Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и характеристика протеиназ поздней фазы роста Bacillus intermedius 3-19

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика протеиназ поздней фазы роста Bacillus intermedius 3-19"

На правах рукописи

СОКОЛОВА ЕВГЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТЕИНАЗ ПОЗДНЕЙ ФАЗЫ РОСТА BACILLUS 1NTERMEDIUS 3-19

03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2006

Работа выполнена на кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета ГОУВПО «Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина».

Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший научный

сотрудник Нэлли Павловна Балабан

Официальныеоппоненты: доктор ветеринарных наук, заведующий кафедрой

микробиологии, вирусологии и иммунологии Казанской государственной ветеринарной академии им. Н.Э. Баумана профессор Госманов Рауис Госманович

- кандидат биологических наук, заведующий отделением культивирования и идентификации вирусов РЦПБ СПИД и ИБ МЗ РТ старший научный сотрудник Уразов Наиль Гумерович

Ведущая организация: Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ

РАН

Защита диссертации состоится «/^»2006 г. в /У- часов на заседании

диссертационного совета Д.212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 209.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного университета

Автореферат разослан « 9 » КОЛД^2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

З.И. Абрамова

Актуальность проблемы. Протеолитические ферменты представляют собой уникальную группу биологических катализаторов. Функции этих ферментов разнообразны - они принимают участие в процессах катаболизма, постгрансляционном процессинге белков, задействованы в процессах эмбриогенеза эукариот. Выявленная в последние годы способность микробных протеиназ к осуществлению реакции селективного протеолиза таких белков крови человека, как фибрин, плазминоген и протеин С, определяет перспективность использования этих ферментов для коррекции гемостаза человека при профилактике, диагностике и лечении атеросклероза и таких его последствий, как тромботические состояния. Важным свойством протеиназ является их способность к ферментативному синтезу олигопептидов, что перспективно для получения биологически активных соединений и лекарственных препаратов. В настоящее время с помощью этого метода получают аспартам (искусственное подслащивающее вещество).

Одним из наиболее интересных семейств класса протеолитических ферментов являются сериновые протеиназы бацилл. В стационарной фазе роста бациллы секретируют сериновые и нейтральные протеиназы, которые играют определенную роль в адаптационных процессах и, в частности, в спорообразовании. Показано, что сериновые протеиназы принимают непосредственное участие в процессе синтеза споровой оболочки и прорастании спор. Так, протеиназа TesA, секретирующаяся в . среду спорулируюшими клетками Bacillus subtilis, вовлекается в построение оболочки споры [Serrano et al., 1999]. Обнаружено, что продукт гена clpP ; представляет собой протеиназу, играющую важную роль в период стационарной фазы роста В. subtilis. Этот белок является определяющим для роста клеток в условиях теплового шока [Msadek et al.,1988]. Неослабевающий интерес к этим белкам обусловлен также широтой практического применения. Выход целевого продукта у бацилл может быть существенно повышен за счет направленного воздействия на условия роста, использования штаммов с нарушениями систем регуляции либо модификацией гена. На основе протеиназ бацилл конструируются каталитические антитела с протеолитической активностью. Выделены протеиназы бацилл, обладающие фибринолитическими и тромболитическими свойствами. В связи с ростом числа тромбических заболеваний актуальным является поиск новых эффективных протеолитических ферментов, обладающих высокой активностью, специфичностью и низкой токсичностью. Одной из подгрупп сериновых протеиназ являются глутамилэндопептидазы, обладающие узкой субстратной специфичностью. Они используются как высокоточные «инструменты» для ' фрагментации белковых молекул при исследовании их первичной структуры, а также как удобные модели для конструирования белков с заданными свойствами.

Целью настоящей работы явилось выделение глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius, секретируемых в поздней стационарной фазе роста бактерий, очистка и изучение свойств этих ферментов.

Основные задачи исследования.

1. Исследование влияния экзогенных факторов питательной среды на накопление внеклеточных протеиназ В. intermedius в поздней стационарной фазе роста бактерий.

2. Выделение из культуральной жидкости В. intermedins гомогенных препаратов протеиназ и их идентификация.

3. Исследование влияния ингибиторов на активность ферментов.

4. Определение энзиматических и каталитических свойств ферментов.

5. Определение субстратной специфичности глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной сериновой протеиназы.

6. Установление аминокислотного состава и N-концевой последовательности протеиназ В. intermedius.

Научная новизна. Установлено, что бактерии В, intermedius 3-19 активно синтезируют и секретируют протеолитические ферменты в течение всей стационарной фазы роста. Впервые из культуральной жидкости В. intermedius 3-19 в поздней стационарной фазе роста выделены глутамилэндопептидаза и субтилизиноподобная протеиназа, так называемые поздние ферменты. Определены условия биосинтеза обоих ферментов и подобран состав питательной среды для максимального синтеза этих протеиназ. Получены данные, свидетельствующие о том, что каталитические характеристики ранних и поздних протеиназ различны, тогда как энзиматические и физико-химические свойства схожи. Установлены N-концевые последовательности аминокислот для глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы поздней стационарной фазы роста и показано, что они идентичны ранним ферментам.

Практическая значимость. Полученные в работе результаты позволяют использовать штамм В. intermedius 3-19 как эффективный продуцент протеолитических ферментов. Подобраны оптимальные питательные среды для максимальной продукции глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы поздней стационарной фазы роста. Разработаны методы очистки поздних белков. Получение гомогенных препаратов ферментов увеличивает арсенал белков, используемых в научных исследованиях и в практических целях. Результаты исследования свойств ферментов поздней стационарной фазы роста позволят расширить наши представления о сериновых протеиназах, в частности о субтилизиноподобных протеиназах и об особой подгруппе ферментов -глутамилэндопептидазах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования: Работа выполнялась в соответствии с планом НИР КГУ (№ государственной регистрации 01.2.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»; № государственной регистрации 01.2.006 09683 «Механизмы регуляции функциональной активности клетки»). Научные исследования поддержаны грантами РФФИ 01-04-48037, 05-04-48182а, АНТ 03.3.10-11, 03.3.10-295 и грантом Программы CRDF REC 007. Исследования получили персональную поддержку Правительства Российской Федерации (2002 г.) и были удостоены специальной медали Российской академии наук с премиями для молодых ученых РАН (2003 г.).

Положения, выносимые на защиту.

1. Впервые обнаружены, выделены и охарактеризованы протеолитические ферменты (глутамилэндопептидаза и субтилизиноподобная протеиназа) поздней стационарной фазы роста В. intermedins 3-19.

2. Ферменты ранней и поздней фазы роста В. intermedins 3-19 имеют определенные различия в каталитических характеристиках, а именно, различаются по константе Михаэлиса и каталитической константе.

3. Идентичные аминокислотные последовательности N-kohuob глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы ранней и поздней фаз роста В. intermedins 3-19 позволяют считать эти ферменты продуктами экспрессии одного гена, а различия в каталитических характеристиках связать с возможной посттранскрипционной модификацией белков В. interniedius, 3-19.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и региональных конференциях: 9-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005г.), итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (2002 г. - 2004 г.), XLII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», секция биология (Новосибирск, 2004), FEMS Congress of European Microbiologist «Bacillus-2003» (Ljubljania, Slovenia, 2003), на V симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Москва, 2002), на 1П съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), а также на семинарах кафедры микробиологии и Института биологии Казанского государственного университета.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 научные работы.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю кандидату биологических наук Н.П. Балабан; благодарит доктора химических наук Г.Н. Руденскую (МГУ им. Ломоносова) за возможность определения энзиматических свойств ферментов на базе её лаборатории; доктора биологических наук О.Н. Ильинскую и кандидата биологических наук Л.А. Габдрахманову за поддержку и помощь в обсуждении результатов; доктора биологических наук М-Р. Шарипову за внимательное отношение к работе.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, включает 5 таблиц, 24 рисунка. Библиография содержит 147 наименований российских и зарубежных авторов.

Материалы и методы

Бактериальный штамм. Объектом исследования служил штамм B.intermedius 3-19 (В-3833, Всесоюзная коллекция промышленных микроорганизмов), выделенный из штамма Bacillus intermedins 7Р (коллекция кафедры микробиологии Казанского государственного университета) методом рассева на среде, содержащей стрептомицин (500 мкг/мл). Штамм В. intermedins 3-19 был отобран из числа антибиотикоустойчивых штаммов В. intermedins по признаку максимальной продукции протеиназ.

Исходной средой для культивирования клеток служила среда следующего состава (г/л): СаС12 х 2НгО - 0,1, MgS04 х 7НгО - 0,3, NaCl - 3,0, MnS04 - 0,1, пептон - 20 г/л. рН среды равен 8,5. Среду стерилизовали при 1 атм в течение 1 часа. Растворы неорганического фосфата (Na2HP04) и растворы солей

двухвалентных металлов стерилизовали при 1 атм и вносили в среду перед посевом: неорганический фосфат в конечной концентрации 0,2 г/л, ионы металлов - 2, 5 и 10 мМ. Растворы дрожжевого экстракта, казеина по Гаммерстену и желатина стерилизовали при 0,5 атм и вносили в питательную среду в конечной концентрации 0,1%, 0,5% и 1%. Растворы стерильных LD-аминокислот вносили в среду до конечной концентрации 1,0 мг/мл. Растворы цитрата аммония и хлористого аммония стерилизовали при 1 атм и вносили в среду перед посевом до конечной концентрации 2-8 мМ.

Культивирование проводили при 30° на вибростенде, 200 об/мин. Соотношение объёма среды к объёму колбы составляло 1:5. Посевным материалом служила 12-18 часовая культура (1% v/v), выращенная на среде с добавлением 500 мкг/мл стрептомицина.

При исследовании влияния глюкозы на биосинтез поздних протеиназ вносили стерильный раствор глюкозы в опытные колбы в конечной концентрации 2% перед началом культивирования и в концентрации 1% на 34-й, 36-й и 38-й часы роста для глутамилэндопептидазы, и 36-й, 38-й и 40-й часы для субтилизиноподобной протеиназы. В течение 6 часов через каждые 2 часа из колб отбирали пробы для определения прироста биомассы и активности.

Количество свободных спор выражали в процентах по отношению к общему числу вегетативных и спорулирующих клеток (100%), подсчет которых проводили в режиме фазово-контрастной микроскопии (микроскоп Carl Zeiss Jena) при увеличении в 1600 раз в 5 - 10 полях зрения. В качестве инокулята использовали синхронную 50-часовую культуру.

Прирост биомассы измеряли нефелометрически на КФК-2 при длине волны 590 им. Количество биомассы выражали в единицах светопоглощения в кювете толщиной 1 см.

Продуктивность культуры в отношении синтеза протеиназ определяли как отношение величины протеолитической активности в культуральной жидкости к величине биомассы и выражали в условных единицах [Перт с со авт., 1980] или в процентах относительно контроля.

Для получения чистых ферментов культуральную жидкость освобождали от клеток центрифугированием в течение 60 минут при 3000 об/мин на центрифуге К-70 (Janetzki, Польша).

Белок и протеолитическая активность. Белок определяли спектрофотометрически, считая, что концентрация белка 1 мг/мл соответствует Агко = 1 оптической единице (оп. ед.) в кювете толщиной 1 см.

Определение протеолитической активности протеиназ проводили по гидролизу казеина [Каверзнева с соавт., 1971] и синтетических хромогенных субстратов [Мосолова с соавт., 1987].

За единицу казеинолитической активности принимали количество фермента, необходимое для образования 1 мкМ тирозина за 1 мин на 1 мл ферментного раствора.

Протеолитическую активность глутамилэндопептидазы определяли по гидролизу синтетического субстрата Z-Glu-pNa, активность субтилизиноподобной протеиназы определяли с помощью синтетического субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa.

За единицу активности ферментов по гидролизу синтетических субстратов принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1мкМ субстрата за 1 мин. За единицу активности ферментов, определяемых в культуральной жидкости, принимали количество фермента, гидролизующее 1нМ субстрата за 1 мин.

Продуктивность культуры определяли как отношение величины протеолитической активности к величине биомассы и выражали в условных единицах или процентах.

Поскольку синтетические полипептиды Z-Glu-pNa и Z-Ala-Ala-Leu-pNa являются специфическими субстратами для глутамилэндопептидаз и субтилизинов, соответственно, то их использовали для идентификации полученных после хроматографии на колонке MonoS белковых пиков.

Активность р-галактозидазы определяли в соответствии со стандартным методом, как описано ранее [Балабан с соавт, 2003].

За единицу активности принимали количество фермента, которое вызывало увеличение оптической плотности на одну оптическую единицу при 420 нм на 1 мл ферментного препарата за 1 час инкубации при 37°.

Для получения клеточного лизата клетки бактерий разрушали при 0е с помощью ультразвука (УЗДИ-IV 4.2) при частоте 22 кГц (15 раз по 30 сек). Затем в лизатах клеток определяли активность р-галактозидазы.

Выделение и очистка поздних протеиназ. Культурапьную жидкость В. intertnedius освобождали от клеток центрифугированием, доводили до рН 6,3, разводили водой в 10 раз и добавляли к КМ-целлюлозе, уравновешенной 0,02 M Na-ацетатным буфером, рН 6,3, перемешивали в течение 10 - 15 мин., отстаивали, надосадочную жидкость декантировали. Затем КМ-целлюлозу помещали в колонку (1,5 х 17 см), промывали уравновешивающим буфером и элюировали 0,2 M Na-ацетатным буфером, рН 6,3. Элюат разбавляли в 10 раз и наносили на колонку MonoS 5/5 в системе FPLC «Pharmacia», уравновешенную 0,015 M Na-ацетатным буфером, рН 6,3, содержащим 0,5 мМ СаСЬ. Элюцию проводили линейным градиентом (0-0,5М NaCl) в том же буфере со скоростью 1 мл/мин. Для получения хроматографически гомогенных препаратов белков проводили рехроматографию на колонке MonoS в тех же условиях. Полученные белки, активные по Z-Glu-pNa или Z-Ala-Ala-Leu-pNa, обессоливали на сефадексе G-25 и лиофильно высушивали [Остерман с соавт., 1985, Скоупс Р., 1985].

Физико-химические и кинетические свойства ферментов. Для определения степени чистоты препаратов ферментов и их молекулярной массы проводили электрофорез в 12,5%-ном ПААГ в присутствии 0,1% DS-Na по методу Лаэммли [Laemmli, 1970]. В качестве белков-маркеров использовали бычий сывороточный альбумин (67 кДа), овальбумин (43 кДа), ингибитор трипсина (20,1 кДа) и лизоцим (14,4кДа). Для определения констант Михаэлиса (Кт) использовали субстраты Z-Glu-pNa, а также субстрат Z-Ala-Ala-Leu-pNa, растворенный в 20% диметилформамиде (ДМФА) в концентрации 0,2 - 3,3 мМ. Начальные скорости гидролиза субстратов определяли на спектрофотометре при длине волны 400 нм и 20°; с временным интервалом равным 1 мин., считая молярный коэффициент поглощения для п-нитроанилина равным 8900 М 'см"1. Величину Кт определяли графически из зависимости l/[v] от 1/[S] [Ленинджер, 1985].

Изоэлектрические точки белков определяли методом изоэлекгро-фокусирования в 5% полиакриламидном геле в присутствии 2% амфолинов Biolyte 3/10 в мини-колонке 1EF Cell (Bio-Rad, США). Для калибровки колонки использовали коммерческий набор маркерных белков («Serva», Германия).

Влияние ингибиторов на активность ферментов. Влияние ингибиторов на активность ферментов определили, используя DFP, PMSF, TLCK, EDTA, о-фенангролин, бензамидин и HgCl2 в молярном соотношении фермент:ингибитор 1:100; р-СМВ в соотношении 1:130. Белковые ингибиторы: утиный овомукоид, соевый ингибитор трипсина, ингибитор из морской анемоны использовали в молярном соотношении 1:10. Ингибирование проводили в течение 1 часа, инкубируя пробы при 22°, после чего определяли остаточную активность по гидролизу синтетических хромогенных субстратов.

Энзиматические свойства ферментов. pH-Оптимум протеиназ определяли, используя в качестве субстратов казеин, Z-Glu-pNa и Z-AIa-Ala-Leu-pNa. Для казеина использовался буфер- 0,1 М трис-HCI буфер, pH 7,2 - 10,0; для синтетического хромогенного субстрата Z-Glu-pNa — 0,1 М трис-HCI буфер при значениях pH от 7,2 до 9,5; для субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa - 0,05М трис-HCI буфер при значениях pH 7,5 - 10,0.

pH-Стабильность ферментов определяли по гидролизу синтетических хромогенных субстратов в тех же условиях. Ферменты инкубировали в 0,1 М трис-HCI буфере при различных значениях pH (7,2 - 9,5) в течение 2 часов при комнатной температуре в присутствии и в отсутствие 0,5 мМ СаС12, после чего определяли активность по стандартной методике. В качестве контроля (100%) считали активность ферментов, полученную без предварительной инкубации.

Температурный оптимум ферментов также определяли по гидролизу синтетических хромогенных субстратов, инкубируя реакционную смесь при температурах от 22° до 65° в присутствии 0,5 мМ Ca и в его отсутствие.

При изучении термостабильности растворы ферментов инкубировали 2 часа при температурах 22° - 60° в присутствии и в отсутствие 0,5 мМ СаС12 и определяли активность для протеиназ по гидролизу синтетических субстратов. Контролем считали активность ферментов без предварительного прогрева.

Определение субстратной специфичности поздних протеиназ. Субстратную специфичность глутамилэндопептидазы определяли по гидролизу синтетических тетрапептидов Z-Ala-Ala-Met-Glu-pNa, Z-Ala-Ala-Trp-Glu-pNa, Z-Ala-Ala-Phe-Glu-pNa, Z-Ala-Ala-Leu-Glu-pNa, Z-Gly-Ala-Ala-Glu-pNa, Z-Ala-Ala-Trp-Asp-pNa, Z-Ala-Ala-Leu-Asp-pNa, Z-Ala-Ala-Phe-Asp-pNa, Z-Ala-Ala-Met-Asp-pNa, Z-Gly-Ala-Ala-Asp-pNa, а также Z-Glu-pNa [Люблинская с соавт., 1987]. Расщепление синтетических олигопептидов проводили в 0,025 М трис-HCI буфере, pH 8,5 при 37° в течение 30 минут. К растворам субстратов в концентрации 1 мг/мл в 0,025 М трис-HCI, pH 8,5 с 5 мМ СаС12 добавляли 10 мкл раствора фермента (1 мкг/мл) в том же буфере и инкубировали 4 часа при 37°. Высушенные гидролизаты разделяли в режиме FPLC на колонке (4,6x250 мм) Ultrasphere Octyl, используя линейный градиент вода - 70% ацетонитрила в присутствии 0,1% CF3COOH. Элюаты регистрировали при 215 и 280 нм и анализировали на аминокислотном анализаторе Hitachi 835 (Япония).

Определение аминокислотного состава и N-концевой последовательности ферментов. Аминокислотный состав протеиназ определяли после гидролиза 5,7 н HCl при 105° в течение 48 часов на аминокислотном анализаторе Hitachi 835 (Япония). Остатки полуцистина и метионина определяли после их окисления надмуравьиной кислотой, триптофан - после гидролиза белка метансульфоновой кислотой в присутствии 0,2%-ного триптамина. N-концевую последовательность глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы определяли по методу Эдмана в образцах, полученных после дополнительной очистки хроматографией на колонке (4,6x100 мм) Aquapore («Applied Biosystems», USA) в градиенте концентраций (15-16%) ацетонитрила с 0,1% трифлуороацетовой кислотой в течение 40 мин с помощью HPLC. Белки затем иммобилизовали на мембранах Immobilon Р и секвенировали на приборе Knauer-816 («Applied Biosystem» 120 А PIH, Analyzer One Line, USA).

Результаты и их обсуждение

Нами показано, что в поздней стационарной фазе роста клетки В. intermedius секретируют два протеолитических фермента: глутамилэндопептидазу с максимальной активностью на 40-й час роста и субтилизиноподобную протеиназу с максимальной активностью на 44 час (рис. 1).

56

часы роста

Рис. 1. Динамика роста и биосинтеза протеиназ Bacillus intermedius 1 - рост культуры (OD59o)» 2 - активность глутамилэндопептидазы (А(), 3 - активность субтилизиноподобной протеиназы (А)

Для отличия поздних ферментов от известных и хорошо изученных ферментов ранней стационарной фазы роста В. intermedius мы обозначили обнаруженные ферменты индексом 2.

С помощью биохимического маркера р-галактозидазы определяли целостность клеток в момент максимального накопления поздних протеиназ. Активность Р-галактозидазы в культуральной жидкости остается на низком уровне до 44 часа роста, а к 50 часу резко возрастает. При этом количество свободных спор достигает своего максимума на 56 - 60 час роста (80%). Следует отметить также, что максимальная активность поздних протеиназ соответствует поздним стадиям спорообразования (стадии У-УП) (рис. 2). Полученные результаты

свидетельствуют о целостности клеток в период накопления ферментов поздней стационарной фазы роста [Балабан с соавт., 2001].

200

0 II

IV - VI

VII

16

12

0

16 24 32 40 48 56

часы роста

Рис. 2. Динамика спорообразования и накопления р-галактозидазной активности В. ШегтесНия

1- рост культуры (СЮ590). 2 - количество спор, 3 - активность (3-галактозидазы в культуральной жидкости (АО, 4 - активность р-галактозидазы в лизатах клеток (А2)

I. Подбор компонентов питательной среды для максимальной продукции ферментов В. Ы1егте<1ш$

Синтез внеклеточных ферментов в значительной степени определяется составом среды культивирования [АсИпагауапа, Е11а1аЬ, 2002]. Мы подбирали оптимальное соотношение концентраций двух основных для максимальной продукции ферментов компонентов питательной среды - пептона и неорганического фосфата в двухфакторных экспериментах с последующим обсчетом результатов в программе «ВЮРТ». Было установлено, что оптимальные концентрации пептона и неорганического фосфата, необходимые для максимальной активности и продуктивности глутамилэндопептидазы 2, составляют 19 и 0,3 г/л соответственно, для максимальной активности и продуктивности субтилизиноподобной протеиназы 2 — 22 и 0,24 г/л, соответственно (рис.3). Полученные данные коррелируют с результатами для ранних белков В. Шеппе&иь, лишь для глутамилэндопептидазы 2 неорганического фосфата требуется больше, чем для глутамилэндопептидазы 1 (0,3 г/л против 0,2 г/л, соответственно) [Шакиров с соавт., 2000].

о.з

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 3D

22 28 30

Рис. 3. Влияние соотношения концентраций пептона и неорганического фосфата на накопление ферментов поздней фазы роста. За единицу принята максимальная активность протеиназы. А - глутамилэндопептидаза, Б - субтилизиноподобная протеиназа

Исследовали влияние на биосинтез глутамилэндопептидазы 2 и субтилизиноподобной протеиназы 2 В. intermedins ряда индивидуальных аминокислот - ароматической (триптофан), гидрофобных (аланин, валин и лейцин), а также лизина. Внесение в среду, содержащую пептон, индивидуальных аминокислот в концентрации 1 % вызывало интенсивный рост клеток В. intermedins, нр ингибировало синтез протеиназ поздней стационарной фазы роста. Аланин, лейцин, лизин и триптофан снижали продуктивность культуры в отношении синтеза глутамилэндопептидазы 2 на 45-50%, валин - на 20%. Наибольший .ингибиторный эффект для субтилизиноподобной протеиназы 2 наблюдался при внесении в среду культивирования 1% аланина и валина (до 40%). Исследование влияния ионов аммония в виде цитрата аммония на продукцию поздних протеиназ В. intermedius показало подавляющий эффект (до 30%) в отношении синтеза обоих ферментов. Наличие хлористого аммония в среде культивирования не влияло на продуктивность культуры. Похожие результаты получены при исследовании влияния индивидуальных аминокислот и солей аммония на продукцию ранних протеиназ В. intermedius [Ицкович с соавт., 1995; Шакиров с соавт., 2000]. Таким образо^,!, присутствие в среде аминокислот и ионов аммония подавляет синтез протеиназ В. intermedins по типу репрессии конечным продуктом, поэтому внесение их в среду культивирования нецелесообразно.

При исследовании влияния дрожжевого экстракта на биосинтез глутамилэндопептидазы 2 и субтилизиноподобной протеиназы 2 В. intermedius установлено, что при добавлении его в среду в концентрации 0,1-1,0% рост культуры не изменяется, а продуктивность культуры в отношении синтеза обеих протеиназ снижается по сравнению с контрольным вариантом. При дальнейшем увеличении концентрации дрожжевого экстракта в среде это снижение становится интенсивнее. Таким образом, внесение дрожжевого экстракта в среду для

биосинтеза протеиназ поздней стационарной фазы роста В. intermedins нецелесообразно. Такие же результаты получены для глутамилэндопептидазы 1, секретируемой в период вегетативного роста, тогда как для субтилизиноподобной протеиназы 1, секретируемой в начале стационарной фазы роста В. intermedins, показано увеличение активности фермента при внесении в среду 0,5% кукурузного экстракта [Ицкович с соавт., 1995].

Внесение в среду культивирования 0,1-1,0% желатина и казеина приводит к увеличению роста и к снижению удельной активности глутамилэндопептидазы 2. Подобные результаты получены и для глутамилэндопептидазы 1. Для субтилизиноподобной протеиназы 2 В. intermedins показано увеличение продуктивности культуры в отношении синтеза фермента на 40%. Таким образом, для максимального накопления субтилизиноподобной протеиназы 2 необходимо добавлять в питательную среду 0,1% казеина.

Исследовали влияние ионов двухвалентных металлов на биосинтез протеиназ поздней стационарной фазы роста В. intermedins. Для глутамилэндопептидазы 2 установлено, что в присутствии 5 мМ ионов Mg2+ и Са2+ увеличивается удельная активность на 13% и 20% соответственно, для субтилизиноподобной протеиназы 2 - 5 мМ Mg2+ и Са2+ увеличивают удельную активность на 30% и 10%, соответственно. Таким образом, для максимального накопления протеиназ В. intermedins поздней фазы роста необходимо вносить в питательную среду 5 мМ ионов Са2+ и Mg2+. Ранее были получены схожие данные о положительном влиянии ионов Mg2+ и Са2+ на биосинтез глутамилэндопептидазы 1 исходным штаммом В. intermedins и рекомбинантным штаммом В. subtilis [Габдрахманова с соавт., 2000].

Для выяснения влияния глюкозы на синтез сериновых протеиназ в поздней стационарной фазе роста культуры, в питательную среду добавляли 1% глюкозы на 34-40 часы роста В. intermedins. Показано, что уровень активности глутамилэндопептидазы 2 и субтилизиноподобной протеиназы 2 не понижается в присутствии глюкозы в течение 6 часов после внесения ее в питательную среду, то есть не происходит репрессии биосинтеза ферментов глюкозой. Из литературы известно, что глюкоза, внесенная в питательную среду перед началом культивирования, подавляет синтез протеолитических ферментов. Подобные результаты были получены и для глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы ранней стационарной фазы роста В. intermedins [Шакиров с соавт., 2000].

Определяли количество спор в культуральной жидкости В. intermedins в отсутствие глюкозы и при внесении ее в среду на 32 час, то есть перед появлением в культуральной жидкости поздних белков. Показано, что свободные споры появляются в контрольной среде и в среде с глюкозой на 38-40 часы роста культуры. В последующие часы культивирования увеличение количества свободных спор наблюдается на обеих средах, но на контрольной среде лизис клеток и освобождение спор идет интенсивнее, чем на среде с глюкозой. Полученные данные свидетельствуют, что процессы спорообразования и синтеза протеолитических ферментов на поздних стадиях развития культуры взаимосвязаны и не регулируются по механизму катаболитной репрессии [Шарипова с соавт., 2000]. По-видимому, на разных этапах развития культуры

происходит смена механизмов регуляции экспрессии поздних генов, которые активируются в период стационарного роста иным способом, чем в период вегетативного роста.

II. Выделение ферментов Bacillus intermedins поздней фазы роста и определение их свойств

Выделение и очистку сериновых протеиназ поздней стационарной фазы роста Bacillus intermedins 3-19 проводили с помощью ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе и высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке MonoS. После хроматографии на MonoS были получены две белковые фракции, которые по гидролизу синтетических хромогенных субстратов были идентифицированы как глутамилэндопептидаза и субтилизиноподобная протеиназа (рис. 4). Так как в результате одностадийной высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке MonoS препараты белков не были гомогенными, проводили рехроматографию в тех же условиях. За три стадии очистки получены препараты белков, чистота которых подтверждена электрофорезом в 12% ПААГ (рис. 5). Молекулярная масса глутамилэндопептидазы 2, определенная нами электрофоретически, равна 26,5 кДа, молекулярная масса, рассчитанная по аминокислотной последовательности, равна 23 кДа [Rebrikov et al., 1999]. Электрофорез препарата субтилизиноподобной протеиназы 2 показал наличие одного полипептида с молекулярной массой 28 кДа, что совпадает с молекулярной массой, рассчитанной по аминокислотной последовательности (27,5 кДа) [Sharipova et al, 2006]. Константа Михаэлиса глутамилэндопептидазы 2 равна 0,5 мМ, в то время как константа Михаэлиса глутамилэндопептидазы 1 В. intermedius равна 6 мМ [Leschinskaya et al., 1997]. Каталитическая константа глутамилэндопептидазы 2 из В. intermedius 3-19 - 81 сек"1. Константы Михаэлиса и Кках. субтилизиноподобной протеиназы 2 равны 0,0054 мМ и 16545 сек"1, соответственно. Константы Михаэлиса Ккат субтилизиноподобной протеиназы 1 равны 1,25 мМ и 0,15 сек'1, соответственно [Ицкович с соавт., 1997]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что гидролитические ферменты, секретируемые клетками Bacillus intermedius 3-19 в поздней стационарной фазе роста, значительно активнее связывают и расщепляют субстрат, чем протеиназы ранней стационарной фазы роста. Высокая протеолитическая активность субтилизиноподобной протеиназы 2, возможно, связана с её функциональной ролью на поздних стадиях спорообразования, когда клетка подвергается значительным физиологическим и морфологическим изменениям. Изоэлектрическая точка глутамилэндопептидазы 2 В. intermedius 3-19 равна 8,4 и соответствует изоэлектрической точке глутамилэндопептидазы 1.

Рис. 4. А. Хроматография протсиназ В. Ыегте&т наколонке МопоЯ

1 - протеиназа, активная по гидролизу субстрата 2-С1и-р^,

2 - протеиназа, активная по гидролизу субстрата 2-А1а-А1а-Ьси-рМ А;

Б. Рехроматография глутамилэндопептидазы В. Шегтесйш наколонке МопоБ; II Рехроматография субтилизиноподобной протеиназы 2 В. Шегтес/т наколонке МопоЯ I " А 2«)

И - градиент №С1 (0-0,5 М) в 15 мМ Ыа-ацетатном буфере р! 16,3, содержащем 0,5 мМ СаС1

«- 20,1

— 14,4

1 2 3

Рис. 5. Электрофорез внеклеточных щелочных протеиназ поздней стационарной фазы роста В. intermedins в ПААГ с DS-Na. 1 - субтилизиноподобная протеиназа;

2 - глутамилэндопептидаза; 3 - маркеры: бычий сывороточный альбумин (67 кДа), овальбумин (43 кДа), карбоксиангидраза (30 кДа), ингибитор трипсина (20,1 кДа), лизоцим (14,4 кДа)

Изоэлектрическая точка субтилизиноподобной протеиназы 2 соответствует рН 9,2 (табл.1).

Таблица 1

Физико-химические свойства поздних протеиназ В. intemiedius 3-19

Свойства Глутамилэндопептидаза Субтилизиноподобная протеиназа

Молекулярная масса (ЭФ), кДа 26,5 28

Изоэлектрическая точка 8,4 9,2

Оптимум рН по казеину по синт. субстрату 7,2 и 9,5 8,5 8,5 9,0

рН-стабильность по синт. субстрату 7,2-9,5 7,2 - 9,5

Оптимум температуры (Са2+) по синт. субстрату,0 55 55

Термостабильность (Са2+) по синт. субстрату,0 37-50 22 - 45

Глутамилэндопептидазы устойчивы к действию различных ингибиторов. Активность глутамилэндопептидазы 2 подавляется ингибитором сериновых протеиназ — DFP. Другой ингибитор сериновых протеиназ - PMSF - оказывает незначительное влияние на активность фермента. Глутамилэндопептидаза 2 не чувствительна к бензамидину, ЭДТА и белковым ингибиторам, р-СМВ незначительно инактивирует фермент. Похожие результаты получены для глутамилэндопептидазы 1 [Leschinskaya et al., 1997].

При изучении влияния ингибиторов на активность субтилизиноподобной протеиназы 2 было показано, что специфические ингибиторы сериновых протеиназ PMSF и DFP полностью ингибируют, а ингибиторы нейтральных протеиназ ЭДТА,

о-фенантролин и ТЛСК не влияют на активность фермента. р-СМВ уменьшает активность протеиназы на 25%. Природные белковые ингибиторы по-разному влияют на активность субтилизиноподобной протеиназы 2: утиный овомукоид снижает активность на 70%, соевый ингибитор трипсина - на 25%, а ингибитор из морской анемоны не влияет на активность фермента (табл. 2). Похожие результаты были получены ранее для субтилизиноподобной протеиназы 1, секретируемой в ранней стационарной фазе роста клетками В. тгегте<Ит.

Таблица 2

Влияние ингибиторов на активность сериновых протеиназ поздней стационарной

фазы роста В. intermedins

Ингибитор Молярное соотношение ферментгингибитор Остаточная активность глутамилэндопептидазы, % Остаточная активность субтилизиноподобной протеиназы, %

ррр 1:100 0 0

РМБР 1:100 84 0

ТЬСК 1:100 - 100

ЕЭТЛ 1:100 100 100

о-фенантролин 1:100 - 100

р-СМВ 1:130 82 75

1:100 - 32

Утиный овомукоид 1:10 100 30

Ингибитор из морской анемоны 1:10 100 100

Соевый ингибитор трипсина 1:10 100 75

Таким образом, результаты исследования влияния ингибиторов на активность ферментов подтвердили, что поздние протеиназы В. intermedins относятся к классу сериновых протеиназ.

По физико-химическим свойствам глутамилэндопептидаза 2 похожа на глутамилэндопептидазу 1 и на ферменты того же типа, выделенные из других источников. Глутамилэндопептидаза 2 имеет один рН оптимум при гидролизе синтетического субстрата (8,5) и два рН оптимума при гидролизе казеина (7,2 и 9,5). До сих пор наличие двух рН оптимумов при гидролизе природного субстрата не объяснено в литературе. Фермент рН стабилен в том же диапазоне, что и другие глутамилэндопептидазы (7,2 - 9,5) [Руденская, 1998].

Температурный оптимум глутамилэндопептидазы 2, определенный по гидролизу синтетического субстрата, в отсутствие ионов Са2+ равен 50°. В присутствии 5 мМ Са2+ температурный оптимум смещается к 55°. Для глутамилэндопептидазы 1 показано, что в отсутствие Са2+ равен 55°, в присутствии Са2+ он смещается к 65°, и при этом повышается активность на 30% [Leschinskaya et al., 1997]. Глутамилэндопептидаза 2, также как и глутамилэндопептидаза 1, не теряет своей активности в интервале температур 37 - 50° в присутствии ионов Са2+ после предварительного прогрева в течение двух часов. В отсутствие ионов Са2+ в этих условиях теряется 50% активности.

Субтилизиноподобная протеиназа 2 проявляет максимальную активность при рН 9,0 на синтетическом субстрате и на казеине - 8,5. Фермент стабилен в интервале рН 7,2 - 9,5. Температурный оптимум соответствует 55°, активность фермента сохраняется в интервале температур 22 - 45° при наличии ионов Са2+. Эти результаты полностью коррелируют с данными, полученными для других бациллярных ферментов [Степанов с соавт., 1980; Хайдарова с соавт., 1990].

Итак, наблюдаемые отклонения при сравнении энзиматических свойств ранних и поздних протеиназ практически не значительны.

Глутамилэндопептидаза при гидролизе синтетических тетрапептидов проявляет предпочтительную специфичность к связям, образованным остатками глутаминовой кислоты в положении Р1 по сравнению с остатками аспарагиновой кислоты. Кроме того, в положении Р2 наиболее предпочтительными являются связи, образованные остатками фенилаланина и метионина (табл. 3). Аналогичные результаты получены для глутамилэндопептидазы 1 В. intermedins. При исследовании специфичности протеаз из В. licheniformis, S. griseus и S. aureus также было показано, что ферменты гидролизовали связи Glu-Xaa в тысячу раз быстрее, чем связи Asp-Xaa [Breddam, Meldal, 1992].

Таблица 3

Гидролиз синтетических субстратов глутамилэндопептидазой В. intermedins

№ Субстрат Активность, ед/мг

1 Z-Ala-Ala- Met-Glu-pNA 1,62

2 Z-Ala-Ala-Trp-Glu-pNA 0,75

3 Z-Ala-Ala-Phe-Glu-pNA 1,86

4 Z-Ala-Ala-Leu-Glu-pNA 1,12

5 Z-Gly-Ala-Ala-Glu-pNA 1,12

6 Z-Glu-pNA 0,51

7 Z-Ala-Ala-Tip-Asp-pNA 0,03

8 Z-Ala-Ala-Leu-Asp-pNA 0,05

9 Z-Ala-Ala-Phe-Asp-pNA 0,02

10 Z- Ala-Ala-Met-Asp-pNA 0,05

11 Z-Gly-Ala-Ala-Asp-pNA 0,02

Субстратная специфичность глутамилэндопептидазы 2 по гидролизу белковых субстратов аналогична таковой для глутамилэндопегттидазы 1. Эти ферменты гидролизуют связи в А и В цепях окисленного инсулина не только по глутаминовой, но и по цистеиновой кислоте, которая образуется при окислении цистеина (рис. 6).

Определение субстратной специфичности субтилизиноподобной протеиназы 2 по расщеплению В цепи окисленного инсулина показало, что фермент обладает широкой субстратной специфичностью - после гидролиза обнаруживается большое количество различных белковых фрагментов, кроме того, гидролиз идет гораздо глубже, чем у других ранее описанных субтилизиноподобных белков. Субтилизиноподобная протеиназа 2 активно гидролизует связи, образованные карбоксильными группами гидрофобных аминокислот лейцина, фенилаланина и тирозина (Ьеи11-УаИ2, Ьеи15-Туг16, РЬе24-РЬе25 и т.д.), а также гидрофильных аминокислот - серина, цистеина, глутамина (рис. 7).

А-Цепьинсулина

БОзН 803Н

I I

С1УЕ0ССАУС5 LYQLENYCN

В. ШегтесИш 1 Т Т Т

т т т

В. МегтесНих 2

Б^теш Т Т Т

В-Цепь инсулина

аигеиз У8 I I

л. Бр >1 4

5. (Иегтоуи^агЬ 1 1

ад! <ю3п

I I

VNQHLCGSHLVEAL Y LVCGERGFFYTPKA

В.МегтесИш I Т Т Т Т

т т т т

В. Мегтеё'ш 2

В.зиЬПШ Т Т Т

Рис. 6. Гидролиз А и В -цепей окисленного инсулина глутамилэндо пептидазами различного происхождения

Для субтилизиноподобной протеиназы 1 получены похожие результаты. Таким образом, субстратная специфичность протеиназ поздней стационарной фазы роста В. ШегтесИш не меняется на разных стадиях роста культуры и биосинтеза ферментов.

Аминокислотный состав глутамилэндопептидазы 2 близок к таковому для глутамилэндопептидазы 1. Анализ аминокислотной последовательности также показал наличие двух полуцистинов [КеЬпкоу е1 а1., 1999]. И-концевая последовательность глутамилэндопептидазы 2 на протяжении десяти аминокислотных остатков полностью совпадает с глутамилэндопептидазой 1.

Определены аминокислотный состав и Ы-концевая последовательность субтилизиноподобной протеиназы 2. Молекула субтилизиноподобной протеиназы 2 состоит из 272 аминокислотных остатков и не содержит полуцистинов, что характерно для классических субтилизинов. Ы-концевые последовательности раннего и позднего ферментов на протяжении 10 аминокислот идентичны.

Таким образом, на основании сравнения физико-химических свойств протеиназ, синтезирующихся клетками В. ЫеппеШт в разные фазы развития культуры, влияния ингибиторов на активность ферментов, субстратной специфичности, аминокислотного состава и К-концевой последовательности можно заключить, что ферменты не полностью идентичны. Нами установлены различия в каталитических константах ранних и поздних протеиназ, причем ферменты поздней стационарной фазы роста активнее связывают и расщепляют субстрат по сравнению с ранними ферментами. Это можно объяснить тем, что на поздних стадиях роста, когда запас питательных веществ исчерпан, возрастает потребность в ферментах с высокой молекулярной активностью. Ы-концевые последовательности ранних и поздних ферментов идентичны, что предполагает идентичный фолдинг - то есть ранние и поздние белки являются продуктами экспрессии одного гена. В то же время выявленные различия в свойствах белков свидетельствуют о некоторых структурных отличиях. Учитывая идентичность Ы-концевых последовательностей ранних и поздних белков, можно предположить, что различия в свойствах ферментов обусловлены посттранскрипционной модификацией этих белков (ацетилированием, метилированием и др.).

Известно, что эукариотические клетки, а также клетки некоторых микроорганизмов, и в частности бацилл, способны к считыванию мРНК одного гена с различных промотеров [Егг^1оп, 1993; ЬоЬ е1 а1., 1999]. К тому же в поздней стационарной фазе происходит изменение экспрессии генов, связанное со сменой основных сигма-факторов транскрипции, что отчасти может объяснить выявленные различия в аминокислотном составе исследованных ферментов поздней стационарной фазы роста по сравнению с ранними белками. Также на этот процесс может оказывать влияние вариабельность задействованных в биосинтезе стартовых кодонов.

В-цепьинсулина

В. ШегтейЬк 1 ], 4 1114 4 11 11 111

В. ШегтесНия 2 114111111 111114 444

Б03Н 80,Н

I I

УКОНЬССвНЬУЕАЪУЬ УССЕНСРРУТРКА

ПротеипазаК

Тсрмитаза 14 Т II Т ТТТТ

Субтилизин BPN' Т Т Т Т Т Т Т

Аквализин Т Т Т I Т Т I Т Т

Рис. 7. Гидролиз В -цепи окисленного инсулина субтилизиноподобными протеиназами различного происхождения

Данные литературы свидетельствуют также о влиянии собственных антагонистических факторов, выделяемых микроорганизмами в фазе замедления роста, на транскрипцию мРНК, проявляющемся в посттранскрипционных изменениях аминокислотного состава белка, как это показано для То1урос1асИит ¿р. [Сазыкин и Навашин, 1991]. Не исключено, что бациллы также выделяют антагонистические факторы со сходным механизмом действия.

Основной вывод, на наш взгляд, заключается в том, что глутамилэндопептидаза и субтилизиноподобная протеиназа поздней стационарной фазы роста В. ШегтесНья претерпевают различные постгранскрипционные модификации.

Выводы

1. Подобран состав питательной среды для максимальной продукции протеиназ поздней стадии роста В. intermedius: для максимального выхода глутамилэндопептидазы среда культивирования должна содержать следующие компоненты (г/л): пептон - 19, неорганический фосфат - 0,3, СаС12 х 2Н20 -0,55, MgS04 х 7Н20 - 1,5, NaCl - 3,0; для субтилизиноподобной протеиназы (г/л): пептон - 22, неорганический фосфат - 0,24, СаС12 х 2НгО - 0,55, MgS04 х 7Н20 - 1,5, NaCl - 3,0, казеин - 1,0.

2. Из культуральной жидкости В. intermedius получены гомогенные препараты глутамилэндопептидазы 2 с удельной активностью 1,02 ед/А28о и выходом 19,6% и субтилизиноподобной протеиназы 2 с удельной активностью 25,9 ед/ А28о и выходом 11%.

3. Исследовано влияние ингибиторов на активность глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы. Показано, что исследуемые ферменты по типу ингибирования относятся к классу сериновых протеиназ.

4. Определены энзим этические и каталитические свойства белков. Показано, что по энзиматическим свойствам протеиназы В. intermedius поздней фазы роста похожи на ферменты начала стационарной фазы роста, тогда как каталитические характеристики ранних и поздних ферментов В. intermedius отличаются.

5. Субстратная специфичность протеиназ поздней стационарной фазы роста В. intermedius не меняется на разных стадиях роста культуры и биосинтеза ферментов.

6. Определены аминокислотные составы и N-концевые последовательности глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы поздней стадии роста В. intermedins. Установлена 100% гомология N-концевых последовательностей соответствующих ферментов в ранней и поздней стационарной фазе роста бактерий.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Балабан Н.П. Протеиназы Bacillus intermedins, секретируемые в поздней стационарной фазе роста / Н.П. Балабан, A.M. Марданова, М.Р. Шарипова, Л.А. Габдрахманова, Ю.С. Токмакова, Е.А. Соколова, И.Б. Лещинская //Вестник Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского, серия Биология. - 2001. - Вып.З. - С. 45-50.

2. Габдрахманова Л.А. Факторы среды, влияющие на продукцию глутамилэндопептидазы стрептомицин-устойчивых штаммов Bacillus intermedius 3-19 /Л.А. Габдрахманова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, Ю.С. Токмакова, Е.А. Соколова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 2002. - Т. 71. - №3. - С. 323-329.

3. Nelly P. Balaban, Proteinases from Bacillus intermedius secreted in the late stages of sporulation / Nelly P. Balaban, Leila A. Gabdrakhmanova, Margarita R. Sharipova, Evgeniya A. Sokolova, Galina N. Rudenskaya, Inna B. Leshchinskaya // Med Sci Monit. - 2002. - 8(5). - BR.168-171.

4. Балабан Н.П. Синтез и секреция протеиназ Bacillus intermedius на поздних стадиях спорообразования / Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, Л.А. Габдрахманова, A.M. Марданова, Ю.С. Токмакова, Е.А. Соколова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 2003. - Т. 72. - С. 338-342.

5. Балабан Н.П. Получение и характеристика глутамилэндопептидазы 2 Bacillus intermedius / Н.П. Балабан, А.М. Марданова, М.Р. Шарипова, Л.А. Габдрахманова, Е.А. Соколова, А.В. Гарусов, Е.И. Мильготина, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Биохимия. - 2003. - Т. 68. - С. 1514-1521.

6. Марданова A.M. Очистка и характеристика субтилизиноподобной сериновой протеиназы 2 Bacillus intermedius 3-19 / A.M. Марданова, М.Р. Шарипова, Л.А. Габдрахманова, Е.А. Соколова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Биохимия. - 2004. - Т. 69. - № 4. - С. 519-526.

7. Balaban N.P. Biosynthesis of serine proteinases of B.intermedius on the late stage of bacterial growth / L.A. Gabdrahkmanova, M.R. Sharipova, A.M., Mardanova, E.A. Sokolova, L.A. Malikova, I.B. Leshchinskaya // J. Basic Microbiol.- 2005. -V.44 - № 6. - P. 415-423.

8. Соколова E.A. Оптимизация выделения внеклеточных протеиназ Bacillus intermedius 3-19, секретируемых бактериями в поздней стационарной фазе роста / Е.А. Соколова, Т.Р. Шамсутдинов, Н.П. Балабан // Вестник Казанского государственного университета. Принята в печать в апреле 2006 г.

9. Соколова Е.А. Биосинтез глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius рекомбинантными штаммами Bacillus subtilis / Е.А. Соколова, И.Е. Вишняков, Л.А. Габдрахманова //I Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета. - Казань, 2000. - С. 91-92.

10. Соколова Е. А. Выделение и характеристика щелочной протеиназы Bacillus intermedius / Е.А. Соколова, Ю.С. Токмакова // Материалы XXXIX международной научной студенческой конференции «Студент и научно-

технический прогресс», посвященной 70-летию академика В.А. Коптюга. -Новосибирск, 2001. - С. 34-35.

11. Токмакова Ю.С. Протеиназы Bacillus intermedins 3-19, секретируемые в стационарной фазе роста / Ю.С. Токмакова, Е.А. Соколова, A.M. Марданова, Н.П. Балабан // XII Юбилейная конференция «Ферменты микроорганизмов». Сборник докладов. - Казань, 2001. - С. 61-62.

12. Соколова Е.А. Глутамилэндопептидазы Bacillus intermedins 3-19 поздней стационарной фазы роста / Е.А. Соколова, A.M. Марданова, Н.П. Балабан // И Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета. - Казань, 2001.-С. 86.

13. Яхъяев A.M. Влияние компонентов питательной среды на продукцию субтилизина, секретируемого Bacillus intermedins 3-19 на поздних стадиях спорообразования / A.M. Яхъяев, Е.А. Соколова, Н.П. Балабан // II Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета. — Казань,

2001.-С. 105.

14. Соколова Е.А. Выделение и характеристика внеклеточных субтилизинов Bacillus intermedins 3-19 поздней стационарной фазы роста / Е.А. Соколова, A.M. Яхъяев, A.M. Марданова, Н.П. Балабан // I Форум молодых ученых и специалистов республики Татарстан. - Казань, 2001. — С. 8.

15. Балабан Н.П. Секретируемые протеиназы Bacillus intermedins поздней стационарной фазы роста / Н.П. Балабан, A.M. Марданова, М.Р. Шарипова, JI.A. Габдрахманова, Е.А. Соколова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // V симпозиум по химии протеолитических ферментов: Тез. докл. и стенд, сообщ. - Москва, 2002. - С. 48.

16. Шарипова М.Р. Глутамилэндопептидазы Bacillus intermedins на разных фазах роста / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова, A.M. Марданова, Е.А. Соколова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // V симпозиум по химии протеолитических ферментов: Тез.докл и стенд, сообщ.- Москва,

2002. - С. 109.

17. Соколова Е.А. Субтилизины Bacillus intermedins поздней стационарной фазы роста / Е.А. Соколова, Н.П. Балабан // III Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета. - Казань, 2003 - С. 78.

18. Балабан Н.П. Получение и характеристика протеиназ Bacillus intermedins 319, секретируемых на поздних стадиях развития / Н.П. Балабан, A.M. Марданова, М.Р. Шарипова, Л.А. Габдрахманова, Е.А. Соколова, Г.Н. Руденская, Г.И. Эль-Регистан, И.Б. Лещинская // Тез. научн. докл. «III Съезд Биохимического общества». - Санкт-Петербург, 2002. - С. 593.

19. Соколова Е.А. Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedins поздней стационарной фазы роста / Е.А. Соколова, Н.П. Балабан // Сборник тезисов докладов итоговой научной студенческой конференции 2002 года. - Казань,

2003. - С. 15.

20. Evgeniya A. Sokolova Serine proteinases from Bacillus intermedins 3-19, secreted at the late stationary phase of bacterial growth / Evgeniya A. Sokolova,

Nelly P. Balaban, Leila A. Gabdrakhmanova, Margarita R. Sharipova, Inna B. Leshchinskaya.. // FEMS Congress of European Microbiologist «Bacillus-2003». -Ljubljania, Slovenia, 2003. - P. 17.

21. Рудакова Н.Л. Щелочные и нейтральные протеиназы Bacillus intermedins на поздних стадиях роста / Н.Л. Рудакова, Е.А. Соколова, Н.П. Балабан // Материалы XLII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» секция биология. - Новосибирск,

2004. - С. 33.

22. Рудакова Н.Л. Протеиназы Bacillus intermedins на поздних стадиях роста / Н.Л. Рудакова, Е.А. Соколова, Н.П. Балабан // IV научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ «Материалы и технологии XXI века, Тезисы докладов. - Казань, 2004. -С. 66.

23. Рудакова Н.Л. Влияние компонентов питательной среды на биосинтез нейтральной протеиназы рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis JB 20-36 (met) / Н.Л. Рудакова, E.A. Соколова // Сборник тезисов 9-й международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». -Пущино, 2005. - С. 210.

24. Зайнетдинова А.Х. Влияние экзогенных факторов на продукцию глутамилэндопептидазы Bacillus cereus / А.Х. Зайнетдинова, Е.А. Соколова, Л.А. Габдрахманова // Тезисы Всероссийской молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». - Москва,

2005. - С. 26 - 27.

Факс Казанского государственного университета (843) 292-26-43

Подписано в печать 10.10.2006 г. Форм. 60 х 84 1/16. Гарнитура «Тайме». Печать ризографическая. Печ.л. 1,5. Тираж 100. Заказ 394.

Лаборатория оперативной полиграфии УМУ КГУ 420045 Казань, Кр. Позиция, 2а Тел. 272-22-54

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соколова, Евгения Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Протеолитические ферменты микроорганизмов

1. Принципы классификации протеолитических ферментов

2. Сериновые протеиназы

3. Характеристика химотрипсиноподобных протеиназ

4. Глутамилэндонептидазы - новое подсемейство химотрипсиноподобных протеиназ микроорганизмов

4.1. Физико-химические свойства глутамилэндопептидаз

4.2. Аминокислотная последовательность и пространственная структура глутамилэндопептидаз

4.3. Роль аминокислот гистидиновой триады в первичной специфической активности глутамилэндопептидаз

4.4. Субстратная специфичность глутамилэндопептидаз

5. Характеристика субтилизинов и субтилизиноподобных протеиназ

5.1. Физико-химические свойства протеиназ

5.2. Субстратная специфичность субтилизинов

5.3. Аминикислотная последовательность и пространственная структура ферментов

5.4. Строение активного центра и механизм действия субтилизинов

5.5. Стабильность субтилизинов

6. Эволюция сериновых протеиназ 41 И. Функциональная роль протеиназ бацилл

1. Множественность функций протеолитических ферментов

2. Локализация протеолитических ферментов в клетке

3. Связь секрстируемых протеиназ бацилл и физиологии клетки в стационарной фазе

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и характеристика протеиназ поздней фазы роста Bacillus intermedius 3-19"

Актуальность проблемы: Протеолитические ферменты представляют собой уникальную группу биологических катализаторов. Функции этих ферментов разнообразны - они принимают участие в процессах катаболизма, посттрансляционном процессинге белков, задействованы в процессах эмбриогенеза эукариот. Выявленная в последние годы способность микробных протеиназ к осуществлению реакции селективного протеолиза таких белков крови человека, как фибрин, плазминоген и протеин С, определяет перспективность использования этих ферментов для коррекции гемостаза человека при профилактике, диагностике и лечении атеросклероза и таких его последствий, как тромботические состояния. Важным свойством протеиназ является их способность к ферментативному синтезу олигопептидов, что перспективно для получения биологически активных соединений и лекарственных препаратов. В настоящее время с помощью этого метода получают аспартам (искуственное подслащивающее вещество).

Одной из наиболее интересных групп класса протеолитических ферментов являются сериновые протеиназы бацилл. В стационарной фазе роста бациллы секретируют сериновые и нейтральные протеиназы, которые играют определенную роль в адаптационных процессах и, в частности, в спорообразовании. Показано, что сериновые протеиназы принимают непосредственное участие в процессе синтеза споровой оболочки и прорастании спор. Так, протеиназа TesA, секретирующаяся в среду спорулирующими клетками Bacillus subtilis, вовлекается в построение оболочки споры [Serrano et al., 1999]. Обнаружено, что продукт гена clpP представляет собой протеиназу, играющую важную роль в период стационарной фазы роста Bacillus subtilis. Этот белок является определяющим для роста клеток в условиях теплового шока [Msadek et al., 1988]. Неослабевающий интерес к этим белкам обусловлен также широтой практического применения. Выход целевого продукта у бацилл может быть существенно повышен за счет направленного воздействия на условия роста, использования штаммов с нарушениями систем регуляции, либо модификацией гена. На основе протеиназ бацилл конструируются каталитические антитела с протеолитической активностью. Выделены протеиназы бацилл, обладающие фибринолитическими и тромболитическими свойствами. В связи с ростом числа тромбических заболеваний, актуальным является поиск новых эффективных протеолитических ферментов, обладающих высокой активностью, специфичностью и низкой токсичностью. Одной из подгрупп сериновых протеиназ являются глутамилэндопептидазы, обладающие узкой специфичностью, поэтому они являются высокоточными "инструментами" для фрагментации белковых молекул при исследовании их первичной структуры, а также удобными моделями для конструирования белков с заданными свойствами.

Ранее сотрудниками нашей лаборатории были выделены и охарактеризованы протеолитические белки поздней логарифмической фазы роста В. intermedins. Целыо настоящей работы явилось изучение биосинтеза, получение глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы В. intermedius, секретируемых в поздней стационарной фазе роста бактерий и изучение свойств этих ферментов.

В работе решались следующие задачи:

1. Исследование влияния экзогенных факторов питательной среды на накопление внеклеточных протеиназ В. intermedius в стационарной фазе роста бактерий.

2. Выделение из культуральной жидкости В. intermedius гомогенных препаратов протеиназ и их идентификация.

3. Исследование влияния ингибиторов на активность ферментов.

4. Определение энзиматических и каталитических свойств ферментов.

5. Определение субстратной специфичности глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной сериновой протеиназы.

6. Установление аминокислотного состава и Ы-концевой последовательности протеиназ В. ШегтесНш.

Научная новизна: Установлено, что бактерии В. ШегтесНш 3-19 активно синтезируют и секретируют протеолитические ферменты в течение всей стационарной фазы роста. Впервые из культуральной жидкости В. ШегтесНш 3-19 в поздней стационарной фазе роста выделены глутамилэндопептидаза и субтилизиноподобная протеиназа. Установлены условия биосинтеза обоих ферментов и подобран состав питательной среды для максимального синтеза этих протеиназ. Получены приоритетные данные, свидетельствующие о том, что каталитические характеристики Кт и кса1 ранних и поздних протеиназ различны, тогда как энзиматические и физико-химические свойства схожи. Установлены ГчГ-концевые последовательности аминокислот для глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы поздней стационарной фазы раста и показано, что они идентичны ранним ферментам.

Практическая значимость результатов: Полученные в работе результаты позволяют использовать штамм В. ШегтесНшЗ-19 как эффективный продуцент протеолитических ферментов. Подобраны оптимальные питательные среды для получения глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы поздней стационарной фазы роста. Разработаны методы очистки поздних белков. Получение гомогенных препаратов ферментов увеличивает арсенал белков, используемых в научных исследованиях и в практических целях. Результаты исследования свойств ферментов поздней стационарной фазы роста позволит расширить наши представления о сериновых протеиназах, в частности, о субтилизиноподобных протеиназах и об особой подгруппе ферментов -глутамилэндопептидазах.

Связь работы с научнимы программами и собственный вклад автора в исследования: Научные исследования поддержаны грантами РФФИ 01-0448037, 05-04-48182а, АНТ 03.3.10-11, 03.3.10-295 и грантом Программы CRDF REC 007. Авторские исследования получили персональную поддержку Правительства Российской Федерации (2002 г) и были удостоины специальной медали Российской академии наук с премиями для молодых ученых РАН (2003 г.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Впервые обнаружены, выделены и охарактеризованы протеолитические ферменты (глутамилэндопептидаза и субтилизиноподобная протеиназа) поздней стационарной фазы роста В. intermedins 3-19.

2. Ферменты ранней и поздней фазы роста В. intermedins 3-19 имеют определенные различия в каталитических характеристиках, а именно, различаются по константе Михаэлиса и каталитической константе.

3. Идентичные аминокислотные последовательности N-концов глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы ранней и поздней фаз роста В. intermedins 3-19 позволяют считать эти ферменты продуктами одного гена, а различия в каталитических характеристиках связать с возможной посттранскрипционной модификацией белков В. intermedins 3-19.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и региональных конференциях: 9-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005г.), итоговых научных конференциях Казанского Государственного Университета (2002г. - 2004г.), Материалы XL1I международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» секция биология (Новосибирск, 2004), FEMS Congress of European Microbiologist "Bacillus-2003" (Ljubljania, Slovenia, 2003), на V симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Москва, 2002), "III Съезд

Биохимического общества" (Санкт-Петербург, 2002), а также на семинарах кафедры микробиологии и Института Биологии Казанского Государственного Университета.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 22 научных работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, включает 5 таблиц, 24 рисунка. Библиография содержит 147 наименований российских и зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Соколова, Евгения Александровна

выводы

1. Подобран состав питательной среды для максимальной продукции протеиназ поздней стадии роста В. intermedins: для максимального выхода глутамилэндопептидазы среда культивирования должна содержать следующие компоненты (г/л): пептон - 19, неорганичесий фосфат - 0,3, СаС12 х 2Н20 - 0,55, MgS04 х 7Н20 - 1,5, NaCl - 3,0; для субтилизиноподобной протеиназы (г/л): пептон - 22, неорганический фосфат - 0,24, СаС12 х 2Н20 - 0,55, MgS04 х 7Н20 - 1,5, NaCl - 3,0, казеина - 1,0.

2. Из культуралыюй жидкости В. intermedins получены гомогенные препараты глутамилэндопептидазы 2 с удельной активностью 1,02 ед/А280 и выходом 19,6% и субтилизиноподобной протеиназы 2 с удельной активностью 25,9 ед/ A2go и выходом 11%.

3. Исследовано влияние ингибиторов на активность глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы. Показано, что исследуемые ферменты по типу ингибирования можно отнести к классу бациллярных сериновых протеиназ.

4. Определены энзиматические и каталитические свойства белков. Показано, что по энзиматическим свойствам протеиназы В. intermedins поздней фазы роста похожи на ферменты начала стационарной фазы роста, тогда как каталитические характеристики (Km и ксгЛ) ранних и поздних ферментов)?, intermedins отличаются.

5. Субстратная специфичность протеиназ поздней стационарной фазы роста В. intermedins не меняется на разных стадиях роста культуры и биосинтеза ферментов.

6. Определены аминокислотные составы и N-концевые последовательности глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы поздней стадии роста В. intermedins. Установлена 100% гомология N-концевых последовательностей соответствующих ферментов в ранней и поздней стационарной фазе роста бактерий.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю кандидату биологических наук Н.П. Балабан; благодарит доктора химических наук Г.Н. Руденскую (МГУ им. Ломоносова) за возможность определения каталитических и энзиматических свойств ферментов на базе её лаборатории; доктора биологических наук О.Н. Ильинскую и кандидата биологических наук Л.А. Габдрахманову за поддержку и помощь в обсуждении результатов; доктора биологических наук М.Р. Шарипову за внимательное отношение к работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколова, Евгения Александровна, Казань

1. Балабан Н.П. Выделение и характеристика глутамилэндопептидазы 2 Bacillus intermedius / Н.П. Балабан, А.М. Марданова, М.Р. Шарипова и др. // Биохимия. 2003. - Т. 68. - № 11. - С. 1514 - 1521.

2. Безбородов А.М. Секреция ферментов у микроорганизмов / А.М. Безбородов, Н.И. Астапович. М.: Наука, 1984. - 58 с.

3. Габдрахманова JI.A. Среда для биосинтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / Л.А. Габдрахманова, Е.В. Шакиров, Н.П. Балабан и др. // Микробиология. -2000. Т. 69. - № 5. - С. 653-659.

4. Габдрахманова Л.А. Оптимизация среды культивирования для продукции глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius 3-19 / Л.А. Габдрахманова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова и др. // Микробиология. 2002. - Т. 71. - № 3. - С. 323-329.

5. Гололобов М.Ю. Влияние температуры и рН на стабильность и каталитическую активность сериновой протеиназы Bacillus subtilis шт. 72 / М.Ю. Гололобов, И.П. Морозова, В.М. Степанов и др. // Биохимия. -1991.-Т. 56. № 1. - С. 33-40.

6. Демидюк И.В. Выделение и характеристика сериновой протеиназы из Thermoactinomyces species, относящейся к группе Glu, Aspспецифичных ферментов / И.В. Демидюк, Е.А. Носовская, H.A. Цаплина и др. // Биохимия. 1997. - Т. 62. - № 2. - С. 171-175.

7. Демидюк И.В. Про-зависимый фолдинг микробных протеолитических ферментов / И.В. Демидюк, М.В. Заболотская, Н.С. Велишаева и др. // Мол. ген. микробн. вирусол. -2003. Т. 4. - С. 11-15.

8. Добржанская Е.О. К вопросу о регуляции синтеза щелочной протеазы у Bacillus subtilis А-50 / Е.О. Добржанская, Л.И. Ерохина // Генетика. -1975.-Т. П.-№7.-С. 135-143.

9. Дунаевский Я.Е. Влияние состава среды на количественный и качественный состав внеклеточних протеиназ микромицетов / Я.Е. Дунаевский, Т.Н. Грубань, Г.А. Белякова и др. // Микробиология. -1999. Т. 68. - № 3. - С. 324-329.

10. Знаменская Л.В. Биосинтез внеклеточных ферментов Bacillus intermedius / Л.В. Знаменская, Е.Р. Ромахина, C.B. Филатова и др. // Микробиология. 1986. - Т. 56. - № 3. - С.449-454.

11. Иваница В.А. Влияние аминокислот как единственного источника азота на биосинтез экзопротеаз Aspergillus Candidus / В.А. Иваница, Н.С. Егоров, М.А. Аль-Нури // Микробиология. 1978. - Т. 47. - № 3. -С. 424-429.

12. Ицкович Е.Л. Биосинтез внеклеточной щелочной протеиназы Bacillus intermedius / Е.Л. Ицкович, Л.В. Знаменская, Н.П. Балабан и др. // Микробиология. 1995. - Т.64. - № 5. - С. 623-629.

13. Ицкович Е.Л. Энзиматические свойства тиолзависимой сериновой протеиназы Bacillus intermedius 3-19 / Е.Л. Ицкович, Н.П. Балабан, A.M. Марданова и др. //Биохимия. 1997. - Т. 62. -№ 1. - С. 49-53.

14. Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности комплексных препаратов протеаз / Е.Д. Каверзнева // Прикл. биохимия и микробиология. 1971. - Т. 7. - № 2. - С.

15. Казанская Н.Ф. О строении активного центра субтилизина 72 / Н.Ф. Казанская, O.A. Кост // Биохимия. 1982. - Т. 46. - № 5. - С. 834-841.

16. Кириллова Ю.М. Условия роста культуры и биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / Ю.М. Кириллова, Е.О. Михайлова, Н.П. Балабан и др. // Микробиология. 2000. - Т. 73. - № 1. -С. 76-84.

17. Колев Д.А. Репрессия синтеза у штамма 90-11-формы Bacillus mesentericus аминокислотами / Д.А. Колев // Микробиология. 1986. -Т. 55,-№4.-С. 295-300.

18. Краснов С.И. Комплекс программ ВЮРТ для оптимизации в биологических исследованиях / С.И. Краснов, JI.B. Знаменская // Биол. науки.- 1992.-№2.-С. 15-18.

19. Лениджер А. Основы биохимии / А. Лениджер. М.: Мир, 1985 - 365 с.

20. Люблинская Л. А. П-нитроанилиды пироглутамилпептидов -хромогенные субстраты сериновых протеиназ /Л.А. Люблинская, И. Хайду, Г.Н. Баландина// Биоорг. химия. -1987. -Т. 13. -№ 6.-С.748-753.

21. Максимов В.Н. Многофакторный эксперимент в биологии / В.Н. Максимов. М.: Изд-во МГУ, 1980. - 280 с.

22. Мосолова О.В. Glu, Asp специфическая протеиназа актиномицетов / О.В. Мосолова, Г.Н. Руденская, В.М. Степанов и др. // Биохимия. -1987.-Т. 52.-№3.-С. 414-422.

23. Новикова Т.М. Внеклеточная протеаза Bacillus alvei 5-724 / Т.М. Новикова, С.Н. Выборных, Н.С. Егоров и др. // Прикл. биохимия и микробиология. 1986. - Т. 22. - № 6. - С. 772-777.

24. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л.А. Остерман. М.: Наука, 1985. - 536 с.

25. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С.Д. Перт. -М.: Мир, 1980.-331 с.

26. Руденская Г.Н. Сериновая протеиназа архебактерии Halobacterium mediterranei аналог субтилизина эубактерий / Г.Н. Руденская, Л.П. Ревина, Ю.Б. Грязнова // Биохимия. -1992. -Т.57. - № 8. - С. 1230-1241.

27. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизинов / Г.Н. Руденская // Биоорган, химия. 1994. - Т. 20. - № 5. - С. 475-484.

28. Руденская Г.Н. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ / Г.Н. Руденская // Биоорган, химия. - 1998. - Т. 24. - № 4. - С.256 - 251.

29. Сазыкин 10.0. Антибиотики и оболочка бактериальной клетки / 10.0. Садыкин, П.С. Навашин // Итоги Науки и Техники, Серия «Биотехнология». 1991.-С. 182-183.

30. Сафонова М.Е. Особенности роста и продукции внеклеточных протеиназ Lactobacillus plantarum ИМ-9/138 / М.Е. Сафонова, Н.И. Астапович, И.А. Буряко // Микробиология. 1999. - Т.68. - № 4. - С. 396-403.

31. Серкина А.В. Структура и функции предшественников бактериальных протеиназ / А.В. Серкина, А.Б. Шевелев, Г.Г. Честухина // Биоорганическая химия. -2001. Т. 27. - № 5. - С. 323-346.

32. Скоупс Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. М.: Мир, 1985. - 358 с.

33. Степанов В.М. Сериновая протеиназа из Thermoactinomyces vulgaris INMI-4a / В.М. Степанов, Г.Н. Руденская, Н.Г. Нестерова и др. // Биохимия.- 1980.-Т.45.-Ж 10.-С. 1871-1880.

34. Степанов В.М. Сериновая протеиназа II из Acremonium chrysogenium / В.М. Степанов, Г.Н. Руденская, Л.И. Васильева и др. // Биохимия. -1986. Т. 51. - № 9. - С. 1476-1483.

35. Сурова И.А. Первичная структура внутриклеточной сериновой протеиназы Bacillus amyloliquefaciens II. Аминокислотная последовательность пептидов / И.А. Сурова и др. // Биохимия. 1994. -Т. 59.-С. 1290-1301.

36. Тепляков A.B. Кристаллическая структура термитазы и стабильность субтилизинов / A.B. Тепляков, И.П. Куранова, Э.Г. Арутюнян и др. // Биоорганическая химия. 1990. - Т. 16. - № 14. - С. 437-447.

37. Хайдарова Н.В. Glu, Asp-специфичная протеиназа из Streptomyces thermovulgaris / H.B. Хайдарова, Г.Н. Руденская, Л.П. Ревина и др. // Биохимия. 1989. - Т. 54. - С. 46-52.

38. Хайдарова Н.В. Тиолзависимая сериновая протеиназа Streptomyces thermovulgaris / Н.В. Хайдарова, Г.Н. Руденская, Л.П. Ревина и др. // Биохимия. 1990. - Т. 55. - № 6. - С. 1110-1118.

39. Честухина Г.Г. Внеклеточные сериновые протеиназы подвидов Bacillus thuringiensis эволюционируют существенно медленнее соответствующих ô-эндотоксинов / Г.Г. Честухина, О.П. Загнитько, Л.П. Ревина и др.//Биохимия. 1985.-Т.50.-№ 10.-С. 1724-1731.

40. Шагинян К.А. Сериновая протеиназа высших базидиомицетов Coprinus genus / К.А. Шагинян, И.А. Алехина, Н.П. Денисова // Биохимия. -1990.-Т. 55- №8. -С. 1387-1395.

41. Шакиров Е.В. Влияние компонентов питательной среды на накопление глутамилэндопептидазы в культуралыюй жидкости Bacillus intermedins3.19 / Е.В. Шакиров, JI.A. Габдрахманова, Н.П. Балабан и др. // Микробиология. 2000. - Т. 69. - № 1. - С. 29-33.

42. Шарипова М.Р. Локализация протеолитических ферментов в клетках Bacillus intermedins / М.Р. Шарипова, Е.В. Шакиров, Н.П. Балабан и др. // Микробиология. 2000. - Т. 69. - № 5. - С. 660-667.

43. Шарипова М.Р. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedins / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова и др. // Микробиология. 2002. - Т. 71. - № 4. - С. 494499.

44. Шлегель Г. Общая микробиология / Г. Шлегель. М.: Мир, 1987. - С. 76-79.

45. Adinarayana К. Response surface optimization of the critical medium components for the production of alkaline protease by a newly isolated Bacillus sp. / K. Adinarayana, P. Ellaiah // J. Pharm. Pharmaceut Sci. -2002. V. 5. - № 3. - P. 272-278.

46. Andreeva N.S. Analysis of crystal structures of aspartic proteinases: On the role of amino acid residues adjacent to the catalytic site of pepsin-like enzymes / N.A. Andreeva, L.D. Rumsh // Protein Science. 2001. - V. 10. -P. 2439-2450.

47. Andreeva N.A. Is histoaspartic protease a serine protease with a pepsin-like fold? / N.A. Andreeva, P. Bogdanivich, I. Kashparov et al. // Proteins: Structure, Function and Bioformatics. 2004. - V. 55. - P. 705-710.

48. Aronson A.J. Regulation of extracellular protease production in Bacillus cereus T. Characterization of mutants producing altered amounts of protease / A.J. Aronson, N. Angelo, S.C. Holt // J. Bacterid. 1971. - V. 106. - P. 1016-1017.

49. Bachovchin W.W. Confirmation of the assignment of the low-field proton resonans of serine proteases by using specifically nitrogen-15 labeled enzyme / W.W. Bachovchin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 82. -P. 7948-7951.

50. Barinka C. Amino acid at the N- and C-termini of human glutamate carboxypeptidase II are required for enzymatic activity and proper folding / C. Barinka, P. Mlcochova, P. Sacha et al. // Eur. J. Biochem. 2004. - V. 271.-№ 13.-P. 2782-2790.

51. Barrett A.J. Families and clans of serine peptidases / A.J. Barret, R.D. Rawlings // Arch. Biochem. Biophys. 1995. - V. 318. - P.247-250.

52. Banerjee A. Induction of secretory acid proteinase in Candida albicans / A. Banerjee, K. Ganesan, A. Datta // J. Gen. Microbiology. 1991. - V. 137. -P. 2455-2461.

53. Betzel C. Termitase and proteinase K: a comparison of the refined three-dimensional structures of the native enzymes / C. Betzel, A.V. Teplyakov, E.H. Harutyunyann et al. // Protein Engineering. 1990. - V. 3. - № 3. - P. 161-172.

54. Betzel C. Crystal structure of the alkaline proteases Savinase and Esperase from Bacillus lentus / C.Betzel, S. Klupsch, S. Branner et al. // Adv. Exp. Med. Biol. 1996. - V. 379. - P. 49-61

55. Bott R. Structural changes leading to increased enzymatic activity in an engineered variant of Bacillus lentus subtilisin / R. Bott, J. Dauberman, L. Wilson et al. // Adv. Exp. Med. Biol. 1996. - № 379. - P. 277-283.

56. Breddam K. Substrate preferences of glutamic-acid-specific endopeptidases assessed by synthetic peptide substrates based on intramolecularfluorescence quenching / K. Breddam, M. Meldal // Eur. J. Biochem. -1992. -V. 206. № 1. -P.103-107.

57. Bruinenberg P.G. Evidence for a large dispensable segment in the subtilisin-like catalytic domain of the Lactococcus lactis cell-envelope proteinase / P.G. Bruinenberg, P. Doesburg, A.C. Alting et al. // Protein Eng. 1994. -V. 7.-P. 991-996.

58. Carmona C. Nucleotide sequence of the serine protease gene of Staphilococcus aureus, strain V8 / C. Carmona, G.L. Gray // Nucleic Acids Research. 1987. - V. 15. - № 16. - P. 57-67.

59. Craik C.S. The catalylic role of the active site aspartic acid in serine proteases / C.S. Craik, S. Roczniak, C. Largman et al. // Science. 1987. -V. 237.-№4817.-P. 909-913.

60. Czapinska H. Structural and energetic determinants of the SI-site specificity in serine proteases / H. Czapinska, J. Otlewski // Eur. J. Biochem. 1999. -V. 260.-№3.-P. 571-595.

61. Delorme V.G. A matrix metalloproteinase gene is expressed at the boundary of senescence and programmed cell death in cucumber // V.G. Delorme, P.F. McCabe, D.J. Kim et al. // Plant Physiol. 2000. - V. 123. - № 3. - P. 917-27.

62. Demidyuk I.V. On the functional organization of glutamyl endopeptidases / I.V. Demidyuk, S.V. Kostrov // Mol. Biol. (Moscow). 1999. - V. 33. - P. 84-88.

63. Demidyuk I.V. Modification of substrate-binding site of glutamyl endopeptidase from Bacillus intermedius / I.V. Demidyuk, D.V. Romanova, E.A. Nosovskaya et al. // Protein Eng Des Sei. 2004. - V. 17. - № 5. - P. 411-416.

64. Drapeau G.R. Purification and properties of an extracellular protease of Staphylococcus aureus / G.R. Drapeau, Y. Boily, J.J. Houmard // J. Biol. Chem. 1972. - V.247. - № 20. - P. 6720-6726

65. Drapeau G.R. The primary structure of staphylococcal protease / G.R. Drapeau // Can. J. Biochem. 1978. - V.56. - № 6. - P.534-544.

66. Eder J. Hydrolysis of small peptide substrates parallels binding of chymotrypsin inhibitor 2 for mutants of subtilisin BPN' / J. Eder, M. Rheinnecker, A.R. Fersht // FEBS Lett.- 1993. V.335. - № 3. - P 349-352.

67. Eijsink V.G. Improving the thermostability of the neutral protease of Bacillus stearothermophilus by replacing a buried asparagine by leucine / V.G. Eijsink, J.R. van der Zee, B. van den Burg et al. // FEBS Lett. 1991. -V. 282.-№ l.-P. 13-6.

68. Errington J. Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expressionand control of morphogenesia / J. Errington // Microbiol. Rev. 1993. - V. 57. -P.1-33.

69. Fersht A. Enzyme structure and mechanism / A. Fersht, W.H. Freeman // San Francisco, CA.- 1984.

70. Fujivara N. Purification and properties of the highly thermostable alkaline protease from an alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp. / N. Fujivara, A. Masui, T. Imanaka et al. // J. Biotechnol. 1993. - V. 30. - № 2. - P. 245256.

71. Gabdrakhmanova L.A. Biosynthesis and localization of glutamylendopeptidase of Bacillus intermedius 3-19 / L.A. Gabdrakhmanova, E.V. Shakirov, N.P. Balabanet al. // Microbios. 1999. -V. 100.-P. 97-108.

72. Gabdrakhmanova L. Salt stress induction of glutamyl endopeptidase biosynthesis in Bacillus intermedius / L. Gabdrakhmanova, I. Vishniakov, M. Sharipova, N. Balaban, S. Kostrov, I. Leshchinskaya // Microbiol. Res. -2005. V. 160. - № 3. - P. 233-242.

73. Gros P. Calcium binding to thermitase / P. Gros, K.H. Kalk, W.C.J. Hoi // J. of Biological Chemistry. 1991. - V. 266. - № 5. - P. 2953-2961.

74. Hamilton J.M. Ara subtilisin-like protease from Arabidopsis thaliana: purification, substrate specificity and tissue localization / J.M. Hamilton,

75. D.J. Simpson, S.C. Hyman et al. // Biochem. J. 2003. - V. 370. - № 1. - P. 57-67.

76. Heringa J. Three-demensional domain duplication, swapping and stealing / J. Heringa, W.R. Taylor // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. - V.7. - P. 416421.

77. Imanaka T. A new way of enchancing the thermostability of proteases / T. Imanaka, M. Shibazaki, M. Takagi // Nature. 1986. - V. 324. - P. 695-698.

78. Johansen J.T. The degradation of the B-chain of oxidized insulin by two subtilisins and their succinnylated and N-carbamylated derivatives / J.T. Johansen, M. Ottesen, I. Svendsen et al. // CR Lab. Carlsberg. 1968. - V. 36.-P. 365-384.

79. Kim H.J. Complex Regulation of the Bacillus subtilis Aconitase Gene / H.J. Kim, S.I. Kim, M. Ratnayake-Lecamwasam et al. // J. Bacteriol. 2003. -V. 185.-№5.-P. 1672-1680.

80. Kitadokoro K. Purification, characterization and molecular cloning of an acidic amino acid-specific proteinase from Streptomyces fradiae ATCC 14544 / K. Kitadokoro, E. Nakamura, M. Tamaki et al. // Biochim. Biophys.- 1993.-V. 1163.-P. 149-157.

81. Koide A. ScoC regulates peptide transport and sporulation initiation in Bacillus subtilis / A. Koide, M. Perego, Y.A. Hoch // J. Bacteriol. 1999. -V. 181.-№ 13. -P. 4114-4117.

82. Krem M.M. Molecular markers of serine protease evolution / M.M. Krem,

83. E. Di Cera // The EMBO J. 2001. - V. 20 - № 12. - P. 3036-3045.

84. Laemmli H.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4 / H.K. Laemmli // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

85. Leshchinskaya I.B. Glutamyl endopeptidase of Bacillus intermedius, strain 3-19 / I.B. Leshchinskaya, E.V. Shakirov, E.L. Itskovich et al. // FEBS Lett.- 1997. V. 404.-P. 241-244.

86. Lesk A.M. Conversation and variability in the structures of serine proteinases of the chymotrypsin family / A.M. Lesk, W.D. Fordham // J. Mol. Biol. 1995. - V. 258. - P. 501-537.

87. Liu W. Bacillus subtilis PhoP binds the phoB tandem promoter exclusively within the phosphate starvation-inducible promoter / W. Liu, F.M. Hulett // J. Bacteriol. 2001. - V. 179. - № 20. - P. 6302-6310.

88. Loh J. The Bradyrhizobium japonicum nolA gene encodes three functionally distinct proteins / J. Loh, M.G. Stacey, M.J. Sadowsky et al. // J. of Bacteriology.- 1999.-V. 181.-№5.-P. 1544-1554.

89. Matsuzava H. Purification and characterization of aqualysin I produced by Thermus aquaticus YT-1 / H. Matsuzava, K. Tokugawa, M. Hamaoki et al. I I Eur. J. Biochem. 1988. - V. 171. - P. 441 -447.

90. McPhalen C.A. Structural comparison of two serine proteinase-protein inhibitor complexes: Eglin-C-subtilisin Carlsberg and CI-2-subtilisin Novo / C.A. McPhalen, M.N.G. James // Biochemistry. 1988. - V. 27. - P. 65826598.

91. Meloun B. Complete primery structure of thermitase from Thermoactinomyces vulgaris and its structural features related to subtilisin-type proteinases / B. Meloun, M. Baudys, V. Kostka et al. // FEBS Letters. -1985.-V. 183. -№ 2. P. 195-200.

92. Moon E.K. Intracellular localization and trafficking of serine proteinase AhSub and cysteine proteinase AhCP of Acanthamoeba healyi / E.K. Moon, S.T. Lee, D.I. Chung et al. I I Eukaryot Cell. 2006. - V. 5. - № 1. - P. 125131.

93. Moravkova J. Repression of the synthesis of exocellular and intracellular proteinases in Bacillus megatherium / J. Moravkova, J. Chaloupka / Folia Microbiol. 1984. - V. 29. - P.273-281.

94. Msadek K. Bacillus subtilis and other grampositive bacteria / K. Msadek, F. Kunst, G. Rappoport // Biochemistry, physiology and molecular genetics, Ed. A.L. Sonenshein. 1993. - P. 713-726.

95. Murzin A.G. Principles determining the structure of ß-sheet barrels in proteins: The observed structures / A.G. Murzin, A.M. Lesk, C. Chothia // J. Mol. Biol. 1994. - V. 236. - P. 1382-1400/

96. Neurath H. Evilution of proteolytic enzymes / H. Neurath // Science. 1984. -V. 224.-P. 350-357.

97. Nienaber V.L. A glutamic acid specific serine protease utilized a novel histidine triad in substrate binding / V.L. Nienaber, K. Breddam, J.J. Birktoft // Biochemistry. 1993. - V. 32. - № 43. - P. 11469-11475.

98. Ogata F. Purification and amino acid sequence of a bitter gourd inhibitor against on acidic amino acid-specific endopeptidase of Streptomyces griseus / F. Ogata, T. Miyata, N. Fujii et al. // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - № 25.-P. 16715-16721.

99. Ogawa K. Localization of a novel type trypsin-like serine protease, neurosin, in brain tissues of Alzheimer's disease and Parkinson's disease / K. Ogawa, T. Yamada, Y. Tsujioka et al. // Psychiatry Clin. Neurosci. 2000. - V. 54. -№4.-P. 419-426.

100. Ollis D.L. The a/ß hydrolase fold / D.L. Ollis // Protein eng. 1992. - V.5. -P.197-211.

101. Ottesen M. The subtilisins / M. Ottesen, I. Svendsen // Meth. Enzymol. -1970.-V. 19.-P. 199-215.

102. Otto B.R. Characterization of a hemoglobin protease secreted by the pathogenic Escherichia coli strain EB1 / B.R. Otto, S.J. van Dooren, J.H. Nuijens et al. // J. Exp. Med. 1998. - V. 188. - № 6. - P. 1091-1103.

103. Paetzel M. Common protein architecture and binding sites in proteases utilizing a Ser/Lys dyad mechanism / M. Paetzel, N.C. Strynadka // Protein Sei. 1999. - V. 8. - № 11. - P. 2533-2536.

104. Poquet I. HtrA is the unique surface housekeeping protease in Lactococcus lactis and is required for natural protein processing /1. Poquet, V. Saint, E. Seznec et al. // Mol Microbiol. 2000. - V. 35. - № 5. - P. 1042-1051.

105. Prestidge L. Protease activities during the course of sporulation in Bacillus subtilis / L. Prestidge, V. Gage, J. Spizizen et al. // J. Bacteriol. 1971. - V. 107.-P. 815.

106. Rao M. B. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases / M.B. Rao, A.M. Tanksale, M.S. Ghatge et al. // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998. - V. 62. - № 3. - P. 597-635.

107. Rawling N.D. Methods of enzymology / N.D. Rawling, A.J. Barrett // Proteolitic Enzymes: Aspartic and Metallopeptidases. Evolutionary Families ofMetallopeptidases.- 1995. V. 248.-P. 183-235.

108. Rebrikov D.V. Molecular cloning and nucleotide sequence of Bacillus intermedius glutamylendopeptidase gene / D.V. Rebrikov, T.V. Akimkina, A.B. Shevelev et al. // J. Prot. Chem. 1999. - V. 18. - P.21-26.

109. Rudenskaya G.N. Taraxalisin a serine proteinase from dandelion Taraxacum officinale Webb s.l. / G.N. Rudenskaya, A.M. Bogacheva, A. Preusser et al. // FEBS Letters. - 1998. - V. 437. - P. 237-240.

110. Schulz I. Subcellular localization suggests novel functions for prolyl endopeptidase in protein secretion /1. Schulz, U. Zeitschel, T. Rudolph et al. // J. Neurochem. 2005. - V. 94. - № 4. - P. 970-979.

111. Sebert M.E. Pneumococcal HtrA protease mediates inhibition of competence by the CiaRH two-component signaling system / M.E. Sebert, K.P. Patel, M. Plotnick et al.//J. Bacteriol.-2005.-V. 187.-№ 12.-P. 3969-3979.

112. Serrano M. A Bacillus subtilis secreted protein with a role in endospore coat assembly and function / M. Serrano, R. Ziehao, P. Ricca et al. // J. Bacteriol. 1999. -V. 181.-P. 3632-3643.

113. Sharipova M. The expression of the serine proteinase gene of Bacillus intermedius in Bacillus subtilis / M. Sharipova, N. Balaban, A. Kayumov et al. II Microbiol Res. 2006. - V. 76. - P. 556-564.

114. Shevelev A.B. Expression of Bacillar glutamyl endopeptidase genes in Bacillus subtilis by a new mobilizable single-replicon vector pLF / A.B. Shevelev, V.V. Aleoshin, L.A. Trachuk et al. // Plasmid. 2000. - V. 43. -P. 190-199.

115. Siezen R.J. Homology modeling and protein engineering strategy of subtilases, the family of subtilisin-like serine proteinases / R.J. Siezen, W.M. Vos, J. Leunissen et al. // Protein Engineering. 1991. - V. 4. - № 7. - P. 719-737.

116. Siezen R.J. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like serine proteases / R.J. Siezen, J. Leunissen // Protein Science. 1997. - V. 6. - P. 501-523.

117. Silva-Lopez R.E. Subcellular localization of an extracellular serine protease in Leishmania (Leishmania) amazonensis / R.E. Silva-Lopez, J.A. Morgado-Diaz, C.R. Alves et al. II Parasitol. Res. 2004. - V. 93. - № 4. - P. 328331.

118. Sleator R.D. Analysis of the role of OpuC, an osmolytetransport system, in salt tolerance and virulence potential of Listeria monocytogenes / R.D. Sleator, J. Wouters, C.G. Gahan et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2001. -V. 67. - № 6. - P. 2692-2698.

119. Stennicke H.R. Characterization of the SI binding site of the glutamic acid-specific protease from Streptomyces griseus / H.R. Stennicke, J.J. Birktoft, K. Breddam // Protein Science. 1996. - V. 78. - P. 2266-2275.

120. Stepanov V.M. A serine proteinase of an archaebacterium, Halobacterium mediterranei / V.M. Stepanov, G.N. Rudenskaya, L.P. Revina et al. II Biochem. J. 1992. - V. 285. P. 281-286.

121. Stephenson K. Influence of a cell-wall-associated protease on production of alpha-amylase by Bacillus subtilis / K. Stephenson, C.R. Harwood // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - № 8. - P. 2875-2881.

122. Stulke J. Regulation of carbon catabolism in Bacillus species / J. Stulke, W. Hillen // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - V. 54. - P. 849-880.

123. Suzuki Y. Cloning and expression of the gene encoding the glutamic acid-specefec protease of Streptomyces griseus ATCC 10137 / Y. Suzuki, M. Yabita, K. Ohsuye // Gene. 1994. - V. 31. - P. 149-151.

124. Svendsen I. The amino acid sequences of carboxypeptidases I and II from Aspergillus niger and their stability in the presence of divalent cations /1. Svendsen, F. Dal Degan //Biochim. Biophys. Acta. 1988. - V. 1387. - № 1-2.-P. 369-377.

125. Svendsen I. The primery structure of the glutamic acid-specific protease of Streptomyces griseus / I. Svendsen, M.R. Jensen, K. Breddam // FEBS Letters.-1991.-V. 292.-№ 1,2.-P. 165-167.

126. Svendsen I. Isolation and amino acid sequence of a glutamic acid specific endopeptidase from Bacillus licheniformis /1. Svendsen, K. Breddam // Eur. J. Biochem. 1992. - V. 204. - P. 165-171.

127. Takagi M. Nucleotide sequence and promoter region for the neutral protease gene from Bacillus stearothermophylus / M. Takagi, T. Imanake, S. Alba // J. Bacteriol. 1985.- V. 163.-P. 824-831.

128. Terada I. Unique precursor structure of an extracellular protease, aqualysin I, with NH2- and COOH-terminal pro-sequences and its processing in Escherichia coli /1. Terada, S.T. Kwon, Y. Miyata // J. Biol. Chem. 1990. -V. 265. -№ 12.-P. 6576-6581.

129. Traincard F. Specific inhibition of AGC protein kinases by antibodies against C-terminal epitop / F. Traincard, V. Giacomoni, M. Veron // FEBS Lett. 2004. - V. 13. - № 3. - P. 276-280

130. Vlakhov S. Induction of elastase biosynthesis in Streptomyces sp. 82 / S. Vlakhov, P. Dalev, P. Kabadzhova et al. // Antibiotiki i khimioterapia. -1996. V. 292. - № 1-2. - P. 165-167.

131. Warshel A. How do serine proteases really work? / A. Warshel, G. Naray-Szabo, F. Sussman et al. // Archiv. virology. 1989. - V.28. - № 9. - P. 3629-3637.

132. Wells J.A. Cloning sequencing and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis / J.A. Wells, E. Ferrari, D.J. Henner et al. // Nucleic Acids Res. 1983. - V.l 1. - P. 7911-7925.

133. Yokoi K. Genetic and biochemical characterization of glutamyl endopeptidase of Staphylococcus warneri M / K. Yokoi, M. Kakikawa, H. Kimoto et al. // Gene. 2001. - V. 281. - P. 115-122.

134. Young V.B. Sequence, localization and function of the invasion protein of Yersinia enterocolitica / V.B. Young, V.L. Miller, S. Falkov et al. // Mol. Microbiol. 1990. - V. 4. - № 7. - P. 1119-1128.