Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius 3-19. Биосинтез, выделение, характеристика, кристаллизация

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius 3-19. Биосинтез, выделение, характеристика, кристаллизация"

На правах рукописи

ргк од

J 7 мюл ?,1ПП

ШАКИРОВ ЕВГЕНИЙ ВИТАЛЬЕВИЧ

ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗА Bacillus intermedius 3-19. БИОСИНТЕЗ, ВЫДЕЛЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА, КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ - 2000

Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственной: университета им. В.И.Ульянова-Ленина и в лаборатории Химии бслк; Химического факультета Московского государственного университета им М.В.Ломоносова

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Г.Н.Руденская (МГУ, Москва) доктор биологических наук, академик АН Татарстана, профессор И.Б. Лещинская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник Г.И.Эль-Регистан

(Институт микробиологии РАН, Москва) доктор биологических наук, профессор В.И.Чиков Ведущая организация: Научно-исследовательский ветеринарньп

институт (НИВИ), г. Казань

31 и^ал

2000 г.

Защита диссертации состоится_

в часов на заседании диссертационного совета К 053.29.19 пр]

Казанском государственном университете им.В.И.Ульянова-Ленина, 420008 г.Казань, ул.Кремлевская, 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанской государственного университета

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

2000 г.

Л

А.Н. Аскарова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Белки - основные «рабочие» единицы клетки, осуществляющие множество различных реакций и процессов и являющиеся неотъемлемой частью структуры самой клетки. Синтез и само существование белков, как и любых других составляющих клеток, подвергается строжайшему контролю и регуляции со стороны факторов, ответственных за развитие клетки. Старые, поврежденные или избыточные белковые молекулы должны быть разрушены для того, чтобы клетка смогла развиваться дальше. Этот процесс -быстрое и селективное расщепление химически устойчивой пептидной связи в белках - решается с помощью протеолитических ферментов - протеиназ -уникальных биологических катализаторов, в миллиарды раз ускоряющих реакцию гидролиза белков. Энергия, необходимая для расщепления пептидной связи в белках в нейтральной водной среде при комнатной температуре, настолько велика, что спонтанный гидролиз во многих случаях не происходит даже при инкубации в течение нескольких месяцев. Однако, при температуре 37 0 и нейтральном рН одна молекула протеиназы способна вызвать протеолиз 100 пептидных связей в секунду.

Протеолитические ферменты выполняют в клетке ряд жизненно важных функций. Кроме участия в деструктивных катаболических процессах протеолитические ферменты функционируют на этапе посттрансляционного процессинга белков, участвуют в клеточной дифференцировке , в том числе у прокариот, в таком важном с общебиологических позиций процессе, как переход вегетативных клеток к спорообразованию, то есть в анабиотическое состояние. Они осуществляют селективный протеолиз белков, связанный с изменением метаболизма.

Протеолитические ферменты широко используются в молекулярной биологии в качестве инструментов для изучения первичной структуры белков и пептидов; с другой стороны, сами протеазы являются удобными объектами для изучения механизмов функционирования белков (ВгесИат К. й а1., 1992).

Протеолитические ферменты применяются в производстве моющих средств, кожевенной и пищевой промышленности. Они также нашли широкое применение во многих областях медицины, их используют для лечения опасных ожоговых поражений, для ускорения заживления ран, восстановления повреждений после переломов и травм (Сахаров И.Ю. и др., 1993), при защите организма от вирусных инфекций и роста раковых клеток (Оёаке Б е1 а1., 1991).

Род Bacillus - это непатогенные микроорганизмы, являющиеся легк< культивируемыми продуцентами многих внеклеточных ферментов и поэтом; представляющие собой один из наиболее удобных объектов для получеши протеолитических ферментов и изучения их свойств (Харвуд К., 1992).

Нами было установлено, что бактерии Bacillus intermedins наряду с другим! гидролазами (ферменты, расщепляющие связи в биологических молекулах рибонуклеаза, фосфатаза) секретируют несколько сериновых протеиназ, одна и: которых по предварительным данным относится к группе глутамилэндопептидаз ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные карбоксильным! группами глутаминовой и аспарагиновой кислот. Представлялось интересны» выделить и охарактеризовать этот фермент, который расширяет наш представления о глутамилэндопептидазах класса сериновых протеиназ рассматривающиеся как отдельная эволюционная ветвь с кардинальны» изменением специфичности действия.

Цели и задачи исследования. Данная работа проведена с цельн характеристики нового фермента - внеклеточной глутамилэндопептидазы Bacillu, intermedius 3-19, включая изучение физико-химических и энзиматических свойст] и получения кристаллов протеиназы для проведения рентгеноструктурноп анализа молекулы белка, а также определения условий, оптимальных для синтез; этого фермента.

В соответствии с поставленной целью были определены следующи экспериментальные задачи:

1. Оптимизация состава питательной среды для получени максимальной продукции глутамилэндопептидазы.

2. Выделение и очистка глутамилэндопептидазы из культурально; жидкости В. intermedius ; получение гомогенного препарата фермента.

3. Изучение основных физико-химических и энзиматических свойст протеиназы.

4. Выращивание и предварительный анализ кристаллов дл рентгеноструктурного изучения белка.

Научная новизна работы. Впервые обнаружена внеклеточна глутамилэндопептидаза В.intermedius. Определены оптимальные условия дл продукции протеиназы. Разработан эффективный лабораторный метод получени гомогенного препарата глутамилэндопептидазы, основанный н высокоэффективной жидкостной хроматографии. Определены физико-химически

характеристики и энзиматические свойства фермента. Впервые в отечественной науке получены кристаллы глутамилэндопептидазы B.intermedius, позволяющие проводить рентгеновские исследования структуры этого белка. Полученные результаты дают возможность пополнить новым, ранее неизученным бациллярным ферментом группу глутамилэндопептидаз, входящих в семейство химотрипсина класса сериновых протеиназ.

Практическая ценность работы. Оптимизированы условия биосинтеза глутамилэндопептидазы. Разработан метод очистки фермента, с помощью которого можно получить 2-3 мг гомогенного белка из 1 л культуральной жидкости.

Нами показано, что выделенная и охарактеризованная протеиназа относится к группе глутамилэндопептидаз, специфичность действия которых целиком определяется присутствием в субстрате отрицательно заряженных боковых цепей глутаминовой и аспарагиновой кислот. Уникальные свойства этого фермента делают возможным его использование в качестве инструмента для изучения первичной структуры белков и удобной модели для конструирования протеиназ с модифицированными свойствами.

Полученные впервые в России кристаллы глутамилэндопептидазы B.intermedius позволили провести рентгеновские исследования структуры этого белка с целью выяснения уникального механизма субстратной специфичности фермента.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на VIII Европейском конгрессе по биотехнологии (Будапешт, Венгрия, 1997), VI Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 1997), VII Конференции по промышленному использованию ферментов (Барселона, Испания, 1997), 17 Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Сан-Франциско, США, 1997), П съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), VII Международной конференции по кристаллизации биологических макромолекул (Гранада, Испания, 1998), 13 Симпозиуме по белкам (Бостон, США, 1999).

Публикации. Опубликовано 17 работ по материалам диссертации.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста; состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований, обсуждения

результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 10 таблиц, 2 рисунка. Список литературы включает 145 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования использовали стрептомицинустойчивы штамм Bacillus intermedins 3-19 (В-3833, Всесоюзная коллекция промышленны микроорганизмов), выделенный из дикого штамма Bacillus intermedius 7. (коллекция кафедры микробиологии Казанского государственного университет; путем естественного рассева на среде со стрептомицином в концентрации 50 мкг/мл. Штамм В.intermedius 3-19 был отобран среди други антибиотикоустойчивых штаммов В.intermedius по признаку максимально протеолитической активности.

Для культивирования клеток В. intermedius в качестве исходной использовал среду без глюкозы следующего состава (г/л): пептон - 20; СаСЬ х2Н20 - 0,1 MgS04 х 7Н20 - 0,3; NaCI - 3,0; MnS04 - 0,1; pH - 8,5 (Лещинская И.Б. и др., 1981)

Прирост биомассы измеряли нефелометрически на КФК-2 при длине волш 590 нм. Продуктивность культуры (П) в отношении синтеза протеиназ: определяли как отношение величины протеолитической активности культуральной жидкости к величине биомассы и выражали в условных единица или процентах относительно контроля. Белок определяли спектрофотометричесга считая, что концентрация белка 1 мг/мл соответствует А28о = 1 оптическо единице (оп.ед.) в кювете толщиной 1 см. Протеолитическую активное! определяли по казеину (Каверзнева Е.Д., 1971) и по синтетическому хромогенном субстрату (Мосолова О.В., и др., 1987).

Для выделения и очистки глутамилэндопептидазы использовал ионообменную хроматографию на КМ-целлюлозе и высокоэффективну] жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).

Степень чистоты препарата и молекулярную массу фермента определял электрофорезом в 12,5%-ном ПААГ в присутствии 0,1% DS-Na по метол Лаэммли (Laemmli Н.К., 1970).

Изоэлектрическую точку фермента определяли хроматофокусированис (Sluyterman L. et al., 1978) на Увикорде («ISCO»), используя колонку с гелем PBI 94 («Pharmacia», Швеция).

При изучении влияния специфических ингибиторов на активное! глутамилэндопептидазы использовали DFP, PMSF, TLCK, ЭДТА, Hg(CH3COO]

бензамидин «Sigma» (Германия) в соотношении фермент:ингибитор = 1:100. Белковые ингибиторы использовали в молярном соотношении 1:10.

Субстратную специфичность фермента изучали по действию на синтетические субстраты H-Arg-Lys-Glu-Val-Tyr-OH и H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH и по расщеплению А и В цепей окисленного инсулина и глюкагона.

Для определения аминокислотного состава фермент гидролизовали 5,7 н HCl при 105° в вакуумированных ампулах в течение 48 ч и гидролизат анализировали на аминокислотном анализаторе Hitachi 835 (Япония). Остатки полуцистина и метионина определяли после их окисления надмуравьиной кислотой, триптофан -после гидролиза белка метансульфоновой кислотой в присутствии 0,2%-ного триптамина. N-концевую последовательность глутамилэндопептидазы определяли по методу Эдмана в образцах, полученных после дополнительной очистки хроматографией на колонке (4,6x100 мм) Aquapore («Applied Biosystems», USA) в градиенте концентрации (15-60%) ацетонитрила с 0,1% трифлуороацетовой кислотой в течение 40 мин с помощью HPLC. Белок затем иммобилизовали на мембранах Immobilon Р и секвенировали на приборе Knauer-816 («Applied Biosystem» 120 A PIH, Analyzer One Line, USA).

Кристаллизацию глутамилэндопептидазы проводили методом диффузии паров растворителя в «висячей капле» при комнатной температуре. Объем капли белкового раствора равнялся 2,5-10 мкл. Концентрация белка в капле составляла 615 мг/мл, фосфата калия-0,4-0,8 М , 2-метилпентандиола-2,4 - 3%. Через 5-7 дней вырастали небольшие тонкие пластины (0,05-0,1 мм). Их промывали 1,15 М раствором фосфата калия, pH 7,0 для активации поверхности и помещали в раствор для разращивания (1,2 М фосфат калия, pH 7,0, содержащий 0,6% белка). При выдерживании в этом растворе кристаллы достигали максимального размера за три-четыре дня. Набор дифракционных данных был собран до разрешения 1,7 А на автоматическом синхротроне (EMBL Hamburg Station).

Для анализа цифрового материала экспериментов исследования проводили математическую обработку результатов (Плохинский H.A., 1978).

Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении а < 10%. В качестве критерия достоверности разности использовали критерий Стьюдента, принимая Р á 0,05 за достаточный уровень значимости.

Наряду с традиционным изучением влияния отдельных факторов использовали многофакторные эксперименты. Обработка результатов эксперимента проводилась с помощью комплекса компьютерных программ

s

«ВЮРТ», включающего программы обработки результатов многофакторных экспериментов (Краснов С.И. и др., 1992).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Отбор активных штаммов и исследование состава питательной среды для обеспечения высокой продукции глутамилэпдопептидазы B.intermedius 3-19

Среди 16 антибиотикоустойчивых штаммов Bacillus intermedius был отобран стрептомицинустойчивый штамм Bacillus intermedius 3-19 по принципу максимальной активности по хромогенному субстрату Z-Glu-pNA, который и использовали в дальнейшей работе.

Динамика роста культуры и биосинтеза фермента на исходной среде (Лещинская И.Б.,1981) представлена на рис.1. Согласно модели Колемана, синтез катаболических ферментов микроорганизмов представляет собой двухфазный процесс, при котором максимальный синтез ряда ферментов наступает в период замедления или полного прекращения роста культуры (Coleman G. et al., 1975). Глутамилэндопептидаза B.intermedius появляется в культуральной жидкости в стадии замедления роста культуры, активность фермента достигает максимума в стационарной фазе на 18-й час роста. Таким образом, глутамилэндопептидаза B.intermedius относится к ферментам второй фазы, синтез которых осуществляется в фазе замедления роста.

Ой А

2

15

30 -25 -20 -

1 3 5 7 9 И 13 15 17 19 21 23

часы

Рис.1 Динамика роста и биосинтеза глутамилэндопептидазы B.intermedius 1 - биомасса, опт. ед., 2 - активность, мкМ/мл

Согласно данным литературы биосинтез ряда микробных протеиназ подавляется глюкозой. Исследование влияния глюкозы и других легкометаболизируемых источников углерода на биосинтез глутамилэндопептидазы показало, что присутствие в среде минимальной концентрации глюкозы или мальтозы (0,5%) вызывало снижение продуктивности бактерий на 50% (рис.2). Увеличение концентрации глюкозы приводило к значительному снижению продуктивности культуры. Присутствие в среде галактозы, лактозы и сахарозы также приводило к снижению биосинтеза протеиназы, но в меньшей степени. Аналогичные результаты были получены для тиолзависимой сериновой протеиназы B.intermedius 3-19 (Ицкович Е.Л. и др., 1995) и протеазы Streptomyces sp G-157 (Sampath P. et al., 1998). Таким образом, подобно синтезу других протеиназ, синтез глутамилэндопептидазы B.intermedius подавляется легкометаболизируемыми источниками углерода, по-видимому, по типу катаболитной репрессии.

120

П,%

100 80 60 40 20 0

0 0,5 1 2

Углеводы, %

Рис.2 Влияние углеводов на биосинтез глутамилэндопептидазы B.intermedius 1-глюкоза, 2-галактоза, 3-лактоза, 4-мальтоза, 5-сахароза Было исследовано влияние различных типов пептона и их концентраций, а гакже неорганического фосфата на биосинтез глутамилэндопептидазы B.intermedius. Исследование проводили с применением метода математического планирования эксперимента по плану В2 (Максимов В.Н., 1980), где концентрации двух факторов - пептона (XI) и неорганического фосфата (Х2) - варьировались на

трех уровнях (табл.1). С помощью программы "ВЮРТ" получены уравнени регрессии, по которым были рассчитаны оптимальные концентрации пептона ] неорганического фосфора - 20 г/л и 0,2 г/л соответственно, которые I использовались для достижения максимального выхода фермента. И исследуемых пептонов был отобран пептон растительного происхождени производства Тбилисского завода, так как активность протеиназы на среде с ни? была в 2 раза выше, чем на средах с другими.

Одним из путей регуляции биосинтеза внеклеточных ферментов являете регуляция конечным продуктом, которым для глутамилэндопептидазы могу служить аминокислоты. Присутствие в среде индивидуальных аминокислот, ка правило, ингибирует синтез протеиназ. Мы исследовали влияние ряд индивидуальных аминокислот, а также комплекса аминокислот (казаминовы кислоты) на биосинтез глутамилэндопептидазы В.ШегтесИш. Добавление питательную среду, содержащую пептон, индивидуальных аминокислот в той ил] иной степени подавляет биосинтез глутамилэндопептидазы ВлМегтесИш Внесение казаминовых кислот в среду культивирования подавляет рост бактерий 2 раза, активность же снижается незначительно.

Таблица

Оптимизация состава питательной среды по плану В2 для биосинтеза протеиназы В. ШегтесНиз 3-19 на пептоне растительного происхождения

Уровни факторов Биомасса, опт.ед. Активность, мкМ/мл Продуктивное усл.ед

Пептон Фн

XI г/л Х2 г/л

+ 30 + 0,3 14,0 10,7 0,76

- 10 + 0,3 5,5 9,0 1,64

+ 30 - 0,1 12,5 11,5 0,92

- 10 - 0,1 5,9 14,6 2,47

+ 30 0 0,2 13,9 12,0 0,86

- 10 0 0,2 5,3 12,8 2,42

0 20 + 0,3 12,0 23,8 1,98

0 20 - 0,1 10,9 22,2 2,04

Полученные данные позволяют предположить наличие чувствительности синтеза внеклеточной глутамилэндопептидазы к азотметаболитной репрессии. Похожий эффект был получен для других внеклеточных протеиназ (Колев Д.А., 1986, Ицкович Е.Л. и др., 1995).

Казаминовые кислоты при культивировании микроорганизмов могут служить источником одновременно и углерода и азота. При исследовании влияния казаминовых кислот в качестве единственного источника углерода и азота на рост бактерий и синтез фермента было показано, что урожай клеток понижается в 3,5 раза по сравнению с контрольной средой, а активность снижается на 15-20% в зависимости от концентрации казаминовых кислот. Похожий эффект был получен для тиолзависимой сериновой протеиназы В.intermedins 3-19 (Ицкович Е.Л. и др., 1995), для кислой протеиназы Candida albicans (Banerjee A. et al., 1991), для протеиназ B.megaterium (Morovcova J. et al., 1984). При добавлении в питательную среду дрожжевого экстракта увеличивался урожай клеток и активность фермента, однако продуктивность культуры не увеличивалась. Ионы аммония, внесенные в среду в виде соли NH4CI стимулируют синтез фермента на 15% по сравнению с контролем.

Для каталитической активности протеиназ важную роль играют ионы двухвалентных металлов. Известно, что ионы Са 2+ стабилизируют молекулу глутамилэндопептидазы, при этом повышается активность фермента (Руденская Г.Н., 1998, Мосолова О.И. и др., 1987). Мы провели изучение влияния ионов ряда двухвалентных металлов на накопление глутамилэндопептидазы в культуралыюй •кидкости В.intermedins (рис.3). Из рисунка видно, что наличие в среде ионов Mg2+ 1 концентрации 2 мМ и ионов Са2+ в концентрации 5 мМ является оптимальным тля биосинтеза глутамилэндопептидазы. Присутствие в среде ионов Со 2+ в сонцентрации 3 мМ увеличивало продуктивность в 2,5 раза. Однако, при этом тблюдалось сильное ингибирующее действие на рост микроорганизмов оптическая плотность уменьшалась в 4 раза), активность же фермента гееличивалась незначительно, в связи с чем ионы кобальта не вводились в среду сультивирования. При исследовании локализации глутамилэндопептидазы в слетках и культуральной жидкости B.intermedius было показано, что фермент )бнаруживается на мембране и что соли кобальта, вероятно, влияют на процесс ассоциации фермента с мембраны, способствуя выходу мембраносвязанного >елка в среду с образованием внеклеточного фермента (Шарипова М.Р. и др., ЮОО).

Ионы металлов, мМ

Рис.3. Влияние ионов двухвалентных металлов на биосинте: глутамилэндопептидазы В. ШегтесИш

1 - ионы кобальта; 2 - ионы кальция; 3 — ионы марганца; 4 - ионь магния; 5 - ионы меди; 6 - ионы железа; 7 - ионы цинка. За 100% принята продуктивность культуры без ионов металлов а <• 10%

Таким образом, проведенные исследования позволяют отметить, что регуляцш биосинтеза глутамилэндопептидазы В.intermedins осуществляется аналогично регуляции синтеза других протеиназ, а именно, подавляется легкометаболизируемыми источниками углерода по типу катаболитной репрессии и комплексом аминокислот по типу репрессии синтеза фермента конечным продуктом, однако имеются некоторые особенности, например, увеличение продукции глутамилэндопептидазы в присутствии ионов кобальта в среде.

2. Выделение и очистка глутамилэндопептидазы B.intermedius

Для характеристики глутамилэндопептидазы B.intermedius необходимо иметь фермент в гомогенном состоянии. Нами разработан метод выделения и очистки глутамилэндопептидазы из культуральной жидкости B.intermedius с помощью

ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе и высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке МопоБ. На рис.4 представлены результаты хроматографии, включающие 3 белковых пика: белки первого пика элюировались при ионной силе 40 мМ №С1, второго - при 55 мМ ЫаС1, третьего - при 70 мМ №С1. С помощью набора хромогенных субстратов установлено, что второй белковый пик представляет собой глутамилэндопептидазу, расщепляющую субстрат 2-С1и-рМА. Из 2 л культуральной жидкости получено 5 мг гомогенного белка со степенью очистки 770 и выходом 12% (табл.2). Все дальнейшие исследования были проведены с этой протеиназой.

А280 №С1, М

Рис.4. Хроматография глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius на колонке

MonoS

I - А280', II - градиент NaCl (0-0,5М) в 15 мМ Na-ацетатном буфере, pH

6,3, содержащем 0,5 мМ СаСЬ-

1 - протеиназа, активная на субстрате Glp-Ala-AIa-Leu-pNA,

2 - протеиназа, активная на субстрате Z-Glu-pNA,

3 - протеиназа, активная на субстрате Z-Ala-Ala-Leu-pNA

3. Характеристика глутамилэндопептидазы B.intermedius

Чистоту полученного препарата глутамилэндопептидазы определяли с помощью электрофореза в ПААГ, который показал наличие одного полипептида с молекулярной массой 29 кДа. Гомогенность препарата глутамилэндопептидазы подтверждается также обнаружением единственной N-концевой аминокислотной последовательности при секвенировании по Эдману. Изоэлектрическая точка

равна 8,4 (рис.5). Константа Михаэлиса глутамилэндопептидазы В.ШегтесИш н; субстрате г-СЬ-рИА Кт=6 мМ.

В таблице 3 представлены некоторые энзиматические свойств; глутамилэндопептидазы В.ШегтесИш в сравнении с другими протеиназами тоге же семейства, выделенных из разных источников.

Таблица 2

Выделение глутамилэндопептидазы из культуральной жидкости Bacillus intermedins

Стадии очистки Объем, мл Общий белок, сп.ед. Общая активность, мкМ Уд. акт., ед/мг Вых

1. Культуральная жидкость 2000 32000 50 0.0016 10

2. Хроматография на на КМ-целлюлозе 71 71 17 0.24 3<

3. Рехроматография на КМ-целлюлозе 9.5 32.3 8.5 0.26 г

4. Хроматография на колонке MonoS 7.6 4.8 5.92 1.23 11

Прогеиназа В.intermedins имеет один рН-оптимум на субстрате Z-Glu-pN/ (рН 8,0) и два рН-оптимума на белковом субстрате (рН 7,5 и 9,0), как и протеиназь Actinomyces sp., Str.thermovulgaris и стафилококковые глутамилэндопептидазы Факт наличия двух рН-оптимумов пока не получил в литератур! удовлетворительного объяснения. Протеиназа относительно стабильна в широки; пределах рН от 6,5 до 10,0 в течение 3 час при 22 0 (рис.6). Наличие в реакционно! смеси 5 мМ Са 2+ повышает стабильность фермента, несколько увеличивая ег< активность. Такую же рН-стабильность показывают почти все известные н; настоящий момент глутамилэндопептидазы.

Температурный оптимум, определенный в трис-HCI буфере, рН 8,0, ] отсутствие ионов Са2+, равен 55 В присутствии ионов Са2+ температурньп оптимум смещается к 65 0 с возрастанием активности почти в 2 раза, чт< подтверждает стабилизирующую роль ионов Са2+ (рис.7). При 70 0 фермент теряе' около 50% активности.

Таблица 3

Сравнительная характеристика глутамилэндопептидаз микроорганизмов

Протеиназа Мол. масса, KDa Pi рН-оптимум активности Интервал стабильности рН Температурный оптимум,0 Кт, мМ

Пептидный субстрат казеин

B.intermedius 29 8.4 8.0 7.5; 9.0 6.5-10 55; 65 (Са2+) 6.0

Str.thermovul-garis 26 6.7 6.5 6.5; 8.0 6.0-10 55 1.25

Actinomyces sp. 25 5.7 8.5 6.0; 9.0 6.0-10 55 1.1

S. aureus 92 гн 25 4.5 8.2 4.6; 8.0 5.0-10 40-45 10.0

S. aureus V8 26.5 4.5 - 4.0; 7.8 3.5-.9.5 45 28.4

B.licheniformis 23.567 4.8 8.0 - 4.0-10 51 (Са2') 1.8

Str.griseus 18.336 8.4 8.8 - 5.0-8.0 - -

Str.fradiae 18.702 8.2 8.2 - 4.5-9.0 -

B.subtilis 17-18 7.7 8.0 55 -

Thermoactino-myces sp. 23 - 8.5 8.5 5.0-11.0 55 -

* Для реакции гидролиза Z-Glu-pNA

Термостабильность фермента при рН 8,0 в присутствии 5 мМ Са2+ увеличивается только в диапазоне температур от 37 до 50 а затем происходит >езкая потеря активности (рис.8). Похожие свойства отмечены для некоторых фугих глутамилэндопептидаз (Мосолова О.В. и др., 1987, Хайдарова Н.В. и др., .989).

5 10 15 20 25 30 35 40

МЛ

Рис.5. Определение изоэлектрической точки В. ШегтесИш мето, хроматофокусирования на колонке РВЕ-94 в градиенте рН 9,4-7, 1 - А28о, 2 - градиент рН

Рис.6. рН-стабилыюсть глутамидэндопептидазы В. т!егтесИи$ при 22 ° 1 - 3 часа инкубации, 2-24 часа инкубации в отсутствии ионов С 3-24 часа инкубации в присутствии ионов Са~+

и © т,

Рис.7. Зависимость активности протеиназы В. ЫегтесИш от температуры

1 - активность в отсутствии ионов Са2+,

2 - активность в присутствии ионов Са2+

Рис.8. Термостабильность глутамилэндопептидазы В.ШегтесИш ■ 1 - активность в отсутствии ионов Са2+ 2 - активность' в присутствии ионов Са2+

Активность фермента полностью подавляется специфическим ингибиторо сериновых протеиназ - диизопропилфторфосфатом. Другие ингибитор сериновых протеиназ - химической и белковой природы - не оказывают влияш на активность фермента.

При изучении субстратной специфичности глутамилэндопептидаз B.intermedius было показано, что фермент практически полностью расщеплж синтетический субстрат H-Arg-Lys-Glu-Val-Tyr-OH по связи Glu-Val за 30 мину В таких же условиях фермент гидролизует только 5,6% субстрата H-Arg-Lys-As] Val-Tyr-OH по связи Asp-Val. Таким образом, фермент проявляет больш< предпочтение к связям, образованным глутаминовой кислотой, че аспарагиновой кислотой, что характерно для ферментов этой группы.

Специфичность фермента на природных олигопептидных субстрат; определяли по расщеплению А и В цепей окисленного инсулина, содержащих i два остатка глутаминовой кислоты, и глюкагона, имеющего в составе молекул три остатка аспарагиновой кислоты (рис.9). За 4 часа фермент практичеа полностью гидролизовал в А и В цепи окисленного инсулина все связ образованные глутаминовой кислотой и некоторые связи образованш цистеиновой кислотой, полученной в результате окисления цистеина. В молеку. глюкагона фермент расщеплял все связи по остаткам аспарагиновой кислот Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными (Svends I. et al., 1992, Niidome T. et al., 1990, YoshidaN. et al., 1988).

А-цепь инсулина

S03H S03H

В-цепь инсулина

S03H

S03H

1

1

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA

Глюкагон

HSGGTFTS D Y S К Y L D S RAQDFVQWLMNT

/sraqd!7

Рис.9. Гидролиз природных олигопептидных субстр

глутамилэндопептидаз ой Bacillus intermedius

Стрелками показаны гидролизуемые протеиназой пептидные связи

Определены аминокислотный состав и N-концевая последовательность глутамилэндопептидазы B.intermedius. Сравнительный анализ аминокислотного состава глутамилэндопептидазы B.intermedius и других протеиназ этого семейства ферментов показывает, что цистеин отсутствует только у стафилококковой протеиназы, у остальных протеиназ независимо от источника выделения имеется по 4 остатка полуцистина, и 2 остатка - у протеиназы B.intermedius. Фермент содержит в своем составе до 20% (от всего количества аминокислотных остатков) цикарбоновых кислот, что значительно меньше, чем в молекуле протеиназы St.aureus V8 (33%). Эта разница находит свое отражение в величине изоэлектрических точек ферментов: pi 8,4 и 4,5 соответственно.

N-концевая последовательность глутамилэндопептидазы B.intermedius на протяжении 30 аминокислот имеет 45% идентичных остатков при сравнении с •лутамилэндопептидазой, выделенной из B.licheniformis (Svendsen I. et al., 1992, iakudo S. et al., 1992). Столь значительный процент совпадений позволяет федположить, что глутамилэндопептидазы этих двух видов бацилл гомологичны j имеют однотипную укладку полипептидной цепи в пространстве. Высокий фовень совпадений наблюдается при сравнении с N-концевой юследовательностью на протяжении 20 аминокислот для глутамилэндопептидазы l.subtilis (40%). Гораздо меньше совпадений при сравнении с N-концевыми юследовательностями ферментов из стрептомицетов, а число совпадающих >статков при сравнении с протеиназой St.aureus V8 слишком мало для суждения )б их гомологии (рис.10).

Таким образом, по физико-химическим и энзиматическим свойствам, по :убстратной специфичности, по влиянию ингибиторов на активность протеиназа l.intermedius относится к группе глутамилэндопептидаз, специфичность действия готорых целиком определяется присутствием в субстрате отрицательно аряженных боковых цепей глутаминовой или аспарагиновой кислот (КФ ¡.4.21.19).

4. Выращивание и предварительный анализ кристаллов глутамилэндопептидазы B.intermedius

В настоящее время неизвестен молекулярный механизм, обеспечивающий 1ысокую специфичность действия глутамилэндопептидаз по отношению к минокислотным остаткам с отрицательно заряженными боковыми цепями,

поскольку неизвестен компенсатор отрицательного заряда субстрата. Д; выяснения молекулярного механизма действия таких ферментов необходимы

10

Bacillus intermedius V W: г % m Щ G tetó A T R

Bacillus licheniformis s i Ш f s D Щ R Щ i;;' ¡f T ж T

Bacillus subtilis s i Щ ip T E fep R I S S é T

Staphylococcus aureus V8 - & й L p N N D R ti Q I T D T

Actinomyces species s р i: T V Y A N Щ Y Y G F

Streptomyces thermovulgaris s D fe. T N T G WM I N A D T

Streptomyces griseus tá А É G A I Y G G G S R с

Streptomyces fradiae У L к G G А I Y G G G S R с

25

30

Bacillus intermedius X X X X Ir! T F G — a Ш —

Bacillus licheniformis A I V н щ s S S I Q —

Bacillus subtilis —

Staphylococcus aureus V8 A P V I Y I Q V E A P T

Actinomyces species G I A

Streptomyces thermovulgaris D I

Streptomyces griseus V T К N G V R Y F L T

Streptomyces jradiae V T К G G A R Y F V T

2

Рис.10. N-концевые последовательности глутамилэндопептидаз знания пространственной структуры белка. Одним из основных способ' определения структуры белка в настоящее время является кристаллограф! Получение кристаллов глутамилэндопептидаз представляет трудную зада1 Например, до сих пор не удалось получить подходящие для рештеноструктурно исследования кристаллы для давно известной протеиназы St.aureus V8. Bi разработан метод получения кристаллов глутамилэндопептидазы B.intermedi\ размеры и форма которых оказались пригодными для проведения рентгеновско исследования, а также проведен рентгеновский анализ этих кристаллов, котор! показал, что кристаллы принадлежат к пространственной группе С2 и име!

о о

следующие параметры элементарной ячейки: а=61,62Л, в=60,4А,с=60,40

Р=117,6°. Набор дифракционных данных был собран до разрешения 1,68А. настоящее время благодаря полученным нами кристаллам в институ Кристаллографии РАН проведен полный рентгеноструктурный airan глутамилэндопептидазы B.intermedius (результаты обрабатываются). Можно

ольшой вероятностью предположить, что с помощью установленной ространственной структуры фермента будет раскрыт уникальный механизм ействия глутамилэндопептидаз, позволяющий в значительной степени сдвигать Ка имидазольного кольца гистидина. Реализация этого механизма, вероятно, существляется различными способами в ферментах различного происхождения, то может служить отражением степени филогенетического родства этих белков и х продуцентов.

ВЫВОДЫ

1. Подобран состав питательной среды, обеспечивающий максимальный ровень активности глутамилэндопептидазы в культуральной жидкости \intermedius 3-19. При этом установлено, что синтез глутамилэндопептидазы нгибируется глюкозой и смесью аминокислот, активируется ионами кальция, [агния и аммония.

2. Разработан метод выделения и очистки глутамилэндопептидазы из ультуральной жидкости B.intermedius с помощью ионообменной хроматографии а колонках КМЦ и МопоБ в режиме ВЭЖХ и получен гомогенный препарат >ермента с выходом 12%.

3. Впервые охарактеризована глутамилэндопептидаза B.intermedius, которая :меет молекулярную массу 29 ГОа и изоэлектрическую точку 8,4. Обнаружены два Н-оптимума на природном субстрате : при рН 7,5 и рН 9,0, на синтетическом убстрате - при рН 8,0. Температурный оптимум действия фермента 55 °С.

4. Установлено, что макромолекула глутамилэндопептидазы содержит два статка полуцистина; показана 45%-ная гомология И-концевой юследовательности протеиназы с известными глутамилэндопептидазами бацилл.

5. Анализ действия ингибиторов и субстратной специфичности показал, что ¡ермент атакует только связи, образованные дикарбоновьми кислотами, что :озволило отнести его к глутамилэндопептидазам семейства химотрипсина с ардинальным изменением специфичности действия (КФ 3.4.21.19).

6. Впервые в отечественной науке разработаны услоьия кристаллизации и галучены кристаллы глутамилэндопептидазы B.intermedius 3-19.

о

1редварительный рентгеновский анализ с разрешением 1,68 А показал, что ристаллы принадлежат к пространственной группе С2 и имеют следующие

о о о

[араметрыэлементарной ячейки : а=61,62 А, в=55,84 А, с=60,4 А, Р =117,6 .

Публикации по теме диссертации

Шехотяева Н.В., Шарипова М.Р., Балабан Н.П., Ицкович E.JL, Шакиров Е Внеклеточные гидролазы Bacillus intermedins. Выделение и свойства./Деп. ВИНИТИ, N2642-B92,26.09.95. - 18с.

2.Шарипова М.Р., Балабан Н.П., Нехотяева Н.В., Ицкович Е.Л., Шакиров Е. Лещинская И.Б., Руденская Г.Н. Секретируемые гидрола стрептомицинустойчивых бактерий Bacillus intermedins //Биохимия. - 1996, T.61.N1. - С.110-118.

3 .Leshchinskaya I.B., Shakirov E.V., Itskovich E.L., Balaban N.P., Mardanc A.M., Sharipova M.R., Viiyasov M.B., Rudenskaya G.N., Stepanov V.M. Glutan endopeptidase of Bacillus intermedins, strain 3-19 //FEBS Letters. - 1997. - V.404 P.241-244.

4.Лещинская И.Б., Шакиров E.B., Ицкович Е.Л., Балабан Н.П., Марданс A.M., Шарипова М.Р., Благова Е.В., Левдиков В.М., Куранова И.П., Рудена Г.Н., Степанов В.М. Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedins 3-19. Выделен свойства, кристаллизация//Биохимия. - 1997. - T.62,N8. - С. 1052-1059.

5.Shakirov E.V., Mardanova А.М. Glutamylendopeptidase from Bacil intermedins /8 th European Congress of Biotechnology, 1997, Budapest, 17-21 august P. 144.

6.Лещинская И.В., Шакиров E.B., Балабан Н.П., ВирясовМ.Б., Руденская Г. Степанов В.М. Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedins /IV Симпози «Химия протеолитических ферментов», 1997, Москва, 21-23 апреля. - С.42.

7.Благова Е.В., Левдиков В.М., Куранова И.П., Балабан Н.П., Шакиров Е Руденская Г.Н. Получение кристаллов глутамилэндопептидазы Bacillus intermea и их предварительное рентгеноструктурное исследование /^Симпозиум «Хи\ протеолитических ферментов», 1997, Москва, 21-23 апреля, - С.47.

8.Shakirov E.V., Balaban N.P., Sharipova M.R., Gabdrakhmanova L. Leshchinskaya I.B., Rudenskaya G.N., Stepenov V.M. Characterization of glutai endopeptidaze from Bacillus internedius /VII Meeting of industrial applications enzymes, 1997, Barcelona, 25-26 november, - P.170.

9.Shakirov E.V., Leshchinskaya I.B., Balaban N.P., Rudenskaya G.N., Stepai V.M., Blagova E.B., Levdikov V.M., Kuranova I.P. Glutamyl endopeptidase oiBacii intermedins, straim 3-19. Purification, properties, cristallization /17 th Internatic Congress of Biochemistry and Molecular Biology, 1997, San Francisco, California, 29 august.-3135.

Ю.Руденская Г.Н., Шакиров Е.В., Балабан Н.П., Лещинская И.Б., Благова Е.В., :евдиков В.М., Куранова И.П., Степанов В.М. Глутамилэндопептидаза Bacillus itermedius. Выделение, свойства, кристаллизация /Второй съезд Биохимического бщества Российской Академии Наук, 1997, Москва, 19-23 мая. - С.62.

11.Kuranova I.P., Blagova E.V., Levdikov V.M., Rudenskaya G.N., Balaban N.P., hakirov E.V. Crystal growth and preliminary X-ray study of glutamic acid specific roteinase from Bacillus intermedins /7 th International Conference on the rystallization of Biological Macromoleculs, 1998, Granada, SPAIN, 3-8 may.-P.37.

12.Шакиров E.B., Габдрахманова JI.A., Балабан Н.П., Шарипова М.Р., уззятова Р.К., Гарусов А.В., Лещинская И.Б., Руденская Г.Н. лутамилэндопептидаза Bacillus intermedins. Биосинтез и выделение/Х1 сероссийская конференция «Ферменты микроорганизмов», 1998, Казань, 2-4 евраля. - С.70-79.

13.Gabdrakhmanova L.A., Shakirov E.V., Balaban N.P., Sharipova M.R., udenskaya G.N., Leshchinskaya I.B. Biosynthesis and localization lutamylendopeptidase from Bacillus intermedins strain 3-19 //Microbios. - 1999. -.100. - P.97-108.

14.Kuranova I.P., Dlagova E.V., Levdikov V.M., Rudenskaya G.N., Balaban N.P., hakirov E.V. Crystal growth and preliminary X-ray study of glutamic acid specific ;rine protease grom Bacillus intermedins //J.Crystal Growth. - 1999. - V.196.- P.313-18.

15.Shakirov E.V., Gabdrakhmanova L.A., Balaban N.P., Sharipova M.R., cshchinskaya I.B., Rudenskaya G.N. Effects of culture components on the biosynthesis Г glutamylendopeptidase Bacillus intermedins /The Protein Society Thirteenth ymposium, 1999, Boston, Massachusetts, 24-28 july.

16.Sharipova M.R., Shakirov E.V., Balaban N.P., Gabdrakhmanova L.A., udenskaya G.N., Leshchinskaya I.B. Localization of glutamylendopeptidaze and thiol-:pendent serine proteinases in Bacillus intermedins cells /The Protein Society hirteenth Symposium, 1999, Boston, Massachusetts, 24-28 july.

17.Шакиров E.B., Габдрахманова Л.А., Балабан Н.П., Шарипова М.Р., уденская Г.Н., Лещинская И.Б. Биосинтез глутамилэндопептидазы Bacillus termedius //Микробиология. - 2000. - T.69.N1. - С.29-33.