Регуляция синтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius в стационарной фазе роста рекомбинантных штаммов Bacillus subtilis

Частухина, Инна Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция синтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius в стационарной фазе роста рекомбинантных штаммов Bacillus subtilis
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция синтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius в стационарной фазе роста рекомбинантных штаммов Bacillus subtilis"

На правах рукописи УДК 579 852 11

ЧАСТУХИНА ИННА БОРИСОВНА

РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗЫ Bacillus intermedium В СТАЦИОНАРНОЙ ФАЗЕ РОСТА РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ Bacillus subtilis

03 00 07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2004

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии Казанского государственного университета

Научный руководитель1 доктор биологических наук, профессор

Шарипова Маргарита Рашидовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ведущий научный

Защита диссертации состоится 16 декабря 2004 г. в 1300 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете, 420008, г.Казань, ул Кремлевская, 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета

Автореферат разослан_2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

сотрудник Эль-Регистан Галина Ивановна (Институт микробиологии РАН, г Москва)

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Коксин Владимир Петрович (РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ, г.Казань)

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт (ГНИЙ) Генетика РАН, г.Москва

кандидат биологических наук

noos-ч 921329

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Представители рода Bacillus в ходе эволюции выработали сложную и разветвленную регуляторную систему, которая включает транскрипционную модификацию группы генов, контролирующих клеточную дифференцировку, индукцию ряда стрессовых белков, а также синтез ферментов деградации (рибонуклеаз, протеиназ, фосфатаз и др.). В основе формирования бактериями адаптивных ответов лежит механизм сигнальной трансдукции, а именно, двухкомпонентная система регуляции экспрессии генов. Определенные гены активируются регуляторными белками разных двухкомпонентных систем. Сложные взаимодействия между двухкомпонентными системами, образующими сеть сигнальной трансдукции, контролируются на более высоком уровне, объединяющем все генетические ответы клетки. Вклад разных систем регуляции в контроль экспрессии гена можно оценить с помощью модельных систем с мутациями в регуляторных белках. Определение молекулярных механизмов регуляции синтеза гидролитических ферментов позволит направленно влиять на уровень продукции тех из них, которые интересны в практическом отношении. Протеиназы бацилл широко используются в медицине: при лечении ожоговых поражений, для ускорения заживления ран, при защите организма от вирусных инфекций и роста раковых клеток, а также в производстве моющих средств, кожевенной и пищевой промышленности.

Бактерии B.intermedius наряду с рибонуклеазой и фосфатазой секретируют сериновые протеиназы, одна из которых относится к группе глутамилэндопептидаз -ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные карбоксильными группами глутаминовой и аспарагиновой кислот (Leschinskaya et al., 1997). Клонирование и секвенирование гена глутамилэндопепидазы B.intermedius (Rebrikov et al., 1999) открыло возможность изучения механизмов регуляции биосинтеза фермента. В связи с тем, что бациллярные ферменты имеют практическую значимость, результаты исследования регуляции их синтеза могут быть использованы в биотехнологии, например, для повышения выхода ферментов путем клонирования и модификации генов с эффективными регуляторными элементами.

Целью работы явилось выяснение молекулярных механизмов регуляции

биосинтеза глугамилэндопептидазы B.intermediiu ЮСешдооиВДЫОДбрантньши штаммами В subtilis в стационарной фазе роста. БИБЛИОТЕКА

1БЛИОТЕКА

В работе решались следующие задачи:

1. Исследование закономерностей биосинтеза глутамилэндопептидазы В.ШегтеШш рекомбинантными штаммами В.шЬНШ под влиянием различных экзогенных факторов в стационарной фазе роста бактерий.

2. Анализ структуры промоторной области гена глутамилэндопептидазы В Шегше&ш.

3. Выяснение роли регуляторных белков двухкомпонентной сигнально-сенсорной системы КпА^роОР/ЗроОА в регуляции экспрессии гена глутамилэндопептидазы В.ШегтеШш.

4. Исследование влияния спороспецифичных а-факторов транскрипции на экспрессию гена глутамилэндопептидазы В. Шегте/Иш.

5. Определение вклада регуляторных Оег-белков, активных в период прорастания спор, на регуляцию экспрессии гена глутамилэндопептидазы В.ШегтеШш.

Научная новизна. К началу настоящей работы интерес исследователей был направлен на изучение регуляции синтеза бациллярной внеклеточной сериновой протеиназы - глутамилэндопептидазы - факторами внешней среды. Новизна данной работы заключается в качественно новом уровне изучения регуляторных механизмов биосинтеза данного фермента Впервые проведено изучение регуляции синтеза глутамилэндопептидазы В.МегтеШш на молекулярном уровне в связи с процессом клеточной дифференцировки. Выяснены основные закономерности биосинтеза глутамилэндопептидазы ВЛШегте^ш рекомбинантными штаммами В^иЬИШ в стационарной фазе роста бацилл. Впервые установлено, что в стационарной фазе экспрессия гена глутамилэндопептидазы не регулируется по типу катаболитной репрессии, в отличие от стадии вегетативного роста бактерий. Получены приоритетные данные, свидетельствующие о том, что экспрессия гена глутамилэндопептидазы В.ШегтеШш подвергается позитивной регуляции со стороны основных регуляторных белков системы 8роОА-фосфопереноса, спороспецифичных а-факторов транскрипции, регуляторных Оег-белков. Полученные результаты позволили установить, что контроль активности гена gse Б1 осуществляется по перекрестному типу регуляции.

Практическая ценность работы. Разработана питательная среда, обеспечивающая высокий уровень продукции глутамилэндопептидазы В.МегтеШш рекомбинантными штаммами В.шЬНШ в стационарной фазе роста, которая может быть использована для препаративного получения фермента. Сведения об установленных механизмах контроля экспрессии гена глутамилэндопептидазы в стационарной фазе роста могут быть полезны при разработке стратегии

направленного синтеза протеолитических ферментов промышленными штаммами спорообразующих бактерий. Данные о механизмах функционирования регуляторных систем поздних белков бацилл могут послужить основой для направленной модификации промоторной области гена с целью получения высокопродуктивных штаммов в условиях ограниченного роста бацилл.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на Международном конгрессе по микробиологии FEMS "Bacillus-2003" (Словения, 2003), 7-ом Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов в области биотехнологии "Биотехнология-2003" (Пущино, 2003), ежегодных научных конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003, 2004) и ежегодных школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003, 2004), 3-й Междисциплинарной конференции с международным участием ("НБИТТ-21") (Петрозаводск, 2004), Всероссийской научной конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 28 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве штамма-реципиента для плазмид с геном глутамилэндопептидазы В. intermedius использовали штамм B.subtilis AJ73 (amyE4, npr512, арг73), из хромосомы которого делетированы гены внеклеточных протеиназ, любезно предоставленный проф. Ю.Йомантасом, ГНИЙ Генетика. Бактериальные штаммы B.subtilis, дефектные по spo-, kin- и ger-генам, получены из коллекции Bacillus Genetic Stock Center (BGSC). В работе использовали мультикопийные плазмиды pV и Д58.21, сконструированные на основе вектора рСВ22, отличающиеся по размеру фрагмента хромосомной ДНК В intermedius (Rebrikov et al., 1999). Плазмиды любезно предоставлены для работы проф. СВ. Костровым, Институт молекулярной генетики РАН.

Культивирование штаммов В. subtilis, дефектных по 5ро-генам, проводили на среде LB (Sambrook et al., 1989). При культивировании клеток рекомбинантного штамма B.subtilis AJ73 pV в, качестве исходной использовали среду следующего состава (%): пептон -1.7; дрожжевой экстракт - 0.5; желатин -1.0; СаС12х2Н2О - 0.01;

мя804х7н20 - 0.05; №С1 - 0.3; М^04- 0.01; МИ4С1 - 0.01; Ш2ЫР04 - 0.036; рН - 8.5. При культивировании клеток рекомбинантного штамма В subtihs АГ73 Д58.21 в качестве исходной использовали среду следующего состава (%): пептон - 2.4; дрожжевой экстракт - 1.0; желатин - 1.0; СаС12х2Н2О - 0.02; MgSO4x7H2O - 0 03; №С1 - 0.3; М^04- 0.01; Ш2ЫР04 - 0.03; рИ - 8.5.

В среды для рекомбинантных штаммов В subtihs добавляли эритромицин и хлорамфеникол в концентрации 20 мкг/мл, т.к. плазмиды рУ и Д58.21 несут гены устойчивости к данным антибиотикам, соответственно. Культивирование проводили при 30°С. Раствор неорганического фосфата (Ка2ЫР04), растворы КЫ4С1 и С6Н607(КН4)2, желатин, казеин и глюкозу (1%), а также соли металлов вносили стерильно перед посевом.

Прирост биомассы измеряли нефелометрически на КФК-2 при 590 нм. Продуктивность культуры (удельную активность) определяли как отношение активности фермента в культуральной жидкости к количеству биомассы и выражали в условных единицах или процентах. Белок определяли спектрофотометрически, считая, что концентрация белка 1 мг/мл соответствует А280 = 1 оптической единице (опт. ед.) при 280 нм в кювете толщиной 1 см. Протеолитическую активность определяли по синтетическому хромогенному субстрату 2-01и-рКЛ (Мосолова с соавт, 1987).

Для выявления эндоспор мазок окрашивали по Граму (Гусев и Минеева, 1992), фазы спорообразования рассчитывали, как описано (Шлегелъ, 1987).

Для выделения и очистки глутамилэндопептидазы использовали ионообменную хроматографию на КМ-целлюлозе и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).

Степень чистоты препаратов и молекулярную массу глутамилэндопептидазы определяли электрофорезом в 12.5%-ном ПААГ в присутствии 0.1% по методу

Лаэммли (ЬаегатИ, 1970).

Протопласты получали после инкубации клеток с лизоцимом. Активность фермента определяли в кулвтуральной жидкости, во фракции клеточной стенки, полученной после удаления протопластов центрифугированием, во фракции мембранных белков путем солюбилизации протопластов растворами солей металлов высокой концентрации (2М MgC12, 2М СаС12), во фракции цитоплазмы, полученной после лизиса протопластов и осаждения нуклеиновых кислот

Гидролиз гомогенных препаратов глутамилэндопептидазы проводили модифицированы^ трипсином ("Promega") в геле после элекрофореза в 12.5%-ном ПААГ в присутствии 0.1% Надгелевый раствор использовали для получения

масс-спектров на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре "Reflex III BRUKER" (Германия).

Выделение плазмид и трансформацию клеток B.subtilis проводили стандартными методами (Гловер, 1988).

- Математическую обработку результатов проводили в программной среде Microsoft Exel путем расчета среднеквадратичного отклонения (а). Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении В качестве

критерия достоверности получаемых разностей использовали критерий Стьюдента, принимая Р<0.05 за достоверный уровень значимости.

Обработка результатов многофакторных экспериментов проводилась с помощью программы STATGRAPHICS Plus for Windows (Version 2.1) для персональных компьютеров, позволяющей выводить на экран уравнения регрессии, выводы о степени достоверности модели, графическое изображение поверхности отклика.

Обработку результатов масс-спектрометрии препаратов

глутамилэндопептидазы проводили с использованием интернет-программы Matrix Science (http: //www.matiixscience.com/).

Потенциальные -10 и -35 области для узнавания с^ фактором транскрипции идентифицировали в промоторной области гена глутамилэндопептидазы B.intermedius при использовании сервера Softberry BPROM network (Helmann, 1995). Потенциальные участки связывания с сигма-факторами транскрипции и с белками-регуляторами SpoOA, CcpA и AbrB в регуляторной области гена gse Bi были идентифицированы с использованием интерактивной программы BLAST.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Динамика роста, биосинтеза глутамилэщопептилазы B.intermedius и спорообразования рекомбинантных штаммов B.subtilis

Синтез ферментов катаболизма у микроорганизмов представляет собой двухфазный процесс, при котором максимальный синтез белка наступает в период замедления или полного прекращения роста культуры (Coleman et al., 1975). Глутамилэндопептидаза B.intermedius появляется в культуральной жидкости в стадии замедления роста бактерий (Gabdrakhmanova et al., 1999). На рис.1 представлены динамика роста, спорообразования и накопления глутамилэндопептидазы в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов B.subtilis AJ73, несущих плазмиды pV и А58.21 с геном глутамилэндопептидазы В intermedius.

0D, А, П A Споры,% OD, А, П D Споры,%

40 о и rV-VI vil ^ 60 20 ~ 0 II IV-VI VII 60

2 22 42 62 82 2 22 42 62 84

Время, ч Время, ч

Рис.1. Динамика роста, биосинтеза глутамилэндопептидазы и спорообразования рекомбинантных штаммов (А) В subtilis AJ73 pV и (Б) В subtilis AJ73 Д58 21: 1 -OD590, опт. ед; 2 - А, активность глутамилэндопептидазы, ед/мл; 3 - П, продуктивность синтеза глутамилэндопеггтидазы, уел ед; 4 - споры, %; 0-VII - стадии спорообразования 100% - общее количество вегетативных и спорулирующих клеток, о <10%

Выбор в качестве объектов исследования рекомбинантных штаммов обусловлен тем, что нативный штамм Bmtermedms секретирует в среду ряд внеклеточных протеолитических ферментов - субтилизин, глутамилэндопептидазу и металллопротеазу. При изучении путей регуляции биосинтеза индивидуальной протеиназы наложение пула ферментов затрудняет процесс исследования и искажает полученные результаты. Напротив, из хромосомы штамма Bsubtihs AJ73, использованного нами в качестве реципиента, делегированы гены внеклеточных протеиназ, что позволяет оценить влияние экзогенных факторов на модели, когда синтезируется и секретируется только один из этих белков.

Для того, чтобы оценить влияние дополнительных регуляторных областей, присутствующих на мультикопийных плазмидах в работе использовали две плазмиды pV и Д58.21, отличающиеся по размеру фрагмента хромосомной ДНК B.intermedius (Rebrikov et al., 1999). Плазмида pV несет 6,2 kb фрагмент ДНК В intermedius, включающий полный ген глутамилэндопептидазы и прилегающие к нему области хромосомной ДНК B.intermedius. Плазмида А58.21 содержит Pstl-ВатШ локус клонированного в составе плазмиды pV фрагмента ДНК В intermedius и биосинтез глутамилэндопептидазы протекает под контролем собственных регуляторных элементов.

Для обоих рекомбинантных штаммов, наряду с накоплением фермента в стадии замедления роста нами обнаружены два пика глутамилэндопептидазной активности в стационарной фазе, соответствующие 48 ч и 78 ч роста, которые в 1,5-2 раза превышают уровень накопления фермента в фазе замедления роста и соответствуют У-У11 стадиям спорообразования. Этот факт находится в полном соответствии с положением о взаимоотношениях между скоростью роста штамма и скоростью накопления катаболических ферментов в среде: чем ниже скорость роста, тем выше скорость образования ферментов деградации (Цаплина, 1979). Прекращение роста бактерий может способствовать накоплению протеолитических ферментов, синтез которых становится нерепрессированным.

Характер динамики биосинтеза глутамилэндопептидазы у обоих рекомбинантных штаммов В.шЬНШ идентичен характеру биосинтеза фермента у исходного штамма В.МегтеЛш (Балабан с соавт., 20036): наблюдаются те же пики активности протеиназы в фазе замедления роста и в стационарной фазе. Эти результаты свидетельствуют о корректном протекании процессов биосинтеза глутамилэндопептидазы В. ШегтеШш в рекомбинантных клетках B.suЬtilis.

2. Закономерности биосинтеза глутамилэндопептидазы ВлШегтеМж рекомбинантными штаммами В.тЬНШ под влиянием экзогенных факторов в стационарной фазе роста бактерий

Клетки, несущие плазмиды, тратят часть ресурсов, которые в обычных условиях используются для роста и репродукции, на репликацию гетерологичных плазмид и экспрессию чужеродных генов (ЬешЫ, ^иеп, 1988). Для выяснения условий биосинтеза глутамилэндопептидазы В.МегтеШш рекомбинантными штаммами B.suЬtШs мы исследовали влияние ряда факторов среды на эффективность продукции фермента в стационарной фазе роста бактерий.

Влияние экзогенной глюкозы на биосинтез глутамилэндопептидазы рекомбинантными штаммами В.шЬШк. При внесении глюкозы в среду культивирования на разные,часы роста бактерий установлено, что добавление глюкозы до стационарной фазы роста (0 ч, 6-й и 10-й ч) приводит к резкому снижению продуктивности фермента (более чем на 90%). Внесение глюкозы в среду начиная с 20-го ч роста вызывало снижение удельной активности глутамилэндопептидазы на 10%, внесение после 30-го ч роста приводило к возрастанию уровня продуктивности глутамилэндопептидазы в среднем на 10-15%.

Таким образом, в отличие от биосинтеза фермента в фазе замедления роста, синтез гаутамилэндопепгидазы рекомбинантными штаммами В.яиЫШя в стационарной фазе не подвержен катаболитной репрессии. Полученные результаты свидетельствуют о различиях в механизме регуляции экспрессии гена глутамилэндопептидазы на разных этапах развития бациллярной культуры - во время вегетативного роста и в период образования эндоспор.

Влияние пептона и неорганического фосфата на биосинтез глутамилэндопептидазы рекомбинантными штаммами B.subtilis. Нами подобран состав питательной среды для максимальной продукции глутамилэндопептидазы В.ШегтеШш рекомбинантными штаммами ВлиЪШй в стационарной фазе роста. В результате постановки многофакторных экспериментов установлены различия в содержании основных компонентов питательной среды - пептона и неорганического фосфата. В стационарной фазе роста культуры для синтеза фермента рекомбинантным штаммом В.яиЫШя АГ73 рУ требуется в 2 раза меньшее содержание неорганического фосфата в среде по сравнению с биосинтезом фермента этим же штаммом в фазе замедления роста (Габдрахманова с соавт., 2000). Для биосинтеза протеазы рекомбинантным штаммом ВлиЪШй А73 Д58.21 в стационарной фазе требуется в 6 раз меньше пептона в среде, чем в фазе замедления роста (ОаЬсЫАтапоуа е! а1., 2002). Возможно, это объясняется меньшей потребностью в источниках питания при переходе части клеток в покоящееся состояние. Потребность в пептоне штамма В ¡иЫШя ЛД73 Д58.21 для оптимальной продукции глутамилэндопептидазы на поздних стадиях роста в 5 раз меньше по сравнению с исходным штаммом В.Шегте&ш (Балабан с соавт., 20036) и рекомбинантным штаммом В.яиЫШя ЛД73 рУ. Полученные результаты мы связываем с предполагаемыми различиями в регуляции биосинтеза фермента, которые могут определяться присутствием дополнительного гена на мультикопийной плазмиде рУ. Секвестрование генома В.яиЪШя показало, что у бактерий гены расположены близко относительно друг друга так, что практически отсутствуют межгенные участки и, более того, соседние гены могут перекрываться в области 3'-5'-концевых последовательностей. Таким образом, экспрессия гена может зависеть от соседнего близко расположенного гена и, в частности, от его промоторов. В плазмиде Д58.21 (2.6 кЬ) на 5'-конце последовательности фрагмента хромосомной ДНК В.ШегтеШш, содержащей ген &>е, имеется протяженная область соседнего гена, которая была идентифицирована как КАБ-связывающий домен. В более крупной плазмиде рУ

(6.2kb) ген гидрогеназы расположен целиком перед геном глутамилэндопептидазы (Костров, 2001), включая область регуляции, которая может влиять на экспрессию гена шугамилэццопептидазы B. intermedius в рекомбинантных штаммах.

Влияние ионов аммония на биосинтез глутамилэндопептидазы рекомбинантными штаммами B.subtilis. Нами показано, что введение в среду дополнительного неорганического источника азота (4 мМ хлорида аммония и 5мМ цитрата аммония) оказывает положительный эффект на продукцию глутамилэццопептицазы рекомбинантным штаммом B.subtilis AJ73 pV на поздних стадиях роста, что аналогично данным, полученным для биосинтеза фермента этим же штаммом в фазе замедления роста (Габдрахманова с соавт., 2000). Для штамма B.subtilis AJ73 А58.21 нами установлено, что внесение в питательную среду ионов аммония незначительно понижает продуктивность культуры на 48-й ч роста. Напротив, на 78-й ч роста добавление 1 мМ хлорида аммония стимулирует синтез фермента (на 45% по сравнению с контролем), а внесение в среду цитрата аммония не оказывает значительного влияния на продукцию фермента. Ранее было показано, что соли аммония не влияют на накопление фермента в культуральной жидкости штамма с плазмидой Д58.21 на стадии вегетативного роста (Gabdrakhmanova et al., 2002). Наличие в питательной среде помимо пептона дополнительного источника азота (ионы аммония) оказывает репрессирующий эффект на продукцию глутамилэндопептидазы в стационарной фазе роста у исходного штамма B.intermedius (Балабан с соавт., 20036), а в фазе замедления роста выход фермента увеличивается при данных условиях (Gabdrakhmanova et al., 1999). Тот факт, что уровень накопления глутамилэндопептидазы на разных фазах роста по-разному изменяется в ответ на введение в среду источников азота, возможно, является следствием смены механизмов регуляции экспрессии гена глутамилэндопептидазы на разных фазах развития бацилл.

Влияние белковых субстратов на биосинтез глутамилэндопептидазы рекомбинантыми штаммами B.subtilis. Продуктивность бактерий B.subtilis AJ73 pV в отношении синтеза протеиназы в стационарной фазе роста увеличивается при внесении в питательную среду 0,5% казеина и 1% желатина. Для штамма B.subtilis AJ73 А58.21 оптимальной является концентрация казеина и желатина 2%, в отличие от исходного штамма B.intermedius, для которого показано, что добавление этих субстратов в среду не влияет на накопление глутамилэндопептидазы в культуральной жидкости (Gabdrakhmanova et al., 1999). Возможно, это связано с

различиями в питательных потребностях бесплазмидных и рекомбинантных штаммов. Присутствие плазмиды может влиять на уровень отдельных метаболитов в рекомбинантной клетке и в целом вызывать изменения в регуляции клеточного метаболизма (Несмеянова с соавт., 1990).

Влияние ионов двухвалентных металлов на биосинтез гаутамилэндопепгидазы рекомбинантными штаммами B.subtilis. Биосинтез глутамилэндопептидазы на поздних стадиях роста стимулируется при внесении в среду культивирования ионов Са2+ (5 мМ и 2 мМ для штаммов B.subtilis AJ73 pV и B.subtilis AJ73 А58.21, соответственно), Mg2+ (1мМ), Мп2+ (1мМ). Активация ионами Са2+ сильнее выражена в отношении фермента, синтезируемого рекомбинантными клетками на 48-й ч инкубации, что может быть обусловлено различиями в конформации ферментов, секретируемых на 48-й и 78-й ч роста культуры (Балабан с соавт., 2003 а). Известно, что спорулирующие клетки поглощают много ионов Са2+ (Seto-Young, Ellar, 1981; Cazemier et al., 2001). В этом случае клеточная стенка истощается по Са2+, а он необходим для формирования новых активных Са2+-зависимых сайтов в белковой глобуле на заключительном этапе секреции (Шарипова, 2000). Содержание в среде ионов Zn2+, Fe2+ и Cu2+ (1-10 мМ) подавляло биосинтез протеиназы. Введение в среду культивирования ионов Со2+ (2 мМ) приводило к увеличению уровня фермента в культуральной жидкости обоих рекомбинантных штаммов B.subtilis, при этом рост микроорганизмов сильно угнетался, как в случае исходного штамма B.intermedius (Gabdrakhmanova et al., 1999). При исследовании локализации глутамилэндопептидазы B.intermedius ранее показано, что фермент в клетках обнаруживается на мембране (~10% от внеклеточного белка) и соли кобальта, по-видимому, могут влиять на процесс диссоциации фермента с мембраны, способствуя выходу мембраносвязанного белка в среду с образованием внеклеточного фермента (Шарипова с соавт., 2000).

Таким образом, регуляция биосинтеза глутамилэндопептидазы B.intermedius рекомбинантными клетками B.subtilis в стационарной фазе роста бактерий осуществляется аналогично регуляции синтеза других протеиназ: синтез фермента активируется в присутствии ионов кальция, неорганического фосфата, белковых субстратов - казеина и желатина. Нами установлено отсутствие подавления синтеза фермента на поздних этапах роста бактерий легкометаболизируемыми источниками углерода по типу катаболитной репрессии. Это свидетельствует о смене механизмов регуляции экспрессии гена протеиназы в стационарной фазе. По нашим данным на

экспрессию гена глугамилэццопетщцазы Bwtermedms может оказывать влияние соседний ген гидрогеназы, который присутствует на мультикопийной плазмице рУ Результаты исследований биосинтеза глутамилэндопептицазы рекомбинантными штаммами В ъиЬШъ в стационарной фазе роста суммированы в табл 1

Таблица 1. Влияние компонентов питательной среды на накопление шугамилэццопепщдазы в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов В sublihb

Компоненты питательной среды

Штамм 2 Я «*} О О Л о -е- Пептон, г/л Органические субстраты, % Ионы аммония, мМ Ионы двухвалентных металлов, мМ

2 й щ $ -е- казе ин же та тин хлорид цитрат Са Со гп мв Мп Те Си

> о. ГО г-- 48 й час роста 0,18 16 0,5 1 4 5 5 § К 1 О

< §

78 й 1 § ю Б с В о

а ъ Ч час роста Ё 0,2 22 05 1 4 5 5 А, 1 и 1 1 <4 1 в § N 1 К §

гч 00 < 48 й час роста = и X 0,28 4 2 2 подавляет биосин тез (1-6) 2 2 О X го X 8 X Ю Б § д Подавляет биосинтез (2-10) , 1 ю б 1 б а ю 1 § б

-1 < ¡2 ■5 3 ъ 4 78 й час роста 0,26 4 2 2 1 не влия ет (16) 2 Й £ X ь X ё 1

3. Получение гомогенной глутамилэвдопелщцазы ВлШегшеМш, синтезируемой рекомбинантными клетками В^иЪИШ

Для выяснения степени гомологии ферментов, синтезируемых рекомбинантными штаммами В Subtihs в стационарной фазе роста (48-й ч культивирования), с ферментом, синтезируемым в фазе замедления роста клетками нативного штамма В intermedius, проводили выделение и очистку соответствующих белков В результате трехстадийной очистки для обоих рекомбинантных штаммов В subtihs Л173 рУ и В subtihs Л173 А58 21 получены по две гомогенные белковые фракции фермента, обозначенные нами индексами 1 и 2 (табл 2)

Таблица 2. Выделение глутамилзндопептидазы поздней стационарной фазы роста (48-й ч культивирования) из культуральной жидкости рекомбинантных штаммов В 5иЫгШ

Стадии очистки Объем, Общий Активность Степень Выход,

мл белок, общая, удельная, очистки %

Аио ед. ед/ А280

В. subtilis AJ73 pV

Культуральная жидкость 995 19 900 69 212 3,478 1 100

Хроматография на КМЦ 24,5 51,45 19 625 381,45 109,67 28

Хроматограф 1 фракция 5,2 2,45 7 696 3 135 901,5 И

ия на колонке 2 фракция 2,1 0,69 1234 1786 513,5 1,78

Mono S

Рехроматогра- 1 фракция 1,2 0,7 3 374 4766 1370 4,87

фия на колонке 2 фракция 0,65 0,21 577 2699 776 0,83

Mono S

В. subtilis AJ73 А58.21

Культуральная жидкость 970 31525 24 405 0,774 1 100

Хроматография на КМЦ 35 68,25 8 575 125,64 162 35

Хроматограф 1 фракция 7,3 1,59 3 646 2 291 2 959,9 14,9

ия на колонке 2 фракция , 4'! 0,82 2 010 2 451 3 166,6 8,2

Mono S

Рехроматогра- 1 фракция 1.1 0,55 2 089 3 798 4 906,9 8,5

фия на колонке 2 фракция 0,75 0,3 961,95 3 128 4 041 3,9

Mono S

Полученные гомогенные препараты глутамилэндопептидазы рекомбинантных штаммов В 8ыЫ1к8 подвергали процедуре масс-спектрометрии. При расщеплении трипсином препаратов глутамилэндопептидазы фракций 1 и 2 из рекомбинантных штаммов В subtilis АГ73 рУ и B.subtilis АГ73 Д58.21 для каждой фракции были получены ряд пептидов. В результате масс-спектрометрии были установлены молекулярные массы (830 - 4820 Да) (рис.2) и аминокислотные последовательности данных фрагментов. На основании компьютерного сравнения последовательности аминокислот полученных пептидов с полной первичной последовательностью ряда протеиназ, имеющихся в банке данных установлено, что полученные нами фракции протеиназ соответствуют глутамилэндопептидазе В.ШетеШш (номер регистрации в Европейской базе данных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей (ЕМВЬ)У15136)(рис.З).

<в к

Ц 8 I

100

ЧСЧОЧСОГ-^ Ч Т О^С ГЧ ТГС^ о г^<-\ево»1-|

П го г-« Г-> Г"> ГЛ ЧО

оо «о —

Ч Sk•

20;

1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000

Молекулярная масса, Да

Рис. 2. Масс-спектр продуктов гидролиза трипсином глутамилэндопептидазы из рекомбинантных штаммов В^иЫШг АЛ73 рУ и В.тЫШз АЛЗ Д58.21. Сверху указаны молекулярные массы пептидов.

830,44Да 2716,28Да 1619,68Да

-У У-.-7-у У-

VV]GDDGRTKVANTRVAPYNSIAY1TFGGSSCTGTL1APNKILTNGHCVYNTASRSYSAKGSVYPGMND 4421,61 Да 1310,бЗДа 1175,64Да 836,39Да

-т-т т-▼-

STAVNGSANMTEFYVPSGYINTGASQYDFAVIKTDTNIGNTVGYRSIRQVT^ILTGTПKISGYPGDKMR 1366,62Да 4819,91 Да 1444,69Да

-Г-Т-у-

STGKVSQWEMSGSVTREDTNLAYYTIDTFSGNSGSAMLDQNQQIVGVHNAGYSNTINGGPKATMFVEF

-~Т

1МУАКА0и

Рис. 3. Сравнение последовательностей пептидов, полученных в результате масс-спектрометрии глутамилэндопептидазы рекомбинантных штаммов В.тЫШя, с аминокислотной последовательностью глутамилэндопептидазы В. ШегтесИш. Стрелками обозначены облагай расщепления трипсином. Сверху указаны молекулярные массы полученных пептидов. г

Иммунологический анализ позволил установить, что глутамилэндопенгидаза, синтезируемая рекомбинантными клетками В. subtil is по иммунологическим свойствам идентична глутамилэндопептидазе, синтезируемой нативным штаммом В intermedms (рис.4). Также сделано заключение о гомологии ферментов, секретируемых в фазе замедления роста и в стационарной фазе.

Рис. 4. Иммунореакция с антителами против глутамилэндопептидазы В. intermedins. 1 - глугамилэндопептидаза B.intermedius, секретируемая на стадии замедления роста (позитивный контроль); 2 -субтилизин B.intermedius (негативный контроль); 3, 4 -фракции 1 и 2 глутамилэндопептидазы рекомбинангного штамма B.subtilis AJ73 pV стационарной фазы роста; 5, 6 -фракции 1 и 2 глутамилэндопептидазы рекомбинантного штамма B.subtilis AJ73 Д58.21 стационарной фазы роста. Кроличья антисыворотка к глутамилэндопептидазе В intermedius предоставлена проф. C.B. Костровым (Институт молекулярной генетики РАН, Москва).

4. Освобождение глутамилэндопептидазы B.intermedius в культу рал ьную жцакость рекомбинантных клеток B.subtiHs

Ранее показано, что в процессе секреции глутамилэндопептидазы у исходного штамма В intermedius основная часть белка освобождается в культуральную жидкость, небольшая часть активного фермента (до 10%) остается связанным с мембраной, а в цитоплазме активный фермент не обнаружен (Шарипова с соавт.» 2000). При исследовании процесса освобождения глутамилэндопептидазы B.intermedius у рекомбинантных штаммов B.subtiHs нами установлено, что так же, как и у исходного штамма, основная часть образующегося фермента освобождается клетками в культуральную жидкость, где обнаружено 80-90% всего активного белка. Каталитически активная глутамилэндопептидаза не обнаружена нами в цитоплазме. Часть фермента, освобождаемого клетками (от 10 до 15 %) остается связанной с цитоплазматической мембраной.

Таким образом, по совокупности полученных результатов показано, что использованная нами система экспрессии гена глутамилэндопептидазы B.intermedius

рекомбинантными штаммами В subtihs является адекватной и применима для изучения механизмов регуляции экспрессии клонированного гена.

5. Анализ ре1улягорной области гена глутамижэдлрпепщлазы B.intermedius

Биосинтез индивидуальных белков в необходимом для бактерий количестве на определенном этапе их развития обеспечивается за счет разнообразия регуляторных механизмов, выработанных в процессе эволюции. Потенциальную оценку механизмов регуляции синтеза можно дать путем анализа промоторной области, контролирующей экспрессию генов. На рис.5 представлена промоторная область гена глутамилэндопептидазы В intermedius (номер регистрации в Европейской базе данных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей (EMBL) Y15136) При анализе нуклеотидной последовательности промоторной области гена глутамилэндопептидазы В intermedius (gse Bi) выявлено девять участков,

1 aagctttcttctcagaaagaagcaagtcatttacctttagatcagccgattcaaatgagagaat

65 tacttgcgtcacatgttgagcttcaagagcctgcaacacgtacgcagctaagagagctcgcagc

129 atatacagtttgtccgcctcaccgcgtggagcttgagcaaatggcTGGTGAAgcatatcaagaa

193 gccgttttaaagaaacgagtaaccaTGCTGGActtattagatcaatatgaagcgtgtgagctgc

257 cgtttg|t"gcactttttagca[cttttaccaggtttgaagccgcgctattactcaatttctagctc

321 accaaaAGTCGAAgaaaaaagagtcagtatcacagTGGCGGTtg|tgaaaggtaaagca|tggagc

385 gccgcgagaatatcgccggagtcgcatcaaactatttatgcggtcttgcaggcaggagaagaag

4 49 tcgcctgcttcctccacgaagcgcaggcaggattccagctgccaccttcatctgaagtaccgat

513 gatcatgatcggaccgggtacaggaatcgctccatttagagggtttgttcaggcaagagaagtg

577 tggcagaaggaaggaaanccactAGGCGAAgctcacctgtattttggctgtcgtcaccctctTG

641 AAGATgatctgtatttTGAGGAAatgcagcttgcagcgcaaaaaggagttgttcacatccaccg

705 ggcttattctcgtcacaaagagcaaaaagtatatgtccagcattTGTTGAAagaagacggcggc

769 atgctgatcaagttactTGACCAAggtgggtatctttacgtgtgcggggacggaaaagttatgg

833 caccagacgtagaggctacgcttatcgacctctatcaaaacgagaaacattgctcgaaggaaac

897 aqctqaaaattggc|Fqac^ШIИillйЩ^^^^1^1^^'<^n'•^^'^п^^^"^^'4•-[t^'^^^1^"'^^^

961 |aaaattaggaa|gaccgccaattaggcggttttttctatttcatagagagagatcaatagaa|tgi|

1025aggt[tggaaagatacaaa|acacctaatttaaaaatgaaatattttgtaaaaaataagaatattc

-35 -10 SD

1089tctcatttactccaatatqaaacaatcqtatgatttttgatataggacataaaqgagqaatatg

Рис. 5. Промотор гена gse Bi. Последовательность Шайна-Дальгарно и сайты инициации синтеза мРНК, -10 и -35 области, узнаваемые РНК-полимеразой с аА-факгором, подчеркнуты. Жирным шрифтом (прописные буквы) выделены участки с гомологией SpoOA-боксу. Цветом выделена область с гомологией к последовательности для связывания с белком AbrB Обведены в рамку последовательности с гомологией для связывания с белком СсрА.

обладающих 71-86%-ной гомологией для взаимодействия с регуляторным белком SpoOA (TGNCGAA), четыре участка ДНК с 71-78%-ной гомологией к консенсусному сайту взаимодействия с белком катаболитного контроля СсрА (TGWAARCGYTWNCW) (Weicket, Chambliss, 1990) и предполагаемый участок с 81%-ной гомологией к последовательности для специфического взаимодействия с регуляторным белком AbrB - плейотропным репрессором ранних генов споруляции (WAWWTTTWCAAAAAAW) (Strauch, 1995b) (рис.5). Выявленные сайты регуляции в промоторной области гена gse Bi позволили выдвинуть предположения о возможном участии двухкомпонентной системы SpoOA-фосфопереноса и механизмов глобальной регуляции (катаболитная и AbrB-репрессия) в регуляции экспрессии гена gse Bi. В промоторной области гена gse Bi нами идентифицированы потенциальные последовательности для взаимодействия с с-факторами транскрипции. Среди них - сайты связывания с альтернативными вегетативными факторами транскрипции - а также со спороспецифичными сигма-

факторами - аЕ, oF, аС и о" (табл. 3). При этом участки связывания с различными сигма факторами близко расположены или частично перекрываются друг с другом. Этот факт может свидетельствовать о различиях во временной экспрессии гена в зависимости от активации того или иного а-фактора, что соответствует молекулярной основе механизма системной регуляции активности генов.

Таблица 3. Сравнительный анализ промоторной области гена глутамилэндопептидазы В mtermedius

Сигма-факторы В subtilis (Haldenwang, 1995) Степень гомологии предполагаемых сайтов взаимодействия с о-факторами транскрипции в промоторной области гена gse ЕН

Сигма-фактор Промоторные последовательности

-35 -10 -35 -10

Факторы вегетативной клетки

0 ) ТААА GCCGATAT 100 % 50-62%

oL TGGCAC TTGCANNN 67-100% 50-87 %

Споруляционно-специс шчные факторы

о" (О RWAGGAXXT HGAAT 89% 80%

ZHATAXX САТАСАНТ 100% 50%

0С (^POIIALj GCATR GGHRARHTX 80-100% 55-87 %

GHATR САТХНТА 80-100% 100 %

о* (О АС CATANNNTA 100% 55-77 %

6. Молекулярные механизмы регуляции синтеза глутамилэццопептидазы BJntermedius

Влияние регуляторныж белков системы 8роОА-фосфопереноса в контроле экпрессии гена глутамилэндопептидазы B.intermedius. Использование мутантов по регуляторным белкам, входящим в состав двухкомпонентной системы 8роОА-фосфопереноса показало, что влияние этих факторов регуляции на экспрессию гена глутамилэндопептидазы не является выраженным, т.е. во всех вариантах сохраняется остаточная активность этого фермента (25-80%). На рис. 6, 7 представлены результаты, полученные для штаммов, трансформированных плазмидой рУ (для штаммов с плазмидой Д58.21 результаты были аналогичны). Полученные нами данные свидетельствуют о 20-50%-ном снижении продуктивности глутамилэндопептидазы в мутантных штаммах с дефектным белком 8роОА, конечного в цепи переноса фосфата от гистидин киназ в системе, контролирующей инициацию спорогенеза. Этот эффект компенсируется супрессорной мутацией в гене abrB, что подтверждают данные о восстановлении уровня экспрессии гена gse Б1 в двойных мутантах spoOA/abrB (рис. 6 А-Б). Таким образом, экспрессия гена глутамилэндопептидазы подвергается позитивной регуляции со стороны 8роОА-белка, а регуляторный белок АЬгВ оказывает репрессирующее действие на транскрипцию гена gse Бг Дефект в гене одной из гистидин киназ, участвующих в передаче сигнала в этой системе контроля, а именно, в гене ЫпА82, оказывает незначительное влияние на экспрессию гена глутамилэндопептидазы: после трансформации активность фермента в мутантом штамме снижается на 15% (рис.бВ). В штаммах с инактивированной 8роОБ-фосфатазой, участвующей в дефосфорилировании 8роОА-фактора транскрипции, уровень продуктивности глутамилэндопептидазы В. intermedius снижается на 75% по сравнению с контролем (рис.бД). Этот факт свидетельствует о корреляции синтеза 8роОБ-белка и глутамилэндопептидазы B.intermedius. В штаммах, дефектных по 8роОК-белку, а также по фосфотрансферазам 8роОБ и 8роОБ экспрессия гена gse Б1 снижается в среднем на 50 % (рис. 6 Г-Д). В совокупности, полученные нами данные свидетельствуют об участии регуляторных белков двухкомпонентной системы сигнальной трансдукции 8роОА-фосфопереноса в контроле экспрессии гена глутамилэццопептидазы В. intermedius.

с; и

£ я

12 30 48 66

| 1 1 1-'М||

12 30 48 66

Время,ч

1 - контроль г

2 - В зиЫйк Ш646 (¡роОА12) 4. в 5иШ111 $01372 (¡роОА12аЬзВ24) 6 - В зиЫйи МВ170 {ЬпА82]

3 - В ¡иЫйи Щ.!роОА9) 5. в а15.13 (5ро0А12аЬгВ23) 7 - В ыЬЫи Ш651 (щН81)

12 24 36 48 60 72

Время,ч

1 - контроль 1 - контроль

8 - В ¡иЫ11и Ш649 (?ро0Р221) 10 -В ыЪЫк ЪЪЦрррШ)

9 - В ¡Ми Ш648 (зроОВПб) 11 -В шЬЫк ДН647(¡¡роОЕП)

Рис. 6. Динамика накопления глутамилэндопептидазы В ¡Шегтескиз в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов В зиЫйи, дефектных по зро-гстм В качестве контроля использованы штаммы В ¡иЬЫи 168 и В яиЫйи Ш642 (выделены жирным) в зависимости от того, на основе какого из них сконструированы мутантные штаммы Для всех вариантов о< 10%

Экспрессия гена глутамилэндопептидазы B.intermedius в штаммах, дефектных по спороспецифичным факторам транскрипции. Нами установлено, что регуляция экспрессии гена глутамилэндопептидазы B.intermedius в штаммах, дефектных по спороспецифичным а-факторам транскрипции, подвергается ослабленному контролю со стороны данных системных регуляторов и идентична для обеих плазмид. Мутация spoOH с инактивированным о" фактором приводит к снижению уровня экспрессии гена gse Bi на 20-25% относительно контроля (рис. 6). В штаммах B.subtilis, с нарушениями в активации аЕ, И ак факторов транскрипции, экспрессия гена gse Bi снижается на 50% (рис.7 А-Б). В большей степени эффект подавления экспрессии гена (65%) выражен в штамме с дефектом по синтезу активного aF фактора (рис.7 Б). Эти данные свидетельствуют о том, что ген gse Bi может экспрессироваться на всех стадиях развития бактерий, включая позднюю стационарную фазу, а также этап формирования эндоспор.

Влияние ger-мутаций на экспрессию гена глутамилэндопептидазы B.intermedius. Изучали экспрессию гена gse Bi в штаммах, мутантных по Оег-белкам, вовлеченным в процесс прорастания спор (рис. 7 В). Максимальное снижение экспрессии гена gse Bi (на 50% относительно контроля) установлено для штаммов с инактивированным геном gerA, ответственным за синтез специфических белков-рецепторов для узнавания спорами определенных питательных веществ - факторов прорастания (Sammons et al., 1981).

Прорастание бактериальной споры инициирует процесс ее возвращения к вегетативному росту. Наши данные показали, что экспрессия гена глутамилэндопептидазы B.intermedius сохраняется и на этом этапе развития бацилл. По данным литературы известно, что в ходе превращения споры в вегетативную клетку в бактериях активированы факторы транскрипции, тогда как 0е-

фактор остается неактивным до окончания первого клеточного деления (Horsburgh et al., 2001). Тот факт, что в регуляторной области гена gse Bi нами идентифицированы последовательности, с гомологией к сайтам узнавания факторами

транскрипции, и не обнаружены участки с гомологией к сайтам для узнавания ов-фактором, позволяет предподЪжить подобный механизм регуляции экспрессии гена глутамилэндопептидазы В. intermedius.

1 - контроль Р > 1 . контроль

2 - В subtihs 83U {sigK) 4 - В sublihs NGl.67(s;gG) 3- В subtihs 279 6 (stgE) 5- В subtihs NG1.82 (sigF)

5 t

1 - контроль

6 - В subtihs 4447 (gerAll) 7- В subtihs 4593 (gerD) 8 -B subtihs 4151 (gerE36)

12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 Время, ч

Рис. 7. Динамика накопления глутамилэндопептидазы Bintermedius в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов В subtihs, дефектных по спороспецифичным сигма-факторам транскрипции Sig (А-Б) и белкам прорастания спор Ger (В). 1 (контроль) -штамм В subtihs 168 (выделен жирным). Для всех вариантов о<10%.

Таким образом, нами установлено, что в поздней стационарной фазе роста экспрессия гена gse Б1 подчиняется позитивной регуляции со стороны основных регуляторных белков сигнально-сенсорной системы 8роОЛ-фосфопередачи, спороспецифичных с-факторов транскрипции, Оег-белков и не регулируется по механизму катаболитной репрессии. Во всех вариантах, соответствующих выключению каждой из исследованных систем регуляции, не происходит полной инактивации гена протеиназы. Уровень экспрессии гена gse Б1 частично сохраняется в регуляторных мутантах В^иЬ^Из в пределах 25-80%, что может свидетельствовать о пересечении путей контроля активности данного гена. В результате анализа последовательности гена гена gse Б1 установлена сложная организация его регуляторной области, что также может свидетельствовать об участии нескольких систем регуляции в контроле экспрессии гена глутамилэндопептидазы В.ШетеШш. Итак, полученные нами данные позволяют сделать заключение, что экспрессия гена глутамилэндопептидазы ВЛМегшеШш модулируется разными регуляторными системами и осуществляется по типу перекрестной регуляции.

ВЫВОДЫ

1. Рекомбинантные штаммы В.яиЫШя Л173, несущие плазмиды рУ и Д58.21, выделяют в среду глутамилэндопептидазу в период стационарной фазы роста с максимальной активностью на 48-й и 78-й часы роста культур, соответствующей У и VII стадиям спорообразования. Синтез фермента на этой стадии роста активируется в присутствий в среде белковых субстратов, ионов кальция, неорганического фосфата и не подавляется глюкозой.

2. В промоторной области гена глутамилэндопептидазы ВЛМегшеШш выявлены нуклеотидные последовательности, гомологичные сайту связывания со 8роОЛ-регуляторным белком, участвующим в инициации споруляции (71-86%), последовательности для взаимодействия с регуляторным белком АЬгВ -плейотропным репрессором ранних генов споруляции (81%) и участки, с гомологией к консенсусному сайту связывания с белком катаболитного контроля

СЬрА (71-78%). Обнаружены участки ДНК с гомологией к сайтам связывания с вегетативными и спсроспецифичными сигма-факторами транскрипции

3. Регуляторные белки двухкомпонентной системы SpoOA-фосфопереноса участвуют в позитивной регуляции экспрессии гена gse Bi: уровень экспрессии гена в штаммах, мутантных по SpoO-белкам снижается на 15-75%. Регуляторный белок AbrB участвует в негативной регуляции экспрессии гена gse Bi.

4. Регуляпщ экспрессии гена gse Bi со стороны спороспецифических факторов транскрипции не является выраженной: при инактивации

факторов транскрипции уровень экспрессии гена глугамилэндопептвдазы B.intermedius снижается на 20-65%.

5. Экспрессия гена gse Bi подвергается позитивной регуляции со стороны Ger-белков, вовлеченных в процесс прорастания спор: уровень экспрессии гена глутамилэндопептидазы B.intermedius в штаммах, мутантных по Ger-белкам снижается на 25-50 %.

Публикации по теме диссертации

1. Шарипова М.Р. Мембраносвязанные формы сериновых протеиназ Bacillus intermedius I M.P. Шарипова, A.M. Марданова, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова, МА Шилова, И.Б. Чааухииа, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 2003. - Т.72, №5. - С.639-644.

2. Частухина И.Б. Биосинтез глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius в рекомбинантном штамме Bacillus subtilis на поздних стадиях спорообразования / И.Б. Частухина, Д.Н. Забирова, А.А. Голенищева-Кутузова, М.Р. Шарипова, ЛА Габдрахманова // Тезисы докладов Ш научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета 'Материалы и технологии XXI века". - Казань, 14-15 февраля, 2003. - С.92.

3. Чааухииа И.Б. Особенности биосинтеза глутамилэндопептидазы Bacillus

intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis в поздней стационарной

фазе роста / И.Б. Частухина, Д.Н. Забирова, М.Р, Шарипова, Л.А. Габдрахманова

// Сборник тезисов 7-й Путинской школы-конференцци молодых ученых

'Биология - наука XXI века". - Пушино, 14-18 апреля, 2003. - С.388.

4. Частухина И. Б. Синтез и регуляция внеклеточной гаутамилэвдопептидазы Bacillus intermedius рекомбинантными штаммами Bacillus subtilis на поздних стадиях роста / И.Б. Частухина, М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, ЛА Габдрахманова, A.M. Марданова, СВ. Костров, Г.Н. Руденская, И.Б. Лешинская // 7-ой Международный семинар-презентация инновационных научно-технических проектов в области биотехнологии "Биотехнология-2003". - Пушино, 24-25 ноября,2003.-С. 58.

5. I.B. Chastukhina. Biosynthesis of Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase by recombinant strain of Bacillus subtilis on the late stage of sporulation / I.B. Chastukhina, M. R. Sharipova, L. A. Gabdrakhmanova, N. P. Balaban, G. N. Rudenskaya, S. V. Kostrov, I. B. Leshchinskaya. // FEMS Congress of European Microbiologist "Bacfflus-2003". - Ljubljana, Slovenia, 1-3 July, 2003. - P.41.

6. Частухина И.Б. Биосинтез глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius рекомбинантными штаммами Bacillus subtilis, дефектными по spo-генам IИ.Б. Частухина, Е.И. Шагимарданова, АА Голенищева-Кутузова // Тезисы докладов IV научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета 'Материалы и технологии XXI века". - Казань, 16-17 марта, 2004. - С.83.

7. Чаиухина И.Б. Влияние spо-мутаций на экспрессию гена глутамилэндопешидазы Bacillus intermedius I И.Б. Частухина, Е.И. Шагимарданова, ЛА Габдрахманова, М.Р. Шарипова // Сбороник тезисов 8-й Пушинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". -Пушино, 17-21 мая, 2004. - С.38.

8. Частухина И.Б. Влияние SpoO-белков на экспрессию гена глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius I И.Б. Частухина, Е.И. Шагимарданова, Л.А. Габдрахманова, М.Р. Шарипова // Материалы третьей междисциплинарной (медицина, биология, физика, радтоэлектроника, химия, биохимия, информатика, педагогика...) конференции с международным участием СНБИТТ-21"). - Петрозаводск, 21-23 июня, 2004. - С. 41.

9. Частухина И.Б. Оптимизация биосинтеза глутамилэндопептидазы Bacillus

intermedius рекомбинантными штаммами Bacillus subtilis IИ.Б. Частухина, Е.И.

Шагимарданова, Л.А. Габдрахманова, М.Р. Шарипова // Материалы научной

конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии". -Казань, 17-18 июня, 2004. - С. 87-88.

Ю.Чапухина И.Б. Экспрессия гена глугамилэндопептидазы B.intermedius рекомбинантными штаммами В subtihs I И.Б. Частухина, Е.И. Шагимарданова, АА Голенищева-Кутузова, М.Р. Шарипова // Сборник статей научной конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии". -Казань, 2004.-С.47.

11. Чапухииа И.Б. Регуляция биосинтеза внеклеточной глутамилэцдопептидазы Bacillus intermedius в рекомбинантноМ штамме Bacillus subtilis на стадии спорообразования / И.Б. Частухина, М.Р. Шарипова, ЛА Габдрахманова, Н.П. Балабан, Д.Р. Сафина, СВ. Костров, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 2004. - Т.73, №3. - С.335-342.

12.Частухина И.Б. Особенности биосинтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius рекомбинантными штаммами Bacillus subtihs в стационарной фазе роста / И.Б. Частухина, М.Р. Шарипова, ЛА Габдрахманова, Н.П. Балабан, СВ. Костров, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 2004. - Принята в печать.

13.Chastukhina I.B. Regulation of Bacillus intermedius glutamylendopeptidase gene expression on the stationary stage of growth / I.B. Chastukhina, LA. Gabdrakhmanova, N.P. Balaban, I.V. Demidyuk, S.V. Kostrov, G.N. Rudenskaya, I.B. Leshchinskaya, MR. Sharipova // Curr. Microbiol. - 2004. - in press.

Отпечатано в ООО «Печатный двор». Казань, ул Журналистов, 1/16, оф 207 Тел.72-74-59, 41-76-41, 41-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.01 Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 0211.2004 г Усл. п.л 1.-63. Заказ №К-2175. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография

«»217 38

РНБ Русский фонд

2005-4 21152

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Частухина, Инна Борисовна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Механизмы регуляции биосинтеза внеклеточных ферментов у грамположительных бактерий.

• 1. Общие положения.

1.1. РНК-полимераза.

1. 2. Сигма факторы транскрипции.

1.3. Регуляция экспрессии генов B.subtilis на уровне транскрипции.

2. Регуляция синтеза катаболических ферментов.

3. Регуляция экспрессии генов бактерий в стационарной фазе роста.

3.1. Общие механизмы ответа бактериальных клеток на стресс.

3.2. Участие двухкомпонентных систем сигнальной трансдукции в клеточной дифференцировке.

3.3. Регуляция экспресии генов при спорообразовании.

3.3.1. Механизмы инициации спорообразования.

3.3.2.Факторы транскрипции и механизм дифференциальной экспрессии генов.

3.3.3. Регуляция процесса прорастания спор.

II. Глутамилэндопептидазы бацилл.

1. Принципы классификации протеиназ.

2. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов - новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ.

J. Структура и свойства глутамилэндопептидаз.

4. Глутамилэндопептидаза B.intermedius: характеристика и особенности синтеза фермента.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция синтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius в стационарной фазе роста рекомбинантных штаммов Bacillus subtilis"

Бактерии B.intermedius наряду с рибонуклеазой и фосфатазой секретируют сериновые протеиназы, одна из которых относится к группе глутамилэндопептидаз - ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные карбоксильными группами глутаминовой и аспарагиновой кислот (Leschinskaya et al., 1997). Клонирование и секвенирование гена глутамилэндопепидазы B.intermedius (Rebrikov et al., 1999) открыло возможность изучения механизмов регуляции биосинтеза фермента. В связи с тем, что бациллярные ферменты имеют практическую значимость, результаты исследования регуляции их синтеза могут быть использованы в биотехнологии, например, для повышения выхода ферментов путем клонирования и модификации генов с эффективными регуляторными элементами.

Целью работы явилось выяснение молекулярных механизмов регуляции биосинтеза глутамилэндопептидазы В. intermedins, синтезируемой рекомбинантными штаммами B.subtilis в стационарной фазе роста.

В работе решались следующие задачи:

1. Исследование закономерностей биосинтеза глутамилэндопептидазы B.intermedius рекомбинантными штаммами B.subtilis под влиянием различных экзогенных факторов в стационарной фазе роста бактерий.

2. Анализ структуры промоторной области гена глутамилэндопептидазы B.intermedius.

3. Выяснение роли регуляторных белков двухкомпонентной сигнально-сенсорной системы KinA/SpoOF/SpoOA в регуляции экспрессии гена глутамилэндопептидазы В. intermedius.

4. Исследование влияния спороспецифичных о-факторов транскрипции на экспрессию гена глутамилэндопептидазы B.intermedius.

5. Определение вклада регуляторных Ger-белков, активных в период прорастания спор, на регуляцию экспрессии гена глутамилэндопептидазы B.intermedius.

Научная новизна. К началу настоящей работы интерес исследователей был направлен на изучение регуляции синтеза бациллярной внеклеточной сериновой протеиназы - глутамилэндопептидазы - факторами внешней среды. Новизна данной работы заключается в качественно новом уровне изучения регуляторных механизмов биосинтеза данного фермента Впервые проведено изучение регуляции синтеза глутамилэндопептидазы B.intermedius на молекулярном уровне в связи с процессом клеточной дифференцировки. Выяснены основные закономерности биосинтеза глутамилэндопептидазы B.intermedius рекомбинантными штаммами B.subtilis в стационарной фазе роста бацилл. Впервые установлено, что в стационарной фазе экспрессия гена глутамилэндопептидазы не регулируется по типу катаболитной репрессии, в отличие от стадии вегетативного роста бактерий. Получены приоритетные данные, свидетельствующие о том, что экспрессия гена глутамилэндопептидазы B.intermedius подвергается позитивной регуляции со стороны основных регуляторных белков системы SpoOA-фосфопереноса, спороспецифичных а-факторов транскрипции, регуляторных Ger-белков. Полученные результаты позволили установить, что контроль активности гена gse Bi осуществляется по перекрестному типу регуляции.

Практическая ценность работы. Разработана питательная среда, обеспечивающая высокий уровень продукции глутамилэндопептидазы B.intermedius рекомбинантными штаммами B.subtilis в стационарной фазе роста, которая может быть использована для препаративного получения фермента. Сведения об установленных механизмах контроля экспрессии гена глутамилэндопептидазы в стационарной фазе роста могут быть полезны при разработке стратегии направленного синтеза протеолитических ферментов промышленными штаммами спорообразующих бактерий. Данные о механизмах функционирования регуляторных систем поздних белков бацилл могут • послужить основой для направленной модификации промоторной области гена с целью получения высокопродуктивных штаммов в условиях ограниченного роста бацилл.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на Международном конгрессе по микробиологии FEMS "Bacillus-2003" (Словения, 2003), 7-ом Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов в области биотехнологии "Биотехнология-2003" (Пущино, 2003), ежегодных научных конференциях молодых ученых, ф аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003, 2004) и ежегодных школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003, 2004), 3-й Междисциплинарной конференции с международным участием ("НБИТТ-21") (Петрозаводск, 2004), Всероссийской научной конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. Механизмы регуляции биосинтеза внеклеточных ферментов у грам-положительных бактерий 1. Общие положения

1.1. РНК-полимераза

В геноме бактерий содержится информация о тысячах различных белков, необходимых для функционирования клетки и адаптации к изменениям условий окружающей среды. Присутствие того или иного белка в необходимом количестве на определенном этапе развития клетки обеспечивается за счет разнообразных регуляторных механизмов, выработанных в процессе эволюции. Наиболее важный вклад в регуляцию биосинтеза белков вносят механизмы контроля уровня экспрессии генов, кодирующих эти белки. Регуляция экспрессии генов осуществляется, главным образом, на этапе инициации транскрипции (Klier et al., 1992) и ключевым ферментом этого процесса является ДНК-зависимая РНК-полимераза.

Для инициации синтеза РНК с ДНК-матрицы требуется наличие дополнительного полипептида - о-фактора транскрипции, "узнающего" промотор - консервативную последовательность нуклеотидов, расположенную выше стартовой точки транскрипции (Wosten, 1998). Сигма факторы - это се*мейство родственных белков малого размера, способных к обратимой ассоциации с кор-ферментом РНК-полимеразы. Такая ассоциация приводит к образованию комплекса, именуемого холоферментом РНК-полимеразы (Wosten, 1998). Взаимодействие фермента с промотором приводит к образованию "закрытого" комплекса, который превращается в "открытый" при "расплавлении" короткого участка ДНК внутри последовательности, связанной РНК-пол имеразой. После этого РНК-полимераза начинает продуцировать маленькие, состоящие из 2-12 нуклеотидных остатков, молекулы РНК, но остается при этом в области промотора. После диссоциации сг-субъединицы фермент приобретает способность двигаться вдоль ДНК, синтезируя полноценную молекулу РНК. Фермент и вновь синтезированная молекула РНК отделяются друг от друга в момент встречи с терминаторной структурой или фактором терминации.

ДНК при этом полностью возвращается в состояние дуплекса (Record et al., 1996).

Большинство видов бактерий синтезируют несколько а-факторов, различающихся между собой по аминокислотному составу и способности связывать те или иные промоторы бактериальных генов. Это позволяет РНК-полимеразе узнавать разные классы промоторов, отличающиеся друг от друга наличием специфических консервативных последовательностей. Такое разнообразие а-факторов и промоторов способствует более тонкой регуляции процессов метаболизма в клетке, что обеспечивает адекватный ответ микроорганизмов на постоянно меняющиеся условия окружающей среды (Wosten, 1998).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Частухина, Инна Борисовна

выводы

1. Рекомбинантные штаммы B.subtilis AJ73, несущие плазмиды pV и А58.21, выделяют в среду глутамилэндопептидазу в период стационарной фазы роста с максимальной активностью на 48-й и 78-й часы роста культур, соответствующей V и VII стадиям спорообразования. Синтез фермента на этой стадии роста активируется в присутствии в среде белковых субстратов, ионов кальция, неорганического фосфата и не подавляется глюкозой.

2. В промоторной области гена глутамилэндопептидазы B.intermedius выявлены нуклеотидные последовательности, гомологичные сайту связывания со SpoOA-регуляторным белком, участвующим в инициации споруляции (71-86%), последовательности для взаимодействия с регуляторным белком AbrB - плейотропным репрессором ранних генов споруляции (81%) и участки, с гомологией к консенсусному сайту связывания с белком катаболитного контроля СсрА (71-78%). Обнаружены участки ДНК с гомологией к сайтам связывания с вегетативными и спороспецифичными сигма-факторами транскрипции

3. Регуляторные белки двухкомпонентной системы SpoOA-фосфопереноса участвуют в позитивной регуляции экспрессии гена gse Bi: уровень экспрессии гена в штаммах, мутантных по SpoO-белкам снижается на 1575%. Регуляторный белок AbrB участвует в негативной регуляции экспрессии гена gse Bi.

4. Регуляция экспрессии гена gse Bi со стороны спороспецифических факторов транскрипции не является выраженной: при инактивации аЕ, oF, о0, ок и ан факторов транскрипции уровень экспрессии гена глутамилэндопептидазы B.intermedius снижается на 20-65%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из условий выживания бактерий является способность быстро реагировать на вне- и внутриклеточные сигналы, отражающие изменения в окружающей среде. Первичная реакция на стресс у микроорганизмов заключается в индукции синтеза группы новых белков, ответственных за общий и специфический клеточный ответ. Адаптация бактерий к меняющимся условиям1 существования включает в себя широкий круг явлений: индукция подвижности и компетентности клеток, синтез и секреция гидролитических ферментов, продукция антибиотиков и, наконец, образование спор. Регуляция сложных процессов, происходящих в бактериальной клетке в обычных условиях и в условиях стресса, происходит на уровне инициации транскрипции определенных генов. В случае перехода бактериальной культуры к спорообразованию запускается программа дифференциальной генной экспрессии, некоторые из регуляторных механизмов которой установлены. Другие аспекты развития этой программы остаются неясными, в том числе вопрос о вкладе в ее реализацию гидролитических ферментов, продуцируемых бациллами в период спорообразования.

Протеолитические ферменты выполняют в бактериальной клетке ряд жизненно важных функций: участвуют в деструктивных катаболических процессах и в клеточной дифференцировке, функционируют на этапе посттрансляционного процессинга белков, осуществляют селективный протеолиз белков, связанный с изменением метаболизма. В настоящее время достаточно хорошо изучены структура, физико-химические и каталитические свойства глутамилэндопептидаз - внеклеточных ферментов подсемейства сериновых протеиназ, относящееся к семейству химотрипсина. Сведения об их локализации, клеточном топогенезе в процессе секреции и механизмах освобождения в среду отсутствуют. Остаются неясными функции этих ферментов и пути их регуляции. В настоящее время в литературе накапливаются данные о корегуляции экспрессии генов, отвечающих за синтез внеклеточных протеиназ, с физиологическими событиями, происходящими с клетками бацилл. Синтез протеиназ и спорогенез связаны на уровне регуляции и Цаходятся под контролем катаболитной репрессии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. В качестве штамма-реципиента для плазмид с геном глутамилэндопептидазы B.intermedius использовали штамм B.subtilis AJ73 (amyE4, npr512, dpr73), из хромосомы которого делетированы гены с/ с/ внеклеточных протеиназ, любезно предоставленный проф. И.Иомантасом, ГНИИ Генетика. Бактериальные штаммы B.subtilis, дефектные по spo-, kin- и ger-генам, получены из коллекции Bacillus Genetic Stock Center (BGSC) и перечислены в табл.2.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Частухина, Инна Борисовна, Казань

1. Балабан Н.П. Щелочная внеклеточная протеиназа Bacillus intermedius. Выделение, очистка и некоторые свойства фермента / Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, A.M. Усманова, Е.А. Ицкович, И.Б. Лещинская // Биохимия. -1993. Т.58. - №. 12. - С. 1923-1928.

2. Балабан Н.П. Секретируемая протеиназа спорообразующих бактерий Bacillus intermedius / Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, Е.А. Ицкович, И.Б. Лещинская, Г.Н. Руденская // Биохимия. 1994. - Т.59. - №. 9. - С. 10331037.

3. Гловер Д.М. Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ./ Д.М. Гловер. — М.: Мир, 1988.- 538 с.

4. Головлев Е.Л. Введение в биологию стационарной фазы бактерий: механизм общего ответа на стрессы / Е.Л. Головлев // Микробиология. 1999. -Т. 68.-№5.-С. 623-631.

5. Гусев М.В. Микробиология. / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. -М.: Изд. Московского университета, 1985. 376с.

6. Демина Н.Н. Сенсорно-регуляторные системы бактерий / Н.Н. Демина, С.Г. Камзолова // Успехи современной биологии. 1992. - Т.26. - С. 13381349.

7. Ерохина Л.И. Щелочные протеиназы рода Bacillus / Л.И. Ерохина, Е.О. Добржанская // Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. Под. ред. Имшнецкого А.А. М.: Мир, 1979. - С. 244 - 280.

8. Иваница В.А. Влияние аминокислот как единственного источника азота на биосинтез экзопротеаз Aspergillus candidus / В.А. Иваница, Н.С. Егоров, М.А. Аль-Нури // Микробиология. 1978. - Т. 47. - №3. - С. 424-429.

9. Ицкович Е.Л. Биосинтез щелочной внеклеточной протеиназы Bacillus intermedius / Е.Л. Ицкович, Л.В. Знаменская, Н.П. Балабан, Т.А. Ершова, И.Б. Лещинская // Микробиология. 1995. - Т.64. - №.5. - С. 623-629.

10. Колев Д.А. Репрессия синтеза у штамма 90-11-формы Bacillus mesentericus аминокислотами / Д.А. Колев // Микробиология. 1986. - Т. 55. - №4. - С 295-300.1

11. Костров С.В. Структурные детерминанты, существенные для функционирования и стабильности протеолитических ферментов: Автореферат дис. . д-ра хим. наук / С.В. Костров; Ин-т молекулярной генетики РАН. М., 2001.-44с.

12. Льюин Б. Гены.: В 3 т. Т.2. М.: Мир, 1987. 544 с.

13. Мосолова О.В. Glu, Asp-специфичная протеиназа актиномицетов / О.В. Мосолова, Г.Н. Руденская, В.М. Степанов, О.М. Ходова, И.А. Цаплина // Биохимия. 1987. - Т.52. - №3. - С. 414-422.

14. Нестерова Н.Г. Субстратная специфичность ферментов Bacillus mesentericus / Н.Г. Нестерова, Г.В. Чернесова, Н.Ф. Кириллова // Микробиология. 1989. - Т.58. - №.4. - С. 553-556.

15. Новикова Т.М. Внеклеточная протеаза Bacillus alvei В-724 / Т.М. Новикова, С.Н. Выборных, Н.С. Егоров, Ж.К. Лория // Прикл. биохимия и микробиология. 1986. - Т. ,22. - №6. - С. 772-777.

16. Павлова И.Н. Сериновая протеиназа с литическими свойствами / И.Н. Павлова, М.Г. Жолнер, И.Я. Захарова, Н.З. Тиньянова, Г.Г. Честухина, В.М. Степанов // Микробиология. 1988. - Т. 57. - №. 3. - С. 398-405.

17. Прист Ф. Промышленные продукиы бацилл и их применение / Ф. Прист // Бациллы. Генетика и биотехнология. Под. ред. Харвуда К. М.: Мир, 1992.-С. 236-298.

18. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизиров / Г.Н. Руденская // Биоорг. химия. 1994. - Т.20. - №5. - С.475-484.

19. Руденская Г.Н. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ / Г.Н. Руденская // Биоорг. химия. -1998. - Т.24. - №4. - С.256-261.

20. Серкина А.В. Структура и функции предшественников бактериальных протеиназ / А.В. Серкина, А.Б. Шевелев, Г.Г. Честухина // Биоорг. химия. 2001. - Т. 27. - №5. - С. 323-346.

21. Хайдарова Н.В. Glu, Asp-специфичная протеиназа из Streptomyces thermovulgaris I Н.В. Хайдарова, Г.Н. Руденская, Л.П. Ревина, В.М. Степанов, Н.С. Егоров // Биохимия. -1989. Т.54. -№.1.-С. 4б-52.

22. Хайдарова Н.В. Тиолзависимая сериновая протеиназа Streptomycesthermovulgaris / Н.В.'Хайдарова, Г.Н. Руденская, Л.П. Ревина, В.М. Степаtнов, Н.С. Егоров // Биохимия. 1990. - Т.55. - №.6. - С. 1110-1118.

23. Цаплина И.А. Синтез нейтральных протеаз микроорганизмами / И.А. Цап-лина // Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. Под. ред. Имш-нецкого А.А. М.: Мир, 1979.- С. 197-244.

24. Шарипова М.Р. Гидролазы Bacillus intermedins: выделение, свойства, локализация: Дис. . д-ра биол. наук / М.Р. Шарипова; Казанский государственный университет. Казань, 2000. - 224с.

25. Шарипова М.Р. Локализация протеолитических ферментов в клетках Bacillus intermedins / М.Р. Шарипова, Е.В. Шакиров, Н.П. Балабан, JI.A. Габ-драхманова, М.А. Шилова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. 2000. - Т. 69. - № 5. - С. 660-667.

26. Шарипова М.Р. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedins / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова, М.А. Шилова, Ю.М. Кадырова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. 2002. - Т.71. - №4. - С. 494-499.

27. Alba В.М. DegS and YaeL participate sequentially in the cleavage of RseA to activate the sigma(E)-dependent extracytoplasmic stress response / B.M. Alba, J.A. Leeds, C. Onufiyk, C.Z. Lu, C.A. Gross // Genes Dev. 2002. - V. 16. -№16.-P. 2156-2168.

28. Banerjee A. Induction of secretory acid proteinase in Candida albigans / A. Banerjee, K. Ganesan, A. Datta // J. Gen. Microbiol. 1991. - V. 137. - P. 24552461.

29. Barlass P.J. Germination of Bacillus cereus spores in response to L-alanine and to inosine: the roles of gerL and gerQ operons / P.J. Barlass, C.W. Houston, M.O. Clements, A. Moir // Microbiology. 2002. - V.148. - P. 2089-2095.

30. Behravan J. Mutations in the gerP locus of Bacillus subtilis and Bacillus cereus affect the access of germinants to their target in the spore / J. Behravan, H. Chi-rakkal, A. Masson, A. Moir//J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 1987-1994.•

31. Bruckner R. Carbon catabolite repression in bacteria: choice of the carbon source and autoregulatory limitation of sugar utilization / R. Bruckner, F. Tit-gemeyer // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - V. 209. - P. 141-148.

32. Burbulys D. The initiation of sporulation in Bacillus subtilis is controlled by a multicomponent phosphorelay / D. Burbulys, K.A. Trach, J.A. Hoch // Cell. -1991.-V.64.-P. 545-552.

33. Carmona C. Nucleotide sequence of the serine protease of St.aureus strain V8 /

34. C. Carmona, G.L. Cray //Nucl. Acid. Res. 1987. - V. 15. - №6. - P. 6757.

35. Cazemier A.E. Effect of sporulation and recovery medium on the heat resistance and amount of injury of spores from spoilage bacilli / A.E. Cazemier, S.F. Wagenaars, P.F. ter Steeg // J. Appl. Microbiol. 2001. - V.90. - № 5. -P.761-770.

36. Clements M.O. Role of the gerl operon of Bacillus cereus 569 in the response of spores to germinants / M.O. Clements, A. Moir // J. Bacteriol. 1998. -V.180. - №24. - P. 6729-6735i

37. Coleman G. A model for the regulation of bacterial extracellular enzyme and toxin biosynthesis / G. Coleman, S. Brown, D.A. Stormonth // J. Theor. Biol. -1975. V.52. - №1. - P.143-148.

38. Corfe B.M. The gerB region of the Bacillus subtilis 168 chromosome encodes a homologue of the gerA spore germination operon / B.M. Corfe, R.L. Sammons,

39. D.A. Smith, C. Mauel // Microbiology. 1994. - V.140. - P. 471-478.

40. Cutting S. The nucleotide sequence and the transcription during sporulation of I the gerE gene of Bacillus subtilis / S. Cutting, J. Mandelstam // J. Gen. Microbiol. 1986. - V. 132. - P. 3013-3024.

41. Dartois V. Characterization of a novel member of the DegS-DegU regulon affected by salt stress in Bacillus subtilis / V. Dartois, M. Debarbouille, F. Kunst, G. Rapoport // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - №7. - P. 1855-1861.

42. Demidyuk I.V. Modification of substrate-binding site of glutamyl endopepti-dase from Bacillus intermedius / I.V. Demidyuk, D.V. Romanova, E.A. Nosovskaya, G.G. Chestukhina, I.P. Kuranova, S.V. Kostrov // Prot. Eng. — 2004. -in press.

43. Drapeau G.R. Purification and properties of an extracellular protease of Staphylococcus aureus / G.R. Drapeau, Y. Boily, J.J. Houmard // J. Biol. Chem. -1972. -V.247. №20.-P.6720-6726.

44. Dubnau D. Genetic competence in Bacillus subtilis / D. Dubnau // Microbiol. Rev. 1991. - V. 55. - №3. - P. 395-424.

45. Eder S. A Bacillus subtilis secreted phosphodiesterase/alkaline phosphatase is the product of a Pho regulon gene, phoD / S. Eder, L. Shi, K. Jensen, K. Ya-mane, F.M. Hulett//Microbiology. 1996. - V. 142. - P. 2041-2047.

46. Engelmann S. Impaired oxidative stress resistance of Bacillus subtilis sigB mutants and the role of katA and katE / S. Engelmann, M. Hecker // FEMS Microbiol. Lett. 1996. - V. 145. - P. 63-69.

47. Errington J. Bacillus subtilis: regulation of gene expression and control of morphogenesis / J. Errington // Microboil. Rev. 1993. - V. 57. - №1. - P. 1-33.

48. Errington J. Establishment of cell-specific transcription during sporulation in Bacillus subtilis / J. Errington, N. Illing // Mol. Microbiol. 1993. - V.6. - №6. -P. 689-695.

49. Eymann C. Induction of sigma(B)-dependent general stress genes by amino acid starvation in a spoOH mutant of Bacillus subtilis / C. Eymann, M. Hecker // FEMS Microbiol. Lett. 2001. - V. 199. - №2. - P.221-227.

50. Fabret C. Two-component signal transduction in Bacillus subtilis: how one organism sees its world / C. Fabret, V.A. Feher, J.A. Hoch // J. Bacteriol. 1999. - V.181. -P.1975-1983.

51. Feavers I.M. The nucleotide sequence of a spore germination gene (gerA) of Bacillus subtilis 168 / I.M. Feavers, J.S. Miles, A. Moir // Gene. 1985. -V.38. -P. 95-102.

52. Feavers I.M. The regulation of transcription of the gerA spore germination op-eron of Bacillus subtilis / I.M. Feavers, J. Foulkes, B. Setlow, D. Sun, W. Nich

53. Nicholson, P. Setlow, A. Moir // Mol. Microbiol. 1990. - V. 4. - №2. - P. 275-282.

54. Ferrari E. Trancription of Bacillus subtilis subtilisin and expression of subtil-isin in sporulation mutants / E. Ferrari, D. Henner, M. Perego, J.A. Hoch // J. Bacterid. 1988.- V. 170. -P.289-295.

55. Gabdrakhmanova L.A. Biosynthesis and localization of glutamylendopeptidase from Bacillus intermedius3-\9 / L.A. Gabdrakhmanova, E.V. Shakirov, N.P. Balaban, M.R. Sharipova, G.N. Rudenskaya, I.B. Leshchinskaya // Microbios. -1999. V.100. -P.97-108.

56. Georgiou G. Optimizing the production of recombinant proteins in microorganisms / G. Georgiou // AICHE J. 1988. - V.34. - P. 1233-1248.

57. Guidi-Rontani C. Identification and characterization of a germination operon on the virulence plasmid pXOl of Bacillus anthracis / C. Guidi-Rontani, Y. Pereira, S. Ruffle, J-C. Sirard, M. Weber-Levy, M. Mock // Mol. Microbiol. -1999.-V. 33.-P. 407-414.

58. Haldenwang W.G. The sigma factors of Bacillus subtilis / W.G. Haldenwang // Microb. Rev. 1995. - V.59. - №1. - P.l-30.

59. Hamoen L.W. The Bacillus subtilis transition state regulator AbrB binds to the -35 promoter region of comK / L.W. Hamoen, D. Kausche, M.A. Marahiel, D.van Sinderen, G. Venema, P. Serror //FEMS Microbiol. Lett. 2003. - V.218. -№2. - P. 299-304.

60. Hartley B.S. Proteolytic enzymes / B.S. Hartley // Ann. Rev. Biochem. 1960. -V.29. - P. 45-72.

61. Hecker M. General stress response of Bacillus subtilis and other bacteria / M. Hecker, U. Volker // Adv. Microb. Physiol. 2001. - V. 44. - P. 35-91.

62. Helmann J.D. Compilation and analysis of Bacillus subtilis сгА-dependent promoter sequences: evidence for extended contact between RNA polymerase and upstream promoter DNA / J.D. Helmann // Nucleic Acids Res. 1995. - V.23. -P. 2351-2360.

63. Helmann J.D. Alternate sigma factors and the regulation of flagellar gene expression / J.D. Helmann // Mol. Microbiol. 1991. - V.5. - P. 2875-2882.

64. Helmann J.D. Homologous metalloregulatory proteins from both Gram-positive and Gram-negative bacteria control transcription of mercury resistance operons / J.D. Helmann, Y. Wang, I. Mahler, C.T. Walsh // J. Bacteriol. 1989. - V.171.-№l.-P. 222-229.

65. Henkin T.M. The role of CcpA transcriptional regulator in carbon metabolism in Bacillus subtilis / T.M. Henkin // FEMS Microbiol. Lett. 1996. - V. 135. - P. 9-15.

66. Henner DJ. Location of targets of the hpr-91, sacU32 (Ну), and sacQ36 (Ну) mutations in upstream region of the subtilisin promoter / D.J. Henner, E. Ferrari, M. Perego, J.A. Hoch // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - №1. - P. 296-300.

67. Hoch J.A. Keeping signals straight in phosphorelay signal transduction / J.A. Hoch, K.I. Varughese // J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - №17. - P.4941-4949.

68. Horsburgh M.J. Transcriptional responses during outgrowth of Bacillus subtilis endospores / M.J. Horsburgh, P.D. Thackray, A. Moir // Microbiology. 2001. -V.147.-P. 2933-2941.

69. Huang X. The Bacillus subtilis sigma (X) protein is an extracytoplasmatic function sigma factor contributing to survival at high temperature / X. Huang, A. Decatur, A. Sorokin, J.D. Helmann // J. Bacteriol. 1997. - V.179. - P.2915-2921.

70. Hudson K.D. Localization of GerAA and GerAC germination proteins in the Bacillus subtilis spore / K.D. Hudson, B.M. Corfe, E.H. Kemp, I.M. Feavers, P.J. Coote, A. Moir// J. Bacteriol. 2001. - V.183. - №14. - P. 4317-4322.

71. Hullet F.M. Sequential action of two-component genetic switches regulates the PHO regulon in Bacillus subtilis / F.M. Hulett, J. Lee, L. Shi, G. Sun, R. Ches-nut, E. Sharkova, M.F. Duggan, N. Kapp // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - №5. -P.1348-1358.

72. Irie R. A germination mutant of Bacillus subtilis deficient in response to glucose / R. Irie, T. Okamoto, Y. Fujita. // J. Gen. Appl. Microbiol. 1982. -V.28.-P. 345-354.

73. Jacob F. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of protein / F. Jacob, J. Monod // J. Mol. Biol. 1961. - V.3. - P. 318-356.

74. Jenkinson H.F. Protease deficiency and its association with defects in spore coat structure, germination and resistance properties in a mutant of Bacillus subtilis / H.F. Jenkinson, H. Lord // J. Gen. Microbiol. 1983. - V.129. - P. 2727-2737.

75. Jin S. Bacillus subtilis genes that code for enzymes involved in acetyl-CoA metabolism. / S. Jin, A.L. Sonenshein // Presented at the Int. Conf. on Bacilli, 6th, Stanford, Caif. 1991.

76. Jonas R.M. The Bacillus subtilis spoIIG operon encodes both oE and gene necessary for oE activation / R.M. Jonas, E.A. Weaver, TJ. Kenney, C.P. Jr. Moran, W.G. Haldenwang //J. Bacteriol. 1988. - V.170. - P.507-511.

77. Klier A. Distinct control sites located upstream from the levansucrase gene of Bacillus subtilis / A. Klier, A. Fouet, M. Debarbouille, F. Kunst, G. Rapoport // Mol. Microbiol. 1987. - V.l. - №2. - P. 233-241.

78. Klier A. Positive regulation in the gram-positive bacterium: Bacillus subtilis / A. Klier, T. Msadek, G. Rapoport // Ann. Rev. Microbiol. 1992. - V.46. - P. 429-459.

79. Laemmli H.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / H.K. Laemmli // Nature. 1970. - V.227. - P. 680-685.

80. Lenski R.E. Stability of recombinant DNA and its effects on fitness / R.E. Lenski, T.T. Nguen // Trends Biotechnol. Ecol. Evol. 1988. - V.6. - P.51-53.

81. Lepesant Y.A. Chromosomal location of mutations affecting sucrose metabolism in Bacillus subtilis / Y.A. Lepesant, F. Kunst, J. Lepesant-Kejzlarova, R. Dedonder// Mol. Gen. Genet. 1972. - V.l 18. -№2. - P. 135-160.

82. Lonetto M. The ст'и family:sequence conservation and evolutionary relationships /M. Lonetto, M. Gribskov, C.A. Gross // J. Bacteriol. 1992. - V.l74. -P. 3833-3849.

83. Losick R. Cascades of sigma factors / R. Losick, J. Pero // Cell. 1981. -V.25. - P. 582-584.

84. Losick R. Crisscross regulation of cell-type-specific gene expression during development in Bacillus subtilis / R. Losick, P. Stragier // Nature. 1992. -V.355. - P.601-604.

85. Martin J. Identification of a new locus, sacV, involved in the regulation of le-vansucrase synthesis in Bacillus subtilis / J. Martin, M. Debarbouille, A. Klier // FEMS Microbiol. Lett. 1987. - V.44. - P. 39-43.

86. Masaki T. Purification and some properties of Achromobacter protease la from Achromobacter lyticus M497-1 / T. Masaki, H. Suzuki, M. Soejima // Agric. Biol. Chem. 1986. - V.50. - №12. - P.3087-3091.

87. Missiakas D. The extracytoplasmatic function sigma factors: role and regulation / D. Missiakas, S. Raina // Mol. Microbiol. 1998. - V.28. - №.6. -P.1059-1066.

88. Moir A. Germination properties of a spore coat-defective mutant of Bacillus subtilis / A. Moir // J. Bacteriol. 1981. - V. 146. - №.3. - P. 1106-1116.

89. Moir A. The genetics of bacterial spore germination / A. Moir, D. A. Smith // Annu. Rev. Microbiol. 1990. - V.44. - P. 531-553.

90. Moir A. Spore germination. / A. Moir // Biology of Bacilli, R. H. Doi, M. McGloughlin (ed.). London: Butterworth-Heinemann, 1992. - P. 23-38.

91. Moir A. Spore germination. / A. Moir, B.M. Corfe, J. Behravan // Cell. Mol. Life. Sci. 2002. - V. 59. - №3. - P. 403-409.

92. Moravcolova J. Repression of the synthesis of exocellular and intracellular proteinases in Bacillus megaterium / J. Moravcolova, J. Chaloupka // Folia Microbiol. 1984. - V.29. - P. 273-281.

93. Msadek T. Signal transduction pathway controlling synthesis of a class of de-gradative enzymes in Bacillus subtilis: expression of the regulatory genes and analysis of mutations in degS and degU / T. Msadek, F. Kunst, D. Henner, A.

94. Klier, G. Rapoport, R. Dedonder // J. Bacteriol. 1990. - V.172. - №2. - P. 824-834.

95. Nienaber V.L. A glutamic acid specific serine protease utilizes a novel his-tidine triad in substrate binding / V.L. Nienaber, K. Breddam, J.J. Birktoft // Biochemistry. 1993. -V.32. - №43. - P.l 1469-11475.

96. Ohara-Nemoto Y. Characterization and molecular cloning of a glutamyl endopeptidase from Staphylococcus epidermidis / Y. Ohara-Nemoto, Y. Ikeda, M. Kobayashi, M. Sasaki, S. Tajika, S. Kimura // Microb. Pathog. 2002. -V.33. -№1.-P. 33-41.

97. Paidhungat M. Localization of a germinant receptor protein (GerBA) to the inner membrane of Bacillus subtilis spores / M. Paidhungat, P. Setlow // J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - P. 3982-3990.р

98. Partridge S. The role of a in prespore-speciflc transcription in Bacillus subtilis / S. Partridge, D. Foulder, J. Errington // Mol. Microbiol. 1991. - V. 5. -P. 757-767.

99. Perego M. Pentapeptide regulation of aspartylphospate phosphatases / M. Perego, J.A. Brannigan // Peptides. 2001. - V.22. - P. 1541-1547.

100. Postma P.W. Phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase systems of bacteria / P.W. Postma, J.W. Lengeler, G.R. Jacobson // Microbiol. Rev. -1993.-V. 6.-P. 543-594.

101. Power S. Secretion and autoproteolytic maturation of subtilisin / S. Power,

102. R.M. Adams, J.A. Wells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V.83. - №5.7 •»1. P.3096-3100.

103. Pragai Z. Regulatory interactions between the Pho and sigma(B)-dependent general stress regulons of Bacillus subtilis / Z. Pragai, C.R. Harwood // Microbiology. 2002.- V. 148.-P. 1593-1602.

104. Predich M. Bacillus subtilis early sporulation genes kin A, spoF, and spoOA are transcribed by the RNA polymerase containing aH / M. Predich, G. Nair, I. Smith // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 2771-2778.

105. Priest F.G. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacilli / F.G. Priest // Bacteriol. Rev. 1977. - V. 41. - P. 711-753.

106. Qi Y. The pst operon of Bacillus subtilis has a phosphate-regulated promoter and is involved in phosphate transport but not in regulation of the pho regulon / Y. Qi, Y. Kobayashi, F.M. Hulett // J. Bacteriol. 1997. - V. 179. - №8. - P. 2534-2539.

107. Qian Q. AbrB is a regulator of the sigma(W) regulon in Bacillus subtilis / Q. Qian, C.Y. Lee, J.D. Helmann, M.A. Strauch // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - V. 211.- №2. -P.219-223.

108. Rather P.N. Negative regulator of oG-controlled gene expression in stationary-phase Bacillus subtilis / P.N. Rather, R. Coppolecchia, H. DeGrazia, C.P.Jr. Moran // J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 709-715.

109. Record M.D. Escherichia coli RNA polymerase (Ест ), promoters, and thetkinetics of the steps of transcription initiation / M.D. Record, W.S. Reznikoff,V

110. M.L. Craig // Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology. 1996.-P. 792-820.

111. Rufo G.A. Jr. Isolation and characterization of a novel extracellular metallo-^ protease from Bacillus subtilis / G.A. Jr. Rufo, B.J. Sullivan, A. Sloma, J.

112. Pero // J. Bacteriol. 1990. - V.172. - №2. - P. 1019-1023.

113. Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

114. Sampath P. Physiological and nutritional factor affecting biosyntesis of extracellular protease by Streptomyces sp. G-157 / P. Sampath, J. Chandrakasan //Microbiol. Rev. 1998. - V. 21. - №1. - P. 55-63.

115. Seto-Young D.L. Studies on calcium transport during growth and sporulation * / D.L. Seto-Young, D.J. Ellar// Microbios. 1981. - V.30. - P. 191-208.

116. Shafikhani S.H. ScoC mediates catabolite repression of sporulation in

117. Bacillus subtilis / S.H. Shafikhani, E. Nunez, T. Leighton // Curr. Microbiol. 2003. - V. 47. - P. 327-336.

118. Simonen M. Protein secretion in Bacillus species / M. Simonen, I. Palva // Micribiol. Rev. 1993. - V. 57. - P. 109-137.

119. Slynn G.M. Molecular genetical and phenotypical analysis of the gerM spore germination gene of Bacillus Bacillus subtilis 168 / G.M. Slynn, R.L. Sammons, D.A. Smith, A. Moir, B.M. Corfe // FEMS Microbiol. Lett. 1994.-V. 121. P. 315-320.

120. Smith I. The role of negative control in sporulation / I. Smith, I. Mandic-Mulec, N. Gaur // Res. Microbiol. 1991. - V. 142.-P. 831-839.

121. Stennicke H.R. Characterization of the SI binding site of the glutamic acid-specific protease from Streptomyces griseus / H.R. Stennicke, J.J. Birktoft, K. Breddam // Protein Sci. 1996. - V.5. - №11. - P. 2266-2275.

122. Stepanov V.M. A serine protease of an archaebacterium Halobacterium mediteerranei / V.M. Stepanov, G.N. Rudenskaya, L.A. Revina, Y.B. Gryaznova, E.N. lysogorskaya, I.Yu. Filippova, I.I. Ivanova // J. Biochem. -1992. V.285. - P.284-286.

123. Stragier P. Chromosomal rearrangement generating a composite gene for a developmental transcription factor / P. Stragier, B. Kunkel, L. Kroos, R.1.sick// Science. 1989. - V. 243. - P. 507-512.

124. Stragier P. Cascades of sigma factors revisited / P. Stragier, R. Losick // Mol. Microbiol. 1990. - V. 4. - P. 1804-1806.

125. Strauch M.A. The SpoOA protein of Bacillus subtilis is a repressor of the abrB gene / M. A. Strauch, V. Webb, G. Spiegelman, J. A. Hoch // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V.85. - №5.-P. 1801-1805.

126. Strauch M.A. SpoOA activates and represses its own synthesis by binding at its dual promoters / M.A. Strauch, K. Trach, J. Day, J. A. Hoch // Biochimie. -1992.-V. 174.-P. 619-626.I

127. Strauch M.A. AbrB modulates expression and catabolite repression of a Bacillus subtilis ribose transport operon / M.A. Strauch // J. Bacteriol. -1995a. V. 177. - P. 6727-6731.

128. Stulke J. Carbon catabolite repression in bacteria / J. Stulke, W. Hillen // Curr. Opin. Microbiol. 1999. - V. 2. - P. 195-201.

129. Stulke J. Regulation of carbon catabolism in Bacillus species / J. Stulke, W. Hillen // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - V. 54. - P. 849-880.

130. Sun D. Identification of a new sigma-factor involved in a compartmentalized gene expression during sporulation of a Bacillus subtilis / D. Sun, P. Stragier, P. Setlow // Genes Dev. 1989. - V. 3. - P. 141-149.

131. Svensden I. The primary structure of the glutamic acid-specific protease of Streptomyces griseus / I. Svensden, M.R. Jensen, K. Breddam // FEBS Lett. -1991. V.292. - P. 105-167.

132. Svensden I. Isolftion and aminoacid sequence of a glutamic acid specific endopeptidase from Bacillus licheniformis /1. Svensden, K. Breddam // Eur.J. Biochem. 1992. - V204. - P. 165-171.

133. Takagi M. Nucleotide sequence and cloning in Bacillus subtilis of thet

134. Bacillus stearothermophilus pleiotropic regulatory gene degT / M. Takagi, H. Takada, T. Imanaka // J. Bacteriol.'- 1990. V. 173. - P. 411-418.

135. Tanaka T. PrtR enhances the mRNA level of the Bacillus subtilis extracellular proteases / T. Tanaka, M. Kawata, J. Nagami, H. Uchivama // J. Bacteriol. -1987. V.169. - №7.,- P. 3044-3050.

136. Thackray P.D. GerN, an antiporter homologue important in the germination of Bacillus cereus endospores / P.D. Thackray, J. Behravan, T. W. South-worth, A. Moir // J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - P. 476-482.

137. Thomason P. Eukaryotic signal transduction via histidine- aspartate phos-phorelay / P. Thomason, R. Kay // J. Cell Sci. 2000. - V. 113. - P. 31413150.

138. Trach K.A. Multisensory activation of the phosphorelay initiating sporulation in Bacillus subtilis: identification and sequence of the protein kinase of the alternative pathway / K.A. Trach, J.A. Hoch // Mol. Microbiol. 1993. - V.8. -P.67-79.Щ

139. Varon D. Bacillus subtilis operon under the dual control of the general stress transcription factor sigma В and the sporulation transcription factor sigma H / D. Varon, M.S. Brody, C.W. Price // Mol. Microbiol. 1996. - V. 20. - №2. -P. 339-350.

140. Bacillus cereus. i R.J. Warburg, M.R. Davis, I. Mahler, DJ. Tripper, H.O. Halvorson // Molecular Biology of Microbial Differentiation. J.A.Hoch and P. Setlow (ed.). Washington, D. C. American Society for Microbiology, -1985.- -P. 67-70.

141. Weicket M.J. Site-directed mutagenesis of a catabolite repression operator sequense in Bacillus^ subtilis / MJ. Weicket, G.H. Chambliss // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 78. - P. 6238-6242.

142. Weiner M.A. Macrophage-mediated germination of Bacillus anthracis en* dospores requires the gerH operon / M.A. Weiner, P.C. Hanna // Infect Immun. 2003. - V.71. - №7. - P. 3954-3959.

143. Weir J. Regulation of SpoOH, a gene coding for the Bacillus subtilisaH factor

144. J. Weir, M. Predich, E. Dubnau, G. Nair, I. Smith // J. Bacteriol. 1991. -V.l73. - P.521-529.

145. Wells J.A. Cloning, sequensing and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis / J.A. Wells, E. Ferrari, G.J. Henner, D.A. Estell, E.Y. Chen// Nucl. Acids. Res. 1983. - V.l 1. - P. 7911-7925.

146. Wiegert T. Alkaline shock induces the Bacillus subtilis sigma (W) regulon / T. Wiegert, G. Homuth, S. Versteeg, W. Schumann // Mol. Microbiol. 2001.- V.41.-№l.-P. 59-71.

147. Wosten M.M. Eubacterial sigma-factors / M.M. Wosten // FEMS Microbiol. Rew. 1998. - V. 22. - P. 127-150.

148. Yazdi M.A. Characterization and cloning of the gerC locus of Bacillus subtilis 168 / M.A. Yazdi, A. Moir // J. Gen. Microbiol. 1990 - V.l36. - P. 1335-1342.

149. Yokoi K. Genetic and biochemical characterization of glutamyl endopeptidase of Staphylococcus warneri M / K. Yokoi, M. Kakikawa, H. Kimoto, K. Watanabe, H. Yasukawa, A. Yamakawa, A. Taketo, K.I. Kodaira

150. Gene. 2001.- V. 281.- P.l 15-122.>

151. York K. SpoOA controls the aA- dependent activation of Bacillus subtilis sporulation specific transcription unit spoIIE / K. York, T. J. Kenney, S. Satola, C. P. Moran, H. Poth, P. Youngman // J. Bacteriol. - 1992. - V. 174. -P. 2648-2658.

152. Zheng L. Cascade regulation of spore coat gene expression in Bacillus subtilis / L. Zheng, R. Losick // J. Mol. Biol. 1990. - V. 212. - P. 645-660.

153. Zuberi A.R. The nucleotide sequence and gene organization of the gerA spore germination operon of Bacillus subtilis 168 / A.R. Zuberi, A. Moir, I.M. Feavers // Gene. 1987. - V. 51. - №1. - P. 1-11.

Информация о работе

Частухина, Инна Борисовна
кандидата биологических наук
Казань, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Регуляция синтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius в стационарной фазе роста рекомбинантных штаммов Bacillus subtilis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Регуляция синтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius в стационарной фазе роста рекомбинантных штаммов Bacillus subtilis - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы