Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста"

На правах рукописи

ШАМСУТДИНОВ ТАЛГАТ РАХИМЗЯНОВИЧ

G03462820

ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗА BACILLUS INTERMEDIUS, СЕКРЕТИРУЕМАЯ РЕКОМБИНАНТНЫМ ШТАММОМ BACILLUS SUBTILIS НА РАЗНЫХ ФАЗАХ РОСТА

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2009

003462820

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии биолого-почвенного факультета ГОУ ВПО «Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина».

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор

Шарипова Маргарита Рашидовна

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, старший

научный сотрудник лаборатории биохимии РЦПБ СПИД, г. Казань Коксин Владимир Петрович

Доктор ветеринарных наук, профессор, зав. кафедрой биологической и неорганичесской химии Казанской государственной академии ветеринарной медицины, г. Казань Алимов Азат Миргасимович

Ведущая организация: Казанский институт биохимии и биофизики

КНЦ РАН, г. Казань

Защита диссертации состоится «26» марта 2009 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. П.И. Лобачевского Казанского государственного университета

Автореферат разослан «24» февраля 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

З.И. Абрамова

Актуальность проблемы. Интерес к микробным ферментам и, в частности, к протеиназам бацилл, объясняется недостаточной способностью протсолитических белков животного и растительного происхождения удовлетворять спрос на жизненные потребности населения планеты. Микроорганизмы являются источником всех типов гидролаз благодаря широкому разнообразию, простоте культивирования, безопасности в работе, способности к генетическим преобразованиям. Использование ферментов имеет ряд преимуществ по сравнению с химическими веществами. Протеолитические белки микроорганизмов высокоактивны, доступны и легко биодеградируются. В последние годы наблюдается интенсивное развитие биотехнологического производства бактериальных ферментов, область применения которых - промышленность, медицина, научные исследования.

Одной из наиболее интересных групп класса прогеолитичсских ферментов являются сериновые протеиназы бацилл. Эти белки участвуют в адаптационных процессах в условиях стресса, спорообразовании и прорастании спор. Неослабевающий интерес к этим белкам обусловлен широтой их практического применения. Выход целевого продукта у бацилл может быть существенно повышен за счет направленного воздействия на условия роста, использования штаммов с нарушениями систем регуляции, либо модификацией гепа. На основе протеиназ бацилл конструируют каталитические антитела с протеолигической активностью. Выделены протеиназы бацилл, обладающие фибринолитическими и тромболитическими свойствами. В связи с ростом числа заболеваний, связанных с тромбообразованием, актуальным является поиск новых ферментов с высокой активностью, специфичностью и низкой токсичностью. Одной из подгрупп сериновых протеиназ являются глутамилэндонептидазы, обладающие узкой субстратной специфичностью. Поэтому они являются высокоточными "инструментами" для фрагментации белковых молекул при исследовании первичной структуры.

Поскольку бациллы секретируют различные протеиназы, выделение индивидуальных белков контамшшрует с белковыми примесями, которые затрудняют аналитические исследования фермента. Генно-инженерные методы позволяют создавать рекомбинантные штаммы, содержащие на плазмиде ген индивидуального белка, что перспективно для разработки способов получения гомогенных протеиназ.

Целью работы явилось выделение, очистка и сравнительная характеристика глутамилэндопептидазы В. intermedins, секретируемой рекомбинантным штаммом на разных фазах роста.

В работе решались следующие задачи:

1. Подбор условий культивирования для выделения глутамилэндопептидазы В. intermedins из культуральной жидкости рскомбинантного штамма В. subtilis на разных стадиях роста.

2. Выделение и очистка глутамилэндопептидазы В. intermedins из культуральной жидкости рскомбинантного штамма на разных стадиях роста.

3. MALDI-TOF анализ аминокислотных последовательностей глутамилэндопептидазы, соответствующей разным стадиям роста.

4. Сравнительное исследование свойств глутамилэндопептидазы разных фаз роста.

5. Выяснение роли дисульфидной связи в образовании конформеров глутамилэндопептидазы.

Научная новизна. Впервые выделена и охарактеризована глутамилэндопептидаза В. intermedins, секретируемая рекомбинантным штаммом В. subtilis на разных стадиях роста. Впервые проведена сравнительная характеристика свойств ранней и поздней глутамилэндопептидазы. Получены приоритетные данные, о различие их каталитических характеристик (Кт и &cat). Установлено, что оба препарата идентичны по первичной структуре, их N- и С-концевые аминокислотные остатки совпадают. Впервые получены данные о содержании в структуре позднего фермента восстановленной дисульфидной связи в отличие от ранней глутамилэндопептидазы. Сравнительные исследования позволили заключить, что статус дисульфидной связи может определять степень молекулярной активности глутамилэндопептидазы разных фаз роста.

Практическая значимость. Подобраны условия культивирования бактерий для эффективной продукции глутамилэндопептидазы В. intermedius на разных стадиях роста для проведения эффективной очистки фермента. Полученный в работе рекомбинантный штамм В. subtilis может быть использован как эффективный продуцент глутамилэндопептидазы. Результаты работы могут быть использованы при разработке стратегии синтеза ферментов промышленными штаммами бактерий. Получение гомогенных препаратов ферментов увеличивает арсенал белков, используемых в научных исследованиях и в практических целях. Результаты исследования свойств раннего и позднего фермента рекомбинантного штамма В. subtilis позволит расширить наши представления о сериновых протеиназах, в частности, об особой подгруппе ферментов - глутамилэндопептидазах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования: Работа выполнялась в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.02.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования поддержаны грантами РФФИ 05-04-48182-а, Академии наук РТ № 03-3.5-20 и Аналитической Ведомственной Целевой Федеральной Программы PII1I 2.11.1005. Авторские исследования получили персональную поддержку Правительства Республики Татарстан (2007 г) и были удостоены именной стипендии президента Республики Татарстан.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработаны условия культивирования и получена глутамилэндопептидаза В. intermedius, соответствующая разным фазам роста рекомбинантного штамма.

2. Глутамилэндопептидаза, разных фаз роста характеризуется идентичной аминокислотной последовательностью, но отличается по каталитическим характеристикам и энзиматическим свойствам.

3. Дестабилизация глутамилзндопептидазы стадии позднего стационара по сравнению с соответствующим ферментом фазы замедления роста связана со статусом дисульфидной связи в белковой глобуле.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных, всероссийских и региональных конференциях: "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2005, 2006, 2007), школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005, 2006), Всероссийской научной конференции "Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение" (Казань, 2005), V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Паука. Инновации. Бизнес» (Казань, 2005), Международной конференции аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», (Москва, 2005, 2006), Материалах XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» секция биология (Новосибирск, 2005), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), Материалах докладов съезда с международным участием «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов» (Новосибирск, 2008), Материалах XLVI международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 21 научных работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, включает 5 таблиц, 24 рисунка. Библиография содержит 100 наименований российских и зарубежных авторов.

Благодарности: Автор выражает глубокую признательность научному руководителю проф. М.Р. Шариповой за внимательное отношение к работе; д.х.н., проф. I'.II. Руденской за возможность проведения экспериментов на базе лаборатории кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ; к.б.н., с.н.с. Н.П. Балабан, к.б.н., доц. A.M. Мардановой и к.б.н., доц. В.И. Вершининой за постоянную помощь в проведении экспериментов и обсуждении результатов; проф. C.B. Кострову (ИМГ РАН); к.б.н., с.н.с. И.В. Демидюку (ИМГ РАН) за предоставление плазмиды Д58.21 и антисыворотки к глутамилэндопеитидазе; проф. Е. Феррари (Genencor Int. Inc., США) за предоставление протеазо-дефицитпого штамма В. subtilis. Автор выражает искреннюю благодарность заведующей кафедрой микробиологии Казанского университета проф. О.Н. Ильинской и сотрудникам кафедры микробиологии за помощь и теплую рабочую атмосферу.

Материалы и методы

Штаммы и плазмиды. В работе использовали мультикоиийную илазмиду А58.21, полученную па основе вектора рСВ22 [Rebrikov et al., 1999] и любезно предоставленную для работы проф. Костровым C.B. (ИМГ РАН). Плазмида А58.21 содержала вставку размером 2.6 т.п.о. с геном глутамилэндопептидазы В. intermedins 3-19 под контролем собственных регуляторных элементов.

В качестве штамма-реципиента для плазмиды с геном глутамилэндопептидазы В. intermedius 3-19 использовали штамм В. subtilis JB 20-36 (Аарг, Дпрг), из хромосомной ДНК которого делетированы гены внеклеточных протеиназ (проф. Е. Феррари, Genencorlnt. Inc., США).

Культивирование бактерий. Исходной питательной средой для культивирования рекомбинантных бактерий являлась пептон-содержащая среда [Частухина с соавт., 2005]. Для подбора оптимальной среды использовали гидролизат коллагена (колламин) («Биопрогресс», Россия) в концентрации 1% и 2% в качестве добавки к пептон-содержащей среде. Кроме того, производили замену пептона «Sigma» на ферментативный пептон «Диа-М» в концентрациях 10-30 г/л. В среду культивирования непосредственно перед посевом добавляли хлорамфеникол в концентрации 20 мкг/мл. Растворы неорганического фосфата (Na2HPO,i) стерилизовали при 1 агм. и вносили в среду перед посевом в концентрациях 0,1-0,4 г/л.

Прирост биомассы измеряли нефелометрически на ФЭК-56М при 590 нм. Протеолитическую активность определяли по гидролизу синтетического хромогенного субстрата Z-Glu-pNA [Люблинская с соавт., 1987] и казеина [Каверзнева, 1971]. Удельную активность выражали в ед/мг белка.

Выделение и очистку глутамилэндопептидазы разных фаз роста из культуральной жидкости проводили методом ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе и колонке MonoS в системе FPLC («Pharmacia», Швеция).

Степень чистоты белковых препаратов и молекулярную массу определяли электрофорезом в денатурирующих условиях по методу Лаэммли [Laemmli, 1970] и в нативных условиях в 10% ПААГ, как описано на сайте (http://wolfson.huji.ac.il/purification/Protocols/PAGE_Acidic.html).

Гомогенные препараты белка, секретируемые на разных фазах роста культуры, анализировали с помощью метода масс-спектрометрии (MALDI-TOF). Полученные данные обрабатывали с помощью программ Peptide Mass Fingerprint (http://www.matrixscience.com.) и Peptide Mass (http://cn.expasy.org).

Иммуноферментный анализ проводили на кроличьих антителах к глутамилэндопептидазе В. intermedius 3-19. Кроличья антисыворотка к внеклеточной глутамилэндопептидазе В. intermedius любезно предоставлена для работы проф. Костровым C.B. (ИМГ РАН).

Субстратную специфичность глутамилэндопептидазы определяли, как описано в работе [Люблинская с соавт., 1987], на следующих синтетических тетрапептидах: Z-Ala-Ala-Met-Glu-pNa, Z-Ala-Ala-Trp-Glu-pNa, Z-Ala-Ala-Phe-Glu-pNa, Z-Ala-Ala-Leu-Glu-pNa, Z-Gly-Ala-Ala-Glu-pNa, Z-Ala-Ala-Trp-Asp-pNa, Z-Ala-Ala-Leu-Asp-pNa, Z-Ala-Ala-Phe-Asp-pNa, Z-Ala-Ala-Met-Asp-

pNa, Z-Gly-Ala-Ala-Asp-pNa, а также Z-Glu-pNa. Специфичность глутамилэндопептидазы rio отношению к природным субстратам определяли по гидролизу В - цепи окисленного инсулина, как описано в работе [Leshchinskaya et al., 1997].

Влияние ингибиторов на активность фермента определяли, используя диизоиропилфторфосфат (DFP), фенилметилсульфонилфторид (PMSF), диматриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭД'ГА), о-фенантролин, бензамидин и имидазол ("Sigma", Германия) в молярном соотношении фермент: ингибитор=1:100. Белковые ингибиторы: утиный овомукоид и соевый ингибитор трипсина ("Sigma", Германия) использовали в молярном соотношении 1:10.

Свойства ферментов. Кт и ксм препаратов протеиназ определяли но гидролизу специфического хромогенного субстрата Z-Glu-pNa с использованием двулучевого спектрофотометра Lambda 35 «Perkin Klmcr» (США).

рН- и Т-оптимум, рН- и Т-стабильность протеиназ исследовали но гидролизу синтетического хромогенного субстрата Z-Glu-pNA с использованием 0,1М трис-IICl буфера с рН от 7,2 до 10,0 с ионами Са2+ в конечной концентрации 5 мМ.

Изучение влияния ионов 2-х валентных металлов на активность фермента проводили с использованием солей MgSOi, СаС12, MnSOb СоСЬ. К раствору белка добавляли раствор соответствующей соли до конечных концентраций (1; 2.5; 5; 10 и 20 мМ) и выдерживали в течение 10 мин. В качестве контроля (100%) принимали активность фермента без ионов металлов.

Математическую обработку полученных данных проводили в программной среде «Microsoft Excel». Результаты многофакторных экспериментов обрабатывали с помощью программы STATGRAPHICS.

Результаты исследований и их обсуждение

Динамика роста и накопления глутамилэндопептидазы В. intermedins в культуралыюй жидкости рекомбинантного штамма В. subtilis. После трансформации плазмиды А58.21, несушей ген глутамилэндопептидазы В. intermedias под собственным промотором, в протеазо-дефицитный лабораторный штамм В. subtilis JB 20-36 изучали экспрессию гена в рекомбинантном штамме. Выбор штамма-рсциниента определялся отсутствием у itero протеолитической активности в культуральной жидкости, что позволяет получить модельный штамм для изучения экспрессии индивидуального гена и корректно провести выделение и очистку соответствующего белка па разных фазах культивирования.

При исследовании динамики накопления внеклеточной глутамилэндопептидазы нами обнаружены два максимума накопления протеолитической активности по расщеплению специфического хромогенного субстрата Z-Glu-pNA: в фазе замедления роста (24 ч) (ранний фермент) и в поздней стационарной фазе роста (48 ч) (поздний фермент)

(рисунок 1). При этом уровень накопления раннего фермента в 1,5 раза превышал таковой в поздней стационарной фазе роста культуры. Удельная скорость накопления ранней глутамилэндопептидазы (е, ед.акт.хч"1) в культуральной жидкости возрастала в период, когда удельная скорость роста культуры падала (ц, ед.акт.хч'1), т.е. согласно модели Колемана эта протеиназа может быть охарактеризована как катаболитный фермент [Coleman et al., 1975J.

Время, ч

Рисунок 1 - Динамика роста, спорообразования и накоплении глутамилэндопетидазы рекомбинантного штамма В. ¡иЫИй.

А - ранняя глутамилэндопетидаза; Б - поздняя глутамилэндопетидаза

1 - рост культуры, 005,о

2 - активность глутамилэндопетидазы рекомбинантного штамма В. ¡иЬЧ7«. (ед/мл)

3 - удельная скорость роста (д, ед.акт.хч"1)

4 - удельная скорость накопления глутамилэндопетидазы (е, ед.акт.хч"')

5 - количество свободных спор, %

Полученные данные свидетельствуют, что экспрессия гена глутамилэндопептидазы у рекомбинантного штамма характеризуется двумя максимумами активности фермента, что взаимосвязано с физиологическим циклом бацилл.

Подбор питательной среды. Для выделения и очистки внеклеточной глутамилэндопептидазы разных фаз роста бактерий, проводили подбор компонентов питательной среды для эффективной продукции фермента на соответствующие часы роста микроорганизмов. Варьировали концентрации основных источников азота - пептона и тринтона в составе среды культивирования. Наряду с этими источниками питания использовали гидролизат коллагена (колламин) в качестве более доступной замены пептона и триптона в условиях масштабирования процесса очистки белка. Как видно из таблицы 1, максимальный уровень активности глутамилэндопептидазы в культуральной жидкости наблюдался в опытах с пептон-содержащей средой

и средой ЬВ без внесения дополнительных компонентов и замен одного источника азота на другой: пептона и триптона - на гидролизат коллагена (колламин), бактериологического пептона - на ферментативный пептон.

Таблица 1

Подбор питательной среды для максимальной продукции глутамилэндопептидазы В. ШегтесИю, секретирусмой рекомбинантным штаммом В. тЬгШч на разных фазах роста

Активность, ед/мг

Состав питательной среды

В фазе В

замедления стационарном

роста фазе

ЬВ 1,12 0,5

ЬВ+1% колламин 0,33 0,2

ЬВ+2% колламин 0,25 0,15

ЬВ (триптон—>1% колламин) 0,6 0,22

ЬВ (триптон—»2% колламин) 0,7 0,38

Пептон-содержащая среда 1,33 0,58

(бактериологический пептон, 20 г/л)

Пептон-содержащая среда+1% колламин 0,55 0,21

Пептон-содержащая среда+2% колламин 0,33 0,18

Пентон-содержащая среда 0,63 0,29

(пептон—»1% колламин)

Пептон-содержащая среда 0,6 0,31

(пептон—>2% колламин)

Пептон-содержащая среда 0,65 0,4

(ферментативный пептон, 20 г/л)

Пептон-содержащая среда 0,75 0,43

(ферментативный пептон, 30 г/л)

Пептон-содержащая среда 0,71 0,41

(ферментативный пептон, 40 г/л)

Активность фермента в пептон-содержащей среде составила для ранней глутамилэндопептидазы - 1,33 ед/мг, для поздней - 0,58 ед/мг, в среде ЬВ -1,12 и 0,5 ед/мг соответственно. Замена пептона на гидролизат коллагена (колламин), а также внесение последнего в качестве дополнительного источника питания снижали активность протеиназы более, чем в 2 раза (0,6 0,55 ед/мг - для ранней протеиназы, 0,31 - 0,21 ед/мг - для поздней протеиназы). Использование ферментативного пептона в концентрациях 10 -30 г/л вместо бактериологического пептона приводило к снижению активности глутамилэндопептидазы, но в меньшей степени, чем при использовании гидролизата коллагена (колламина) (0,65 - 0,71 ед/мг - для ранней протеиназы, 0,4 - 0,41 ед/мг - для поздней протеиназы). Таким образом, применение гидролизата коллагена (колламина) и ферментативного пептона в составе питательной среды нецелесообразно. Поэтому для очистки

глутамилэндопептидазы из культуральной жидкости рекомбинантного штамма использовали среду ЬВ и пептон-содержащую среду.

Исследовали влияние соотношения двух основных компонентов питательной среды - пептона и неорганического фосфата на биосинтез ранней и поздней глутамилэндопептидазы в двухфакторных экспериментах. Оптимальное соотношение концентраций двух основных компонентов питательной среды - пептона и неорганического фосфата для эффективной продукции фермента на разных фазах роста культуры подбирали в многофакторных экспериментах с последующей обработкой результатов в программе 8ТАТОЯАР1С8. Результаты двухфакторных экспериментов представлены на рисунке 2 в виде линий уровня активности глутамилэндопептидазы, где выделяется оптимальная по двум рассматриваемым факторам зона.

Итак, максимальные значения по активности глутамилэндопептидазы, секретируемой рекомбинантным штаммом на 24-й час культивирования наблюдаются при концентрации в среде пептона 30,5 г/л и неорганического фосфата 0,34 г/л, на 48-й час культивирования - при концентрации в среде пептона 30 г/л и неорганического фосфата 0,25 г/л.

А

Рисунок 2 - Линии уровня активности ранней (А) и поздней (Ь) глутамилэндопептидазы В. ¡ШегтеМш секретируемой рекомбинантным I

штаммом В. яиЫШ$ в двухфакторных экспериментах.

Неорганический 018 фосфат, г/л и:

20 2А И 12 36 40

0.3 0,26 0.22 0.

0.14

/

.......у'.

Ч. >": - .....'Г

____/

20 24 28 32 36 40

Пептон, г/л

Таким образом, подобрано оптимальное соотношение в среде концентраций пептона и неорганического фосфата для получения глутамилэндопептидазы на разных стадиях роста бацилл.

Очистка глутамилэндопептидазы разных фаз роста.

Глутамилэндопептидазу В. ШегтесЧш выделяли из культуральной жидкости на разных фазах роста бактерий: на 24 и 48 ч и подвергали процедуре очис тки (таблица 2). Выделение фермента из освобожденной от клеток культуральной жидкости проводили с помощью ионообменной хроматографии на КМ -

целлюлозе. Это позволило за одну стадию очистки получить глутамилэндопептидазу со степенью очистки в 250-300 раз с выходом 31 и 38,8%, для раннего и позднего фермента соответственно. Последующую очистку проводили на колонке Mono S в системе FPLC-хроматографии. Ранняя глутамидэндопептидаза получена со степенью очистки 1257 и выходом 12,5%. Степень очистки поздней глутамилэндоиептидазы составила 1350 с выходом фермента 7,8%.

Таблица 2

Очистка глутамилэндопептидазы В. intermedins, сскретируемой рекомбинантиым штаммом В. subtilis

Стадии очистки К мл Белок общ., ед. Активность общ., ед. акт. Уд. акт. ед. акт./А28о Степень очистки Выход.

Культуральная жидкость

Ранняя протеиназа 1850 33300 46.3 0.0014 1 100

Поздняя протеиназа 1900 43700 41.8 0.001 I 100

Хроматография на КМ-целлюлозе

Ранняя протеиназа 44 42.5 18.0 0.42 300 38.8

Поздняя протеиназа 46 50.6 12.9 0.25 250 31.0

Хроматография на колонке МопоЭ Ранняя протеиназа 15 3.3 5.8 1.76 1257 12.5

Поздняя протеиназа 12 2.4 3.25 1.35 1350 7.8

Хроматографические профили ранней и поздней глутамилэндопептидазы В. intermedins рекомбинантного штамма представлены на рисунке 3.

- -0.2S O.J.

- .0.3 0.4.

I - И

Рисунок 3 - Хроматография глутамилэндопептидазы В. intermedins, секретируемой рекомбинантиым штаммом В. subtilis на колонке Mono S: I - Л28в, И -градиент NaCl (0-0,5 М) в 15 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 6,3, содержавшем 0,5 мМ СаСЬ, Л - ранняя протеиназа, К -поздняя протеиназа.

Объем элкшии. мл Объем элкшии. мл

Чистота очищенного фермента исследована с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях (рисунок 4). Ранняя и поздняя глутамилэндопептидазы представлены одной белковой полосой, подтверждающей гомогенность белка.

Рисунок 4 - Электрофорез в денатурирующих условиях гомогенных препаратов глутамилэндопептидазы В. intermedius, соответствующих разным фазам роста рекомбинантного штамма.

1. Маркеры: 94.6 кДа (целлюлаза), 66.2 кДа (БСА), 45 кДа (овальбумин куриного яйца), 29 кДа (карбоксиангидраза бычьих эритроцитов), 18.4 кДа ((3-лактоглобулин), 14.4 кДа (лизоцим);

2. Ранний белок (24 ч роста);

3. Поздний белок (48 ч роста)

Проводили иммунологический анализ глутамилэндопептидазы с использованием кроличьей антисыворотки против гомогенной глутамилэндопептидазы, полученной из культуральной жидкости В. intermedius 3-19. Методом иммунодиффузии для фермента разных фаз роста показано образование преципитатов против лунки, содержащей антисыворотку к глутамилэндопептидазе исходного штамма В. intermedius (рисунок 5). Полученные результаты указывают на идентичность глутамилэндопептидазы, продуцируемой рекомбинантными клетками В. subtilis, ферменту, синтезируемому исходным штаммом В. intermedius. Вместе с тем, данные экспериментов свидетельствуют об идентичности аминокислотной последовательности глутамилэндопептидазы,

соответствующей разным стадиям роста.

2

5

Рисунок 5 - Иммунореакция с антителами против глутамилэндопептидазы В. intermedius. 1 - глутамилэндонеитидаза В. intermedins (позитивный контроль); 2 -субтилизиноподобная протеиназа В. intermedius (негативный контроль); 3,4 - ранняя глутамилэндопептидаза рекомбинантного штамма; 5, 6 поздняя

глутамилэндопептидаза рекомбинантного штамма.

кДа

94,6 66,2 45

29

18,4

14,4

I ^

Препараты протеиназы, 24 и 48 ч роста бактерий анализировали методом MALDI-TOF - масс-спектрометрии, который позволил установить первичную структуру аминокислотной последовательности и молекулярную массу исследуемого белка (рисунок 6).

Глутамилэндопептидаза разных фаз роста по результатам MALDI-TOF" имеет молекулярную массу 22,7 кДа, что совпадает с данными, полученными методом SDS-электрофореза.

1 VVIGDDGRTKVANTRVAPYNSIAYITFGGSSCTGTUAPNKILTNGH 1 VVIGDDGRTKVANTRVAPYNSIAYITFGGSSCTGTLIAPNKILTNGH

48 CVYNTASRSYSAKGSVYPGMNDSTAVNGSANMTEFYVPSGYINTGAS 48 CVYNTASRSYSAKGSVYPGMNDSTAVNGSANMTEFYVPSGYINTGAS

95 QYDFAVIKTDTNIGNTVGYRSIRQVTNLTGTTIKISGYPGDKMRSTG 95 QYDFAVIKTDTNIGNTVGYRSIRQVTNLTGTTIKJSGYPGDKMRSTG

142 KVSQWEMSGSVTREDTNLAYYTroTFSGNSGSAMLDQNQQIVGVHNA 142 KVSQWEMSGSVTREDTNLAYYTIDTFSGNSGSAMLDQNQQIVGVHNA

189 GYSNGTINGGPKATAAFVEFMYAKAQ 215 - Ранний белок 189 GYSNGTINGGPKATAAFVEFINYAKAQ 215 - Поздний белок

Рисунок 6 - Аминокислотная последовательность глутамилэндопептидазы В. intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом В. subtüis на разных фазах роста, полученная с помощью MALDI-TOF анализа.

Электрофорез в неденатурирующих условиях показал наличие одной полосы для обоих препаратов, а значит фермент, соответствующий разным стадиям роста, представляет собой мономерный белок (рисунок 7).

Сравнительная характеристика глутамилэндопептидазы разных фаз роста. Исследовали действие ингибиторов различной природы на активность глутамилэндопептидазы В. ШегтеЖия, секретируемой рекомбинантным штаммом В. зыЫШб на разных стадиях роста.

Согласно полученным данным, ранняя и поздняя глутамилэндопептидаза не чувствительна к действию ингибиторов

ранняя пр отеиназа

поздняя протеиназа

Рисунок 7 - Электрофорез препаратов глутамилэндопептидазы В. intermedius в неденатурирующих условиях.

металлопротеиназ: ЭДТА и о-фенантролина. Активность фермента полностью подавлялась специфическим ингибитором сериновых протеиназ - диизопропилфторфосфатом (БРР). Полное подавление со стороны специфического ингибитора сериновых протеиназ указывает на принадлежность белка к этому классу ферментов.

Фепилметилсульфонилфторид (РМБР) частично ингибировал активность протеиназы, причем, активность позднего фермента ингибировалась на 35%, а фермента, соответствующего вегетативному росту только на 15% (таблица 3). Имидазол, бензамидин и белковые ингибиторы снижают активность позднего фермента, в то время как на активность раннего фермента не влияют. Полученные данные могут свидетельствовать о различии конформационного статуса белка разных фаз роста.

Таблица 3

Влияние ингибиторов на активность препаратов глутамилэндопептидазы В. ШеппесНш

Ингибиторы Мол. соотн. Субстрат г-аи-рЫА

фермент: Остаточная

ингибитор активность, %

Ранняя Поздняя

глутамилэндопептидаза глутамилэндопептидаза

БРР 1:100 0 0

РМ8Р 1:100 85 65

ЭДТА 1:100 100 100

о-фенантролин 1:100 100 100

Имидазол 1:100 100 75

Бензамидин 1:100 100 60

Соевый 1:10 100 85

ингибитор

трипсина

Овомукоид 1:10 100 70

утиныи

*а-~10%

Изучение субстратной специфичности глутамилэндопептидазы, выделенной на разных фазах роста рекомбинантного штамма, проводили но гидролизу различных синтетических пептидных и белковых субстратов (таблица 4).

Активность обоих препаратов по отношению к синтетическим пептидам, содержащим остаток глутаминовой кислоты выше, чем на субстратах, содержащих остаток аспарагиновой кислоты, что характерно для ферментов этой группы. Полученные данные позволили достоверно установить, что препарат ранней глутамилэндопептидазы характеризуется более высокой скоростью расщепления синтетических субстратов но сравнению с поздним ферментом. Удельная активность раннего белка на

синтетических пептидах в 3-5 раз выше, чем позднего. Та же закономерность сохраняется при расщеплении белковых субстратов, активность по расщеплению которых в 2-5 раз выше для раннего фермента.

Специфичность обоих препаратов фермента исследовали по расщеплению окисленной В-цепи инсулина (рисунок 8).

Таблица 4

Субстратная специфичность глутамилэндопепгидазы разных фаз росга по гидролизу синтетических и белковых субстратов

Удельная активность, ед/мг

Субстрат ранний фермент поздний ферме

2-А1а-А1а-РЬе-С1и-рКА 188 55,6

2-А1а-А1а-Ьеи-С1и-рЫА 179 63,2

г-А1а-А1а-МеЮ1и-рЫА 162 31,6

г-ау-АЬ-Аь-ети-рЫА 52,5 15

2-А1а-А1а-Тгр-01и-р^ 39 8,8

г-А1а-А1а-Ьеи-А5р-рЫА 10,4 2,5

г-А1а-А1а-Тгр-А5р-рКА 7_______ 2

7-А1а-А1а-Ме1-А$р-р№ 4,7_____ 1,1

Х-Ак-Ак-РЬе-Агр-рМА 1,9 ___________0,4

г-01у-А1а-А1а-Азр-рКА 0.9 0,2

Азоальбумин 11,3 8

Азоказеин 10,1 2,9

Казеин 9,9 2,1

Ранняя протеиназа

F-V-N-Q-H-L-C-G-S-H-L-V-E-A-L-Y-L-V-C-G-E-R-G-F-F-Y-T-P-K-A

Поздняя протеиназа

Рисунок 8 - Гидролиз В-цепи инсулина глутамилэидопептидазой В. ШегтеМш, секретируемой рекомбинантпым штаммом В. ¡иЬ/Шз на разных фазах роста.

Полученные данные показали, что ранняя протеиназа гидролизуст окисленную В-цепь инсулина по остатку глутаминовой кислоты и двум остаткам цистеиновой кислоты. А поздняя протеиназа гидролизует В-цспь инсулина только по остатку глутаминовой кислоты. Таким образом, препараты глутамилэндопептидазы различаются но степени гидролиза окисленной В-цепи инсулина.

Константы Михаэлиса для протеиназы, разных стадий роста определяли по гидролизу специфического хромогенного субстрата. Из графика, построенного в координатах Лайнуивера-Берка, следует, что Кт для ранней

протеиназы составила 4,3 мМ, а для поздней - 8,8 мМ. Каталитическая константа ксЛ (1437с"1) раннего белка выше, чем позднего (887с"1), что указывает на более эффективное расщепление субстрата, по сравнению с поздним ферментом.

Таким образом, каталитические константы и результаты определения субстратной специфичности позволяют сделать вывод о более высокой удельной активности и скорости гидролиза субстратов для ранней г лутами лэндои ецти дазы.

Исследовали зависимость активности глутамилэндоиептидазы разных стадий роста от температуры в отсутствие и присутствии 5 мМ ионов Са2+ (рисунок 9). Ранняя глутамилэндопептидаза проявляет максимальную активность при 45° С в отсутствии ионов Са2+, активность резко снижается при 50-55° С. Присутствие ионов Са2+ в реакционной смеси сдвигает оптимум температуры на 15° С и увеличивает активность на 20%.

т°.с т°,с

Рисунок 9 - Температурный оптимум препаратов глутамилэндопептндазы В. т1егтЫш$:

А-ранняя глутамилэндопептидаза; Б-поздняя глутамилэндопептидаза

1-активность в отсутствие ионов Са2+; 2-активиость в присутствии ионов Са2

Максимальная активность поздней глутамилэндоиептидазы в отсутствии ионов Са2+ наблюдается в диапазоне температур от 37 до 50°С, при 55°С фермент теряет активность. В присутствии ионов Са2+ фермент проявляет максимальную активность при 45°С, причем активность увеличивается почти в 2 раза по сравнению с таковой без ионов Са2+. При исследовании термостабильности установлено, что термостабильность раннего фермента превышает на 5-8° термостабильность позднего белка и увеличивается в присутствии Са2+.

Препараты ранней и поздней глутамилэндопептндазы стабильны в диапазоне рН 7,5-9,5, причем ранний фермент проявляет более высокую рП-стабильность по сравнению с поздним белком: его активность начинает снижаться при рН выше 9.5, тогда как активность позднего фермента снижается при рН 9,0.

Известно, что ионы двухвалентных металлов стабилизируют молекулу фермента и необходимы для формирования функционально-активной конформации протеиназ. Исследование влияния ионов двухвалентных металлов на активность глутамилэндопептидазы показало, что активность раннего белка увеличивается в среднем на 20% в присутствии ионов Са2+, Мё'+, Мп ' и Со2+ (рисунок 10). Поздний фермент оказался более чувствительным к воздействию ионов металлов. Ионы Са24 и М^2" в концентрации до 20 мМ приводили к возрастанию активности фермента в 22,5 раза. Ионы Мп2 и Со2 в концентрациях 2,5-10 мМ увеличивали активность поздней протеиназы в среднем на 40-50%. По-видимому, на разных стадиях роста происходят изменения в конформационной структуре молекулы, природу которых мы соотносим с формированием элементов вторичной СТЛУКТУОЫ.

140 Л 234

г? 100

280 1234

5 10 20 Концентрация, мМ

5Т/Р 10 20,. Концентрация, мм

Рисунок 10 - Влияние ионов двухвалентных металлов на активность ранней и поздней глутамилэндопептидазы В. иПегтшИт рекомбинантного штамма В. эиЬгШа.

А - ранняя протеиназа; Б - поздняя протеиназа;

1 - ионы Са2+; 2 - ионы ¡\^2+; 3 - ионы Мп2'; 4 - ионы Со24

За 100% принята активность препарата глутамилэндопептидазы в отсутствие ионов металлов

Нуклеотидная последовательность гена глутамилэндопептидазы Влп1егтес1ш8 [ЯеЬпкоу ег а1., 1999] и рештено-структурный анализ белка [Меуеге ег а1, 2004] указывают на присутствие дисульфидной связи в белковой глобуле глутамилэндопептидазы. Мы предположили, что обнаруженные нами конформационные изменения могут соответствовать статусу дисульфидной связи в структуре фермента.

Исследовали влияние дитиоэритритола (ДТЭ), реагента для восстановления дисульфидных связей на активность глутамилэндопептидазы В. МегтесИиБ разных фаз роста (рисунок 11). В присутствии ДТЭ в концентрациях от 1 до 100 мМ активность раннего фермента падала на 5060%. Эти данные свидетельствуют о наличие дисульфидной связи в конформационной структуре глутамилэндопептидазы.

Активность позднего фермента в присутствии тех же концентраций ДТЭ оставалась без изменения. Полученные данные указывают на восстановленное состояние дисульфидной связи в структуре поздней глутами лэндоп ептидазы.

Концентрация, мМ Концентрация, мМ

Рисунок 11 - Влияние дитиоэритритола на активность препаратов глутамилэндопептидазы В. ШегтеМт, соответствующих разным фазам роста рекомбинантного штамма В. ииЫНи.

А -протеиназа фазы замедления роста, Б - протеиназа стационарной фазы роста;

За 100% принята активность в отсутствие ДТЭ

Исследовали активность ранней и поздней глутамилэндопептидазы в присутствии парахлормеркурибензоата (п-ХМБ), используемого для анализа -ЯН-групп в структуре белков (рисунок 12).

120 -

£ 100 1-1

£ 80 о

§ 60 со

? 40

< 20 [

120 100 80 60 40 20 0

10

20

Концентрация, мМ

5 10 20 Концентрация. мМ

Рисунок 12 - Влияние п-ХМБ на активность препаратов глутамилэндопептидазы В. ШегтеШш, соответствующих разным фазам роста рекомбинантного штамма В. хиЫШъ.

А - протеиназа фазы замедления роста; Б - протеиназа стационарной фазы роста;

За 100% принята активность в отсутствие п-ХМБ

В присутствие п-ХМБ в реакционной смеси в концентрациях 2-10 мМ активность препарата раннего фермента оставалась без изменения, что свидетельствует об отсутствии свободных БН-групп в структуре фермента. Присутствие ингибитора в концентрациях 2-5 мМ снижало активность

позднего белка на 60%, а в концентрациях 10-20 мМ полностью ингибировало фермент.

Соли ртути 1^1чЮ2, используемые в анализе белков как реагенты на -ЯП-группы, в концентрациях 10-20 мМ незначительно снижали активность ранней глутамилэндопептидазы (10-20%), но в концентрации 20 мМ ингибировали активность позднего белка на 80% (рисунок 13). Данные позволяют предположить наличие ЯН-групп структуре поздней глутамилэндопептидазы.

120 100 80 60 40 20 0

120 100 80 60 40 20 0

10 15 20 Концентрация, мМ

- Влияние

10 15 20 Концентрация, мМ

активность

соответствующих разным

препаратов фазам роста

Рисунок 13 глутамилэндопептидазы В. иПегтесИиэ рекомбинантного штамма В. ¡иЫИ'к.

А - протеиназа фазы замедления роста; Б - протеиназа стационарной фазы роста;

За 100% принята активность в отсутствие

Дисульфидная связь стабилизирует структуру глутамилэндопептидазы, что является важным фактором, определяющим уровень молекулярной активности раннего белка. Восстановление этой связи соответствует позднему фермент-у с более низким уровнем каталитической активности. Полученные нами данные позволили предположить, что статус дисульфидной связи определяет степень молекулярной активности белка на разных стадиях роста.

При переходе к спорообразованию бактериальная клетка претерпевает несколько стадий морфогенеза, которые сопровождаются сменой белковых компонентов клеточной оболочки, среди которых фолдинговые эффекторы и шапероны, участвующие в активации секретируемых белков. Мы предполагаем, что конформационная подвижность глутамилэндопептидазы выявленная в наших исследованиях, определяется набором эффекторов, участвующих в формировании третичной структуры в соответствии со стадией роста.

Будучи ферментом с узкой субстратной специфичностью, глутамилэндопептидаза выполняет не столько трофическую, а скорее регуляторную роль. Ограниченный протеолиз является молекулярным механизмом контроля на постграпсляциошгом уровне, вызывая образование, инактивацию и модификацию биорегуляторов белковой и пептидной

ирироды. Становится очевидным, что протсиназам принадлежит первостепенная роль в реализации межклеточных взаимодействий па уровне бактериальных популяций. В качестве сигнальных молекул в этом случае могут быть пептиды - продукты расщепления протеиназ. В ходе эволюции протеолитических белков переход от ферментов катаболизма к ферментам-биорегуляторам осуществлялся за счет усложнения структуры связывающего центра, обеспечивающего специфичность и скорость гидролиза. В связи с чем, исследования глутамилспецифичных эндопептидаз, обнаруженных у бацилл, патогенных бактерий, вирусов и стрептомицетов, представляют существенный интерес во взаимосвязи с важнейшими физиологическими процессами, такими как морфогенез, адаптация, пролиферация, патогенез и дифференцировка. Нами впервые выявлена модуляция активности внеклеточной глутамилэндонептидазы на разных стадиях роста и дифференцировки бацилл. Эти данные могут служить основой для молекулярного механизма контроля уровня функциональной активности белка в зависимости от фазы развития микроорганизмов.

Таким образом, результаты сравнительного исследования свойств раннего и позднего фермента позволяют расширить наши представления о способах регуляции функциональной активности глутамилэндоиептидаз, малоизученной подгруппы секретируемых сериновых протеиназ, при переходе бацилл в анабиотическое состояние.

ВЫВОДЫ

1. Подобраны компоненты питательной среды, для получения высокого уровня активности ранней (24 ч роста) и поздней (48 ч роста) глутамилэпдопептидазы В. ШегтесИш в культуральиой жидкости рекомбинантного штамма В. виЪНШ.

2. Выделена и очищена глутамилэндопептидаза В. ШегтесИш, соответствующая фазе замедления роста и стационарной фазе роста рекомбинантного штамма, со степенью очистки, составляющей 1257 для ранней и 1350 - для поздней прогеиназы и выходом 7.8% и 12.5%, соответственно. Молекулярная масса ранней и поздней глутамилэпдопептидазы составляет 23 кДа.

3. Методом масс-спектрометрии установлено, что ранняя и поздняя глутамилэндопептидаза имеет идентичную последовательность аминокислот, ]Ы- и С- концы которой совпадают.

4. Установлены различия в каталитических свойствах глутамилэпдопептидазы, секретируемой в фазе замедления роста и стационарной фазе бактерий.

5. Установлено, что уровень каталитической активности глутамилэндонептидазы, соответствующей разным стадиям роста бактерий, определяется статусом дисульфидной связи в конформации белка.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Шагимардаиова, Е. И. Гетерологичная экспрессия гена глутамилэндопептидазы Bacillus inlermedius штаммами Bacillus subtilis, дефектными но регуляторным белкам [Текст]/ Е. И. Шагимардаиова, И. Б. Частухина, Т. Р. Шамсутдинов, II. II. Балабан, Л. М. Марданова, С. В. Костров, М. Р. Шарипова // Микробиология, - 2007. - Т.76. - №5. - С. 645-651.

2. Соколова, Е. А. Оптимизация выделения внеклеточных протеипаз Bacillus intermedius 3-19, секретируемых бактериями в поздней стационарной фазе роста [Текст] / Е. Л. Соколова, Т. Р. Шамсутдинов, Н. П. Балабан // Ученые Записки Казанского университета. - 2007. -Т.149, Серия Естественные науки, Книга 2, №2. - С. 114-124.

3. Sharipova, М. R. The expression of Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase gene in Bacillus subtilis recombinant strains [Text] / M. R. Sharipova, I. B. Chastukhina, E. I. Shagimardanova, T. R. Shamsutdinov, N. P. Balaban, А. M. Mardanova, L. A. Gabdrakchmanova, G. N. Rudcnskaya, I. V. Demiduk, S. V. Kostrov // Molecular Biology Reports. -

2007. V.34.- P. 79-87.

4. Шамсутдинов, Т. Р. Выделение и характеристика глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста [Текст] / Т. Р. Шамсутдинов, Н. П. Балабан, А. М. Марданова, 10. В. Данилова, Г. Н. Руденская, М. Р. Шарипова // Биоорганическая химия, -

2008. - Т.34. - №3. - С. 322-326.

5. Balaban, N. Р. Isolation and characterization of Bacillus amyloliquefaciens endopeptidase that is secreted in ditterent growth phase [Text] / N. P. Balaban, А. M. Mardanova, L. A. Malikova, T. R. Shamsutdinov, O. N. Ilinskaya, G. N. Rudenskaya, M. R. Sharipova // Annais of Microbiology. -2008. - V. 58(4). -P. 1-8.

6. Маликова, JI. А. Субтилизиноподобные нротеиназы Bacillus amyloliquefaciens [Текст] / JI. А. Маликова, Т. Р. Шамсутдинов, Г. II. Руденская, А. М. Марданова, Н. П. Балабан // Материалы XIII международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение». Казань, 2005. - С. 55-56.

7. Маликова, Л. А. Особенности контроля биосинтеза субтилизинов, секретируемых Bacillus pumilus КММ 62 [Текст] / JI. А. Маликова, Т. Р. Шамсутдинов, О. В. Соколова, А. М. Марданова. // Материалы 9-ой международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2005. - С. 201.

8. Шагимардаиова, Е. И. Молекулярные механизмы регуляции экспрессии гена глутамилэндопептидазы В. intermedius рекомбинантным штаммом В. subtilis [Текст] / Е. И. Шагимардаиова, Т. Р. Шамсутдинов, И. Б. Частухина, М. Р. Шарипова // Материалы V Республиканской научно-

практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука, инновации, бизнес», Казань, 2005. - С. 60-61.

9. Шамсутдинов, Т. Р. Оптимизация среды для биосинтеза глутамилэндопептидазы В. intermedins рекомбинантным штаммом В. subtilis [Текст] / Т. Р. Шамсутдинов, Е. И. Шагимарданова, JI. Л. Маликова, Н. П. Балабан, М. Р. Шарипова // Материалы V Республиканской научно- практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука, инновации, бизнес», Казань, 2005. С. 53-54.

¡0. Шамсутдинов, Т. Р. Оптимизация среды для биосинтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis AJ 73 [Текст] / Т. Р. Шамсутдинов, Е. И. Шагимарданова, Л. А. Маликова, Н. П. Балабан // Материалы Молодежной школы конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2005. - С. 111-113.

11. Шагимарданова, Е. И. Регуляция синтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius рекомбинантными клетками Bacillus subtilis в стационарной фазе роста [Текст]/ Е. И. Шагимарданова, Т. Р. Шамсутдинов, И. Б. Частухина // Материалы XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», Новосибирск, 2005. - С. 92-93.

12. Shagimardanova, Е. I Analysis of regulatory region of Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase gene [Text] / E. 1. Shagimardanova, T. R. Shamsutdinov, I. B. Chastuchina, M. R. Sharipova // BGRS-2006: Proceedings of the fifth international conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure, Novosibirsk, Russia, 2006. - P. 156-160.

13. Шамсутдинов, Т. P. Влияние системы регуляции азотного обмена на биосинтез сериновых протеиназ В. intermedius в клетках В. subtilis [Текст] / 'I'. Р. Шамсутдинов, А. Р. Каюмов, Р. А. Байрамов, М. Р. Шарипова П Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», Москва, 2006.-С.248.

14. Шамсутдинов, Т. Р. Влияние системы регуляции азотного обмена на биосинтез сериновых протеиназ В. intermedius в клетках В. subtilis [Текст] / Т. Р. Шамсутдинов, А. Р. Каюмов, Р. А. Байрамов, М. Р. Шарипова // Биология - наука XXI века: Сборник тезисов / 10-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, 2006. - С. 60.

15. Шамсутдинов, Т. Р. Влияние системы регуляции азотного обмена на биосинтез сериновых протеиназ В. intermedius в клетках В. subtilis [Текст] / Т. Р. Шамсутдинов, А. Р. Каюмов, А. Р. Сабирова, М. Р. Шарипова // «Материалы и технологии XXI века»: тезисы докладов / VI Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета, Казань, 2006. - С. 125

16. Шамсутдинов, Т. Р. Экспрессия генов сериновых протеиназ Bacillus intermedius в клетках Bacillus subtilis, дефектных по NRGB-регуляторному белку [текст] / Т. Р. Шамсутдинов, А. Р. Каюмов, М. Р. Шарипова // Материалы VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов», Москва, 2007. - С. 62.

17. Шагимарданова, Е. И. Гетерологичная экспрессия гена глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius [Текст] / Е. И. Шагимарданова, И. Б. Частухина, Т. Р. Шамсутдинов, М. Р. Шарипова // Материалы VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов», Москва, 2007. - С. 63.

18. Шамсутдинов, Т. Р. Свойства глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, продуцируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста [Текст] / Т. Р. Шамсутдинов, А. А. Тойменцева, Ю. В. Данилова, А. М. Черемин, Н. П. Балабан, А. М. Марданова, М. Р. Шарипова // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008.- С. 381.

19. Данилова, Ю. В. Характеристика глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, секретируемой на разных фазах роста рекомбинантного штамма Bacillus subtilis [Текст] / Ю. В. Данилова, А. М. Черемин, Т. Р. Шамсутдинов // Материалы XLVI международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", Новосибирск, 2008. - С. 35.

20. Каюмов, А. Р. Экспрессия генов сериновых протеиназ Bacillus intermedius в клетках Bacillus subtilis в условиях азотного голодания [Текст] / А. Р. Каюмов, Т. Р. Шамсутдинов, А. Р. Сабирова, К. П. Федорова, А. И. Ахметова, М. Р. Шарипова // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008. - С. 148.

21. Шарипова, М. Р. Вклад сигнальной трансдукции в формирование клеточного ответа в стационарной фазе бацилл [Текст] / М. Р. Шарипова, Н. П. Балабан, А. М. Марданова, А. Р. Каюмов, Т. Р. Шамсутдинов, Е. О. Михайлова, А. Р. Сабирова, А. А. Тойменцева, Н. JI. Рудакова [Текст] // Материалы докладов Съезда с международным участием «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, 2008. - С. 109.

Подписано в печать 20.02.09. Формат 60x84 1/16. Усл. печ. л. 1,5. Договор № 7 от 20.02.09. Тираж 100.

Лаборатория оперативной печати Казанского педагогического колледжа 420036, г. Казань, ул. Побежимова, 47а, тел. 571-14-29.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шамсутдинов, Талгат Рахимзянович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Сериновые протеиназы микрорганизмов

1. Принципы классификации протеолитических ферментов

2. Общая характеристика сериновых протеиназ

3. Химотрипсинопрдобные протеолитические ферменты бактерий

II. Глутамилэндопептидазы-особое семейство химотрипсинов

1. Физико-химические свойства глутамилэндопептидаз 18 микроорганизмов

2. Эволюционное биоразнообразие микробных глутамилэндопептидаз

3. Структурные особенности глутамилэндопептидаз бактерий

4. Механизм катализа глутамилэндопептидаз

5. Субстратная специфичность глутамилэндопептидаз

III. Регуляция биосинтеза глутамилэндопептидаз микроорганизмов

IV. Практическое применение глутамилэндопептидаз 42 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Штаммы и плазмиды

2. Выделение плазмидной ДНК

3. Электрофорез ДНК в агарозном геле

4. Трансформация клеток В. subtilis плазмидной ДНК

5. Питательные среды

6. Культивирование бактерий

7. Определение белка

8. Определение протеолитической активности фермента

9. Выделение и очистка протеиназы рекомбинантного штамма

10. Электрофорез в ПААГ

11. Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF)

12. Иммуноферментный анализ

13. Определение субстратной специфичности

14. Влияние ингибиторов на активность глутамилэндопептидазы

15. Физико-химические свойства и кинетические характеристики 63 глутамилэндопептидазы

16. Энзиматические свойства глутамилэндопептидазы

17. Математическая обработка результатов 64 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 66 1. Динамика роста и накопления глутамилэндопептидазы в 66 культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. subtilis

2. Подбор питательной среды для эффективной продукции 69 глутамилэндопептидазы В. intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом В. subtilis

3. Очистка глутамилэндопептидазы В. intermedins, секретируемой 74 рекомбинантным штаммом В. subtilis на разных фазах роста и молекулярная масса белка

4. Иммунологический анализ препаратов глутамилэндопептидазы 79 В. intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом В. subtilis на разных фазах роста

5. Масс-спектрометрический анализ препаратов

6. Электрофорез препаратов глутамилэндопептидазы В. intermedius 82 в нативных условиях

7. Влияние ингибиторов на активность препаратов 83 глутамилэндопептидазы В. intermedins

8. Субстратная специфичность фермента

9. Кинетические параметры глутамилэндопептидазы разных фаз 86 роста

10. рН-оптимум и рН-стабильность фермента

11. Температурный оптимум и температурная стабильность 87 фермента разных фаз роста

12. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность 92 глутамилэндопептидазы разных стадий роста

13. Влияние дитиоэритритола на активность 92 глутамилэндопептидазы разных фаз роста

14. Влияние парахлормеркурибензоата и солей ртути на активность 94 глутамилэндопептидазы разных фаз роста

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста"

Актуальность проблемы. Интерес к микробным ферментам и, в частности, к протеиназам бацилл, объясняется недостаточной способностью протеолитических белков животного и растительного происхождения удовлетворять спрос на жизненные потребности населения планеты. Микроорганизмы являются источником всех типов гидролаз благодаря широкому разнообразию, простоте культивирования, безопасности в работе, способности к генетическим преобразованиям. Использование ферментов имеет ряд преимуществ по сравнению с химическими веществами. Протеолитические белки микроорганизмов высокоактивны, доступны и легко биодеградируются. В последние годы наблюдается интенсивное развитие биотехнологического производства бактериальных ферментов, область применения которых — промышленность, медицина, научные исследования.

Одной из наиболее интересных групп класса протеолитических ферментов являются сериновые протеиназы бацилл. Эти белки участвуют в адаптационных процессах в условиях стресса, спорообразовании и прорастании спор. Неослабевающий интерес к этим ферментам обусловлен широтой их практического применения. Выход целевого продукта у бацилл может быть существенно повышен за счет направленного воздействия на условия роста, использования штаммов с нарушениями систем регуляции, либо модификацией гена. На основе протеиназ бацилл конструируются каталитические антитела с протеолитической активностью. Выделены протеиназы бацилл, обладающие фибринолитическими и тромболитическими свойствами. В связи с ростом числа заболеваний, связанных с тромбообразованием, актуальным является поиск новых ферментов с высокой активностью, специфичностью и низкой токсичностью. Одной из подгрупп сериновых протеиназ являются глутамилэндопептидазы, обладающие узкой субстратной специфичностью. Поэтому они являются высокоточными "инструментами" для фрагментации белковых молекул при исследовании первичной структуры.

Поскольку бациллы секретируют различные протеиназы, выделение индивидуальных белков контаминирует с белковыми примесями, которые создают аналитические ошибки при исследовании фермента. Генно-инженерные методы позволяют создавать рекомбинантные штаммы, содержащие на плазмиде ген индивидуального фермента, что перспективно для разработки способов получения гомогенных протеиназ.

Целью работы явилось выделение, очистка и сравнительная характеристика глутамилэндопептидазы В. intermedins, секретируемой рекомбинантным штаммом на разных фазах роста.

В работе решались следующие задачи:

1. Подбор условий культивирования для выделения глутамилэндопептидазы В. intermedins из рекомбинантного штамма В. subtilis на разных стадиях роста.

2. Выделение и очистка глутамилэндопептидазы В. intermedins из культуральной жидкости рекомбинантного штамма на разных стадиях роста.

3. MALDI-TOF анализ аминокислотных последовательностей глутамилэндопептидазы, соответствующей разным фазам роста.

4. Сравнительное исследование свойств глутамилэндопептидазы, соответствующей разным стадиям роста.

5. Выяснение роли дисульфидной связи в образовании конформеров глутамилэндопептидазы.

Научная новизна. Впервые выделена и охарактеризована глутамилэндопептидаза В. intermedins, секретируемая рекомбинантным штаммом В. subtilis на разных стадиях роста. Впервые проведена сравнительная характеристика свойств ранней и поздней глутамилэндопептидазы. Получены приоритетные данные о различии каталитических характеристик (Кт и kcat) ранней и поздней протеиназы. Установлено, что оба препарата идентичны по первичной структуре, их N- и

С-концевые аминокислотные остатки совпадают. Впервые получены данные, указывающие, что поздний фермент содержит восстановленную дисульфидную связь в отличие от ранней глутамилэндопептидазы. Сравнительные исследования позволили заключить, что наличие дисульфидной связи может определять велечину молекулярной активности глутамилэндопептидазы разных фаз роста.

Практическая значимость. Подобраны условия культивирования бактерий для эффективной продукции глутамилэндопептидазы В. intermedins на разных стадиях роста для проведения эффективной очистки фермента. Полученный в работе рекомбинантный штамм В. subtilis может быть использован как эффективный продуцент глутамилэндопептидазы. Результаты могут быть использованы при разработке стратегии синтеза ферментов промышленными штаммами бактерий. Получение гомогенных препаратов ферментов увеличивает арсенал белков, используемых в научных исследованиях и в практических целях. Результаты исследования свойств раннего и позднего фермента рекомбинантного штамма В. subtilis позволит расширить наши представления о сериновых протеиназах, в частности, об особой подгруппе ферментов - глутамилэндопептидазах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования: Работа выполнялась в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.02.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования . поддержаны грантами РФФИ 05-04-48182-а, Академии наук РТ № 03-3.5-20 и Аналитической Ведомственной Целевой Федеральной. Программы РНП 2.11.1005. Авторские исследования получили персональную поддержку Правительства Республики Татарстан (2007 г) и были удостоены именной стипендии президента Республики Татарстан.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработаны условия культивирования и получена глутамилэндопептидаза В. intermedins, соответствующая разным фазам роста рекомбинантного штамма.

2. Глутамилэндопептидаза, разных фаз роста характеризуется идентичной аминокислотной последовательностью, но отличается по каталитическим характеристикам и энзиматическим свойствам.

3. Дестабилизация глутамилэндопептидазы стадии позднего стационара по сравнению с соответствующим ферментом фазы замедления роста связана со статусом дисульфидной связи в белковой глобуле.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных, всероссийских и региональных конференциях: "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2005, 2006, 2007), школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005, 2006), Всероссийской научной конференции "Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение" (Казань, 2005), V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес» (Казань, 2005), Международной конференции аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», (Москва, 2005, 2006), Материалах XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» секция биология (Новосибирск, 2005), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), Материалах докладов съезда с международным участием «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов» (Новосибирск, 2008), Материалах XL VI международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 21 научных работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шамсутдинов, Талгат Рахимзянович

выводы

1. Подобраны компоненты питательной среды, для получения высокого уровня активности ранней (24 ч роста) и поздней (48 ч роста) глутамилэндопептидазы В. intermedins в культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. subtilis.

2. Выделена и очищена глутамилэндопептидаза В. intermedins, соответствующая фазе замедления роста и стационарной фазе роста рекомбинантного штамма, со степенью очистки, составляющей 1257 для ранней и 1350 - для поздней протеиназы и выходом 7.8% и 12.5%, соответственно. Молекулярная масса ранней и поздней глутамилэндопептидазы составляет 23 кДа.

3. Методом масс-спектрометрии установлено, что ранняя и поздняя глутамилэндопептидаза имеет идентичную последовательность аминокислот, N - и С- концы которой совпадают.

4. Установлены различия в каталитических свойствах глутамилэндопептидазы, секретируемой в фазе замедления роста и стационарной фазе бактерий.

5. Установлено, что уровень каталитической активности глутамилэндопептидазы, соответствующей разным стадиям роста бактерий, определяется статусом дисульфидной связи в конформации белка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шамсутдинов, Талгат Рахимзянович, Казань

1. Балабан, Н. П. Щелочная внеклеточная протеиназа Bacillus intermedins. Выделение, очистка и некоторые свойства фермента Текст. / Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, А.М, Усманова, Е.А. Ицкович, И.Б. Лещинская // Биохимия.- 1993. Т. 58. - №12. - С. 1923 - 1928.

2. Балабан, Н. П. Выделение и характеристика глутамилэндопептдазы 2 Bacillus intermedins Текст. / Н.П. Балабан, А.М Марданова, М.Р. Шарипова, и др. // Биохимия. 2003. - Т. 68. - № 11. - С. 1514 - 1521.

3. Безбородое, А. М. Секреция ферментов у микроорганизмов Текст. / A.M. Безбородов, Н.И. Астапович. М.: Наука, 1984. - С. 58.

4. Габдрахманова, JI. А. Среда для биосинтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedins рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / JI.A. Габдрахманова, Е.В. Шакиров, Н.П. Балабан и др. // Микробиология. -2000. Т. 69. - №5. - С. 653 - 659.

5. Демидюк, И.В. Особенности функциональной организации глутамилэндопептидаз Текст. / И.В. Демидюк, С.В. Костров // Мол. Биология. 1999. - Т.ЗЗ. - №2. - С. 100 - 105.

6. Дунаевский, Я. Е. Влияние состава среды на количественный и качественный состав внеклеточних протеиназ микромицетов Текст. / Я.Е. Дунаевский, Т.Н. Грубань, Г.А. Белякова и др. // Микробиология. -1999. Т. 68. - № 3. - С. 324 - 329.

7. Егоров, Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. -М.: Издательство МГУ, 1983.

8. Замолодчикова, Т.С. Граспазы-особая группа протеиназ семейства химотрипсинов, утративших дисульфидную связь в активном центре Текст. / Т.С. Замолодчикова, Е.А. Соколова, Е.В. Смирнова // Биохимия. 2003 - Т. 68. - №3. - С. 375 - 383.

9. Ицкович, Е. JI. Биосинтез щелочной внеклеточной протеиназы Bacillus intermedius Текст. / E.JT. Ицкович, JT.B. Знаменская, Н.П. Балабан, Т.А. Ершова, И.Б. Лещинская // Микробиология. 1995. - Т.64. - №.5. - С. 623 -629.

10. Каверзнева, Е. Д. Стандартный метод определения протеолитической активности комплексных препаратов протеаз Текст. / Е.Д. Каверзнева // Прикл. биохимия и микробиология. 1971. - Т. 7. - № 2. - С. 225 - 228.

11. Лениджер, А. Основы биохимии Текст. / А. Лениджер. М.: Мир, 1985.-С. 365.

12. Липкин, В.М. Первичная структура субъединицы ДНК - зависимой РНК - полимеразы Е. coli. II Пептиды, полученные при гидролизе протеазой из Staphylococcus aureus Текст. / В.М. Липкин, Н.Н.

13. Модянов, Ю.В. Смирнов, О.Ю. Чертов, B.C. Хохряков, В.В. Тюрин, Н.А. Потапенко // Биорг. химия. 1982. - Т. 8, №12. - С. 1620 - 1623.

14. Люблинская, JL А. Ферментативный синтез пептидных субстратов сериновых протеиназ Текст. / Люблинская Л.А., Воюшина Т.Л., Степанов В.М // Биоорганическая химия. 1982.- Т.8. - №.12. - С. 1620 -1624.

15. Люблинская, Л. А. П-нитроанилиды пироглутамилпептидов -хромогенные субстраты сериновых протеиназ Текст. /Л.А. Люблинская, И. Хайду, Г.Н. Баландина // Биоорг. химия. -1987. -Т. 13. -№ 6.-С.748 -753.

16. Мильготина, Е. И. Глутамилэндопептидазы. Структура, функции, практическое использование Текст. / Мильготина Е.И., Воюшина Т.Л., Честухина Г.Г // Биоорганическая химия. 2003.-Т.29. - №.6. - С. 563 -576.

17. Мосолова, О. В. Glu, Asp-специфичная протеиназа актиномицетов Текст. / О.В. Мосолова, Г.Н. Руденская, В.М. Степанов, О.М. Ходова, И.А. Цаплина // Биохимия. 1987. - Т.52. - №3. - С. 414 - 422.

18. Новикова, Т. М. Внеклеточная протеаза Bacillus alvei 5-724 Текст. / Т.М. Новикова, С.Н. Выборных, Н.С. Егоров // Прикладная биохимия и микробиология. 1986. - Т. 22. - № 6. - С. 772 - 777.

19. Перт, С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С.Д. Перт.-М.: Мир, 1980.-С. 331.

20. Ревина Л. П. Исследование действия Glu, Asp-специфичной протеиназы Streptomyces thermovulgaris на пептидные и белковые субстраты Текст. /

21. Л.П. Ревина, Н.В. Хайдарова, Г.Н. Руденская, Н.И. Гребенщиков, JI.A. Баратова, В.М. Степанов // Биохимия. 1989. - Т. 54. - №5. - С. 846 - 850.

22. Руденская, Г. Н. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов — новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ Текст. / Г.Н. Руденская // Биоорг. химия. 1998. - Т.24. - №4. - С.256 - 261.

23. Серкина, А. В. Структура и функции предшественников бактериальных протеиназ Текст. / А.В. Серкина, А.Б. Шевелев, Г.Г. Честухина // Биоорганическая химия. 2001. - Т. 27. - № 5. - С. 323 - 346.

24. Хайдарова, Н. В. Glu,Asp-специфичная протеиназа из Streptomyces thermovulgaris Текст. / Н.В. Хайдарова, Г.Н. Руденская, Л.П. Ревина, В.М. Степанов, Н.С. Егоров // Биохимия. -1989. Т.54. - №.1. - С. 46 - 52.

25. Шарипова, М.Р. Синтез и секреция фосфогидролаз и протеинзы Bacillus intermedius Текст. / М.Р. Шарипова, В.И. Вершинна, Н.П. Балабан, И.Б. Лещинская // Микробиология. 1987. - Т. 56. - №5. - С. 805 - 811.

26. Шлегель, Г. Общая микробиология Текст. / Г. Шлегель. М.: Мир, 1987. - С. 76-79.

27. Anagnostopolous, С. Requirements for transformation in Bacillus subtilis Text. / C. Anagostopolous, J. Spizizen // Journal of Bacteriology. 1961. -V. 81.-P. 741-746.

28. Banerjee, A. Induction of secretory acid proteinase in Candida albigans Text. / A. Banerjee, K. Ganesan, A. Datta // J. Gen. Microbiol. 1991. - V. 137.-P. 2455 -2461.

29. Barbosa, J. A. A structural model for the glutamate-specific endopeptidase from Streptomyces griseus that explains substrate specificity Text. / J.A. Barbosa, R.C. Garratt, J.W. Saldanha // FEBS Letters. 1993. - V.324. -№1. -P. 45 - 50.

30. Barrett, A. J. Perspectives in biochemistry and biophysics. Families and clans of serine peptidases Text. / A.J. Barrett, N.D. Rawlings //. Arch. Biochem. Biophys 1995. - V.318.- № 2. - P. 247 - 250.

31. Bordusa, F. Nonconventional amide bond formation catalysis: programming enzyme specificity with substrate mimetics Text. / F. Bordusa // Braz J.Med Biol. Res. 2000. - V. 33. - №5. - P. 469 - 485.

32. Breddam, K. Substrate preferences of glutamic acid-specific endopeptidases assessed by synthetic peptide substrutes based on intramolecular fluorecscence quenching Text. / K. Breddam, M. Mendal // Eur.J.Bioch. -1992.-V.206.-P. 103 107.

33. Brenner, S. The molecular evolution of genes and proteins: a tale of two serines Text. / S. Brenner // Nature. 1988. - V. 334. - P. 528 - 530.

34. Carmona, C. Nucleotide sequence of the serine protease gene of Staphylococcus aureus, strain V8 Text. / C. Carmona, G.L. Cray // Nucleic Acids Research 1987. - V. 15. - №16. - P. 6757.

35. Cerovsky, V. V8 proteinase-catalyzed peptide synthesis in hydrophilic organic solvents with low water content Text. / V. Cerovsky // Tetrahedron Lett. 1991.-V. 32.-P. 3421 -3424.

36. Coleman, G. A model for the regulation of bacterial extracellular enzyme and toxin biosynthesis Text. / G. Coleman, S. Brown, D.A. Stormonth // J. Theor. Biol. 1975.-V.52. -№1.-P. 143 - 148.

37. Czapinska, R. Structural and energetic determinants of the Sl-site specificity in serine proteases Text. / R. Czapinska, J. Otlewski // Eur.J.Bioch. 1999. -V.260.-P. 571 -595.

38. Drapeau, G. R. Purification and properties of an extracellular protease of Staphylococcus aureus Text. / G.R. Drapeau, Y. Boily, J.J. Houmard // J. Biol. Chem. 1972. -V.247. - №20.- P.6720 - 6726.

39. Drapeau, G. R. Cleavage at glutamic acid with staphylococcal protease Text. / G.R. Drapeau // Methods enzymol. 1977. - V.47. - P. 189 - 191.

40. Drapeau, G. R. The primary structure of staphylococcal protease Text. / G.R. Drapeau// Can.J.Biochem. 1978. - V.56. - №6. - P. 534 - 544.

41. Enzyme nomenclature 1992: recommendation of the Nomenclature Committee of The International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes // San Diego. -1992.-P. 862.

42. Errington, J. Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expressionand control of morphogenesia Text. / J. Errington // Microbiol. Rev. 1993. - V. 57. - P. 1 -33.

43. Fersht, A. Enzyme structure and mechanism Text. / A. Fersht, W.H. Freeman // San Francisco, CA. 1984.

44. Gudmundsdottir, A Atlantic cod trypsins: from basic research to practical applications Text. / A. Gudmundsdottir, H.M. Palsdottir // Marine Biotechnology. 2005. - V.7. - P. 77 - 88.

45. Haensler, M. Enzymatic formation of Glu-Xaa bonds using Glu/Asp-specific endopeptidase from Bacillus liheniformis + Text. / M. Haensler, H.D. Wissmann, N. Wehofsky // J.Peptide in frozen agueous systems Sci. 2000. -V.6.-P. 366-371.

46. Houmard, J. Staptylococcal protease: a proteolytic enzyme specific for glutamyl bonds Text. / J. Houmard, G.R. Drapeau // Proc Natl Acad Sci USA. 1972.-V. 69, №12.-P. 3506-3509.

47. Houmard, J. Kinetic investigation of the staphylococcal protease-catalyzed hydrolyzed of synthetic substrates Text. / J. Houmard // Eur.J.Biochem. -1976.-V. 68.-P. 621 -627.

48. Huang, Ph. L. Proteolytic fragments of anti HIV and anti-tumor proteins MAP30 and GAP31 are biologically active Text. / Ph. L. Huang, Y. Sun, H. Chen, H. Kung, P.L. Huang, S. Lee-Huang // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1999. - V. 262. - P. 615 - 623.

49. Krem, M. M. Molecular markers of serine protease evolution Text. / M.M. Krem, E. Di Cera// The EMBO J. -2001. -V. 20 № 12. - P. 3036-3045.

50. Laemmli, H. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4 Text. / H.K. Laemmli // Nature. 1970. - V. 227. -P. 680- 685.

51. Lesk, A. M. Conservation and variability in the structure of serine proteinases of the chymotrypsin family Text. / A.M Lesk, W.D. Fordman // J.Mol.Biol. -1996.-V.258.-P. 501 537.

52. Masaki, T. Purification and some properties of Achromobacter protease la from Achromobacter lyticus M497-1 Text. / T. Masaki, H. Suzuki, M. Soejima // Agric. Biol. Chem. 1986. - V.50. - №12. - P. 3087 - 3091.

53. Moravkova, J. Repression of the synthesis of exocellular and intracellular proteinases in Bacillus megaterium Text. / J.Moravkova, J. Chaloupka // Folia Microbiol. 1984,-V. 29.-P. 273 -281.

54. Murzin, A.G. Principles determining the structure of 3-sheet barrels in proteins: The observed structures [Text. / A.G. Murzin, A.M. Lesk, C. Chothia// J. Mol. Biol. 1994.-V. 236.-P. 1382- 1400

55. Nienaber, V.L. A glutamic acid specific serine protease utilizes a novel histidine triad in substrate binding Text. / V.L. Nienaber, К Breddam, J.J. Birktoft // Biochemistry. 1993. - V. 32. P. 11469 - 11475.

56. Ohara-Nemoto, Y. Characterization and molecular cloning of a glutamyl endopeptidase from Staphylococcus epidermidis Text. / Y. Ohara-Nemoto, Y. Ikeda, M. Kobayashi, M. Sasaki, S. Tajika, S. Kimura // Microb. Pathog. -2002.-V. 33.-№1.-P. 33-41.

57. Perego, M The oligopeptide transport system of Bacillus subtilis a role in the initiation of sporulation Text. / M. Perego, C.F. Higgins, S.R. Pearce, M.P. Gallagher, J.A. Hoch//Mol. Microbiol. 1991. -V. 5. - P. 173 - 185.

58. Power, S. Secretion and autoproteolytic maturation of subtilisin Text. / S. Power, R.M. Adams, J.A. Wells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V.83. -№5.-P. 3096-3100.

59. Rao, M. B. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases Text. / M.B. Rao, A.M. Tanksale, M.S. Ghatge et al. // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998. -V. 62. - № 3. - P: 597 - 635.

60. Rawlings N. D. Evolutionary families of peptidases Text. / N.D. Rawlings, A.J. Barrett // Biochem. J. 1993. - V. 290. - P. 205 - 218.

61. Rawlings, N. D. Introduction: clan SB containing the subtilisin family. In A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds), Handbook of Proteolytic Enzymes // San Diego: Academic Press, 1998. P. 284 - 288.

62. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual Text. / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

63. Schuster, M. Enzyme-catalyzed peptide synthesis in ice Text. / M. Schuster, A. Aaviksaar, H.-D. Jakubke // Tetrahedron. 1990. - V. 46. - №24. - P. 8093-8102.

64. Serrano, M. A Bacillus subtilis secreted protein with a role in endospore coat assembly and function Text. / M.A. Serrano, R. Ziehao, P. Ricca et al. // J. Bacteriol. 1999. -V. 181. - P. 3632 - 3643.

65. Siezen, R.J. Homology modelling and protein engineering strategy of subtilases, the family of subtilisin- like serine proteases Text. / R.J. Siezen, W.M. de Vos, J.A.M. Leunissen, B.W. Dijkstra // Protein Eng. 1991. - V. 4. -P. 719-737.

66. Siezen, R. J. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like proteases Text. / R.J. Siezen, J.A. Leunissen // Prot. Sci. 1997. - V. 6. - P. 501 - 523.

67. Stennicke, H. R. Characterization of the SI binding site of the glutamic acid-specific protease from Streptomyces griseus Text. / H.R. Stennicke, J.J. Birktoft, K. Breddam // Protein Science. 1996. - V. 78. - P. 2266 - 2275.

68. Svendsen, I. The primery structure of the glutamic acid-specific protease of Streptomyces griseus Text. / I. Svendsen, M.R. Jensen, K. Breddam // FEBS Letters. 1991.-V. 292.-№ 1,2.-P. 165 - 167

69. Svendsen, I. Isolation and amino acid sequence of a glutamic acid specific endopeptidase from Bacillus licheniformis Text. /1. Svendsen, K. Breddam // Eur.J.Biochem. 1992. - V. 204. - P. 165 - 171.

70. Taguchi, S. The complete amino acid substitutions at position 131 that are positively involved in cold adaptation of subtilisin BPN Text. / S. Taguchi, S. Komada, H. Momose // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 66. - № 4. -P. 1410- 1415.

71. Vlakhov, S. Induction of elastase biosynthesis in Streptomyces sp. 82 Text. / S. Vlakhov, P. Dalev, P. Kabadzhova et al. // Antibiotiki i khimioterapia. -1996.-V. 292.-№ 1-2.-P. 165 167.

72. Yokoi, K. Genetic and biochemical characterization of glutamyl endopeptidase of Staphylococcus warneri Text. / K. Yokoi, M. Kakikawa, H. Kimoto, K. Watanabe, H. Yasukawa, A. Yamakawa, A. Taketo, K-I. Kodaira. // Gene. 2001. - V. 281. - P. 115 - 122.