Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius 3-19

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шакиров, Евгений Витальевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Основные принципы классификации протеолитических 9 ферментов

2. Сериновые протеиназы 12 2.1 Субтилизины и субтилизиноподобные протеиназы 14 2.1.1 Классификация субтилизиноподобных протеиназ

2.1.2. Общая характеристика субтилаз

2.1.3. Секретируемые субтилизины бацилл и их аналоги

2.2. Характеристика химотрипсиноподобцыхгпротеиназ

2.3. Сериновые протеиназы стрептомрдетоб ■

2.4. Глутамилэндопептидазы - особое подсемейство 30 химотрипсиновых протеиназ микроорганизмов. Физико-химические свойства и субстратная специфичность

2.5. Рентгеноструктурный анализ и функциональная 37 организация глутамилэндопептидаз. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Отбор активных штаммов и исследование состава 56 питательной среды для обеспечения высокой продукции глутамилэндопептидазы В.ШегтеШив

1.1. Отбор продуцентов внеклеточной глутамилэндопептидазы по 56 уровню максимальной продукции.

1.2. Изучение динамики роста культуры и биосинтеза фермента.

1.3. Влияние источников углерода на биосинтез 58 глутамилэндопептидазы.

1.4. Влияние концентрации пептона и неорганического фосфата на биосинтез глутамилэндопептидазы.

1.5. Влияние аминокислот, субстратов протеиназы и других 66 факторов на биосинтез глутамилэндопептидазы

1.6. Влияние ионов двухвалентных металлов на биосинтез 71 протеиназы.

2. Выделение, очистка и характеристика 75 глутамилэндопептидазы ВлШегтесИт

2.1. Получение гомогенного препарата глутамилэндопептидазы из 75 культуральной жидкости В. ШегтесИш

2.2. Физико-химическая характеристика глутамилэндопептидазы 78 Степень чистоты и молекулярная масса фермента 82 Кинетические параметры и изоэлектрическая точка фермента

3. Энзиматические свойства глутамилэндопептидазы

3.1. рН-оптимум и рН-стабильность

3.2. Температурный оптимум и термостабильность фермента

3.3. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность 89 глутамилэндопептидаз

3.4. Влияние ингибиторов на активность глутамилэндопептидаз

3.5. Субстратная специфичность глутамилэндопептидазы 98 В.ШегтесИш

4. Аминокислотный состав и ]Ч-концевая последовательность

5. Выращивание и предварительный анализ кристаллов 100 глутамилэндопептидазы В.ШегтесНш

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius 3-19"

Актуальность проблемы. Белки - основные «рабочие» единицы клетки, осуществляющие множество различных реакций и процессов и являющиеся неотъемлемой частью структуры самой клетки. Синтез и само существование белков, как и любых других составляющих клеток, подвергается строжайшему контролю и регуляции со стороны факторов, ответственных за развитие клетки. Старые, поврежденные или избыточные белковые молекулы должны быть разрушены для того, чтобы клетка смогла развиваться дальше. Этот процесс - быстрое и селективное расщепление химически устойчивой пептидной связи в белках - решается с помощью протеолитических ферментов - протеиназ - уникальных биологических катализаторов, в миллиарды раз ускоряющих реакцию гидролиза белков. Необходимо отметить, что энергия, необходимая для расщепления пептидной связи в белках в нейтральной водной среде при комнатной температуре, настолько велика, что спонтанный гидролиз во многих случаях не происходит даже при инкубации в течение нескольких месяцев. Однако, при температуре 37 °С и нейтральном рН одна молекула протеиназы способна вызвать протеолиз 100 пептидных связей в секунду.

Протеолитические ферменты выполняют в клетке ряд жизненно важных функций. Кроме участия в деструктивных катаболических процессах протеолитические ферменты функционируют на этапе посттрансляционного процессинга белков, участвуют в клеточной дифференцировке , в том числе у прокариот, в таком важном с общебиологических позиций процессе, как переход вегетативных клеток к спорообразованию, то есть в анабиотическое состояние. Они осуществляют селективный протеолиз белков, связанный с изменением метаболизма.

Протеолитические ферменты широко используются в молекулярной биологии в качестве инструментов для изучения первичной структуры белков и пептидов; с другой стороны, сами протеазы являются удобными объектами для изучения механизмов функционирования белков (Breddam К. et al, 1992).

Особое значение приобретает изучение микробных протеолитических ферментов, которые благодаря большому разнообразию свойств и возможности их получения в гомогенном состоянии нашли широкое применение во многих областях медицины. Так, некоторые протеиназы обладают фибринолитической и тромболититической активностью, поэтому на их основе разрабатываются лечебные препараты для лизиса тромбов и предотвращения тромбообразования. Широко используются эти ферменты при опасных ожоговых поражениях для удаления некротических тканей, для ускорения заживления ран, послеоперационных швов и восстановления повреждений после переломов и травм (Сахаров И.Ю. и др., 1993). Гранзим В, находящийся в цитотоксических Т-лимфоцитах, участвует в защите организма от вирусных инфекций и роста раковых клеток (Odake S. et al., 1991). Протеолитические ферменты применяются также в производстве моющих средств, кожевенной и пищевой промышленности .

Род Bacillus - это непатогенные микроорганизмы, являющиеся легко культивируемыми продуцентами многих внеклеточных ферментов и поэтому представляющие собой один из наиболее удобных объектов для получения протеолитических ферментов и изучения их свойств (Харвуд К., 1992).

Нами было установлено, что бактерии Bacillus intermedius наряду с другими гидролазами (ферменты, расщепляющие связи в биологических молекулах - рибонуклеаза, фосфатаза) секретируют несколько сериновых протеиназ, одна из которых по предварительным данным относится к группе глутамилэндопептидаз - ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные карбоксильными группами глутаминовой и аспарагиновой кислот. Представлялось интересным выделить и охарактеризовать этот фермент, который расширяет наши представления о глутамилэндопептидазах

- подгруппе сериновых протеиназ, которые рассматриваются как отдельная эволюционная ветвь с кардинальным изменением специфичности действия.

Цели и задачи исследования. Данная работа проведена с целью характеристики нового фермента - внеклеточной глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius 3-19, включая изучение физико-химических и энзиматических свойств, и получения кристаллов протеиназы для проведения рентгеноструктурного анализа молекулы белка, а также определения условий, оптимальных для синтеза этого фермента.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие экспериментальные задачи:

1. Оптимизация состава питательной среды для получения максимальной продукции глутамилэндопептидазы.

2. Выделение и очистка глутамилэндопептидазы из культуральной жидкости В. intermedius ; получение гомогенного препарата фермента.

3. Изучение основных физико-химических и энзиматических свойств протеиназы.

4. Выращивание и предварительный анализ кристаллов для рентгеноструктурного изучения белка.

Научная новизна работы. Впервые обнаружена внеклеточная глутамилэндопептидаза В. intermedius. Определены оптимальные условия для продукции протеиназы. Разработан эффективный лабораторный метод получения гомогенного препарата глутамилэндопептидазы, основанный на высокоэффективной жидкостной хроматографии. Определены физико-химические характеристики и энзиматические свойства фермента. Впервые в отечественной науке получены кристаллы глутамилэндопептидазы В.intermedius, позволяющие проводить рентгеновские исследования структуры этого белка. Полученные результаты дают возможность пополнить новым, ранее неизученным бациллярным ферментом группу 8 глутамилэндопептидаз, входящих в семейство химотрипсина класса сериновых протеиназ.

Практическая ценность работы. Оптимизированы условия биосинтеза глутамилэндопептидазы. Разработан метод очистки фермента, с помощью которого можно получить 2-3 мг гомогенного белка из 1 л культуральной жидкости.

Нами показано, что выделенная и охарактеризованная протеиназа относится к группе глутамилэндопептидаз, специфичность действия которых целиком определяется присутствием в субстрате отрицательно заряженных боковых цепей глутаминовой и аспарагиновой кислот. Уникальные свойства этого фермента делают возможным его использование в качестве инструмента для изучения первичной структуры белков и удобной модели для конструирования протеиназ с модифицированными свойствами.

Полученные впервые в России кристаллы глутамилэндопептидазы В. ШегтесИж позволили провести рентгеновское исследование структуры этого белка с целью выяснения уникального механизма субстратной специфичности фермента.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шакиров, Евгений Витальевич

выводы

1. Подобран состав питательной среды, обеспечивающий максимальный уровень активности глутамилэндопептидазы в культуральной жидкости В. ШегтесИш 3-19. При этом установлено, что синтез глутамилэндопептидазы ингибируется глюкозой и смесью аминокислот, активируется ионами кальция, магния и аммония.

2. Разработан метод выделения и очистки глутамилэндопептидазы из культуральной жидкости ВлЫегтесИш, включающий ионообменную хроматографию на колонках КМЦ и МопоБ в режиме ВЭЖХ и позволяющий получить гомогенный препарат фермента с выходом 12%.

3. Впервые охарактеризована глутамилэндопептидаза В.ШегтесИш, которая имеет молекулярную массу 29 Ша и изоэлектрическую точку 8,4. Обнаружены два рН-оптимума на природном субстрате : при рН 7,5 и рН 9,0, на синтетическом субстрате - при рН 8,0. Температурный оптимум действия фермента 55 °С.

4. Установлено, что макромолекула глутамилэндопептидазы содержит два остатка полуцистина; показана 45%-ная гомология Ы-концевой последовательности протеиназы с известными глутамилэндопептидазами бацилл.

5. Анализ действия ингибиторов и субстратной специфичности показал, что фермент атакует только связи, образованные дикарбоновыми кислотами, что позволило отнести его к глутамилэндопептидазам семейства химотрипсина с кардинальным изменением специфичности действия (КФ 3.4.21.19).

6. Впервые в отечественной науке разработаны условия кристаллизации и получены кристаллы глутамилэндопептидазы В. ШегтесИт 3-19. Предварительный рентгеновский анализ с о разрешением 1,68 А показал, что кристаллы принадлежат к пространственной группе С2 и имеют следующие параметры

0 0 0 элементарной ячейки : а=61,62 А, в=55,84 А, с=60,4 А, |3 =117,6 .

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шакиров, Евгений Витальевич, Казань

1. Балабан Н.П., Шарипова М.Р., Усманова A.M., Ицкович Е.Л., Лещинская И.Б. Щелочная внеклеточная протеиназа Bacillus intermedins. Выделение, очистка и некоторые свойства фермента //Биохимия. -1993. -Т.58,N12. С.1923-1928.

2. Балабан Н.П., Шарипова М.Р., Ицкович Е.Л., Лещинская И.Б., Руденская Г.Н. Секретируемая сериновая протеиназа спорообразующих бактерий Bacillus intermedius 3-19 //Биохимия.-1994. T.59,N9. - С. 13931400.

3. Безбородов A.M., Астапович Н.И. Секреция ферментов у микроорганизмов. М.: Наука. - 1984. - 58с.

4. Безбородов A.M., Коган И.Б., Бочева С.С. Основы биотехнологии микробных синтезов.- Ростов-на-Дону.: Изд-во Ростовского университета. 1989. 112с.

5. Беляева Е.В., Руденская Г.Н., Степанов В.М., Дегтева Г.К. Выделение и свойства внеклеточной протеиназы золотистого стафилококка //Прикл. биохимия и микробиология. 1984. - T.20,N3. -С.363-368.

6. Бриан J1.E. Бактериальная резистентность и чувствительность к химиотерапии. М.: Медицина. - 1984. - 270с.

7. Гааль Э., Медьеши Г., Верецки Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир. - 1982. - 446с.

8. Гололобов М.Ю., Морозова И.П., Степанов В.М. Влияние температуры и рН на стабильность и каталитическую активность сериновой протеиназы Bacillus subtilis шт. 72 //Биохимия. 1991.-T.56,N1. -С.33-40.

9. Гололобов М.Ю., Морозова И.П., Воюшина Т.Л., Тимохина Е.А., Степанов В.М. Субстратная специфичность сериновой протеиназы Bacillus subtilis шт. 72 //Биохимия. -1991. T.56,N2. - С.230-240.

10. Дебабов В.Г., Лившиц В.А. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов. М.: Высшая школа. - 1988. -205с.

11. Демидюк И.В., Носовская Е.А., Цаплина И.А., Каравайко Г.И., Костров С.В. Выделение и характеристика сериновой протеиназы из Thermoactinomyces species, относящейся к группе Glu,Asp-специфичных ферментов //Биохимия. 1997. - T.62,N2. - С.202-207.

12. Демидюк И.В., Руденская Г.Н., Честухина Г.Г., Костров С.В. Структурная организация глутамилэндопептидаз /XI Всероссийская конференция «Ферменты микроорганизмов». Казань. - 1998. - С.59-69.

13. Демидюк И.В., Костров С.В. Особенности функциональной организации глутамилэндопептидаз //Мол.биол. 1999. - T.33,N1. - С. 100105.

14. Детерман Г. Гель-хроматография. М.: Мир. - 1970. - 252с.

15. Долидзе Д.А., Петрова И.С., Фениксова Р.В. Исследование комплекса протеолитических ферментов Actinomyces fradiae 119 //Прикл. биохимия и микробиология. 1974. - Т. 10,N5. - С.721-/28.

16. Дунаевский Я.Е., Грубань Т.Н., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Влияние состава среды на количественный и качественный состав внеклеточных протеаз микромицетов //Микробиология. 1999. - T.68,N3. С.324-329.

17. Егоров Н.С., Лория Ж.К., Брюкнер Б. Регуляция синтеза внеклеточных ферментов у микроорганизмов //Успехи микробиологии. -1977.-N12.-С.59-79.

18. Знаменская Л.В., Ромахина Е.Р., Филатова C.B. Биосинтез внеклеточных ферментов Bacillus intermedius //Микробиология. 1986. -T.55,N3. - С.449-455.

19. Ицкович E.JL, Знаменская J1.B., Балабан Н.П., Ершова Т.А., Лещинская И.Б. Биосинтез щелочной внеклеточной протеиназы Bacillus intermedius //Микробиология. 1995. - T.64,N5 - С.623-629.

20. Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз //Прикл. биохимия и микробиология. 1971. - T.7,N2.- С.225-228.

21. Казанская Н.Ф., Кост O.A. О строении активного центра субтилизина 72 //Биохимия. 1982. - T.47,N5. - С.834-841.

22. Калугер C.B., Боровикова В.П., Лавренова Г.И., Степанов В.М., Шпокене Л.П., Гурьева М.П. Внеклеточная сериновая протеиназа А Streptomyces rutgersenses //Биохимия. 1983. - T.48,N9. - С. 1483-1490.

23. Колев Д.А. Репрессия синтеза экзопротеиназ у штамма 90Б1-формы Bacillus mesentericus аминокислотами //Микробиология. 1986. - T.55,N4. -С.295-300.

24. Краснов С.И., Знаменская Л.В. Комплекс программ «ВЮРТ» для оптимизации в биологических исследованиях //Биол.науки. 1992. - N2.-С.15-18.

25. Крейер В.Г., Руденская Г.Н., Ландау Н.С., Покровская С.С., Степанов В.М., Егоров Н.С. Субтилизиноподобная протеиназа SSPB из Streptomyces spheroides шт. 35 //Биохимия. 1983. - T.48,N8. - С.1365-1373.

26. Крейер В.Г., Руденская Г.Н., Ландау Н.С., Смирнов Л.В., Тимохина Е.А., Егоров Н.С., Степанов В.М. Внеклеточная химотрипсиноподобная протеиназа Streptomyces spheroides 35 //Биохимия.- 1984. Т.49. - С.1890-1898.

27. Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир. - 1985. - 365с.

28. Лещинская И.Б., Клейнер Г.И., Волкова Т.И., Балабан Н.П., Шарипова Ф.Р. Метод выделения и очистки щелочной рибонуклеазы Bacillus intermedius //Прикл. биохимия и микробиология. 1981. - Т. 17,N2.- С.241-246.

29. Люблинская Л.А., Воюшина Т.Л., Степанов В.М. Ферментативный синтез пептидных субстратов сериновых протеиназ //Биоорг. химия. -1982. T.8,N12. - С. 1620-1623.

30. Люблинская Л.А., Хайду И., Баландина Г.Н. П-нитроанилиды пироглутамилпептидов хромогенные субстраты сериновых протеиназ //Биоорг. химия. - 1987. - Т. 13,N6. - С.748-753.

31. Максимов В.Н. Многофакторный эксперимент в биологии.- М.: Изд-во МГУ. 1980. - 280с.

32. Мосолова О.В., Руденская Г.Н., Степанов В.М., Ходова О.М., Цаплина И.А. Glu, Asp-специфичная протеиназа актиномицетов //Биохимия. 1987. T.52,N3. - С.414-422.

33. Новикова Т.М., Выборных С.Н., Егоров Н.С., Лория Ж.К. Внеклеточная протеаза Bacillus alvei В-724 //Прикл. биохимия и микробиология. 1986. T.22,N6. - С.112-111.

34. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука. - 1981. - 286с.

35. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука. - 1985. - 536с.

36. Павлова И.Н., Жолнер Л.Г. Сериновые протеиназы термофильных бацилл //Микробиология. 1994. - T.63,N5. - С.8-16.

37. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. -М.: Мир. 1980.-331с.

38. Плохинский Н.А. Математические методы в биологии. М.: Изд-во МГУ. - 1978. - 265с.

39. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов. М.: Мир. -1987. - 112с.

40. Рассулин Ю.А., Каверзнева Е.Д., Еркомаишвили Г.С. Ферментативная активность компонентов эластолитического комплекса Actinomyces rimosus //Биохимия. 1973. - T.38,N4. - С.727-729.

41. Ревина Л.П., Хайдарова Н.В.Ю Руденская Г.Н., Гребенщиков Н.И., Баратова Л.А., Степанов В.М. Исследование действия Glu, Asp-специфичной протеиназы Streptomyces thermovulgaris на пептидные субстраты //Биохимия.- 1989. Т.54Д5. - С.846-850.

42. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизинов //Биоорг. химия. 1994. - T.20,N5. - С.475-484.

43. Руденская Г.Н. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ //Биоорг. химия. - 1998. -T.24,N4. С.256-261.

44. Сафонова М.Е., Астапович Н.И., Буряко И.А. Особенности роста и продукции внеклеточных протеиназ Lactobacillus plantarum ИМ-9/138 //Микробиология. 1999. - T.689N4. - С.449-452.

45. Сахаров И.Ю., Литвин Ф.Е. Протеазы из гепатопанкреаса Камчатского краба и перспективы их использования в медицинской практике /Тез.докл.Симп. «Химия протеолитических ферментов». -Москва. 1993.

46. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир. - 1985. - 358с.

47. Хайдарова Н.В., Руденская Г.Н., Ревина Л.П., Степанов В.М., Егоров Н.С. Glu, Asp-специфичная протеиназа из Streptomyces thermovulgaris //Биохимия. 1989. - T.54,N1. - С.46-52.

48. Харвуд К. Бациллы. Генетика и биотехнология. М.: Мир. - 1992. -С.143-163.

49. Хартман К., Лецкий Э., Шефер В. Планирование эксперимента в исследовании биотехнологических процессов. -М.: Мир. 1977. - 551с.

50. Шарипова М.Р., Балабан Н.П., Вершинина В.И., Лещинская И.Б. Синтез и секреция фосфогидролаз и протеазы //Микробиология. 1987. -T.56,N5. С.805-811.

51. Шарипова М.Р., Шакиров Е.В., Балабан Н.П., Габдрахманова Л.А., Шилова М.А., Руденская Г.Н., Лещинская И.Б. Локализация протеолитических ферментов в клетках Bacillus intermedius //Микробиология. 2000. T.69,N1.

52. Экспериментальные методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: Изд-во МГУ. 1985. - С.7-23.

53. Bachovchin W.W. Confirmation of the assignment of the low-field proton resonans of serine proteases by using specifically nitrogen-15 labeled enzyme //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. - V.82. - P.7948-7951.

54. Banerjee A., Ganesan K., Datta A. Induction of secretory acid proteinase in Candida albicans //J.Gen.Microbiology. 1991. - V.137 (PtlO). -P.2455-2461.

55. Barbosa J.A.R.G., Garratt R.C., Saldanha J.W. A structural model for the glutamate-specific endopeptidase from Streptomyces griseus that explains substrate specificity //FEBS Letters. 1993. - V.324,N1.- P.45-50.

56. Barr P.J. Mammalian subtilisines: the long-sought dibasic processing proteases //Cell. 1991. - V.6. - P. 1-3.

57. Barrett A.J., Rawlings N.D. Perspectives in biochemistry and biophysics. Families and clans of serine peptidases //Archives of biochemistry and biophysics. 1995 - V.318,N2. - P.247-250.

58. Bech L.M., Sorensen S.B., Breddam K. Significance of hydrophobic S4-P4 interactions in subtilisin 309 from Bacillus lentus //Biochemistry. 1993. - V.32,N11. - P.2845-2852.

59. Betzel C, Teplyakov A.V., Harutyunyan E.H., Saenger W., Wilson K.S. Termitase and proteinase K: a comparison of the refined three-dimensional structures of the native enzymes //Protein Engineering 1990. - V.3,N3. - P. 161172.

60. Betzel C., Klupsch S., Branner S., Wilson K.S. Crystal structures of the alkaline proteases Savinase and Esperase from Bacillus lentus //Adv. Exp. Med. Biol. 1996.-V.379.-P.49-61.

61. Bogacheva A.M. Plant subtilisins //Biochemistry (Moscow). 1999. -V.64,N3. - P.287-293.

62. Breddam K., Mendal M. Substrate preferences of glutamic-acid-specific endopeptidases assessed by synthetic peptide substrates based on intramolecular fluorescence quenching //Eur.J.Biochem. 1992. - V.206. -P.103-107.

63. Borgia P., Campbell L. Properties of two homologous alkaline proteases from Streptomyces rectus //J.Bacteriology. 1974. - V.120,N3. -P.l 109-1115.

64. Carmona C., Gray G.L. Nucleotide sequence of the serine protease gene of Staphylococcus aureus, strain V8 //Nucleic Acids Research. 1987. -V.15,N16. P.6757.

65. Coleman G., Brown S., Stormonth D.A. A model for the regulation of bacterial extracellular enzyme and toxin biosynthesis //J.Theor.Biol. 1975. V.52,N1.- P.143-148.

66. Craik C.S., Roczniak S., Largman C., Rutter W.J. The catalytic role of the active site aspartic acid in serine proteases //Science. 1987. -V.237,N4817. - P.909-913.

67. Czapinska R., Otlewski J. Structural and energetic determinants of the Sl-site specificity in serine proteases //Eur.J.Bioch. 1999. - V.260. - P.571-595.

68. Dancer S.J., Garratt R., Saldanha J., Jhoti H., Evans R. The epidermolytic toxins are serine proteinases //FEBS Letters. 1990. - V.269,N1. -P.129-132.

69. Demidyuk I.Y., Kostrov S.V. On the functional organization of glutamyl endopeptidases //Mol.Biol. 1999, - V.33,N1. - P.84-88.

70. Drapeau G.R., Boily Y., Houmard J.J. Purification and properties of an extracellular protease of Staphilococcus aureus //J.Biol.Chem. 1972.-V.247,N20.-P.6720-6726.

71. Drapeau G.R. Cleavage at glutamic acid with staphylococcal protease //Methods in Enzymol. 1977. - Y.47. - P.181-191.

72. Drapeau G.R. The primary structure of staphylococcal protease //Can.J.Biochem. 1978. - V.56,N6. - P.534-544.

73. Enzyme nomenclature 1992: recomendation of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. San Diego. - 1992. - 862p.

74. Fersht A. Enzyme structure and mechanism, 2nd edition, W.H.Freeman, san Francisco, CA. 1984.

75. Fujiwara N., Masui A., Imanaka T. Purification and properties of the highly thermostable alkaline protease from an alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp //J.Biotechnol. 1993. - V.30,N2. - P.245-256.

76. Gehrig L.M.B., Delbaere L.T.J. Preliminary X-ray data for staphylococcal protease //J.Mol.Biol. 1985. - V.185. - P.651.

77. Gron B., Meldal M., Breddam K. Extensive comparison of the substrate preferences of two subtilizins as determined with peptide substrate which are based on the principle of intramolecular quenching //Biochemistry. 1992. -V.31. - P.6011-6018.

78. Ichishima E., Takada Y., Taira K., Takeuchi M. Specificities of extracellular and ribosomal serine proteinases from Bacillus natto, a food microorganism//Biochim. et Biophys. Acta. 1986. - V.869. - P. 178-184.

79. Houmard J., Drapeau G.R. Staphylococcal protease: a proteolytic enzyme specific for glutamyl bonds //Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1972. -V.69,N12. - P3506-3509.

80. James F., Brouquisse R., Suire C., Pradet A., Raymond P. Purification and biochemical characterization of a vacuolar serine endopeptidase induced by glucose starvation in maize roots //Biochem.J. 1996. - V.320. - P.283-292.

81. Jany K.D., Mayer B. Proteinase K from Tritirachium album Limber I.Molecular mass and sequence around the active serine residue //Hopper Seyler. 1985. - V.366. - P.485-492.

82. Johansen J.T., Ottesen M., Svendsen I., Wybrandt G. The degradation of the B-chain of oxidized insulin by two subtilisins and their succinnylated and N-carbamylated derivatives //CR Lab.Carsberg. 1968. - V.36. - P.365-384.

83. Joshi L., Leger R.J.S., Bidochka M.J. Cloning of a cuticle-degrading protease from the entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana //FEMS Microbiology letters. 1995. - V.125. - P.211-218.

84. Jurasek L., Carpenter M.R., Smillie L.B., Gertler A., Levy S., Ericsson L.H. Amino acid sequence of Streptomyces griseus protease B , a major component of pronase //Biochem.Biophys.Res.Comm. 1974. - V.61,N4. -P.1095-1098.

85. Laemmli H.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4 //Nature. 1970 - V.227. - P.680-685.

86. Lerner C.G., Goldman R.C. Stimuli that induce production of Candida albicans extracellular aspartyl proteinase// J.Gen.Microbiology. 1993. - V.l39 (Pt 7). - P. 1643-1651.

87. Lesk A.M., Fordman W.D. Conservation and variability in the structure of serine proteinases of the chymotrypsin family //J.Mol.Biol. 1996. - V.258. -P.501-537.

88. Mantsala P., Lalkin H. Extracellular and membranebound proteases from Bacillus subtilis //J.Bacteriol. 1980. - V.141. - P.493-501.

89. Mizuno K., Nakamura T., Oshima T., Tanaka S., Matsuo H. Yeast kex2 gene encodes an endopeptidase homologous to subtilisin-like serine proteases //Biochem.Biophys.Res.Commun. 1998. - V.l56. - P.246-254.

90. Moravcova J., Chaloupka J. Repression of the synthesis of exocellular and intracellular proteinases in Bacillus megaterium IIFolia Microbial (Praha). -1984. V.29,N4. -P.273-281.

91. Murzin A.G., Lesk A.M., Chothia C. Principles determining the structure of ft-sheet barrels in proteins: II.The observed structures //J.Mol.Biol.1994. V.236. - P.1382-1400.

92. Narahashi Y., Yoda K. Alkalina serina proteinase D and E of Streptomyces griseus K-l //J.Biochem. 1977. - V.81.N3. - P.587-597.

93. North M.J. Comparative biochemistry of the proteinases of eucaryotic microorganisms //Microbiol.Rev. 1982. - V.46,N3. - P.308-340.

94. Nienaber V.L., Breddam K., Birktoft J.J. A glutamic acid specific serine protease utilized a novel histidine triad in substrate binding //Biochemistry. 1993. V.32,N43. - P.l 1469-11475.

95. Nierath H. Evolution of proteolytic enzymes // Science. 1984. -V.224. - P.350-357.

96. Ottesen M., Svendsen I. The subtilisins //Meth.Enzymol. 1970. -V.19. - P.199-215.

97. Peters K., Rose A. Bli-4 encodes a protein structurally related to the yeast serine proteinase kex2 //Worm Breeder's gazette. 1991.-V. 11.- P.28.

98. Ribeiro A., Akkermans A.D.L., van Kämmen A., Bisseling T., Pawlowski K. A nodule-specific gene encoding a subtilisin-like protease is expressed in early stages of actinorhizal nodule development //The Plant cell/ -1995.- V.7. P.785-794.

99. Robertus J.D., Kraut J., Alden R.A., Birktoft J.J. Subtilisin; a stereochemical mechanism involving transition state stabilization //Biochemistry. - 1972. - V.l 1,N23. - P.4293-4303.

100. Rudenskaya G.N., Bogacheva A.M., Preusser A., Kuznetsova A.V., Dunaevsky Y.E., Golovkin B.N., Stepanov V.M. Taraxalisin a serine proteinase from dandelion Taraxacum officinale Webb s.l. //FEBS Letters. -1998. - V.437. - P.237-240.

101. Ryden A.C., Ryden L., Philipson L. Isolation and properties of a staphylococcal protease, preferentially cleaving glutamyl-peptide bonds // Eur.J.Biochem. 1974. - V.44. - P.105-114.

102. Sampath P., Chandrakasan G. Physiological and nutritional factors affecting biosynthesis of extracellular protease by Streptomyces sp. G 157 // Microbiologica. 1998. - V.21,N1. - P.55-63.

103. Schmidt B.F., Woodhouse L., Adams R.M., Ward T., Mainzer S.E., Lad P.J. Alkalophilic Bacillus sp. strain LG-12 has a series of serine protease genes //Appl.Environ.Microbiol. 1995. - V.61,N12. - P.4490-4493.

104. Seetharam R., Acharya A.S. Synthetic potential of Staphylococcus aureus V8 protease: an approach toward semisynthesis of covalent analogs of a-chain of hemoglobins //J.Cellular Biochemistry. - 1986. - V.30,N1. - P.87-99.

105. Seidah N.G., Gaspar L., Mion P., Marcinkiewicz M., Mbikay M., Chretien M. CDNA sequence of two distinct pituitary proteins homologous to

106. Kex2 and furin gene products: Tissue specific mRNAs encoding candidates for prohormone processing proteinases //DNA. 1990. - Y.9. - P.415-424.

107. Sidhu S.S., Kalmar G.B., Willis L.G., Borgford T.J. Protease evolution in Streptomyces griseus. Discovery of a novel dimeric enzymes //J.Biol.Chem. 1995. V.270,N13. - P.7594-7600.

108. Simonen M., Palva I. Protein secretion in Bacillus species //Microbiol. Rev. 1993. V.57,N1. - P.109-137.

109. Siezen R.J., Vos W.M.de, Leunissen J.A.M., Dijkstra B.W. Homology modelling and protein engineering strategy of subtilases, the family of subtilizin-like serine proteases //Protein science. 1991. - Y.4. - P.719-737.

110. Siezen R.J., Leunissen J.A.M. Subtilases: the superfamily of subtilisin-like serine proteinases //Protein science.-1997. V.6. - P.501-523.

111. Sluyterman L.A.A., Elgersma O. Chromatofocusing : isoelectric focusing on ion-exchange columns. I. General principles //J.Chromatogr. 1978. - Y.150. - P.17-30.

112. Smeekens S.P., Avruch A.S., La Mendola J., Chan S.J., Steiner D.F. Identification of a cDNA encoding a second putative prohormone convertase related to PC2 in Att 20 cells and islets of Langerhans //roc.Nat.Acad.Sci.USA. 1991.-V.88.-P.340-344.

113. Smeekens S.P., Steiner D.F. Identification of a human insulinoma cDNA encoding a novel mammalian protein structurally related to the yeast dibasic processing protease Kex2 //J.Biol.Chem. 1990. - V.265. - P.2997-3000.

114. Smeekens S.P. Processing of protein precursors by a novel family of subtilisin-related mammalian endoproteases //Biotechnology. 1993. - V.ll. -P. 182-186.

115. Smith E.L., Delange R.J., Evans W.H., London M., Markland F. Subtilisin Carlsberg. V. The complete sequence, comparison with subtilisin BPN'; evolutionary relationships //J.Biol.Chem. 1968. - V.243. - P.2184-219I.

116. Stahl M.L., Ferrari E. Replacement of the Bacillus subtilis subtilisin structural gene with an in vitro-derived deletion mutation //J.Bacteriol. 1984. -V.158. - P.411-418.

117. Stennicke H.R., Birktoft J.J., Breddam K. Characterization of the SI binding site of the glutamic acid-specific protease from Streptomyces griseus //Protein Science. 1996. - P.2266-2275.

118. Suzuki Y., Yabuta M., Ohsuye K. Cloning and expression of the gene encoding the glutamic acid-specific protease of Streptomyces griseus ATCC 10137//Gene. 1994. - P.149-151.

119. Svendsen I., Jensen M.R., Breddam K. The primary structure of the glutamic acid-specific protease of Streptomyces griseus //FEBS Letters. 1991. -V.292,N1,2. - P. 165-167.

120. Svendsen I., Breddam K. Isolation and amino acid sequence of a glutamic acid specifec endopeptidase from Bacillus licheniformis //Eur.J.Biochem. 1992. - Y.204. - P. 165-171.

121. Tornero P., Conejero V., Vera P. Primery structure and expression of a pathogen-induced protease (PR-P69) in tomato plants: Similarity of functionaldomains to subtilisin-like endoproteases //Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 1996. -V.93. - P.6332-6337.

122. Uchikoba T., Yonezawa R., Kaneda M. Isolation and characterization of a proteinase from the sarcocarp of melon fruit //J.Biochemistry. 1975. -V.78.-P. 1287-1296.

123. Vitale L., Renko M., Lenarcic B., Turk V., Pokorney M. Isolation and characterization of Streptomyces rimosus proteases /Sympos.Biolog.Hungarica. 1984.-25.-P.413-424.

124. Vlakhov S., Dalev P., Kabadzhova P., G'oreva V. Induction of elastase biosynthesis in Streptomyces sp.82 //Antibiotiki i Khimioterapiia. -1996. V.41,N4. - P. 16-22.

125. Warshel A., Naray-Szabo G., Sussman F., Hwang J.K. How do serine proteases really work? //Biochemistry. 1989. - V.28,N9. - P.3629-3637.

126. Wellink J., Kämmen A. Proteases involved in the processing of viral polyproteins//Archiv.virology. 1988. - V.98. - P. 1-26.

127. Wells J.A., Ferrari E. Henner D.J., Estell D.A., Chen E.Y. Cloning, sequencing and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis //Nucleic Acids Res. 1983. - V.l 1. - P.7911-7925.