано, что разрабатываемая схема полностью соответствует предъявляемым к ней требованиям. В опытах с клонированными генами cry 1Са2 и cry9A и на примере мультигенных штаммов 6-96 и 11-76 В. thuringiensis была продемонстрирована универсальность схемы: амплификация с равным выходом проходила на относительно близкородственных генах, таких как cry] Ab и cry] Gal, так и на структурно отдаленных сгу9А и сгу9В. Гибридизационная техника позволила идентифицировать в геноме штамма 11-67 новый ген crylGal, в короткий срок разработать и реализовать схему его клонирования с помощью плазмидиого мини-банка. Полученные результаты дают основания считать схему пригодной для характеристики природных штаммов В. thuringiensis по наличию генов cry и клонирования наиболее перспективных вариантов.

В результате использования новой схемы был клонирован ген cry 1 Gal, обнаруженный в подвиде В. thuringiensis подвида galleriae впервые. Ранее он был клонирован из неидентифицированного природного изолята В. thuringiensis Б. Ламбертом (Plant Genetics System, Бельгия), однако последовательность гена не была опубликована, а сам ген не доступен для исследовательских целей.

Ген crylGal структурно близок ранее обнаруженному нами crylGa2 из подвида wuhanensis. Оба гена способны к экспрессии в природных штаммах, несмотря на наличие необходимых регуляторных элементов. Клонированный в данной работе ген не до конца охарактеризован с точки зрения причин отсутствия его полноценной природной экспрессии, однако не исключено, что обнаруженная пара генов crylGal/crylGa2 может служить удобной моделью для изучения причин криптичности или слабой активности геномных генов cry. Фланкирующие области генов cryIGal и crylGa2 на значительном протяжении совпадают. Однако, в отличие от crylGaZ, cry 1 Gal из В. thuringiensis подвида galleriae 11-67 не находится в составе транспозона и не соседствует с копией cry\ Ab.

2.3. Разработка экспрессионных систем для введения генов cry в В. thuringiensis Ii изучение влияние эффекта положения генов cry в геноме па уровень нх экспрессии

В природном хозяине В. thuriengiensis подвида gallerie 11-67 экспрессия гена try 1 Gal находится на крайне низком уровне или полностью отсутствует. Тем не менее, установленная структура кодирующей и регуляторной области этого гена позволила предположить возможность его эффективной экспрессии. С целью изучения функциональности гена cryIGal была поставлена задача создать конструкцию, несущую его клонированную копию на базе репликона грам-положительных бактерий, и ввести се в клетки различных штаммов В. thuriengiensis.Для облегчения отбора клонов- трансформантов В. thuriengiensis, экспрессирующих cry 1 Ga 1 была разработана система прямой фенотипической селекции на основе мини-гена устойчивости к эритромицину. Для этого был сконструирован искусственный оперон, где под контролем собственного промотора находилась кодирующая область cry 1 Gal и мини-ген устойчивости к эритромицину orfЕ. Искусственный оперон ввели в состав низкокопийной плзмиды рВА4 из В. amylologuenfaciens, предоставленной

Й.Иомантасом (ЗЛО «АГРИ»). Трансформация полученной конструкцией pBA-G12 клеток В. subtilis по методу Спицанзена позволила получить устойчивые к эритромицину колонии. Ни одной колонии не было получено при концентрации эритромицина в среде 80 мг/л и выше. Трансформированные pBA-G12 клетки В. subtilis не росли при концентрации эритромицина выше 20 мг/л, однако, как показали данные иммуноблоттинга, проведенная таким образом селекция гена сгуЮл\, трапскрипционно слитого 'с ог/Е, позволила добиться его экспрессии в В. subtilis без какой-либо модификации области промотора. Трансформированные этой же плазмидой клетки В. ihuriengiensis ssp. kurstaki 4D10 и finitimus BKIIM В-1166 приобретшие эритромициновую устойчивость, также производили белок Cry 1 Gal в составе белковых кристаллов.

С целью доказательства наличия у рекомбинантного продукта гена cry 1 Gal нативной пространственной структуры были проведены эксперименты по его искусственной активации путем ограниченного протеолиза трипсином и химотрипсином. Было установлено, что ограниченный протеолиз tryIGal химотрипсином, подобно другим изученным эндотоксинам приводит к образованию фрагментов с молекулярной массой 70 кДа, соответствующих истинному токсину В. thuringiensis классов 1, 4, 9 и других. Кроме того, в ходе протеолиза cry 1 Gal иногда появлялся минорный компонент с молекулярной массой около 35 кДа, который, вероятно, является продуктом деградации 70 кДа белка. Этот результат свидетельствует о наличии у cryIGal типичной для 5-эндотоксина третичной структуры, обеспечивающей нормальную активацию в физиологических условиях, и предохраняющей от неспецифнческой деградации.

Наличие нативной структуры у рекомбинантного продукта гена cry IGal позволило провести эксперименты по изучению его токсической активности в отношении насекомых. В качестве тест объекта были выбраны гусеницы соснового походного шелкопряда Т. pytiocampa, токсичность к которому ранее была определена только для небольшого числа индивидуальных эндотоксинов. В качестве положительного контроля использовали споро-кристаллические смеси В. thuringiensis нескольких видов: alesti, finitimus, shondungensis, caucasicus и kenyae. Суспензии споро-кристаллических смесей наносили на поверхность игл соспы черной Pimts nigra, после чего помещали иглы в контейнеры и вносили туда гусениц Т. pytiocampa первого возраста. Для повышения достоверности эксперимента использовали выводки насекомых, собранные в нескольких изолированных друг от друга биотипах в Северной Италии. В анализе использовались две переменные: процент съеденных во время испытаний иголок и процент смертности в течение 7 дней с момента начала испытаний. Для обработки результатов использовался пакет ANOVA. Всего было проведено 160 независимых тестов. Величина предъявляемой насекомым дозы токсина вычислялась на основании его известной концентрации в маточной суспензии и расхода раствора (определялся путем взвешивания пробирки с раствором до и после обработки в ней сосновых игл). Токсин в разведении 1000 раз наносили на 1 г свежих игл. При этом концентрация токсина составляла до 2.57 мкг на г корма (Таблица 2).

Таблица 2. Изучение биологической активности эндотоксинов против соснового походного

шелкопряда Т. pytiocampa

Тест Тип токсина Концентрация токсина в суспензии (м кг/мл) Количество токсина в пробе (мкг/ 100 мг корма)

Btgal 6-96 1 Cry9A, Cry 1 Ab7 25000 80.625

Btgal 6-96 10 Cry9A, Cryl Ab7 2500 6.813

Btgal 6-96 100 Cry9A,CryIAb7 250 0.688

Btgal 6-96 1000 Cry9A,CrylAb7 25 0.073

Btgal 11-67 ! Cry9A, Cry 1D, Oy'.F 25000 85.625

Btgal 11-67 10 Cry9A, CrylD, CrvlF 2500 8.750

Btgal 11-67 100 Cry9A, CrylD, Cry IF 250 0.806

Btgal 11-67 1000 Cry9A, CrylD, Cry IF 25 0.095

Среди двух препаратов на основе В. thuringiensis ssp galleriae наиболее эффективным оказался 11-67, что можно объяснить более высоким содержанием в его кристаллах Сгу9А по сравнению со штаммом 6-96. Тем не менее, оба штамма В. thuringiensis подвида galleriae не вызывали значительной смертности в разведениях 3 и 4. Один из выводков (№ 26) в стократном разведении ни в одном тесте не показал какой-либо смертности. Это было причиной полученного высокого стандартного отклонения.

Постановка основных биотестов с использованием CrylGal и других 5-эндотоксинов технически проводилась аналогично постановке положительных контролей. Статистически препараты В. thuringiensis дали отличия только в поедании, но не в смертности личинок. Кристаллы из штаммов подвидов finitimus, shondungensis а также источник CrylGal -кристаллы штамма kurstaki 7D10(pBA-G12), показали средний уровень поедания среди других препаратов В. thuringiensis. Эти препараты показали также высокое стандартное отклонение по смертности, которая, вероятно, превышает различия, которые были бы статистически значительны, среди препаратов В. thuringiensis. В. thuringiensis caucasicus и кепуае показали лучшие и наиболее стабильные результаты, не смотря на то, что в обоих препаратах не содержалось белка CrylAa, ранее считавшегося наиболее активным в отношении Т. pytiocampa. Таким образом, проведенные эксперименты по биотрстированию доказывают наличие биологической активности у искусственно полученного продукта гена cry 1 Gal -эндотоксина CrylGal, хотя уровень его токсичности недостаточно велик для практического применения против использования насекомого-мишени.

3. Исследование генов новых секреторных ферментов бацилл

3.1. Глутамнлэндоиентплазы В. licheniformis, В. intermedins и В. cereus

Глутамилэндопептидазами (Gse) называют отдельное семейство в составе клана SA химотрипсиновых сериновых протеиназ, встречающееся у микроорганизмов н характеризующееся специфичностью в отношении пептидных связей а-карбоксильной группы глютаминовой кислоты. В структурном отношении Gse четко распадаются на две неродственных группы, одна из которых объединяет ферменты, обнаруженные у актиномицетов Streptomyces fradiae и Streptomyces griseus, а вторая - ферменты из бактерий порядка Bacillales: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis. В отличие от генов а-амилаз, щелочной и нейтральной протеаз, имеющихся у абсолютного большинства штаммов мезофильных и психрофильных бацилл различных видов, гены Gse содержатся лишь у 5-20% исследованных штаммов. К началу нашей работы были опубликованы аминокислотные последовательности Gse из S. aureus -V8, В. licheniformis GseBL и В. subtilis GscBS. При этом последовательности генов были установлены только для V8 и GseBL. Необходимо отметить, что до настоящего времени отсутствует понимание адаптивного значения Gse с точки зрения физиологии бациллярных штаммов.

Задача нашей работы в ходе исследования Gse состояла в изучении особенностей секреции и созревания ферментов этой группы у бацилл разных видов, в частности Bacillus intermedius и Bacillus cereus. При этом основными параметрами, подлежащими сопоставлению между различными Gse из бацилл с одной стороны и мажорными секреторными ферментами с другой, служили: (1) вариабельность и частота встречаемости гена в пределах вида; (2) длина и аминокислотный состав препептида, (3) сайт процсссинга пропептида, (4) число и расположение дисульфидных связей.

3.1.1. Глутамилэндопептидаза из Bacillus intermedius (GseBI)

Способность штамма В■ intermedius 3-19, в течение ряда лет исследовавшегося в Казанском Государственном Университете, была изначально обнаружена по специфической активности в отношении белковых субстратов. Целью клонирования гена gseBI была создана библиотека генов хромосомы В. intermedius на базе плазмиды рСВ22. Полученной библиотекой генов трансформировали клетки лабораторного штамма В. subtilis AJ73, дефицитного по способности к секреции собственных протеолитических ферментов. Последующий отбор осуществляли по способности колоний формировать зоны гидролиза

казеина при выращивании на молочном агаре и по способности секретируемого в культурапьную жидкость фермента гидролизовать хромогенный субстрат 2-С1и-рЫД. В результате проделанной работы был идентифицирован клон, несущий в составе плазмидного вектора фрагмент чужеродной ДНК размером 6.2 т.п.н., и накапливающий в культуральной жидкости фермент с активностью С.че. Данный фермент был выделен из культуральной жидкости рекомбннантного штамма-продуцента в гомогенном состоянии. В результате подробного физического картирования клонированного фрагмента ДНК В. ШегтееНих и последующего конструирования делеционных вариантов, несущая полный структурный ген

была минимизирована до размера 1.9 т.п.н. и полностью секвенирована (номер доступа в банке нуклеотидных последовательностей ЕМВЬ - У15136). Анализ аминокислотной последовательности показал, что глутамилэндопептндаза синтезируется в виде препрофермента, в результате процессинга которого формируется зрелый фермент, состоящий из 215 а.о. Сравнение с последовательностями известных глутамилэндопептидаз показало, что ввеВ! наиболее близка к Сче из В. .чиЬпИ* и В. ЧсИаи/огпих (35 и 38% совпадающих остатков, соответственно) и позволило предварительно локализовать остатки его каталитической триады Н1я47, Азр97, Бег 171, соответствующие позициям 1П$57, А5р102 и Бег 195 по общепринятой нумерации последовательности ос-химотрипсина. Был также идентифицирован остаток НЫВб, по-видимому, соответствующий остатку Шз213 СзсБО. Напомним, что на основе рентгеноструктурного анализа С5с8С, именно этот остаток был идентифицирован как возможный ключевой элемент в распознавании субстрата всеми Сзе.

Для создания возможности высокоэффективной экспрессии ¡¡еВ1 в клетках бацилл на заключительном этапе работы с клонированным геном был сконструирован продуцент на основе разработанного нами однореплпконного челночного вектора рЬР14, обладающего повышенной ёмкостью и копнйностыо (до 70 копий на клетку). Ген #леВ[ был введен в состав вектора рЬБ14 под контролем собственного промотора, экспрессия полученной конструкции происходила в клетках протеазодефицитиого штамма В. хиЫШя АЛЗ. Содержание в культуральной жидкости сконструированного рекомбннантного штамма достигало 50 мг/л. Выделение фермента из культуральной жидкости рекомбннантного штамма проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с бацитрацин-агарозой и последующей ионообменной хроматографии на колонке МопоЭ в системе ГРЬС. Гомогенность препарата оценивалась электрофорезом в полиакриламидном геле. Очищенный фермент был использован для получения белковых кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа. В результате получены кристаллы призматической формы размером 0.25-0.3 х О, 150.2 х 0.07-0.15 мм для которых с использованием синхротронного излучения (ЕМВЦ Гамбург) был собран набор дифракционных данных с разрешением 1.5 А. На основе полученных данных трехмерная структура рэеВ! была решена с разрешением 1.75 А.

3.1.1. Глутамилэндопептндазы из В. ИсИет/отш (СБеВ1) и В. сегет (СвеВС)

Глутамилэндопептндаза из В. ИсНет/огпиа (СяеВ!), включая последовательность структурного гена, была описана ранее Какис1о е! а1 (1992). Глутамилэндопептндаза В. сегеи.ч (СэеВС) не была описана в публикациях, однако, ее ген удалось обнаружить при анализе полногеномной последовательности В. сегеи.ч, установленной в Институте Пастера (Франция) в 2003 г. Оба фермента имеют ограниченное сходство друг с другом и другими известными вБе бациллярного происхождения - 30-35%. В рамках настоящей работы была поставлена цель изучить распространенность генов дхеВЬ и ВС среди природных штаммов соответствующих видов и сопоставить особенности экспрессии друг с другом и с геном #.?еВ1, детально описанным в предыдущей главе. С этой целью были подобраны праймеры, позволяющие амплифицировать гены длеВЬ и ¿¡.кгВС из геномной ДНК, а также проведены определения специфической протеолитической активности культуральной жидкости этих штаммов по хромогенному субстрату г-ОЫ-рЫА. С целью изучения адаптивного значения вве с точки зрения физиологии бацилл были также проведены эксперименты по

сопоставлению субстратной специфичности и кинетических особенностей катализа йве различного происхождения. Результаты исследования приведены в таблице 3.

Таблица 3. Данные о встречаемости генов ¿>л? в исследованных бациллярных штаммах по данным ПЦР и величина специфической активности Ояе в культуральной жидкости штаммов по результатам измерения по хромогенному субстрату 2-С1и-рКА._

Штамм Происхождение Наличие гена gse Активность Gse, Ед/мл КЖ

В. intermedius 3-19 Казанский Госуниверситет ««'DI 0.02

В. licheniformis В16 Лаб. химии белка ГосНИИгепетика 0

В. licheniformis ЛБЗ Ладыжинский биохимический завод tf.y?BL 0.002

В. licheniformis 103 Лаб. химии белка ГосНИИгепетика irve-BL 0.12

В. licheniformis В1951 ВКПМ - 0

В. cereus В-5370 ВКПМ i.vi-BC 0

В. thuringiensis ssp. israelensis Лаб. химии белка ГосНИИгепетика g.reBC 0

В. thuringiensis ssp. tenebrionis Лаб. химии белка ГосНИИгепетика gieBC 0.01

В. thuringiensis ssp. galleriae B-l 167 ВКПМ i'.Vi'BC 0

B. thuringiensis ssp. galleriae ВКПМ B-696 ВКПМ g.veBC 0

B. thuringiensis ssp. wuhanensis В-1176 ВКПМ - 0

С целью сопоставления энзиматических характеристик Gse из бациллярных штаммов различных видов и выяснения их структурных особенностей, влияющих на уровень продукции, все имеющиеся клонированные гены без собственных промоторов были введены в состав высококопийного вектора pLF14 под контроль имеющегося в нем промотора гена кап из Тп903. Полученные таким образом однотипные конструкции экспрессированы в клетках протеазодефицитного штамма В. subtilis AJ73. При этом уровень продукции GseBL и GseBC в составе однотипных конструкций значительно отличался: GseBL удавалось получать с выходом до 200 мг/л, тогда как GseBC продуцировалась с выходом не более 1-2 мг/л.

3.2. Изучение влияния продукции щелочной протеазы и глутамилэндонептндазы на секрецию тсрмостабнльных пуллулаиаз у В. licheniformis 103

Штамм В. licheniformis 103 был описан ранее в работе Балаян и Маркосян (1989), как продуцент термостабильных пуллуланаз. Пуллуланазы представляют собой a-1-б-гликозидазы, практически важной способностью которых является расщепление крахмала (амило-пектина) в сайтах ветвления. Кроме того, штамм В. licheniformis 103 в течение ряда лет использовался на предприятиях микробиологической промышленности в качестве продуцента комплекса щелочных протеаз с повышенным кератинолитическим потенциалом. Выбор штамма В. licheniformis 103 в качестве объекта исследования в рамках настоящей работы связан с его уникально высокой способностью к продукции GseBL (Таблица 3). В рамках изучения физиологической роли GseBL в адаптивности бациллярных штаммов было принято решение провести направленную инактивацию гена greBL в штамме, характеризующемся высоким уровнем продукции этого фермента. Параллельно в геноме В. licheniformis 103 была проведена направленная инактивация гена арг (кодирует субтилизин типа «Карлсберг»),

Для получения генных кассет для инактиации генов jjveB L и арг, было проведено ПЦР-клонирование этих генов с помощью специфических праймеров с использованием в качестве матрицы геномной ДНК В. licheniformis 103. Полученные продукты ПЦР были частично секвенированы для подтверждения факта специфичности ПЦР, после чего их расщепляли рестриктазой и лигировали с ДНК маркеров устойчивости к канамицину из Тп903 (в случае

гена арг) или к тетрациклину из природной плазмиды рВС16 (в случае gjeBL). Полученные лигазные смеси использовали для трансформации штамма В. licheniformis 103 по методу регенерации протопластов, трансформированные клетки высевали на полные среды, содержащие канамицнн или тетрациклин соответственно. Выросшие антибнотикоустончивые клопы троекратно пассировали на селективной среде, после чего подтверждали факт замены диких аллелей на неактивные с помощью ПЦР-амплификации генов gseBL и арг с теми же фланкирующими праймерами, которые были использованы для их первоначального клонирования. В результате был отобран один клон со значительно укороченным геном арг и четыре независимых клона с измененной структурой £.у?ВЬ, Помимо гена, предположительно подвергшегося инактивации, проводилось тестирование генов других секреторных ферментов: прг и а-амилазы. При этом было, что ни в одном из исследованных штаммов не наблюдалось вторичных перестроек генов, неспецифичных по отношению к вводимой кассете.

Отобранные пять клонов получили обозначения Carll, Gapl, Gap2, Gap3 и Gap4. Их физиологические отличия по сравнению со штаммом В. licheniformis 103 дикого типа выявлялись в ходе культивировали на различных различного состава: базовая полная среда с соевой мукой и экструдатом кукурузной муки, безуглеводный вариант среды, обедненные среды с капралактамом, соевым маслом, кутином и цетиловым спиртом (всего 10 вариантов).

среда 111223 3 4 466 7

клон дар2 дарЗ Carl дар2 дарЗ gapl дар2 дарЗ Carl дар2 Carl дар2 пулл. 261 47 339 76 219 289 214 0 113 0 296 405 Рисунок 2. Сопоставление белкового состава КЖ с наивысшей активностью пуллуланазы. В строке «ср №» - название среды культивирования, в строке «пулл.» - активность пуллуланазы в КЖ (ед/мл).

Культивирование проводилось в течение 72 часов. Результаты оценивались по следующим параметрам: pH среды по окончании ферментации, общая протеолитичсская активность по казеину (ПС), активность а-амилазы по ГОСТ (АС), активность пуллуланазы (прирост числа восстанавливающих концов при расщеплении пуллулана, определяемый с ■ помощью реагента Шомодьи-Нельсона): результаты измерений приведены на Рис. 2. Кроме того, препараты осветленной КЖ анализировали с помощью денатурирующего электрофореза

белков в ПААГ с окраской гелей Кумассн G-250. Рис. 2.

Результаты электрофореза приведены на

»«mi ^

gapl gap2 дарЗ Carl 103

Рисунок 3. Исследование содержания пуллуланаз 80 и 90 кДа в культуральных жидкостях мутатных производных В. Искет/отиа штамма 103, Ферментация в течение 72 часов проведена на безбелковой среде №7 (экструдат кукурузной муки 16%, хлопковое масло 2%) в ферментере объемом 1 л. В подписях дорожек -названия мутатных клонов.

Полученные КЖ использовались для препаративной очистки и изучения энзиматических свойств пуллуланаз (см. в тексте).

Проведенный эксперимент показал принципиальное изменение спектра секретируемых в среду белков у штаммов, подвергшихся инактивации генов арг и gseBL по сравнению с родительским штаммом. Для исходного штамма, культивируемого на всех без исключения испробованных средах, характерно накопление в среде четырех основных белков: GseBL (24 кДа), Apr (29 кДа), а-амилазы (52 кДа) и, в отдельных случаях, пуллуланазы массой 6570 кДа (Рис. 3). Соотношение между содержанием этих четырех продуктов значительно варьировало: например, на безуглеводной среде наблюдалось явное доминирование сс-амилазы при резком падении продукции протеаз. Можно предположить, что такая реакция штамма на условия культивирования призвана максимально компенсировать нехватку Сахаров за счет гидролиза имеющегося в среде ограниченного количества крахмала. Однако, ни при каких условиях ферментации родительского штамма не наблюдалось увеличения доли минорных секретируемых компонентов.

Напротив, во всех штаммах, несущих интегрированные кассеты Gap и Carls, наблюдалось резкое увеличение полиморфизма минорных секретируемых белков, тогда как накопление мажорных белков: GseBL (24 кДа), Apr (29 кДа) и а-амилазы (52 кДа) полностью подавлялось. Таким образом, можно сделать вывод о том, что мажорные секретнруемые компоненты штамма В. lichentformis 103 составляют единую систему, изъятие любого из компонентов которой нарушает функционирование механизма в целом. Принцип работы и назначение этой системы остается неясным, однако, можно предполагать, что GseBL является ее полноправным компонентом, хотя уровень продукции этого фермента существенно ниже, чем а-амилазы и, особенно, Apr. Более того, как показано в предыдущей главе, в отличие от Apr, GseBL продуцируется лишь частью штаммов вида В. lichenifonnis. Следовательно, GseBL не является необходимым компонентом пищеварительного комплекса бактерии.

Неожиданным результатом эксперимента является то, что при культивировании мутантных штаммов на безбелковых средах с капролактамом и кутином в культуральной жидкости мутантов Gap и Carls наблюдалось накопление нейтральной протеазы массой 35 кДа: этот фермент не был ранее обнаружен ни в одном из описанных в литературе штаммов В. licheniformis и не обнаруживается в культуральной жидкости В. licheniformis 103 дикого типа. Этот фермент был очищен нами до гомогенного состояния и охарактеризован методами ферментативной кинетики. Это наблюдение позволяет предполагать, что необходимость восстановления протеолитической активности, подавленной мутациями в генах арг или g.veBL, приводит к перестройкам регуляторного аппарата, активирующим молчащий в норме ген прг. В то же время, ни в одном из штаммов, инактивированных по gseBL, не происходит активации гена арг, хотя по данным ПЦР-картирования все штаммы группы Gap имеют ннтактный ген арг. Симметричным образом, инактивация арг блокирует экспрессию gi'iBL.

Важной особенностью культуральной жидкости мутантных вариантов Gap2 и Gap3 штамма В. licheniformis 103 оказалась высокая стабильность содержащихся в них белков при хранении. Это результат не является неожиданным, поскольку неспецифическая протеолитическая активность этих культуральных жидкостей существенно ниже, чем в случае родительского штамма. Это наблюдение было использовано для исследования пуллуланаз В. licheniformis 103, существование которых было отмечено ранее в опубликованной работе 1989 г, однако, выделения и характеристики чистых ферментов не проводилось. Важность этой работы обусловлена тем, что до настоящего времени в литературе описаны лишь ннзкоактивные пуллуланазы бациллярного происхождения, по pH- и температурному оптимуму работы не пригодные для промышленного использования. Напротив, пуллуланазная активность ферментов из В. licheniformis 103 не подавляется даже при прогревании на 95°С в течение часа и имеет pH оптимум 5.0, что позволяет совмещать ее с грибной глюкоамилазой при гидролизе крахмала в промышленных условиях.

В качестве источника для выделения пуллуланаз были выбраны КЖ мутантов Gap2 и Gap3, полученные на стандартной среде №1. Они подвергались диализу, фракционированию дробным осаждением изопропанолом и очистке с помощью аффинной хроматографии па бацитрацин-сефарозе и гель-фильтрацией в режиме FPLC на сорбенте Superdex 75HR. В результате в гомогенном состоянии было получено два фермента, обладающих пуллуланазной активностью, с молекулярной массой 70 и 80 кДа.

Исследования гомогенных ферментов показали, что более легкий и них с молекулярной массой 70 кДа представлял собой эндогликозидазу, гидролизующую крахмал до фрагментов длиной около 20 остатков глюкозы: т.е., напоминал по специфичности действия а-амилазу. В то же время, этот фермент, в отличие от а-амилазы, обладал выраженной способностью к гидролизу пуллулана (a-1-б-глюкан), а также отличался более высокой термостабильностью (до 65°С) и более низким pH оптимума работы от 5.0 до 6.0.

Однако наибольший интерес представлял фермент с молекулярной массой 80 кДа. Он обладал как эндоглюканазной, так и истинной экзоглюканазной активностью, в равной мере проявлявшейся в отношении крахмала, мальтодекстринов и пуллулана. Этот фермент обладал чрезвычайно высокой удельной активностью и термостабильностью, выдерживая прогревание при 95°С в течение часа практически без потери активности. Эти особенности, а также молекулярная масса роднят новый фермент с бинарными (двухдоменными) гликозидазами клостридий, имеющими как пуллуланазный, так и a-амилазный домены. Ферменты этого типа обладают ценными с точки зрения технологии спиртового производства энзиматическими характеристиками, однако, не используются в промышленности из-за невозможности получения соответствующих продуцентов. Таким образом, мутантные варианты Gap2 и СарЗ могут рассматриваться как основа для создания перспективных продуцентов пуллуланазы для использования в спиртовой, пищевой и крахмало-паточной промышленности.

Для обоих ферментов были определены N-концевые аминокислотные последовательности, оказавшиеся уникальными:

Фермент с массой 70 кДа SEAVAIVXY;

Фермент с массой 80 кДа GLSFPDVAAV.

Таким образом, применение метода инсерционного мутагенеза генов арг и gseBL, для изучения секреторного потенциала штамма В. licheniformis 103 позволило сделать следующие выводы:

- одиночная инактивация как гена глутамилэндопептидазы, так и щелочной протеазы блокирует систему секреции мажорных белков штамма, одновременно интенсифицируя секрецию минорных белков, и увеличивая их стабильность во внешней среде;

- инактивация генов мажорных секреторных ферментов позволила повысить их способность к синтезу пуллуланазного комплекса, состоящего как минимум из двух ферментов, один из которых обладает уникальной структурой и потенциальной ценностью для использования в промышленности.

впервые обнаружена способность штамма вида В. licheniformis к высокоэффективному синтезу нейтральной протеазы, проведена очистка и характеристика нового фермента.

4. Изучение роли гена wprA, кодирующего субтилнзнно-подобную протеиназу клеточной стснки у В. subtilis, В. amyloliquefaciens и В. licheniformis, в контроле продукции секреторных протеаз

Ранее в работе Margot &Kararaata (1996) был описан ген wprA из типового штамма В. subtilis 168. Этот ген, активно экспресирующийся в экспоненциальной фазе роста, кодирует полипептид с сигнальным пептидом массой 96 кДа. В ходе секреции за пределы цитоплазмы продукт трансляции wprh подвергается процессингу и превращается в два независимых белка с молекулярной массой 23 и 52 кДа, прочно связанных с клеточной стенкой. В составе предшественника эти белки располагаются в N- и С-концевой частях соответственно. При этом соединяющий их центральный пептид массой 20 кДа в процессе созревания подвергается деградации и не детектируется ни в цитоплазме, ни клеточной стенке, ни в культуральной жидкости бациллярных клеток. Белок с молекулярной массой 52 кДа -CWBP52 содержит структурные мотивы, сходные с субтилизииами Карлсберга и BPN', и обладает неспецифической протеазной активностью. Таким образом, 20 кДа-пептид можно считать аналогом активационного пропептида обычного секреторного субтилизина типа Карлсберг или BPN'. В рамках нашей работы были изучены эффекты инактивации гена wprA в промышленных штаммах-суперпродуцентах видов В. amyloliquefciens и В. licheniformis на продукцию щелочной и нейтральной протеаз, а также глутамилэндопептидаз GseBL и GseBI плазмидными продуцентами на базе В. subtilis.

При этом принималась в расчет рабочая гипотеза о возможном участии CWBP52 в деградации секретируемых белков при прохождении клеточной стенки. Таким образом, инактивация wprA должна была в первую очередь повысить продукцию тех белков, которые отличаются наименьшей устойчивостью к песпецифическому протеолизу или имеют кинетические ограничения в процессе секреции, связанные с необходимостью дефолдннга и фолдинга в толще клеточной стенки.

4.1. Направленная инактивации гена wprA путем нисерцнонного мутагенеза в В. subtilis, В. amyloliquefciens и В. licheniformis и изучение влияния мутации на физиологию клеток

5'-копцевой фрагмент гена wprA длиной 1650 п.н., соответствующий CWBP23 и пропептиду CWBP52, был успешно клонирован с помощью ПЦР с праймерами Wprl и Wpr2, подобранными на основе последовательности известного гена из В. subtilis 168 на матрицах геномной ДНК В. subtilis AJ73, В. amyloliquefaeeins ВКПМ В-1150 (промышленный продуцент нейтральной протеазы) и А50 (исходный штамм, использованный для получения промышленного плазмидного продуцента мезофильной а -амилазы) и В. licheniformis ВКПМ-В1951. Этот эксперимент показал наличие и достаточную консервативность гена wprA в

мезофнльных штаммах бацилл различных видов. Фрагмент, полученный из генома В. amyloliquefaceins ВКПМ В-1150, был секвеиирован и депонирован в Банке генов NCBI под номером AF533533. Этот фрагмент был далее расщеплен по природным сайтам рестриктаз, полученные концевые фрагменты были соединены с геном устойчивости к апрамицину. Далее полученной линейной конструкцией Wpr-Dl в виде продукта ПЦР трансформировали изучаемые штаммы В. amyloliqefaciens А50 и ВКПМ В-1150, В. subtilis AJ73 и В. lieheniformis ВКПМ-В1951, отбирая трансформантов по устойчивости к апрамицину в концентрации 40 мкг/мл. Клоны трансформантов пассировали на среде с антибиотиком, после чего верифицировали мутантный генотип, выделяя геномную ДНК, и используя ее для ПЦР с праймерамн Wprl и Wpr2. Полученные штаммы характеризовали по наличию протеазной активности субтилизипового типа, связанной с клеточной стенкой: общая протеолитическая активность препарата клеточной стенки протсазодефицитного штамма AJ73 в результате инактивации гена wprA упала в 20-400 раз. Анализ электрофореграммы полученного препарата клеточной стенки дизруптантов AJ73 и В. amyloliqefaciens В-1150 показал полное отсутствие в нем белка с молекулярной массой 52 кДа, являющегося мажорным компонентом в препарате клеточной стенки AJ73 и В-1150 дикого типа. Одновременно в обоих штаммах в результате мутации появился дополнительный мажорный белок с массой 57 кДа. Для белков с массами 52 и 57 кДа из обоих штаммов в диком и мутантном варианте были определены N-концевые аминокислотные последовательности белков, разделенных электрофорезом. Как и ожидалось, анализ показал соответствие последовательности 52 кДа белка из AJ73 и В-1150 дикого типа - ANDIQYPYQ- опубликованной N-концевой аминокислотной последовательности CWBP52 из В. subtilis. Неожиданным оказался тот факт, что белок 57 кДа из мутаитных вариантов AJ73 и В-1150 имел последовательность - XAKEIKFS идентичную шапероиу теплового шока GroEL В. subtilis (номер доступа в банке генов NCBI - М84965). Появление в препарате клеточной стснки обоих мутаитных производных белка теплового шока GroEL поставил вопрос о наличии в нем второго основного белка теплового шока -GroES. С этой целью было проведено секвепирование по Эдману мажорного белка массой ЮкДа из мутаптного варианта AJ73, отсутствовавшего в препарате диких штаммов. Как и ожидалось, появившийся в результате мутации белок имел N-концевую последовательность MLKPLGDR, точно соответствующую GroES В. subtilis (номер доступа в банке генов NCBI -М84965). Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о постоянной индукции синтеза шаперопов теплового шока в результате инактивации гена wprA у обоих изученных бациллярных штаммов. Необходимо отмстить, что белки GroEL и GroES, в норме формирующие комплекс в цитоплазме бактерий и не связанные с секрецией, были обнаружены нами во фракции белков, прочно связанных с препаратом клеточной стенки.

Столь заметный физиологический эффект, как постоянный ответ типа «тепловой шок», развившийся в клетках бацилл в результате инактивации гена wprA, как ожидалось, должен был сказаться на скорости роста культур, эффективности утилизации ими субстратов и спорообразовании. Однако экспериментальное определение этих параметров у мутаитных штаммов выявило отсутствие значительных различий со штаммами дикого типа. Для этого культуры штаммов высевали в начальной плотности 103к.о.е./мл в полную среду Леннокса и выращивали в одинаковых условиях при 37°С. Через 5 часов после начала эксперимента определяли содержание в среде живых клеток, а через 28 часов - их суммарную биомассу и количество сформировавшихся тсрмостабильных спор. Результаты проведенного эксперимента приведены в Таблице 4.

Таблица 4. Физиологические характеристики бациллярных штаммов с ипактивированным геном wprA_

В. subtilis AJ73 В. amyloliquefaciens 1150 В. lieheniformis 1951

wprA+ wprA' wprA+ wprA' wprA+ wprA"

Всего к.о.е./мл 5x10a 5x108 io'J 5x10s 10* 10"

Биомасса, мг/мл 122 125 210 205 191 199

Споры, к.о.е./мл 5x106 10" 5x108 5x108 5x10s 5xl08

4.2. Изучение эффекта ннактивацни гена wprA на продукцию секреторных ферментов В. subtilis, В. amyloliquefciens и В. licheniformis

Продемонстрировав отсутствие значимых дефектов роста у штаммов, несущих ноль-мутацию по гену wprA, были проведены эксперименты по изучению способности этих штаммов к продукции секреторных ферментов. При этом анализировали как изменение в экспрессии эндогенных хромосомных генов нейтральной протеазы (Npr) и щелочной протсазы (Apr) (Таблица 5), так и генов прг и gse, искусственно вводимых в составе плазмидных векторов (Таблицы 6 и 7). Ген прг вводился в составе двух различных плазмид: высококопийной pLF14 с устойчивостью к хлорамфениколу, снабженной дополнительно промотором гена wprA - pLF-Wpr-Npr, и низкокопийной рВА4 с устойчивостью к эритромицину, в составе которой ген прг эксперссировался под контролем собственного промотора - pBA4-Npr5. Гены gseBL и g.veBI вводили в составе конструкций на базе pLF14 с промотором гена кап. Всеми перечисленными плазмидными конструкциями параллельно трансформировали штамм В. subtilis AJ73 дикого типа и В. subtilis AJ73 (wprA").

Таблица 5. Изучение эффективности экспрессии эндогенных хромосомных генов прг (А) и арг (Б) у штаммов В. subtilis AJ73, В. amyloliquefaciens А50 и В-1150 и В. licheniformis В-1951. В ячейках таблицы приведены значения активности на мл (мкм субстрата, расщепленного в минуту при стандартных условиях).

А. Активность Npr по Dnp-Ala-Ala-Leu-Arg-NH2, ед./мл

B. subtilis AJ73 B. amyloliquefaciens A50 B. amyloliquefaciens B-1150 B. licheniformis 1951

20 час wprA+ 0.14 166 211 0

wprA" 2.45 758 890 0

24 час wprA+ 0.15 312 846 0

wprA" 1.95 801 1776 0

39 час wprA* 0.32 17.6 921 0

wprA" 0.39 710 1820 0

44 час wprA+ 0.4 25.6 -Г 331 0

wprA" 0.32 806 1744 0-

Б. Активность Apr по Z-Ala-Ala-Leu-pNA, ед./мл

B. subtilis AJ73 B. amyloliquefaciens A50 B. amyloliquefaciens B-1150 B. licheniformis 1951

20 час wprA+ 0.081 1.08 0 4

wprA" 0.84 3.84 0 33

24 час wprA+ 0.092 1.09 30

wprA" 0.90 3.90 - 40

39 час wprA+ 0.077 1.19 62

wprA" 0.081 4.81 - 97

44 час wprA+ . 0.064 0.06 0.23 48

wprA" 0.064 4.05 1.88 81

Таблица 6. Изучение эффективности экспрессии гена прг в штамме В. subtilis А173, введенного в составе конструкций рЬР-\Ург-Мрг и рВА4-Ырг5. Время культивирования штаммов - 24 часа. В ячейках таблицы приведены значения активности на мл (мкм субстрата,

Введенная конструкция Штамм В. subtilis AJ73

wprA* (дикий тип) wprA'

pLF 14 (исходный вектор) 0.40 0.32

pLF-Wpr-Npr 0.20 409

pBA4-Npr5 0.72: 26

Таблица 7. Изучение эффективности экспрессии генов и в штамме В. зиЫШя АЛЗ, введенных в составе конструкций на базе рЦ?14. В ячейках таблицы приведены значения активности на мл (мкм субстрата, расщепленного в минуту при стандартных условиях) по Z-Glu-pNA, ед./мл__

Введенная конструкция Штамм В. subtilis AJ73

wprA+ (дикий тип) wprA'

pLF14 (исходный вектор) 0 0

pLF14 + £.v<?BI 0.08 0.07

pLF14 + tf.Vé-BL 1.10 1.08

Представленные в таблицах 6 и 7 данные убедительно доказывают значительный эффект мутации в гене wprA на продукцию как щелочной, так и нейтральной протеазы. В случае наиболее активного промышленного продуцента нейтральной протеазы В. amyloliquefaciens В-1150 мутаитный штамм демонстрировал продуктивность в 2.3 раза выше родительского, достигнув уровня 1820 ед. активности на мл, что соответствует 1.5 г/л чистого фермента. Этот уровень в 2 раза превосходит достигаемый в среднем на предприятиях отечественной микробиологической промышленности. Уровень продуктивности штамма В. licheniformis 1951 по щелочной протеазе в оптимуме был превышен в 1.5 раза по сравнению с базовым вариантом, что доказывает перспективность введения мутации по гену wprA в промышленные штаммы-продуценты.

Еще больший в процентном выражении эффект от введения ноль-мутации по гену wprA был достигнут при тестировании продуцентов лабораторного уровня. Здесь эффект достигал величины 20-50 раз: в случае штамма AJ73, несущего плазмиду pLF-Wpr-Npr, где ген прг находился под контролем промотора wprA. Ile исключено, что этот результат объясняется снятием регуляции промотора wprA по принципу отрицательной обратной связи вследствие инактивации хромосомной копни wprA. Это наблюдение в дальнейшем использовалось нами для введения кассет, требующих активной транскрипции с внешнего промотора, непосредственно в структурную область гена wprA. При введении гена прг под контролем собственного промотора эффект был ниже, чем при использовании промотора wprA, однако, он позволил в 37 раз превзойти базовый уровень экспрессии той же конструкции в штамме В. subtilis дикого типа.

При исследовании влияния инактивации wprA на гены секреторных протеаз с невысоким базовым уровнем продукции - ар г у В. amyloliquefaciens В-1150 и А50, арг и прг у нерекомбииаптного В. subtilis AJ73 - также был обнаружен значительный положительный эффект, достигавший в среднем 2-4 раз. При этом соотношение активностей нейтральной и щелочной протеаз в культуральной жидкости мутантного штамма, как правило, несколько изменялось в пользу минорного компонента по сравнению с родительским вариантом.

Существенной особенностью штаммов, инактивированных по гену wprA, является более ранее начало секреции ферментов в ходе ферментации и существенное улучшение стабильности секретированных ферментов по окончании фазы активного синтеза. Этот эффект наиболее ярко проявился на примере продукции Npr штаммом А50: при ферментации в течение 44 часов падение активности в штамме дикого типа составило 12 раз, тогда как в штамме с мутацией по wprA падения активности не наблюдалось. Однако, то же явление наблюдалось в той или иной мере практически на всех других исследованных моделях. Механизм стабилизации секретированного фермента в результате инактивации wprA в клетках продуцента не может быть объяснен в строгих терминах, поскольку механизм деградации секретированного во внешнюю среду клетками остается неизвестным. Однако, необходимо заметить, что начало интенсивной деградации секретированного фермента всегда совпадает с началом лизиса бациллярных клеток. Удаление клеток из КЖ до начала лизиса полностью стабилизирует целевой продукт, тогда как их отделение после начала лизиса может лишь в той или иной мере замедлить его распад.

Несмотря на значительность эффекта инактивации wprA в случае генов пгр и арг, этот эффект ни в какой степени не коснулся экспрессии генов gseBL и gseBI. Этот результат не вполне согласуется с выдвинутой начальной гипотезой относительно механизма действия продуктов wprA на секретируемые белки, поскольку устойчивость Gse к неспецифическому протеолизу in vitro значительно ниже, чем нейтральной и, особенно, щелочной протеазы.

5. Изучение структуры и механизма процесспнга предшественников секреторных протеиназ бацилл in vitro

5.1. Получение предшественника металлопротсиназы Brevibacillus brevis н изучение структурно-функциональных отношений в его молекуле

Получение секреторных бактериальных протеиназ в виде их неактивных предшественников - нестандартная методическая задача, требующая разработки специальных подходов. Использование для этой цели бациллярных систем исключается вследствие быстрого процесспнга профермента до зрелой формы. Экспрессия генов предшественников протеиназ в штаммах Е. coli или других грам-отрицательных бактериях почти всегда приводит либо к накоплению предшественника в виде тел включения, что влечет за собой дополнительные проблемы, связанные с их ренатурацней, либо к процессннгу предшественника с образованием зрелого фермента. Поэтому необходимо было разработать систему, позволяющую получать предшественники бактериальных протеиназ в натнвиой непроцессированной форме.

Экспрессия гена предшественника металлопротсиназы В. brevis (прг) в Е. coli н анализ полученных продуктов. Внеклеточная металлопротеиназа термофильной бактерии В. brevis (Npr) синтезируется в виде препрофермента с большим пропептидом, состоящим из 195 а.о. Полноразмерный ген прг, кодирующий препрофермент Npr, был клонирован в клетках Е. coli под контролем термоиндуцибелыюго промотора фага X. Выбор мезофильной бактерии Е. coli в качестве хозяина для экспрессии был основан на предположении, что получению стабильного нативного предшественника может способствовать снижение температуры роста с 60°С, используемой для ферментации термофильного природного продуцента металлопротеиназы, до 37°С. При анализе клеточных лизатов методами SDS- электрофореза и Вестерн-блоттинга оказалось, что значительная часть синтезированного рекомбинантного белка находится в растворимой внутриклеточной фракции, несмотря на достаточно высокий уровень продукции (-5% от общего клеточного белка). При этом, находящаяся в клеточных экстрактах металлопротеиназа была обнаружена как в форме профермента (Мг~60 кДа), так и в зрелой форме (М,~35 кДа), что свидетельствует о частичной активации предшественника. Кроме того, в клеточных экстрактах присутствовал белок с Мг-25 кДа, который предположительно мог соответствовать пропептиду, образующемуся в результате процессинга предшественника до зрелого фермента.

Очистка и разделение полученных компонентов. В качестве первой стадии для очистки Npr от белков Е. coli и разделения полученных компонентов была использована аффинная хроматография на грамицидин-агарозе (рис. 4А), которая ранее применялась для выделения Npr В. brevis из природного продуцента. В ходе хроматографии установлено, что эффективность сорбции предшественника и пропептида Npr была значительно выше, чем у зрелой формы. В результате хроматографии на грамицидин-агарозе были получены фракция «а», содержащая практически чистый зрелый фермент, и фракция «б», содержащая преимущественно предшественник и пропептид с небольшим количеством зрелого фермента.

Благодаря существенному различию молекулярных масс компоненты фракции «б» удалось разделить методом гель-фильтрации на колонке Superdex 75 HR в системе FPLC. Необходимо отметить, что в ходе хроматографии обнаружена склонность компонентов образовывать комплексы в составе пропептид-зрелый фермент и пропептнд-предшественник. Чтобы ослабить эти взаимодействия и увеличить эффективность разделения использовались растворители с высокой ионной силой (0.5-2.0 М NaCI), содержащие 25% изопропанола. В результате хроматографии в указанных условиях были получены в индивидуальном состоянии

предшественник Npr, зрелый фермент и пропептид, что было подтверждено данными SDS-электрофореза. Фракция 2, содержащая зрелую форму Npr, проявляла специфическую активность по синтетическому субстрату Dnp-Ala-Ala-Leu-Arg-NH2 (330 ед. акт. / А280)

Определение молекулярной массы профермента Npr. При определении молекулярной массы предшественника методом эксклюзионной хроматографии на колонке Superose 12 (FPLC) оказалось, что в использованных условиях (50 мМ трис-HCl рН 7,2, содержащий 1 М NaCl и 1 мМ CaCh) профермент Npr элюируется в виде димера с Мг~110кДа. Тот факт, что в присутствии 25%-ного нзопропанола профермент не образовывал димера, а элюировался в виде мономера, позволяет предположить, что стабилизация взаимодействий внутри димера происходит с участием гидрофобных контактов. Способность профермента Npr образовывать димеры, возможно, отражает некую структурно-функциональную особенность проферментов вообще, поскольку для просубтилизина Е также была обнаружена способность к димеризации.

Пропептид Npr - сильный ингибитор собственного зрелого фермента. Исходные клеточные лизаты Е. coli, содержащие по данным иммуноферментного анализа и ссквснпровання правильно процессированный зрелый фермент, тем не менее, не проявляли металлоэндопептидазной активности. Это могло объясняться ингибирующим действием пропептида, образующегося в результате процессинга предшественника, на собственный зрелый фермент.

Нагревание клеточного экстракта при 65°С в течение 15 мин. приводило к появлению металлоэндопептидазной активности и исчезновению пропептида. Видимо, при повышенной температуре происходит диссоциация комплекса пропептид-зрелый фермент с последующей денатурацией и деградацией пропептида, что и приводит к высвобождению активности.

Кинетические параметры ингибирования были определены на очищенных фракциях пропептида и зрелого фермента с использованием Dnp-Ala-Ala-Leu-Arg-NH2 в качестве субстрата. Оказалось, что пропептид ннгибирует зрелый фермент, находясь практически в стехиометрнческих концентрациях с последним, что свидетельствует о том, что в данном случае мы имеем дело с так называемым "tight-binding" ингибированием и для кинетического анализа вынуждены использовать особую модель, отличную от модели Михаэлиса-Мептен. Ингибирование является конкурентным и характеризуется следующими параметрами:

К„, = 0.6 +/-0.2 мМ, = 0.17 +/-0.03 нМ,

ксц, = 3800 +/-500 мин"1 (63 +/-9 сек"1). Таким образом, пропептид Npr В. brevis является одним из сильнейших пропептидных ингибиторов, известных и описанных в литературе к настоящему времени (таблица 9).

Таблица 9. Ингибирование зрелых протеиназ собственными пропептидами.

Фермент Константа ингибирования, 11M Тип ингибирования

субтилизин Е 2000 Конкурентное

протеаза IV из папайи 860 НО

Термолизин 6.0 Смешанное

Нейтральная протеаза из A. fumigatus 3.0 НО

карбоксипептидаза А 2.0 Конкурентное

Папанн 1.89 НО

субтилизин BPN' 1 Конкурентное

катепсин В 0.4 НО

Нейтральная протеаза из В. brevis 0.17 Конкурентное

а-литическая протеаза 0.1 Конкурентное

НО - не определялось

Специфичность нпгибировапня. Ингибирование является высоко специфичным, так как значение IC50 для ингибирования пропептидом Npr гетерологичной металлопротеиназы из В. megaterium было в 16 раз выше, чем в случае гомологичного фермента (12.5 нМ и Q.8 нМ соответственно), в то время как термолизин совсем не ингибировался пропептидом Npr В. brevis.

Таким образом, можно предположить, что именно благодаря такому сильному взаимодействию пропептида Npr с собственным зрелым ферментом, особенно выраженному при снижении температуры с 60°С до 37°С, зрелый фермент оказывается связанным в неактивный комплекс с пропептидом и реакция самоактивации профермента в клетках Е. coli протекает медленно. Подобное замедление активации предшественника, по какому бы механизму оно не осуществлялось (аутопроцессннг или активация внешними протеиназами), позволяет получить предшественник Npr в непроцессированнон, пативной форме.

5.2. Получение предшественника глутамилэндоиептидазы В. licheniformis 11 изучение его процессии га in vitro

5.1.x. Получение предшественника GseBL в клетках Е. coli

Во многих экспериментальных работах для экспрессии рскомбинантных белков используются клетки Е. coli. Этот подход удобен тем, что для данного микроорганизма разработаны удобные генноинженерные системы клонирования и экспрессии генов, что обычно позволяет получить достаточное для исследований количество рекомбинантного продукта. Продуктивность клеток может достигать порядка 200 мг белка на литр культуральной жидкости. Однако ввиду неспособности к истинной секреции белков у клеток Е. coli, высокой мощности и достаточной изученности их трансляционной и транскрипционной систем при достижении хорошего уровня экспрессии рскомбннантные белки зачастую образуют денатурированные гидрофобные агрегаты внутри клетки. Для изучения структурно-функциональных свойств ферментов требуется разработать способ их получения в нативном виде и очистки, что зачастую является достаточно сложной технической задачей. Для экспрессии модифицированного гена gseBL в клетках Е. coli был использован экспрессионный вектор pET23d. С использованием пары праймеров Blp-tra2 и Blp-rev, специфичных к началу про-части и Зч-нетранслируемой области гена g.veBL (соответственно), была проведена модификация гена протеазы. С целью оптимизации экспрессии гена предшественника GseBL в Е. coli он был лишен собственного промотора и 5*-концевого участка, кодирующего секреторный пептид (пре-часть) (рис. 4). Полученная в результате конструкция pET-npo-GseBL содержала ген, кодирующий GseBL в виде не способного к секреции предшественника. Отсутствие мутаций после ПЦР проверяли определением нуклеотидной последовательности клонированного гена.

Полученная конструкция pET-npo-GseBL была введена в клетки экспрессионного штамма Е. coli BL21 (DE3). В качестве отрицательного контроля для экспериментов использовали тот же штамм Е. coli, несущий вектор pET23d без вставки. Для получения тел включения GseBL ночную культуру клеток штамма-продуцента индуцировали добавлением IPTG, клетки отделяли от среды центрифугированием и использовали в качестве источника целевого белка.

Предшественник GseBL, не содержащий секреторного пептида, экспрессировали в клетках Е. coli. Суммарный клеточный белок анализировали методом электрофореза в ПАЛГ с SDS. По данным электрофореза, выход целевого продукта с молекулярной массой 31 кДа составлял до 20% от суммарного клеточного белка.

После разрушения клеток Е. coli ультразвуком npo-GseBL был обнаружен в нерастворимой фракции. Обогащение тел включения путем многократной отмывки в буферных растворах, содержащих сахарозу и хлористый натрий, позволило получить препарат, содержащий не менее 80% npo-GseBL. Полученный таким образом белок растворяли в денатурирующих условиях и подвергали рснатурации.

Количество белка в полученных растворах оценивали по данным спектрофотомерии при длине волны 280 им. По этим данным выход суммарного белка после рснатурации

предшественника GseBL составил около 40%. В растворах исследуемого белка после ренатурации была обнаружена незначительная ферментативная активность по субстрату Z-Ala-Ala-Met-Glu-pNA.

Ренатурированный npo-GseBL активировали обработкой субтилизином, химотрипсином и термолизином. В результате ограниченного протеолнза предшественника наблюдался его количественный переход в зрелую форму с молекулярной массой 23.5 кДа.

Ферментативная активность полученного при активации препарата зрелого фермента GseBL измерялась по хромогенному субстрату Z-Ala-Ala-Met-Glu-pNA. Удельная активность GseBL составила 0.31 ед.акт./мг белка. Наличие протсолитической активности говорит о нативности третичной структуры полученного зрелого фермента, а количественный выход зрелого белка после протеолиза подтверждает нативность третичной структуры ренатурированного предшественника npo-GseBL.

Таким образом, показана возможность получения нативного предшественника глутамилэндопептидазы npo-GseBL путем ренатурации из тел включения, образующихся при экспрессии в клетках Е. coli. Ренатурированный предшественник не подвергается спонтанной активации, что может служить указанием на существование внешних контрольных механизмов, обеспечивающих запуск процессинга природного предшественника GseBL при созревании in vivo.

Создание рскомбннантной экспрессионной системы для непосредственного получения предшественника GseBL в нативнон форме в L-формах P. mirabilis

На примере металлопротеиназы В. brevis стало очевидным, что для получения секреторной протеиназы в форме предшественника необходимо снизить вероятность запуска каскадного механизма аутопроцессинга профермента. С этой точки зрения удобным подходом к получению ферментов в виде их неактивных предшественников было бы использование для создания рекомбинантных экспрессионных систем таких протеиназ, чьи предшественники не способны к аутоактивации.

Глутамилэндопептидаза В. licheniformis (GseBL), являющаяся представителем недавно открытого и немногочисленного подсемейства глутамил-специфичных сериновых протеиназ, вследствие своей узкой субстратной специфичности и полного несоответствия сайта процессинга профермента (Lys-Ser) специфичности глутамилэндопептидаз, выглядит удобным объектом для получения этого фермента в виде предшественника. Наши предварительные попытки получить предшественник GseBL в Е. coli привели к образованию тел включения даже при достаточно низком уровне синтеза фермента.

В качестве альтернативного варианта объектом для трансформации были выбраны L-формы Proteus mirabilis. Лишенные клеточной стенки и внешней мембраны клетки L-форм грам-отрицательных бактерий позволяют сочетать хорошо разработанные для Е. coli системы клонирования, контроля транскрипции и трансляции с возможностью выводить белок в среду культивирования. В случае секреторных бациллярных протеиназ это позволяет не только защитить клетки продуцента от протеолиза, но и улучшить условия формирования третичной структуры протеиназ, приблизив их к естественным. Кроме того, незначительная по сравнению с бациллами протеолитическая активность L-форм P. mirabilis увеличивает шансы получения предшественников бациллярных протеиназ, быстро процессируемых эндогенными протеиназами в большинстве доступных клеточных систем.

Конструирование модифицированного гена gse BL и анализ продуктов его экспрессии. На базе стандартного вектора для экспрессии с lac-tac промотором (pSIS2) были получены две конструкции, несущие модифицированный ген g.vtBL. Модификация заключалась в том, что собственный лидерный препептид бациллярной протеиназы, не приспособленный для секреции в грам-отрицательном хозяине, был заменен либо на лидер щелочной фосфатазы (рис. 4) Е. coli, либо на лидер стафнлокиназы Staphyllococcus aureus, которые, как было показано ранее, функциональны в клетках L-форм грам-отрицательных бактерий.

PhоАпропептидзрелый

V.'KWfWI'ÍVÍV,1!

...SIKSVI...

трипсин;

Gse В. intermedium

...■/.■.i модифицированный *"' ген g.veBL

экспрессия

С

предшественник, ЗОкДа, нет самоактивации

активация m vitro

термолизин субтилизин

металлопротеиназа В. megaterium

24кДа

Рисунок 4. Получение предшественника глутамилэндопептидазы tí. licheniformis в L—формах P. mirabilis и его активация in vitro

После оптимизации условий экспрессии указанных выше модифицированных генов в клетках L-форм P. mirabilis оказалось, что оба лидерных препептида с равной эффективностью способны обеспечивать секрецию GseBL в культуральную жидкость L-форм в виде неактивного профермента (М,-30кДа), как это следует из данных иммуноблоттинга. Предшественник GseBL был вполне стабилен при физиологических условиях и не проявлял тенденции к образованию зрелой формы или деградации даже при длительной инкубации в культуральной жидкости L-форм.

Активация in vitro профермента GseBL. Полученные результаты свидетельствуют о том, что предшественник GseBL, в отличие от предшественников других протеиназ -субтилнзина, термолизина, а-литической протеиназы, не способен к аутоактивацни, что, вероятно, и позволило получить его в непроцессированной форме. Это дает основания предположить, что in vivo профермент GseBL активируется внешними протеиназами. Мы проверили действие некоторых из них на полученный предшественник. Оказалось, что профермент GseBL эффективно процессируется с образованием зрелой формы (М, ~24кДа) под действием субтилизина, термолизина, металлопротеипазы В. megaterium (мегатерии). В то же время, трипсин, специфичность которого в точности соответствует природному сайгу процессинга профермента GseBL, и глутамилэндопептидаза В. intermedius (GseBI), сходная с GseBL по своим энзиматическим характеристикам, оставляют предшественник интактным.

Эти результаты позволяют, во-первых, подтвердить нативность третичной структуры полученного предшественника, а, во-вторых, получить еще один аргумент, доказывающий невозможность в данном случае механизма аутокаталитической активации. А именно такой механизм был предложен ранее для глутамилэндопептидазы Streptomyces griseus и претендовал на универсальность для всех представителей этого подсемейства.

Очистка активированного GseBL. Для подтверждения того, что профермент GseBL, полученный с помощью рекомбинантной экспрессионпой системы в культуральной жидкости L-форм P. mirabilis, имеет нативную структуру, необходимо было доказать наличие ферментативной активности у зрелого GseBL, образующегося в результате активации профермента. Для этого проводилась очистка активированного мегатернном GseBL на бацитрацин-сефарозе - аффинном сорбенте, широко применяемом для очистки протеиназ вообще и глутамилэндопептидаз в частности. Это позволило нам, во-первых, избавиться от примесей пигментов и неспецифических белков, содержащихся в культуральной жидкости L-форм P. mirabilis, а во-вторых, отделить активированный зрелый GseBL от активирующей протеиназы, которая могла препятствовать измерению активности. Фракция GseBL,

полученная в результате хроматографии на бацитрацин-сефарозе, обнаруживала единственную иммуноположительную полосу (-24кДа), соответствующую зрелой форме, и проявляла специфическую активность к синтетическому субстрату 7-А1а-А1а-Мс1-С1и-рМЛ (рис. 5), соответствующую активности СэеВЦ выделенной из природного продуцента.

предшественник GseBL, обнаруженный в культуральнои _жидкости P. mirabilis, 30 кДа

зрелая форма GseBL, 24 кДа

очищенный зрелый фермент GseBL, специфически гидролизующий Z-Ala-Ala-Met-GIu-pNA

мегатерии; ...............................

пептиды среды; t-.-.Ñ-.-.ч-:■:■;■■*■•••'■'■''■•.•■•■■'•■■■^■■•■•I

нигмешы

• Рисунок 5. Схема активации in vitro предшественника GseBL и выделение зрелого фермента.

Продукция GseBL в отсутствие пропептида. С целью изучения роли пропептида GseBL в формировании функционально активного зрелого фермента in vivo, на базе вектора pSIS2 были созданы конструкции, в которых гетерологичные препептиды щелочной фосфатазы Е. coli или стафилокиназы S. aureus были непосредственно соединены с последовательностью, кодирующей зрелый фермент GseBL. Подобные конструкции, несущие модифицированный ген g.veBL, были введены в штамм L-форм P. mirabilis. В этом случае, при оптимальных условиях экспрессии, разработанных ранее для профермента GseBL, ни в клетках, ни в культуральной жидкости L-форм не было обнаружено продукции специфического белка. Подобный результат может отражать существенную роль пропептида GseBL в фолдинге или секреции фермента.

5.3. Изучение функций пропептида карбоксипептндазы 'Г Thermoactinomyces vulgaris путем делециопного анализа

Конструирование и зкспрсссия модифицированного гена cpt. Поскольку фолдирующая роль пропептидов в литературе часто постулируется как основная и универсальная для секреторных бактериальных протеиназ, было интересно проверить этот аспект еще на одном представителе семейства Bacillaceae - карбоксипептидазе Т Т. vulgaris (СрТ). Этот фермент, сочетающий ферментативную активность карбоксипептидаз А и В животных, обладает, тем не менее, достаточно низкой удельной активностью, что делает СрТ неагрессивной в отношении производящих ее клеток и облегчает ее получение в различных экспрессионных системах.

СрТ, как и другие бактериальные протеиназы, синтезируется в виде предшественника, в котором препрочасть составляет 98 а.о. Нами был сконструирован модифицированный ген

активация мегатерином

хроматография на бацитрацин-сефарозе

cpt. Основное его отлнчие от природного состояло в том, что собственный лидерный препептид СрТ был заменен 'на лидер щелочной фосфатазы Е. coli, а последовательность, кодирующая пропептнд, практически полностью удалена, за исключением последних семи а.о. (в С-концевой части пропептида), которые служили своеобразным линкером между гетерологичным препептидом и последовательностью, кодирующей зрелую СрТ (Рис. 7). Конструкция, содержащая такой модифицированный геи, была введена в штамм L-форм P. mirabilis. В результате оптимизации условий экспрессии рекомбшгаптного гена, СрТ была получена в секреторной форме в количестве 10-50 мг/л.

Очистка и характеристика продукта экспрессии модифицированного гена cpt. Очистку рекомбннантного белка проводили согласно схеме (Рис. 8), с использованием иммуносорбента, содержащего иммобилизованные на ссфарозе антитела к СрТ. Секвепирование по Эдману очищенной СрТ показало, что белок секретировался в виде зрелого фермента с небольшим (7 а.о.) фрагментом пропептида, содержащимся в исходной конструкции (Рис. 7). Для проверки нативности третичной структуры полученной СрТ препарат обрабатывали протеолитическими ферментами трипсином и субтилнзипом (рис. 8). Оказалось, что секреторная форма СрТ устойчива к действию трипсина, в то время как субтилизин приводит к образованию истинно зрелого фермента, идентичного по N-копцсвой аминокислотной последовательности природному.

Рисунок 7. Картирование сайта процссснга субтнлнзином продукта экснрссснп гена cpt it /'■ mirabilis.

2.GDTSL-TQDFP

3.DFPSYDSXYXNYNXM

1. Теоретически предсказанная аминокислотная последовательность модифицированной СпТ (Двойным подчеркиванием отмечена последовательность пре-пептида PhoA до сайта процсссимга, однократно подчеркнута последовательность С-концсвого фрагмента про-пептнда СрТ, стрелкой отмечен сайт естественного процсссинга про-пептида.^

2. Экспериментально определенная последовательность секреторной формы СрТ из 1 ,-<Ьорм P. mirabilis.

3. Последовательность истинно зрелой СрТ. полученной после in vitro процессинга субтилнзином.

Рисунок 8. Схема выделения карбоксипептидазы Т из культуральпоп жидкости L-форм Proteus mirabilis.

Активность по синтетическому пептидному субстрату

Dnp-Ala-AIa-Arg-OH = 6 сд. акт./Агво

Удельная активность секреторной и истинно зрелой форм СрТ по специфическому пептидному субстрату Drip-Ala-AIa-Arg одинакова (6 ед. акт. / A2so) и сравнима с удельной активностью карбоксипептидазы Т T. vulgaris, выделенной из природного продуцента (16 ед. акт. / Агво). Этот факт, вероятно, можно расценивать как доказательство того, что 7-членный С-концевой фрагмент пропептида в секреторной форме СрТ вряд ли можно рассматривать как аналог полноразмерной прочасти и приписывать ему какую-то роль в формировании нативной третичной структуры полученного функционально активного фермента.

Таким образом, на базе L-форм P. mirabilis нами сконструирован продуцент СрТ, позволяющий получить активный зрелый фермент в отсутствие полноразмерного пропептида. Полученная СрТ обладает нативной структурой, что отличает ее от других секреторных протеаз бактерий семейства Bacillaceae, пропептиды которых абсолютно необходимы для принятия зрелым белком естественной конформации.

6. Разработка промышленных продуцентов секреторных ферментов на базе бацилл с

использованием генов-регуляторов секреторного аппарата 6.1. Нейтральная протеаза Bacillus megaterium

В. megaterium ВКПМ В-3937 и ряд генетически родственных ему штаммов на протяжении ряда лет использовались в качестве основы для селекционной работы но созданию продуцентов высокоочищенной нейтральной протеазы промышленного назначения. В отличие от большинства известных промышленных продуцентов этого фермента на основе В. arnyloliquefaciens, В. megaterium В-3937 синтезировал нейтральную протеазу без примеси щелочной протеазы. Для сравнения, такие препараты нейтральной протеазы бациллярного происхождения, как Протосубтилин (АО «Восток») и Neutrase (Novozymes) содержат 6 и 4% щелочной протеазы от массы основного фермента, тогда как в препарате Мегатерии на основе В. megaterium В-3937 содержание щелочной протеазы не превышало 0.008%.

Необходимо отметить, что наличие примесной активности щелочной протеазы не снижает эффективности препаратов нейтральной протеазы в традиционных для него сферах применения: комбикормовой промышленности, подготовке сырья для спиртового брожения, в хлебопечении и пивоварении. Именно по этой причине разработчики штаммов долгое время не уделяли внимания наличию в получаемых препаратах нейтральных протеаз примесных активностей.

Разработка промышленных технологий, основанных на Мегатерине, поставила вопрос о направленном повышении эффективности штамма-продуцента, которая на момент начала настоящей работы составляла 300-500 мг/л КЖ, и существенно уступала продуцентам на основе В. arnyloliquefaciens — 900-1500 г/л. Традиционно повышение продуктивности бациллярных продуцентов протеаз основано на отборе наиболее эффективно спорулирующих линий, однако, этот подход оказался не применим к В. megaterium В-3937, для которого природная олигоспорогенность оказалась жестко сцепленной с подавленным синтезом щелочной протеазы: отбор спорогенных мутантов В. megaterium В-3937 приводил к резкому подъему уровня синтеза щелочной протеазы, что сводило на нет целесообразность дальнейшей селекционной работы.

Поэтому для повышения продуктивности В. megaterium В-3937 был применен метод направленного воздействия на гены, потенциально участвующие в контроле синтеза нейтральной проетазы. Всего было апробировано три различных подхода: (1) повышение копийности гена мегатерина путем введения его в гомологичный штамм на интегративных векторах, 0- и а-реплицирующихся плазмидах; (2) изменение и диверсификация промоторной регуляции экспрессии структруного гена и (3) воздействие на регуляторпые гены, влияющие на процесс споруляции и секрецию белков.

Клонирование структурного гена мегатернна (нргВМ) и создание мультикопнимых вариантов продуцентов

С целью клонирования структурного гена мегатерина была предпринята попытка провести его ПЦР-амплификацию, воспользовавшись в качестве основы для создания

праймеров последовательностью гена пргМ из В. megaterium DSM319 (номер доступа в банке генов NCBI Х75070). Однако, при использовании в качестве матрицы геномной ДНК В. megaterium В-3937 продукт ПЦР получить не удалось, что, по-видимому, свидетельствует о значительных различиях в последовательностях генов нейтральных протеаз штаммов DSM319 и В-3937. Поэтому далее клонирование гена прг из штамма В-3937 проводилось путем скрининга экспрсссирующегося полиогеномиого банка с помощью вектора рСВ20 в штамме-хозяине В. subtilis AJ73, дефицитном по протеолитической активности. После частичного расщепления хромосомной ДНК В-3937 рестриктазой АгыЗА, лигирования с вектором и транмеофрмации по Спизайзену было получено более 104 независимых клонов, которые тестировались по способности формировать зоны просветления на молочном агаре. В результате было отобрано 11 клонов, которые далее проверялись на наличие повышенной активности секретируемой нейтральной протеазы в КЖ с помощью определения активности по специфическому субстрату DNP-Ala-Ala-Arg-NH2- В результате был отобран один клон, несший вставку размером 5.5 т.п.н. и продуцировавший до 50 мг/л нейтральной протеазы при культивировании па среде Леинокса. В дальнейшем отобранная плазмида рМ11 использовался в качестве источника гена мегатерина (лргВМ).

Попытка непосредственного введения рМ11 в гомологичный штамм В. megaterium В-3937 привела к увеличению его продуктивности при выращивании на среде ДПС (1% кукурузной муки, 1% парафиновых дрожжей БВК, 0.1% СаСОз) течение 30 часов в среднем с 300 до 400 мг/мл, что не позволяло рассматривать штамм В-3937 (рМ 11) в качестве перспективного варианта промышленного продуцента. Кроме того, при храпении в течение более 2 недель этот штамм утрачивал даже то небольшое преимущество относительно базового варианта, которое имел. Поэтому в дальнейшем он непосредственно не использовался.

Клонированная вставка с геном пргВМ была подвергнута минимизации: отобранные субклоны pLF-NprBMl, pLF-NprBM2 и pLF-NprBM3 несли вставки размером 3.5, 2.5 и 4.1 т.п.н. соответственно и продуцировали до 15, 250 и 180 мг/л нейтральной протеазы при культивировании на среде Леннокса. Трансформация плазмиды pLF-NprBM2 в гомологичный штамм В. megaterium В-3937 привела к увеличению его продуктивности при выращивании на среде ДПС в течение 30 часов в среднем до 850 мг/мл, что позволяло рассматривать штамм В-3937 (pLF-NprBM2) в качестве перспективного варианта промышленного продуцента.

Тем не менее, ферментации штамма В-3937 (pLF-NprBM2) в условиях ферментера объемом 1 л давали недостаточно воспроизводимые результаты. Поэтому была предпринята попытка получения хромосомного варианта мультикопийного продуцента. С использованием в качестве матрицы плазмидной ДНК pLF-NprBM2 и стандартных праймеров к pLF14 была проведена ПЦР-амплификация ДНК вставки вместе с маркером лекарственной устойчивости к хлорамфениколу. Полученный фрагмент ДНК расщепляли по фланкирующим сайтам и лигировали с фрагментами хромосомной ДНК В. megaterium В-3937. Лигазной смесью методом регенерации протопластов трансформировали В. megaterium В-3937 и отбирали клоны с повышенной продукцией протеазы на молочном агаре с хлорамфениколом. В результате было отобрано 7 независимых клонов, лучший из которых при выращивании на среде ДПС в течение 30 часов секретировал в среднем до 950 мг/мл, что позволяло рассматривать этот штамм, получивший название D7, в качестве перспективного варианта промышленного продуцента. Ферментации этого штамма на среде ДПС отличались высокой воспроизводимостью, в том числе, при использовании в качестве посевного материала культуры, хранившейся на скошенном агаре в течение нескольких месяцев.

Таким образом, в результате проведенных манипуляций удалось получить стабильный бесплазмидный продуцент Мегатерина, в 3 раза превосходивший базовый вариант по продуктивности.

Разработка штаммов-продуцентов мегатерина путем воздействия на регулиториые гены

Дня повышения выхода Мегатерина был использован принцип регуляторных путей, предположительно, контролирующих работу промотора структурного гена, фолдинг,

секрецию и созревание продукта. С этой целью было применено два подхода: создание мультифункциональных кассет, предназначенных для суперэкспрессии известных регуляторных генов (преимущественно, извлеченных из В. хиЫШх), а также скрининг геномного банка В. тадеиепит на наличие эндогенных регуляторных генов.

Схема направленного воздействия на систему регуляции экспрессии пргВМ заключалась в создании двух линейных кассет, предназначенных для введения генов (¿едК, ¡епА, и

с/е^и в локус, несщий хромосомной ген \vprA. При этом кодирующая область гена кргА замещалась на искусственный оперон, который приобретал при этом возможность транскрибироваться с промотора \vprA. Схемы полученных конструкций гг^Т и гг^О приведены на рис. 9.

Рисунок 9. Схемы линейных интегративных конструкций megT и megD, предназначенных для введения генов «fe^R (L77246.1 Gl: 1256615), tenA (М73546), deglí и degS (U56901) в локус wprA В. megaterium В-3937. Черным отмечены последовательности плечсй, соответствующих 5'-некодирующей и З'-концевой части кодирующей областей гена wprA. Маркерные гены лекарственной устойчивости к апрамицину (Агак) и эритромицину (orfß) выделены штриховкой. Промоторы в составе кассет обозначены стрелками.

Была проведена амплификация перечисленных генов с использованием в качестве матрицы геномной ДНК В. subtilis 168 и специфических праймеров, подобранных на основании опубликованных последовательностей. Кассета megD была собрана путем последовательного парного лигирования каждого из исходных ПЦР-продуктов промотор wprA — degR - tenA и маркера устойчивости к апрамицину. Кассета изначально вводилась трансформацией по Спизайзену в В. subtilis AJ73 с отбором трансформантов на среде с апрамицином.

Сборка кассеты megT проводилась in vivo путем котрансформацни по Спизайзену двух частей в составе (1) промотор wprA - degR - tenA- AraR и (2) Ara - degS/degV -EryR- wprA в штамм В. subtilis AJ73 с отбором трансформантов на среде с апрамицином и эритромицином.

ДНК штаммов В. subtilis AJ73(megD) и В. subtilis AJ73(megT) была выделена в препаративных количествах, проконтролирована на интактность интегрированных кассет путем ПЦР с перекрестно отжигающимися праймерами на различные составные части кассет и далее использовалась в качестве источника megT и megD при трансформации В. megaterium В-3937.

В результате введения кассет в штамм-продуцент Мегатерина дикого типа были получены производные В. megaterium В-3937 (megD) с продуктивностью 850 мг/л и В. megaterium В-3937 (megT) с продуктивностью 950 мг/л. Далее эти штаммы использовались в качестве реципиентов для введения интегративных конструкций с клонированным геном лргВМ из штамма D7 (трансформация была проведена с использованием геномной ДНК D7 в штамм) В. megaterium В-3937 (megT). В результате был получен штамм с продуктивностью D7 (megT) 2200 мг/л при культивировании в среде ДПС в течение 32 часов.

Далее был проведен эксперимент по клонировнию генов эндогенных активаторов синтеза нейтральной протеазы из В. megaterium В-3937. Для этого путем клонирования частично расщепленной Sau3A.\ геномной ДНК В. megaterium В-3937 на базе плазмиды pLF14 был сконструирован геномный банк генов, которым трансформировали штамм В. subtilis AJ73 (pMI 1). Выше было упомянуто, что плазмида рМ11 с полноразмерным геном пргВЫ в составе вставки размером 5.5 т.п.н., будучи введена в В. subtilis AJ73, обеспечивала продукцию 230

5 мг/л нейтральной протеазы. Основанием для выбора столь низкопродуктивного штамма в качестве реципиента для скрининга банка генов В. megaterium В-3937 послужило, в первую очередь, то обстоятельство, что увеличение продукции на фоне низкого базового уровня легко визуализировалось в чашечном тесте по увеличению изначально небольших зон гидролиза казеина на чашках Петри с молочным агаром. Кроме того, штамм В. ¿ubtilis AJ73 при трансформации по Спицайзену позволял получать значительно большее число колоний, чем В. megaterium В-3937 - при трансформации по методу регенерации протопластов. Таким образом, скрининг банка был основан на активации работы клонированного гена пртВМ в составе вектора рСВ20 в протеазодефицитном штамме В. subtilis AJ73.

В результате скрининга 5000 независимых колоний, устойчивых к эритромицину и хлорамфениколу, удалось выделить один клон, обладавший продуктивностью на уровне 5070 мг/л. Его тотальной геномной ДНК был трансформирован штамм Е. coli, из которого затем была выделена чистая ДНК pLF14, несущая вставку около 4 т.п.н. Отобранная таким образом плазмидная конструкция получила название pLF-Xl.

При введении pLF-Sl в штамм В. megaterium В-3937 (megT) с отбором по устойчивости к хлорамфениколу был получен штамм В-3937 (mcgT, pLF-Sl) с продуктивностью по Мегатерину 1400 мг/л.

Создание итогового варианта штамма-продуцента Мегатсрпна

В результате реализации описанных выше схем конструирования и скрининга были отобраны следующие наиболее преспективные элементы (Рис. 10):

(1) интегрированная копия структурного гена пргВМ с собственным промотором, (маркер CmR) - штамм D7;

(2) интегрированная копия структурного гена пргВЪЛ с измененным промотором, (маркер CmR) - штамм Т1;

(3) активаторная кассета megT, меченная (маркеры Ery и AraR) - штамм D7(megT);

(4) активаторная плазмида pLF-Zl (маркер CmR).

Для создания оптимизированного штамма-продуцента наиболее целесообразным представлялось совмещение в одном хозяине элементов 1, 3 и 4 или 2, 3 и 4. Однако, наличие в элементах 1, 2 и 4 однотипного маркера устойчивости CmR не позволяло непосредственно осуществить их совместное введение. Кроме того, кассета pLF-Zl имела плазмидную локализацию, что могло привести к генетической и физиологической нестабильности итогового варианта продуцента. Учитывая изложенное, кассета pLF-Zl была переведена в интегративную форму с одновременной сменой маркера. С этой целью плазмидная ДНК pLF-El была расщеплена по сайту £coRI, смешана с расщепленным Mfel фрагментом ДИК, несущим маркер устойчивости к канамицину из Тп903. Далее объединенная ДНК 21 и маркера KmR была расщеплена рестриктазой ХЬа\, лигирована с хромосомной ДНК В. megaterium В-3937, также расщепленной по сайтам ХЬа\, и затрансформирована в штамм D7 с отбором по устойчивости к канамицину. Отобранный штамм D7(Z-K1) был использован для засева ферментера объемом 1л и показал продуктивность 1800 мг/л при длительности культивирования 32 часа. Этот показатель позволил сделать вывод о том, что маркер £1 был успешно введен в хромосому В. megaterium D7.

Далее штамм Ü7(Z-K1) был дополнительно затрансформирован хромосомной ДНК, выделенной из штамма В-3937 (megT) с отбором трансформаитов на среде с эритромицином и апрамицином.

Итоговый вариант D7(£l-Km, megT) был подвергнут детальной физиолого-биохимической характеристике в ходе культивирования в лабораторных ферментерах, пробирках и колбах. Было установлено, что по сравнению с исходным вариантом В. megaterium В-3937 обладает повышенной способностью к споруляции, что улучшает его стабильность при хранении. Несмотря на это, он практически не отличался от исходного штамма по уровню продукции щелочной протеазы (10-20 мкг/л). Продуктивность штамма

07(Х1-Кгп, п^Т) при ферментации в течение 30 часов достигала 2800 мг/л, а в течение 36 часов - 3200 мг/л. Дальнейшая ферментация в течение 1-2 часов приводила к лизису клеток, что ухудшало качество продукта, но не приводило к падению его активности. Для сравнения, исходный штамм характеризовался быстрым падением активности синтезированного продукта при длительности ферментации более 30-32 часов. Таким образом, штамм Кт, тейТ) в оптимуме требовал на 6 часов более длительного процесса ферментации по сравнению родительским вариантом.

Рисунок 10. Схема создания штаммов-продуцентов Мегатерина на основе В. те§а!ег1ит В-3937. Условные обозначения:

Квадратные боксы: названия штаммов (в фигурных скобках: продуктивность по

нейтральной протеазе, мг/л) Овалы: названия интегративных и плазмидных конструкций

Стрелками обозначено введение конструкции (в начале стрелки) в родительский штамм (название которого перечеркнуто стрелкой) с образованием производного штамма (название у окончания стрелки). Тип и объем селекции рекомбинантных клонов при трансформации обозначено формой стрелки:

Сплошные тестирование единичных трасформантов;

Жипнме. пунктирные скрининг полногеномного банка; Пхчлшннш« скрининг мини-банка.

Были сделаны попытки оптимизации состава среды культивирования П7(5Л-Кт, пг^Т) за счет повышения и понижения содержания в ней общих сухих веществ, введения лимита по сырому протеину и сахарам, внесения глюкозы и изменения содержания минерального фосфора и азота. В результате было установлено, что выход ферментации резко ухудшается

при обогащении среды, особенно, при повышении содержания в иен белка. Содержание полисахаридов мало сказывалось на выходе, причем известно, что повышение их массовой доли нежелательно, так как это осложняет процесс сепарации биомассы по окончании ферментации. Небольшого прироста продуктивности удалось добиться за счет введения в среду глюкозы в концентрации 0.01% (но не 0.05 или 0.1%). Введение источников минерального фосфата и азота приводило к существенному снижению продукции. Таким образом, можно сделать вывод о том, что среда ДПС, ранее оптимизированная для проведения ферментации базового продуцента Мсгатсрина, оказалась оптимальной и для ведения ферментации сконструированного трехкассетного интегративного штамма В. тецагег'шт 07(£1-Кт, гг^Т).

6.2. Разработка продуцентов нейтральной протеазы на основе В. ату1оИдие/аЫеп5

В настоящей главе изложены результаты экспериментов, в ходе которых методические приемы, разработанные при конструировании продуцентов Мегатерина на базе В. тецШегшт были, были априбированы применительно к наиболее традиционным продуцентам нейтральной протеазы - штаммам В. ату1оИцие/аскпх.

Несмотря на таксономическое родство и принципиальное сходство геномной организации, штамм В. тецсиепипг В-3937 имеет существенные физиологические отличия по сравнению с промышленными штаммами линий Л50 и В65 вида В. ату1оЩие/асгеп.V. В отличие от В. те^Мепит В-3937, последние отличаются быстрым ростом и хорошей способностью к споруляции, жестко связанной с суперпродукцией целевого фермента. При этом все известные варианты В. ату1оНцие/ас1еп.ч, наряду с нейтральной протсазой в значительных количествах продуцируют щелочную протеазу и а-амилазу (те же или близкородственные штаммы используются и в качестве промышленных продуцентов а-амилазы). Это дает им возможность эффективно развиваться на средах с высоким содержанием крахмала и белка. В отличие от В. те^Мепит, штаммы В. ату1о1щие/аЫеп.1 традиционно культивируют на богатых средах на основе кукурузной и соевой муки с добавлением дрожжей и минеральных источников фосфора и азота. Это позволяет накапливать до 1500 мг/л целевого продукта, однако, приводит к удлинению процесса до 5256 часов. С точки зрения экономической эффективности удлиненная по сравнению с В. те§а1ег1ит ферментация является недостатком В. атукАщие/аЫепя, однако, он отчасти компенсируется возможностью использовать низкие дозы посевного материала без снижения воспроизводимости.

При повышении продуктивности штаммов В. атуЫщие/аскм по нейтральной протеазе мы стремились уже в ходе первичной селекции добиться их максимальной адаптации к существующим промышленным регламентам. Поэтому тестирование продуктивности проводилось на средах, непосредственно используемых на производстве (Бердский БХЗ и АО «Восток»). В работе были использованы конструкции, несущие гепы-активаторы, созданные в ходе экспермиснтов со штаммами В. тецМегшт.

Как и в случае В. тевмегшт, основные направления воздействий на штаммы заключались в увеличении копийности структурного гена л/)/В А, модификации промоториой регуляции и контрольного аппарата синтеза и секреции продукта. Однако, в случае В. ату1оНдие/ас1епх в меньшей степени, по сравнению с В. тецшепит, были задействованы схемы скрининга, поскольку последовательности основных генов В. ¿1ту1оИс]1и'/ас1еп.ч, необходимых для конструирования, были ранее секвенированы, опубликованы и доступны для клонирования с помощью ПЦР.

6.2.1. Разработка подходов к повышению продуктвности за счет диверсификации промоторов, контролирующих транскрницню структурного гена прг, и модификации аппарата контролирующего синтез, созревание и секретно фермента

Целью проведенного эксперимента в рамках проекта по конструированию генно-инженерного продуцента нейтральной протеазы на основе В. ату1оШ]ие/ас1епх была разработка и создание генных конструкций, предназначенных для изучения возможности

диверсификации промоториой регуляции структурного гена прг путем введения в базовый штамм нескольких копий этого гена под контролем различных промоторов.

Выбранный принцип создания продуцента нейтральной протеазы (Рис. 11) состоял во введении путем гомологичной рекомбинации структурного гена прг под контроль промоторов генов наилучшим образом экспрессирующихся секреторных белков В. amyloliquefaciens. Конкретно в качестве мишеней для интеграции были выбраны гены щелочной протеазы ВргГ (аргП) и мезофильной а-амилазы (атуА). Так как в ходе индукции споруляции естественная экспрессия генов атуА и пргВА у В. amyloliquefaciens происходит рано — в среднем, начиная с 15 часа роста культуры, а экспрессия гена арг в существенно более поздней фазе, ожидалось, что в результате реализации схемы клонирования не только удастся увеличить общую копийность гена прг, но и не допустить нарушения регуляторпых механизмов контроля экспрессии за счет использования параллельных регуляторных путей. Кроме того, была использована возможность усиления экспрессии генов-активаторов синтеза секреторных ферментов SacQ. С этой целью ген sacQ В. licheniformis был введен под контроль промотора атуА, что должно было приводить к созданию системы с положительной обратной регуляцией транскрипции как гена прг, так и sacQ. Наконец, с целью улучшения трансляции была проведена замена инициаторного кодона прг с GTG на ATG, а также замена его последовательности Шайна-Дельгарно на аналогичный элемент гена арг.

В ходе интеграции планировалась эксцизионная инактивация гена арг путем замещения его на кассету Npr4 в составе гена прг и маркера устойчивости к апрамицину (Агак). В случае гена атуА планировалась интеграция кассеты в составе гена пргВА и минигена устойчивости к эритромицину orfE в точку, лежащую между промотором и структурной областью ату А.

Технически создание интегративной генной конструкции проводилось с помощью постадийного лигирования первичных продуктов ПЦР, содержащих необходимые элементы, и последующей реамплификацией продуктов лигирования.

Кассета Npr4

p-aprnprAra^t-apr

Кассета Npr5

р - a mys а с Qп р г Ery* t - а ту

Рисунок 11. Интегративные конструкции, предназначенные для диверсификации промоторов, контролирующих транскрипцию структурного гена прг

Введение кассет Npr4 и Npr5 в промышленные штаммв-продуценты нейтральной протеазы. Мы ограничили выбор штаммов, пригодных в качестве основы для создания продуцентов нейтральной протеазы, доступными промышленными продуцентами, относящимися к виду В. amyloliquefaciens. Это было сделано с целью облегчить внедрение разрабатываемых продуцентов на существующих заводах ферментных препаратов. В результате было установлено, что практически все используемые в РФ и СНГ штаммы В. amyloliquefaciens являются потомками природных штаммов А50 (фаготип Н) или В65 (фаготип К). Штаммы линии А50 лучше охарактеризованы генетическими методами. Тем не менее, при создании продуцента мезофильной и термофильной а-амилаз штаммы линии В65 оказались более продуктивны, что позволило отдать им предпочтение при определении конечного хозяина для введения экспрессионных кассет. Кроме того, плазмидный продуцент мезофильной а-амилазы В5144 на базе В65 был ранее подвергнут мутагенезу с целью получения мутаций фагоусточивости. Таким образом, именно В5144 был выбран в качестве основы для создания продуцента. Он не содержит хромосомных маркеров ауксотрофности

или каких-либо описанных мутаций в системе синтеза секреторных белков. Заявленные в патенте на разработку штамма-продуцента показатели продуктивности В5144 по а-амилазе -4.5 г с л среды.

Данные, полученные в ходе амплификации структурных генов для получения экспрессионных кассет, также свидетельствуют о предпочтительности использования линии В65 по сравнению с А50: отсутствие возможности получить амплифнкат гена арг с производного А50 могут указывать на существенные расхождения нуклеотидпых последовательностей плеч интегрируемых кассет и ДНК-мишени, что может привести к невозможности к интеграции кассеты Npr4 в хромосому А50 путем гомологичной рекомбинации.

6.2.2. Характеристика продукции протсаз штаммов

Родительский штамм Al - В5144, В65 был депонирован в ВКПМ в качестве продуцента протеаз. Тем не менее, уровень его продуктивности по щелочной и нейтральной протсазам оставался неизвестным. Поэтому мы провели определение активности обоих типов ферментов в культуральной жидкости штаммов, выращенных в различных условиях.

Выращивание проводилось в пробирках, в объеме 5 мл, при интенсивной аэрации и температуре 37°С, в течение 20 часов. Использовали среды двух различных составов: дрожжеполисахаридная среда ДПС, содержащая кукурузную муку, БВК и мел, либо среду ОС (осахаренный амилосубтилином крахмал, кукурузный экстракт, сухие дрожи и минеральные соли). Среда на основе осахаренного крахмала применяется для производства амилосубтилина на основе штамма В5144 на Бердском и Вильнюсском ЗФП.

Результаты измерений приведены в таблице 10.

Таблица 10. Протеолитическая активность исходных штаммов В. amyloliquefaciens, рассматриваемых в качестве основы для конструирования продуцентов нейтральной протеазы. Результаты по нейтральной протеазе даны в мг произведенного фермента на литр культуральной среды, по щелочной протеазе - в единицах активности (мкмоль расщепляемого паранитроанилидпого субстрата в минуту) на литр культуральной среды.

Название штамма Генотип Нейтральная протеаза Щелочная протеаза

ДПС дне

В4899 А50, дикий тип <0.1 0.58

В4900 А50, StrK, amyA4 <0.1 0.13

В5262 А50, ribO, ribC <0.1 0.15

В5144 В65 (рВА1418), устойчивость к фагам 12.5 0.014

Al В65, устойчивость к фагам 0.105 <0.01

В. licheniformis 103 дикий тип, продуцент щелочной протеазы 16 0.48

Полученные результаты свидетельствуют о невысокой продуктивности базового штамма-реципиента как по щелочной, так и в ососбспности по нейтральной протеиназе. Не исключено, что большей продуктивности можно достигнуть, меняя условия культивирования, частности, увеличивая время культивирования на среде, с осахарепным крахмалом.

На необходимость изучения режима питания штамма и механизмов индукции синтеза секреторных ферментов указывает неожиданный результат по определению продуктивности штамма А1. Плазмида рВА1418 не содержит генов протсаз или их известных активаторов.

Тем не менее, ее удаление привело к существенному падению протеазной активности в четырех независимо полученных бесплазмидных клонах. Этот эффект можно объяснить нарушением усвоения культурой крахмала среды непосредственно за счет ухудшения доступности субстрата или в результате изменения скорости образования декстранов и олигосахаридов, возможно, способных индуцировать синтез протеаз.

Введение интегративных кассет в штаммы-реципиенты В. ату1оИдие/ас1епх

Кассета Ирг4 первоначально была получена в виде вставки в хромосому В. шЬи\Ш А173. Интсгрант обладал существенной протеолитической активностью, выявляемой в чашечном тесте по просветлению молочного агара. Измерение активности нейтральной протеазы в модифицированном штамме В. ьиЫШя показало, что она находится на уровне 400-500 мг/л. Такая продуктивность не является удовлетворительной для промышленного продуцента, однако она, а также результаты ПЦР-амплификации интегрированной кассеты, доказывают, что в ходе конструирования в составе структурного гена прг и его регуляторных элементов не произошло перестроек или замен, вызванных неточностью работы Taq-пoлимepaзы, и она может быть использована для переноса в штамм В. ату1оИдие/ае1епх.

Пренос кассеты в бесплазмидный вариант В5144 с использованием в качестве вектора хромосомной ДНК трансформанта В. .чиЫШх АЛЗ проводился методом регенерации протопластов. В результате были получены штаммы, устойчивые к апрамицину, и способные давать зоны просветления на молочном агаре.

Одновременно в штамм А1 были введены кассеты гг^Т, п^О и Х-К1, описанные в главе «Разработка продуцентов Мегатерина».

Результаты тестирования активности нейтральной протеазы в КЖ полученных штаммов после ферментации в течение 56 часов на среде ОС проведены в таблице П.

Таблица 11. Прогеолитическая активность КЖ штаммов В. ату1оИдие/ас1еш-, полученных путем введения кассет ^г4, Крг5, 1т^Т, megD и £-К1. Штаммы культиировапись на среде ОС в течение 32 и 56 часов. Результаты измерения активности нейтральной протеазы даны в мг произведенного фермента на литр культуральной среды. В шапках колонок указанов время роста культуры с момента начала ферментации.

Название штамма Генотип Активность Npr, мг/л

32 часа 56 часов

А50 Дикий тип 260 520

В65 Дикий тип 250 920

В5144 В65 fpBА1418, фагоустойчивость) 230 1100

Al В65 (фагоустойчивость) 250 750

Al (Npr4) В65 (яргВ::[лргВА, Агак]) 110 350

AI (Npr5) Npr5 (nmjyA::[sacQ, nprBA, Егук]) 60 120

AI (megT) В65 (wprA::[íte£R, ten A, AraK, degS, degü, orjЕ]) 790 3250

AI (megD) В65 (wprA::[</<?írR, tenA, AraK]) 810 3350

Al (E-Kl) B65 (kanK) 3200 1850

Результаты тестирования протеолитической активности полученных рекомбинантных продуцентов свидетельствовали о неэффективности кассет, нарушающих работу генов мажорных секреторных экзоферментов атуА и аргВ. Мы предполагаем, что причины этого явления сходны с теми, которые приводили к скоординированному подавлению экспрессии генов ату арг и £лсВЬ в результате одиночной мутации в генах арг и gseBh в штамме В. ¡«¡и'пф/гпй.ч 103 и заключается в блокировании единой косекреторной контролирующей системы. Однако, в случае штамма В. ИсИет/огти 103, в противоположность А1, инактивация арг и ¿'.К'ВЬ приводила к активации продукции Крг, заблокированной в штамме 103 дикого

типа. Обобщая наблюдения, мы предполагаем, что каждый из высокопродуктивных бациллярных штаммов имеет сбалансированную систему потоков мажорных белков через клеточную стенку (главный секреторный комплекс ферментов - ГСК): Amy, Npr, Apr в случае штамма Al и Amy, Apr, GseBL в случае штамма 103. Инактивация любого из генов мажорных белков приводит к подавлению синтеза всего ГСК, тем самым, способствуя активации репрессированных генов секреторных ферментов: Npr в случае штамма 103. Па это же указывает сниженная продуктивности по Npr штамма AI по сравнению с исходным для пего В5144, за счет введенной плазмнды обладающим также существенно более высокой продуктивностью по АтуА.

Напротив, все три ннтегративные кассеты mcgT, mcgD и Z-Kl, ранее апробированные на модели продуцента Мегатерина, оказали положительное воздействие па синтез Npr штаммом AI. Поскольку в случае штамма В. megaterium В-3937 кассеты megT и Z-K1 показали синергизм при одновременном введении, было проведено их совмещение в одном штамме В. amyloliquefaciens. При этом производные штаммы характеризовали по продукции всех компонентов ГСК: Npr, Amy, Apr. Результаты эксперимента приведены в Таблице 12.

Таблица 12. Протеолитическая активность КЖ штаммов В. amyloliquefaciens, полученных путем введения кассет megT, megD и S-K1. Штаммы культивировались на среде ОС в течение 52 часов. Результаты измерения активности Npr и Apr проводилось по синтетическим хромогенным субстратам, Amy - в единицах АС ГОСТ (по гидролизу нативного крахмала с определением остатчного субстрата по окрашиванию Ь). Результат измерения дан в пересчете в мг произведенного фермента на литр культуралыюй жидкости.

Название штамма Генотип Npr, мг/л Amy, мг/л Apr, мг/л

В 65 Дикий тип 900 120 28

В5144 B65 (pBA1418, фагоустойчивость) 730 2300 85

Al B65 (фагоустойчивость) 550 90 55

Al (megT) В65 (M^rA::[rfí-gR, tenA, AraK, degS, degU, orfE]) 3550 1100 5

Al(megD) B65 tenA, AraK]) 3650 1770 80

Al (2-K1) B65 (orfX, kanK) 1220 560 350

Al (S-Kl, megT) В65 (orjX, kanK; wprAv.[degR, tenA, AraK, degS, degV, orfE]) 5600 1850 70

Приведенные данные убедительно доказывают значительный прирост продуктивности штамма A1 (Z-Kl, mcgT) по сравнению с родительскими А1 (S-K1) и A1 (mcgT). Этот штамм в 4-5 раз превосходит по продуктивности покзателн, достигаемые при ферментациях па предприятиях микробиологической промышленности России.

Анализируя причины повышения продуктивности нового штамма по сравнению с исходными вариантами, необходимо отметить две закономерности: продукция Npr и Amy во всех исследованных штаммах растет и падает скоординировано, а продукция Apr не проявляет явной корреляции с ними. При этом подъем активности Apr (например, в штамме A1 (Е-К1), Таблица 12) значительно ухудшает стабильность как Npr, так и Amy при храпении культуралыюй жидкости. Это явление обусловлено деградацией белков под действием субтилизина, что можно наблюдать с помощью электрофореза препаратов КЖ. Обратный эффект - значительная стабилизация активностей Npr и Amy при храпении в виде цельной КЖ - наблюдается во всех штаммах, несущих кассеты megD и megT: А1 (megT), AI (mcgD) и А1(2-К1, megT). Можно предполагать, что он связан с утратой этими штаммами белка CWBP52, субтилизиноподобной протеиназы клеточной стенки, в результате инактивации хромосомного гена wprA интегрировавшимися кассетами. Тем не менее, эффект введения кассет не ограничен лишь замедлением деградации секретнрованного белка: это было установлено путем введения в штамм А1 кассеты, инактивпрующей wprA. Этот мутант

синтезировал Npr в количестве до 1000 мг/л, значительно уступая по этому параметру Al(megT), Al(megD) и A1(Z-K1, megT). В то же время, введение кассеты wprA:: AraR, подобно megT и megD приводило к стабилизации накопленной в КЖ активности Npr и Ату.

Еще одно наблюдение, касающееся изменения оптимального состава среды для ферментации, было сделано в отношении штамма Al (megT). Было показано, что он утратил чувствительность к повышенной концентрации в среде неорганического фосфата и глюкозы, свойственную родительскому штамму Al. В результате его продуктивность на среде с 0.2% глюкозой и 20 мМ фосфатом при ферментации в течение 40 часов достигала 4200 мг/л. Этим свойством не обладал штамм Al (megD), поэтому снятие фосфатной и глюкозной репрессии синтеза Npr на ранних стадиях роста культуры можно связать с генами degS и deg\J, наличие которых отличает megT от megD. Поскольку DegS представляет собой протеинкиназу, модифицирующую активность транскрипционного фактора DegU, можно предполагать, что в норме изменение фосфатного обмена и сАМР может прямо или косвенно индуцировать секреторной системы. При этом суперпродукция DegU и DegS снижает чувствительность клеток к фосфату и делает продукцию белков ГСК возможной при благоприятных для культуры условиях доступности питательных факторов, что не имеет адаптивного смысла при выживании бактерий в природе, но повышает их технологическую эффективность.

выводы

1. Разработан методический аппарат, позволяющий комплексно исследовать роль отдельных генов и их продуктов в секреции белков у бацилл. Доказано преимущество однокопийных векторов сайт-направленной интеграции перед плазмидными при исследовании регуляторных механизмов и создании штаммов-продуцентов промышленного назначения.

2. Клонировано б новых генов белков бацилл, вовлеченных в секрецию и споруляцию: глутамилэндопептидазы В. licheniformis, В. intermedius, В. cereus, 5-эндотоксины сгу9Аа и сгу9Ва, гены wprA В. licheniformis и

В. amyloliquefaciens.

3. С использованием размножающихся бактериальных L-форм впервые показана необходимость клеточной стенки для запуска аутопроцессинга предшественников глутамилэндопептидаз и карбоксипептидазы Т.

4. Показана способность предшественников секреторных протеиназ бацилл к мультимеризации. Выдвинута гипотеза о взаимодействии клеточной стенки бацилл с предшественниками секреторных белков в форме линейных полимеров.

5. Показано существование отрицательной обратной связи, запускающей механизм генерализованного ответа типа heat-shock в результате инактивации гена WprA, кодирующего субтилизиноподобную протеиназу, прочно связанную с клеточной стенкой. Разработана векторная система для замещения природного гена wprA интегративными кассетами, несущими регуляторные гены.

6. Сконструированы новые высокостабильные бесплазмидные штаммы продуценты нейтральных протеаз на базе Bacillus megaterium и Bacillus amyloliquefaciens, в 3-5 раз превышающие по продуктивности лучшие отечественные аналоги.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих

публикациях:

1. Alberghini S., Filippini R., Marchetti E., Dindo M.L., Shevelev A.B., Battisti A., Squartini A. Construction of a Pseudomonas sp. derivative carrying the cry9Aa gene from Bacillus thuringiensis and a proposal for new standard criteria to assess entomocidal properties of bacteria. // Research in Microbiol. 2005; 156(5-6): 690-699

2. Vertiev Y.V., Zdanovsky A.G., Shevelev A.B., Borinskaya S.A., Gening E.L., Martin Т., Ivanov P.A., Yankovsky N.K. Recombinant Listeria strains

„ producing the nontoxic L-chain of botulinum neurotoxin A in a soluble form // Research in Microbiol. 2001; 152(6): 563-567

3. Ivanov P.A., Lewitin E.I., Shevelev B.I., Fominov G.V., Wojciechowska J.A., Asadi Mobarhan A.H., Vertiev Y.V., Yankovsky N.K., Shevelev A.B. Sup35p

, yeast prion-like protein as an adapter for production of the Gag-p55 antigen of HIV-1 and the L-chain of botulinum neurotoxin in Saccharomyces cerevisiae П Research in Microbiol. 2001; 152(1): 27-35

4. Shevelev A.B., Aleoshin V.V., Trachuk L.A., Granovsky A.E., Kogan Y.N., Rumer L.M., Serkina A.V., Semenova E.V., Bushueva A.M., Livshits V.A.,

» Kostrov S.V., Shcheglov A.S., Novikova S.I., Chestukhina G.G. Expression of bacillar glutamyl endopeptidase genes in Bacillus subtilis by a new mobilizable single-replicon vector pLF. Plasmid. 2000; 43(3): 190-199

5. Novikova S.I., Bushueva A.M., Trachuk L.A., Konstantinova G.E., Serkina A.V., Hoischen C., Gumpert J., Chestukhina G.G., Mankin A., Shevelev A.B. Introduction of a mini-gene encoding a five-amino acid peptide

' confers erythromycin resistance on Bacillus subtilis and provides temporary erythromycin protection in Proteus mirabilis II FEMS Microbiol Lett. 2000; 182(2): 213-218

6. Serkina A.V., Gorozhankina T.F., Shevelev A.B., Chestukhina G.G. Propeptide

v of the metalloprotease of Brevibacillus brevis 7882 is a strong inhibitor of the

mature enzyme// FEBS Lett. 1999; 456(1): 215-219

7. Rebrikov D.V., Akimkina T.V., Shevelev A.B., Demidyuk I.V., Bushueva A.M., Kostrov S.V., Chestukhina GG, Stepanov VM. Bacillus intermedins

чУ glutamyl endopeptidase. Molecular cloning and nucleotide sequence of the structural gene//J. Protein Chem. 1999; 18(1): 21-27

8. Shevelev A.B., Lewitin E., Novikova S.I., Wojciechowska Ya.A., Usacheva E. A., Chestukhina G.G., Stepanov V.M. A new PCR-based approach to a fast

\j search of a wide spectrum of cry genes from Bacillus thuringiensis strains // Biochem. Mol. Biol. Int. 1998; 45(6): 1265-1271

9. Bushueva A.M., Shevelev A.B., Gumpert J., Chestukhina G.G., Serkina A.V., Hoischen C., Matz M.V., Kuryatova M.V., Stepanov V.M. Expression of the carboxypeptidase T gene from Thermoactinomyces vulgaris in stable protoplast type L-forms of Proteus mirabilis И FEMS Microbiol. Lett. 1998; 159(2): 145150

lO.Shevelev A.B., Kogan Ya.N., Bushueva A.M., Voronina E.J., Rebrikov D.V., Novikova S.L, Chestukhina G.G., Kuvshinov V., Pehu E., Stepanov V.M. A novel delta-endotoxin gene crylM from Bacillus thuringiensis ssp. wuhanensis //FEBS Lett. 1997; 404(2-3): 148-152

1 l.Shevelev A.B., Svarinsky M.A., Karasin A.I., Kogan Ya.N., Chestukhina G.G., Stepanov VM. Primary structure of cryX, the novel delta-endotoxin-related gene from Bacillus thuringiensis spp. Galleriae II FEBS Lett. 1993; 336(1): 7982

12.Smulevitch S.V., Osterman A.L., Shevelev A.B., Kaluger S.V., Karasin A.I„ Kadyrov R.M., Zagnitko O.P., Chestukhina G.G., Stepanov V.M. Nucleotide sequence of a novel delta-endotoxin gene crylG of Bacillus thuringiensis ssp. galleriae И FEBS Lett. 1991; 293(1-2): 25-28

13.Сперанская A.C., Дорохин A.B., Новикова С.И., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Клонирование последовательности, кодирующей ингибитор протеиназ семейства SKT1 из картофеля // Генетика. 2003; 39(11): 14901497

14.Трачук J1.A., Бушуева A.M., Шевелев А.Б., Новогородова С.А., Акпаров В.Х., Честухина Г.Г. Характеристика специфичности Sl'-субсайта карбоксипептидазы Т из Thermoactinomyces vulgaris методом сайт-направленного мутагенеза // Вопр. Мед. Химии. 2002; 48(6): 577-585

15.Серкина A.B., Шевелев А.Б., Честухина Г.Г. Структура и функции предшественников бактериальных протеиназ И Биоорганической Химии 2001; 27(5):323-346. Обзор

16.Жданова Л.В., Романова Ю.М., Бондаренок В.М., Константинова Г.Е., Шевелев А.Б. Клонирование генов лизоцима и лизостафина из Staphylococcus aureus и их экспрессия в клетках Bacillus subtilis. Н

Ж. Мпкробиол. Эгшдемнол. Иммунол. 2001; (4): 3-6

17.Новикова С.И., Серкина A.B., Константинова Г.Е., Хлебалина О.И., Честухина Г.Г., Шевелев А.Б. Исследование структурно-функциональной организации предшественника металлопротеиназы из В. amyloliquefaciens методом делеционного анализа // Вопр. Мед. Химии. 2001; 47(1): 123-131

18.Серкина A.B. Ьушуева A.M., Честухина Г.Г., Гумперт Й„ Хойшен К., Куяу М., Шевелев А.Б.. Получение предшественника, глутамилэнлопеггп"1-'1-"-' Р licheniformis и его процессинг in vitro И Вопр. Мед. Химии. 2001; 47(1): 111-122

19.Калебина Т.С., Лауринавичуте Д.К., Шевелев А.Б., Фоминов Г.В., Левитин Е.И., Алексеева О.В., Чжан С., Панькова Н.В., Ксензенко В.Н., Степанов В.М., Кулаев И.С. Очистка и характеристика белка РЗЗ из Candida utilis гомологичного bg!2p из Saccharomyces cerevisiae: сравнительный анализ роли этих белков в молекулярной орагнизации клеточной стенки дрожжей. Биохимия. 1998; 63(12): 1419-1423

20.Сперанская A.C., Криницына A.A., Польтроньери П., Фазано Л., Сантино А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ типа Кунитца из картофеля: молекулярное клонирование генов группы В // Биохимия. 2005; 70(3): 360-369

21.В.Г. Хоменков, А.Б. Шевелев, Жуков В.Г., Курлович А.Е., Загустина H.A., Попов В.О. Применение методов геносистематики для исследования бактериальных культур, утилизирующих летучие органические соединения // Прикладная биохимия и микробиология. 2005; 41(2): 1-9

22.В.Г. Хоменков, А.Б. Шевелев, Жуков В.Г., Курлович А.Е., Загустина H.A., Попов В.О. Молекулярно-генетическая характеристика метаболических путей утилизации ароматических углеводородов консорциумами микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 2005; 41(3): 10-19

23.Крахмалева H.H., Шишкин С.С., Шаховская Н.И., Столярова Е.Б., Плугов А.Г., Князев А.И., Хоменков В.Г., Шевелев А.Б., Чернов H.H.. ДНК-технологии, позволяющие выявлять SNP's, в решении некоторых вопросов прикладной биохимии.// Прикладная биохимия и микробиология 2005; 41(3); 303-307

24.Шевелев А.Б., Карасин А.И., Сваринский М.А., Кадыров P.M., Коган Я.Н., Честухина Г.Г., Степанов В.М. Множественные гены дельта-эндотоксинов из Bacillus thuringiensis подвида galleríae II Мол. Биол.. 1994; 28(3): 586594

25.Суровцева Е.В., Кузнецова Т.В., Хоменков В.Г., Домогатский С.П., Шевелев А.Б. Использование рекомбинантного белка в виде телец включения в качестве антигена для иммунизации на примере TNF-a человека// Биоорганическая химия, 2005; 31(5): 426-432

26.Суровцева Е.В., Аникеева Н., Сикулев Ю., Шевелев А.Б. Получение

I/ растворимой формы рецептора фактора некроза опухоли человека путем экспрессии в клетках Drosophila // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2005; 23(3): 34-38

27.Шевелев А.Б., Хоменков В.Г., Кузнецова Т.В., Ковалев Л.И., Лагодная Н.В. Создание продуцента миостатина в виде слитого белка с 6HÍS-GFP на основе Е. coli и изучение его иммуногенности. // Сборник статей «Медико-биологические технологии повышения работоспособности в условиях напряженных физических нагрузок». Министерство образования и науки Российской Федерации, 2004, С. MO-ISO

28.Kazeeva T.N., Khomenkov V.G., Kuznetsova T.V. and Shevelev A.B. Study of IgA-specific endopeptidases from Neisseria meningitides and their genes. // Book of abstracts: International conference "Biocatalysis 2005", June, 19-23, 2005, St. Peterburg -Kizhiy-Valaam. Departament of Chemical Enzymology, The M.V. Lomonosov Moscow State University, 2005, p. 90.

29.Суровцева E.B., Кузнецова T.B., Шевелев А.Б. Использование рекомбинантной технологии для изучения взаимодействия рецепторов и их лигандов на примере TNF и TNFR1. // Тезисы. Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. Москва, 2005, стр. 72

30.Бушуева A.M., Серкина A.B., Шевелев А.Б., Гумперт Й., Хойшен К., Курятова М.В., Честухина Г.Г.. Экспрессия гена карбоксипептидазы Т

Т. vulgaris в клетках L-форм P. mirabilis. IV Всероссийский Симпозиум "Химия протеолнтическпх ферментов", Москва. Россия. Апрель 21-23. 1997, стр. 127.

31.Серкина А.В., Горожанкина Т.Ф., Сурова И.А., Иванова Н.М., Честухина Г.Г. Пропептид метаплопротеиназы Bacillus brevis ингибирует зрелый фермент. IV Всероссийский Симпозиум "Химия протеолптнческнх ферментов". Москва. Россия. Апрель 21-23. 1997, стр. 51.

32.Серкина А.В., Горожанкина Т.Ф., Сурова И.А., Иванова Н.М., Честухина Г.Г., Степанов В.М. Функциональная характеристика предшественника и пропептида метаплопротеиназы Bacillus brevis. V Научная Конференция ГосНИИ Генетика. Москва. Россия. Октябрь 28-31. 1997.

33.Шевелев А.Б., Серкина А.В., Честухина Г.Г. Методы получения предшественников бактериальных протеиназ и изучения их процессинга. Конференция «Химия белка и протеолнтическпх ферментов». Институт Биоорганической Химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, 1999

34.Новикова С.И., Серкина А.В., Константинова Г.Е., Хлебалина О.И., Честухина Г.Г., Шевелев А.Б. Исследование структурно-функциональной организации предшественника металлопротеиназы из В. amyloliquefaciens методом делеционного анализа. Конференция памяти В.Н. Ореховнча «Структура и функция протеолптнческнх ферментов», Институт Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва, 2000

35.Серкина А.В. Бушуева A.M., Честухина Г.Г., Гумперт Й., Хойшен К., Куяу М., Шевелев А.Б.. Получение предшественника глутамилэндопептидазы В. licheniformis и его процессинг in vitro. Конференция памяти В.Н. Ореховича «Структура н функция протсолитнческих ферментов», Институт Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва, октябрь 2000

36.Шевелев А.Б. Разработка секреторной системы для экспрессии в клетках Грам-отрицательных бактерий на основе транспортного домена IgA-специфичной протеиназы Neisseria meningitidis. Конференция «Химия белка и протеолптнческнх ферментов». Институт Биоорганической Химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, март 2002

37.Kogan Ya.N., Shevelev А.В. and Chestukhina G.G. Studies of molecular organization and multiplicity of Bacillus thuringiensis 5-endotoxins, International conference "Molecular responses to biotic and abiotic stresses", Helsinki, Finland, Dec. 6-10, 1994

38.Shevelev A.B., Bushueva A.M., Rebrikov D.V. and Kogan Ya.N. New

approaches to identification and cloning new 5-endotoxin genes from Bacillus thuringiensis, International conference "Molecular responses to biotic and

! abiotic stresses", Helsinki, Finland, Feb. 7-9, 1996

Типография ордена "Знак Почета" издательства МГУ 119992, Москва, Ленинские горы Заказ № 292 Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Шевелев, Алексей Борисович

Список сокращений

1. Введение. Цели и задачи исследования

2. Обзор литературы. Секреция белков у Bacillus subtilis. Свойства 10 секреторных белков

2.1. Введение

2.2. Какие белки секретируются?

2.3. Структура сигнального пептида в целом

2.4. Классификация сигнальных пептидов

2.4.1. Идентификация сигнальных пептидов методом 17 компьютерного предсказания

2.4.2. Сигнальные пептиды белков, транспортирующихся по 22 главному секреторному пути (Бес-система)

2.4.3. Сигнальные пептиды, несущие мотив с двумя 23 аргининовыми остатками (RR-мотив)

2.4.4. Сигнальные пептиды липопротеинов

2.4.5. Сигнальные пептиды препилин-подобных белков

2.4.6. Сигнальные пептиды бактериоцинов и феромонов

2.5. Количество транспортируемых белков

2.6. See-зависимая секреторная система

2.6.1. Цитозольные шапероны

2.6.1.1. Шапероны, специфически участвующие в секреции

2.6.1.2. Шапероны широкого спектра действия

2.6.2. Транслоказа

2.6.3. Сигнальные пептидазы типа I

2.6.4. Процессинг липопротеинов СПазой типа II

2.6.5. Пептидазы сигнальных пептидов

2.6.6. Внецитоплазматические катализаторы фолдинга белков 52 2.6.6.1 .Петидил-пролил цис-транс изомеразы

2.6.6.2. Тиол-дисульфид оксидоредуктазы

2.6.6.3. Пропептиды

2.6.6.4. Другие катализаторы фолдинга (небелковой природы)

2.7. Контроль качества транспортируемых белков

2.8. Бес-независимый экспорт белков

2.8.1. Tat-система транспорта

2.8.2. Система экспорта препилин-подобных белков 64 ' 2.8.3. ABC-система транспорта

2.9. Роль пропептида в секреции белков

2.10. Экспорт белков, локализованных в клеточной стенке

2.10.1. Сигналы для удержания белков в клеточной стенке

2.10.2. Белки, ковалентно связыванные с клеточной стенкой

2.11. Транспорт белков во время споруляции

2.11.1. Транспорт белков, специфичных для процесса споруляции

2.11.2. Факторы, участвующие в споруляционно-зависимом 77 транспорте белков

3. Материалы и методы

3.1. Материалы

3.2. Методы

3.2.1. Выделение плазмидной ДНК по модифицированному 81 методу Бирнбойма- Долли

3.2.2. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)

3.2.3. Выделение фрагмента ДНК из агарозного геля методом 82 Gene clean

3.2.4. Трансформация L-форм

3.2.5. Адаптация культур L-форм к росту в жидкой среде

3.2.6. Ферментация рекомбинантных штаммов L-форм- 83 продуцентов GseBL и СрТ

3.2.7. Анализ экспрессии рекомбинантных генов gseBL и cpt в 83 клетках L-форм P. mirabilis

3.2.8. SDS-электрофорез в ПААГ

3.2.9. Иммуноферментный анализ методом Вестерн-блоттинга

3.2.10. Анализ аминокислотных последовательностей

3.2.11. Определение активности глутамилэндопептидазы GseBL

3.2.12. Определение активности карбоксипептидазы Т

3.2.13. Протеолитическая активация предшественника GseBL

3.2.14. Выделение предшественника GseBL из культуральной 85 жидкости L-форм

3.2.15. Выделение СрТ из культуральной жидкости L-форм 86 P. mirabilis

3.2.16. Процессинг секреторной формы СрТ in vitro

3.2.17. Трансформация клеток Е. coll Ферментация $6 рекомбинантных штаммов Е. coli - продуцентов предшественников GseBL и СрТ в виде тел включения

3.2.18. Ренатурация предшественников протеиназ, полученных в 87 виде тел включения

3.2.19. Трансформация клеток В. subtilis методом Спицайзена

3.2.20. Ферментация рекомбинантных штаммов В. subtilis - 88 продуцентов GseBL и СрТ

3.2.21. Выделение геномной ДНК из клеток В. subtilis и Т. vulgaris

3.2.22. Разработка нового вектора pLF для экспрессии генов 88 протеиназ в В. subtilis

3.2.23. Экспрессия генов глутамилэндопептидаз в В. subtilis на 91 основе разработанного вектора pLF

3.2.24. Использование мини-гена, кодирующего пентапептид 93 устойчивости к эритромицину, в качестве транскрипционного репортера в клетках В. subtilis и L-формах P. mirabilis

4. Результаты и обсуждение

4.1. Разработка векторных систем для клонирования в бациллах

4.2. Гены 8-эндотоксинов В. thuringiensis

4.3. Исследование генов новых секреторных ферментов бацилл

4.4. Изучение структуры и механизма процессинга 154 предшественников секреторных протеиназ бацилл in vitro

4.5. Разработка промышленных продуцентов секреторных 166 ферментов на базе бацилл с использованием генов-регуляторов секреторного аппарата

5. Выводы

6. Благодарности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы молекулярно-генетического контроля секреции у бацилл - продуцентов ферментов"

Достигнутый в последние десятилетия стремительный прогресс биотехнологии, в частности, микробиологического производства промышленных ферментов сделал бациллы одним из наиболее значимых для человека объектов живой природы, поставив их в один ряд с сельскохозяйственными животными и растениями, пекарскими дрожжами, мицелиальными грибами и актиномицетами. Иллюстрируя экономическую значимость бацилл, достаточно сказать, что объем мирового производства только препаратов а-амилазы, синтезируемых штаммами Bacillus amyloliquefaciens, в 2003 г достиг 800 тыс. тонн. Рыночная стоимость этого продукта составляет около 20 млрд. долл. Этот фермент, бесспорно, играет ключевую роль в решении проблемы разработки экономически оправданного способа синтеза топливного этанола, что в свою очередь, способно снизить зависимость экономически развитых стран от импорта нефти, решить множество глобальных социально-экономических, политических и экологических проблем. Наряду с а-амилазой, бациллы являются основными продуцентами щелочной и нейтральной протеаз, которые служат основой десятков наиболее современных технологий глубокой переработки сырья в пищевой промышленности, при синтезе моющих средств и получении новых материалов.

Уникальной особенностью бацилл с точки зрения биотехнологии является их непревзойденная способность к секреции белка во внешнюю среду в сочетании с эффективной утилизацией дешевых низкоочищенных полимерных субстратов, таких, как зерновая мука, растительная и дрожжевая биомасса в сочетании с минеральными источниками азота. Бациллы обладают мощным потенциалом аэробного метаболизма в сочетании с экзогидролазной активностью, позволяющим им стремительно расти, без потерь конвертируя субстраты в целевой продукт. Биотехнология не знает других объектов, способных в течение 30 часовой ферментации накапливать в среде до 40 г/л целевого белка.

По мере развития технологии рекомбинантных продуцентов различных белков высокая способность бацилл к секреции белка стимулировала попытки конструирования на их основе продуцентов ценных биоактивных белков и пептидов: проинсулина, интерферонов, соматотропина, сывороточного альбумина, вакцинирующих вирусных антигенов и других. Однако, все эти попытки закончились неудачно. Более того, было установлено, что бациллярные клетки неспособны к секреции даже собственных секреторных белков, подвергнутых более или менее значительным модификациям. В частности, не удалось заставить бациллы секретировать экзогидролазы, неспособные к естественному фолдингу, или лишенные ферментативной активности. Таким образом, можно сделать вывод о способности секреторного аппарата бацилл, в отличие от секреторного аппарата дрожжей, мицелиальпых грибов и клеток высших эукариот, избирательно распознавать дефектные неактивные молекулы и не допускать их транспорта во внешнюю среду.

Еще одной уникальной особенностью бацилл, важной в технологическом отношении, является их способность к образованию эпдоспор. С одной стороны, это делает бациллярные культуры неприхотливыми при культивировании и хранении, с другой - осложняет процесс управления ферментацией. Последнее обстоятельство обусловлено тем, что синтез секреторных ферментов бациллярными клетками жестко сопряжен со стадией, предшествующей переходу к спорообразованию. Таким образом, функционирование аппарата синтеза целевого белка в ходе ферментации бациллярного штамма-продуцента происходит в течение короткого периода, соответствующего переходу от стадии вегетативного роста культуры к формированию спор.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение молекулярно-генетических особенностей бактерий рода Bacillus, обусловливающих их принципиальную с технологической точки зрения черту: способность к сверхэффективному синтезу и секреции собственных секреторных гидролаз, но не гетерологичных или дефектных гомологичных белков.

В ходе исследований решались следующие задачи:

- Разработка экспериментального метода, позволяющего направленно вносить в геном бациллярных штаммов необходимые стабильно наследуемые перестройки, инактивируя или вводя в него дополнительные копии различных генов.

- Изучение организации сопряженной со спорообразованием высокоэффективной экспрессии генов на примере параспоральных кристаллических белков Bacillus thuringiensis.

- Исследование распространенности в природных штаммах бацилл генов различных секреторных экзогидролаз, сопоставление особенностей их структуры и регуляции экспрессии.

- Разработка метода получения интактных предшественников секреторных протеаз бацилл, изучение механизма их косекреторной активации.

- Построение обобщенной модели регуляции синтеза и секреции ферментов клетками бацилл. Применение разработанной модели для получения промышленных 8 продуцентов ферментов: нейтральных протеаз Bacillus megaterium и Bacillus amyloliquefaciens, щелочной протеазы Bacillus licheniformis и мезофильной ос-амилазы В. amyloliquefaciens.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шевелев, Алексей Борисович

4. В Ы В О Д Ы

1. Разработан методический аппарат, позволяющий комплексно исследовать роль отдельных генов и их продуктов в секреции белков у бацилл. Доказано преимущество однокопийных векторов сайт-направленной интеграции перед плазмидными при исследовании регуляторных механизмов и создании штаммов-продуцентов промышленного назначения.

2. Клонировано 6 новых генов белков бацилл, вовлеченных в секрецию и споруляцию: глутамилэндопептидазы В. licheniformis, В. intermedins, В. cereus, 5-эндотоксины сгу9Аа и сгу9Ва, гены wprA В. licheniformis и

В. amyloliquefaciens.

3. С использованием размножающихся бактериальных L-форм впервые показана необходимость клеточной стенки для запуска аутопроцессинга предшественников глутамилэндопептидаз и карбоксипептидазы Т.

4. Показана способность предшественников секереторных протеиназ бацилл к мультимеризации. Выдвинута гипотеза о взаимодействии клеточной стенки бацилл с предшественниками секреторных белков в форме линейных полимеров.

5. Показано существование отрицательной обратной связи, запускающей механизм генерализованного ответа типа heat-shock в результате инактивации гена WprA, кодирующего субтилизиноподобную протеиназу, прочно связанную с клеточной стенкой. Разработана векторная система для замещения природного гена wprA интегративными кассетами, несущими регуляторные гены.

6. Сконструированы новые высокостабильные бесплазмидные штаммы продуценты нейтральных протеаз на базе Bacillus megaterium и Bacillus amyloliquefaciens, в 3-5 раз превышающие по продуктивности лучшие отечественные аналоги.

6. Благодарности

Автор выражает благодарность за предоставленные материалы сотрудниками, аспирантами и студентами Лаборатории химии белка им. В.М. Степанова ФГУП ГосНИИгенетика А.В. Серкиной, A.M. Савиловой, Г.Е. Константиновой, С.И. Новиковой, Д.В. Ребрикову, А.Э. Грановскому и Я.Н. Когану. При исследовании предшественника металлоэндопептидазы Brevibacillus brevis использованы результаты, предоставленные д.б.н. Г.Г. Честухиной, д.б.н. А.В. Сорокиным и к.б.н. Т.Ф. Горожанкиной. При разработке системы экспрессии на основе L-форм использованы лабораторные технологии, созданные в секторе клеточной биологии прокариот института Молекулярной биологии (г. Йена, Германия) под руководством проф. Й. Гумперта. Цикл работ по разработке маркерной системы на основе мини-гена устойчивости к эритромицину проведен в сотрудничестве с лабораторией под руководством проф. А. Манькина (Университет Иллинойса, Чикаго, США). Исходный материал для конструирования вектора pLF14 и вектор рСВ20 получен автором от к.б.н. В.В. Лившица и д.б.н. В.В. Алешина. Исходные материалы для проведения экспериментов по изучению карбоксипептидазы Т предоставлены А.Л. Остерманом, О.П. Загнитько и М.В. Матцем. Эксперименты по культивированию штамма В. licheniformis 103 проводились совместно с сотрудниками лаборатории генетики актиномицетов (д.б.н. Т.А. Воейкова). Работы по клонированию и секвенированию гена глутамтлэндопептидазы выполнены совместно с сотрудниками Института Молекулярной Генетики РАН д.х.н. С.В. Костровым, K.6.H. Демидюком И.В. и к.б.н. Т.А. Акимкиной, а также проф. И.П. Кураповой (Институт Кристаллографии им. В.В. Шубникова РАН). Эксперименты по тестированию биологической активности эндотоксинов В. thuringiensis выполнены на базе университета г. Падуи (Италия) совместно с проф. А. Баттисти.

Работа поддерживалась грантами РФФИ №93-04-20263-а, 96-04-50886-а, 97-04-50162-а, 98-04-48168-а, 99-04-48812-а, 00-04-48280-а, 00-04-48320-а, 02-04-48755-а, 02-04-48760-а, 03-04-48433-а, а также грантами Минэкономики и Минпромнауки РФ.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Шевелев, Алексей Борисович, Москва

1. Akita М., Sasaki S., Matsuyama S. and MizushimaS. 1990. SecA interacts with secretory proteins by recognizing the positive charge at the amino terminus of the signal peptide in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 265: 8162-8169.

2. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W. and Lipman D.J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucl. Acids Res. 15: 3389-3402.

3. Asai K., Kawamura F., Sadaie Y. and Takahashi H.J. 1997. Isolation and characterization of a sporulation initiation mutation in the Bacillus subtilis secA gene. J. Bacteriol. 179: 544-547.

4. Baardsnes J., Sidhu S., MacLeod A., Elliott J., Morden D., Watson J. and Borgford T. 1998. Streptomyces griseus protease В: secretion correlates with the length of the propeptide. J. Bacteriol. 180:3241-3244.

5. Baba T. and Schneewind O. 1998. Targeting of muralytic enzymes to the sell division site of gram-positive bacteria: repeat domains direct autolysin to the equatorial surface ring of Staphylococcus aureus. EMBO J. 17:4639-4646.

6. Banerjee S. and Hansen J.N. 1988. Structure and expression of a gene encoding the precursor of subtilin, a small protein antibiotic. J. Biol. Chem. 263:9508-9514.

7. Beaman T.C., Hitchins A.D., OchiK., VasanthaN., EndoT. and FreeseE.I. 1983. Specificity and control of uptake of purines and other compounds in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 156: 1107-1117.

8. Beck K., Wu L.F., Brunner J. and Muller M. 2000. Discrimination between SRP- and SecA/SecB-dependent substrates involves selective recognition of nascent chains by SRP and trigger factor. EMBO J. 19: 134-143.

9. Berks B.C., Sargent F. and Palmer T. 2000. The Tat protein export pathway. Mol. Microbiol. 5:260-274.

10. Bolhius A., Broekhuizen C.P., Sorokin A., van Roosmalen M.L., Venema G., Bron S., QuaxWJ. and vanDijlJ.M. 1998. SecDF of Bacillus subtilis, a molecular Siamese twin required for the efficient secretion of proteins. J. Biol. Chem. 273: 21217-21224.

11. Bolhuis A., Tjalsma H., Smith H.E., deJongA., MeimaR., Venema G., BronS. and van Dijl J.M. 1999a. Evaluation of bottlenecks in the late stages of protein secretion in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 65: 2934-2941.

12. Bolhuis A., Venema G., Quax J., BronS., vanDijlJ.M. 1999c. Functional analysis of paralogous thiol-disulfide oxidoreductases in Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 274:24531-24538.

13. Bolhuis A., Koetje E., Dubois J.-Y., Vehmaanpera J., Venema G., Bron S. and van Dijl J.M. 2000. Did the mitochondrial processing peptidase evolve from a eubacterial regulator of gene expression? Mol. Microbiol. Evol. 17: 198-201.

14. Bowie J.U. 1997. Helix packing in membrane proteins. J. Mol. Biol. 272: 780-789.

15. Boyd D., Schierle C. and Beckwith J. 1998. How many membrane proteins are there? Protein Sci. 7:201-205.

16. Braun P., Gerritse G., van Dijl J.M. and Quax W.J. 1999. Improving protein secretion by engineering components of the bacterial translocation machinery. Curr. Opin. Biotechnol. 10: 376-381.

17. Braun P., Tommassen J. and Filloux A. 1996. Role of the propeptide in folding and secretion of elastase of Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 19:297-306.

18. Briggs M.S., Cornell D.J., Dluhy R.A. and Gierasch L.M. 1986. Conformations of signal peptides induced by lipids suggest initial steps in protein export. Science 233: 206-208.

19. Bron S., Bolhuis A., Tjalsma H., Holsappel S., Venema G. and van Dijl J.M. 1998. Protein secretion and possible roles for multiple signal peptidases for precursor processing in bacilli. J. Biotechnol. 64:3-13.

20. Chambcrt R. and Petit-Glatron M.F. 1999. Anionic polymers of Bacillus subtilis cell wall modulate the folding rate of secreted proteins. FEMS Microbiol. Lett. 179:43-47.

21. Chen M. and Nagarajan V. 1994. Effect of alteration of charged residues at the N termini of signal peptides on protein export in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 176: 5796-5801.

22. Chung Y.S. and Dubnau D. 1995. ComC is required for the processing and translocation of ComGC, a pilin-like competence protein of Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 15: 543-551.

23. Chung Y.S. and Dubnau D. 1998. All seven comC open reading frames are required for DNA binding during transformation of competent Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 180: 41-45.

24. Chung Y.S., Breidt F. and Dubnau D. 1998. Cell surface localization and processing of the ComG proteins, required for DNA binding during transformation of Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 29: 905-913.

25. Cristobal S., de Gier J.W., Nielsen H. and von Heijne G. 1999. Competition between Sec- and Tat-dependent protein translocation in Escherichia coli. EMBO J. 18: 2982-2990.

26. Dalbey R.E. and Robinson С. 1999. Protein translocation into and across the bacterial plasma membrane and the plant thylacoid membrane. Trends Biochem. Sci. 24: 17-22.

27. Dalbey R.E., Lively M.O., Bron S. and van Dijl J.M. 1997. The chemistry and enzymology of the type I signal peptidases. Protein Sci. 6:1129-1138.

28. Debabov D.V., Heaton M.P., Zhang Q., Stewart K.D., Lambalot R.H., Neuhaus F.C. 1996. The D-Alanyl carrier protein in Lactobacillus casei: cloning, sequencing, and expression of dltC. J. Bacteriol. 178(13): 3869-3876.

29. Deuerling E., Mogk A., Richter C., Purucker M. and Schumann W. 1997. The ftsH gene of Bacillus subtilis is involved in major cellular processes such as sporulation, stress adaptation and secretion. Mol. Microbiol. 23: 921-933.

30. Errington J. 1993. Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expression and control of morphogenesis. Microbiol. Rev. 57:1-33.

31. Fahnestock S.R. and Fisher K.E. 1986. Expression of staphylococcal protein A gene in Bacillus subtilis by gene fusions utilizing the promoter from Bacillus amyloliquefaciens a-amylase gene. J. Bacteriol. 165:796-804.

32. Fekkes P. and Driessen A.J.M. 1999. Protein targeting to the bacterial cytoplasmic membrane. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63: 161-173.

33. Fekkes P., van dcr Does C. and Driessen A.J. 1997. The molecular chaperone SecB is released from the carboxyl terminus of SecA during initiation of precursor protein translocation. EMBO J. 16:6105-6113.

34. Franke C.M., Tiemersma J., Venema G. and KokJ. 1999. Membrane topology of the lactococcal bacteriocin ATP-binding cassette transporter protein LcnC. Involvement of LcnC in lactococcin maturation. J. Biol. Chem. 274: 8484-8490.

35. Gruss A. and Ehrlich D. 1988. Insertion of foreign DNA into plasmids from gram-positive bacteria induces formation of high-molecular-weight plasmid multimers. J Bacteriol. 170(3): 1183-1190.

36. Gumpert J. and Taubeneck U. 1983. Characteristic properties and biological significance of stable protoplast type L-forms. Experientia Suppl. 46:227-241.

37. Hartl F.U., Lccker S., Schiebel E., Hcndrick J.P. and Wickncr W. 1990. The binding cascade of SecB to SecA to SecY/E mediates pre-protein targeting to the E. coli plasma membrane. Cell 63:269-279.

38. Havarstein L.S., Diep D.B. and Nes I.F. 1995. A family of bacteriocin ABC transporters carry out proteolytic processing of their substrates concominant with export. Mol. Microbiol. 16:229-240.

39. Hell K., Herrmann J.M., Pratje E., Ncupert W. and Stuart R.A. 1998. Oxalp, an essential component of the N-tail protein export machinery in mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2250-2255.

40. Ilirose I., Sano K., Shioda I., Kumano M., Nakamura K. and Yamane K. 2000. Proteome analysis of Bacillus subtilis extracellular proteins: a two-dimensional protein electrophoretic study. Microbiology 146:65-75

41. Hofmcister A. 1998. Activation of the proprotein transcription factor pro-sigma E is associated with its progression through three patterns of subcellular localization during sporulation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 180:2426-2433.

42. Hynds P.J., Robinson D. and Robinson C. 1998. The sec-independent twin-arginine translocation system can transport both tightly folded and malfolded proteins across the thylakoid membrane. J. Biol. Chem. 273: 34868-34874.

43. Jensen C.L., Stephenson K., Jorgensen S.T. and Harwood C. 2000. Cell-associated degradation affects the yield of secreted engineered and heterologous proteins in the Bacillus subtilis expression system. Microbiology 146:2583-2594.

44. Jiang M., Grau R. and Perego M. 2000. Differential processing of propeptide inhibitors of Rap phosphatases in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 182:303-310.

45. Jungnickel B*, Rapoport T.A. and Hartmann E. 1994. Protein translocation: common themes from bacteria to man. FEBS Lett. 346: 73-77.

46. Keiler K.C., Waller P.R. and Sauer R.T. 1996. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science 271:990-993.

47. Kessler E. 1995. Beta-lytic endopeptidases. Methods Enzymol. 248: 740-756.

48. Kessler E. and Safrin M. 1988. Partial purification and characterization of an inactive precursor of Pseudomonas aeruginosa elastase. J. Bacteriol. 170: 1215-1219.

49. Kessler E., Safrin M., Gustin J.K. and Ohman D.E. 1998. Elastase and the LasA protease of Pseudomonas aeruginosa are secreted with their propeptides. J. Biol. Chem. 273: 30225-30231.

50. Kihara A., Akiyama Y. and Ito K. 1999. Dislocation of membrane proteins in FtsH-mediated proteolysis. EMBO J. 18:2970-2981.

51. Knoblauch N.T., Rudiger S., Schonfeld H.J., Driesscn A.J.M., Schneider-Mcrgener J. and Bukau B. 1999. Substrate specificity of the SecB chaperone. J. Biol. Chem. 274: 34219-34225.

52. Kontinen V.P. and Sarvas M. 1993. The PrsA lipoprotein is essential for protein secretion in Bacillus subtilis and sets a limit for high-level secretion. Mol. Microbiol. 8: 727-737.

53. Kopito R.R. 1997. ER quality control: the cytoplasmic connection. Cell 88:427-430.

54. Kumamoto C.A. and Francetic O. 1993. Highly selective binding of nascent polypeptides by an Escherichia coli chaperone protein in vivo. J. Bacteriol. 175: 2184-2188.

55. Kunst F., Ogasavara N., Moszer I., Albertini A.M., AHoni G., Azevedo V., Bertero M.G., Bessieres P., Bolotin A., Borchert S. et al. 1997. The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature 390: 249-256.

56. LaPointe C.F. and Taylor R.K. 2000. The tipe IV prepilin peptidases comprise a novel family of aspartic acid proteases. J. Biol. Chem. 275: 1502-1510.

57. Lee S.J., Kim D.M., Bae K.Il., Byun S.M. and Chung J.II. 2000. Enhancement of secretion and extracellular stability of staphylokinase in Bacillus subtilis by wprA gene disruption. Appl. Environ. Microbiol. 66: 476-480.

58. Le Loir Y., Gruss A., Ehrlich S.D. and Langella P. 1998. A nine-residue synthetic propeptide enhances secretion efficiency of heterologous proteins in Lactococcus lactis. J. Bacteriol. 180:1895-1903.

59. Le Loir Y., Nouaillc S., Commissaire J., Bretigny L., Gruss A. and Langella P. 2001. Signal peptide and propeptide optimization for heterologous protein secretion in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 67:4119-4127.

60. Leshchinskaya I.B., Shakirov E.V., Itskovich E.L., Balaban N.P., Mardanova A.M., Sharipova M.R., Viryasov M.B., Rudenskaya G.N. and StepanovV.M. 1997. Glutamyl endopeptidase from Bacillus intermedius, strain 3-19. FEBS Lett. 404: 241-244.

61. Lill R., Crooke E., Guthrie B. and Wickner W. 1988. The "trigger factor cycle" includes ribisomes, presecretory proteins and the plasma membrane. Cell 54: 1013-1018.

62. Magnuson R., Solomon J. and Grossman A.D. 1994. Biochemical and genetic characterization of a competence pheromone from Bacillus subtilis. Cell 77: 207-216.

63. MansfeId J., Vriend G., Dijkstra B.W., Veltman O.R., van den Burg O.R., Venema G., Uibrich-Hofmann R. and EijsinkV.G. 1997. Extreme stabilization of a thermophlysin-like protease by an engeneered disulfide bond. J. Biol. Chem. 272:11152-11156.

64. Maguin E., Duwat P., Hege Т., Ehrlich D., Gruss A. 1992. New thermosensitive plasmid for gram-positive bacteria. J. Bacteriol. 174(17): 5633-5638.

65. Margot P., Wahlen M., Gholamhoscinian A., PiggotP. and Karamata D. 1998. The lytE gene of Bacillus subtilis 168 encodes a cell wall hydrolase. J. Bacteriol. 180: 749-752.

66. Matsumoto G., Mori H. and Ito K. 1998. Roles of SecG in ATP- and SecA- dependent protein translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13567-13572.

67. Matsuyama S., Tajima T. and Tokuda II. 1995. A novel periplasmic carrier protein involved in the sorting and transport of Escherichia coli lipoproteins destined for the outer membrane. EMBO J. 14:3365-3372.

68. Matsuyama S., Yokota N. and Tokuda H. 1997. A novel outer membrane lipoprotein, LolB (HemM), involved in the LolA (p20)-dependent localization of lipoproteins to the outer membrane of Escherichia coli. EMBO J. 16: 6947-6955.

69. Mazmanian S.K., Liu G., Ton-That H. and Schneewind O. 1999. Staphylococcus aureus sortase, an enzyme that anchors surface proteins to the cell wall. Science 285: 760-763.

70. Mclver K.S., Olson J.C. and Ohman D.E. 1993. Pseudomonas aeruginosa lasBl mutants produce an elastase, substituted at active-site His-223, that is defective in activity, processing, and secretion. J. Bacteriol. 175:4008-4015.

71. Miller J.R., Kovacevic S. and Veal L.E. 1987. Secretion and processing of staphylococcal nuclease by Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 169: 3508-3514.

72. Miiller J., OzegowskiJ., Vettermann S., SwavingJ., vanWelyK.II. and Driessen A.J.M. 2000. Interaction of Bacillus subtilis CsaA with SecA and precursor proteins. Biochem. J. 348: 367-373.

73. Nakamura K., Yahagi S., Yamazaki T. and Yamane K. 1999. Bacillus subtilis histone-like protein, HBsu, is an integral component of a SRP-like particle that can bind the Alu domain of small cytoplasmic RNA. J. Biol. Chem. 274:13569-13576.

74. Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S. and von Heijne G. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng. 10: 1-6.

75. Novak P. and DevI.K. 1988. Degradation of a signal peptide by protease IV and oligopeptidase A. J. Bacteriol. 170: 5067-5075.

76. Ogura A., Kakeshita H., Honda K., Takamatsu H., Nakamura K. and Yamane K. 1995. srb: a Bacillus subtilis gene encoding a homologue of the alpha-subunit of the mammalian signal recognition particle receptor. DNA Res. 2:95-100.

77. Paetzel M., Dalbey R.E. and Strynadka N.C. 1998. Crystal structure of a bacterial signal peptidase in complex with a beta-lactam inhibitor. Nature 396:186-190.

78. Palva I. 1982. Molecular cloning of a-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens and its expression in Bacillus subtilis. Gene 19: 81-87.

79. Perego M. 1997. A peptide export-import control circuit modulating bacterial development regulates protein phosphatases of the phosphorelay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 8612-8617.

80. Pohlschroder M., PrinzW.A., Hartmann E. and Beckwith J. 1997. Protein translocation in the three domains of life: variations on a theme. Cell 91: 563-566.

81. Pooley H.M., Merchante R. and Karamata D. 1996. Overall protein content and induced enzyme components of the periplasm of Bacillus subtilis. Microbiol. Drug Resist. 2:9-15.

82. Popham D.L., Helin J., Costello C.E. and SetlowP. 1996. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J. Bacteriol. 178: 6451-6458.

83. Popham D.L., Meador-Parton J., Costello C.E. and SetlowP. 1999. Spore peptidoglycan structure in cwlD dacB double mutant of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 181: 6205-6209.

84. Powers T. and Walter P. 1997. Co-translational protein targeting catalyzed by the Escherichia coli signal recognition particle and its receptor. EMBO J. 16:4880-4886.

85. Prozorov A.A., Bashkirov V.I., Khasanov F.K., Glumova E.F., Irich V.Y. 1985. Insertion of eukaryotic DNA into the Bacillus subtilis genome by means of a temperature-sensitive plasmid vector. Gene. 34(1): 39-46.

86. Pugsley A.P. 1993. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57: 50-108.

87. Pugsley A.P., Francetic O., Possot O.M., SauvonnetN. and HardieK.R. 1997. Recent progress and future directions in studies of the main terminal branch of the general secretory pathway in gram-negative bacteria. Gene 192: 13-19.

88. Quax W.J. 1997. Merits of secretion of heterologous proteins from industrial microorganisms. Folia Microbiol. (Prague) 42: 99-103.

89. Rosenow C., Ryan P., Weiser J.N., Johnson S., Fontan P., Ortqvist A. and Masure H.R. 1997. Contribution of novel choline-binding proteins to adherence, colonization and immunogenecity of Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 25: 819-829.

90. Sadaie Y. and Kada T. 1985. Bacillus subtilis gene involved in cell division, sporulation, and exoenzyme secretion. J. Bacteriol. 163: 648-653.

91. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. 1989. Molecular cloning; 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol.3, New York, NY.

92. Sargent F., Stanley N.R., Berks B.C. and Palmer T. 1999. Sec-independent protein translocation in Escherichia coli: a distinct and pivotal role for the TatB protein. J. Biol. Chem. 274: 36073-36082.

93. Schatz G. and Dobberstein B. 1996. Common principles of protein translocation across membranes. Science 271:1519-1526.

94. Schneewind O., Fawler A. and Faull K.F. 1995. Structure of the cell wall anchor of surface proteins in Staphylococcus aureus. Science 268: 103-106.

95. ScottiP.A., UrbanusM.L., BrunnerJ., deGierJ.W., von Heijne G., van der Does C., Driessen A.J.M., Oudega B. and Luirink J. 2000. YidC, the Escherichia coli homologue of mitochondrial Oxalp, is a component of the Sec translocase. EMBO J. 19: 542-549.

96. Серкипа A.B., Бушуева A.M. (Савилова), Честухина Г.Г., Гумперт Й., Хойшеп К., КуяуМ., Шевелев А.Б. 2001. Получение предшественника глутамилэндопептидазы В. licheniformis и изучение его процессинга in vitro. Вопр. Мед. Хим. 47: 111-122.

97. Settles A.M., Yonetani A., Baron A., Bush D.R., Clinе К. and Martienssen R. 1997. Sec-independent protein translocation by the maize Hcfl06 protein. Science 278: 1467-1470.

98. Seydel A., Gounon P. and Pugsley A.P. 1999. Testing the "+2 rule" for lipoptotein sorting in the Escherichia coli cell envelope with a new genetic selection. Mol. Microbiol. 34: 810-821.

99. Siegel V. and Walter P. 1988. Each of the activities of signal recognition particle (SRP) is contained within a distinct domain: analysis of biochemical mutants of SRP. Cell 52:39-49.

100. Simonen M. and Palva I. 1993. Protein secretion in Bacillus species. Microbiol. Rev. 57:109-137.

101. Sipos L. and von Heijne G. 1993. Predicting the topology of eukaryotic membrane proteins. Eur. J. Biochem. 213: 1333-1340.

102. Solomon J.M., Magnuson R., Srivastava A. and Grossman A.D. 1995. Convergent sensing pathways mediate response to two extracellular competence factors in Bacillus subtilis. Genes Dev. 9: 547-558.

103. Stephenson K. and Harwood C.R. 1998. Influence of a cell wall-associated protease on production of alpha-amylase by Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 64:2875-2881.

104. Stephenson K., Carter N.M., Harwood C.R., Petit-Glatron M.F. and Chambert R. 1998. The influence of protein folding on the late stages of the secretion of a-amylases from Bacillus subtilis. FEBS Lett. 430: 385-389.

105. Stover A.G. and Driks A. 1999. Secretion, localization, and antibacterial activity of TasA, a Bacillus subtilis spore-associated protein. J. Bacteriol. 181:1664-1672.

106. Stragier P. and Losick R. 1996. Molecular genetics of sporulation in Bacillus subtilis. Annu. Rev. Genet. 30: 297-341.

107. Sturmfels A., Gotz F. and PeschelA. 2001. Secretion of human growth hormone by the food-grade bacterium Staphylococcus carnosus requires a propeptide irrespective of the signal peptide used. Arch. Microbiol. 175:295-300.

108. Suciu D. and M. Inouye. 1996. The 19-residue pro-peptide of staphylococcal nuclease has a profound secretion-enhancing ability in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 21: 181-195.

109. Sutcliffe I.C. and Russell R.R.B. 1995. Lipoproteins of gram-positive bacteria. J. Bacteriol. 177:1123-1128.

110. Svendsen I. and Breddam K. Isolation and amino acid sequence of a glutamic acid specific endopeptidase iromBacillus licheniformis. 1992. Eur. J. Biochem. 204: 165-171.

111. Swaving J., van Wely K.II. and Driessen A.J.M. 1999. Pre-protein translocation by a hybrid translocase composed of Escherichia coli and Bacillus subtilis subunits. J. Bacteriol. 181:7021-7027.

112. Taura Т., Akiyama Y. and Ito K. 1994. Genetic analysis of SecY: additional export-defective mutations and factors affecting their phenotypes. Mol. Gen. Genet. 243:261-269.

113. Tjalsma H., Zanen G., Venema G., Bron S. and van Dijl J.M. 1999c. The potential active site of the lipoprotein-specific (type II) signal peptidase of Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 274:28191-28197.

114. Tjalsma H., Bolhius A., Jongbloed J.D.H., Bron S. and van Dijl J.M. 2000. Signal peptide-dependent protein transport in Bacillus subtilis: a genome-based survey of the secretome. Microbiol, and Mol. Biol. Rew. 64: 515-547.

115. Tomilin N.V. and Hofemeister J. 1982. Site-specific recA-independent recombination (fusion) of pMB8-related replicons in Escherichia coli in the region of the replication origins. Gene. 17(1): 65-73.

116. Ulbrandt N.D., Newitt J.A. and Bernstein II.D. 1997. The Escherichia coli signal recognition particle is required for the insertion of a subset of inner membrane proteins. Cell 88: 187-196.

117. Wallin E. and von Heijne G. 1997. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Sci. 7: 1029-1038.

118. Weiner J.H., Bilous P.T., Shaw G.M., Lubitz S.P., Frost L., Thomas G.IL, Cole J.A. and Turner R.J. 1998. A novel and ubiquitous system for membrane targeting and secretion of cofactor-containing proteins. Cell 93: 93-101.

119. Wetmore D.R., Wong S.L. and Roche R.S. 1992. The role of the pro-sequence in the processing and secretion of the thermolysin-like neutral protease from Bacillus cereus. Mol. Microbiol. 6:1593-1604.

120. Wild J., Rossmeissl P., Walter A. and Gross C.A. 1996. Involvement of the DnaK-DnaJ-GrpE chaperone team in protein secretion in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178: 3608-3613.

121. Young E.F. Spizizcn J. 1961. Physiological and genetic factors affecting transformation of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 81: 823-829.

122. Zheng G., Yan L.Z., Vederas J.C. and Zuber P.J. 1999. Genes of the sbo-alb locus of Bacillus subtilis are required for production of the antilisterial bacteriocin subtilosin. J. Bacteriol. 181:7346-7355.

123. Zhu X.L., Ohta Y., Jordan F. and Inouye M. 1989. Pro-sequence of subtilisin can guide the refolding of denatured subtilisin in an intermolecular process. Nature 339:483-484.