Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus Intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus Subtilis на разных фазах роста
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus Intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus Subtilis на разных фазах роста"
На правах рукописи
МИХАЙЛОВА ЕКАТЕРИНА ОЛЕГОВНА
СУБТИЛИЗИНОПОДОБНАЯ ПРОТЕИНАЗА BACILLUS INTERMEDIUS, СЕКРЕТИРУЕМАЯ РЕКОМБИН АНТНЫМ ШТАММОМ BACILLUSSUBTILIS НА РАЗНЫХ ФАЗАХ РОСТА
03.00,07 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Казань-2007
003160775
На правах рукописи
МИХАЙЛОВА ЕКАТЕРИНА ОЛЕГОВНА
СУБТИЛИЗИНОПОДОБНАЯ ПРОТЕИНАЗА BACILLUS INTERMEDIUS, СЕКРЕТИРУЕМАЯ РЕКОМБИНАНТНЫМ ШТАММОМ BACILLUSSUBTILIS НА РАЗНЫХ ФАЗАХ РОСТА
03 00 07 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Казань - 2007
Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии биолого-почвенного факультета ГОУ ВПО «Казанский государственный университет им В.И Ульянова-Ленина»
Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор
Шарипова Маргарита Рашидовна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук,
старший научный сотрудник лаборатории биохимии РЦПБ СПИД Коксин Владимир Петрович
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Казанского института биохимии и биофизики РАН Давыдова Марина Николаевна
Ведущая организация: Институт биологии УНЦ РАН, г Уфа
Защита диссертации состоится «25» октября 2007 г в часов на заседании диссертационного совета Д 212 08108 при Казанском государственном университете им В.И. Ульянова-Ленина по адресу 420008, г Казань, ул Кремлевская, 18, главное здание, ауд.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им Н.И Лобачевского Казанского государственного университета
Автореферат разослан « » сентября 2007 г
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук
3 И Абрамова
Актуальность проблемы. Субтилизиноподобные сериновые протеазы -группа протеолитических ферментов, которые обнаружены на всех ступенях эволюционной лестницы вирусах, бактериях, археях, грибах и высших эукариотах [Rawhngs, Barett, 1994] Несмотря на высокую степень филогенетической удаленности организмов, синтезируемые ими протеиназы имеют немало общего в строении и функциях, что позволяет сделать заключение об эволюционном родстве этих ферментов. Для многих субтилаз известна третичная структура [Siezen, Leunissen, 1997] Распространенность субтилаз в природе свидетельствует о том, что они являются жизненно-важными ферментами Разнообразие этих белков находит отражение в функционировании субтилаз Круг процессов, в которые вовлечены эти ферменты, обширен благодаря отсутствию узкой специфичности, сохранению каталитической активности в широких пределах pH и температур, а также различной клеточной локализации Доказано их участие в процессах эмбриогенеза эукариот, а также в различных патологических состояниях от болезни Альцгеймера и рака до лихорадки Эбола и ВИЧ [Thomas, 2002, Henrich et al., 2003] Современная наука располагает данными более чем о 550 прокариотических субтилизиноподобных протеиназ, их число постоянно растет [Siezen et al, 2007]. В клетках прокариот они участвуют в разнообразных физиологических процессах, включая клеточную дифференцировку Тем не менее, сведения о механизмах вовлечения протеаз в различные процессы, и, в частности, в формирование клеточного ответа в стационарной фазе роста, ограничены Дальнейшие исследования в этой области будут способствовать пониманию молекулярных механизмов участия этих ферментов в реакциях адаптации микроорганизмов к меняющимся условиям среды
Ранее показано, что бактерии Bacillus intermedius секретируют различные протеиназы, среди которых доминирует субтилизиноподобная сериновая протеиназа (AprBi); ее доля составляет до 80% от пула внеклеточных протеиназ, выделяемых этими бактериями в среду [Шарипова с соавт, 2000] Ген субтилизиноподобной протеиназы клонирован в мультикопийную плазмиду pCS9, его экспрессия изучена в рекомбинантном штамме Bacillus subtihs [Sharipova et al, 2007]. Показано, что накопление фермента Bacillus intermedius в культуральной жидкости рекомбинантного штамма достигает максимального значения на 28 ч (ранняя протеиназа) и 48 ч (поздняя протеиназа) роста Установлено, что в процессе роста культуры происходит смена механизмов регуляции экспрессии гена протеиназы
Целью работы явились выделение и характеристика субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedms, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis в ранней и поздней стационарной фазе роста
Основные задачи исследования:
1 Подбор условий культивирования для выделения протеиназы \ Bacillus intermedius из рекомбинантного штамма Bacillus subtihs нач '
ранней (ранняя протеиназа) и поздней (поздняя протеиназа) стационарной фазе роста культуры
2. Очистка субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtihs на ранней и поздней стационарной фазе роста культуры
3 MALDI-TOF и BLAST анализ аминокислотных последовательностей протеиназы ранней и поздней стационарной фазы роста
4 Исследование физико-химических свойств субтилизиноподобной протеиназы, соответствующей разным стадиям роста рекомбинантного штамма
5 Выяснение роли ионов кальция в стабилизации структуры протеиназы, соответствующей разным стадиям культивирования рекомбинантных бактерий
Научная новизна. Впервые выделена и охарактеризована внеклеточная субтилизиноподобная протеиназа В intermedius, соответствующая разным стадиям роста рекомбинантного штамма В subtilis Проведена сравнительная характеристика свойств протеиназы, секретируемой бациллами в начале и конце стационарной фазы Установлено, что, обладая идентичной аминокислотной последовательностью, ферменты различаются по каталитическим свойствам Получены приоритетные данные о способности протеиназы, секретируемой в позднюю стационарную фазу, образовывать димеры Предполагается, что ведущая роль в формировании димеров принадлежит ионам кальция в кальций-связывающих центрах на поверхности белковой глобулы На основании аминокислотной последовательности протеиназы предложена модель третичной структуры
Практическая значимость. Подобраны условия культивирования бактерий для эффективной продукции фермента, секретируемого на ранней и поздней стационарной фазе роста и разработаны условия очистки этих ферментов Результаты могут быть использованы при разработке стратегии синтеза ферментов промышленными штаммами бактерий Получение гомогенных препаратов ферментов увеличивает арсенал белков, используемых в научных исследованиях и в практических целях Данные по стабильности белка открывают возможность применения протеиназы AprBi в качестве добавок к различным детергентам, фармацевтике и в генноинженерных исследованиях
Связь работы с научными программами. Работа проводилась в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос регистрации 01 2 00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения») Исследования поддержаны грантами РФФИ 05-04-48182-а, Академии наук РТ № 03-3 5-20 и Аналитической Ведомственной Целевой Федеральной Программы РНП 2 11 1005 Все результаты, представленные в работе, получены лично автором
Положения, выносимые на защиту.
1 Выделена и охарактеризована субтилизиноподобная сериновая протеиназа Bacillus intermedius рекомбинантного штамма Bacillus subtihs, секретируемая в раннюю и позднюю стационарную фазу роста
2 Ранняя и поздняя протеиназы рекомбинантного штамма Bacillus subtilis имеют идентичную аминокислотную последовательность и близкие энзиматические свойства, но отличаются по каталитическим характеристикам
3 Поздняя протеиназа Bacillus subtilis, в отличие от ранней, образует димеры, в формировании которых участвуют ионы кальция
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных, всероссийских и региональных конференциях- "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2005-2007), школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005, 2006), Всероссийской научной конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004), Всероссийской научной конференции "Ферменты микроорганизмов структура, функции, применение" (Казань, 2005), V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука Инновации Бизнес» (Казань, 2005), Международной конференции аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», (Москва, 2005-2007), Материалах XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» секция биология (Новосибирск, 2005), BGRS-2006 Proceedings of the fifth international conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (Novosibirsk, 2006), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ Место выполнения работы и благодарности. Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственного университета Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д б н, проф М Р Шариповой за внимательное отношение к работе, д х н , проф Г Н Руденской за возможность проведения экспериментов по изучению свойств ферментов на базе лаборатории кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ, кбн,снс НП Балабан и к.б н , доц А М Мардановой за постоянную помощь в проведении экспериментов, д б н, проф С В Кострову (ИМГ РАН) за предоставление плазмиды pCS9, профессору Ю Иомантасу (ГНИИ Генетика и Селекция Промышленных микроорганизмов) за предоставление протеазо-дефицитного штамма В subtilis AJ73, кбн снс ИВ Демидюку (ИМГ РАН) за консультацию при проведении экспериментов по изучению механизма формирования димеров
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы Работа изложена на 166 страницах машинописного
(
текста, включает 10 таблиц, 21 рисунок Библиография содержит 293 наименования российских и зарубежных авторов
Материалы и методы Объект исследования. Объектом исследования служил рекомбинантный штамм В subtihs AJ73(pCS9) Он получен путем трансформации плазмиды pCS9 в протеазо-дефицитный штамм В subtihs, из хромосомы которого делегированы гены внеклеточных протеиназ (штамм любезно предоставлен проф Ю Йомантасом, ГНИИ Генетики и Селекции Промышленных микроорганизмов, Москва) В работе использована мультикопийная плазмида pCS9, любезно предоставленная для исследований проф С.В Костровым, ИМГ РАН, Москва Плазмида сконструирована на основе вектора рСВ22 [Sorokin et al., 1990] и несет полный ген субтилизиноподобной сериновой протеиназы В intermedins под собственным промотором
Культивирование бактерий. Исходной питательной средой для культивирования рекомбинантных бактерий являлась пептон-содержащая среда [Ицкович с соавт, 1995] Для подбора оптимальной среды использовали колламин («Биопрогресс», Россия) в концентрации 1 и 2% в качестве добавки к пептон-содержащей среде Кроме того, производили замену пептона («Sigma») на ферментативный пептон («Диа-М») в концентрациях 10-30 г/л В среду культивирования непосредственно перед посевом добавляли эритромицин в концентрации 20 мкг/мл. Растворы неорганического фосфата (Na2HP04 12Н20) стерилизовали при 1 атм и вносили в среду перед посевом в концентрациях 0,1-0,4 г/л
Прирост биомассы измеряли нефелометрически на КФК-2 при 590 нм. Протеолитическую активность определяли по гидролизу синтетического субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNA [Люблинская с соавт., 1987], азоказеина и казеина [Каверзнева, 1971]. Удельную активность выражали в ед/мг белка
Выделение и очистку протеиназы из культуральной жидкости проводили методом ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе и колонке MonoS в системе FPLC («Pharmacia», Швеция)
Степень чистоты полученных белковых препаратов и их молекулярную массу определяли электрофоретически Электрофорез проводили в денатурирующих условиях по методу Лаэммли [Laemmh, 1970] и в нативных условиях в 10% ПААГ, как описано на сайте (http //wolfson huji ас il/purification/Protocols/PAGEAcidic html)
Гомогенные препараты белка, секретируемые на разных стадиях роста культуры, анализировали с помощью метода масс-спектрометрии (MALDI-TOF) Полученные данные обрабатывали с помощью программ Peptide Mass Fingerprint (http.//www matnxscience com) и Peptide Mass (http //cn.expasy org) Свойства ферментов. Влияние ингибиторов на активность протеиназ определяли, используя PMSF, DTT, пХМБ, бензамидин, ЭДТА в соотношении 1.1000, овомукоид, ингибитор из морской анемоны, ингибитор трипсина и о-фенантролин в молярном соотношении фермент ингибитор 1 10
Субстратную специфичность полученных ферментов определяли по гидролизу синтетических я-нитроанилидных субстратов Glp-Ala-Ala-Leu-pNa, Glp-Phe-Ala-Ala-pNa, Z-Ala-Ala-Val-pNa, GIp-Phe-Gly-pNa, Z-Ala-Ala-Leu-pNa и Z-Glu-pNa Специфичность протеиназ на природных субстратах изучали по действию на В-цепь окисленного инсулина овцы как описано в работе [Ицкович с соавт, 1997]
Кт и ¿кат препаратов протеиназ определяли по гидролизу специфического хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa с использованием двулучевого спектрофотометра Lambda 35 «Perkin Elmer» (США)
рН- и Т-оптимум, рН- и Т-стабильность протеиназ исследовали по гидролизу синтетического хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNA с использованием Трис-НС1-буфера и универсального буфера, в состав которого входили 0,04 М растворы СН3СООН, Н3РО4 и Н3В03, рН доводили 0,2 М NaOH
Влияние ионов двухвалентных металлов на активность протеиназ изучали после инкубации растворов белков в Трис-HCl буфере, содержащем Mn2+, Ni2+, Cu2+, Со2+, Са2+ и Mg2+ в концентрации от 5 до 20 мМ
Гель-фильтрацию ферментных растворов проводили на колонке с сефадексом G-100 (Pharmacia, Sweden) Диализ белковых растворов для удаления ионов Са2+ проводили против Трис-HCl буфера, содержащего 1% ЭДТА
Выравнивание аминокислотной последовательности протеиназы AprBi с последовательностями классических субтилизинов, а также построение филогенетического древа проведено с помощью программы BLAST (http //www.ncbi nlm nih gov) Модель третичной структуры построена на основании аминокислотной последовательности протеиназы AprBi из рекомбинантного штамма в программах SwissProt (www.au expasy.org/spdbv) и YASARA (www yasara org).
Математическую обработку полученных данных проводили в программной среде «Microsoft Excel» Результаты многофакторных экспериментов обрабатывали с помощью программы STATGRAPHICS.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Подбор состава питательных сред для эффективной продукции протеиназы В. intermedins, секретируемой рекомбинантным штаммом
В. subtilis
Бациллы продуцируют различные внеклеточные ферменты в период пост-экспоненциальной и стационарной фаз роста Секреция субтилизиноподобных протеиназ сильно зависит от компонентов питательной среды, а именно от соотношения в среде источников азота и углерода, присутствия легко метаболизируемых Сахаров (например, глюкозы), ионов металлов и тд [Varela et al., 1996, Beg et al, 2002] Использование сред, содержащих сложные органические соединения (пептон, триптон, дрожжевой экстракт) приводит к более интенсивному росту и
продукции внеклеточных протеиназ бактерий [Сафонова с соавт, 1999] Обогащенность сред физиологически активными соединениями, микроэлементами и другими факторами роста благоприятно сказывается на жизнедеятельности и биосинтетической активности микроорганизмов Для культивирования рекомбинантного штамма мы использовали пептон-содержащие среды
Таблица 1 Питательная среда для максимальной продукции субтилизиноподобной протеиназы В гШегтесЬих, секретируемой _рекомбинантным штаммом В змЬЫю_
Состав питательной среды Активность, ед/мг
(основные источники азота)
№ Бактериологи- Колламин Фермента- Ранняя Поздняя
ческий тивный протеиназа протеиназа
пептон пептон
1 20 г/л - - 0,54 1,24
2 20 г/л 1% - 0,23 0,5
3 20 г/л 2% - 0,13 0,3
4 - 1% - 0,27 0,61
5 - 2% - 0,35 0,64
6 - - 20 г/л 0,38 0,7
7 - - 30 г/л 0,4 0,73
8 - - 40 г/л 0,42 0,76
Солевая основа среды (%) СаС12-2Н20 - 0,06,1\%504 7Н20 - 0,05, ЫаС1 - 0,3, Ш4С1 - 0,02, Мп804 - 0,01, На2НР04 - 0,035, рН - 8,5
Накопление протеиназы В гШегтеЛш в культуральной жидкости рекомбинантного штамма В зиЫгШ начинается в фазе замедления роста, достигает максимального значения на 28 и 48 ч роста и зависит от состава питательной среды С целью достижения эффективной продукции протеиназы, соответствующей ранней и поздней стационарной фазе роста, проводили подбор питательной среды Для этого варьировали концентрации различных источников азота в среде культивирования Наряду с бактериальным пептоном (20 г/л) использовали колламин (1 и 2%) и ферментативный пептон (20-40 г/л) в качестве более дешевых замен пептона в условиях масштабирования процесса очистки Максимальный уровень активности субтилизиноподобной протеиназы в культуральной жидкости отмечен для среды, содержащей бактериальный пептон (табл 1) активность ранней протеиназы в пептон-содержащей среде составила - 0,54 ед/мг, поздней протеиназы - 1,24 ед/мг Замена пептона на колламин, а также внесение последнего в качестве дополнительного источника питания снижали активность протеиназы, более чем в 2 раза (0,23-0,35 ед/мг - для ранней протеиназы, 0,5-0,64 ед/мг - для поздней протеиназы) Использование ферментативного пептона в концентрациях 20-40 г/л вместо
пептона приводило к снижению активности протеиназы, но в меньшей степени, чем при
бактериологического субтилизиноподобной использовании колламина (0,38-0,42 ед/мг - для ранней протеиназы, 0,7-0,76 ед/мг - для поздней протеиназы) По-видимому, это связано с компонентным составом колламина и ферментативного пептона, и, в частности, с набором аминокислот и пептидов, которые могут репрессировать накопление фермента в среде, либо ингибировать его активность Полученные данные свидетельствовали в пользу использования для дальнейшей работы бактериологического пептона в качестве источника азота.
Оптимальное соотношение концентраций двух основных компонентов питательной среды - пептона и неорганического фосфата для эффективной продукции фермента подбирали в многофакторных экспериментах с последующей обработкой результатов в программе БТАТвКАРЮЗ
Максимальная активность ранней субтилизиноподобной протеиназы наблюдается при концентрации в среде пептона 30 г/л и неорганического фосфата 0,25 г/л, поздней потеиназы - при концентрации в среде пептона 30 г/л и неорганического фосфата 0,34 г/л (рис 1) Таким образом, количество пептона, необходимое для максимальной продукции субтилизиноподобной протеиназы, соответствующей разным часам роста, идентично, в то время как количество неорганического фосфата, различно Полученные результаты позволили разработать оптимальные питательные среды для продукции фермента с целью его выделения
А Б
Неорганический фосфат, г/л
Неорганический
0,3 0,26
0,22 0,18 0,14 0,1
Г"5-У — ч
/ — . _ - -
) > • / :
7'
„ ' / -
I: „ г„г ^
фосфат, г/л
0,26 0 22
<
- - ' ' ;
~ «—
_____ „ •* , _____.„_
4 28 32 Пептон, г/л
28 32 Пептон, г/л
Рис 1 Линии уровня активности ранней (А) и поздней (Б) протеиназы рекомбинантного штамма В тЬМи в двухфакторных экспериментах
Выделение и очистка субтилизиноподобной протеиназы В. ШегтеШш
Субтилизиноподобная протеиназа В гМегтесЬш, секретируемая рекомбинантным штаммом В шЬп1гв, была выделена с помощью ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе, высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Мопов в системе РРЬС и рехроматографии белков на колонке Мопов В результате получены два
препарата су от и л из и но подобной протеи пазы, секретируемой на 28 (протеиназа ранней стационарной фазы) и 48 ч (протеиназа поздней стационарной фазы) роста. Степень очистки ранней протекназы составила 711, поздней протеиназы - 745. Выход по активности - 9,6% и 16,4%, соответственно. Гомогенность полученных препаратов фермента подтверждена электрофоретически (рис. 2). Молекулярная масса ранней и поздней протенназ была идентична и составила 27 к Да,
66 40
21,5 15,7 14,4 12,3
I 2 М
Рис. 2. Электрофорез в SDS-PAAG препаратов сериноиой протеиназы В intermedins, Секретируемой В. subtilis. М - Маркеры; РНКаза (Биназа) (12,3 кДа), лизоцим (14,4 кДа), РНКаза А (15,7 кДа), ингибитор трипсина (21,5 кДа), перокешша (40 кДа), ВСА (66 кДа).
1 - ранняя протеиназа; 2 - поздняя протеиназа.
Препараты белка, соответствующие разным часам стационарной фазы роста культуры, проанализированы нами с помощью метода MALDI-TOF-спектрометрии. Метод позволяет установить структуру аминокислотной последовательности и молекулярную массу исследуемого белка. Результаты, полученные с помощью MALDI-TOF спектрометрии, были обработаны в программных средах Peptide Mass Fingerprint и Peptide Mass (www.expasy.org). Нами установлена первичная структура белка, секретируемого рекомбинантным штаммом В. subtilis на ранней и поздней стационарной фазе роста (рис. 3). Полученные данные свидетельствуют, что протеиназы рекомбинантного штамма, соответствующие разным фазам роста, имеют идентичную последовательность аминокислот, начинаются с одной и той же аминокислоты и их N- и С-концевые последовательности совпадают. Рассчитанная на основе полученной последовательности молекулярная масса препаратов фермента составила 27 кДа. Таким образом, аминокислотная последовательность, полученная методом М ALDI-TOF идентична последователь] гост и белка, конвертированного из последовательности секвенированного гена aprBi (AY754946). Закономерно, что в последовательности протеиназы AprBi отсутствует цистеин, тремя консервативными аминокислотными остатками сформирована
каталитическая триада активного центра D32, Н64, S221 Положение аминокислот в области активного центра консервативно и соответствует положению таковых для других ферментов, относящихся к семейству субтилизинов [Siezen, Leunissen, 1997]
Ранняя протеиназа gipqikapavhaogykgaiwkvavlihtgihaaiipdlhvaggasfvpsepnatqi) б<з Поздняя протеиназа GXPQIKAPAVHAQCYKGAnVKVAVlffirrGIHAAaPDLNVAGGASrVPSEPNATQD 60
FQS0STHVAGTIAALDNTIGVLGVAPSASLyAVKVLÍiEHtíDGQYStfIISGIE»AVAHNHD 120 F03ffi3THVAGTIAALI>NTIGVLGVAPSASLY¿VKVLtiMGDGQYSBXISGIEtíAVAHNHD 120
VINHSLGGPWGSTALKNAVDTANWRGW/VAAAGMSGSTGSTSTVGYPAKYDSTIAVAUV 180 VIKUSLGGPNGSTALKWAVDTANNRGWWAAAGKSGSTGSTSTVGYPAKYDSTIAVANV 180
NSSNVBNSSSSAGPELDVÜAPGTS ILSTVPSSGYTSYTGTEteASPHVAGAAAL ILSKNPN 240 KSSHVBNSSSSAGPEL0VSAPGTSIL3TVPSSGYTSYTGTB|íjSSFHVAGAAAHLáKNPN 240
LSHSQVRQRLENTATPLGNSFYYGKGLINAQAАЗЫ 275 LSNSQVRQRLEHTATPLGHSFtYGKGLINAQAASM 2 7S
Рис 3 Аминокислотная последовательность протеиназы AprBi, полученная с помощью MALDI-TOF анализа
С использованием программы BLAST Tree View Widget на основе аминокислотной последовательности субтилизиноподобной протеиназы В intermedius мы построили филогенетическое древо (рис 4) На рисунке видно, что протеиназа AprBi располагается на одной ветви с другими бациллярными субтилизинами, которые выделены из аэробных спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus Несмотря на то, что эти микроорганизмы населяют разные экологические ниши В intermedius и В subtilis - типичные почвенные микроорганизмы, В pumilus - выделены из морской воды и соевых продуктов, а В subtilis subsp natío - из соевого сыра, секретируемые ими субтилизиноподобные протеазы имеют консервативную структуру. Построение эволюционного древа на основе вариабельности структуры субтилизиноподобных протеиназ выявило интересные особенности филогенеза протеиназы AprBi Субтилизиноподобная протеиназа В intermedius и субтилизиноподобная протеаза ВРР-А представляют собой отдельную ветвь эволюции субтилизиноподобных протеаз Известно, что субтилизиноподобная протеаза В pumilus, также как протеиназа AprBi, обладает широкой субстратной специфичностью и активна при высоких значениях pH [Kumar, 2002, Huang et al, 2003, Miyaji et al, 2006] Другие родственные ферменты, и субтилизин АР01, и наттокиназа находятся на других ветвях эволюционного древа этих ферментов Полученная картина
эволюции данных ферментов показывает, что все они произошли от одного общего древнего предка (рис. 4).
Рис.4. Филогенетическое древо субтилизиноподобной протеиназы В 1п1егтес1ш$ 3-19
Характеристика протеиназы рекомбинантного штамма В. яиЬШм Активность обоих препаратов фермента полностью подавлялась специфическим ингибитором РМББ, фермент нечувствителен к ингибиторам металлопротеаз и белковым ингибиторам (табл 2) Полученные -данные свидетельствуют об их принадлежности к семейству сериновых протеиназ
Изучение субстратной специфичности протеиназы ранней и поздней стационарной фазы роста выявило различия в расщеплении ими синтетических пептидных и белковых субстратов (табл 3) Оба фермента не способны гидролизовать субстраты, специфичные для химотрипсина (С1р-РЬе-С1у-рКа) и ОЫ-Авр-специфичных протеаз (2-01и-рЫа) Максимальная активность ранней и поздней протеиназы в отношении субстратов, специфичных для субтилизинов (С1р-А1а-А1а-Ьеи-рНа и 2-А1а-А1а-Ьеи-рЫа), подтверждает принадлежность протеиназы к клану субтилаз.
Таблица 2 Влияние ингибиторов на активность субтилизиноподобной протеиназы В intermedius, секретируемых рекомбинантным штаммом
Ингибитор Ранняя протеиназа, Поздняя протеиназа,
активность, % активность, %
PMSF 0 0
DTT 100 100
ЭДТА 100 100
Бензамидин 100 100
пХМБ 100 100
о-фенантролин 100 100
Овомукоид 100 100
ингибитор трипсина 100 100
ингибитор из 100 100
морской анемоны
Таблица 3 Субстратная специфичность протеиназы AprBi
субстрат ранняя протеиназа, ед/мг поздняя протеиназа, ед/мг
Glp-Ala-Ala-Leu-pNa 105,6±1,58 138,7±2,08
Glp-Ala-Ala-Phe-pNa 1,0±0,02 1,6±0,02
Z-Ala-Ala-Val-pNa 0 0
Glp-Phe-G ly-pNa 0 0
Z-Ala-Ala-Leu-pNa 102,0±1,53 121,7±1,83
Z-Glu-pNa 0 0
Казеин 250,1±3,75 301,4±4,5
Азоказеин 300,7±4,51 354,6±5,32
Большинство субтилизинов бактерий, например, субтилизин BPN', савиназа, эспераза, предпочитают гидролизовать связи, образованные ароматическими (Phe) и алифатическими (Leu) аминокислотами Протеиназа AprBi наиболее эффективно гидролизовала и-нитроанилиды, содержащие гидрофобные аминокислоты лейцин и фенилаланин Однако удельная активность протеиназы ранней и поздней стационарной фазы на этих субстратах различалась. Данные по удельной активности белков свидетельствуют в пользу более высокого сродства по отношению к этим субстратам поздней протеиназы Аналогичные результаты получены для белковых субстратов - казеина и азоказеина, которые эффективнее расщепляются более поздним ферментом Таким образом, поздняя протеиназа более эффективно расщепляет синтетические и природные субстраты
Гидролиз В-цепи субтилизиноподобной протеиназой В ¡ШегтеЛия из рекомбинантного штамма, соответствующей разным фазам роста, приводил к появлению многочисленных пептидных фрагментов, что указывает на широкую субстратную специфичность фермента. Ранняя и поздняя протеиназы активно гидролизуют связи, образованные карбоксильными группами гидрофобных аминокислот (Ьеи11-УаИ2, РЬе25-Туг26 и т д), а также гидрофильных аминокислот, включая кислые и основные (С1у8-8ег9, С1п4-Н155 и т д) (рис. 5) Однако существуют различия в протеолитической активности субтилизиноподобной протеиназы поздняя протеиназа при равных условиях гидролизует субстрат более эффективно, а именно расщепляет две дополнительные связи в цепи В-инсулина (Суз19-01у20 и Туг26-Тге27)
Ранняя протеиназа В тХегтейгт (В хиЫйы А.173)
I 111 1111 1
Р-У-^д-Н-Ь-С-С-З-Н-Ь-У-Е-А-Ь-У-Ь-У-С-е-Е-КС-Р-Г-У-Т-Р-К-А
! 11! тт ти Т
Поздняя протеиназа В гМегтесЬт {В эиЬЫк А.173)
Рис 5 Гидролиз В-цепи инсулина субтилизиноподобной протеиназой В т(егтеЛш, секретируемой рекомбинантным штаммом В зиЫШв
Более высокая протеолитическая активность поздней протеиназы в отношении белковых и синтетических субстратов может быть связана с функцией этого фермента в клетке Предполагается, что ранняя протеиназа играет регуляторную роль на этапе инициации споруляции Поздняя протеиназа соответствует VI стадии споруляции и участвует в апоптозо-подобных реакциях, в частности в расщеплении белков материнской клетки, способствуя освобождению эндоспор в среду [Шарипова с соавт., 2002]
Исследование кинетических параметров показало, что значение Кт для ранней протеиназы (1,85 мМ) более чем в 2 раза превышало значение Кт для поздней протеиназы (0,86 мМ) Из этого следует, что поздняя протеиназа обладает большим сродством к субстрату 2-А1а-А1а-Ьеи-рШ, чем ранняя протеиназа Эффективность катализа поздней протеиназы значительно выше, чем ранней так как значение ккм (5574 с"1) поздней протеиназы выше, чем ккл (4748 с"1) ранней протеиназы.
Субтилазы весьма устойчивы в широких пределах температур Нами установлено, что температурный оптимум для раннего фермента равен 37°С, а для позднего - 45°С (табл. 4) Эти значения ниже, чем для других субтилизинов мезофильных бактерий - субтилизинов ВРИ' и СаНэЬе^, температурный оптимум которых равен 60°С
Таблица 4 Энзиматические свойства субтилизиноподобной протеиназы В intermedius рекомбинантного штамма В subtihs
Свойства Ранняя протеиназа Поздняя протеиназа
Т-оптимум 37°С 45 °С
Термостабильность 0-50°С 0-55 °С
рН-оптимум
Трис-НС1 буфер 9,5 9,5
Универсальный буфер 11,0 11,0
рН-стабильность
Трис-НС1 буфер 7,0-10,0 7,0-10,0
Универсальный буфер 7,5-11,5 7,5-11,5
Стабильность ферментов имеет важное значение при их работе в живых системах и при использовании в промышленных целях Для обоих препаратов фермента характерно сохранение активности в широком интервале температур ранней протеиназы от 0-50°С, поздней протеиназы - от 0-55°С (табл 4) Увеличение интервала термостабильности для поздней протеиназы, по-видимому, представляет собой адапторный механизм устойчивости при неблагоприятных воздействиях окружающей среды
Интересно, что обе протеиназы стабильны при температурах ниже 30°С Оба фермента сохраняют до 40% активности при температуре +5°С При +15°С поздняя протеиназа сохраняла до 80% активности Подобная картина характерна для субтилизинов психрофильных бактерий [Kulakova et al, 1999, Wang et al, 2005]. Устойчивость протеиназы AprBi при низких температурах открывает возможности ее практического применения
Субтилизиноподобные протеазы - щелочные ферменты, они активны при высоких значениях pH Рекомбинантная протеиназа AprBi не является исключением Значение pH-оптимума для протеиназы рекомбинантного штамма В subtilis, в универсальном буфере равно 11, в Трис-НС1-буфере - 9,5 (табл 4) Оба фермента в универсальном буфере сохраняли стабильность в интервале pH 7,5-11,5, в Трис-НС1-буфере - 7-10 Таким образом, протеиназа AprBi входит в число высокощелочных субтилизинов, что также может иметь практическое значение
Стабилизация белковой глобулы субтилизиноподобных протеиназ происходит за счет ионов кальция [Siezen, Leunissen, 1997] В присутствии ионов Са2+ наблюдалось повышение активности обоих препаратов протеиназы Показано, что ионы других металлов также способны влиять на активность разных субтилаз Нами установлено, что ионы двухвалентных металлов оказывают различное влияние на активность ранней и поздней протеиназы (рис 6) Максимальный ингибирующий эффект обнаружен для ионов Си2+ в концентрации 20 мМ, которые снижали активность поздней протеиназы более чем на 70%, а активность ранней протеиназы только на 40% В присутствии ионов Ni2+ и Со2+ в концентрации 5 мМ активность обоих
белков снижалась незначительно (на 10%) Ионы №2+ и Со2+ в концентрации 10 мМ ингибировали активность ранней и поздней протеиназ на 20%, а в концентрации 20 мМ - понижали активность ранней протеиназы на 35-40% Аналогичные результаты получены для ионов №2+в концентрации 10 и 20 мМ Низкие концентрации Мп2+ (5 мМ) не оказывали влияния на активность ранней протеиназы и снижали активность поздней протеиназы на 15% Активность поздней протеиназы при увеличении концентрации ионов Мп2+ до 20 мМ снижалась на 50%, в то время как активность ранней протеиназы только на 30% Проведенные нами исследования по влиянию ионов М§2+ показали, что активность обоих ферментов практически не снижалась в
присутствии 5 мМ Mgz+ 10 и 20 мМ Mg2+ ингибировали активность ранней протеиназы на 20 и 40%, соответственно, в то время как ингибирование активности поздней протеиназы ионами Mg2+ наблюдалось только при концентрации Mg2+ 20 мМ (на 30%) Активация ионами Са2+ известна в отношении многих субтилизинов [Betzel et al, 1988, Siezen et al, 1991] Нами показано, что ионы кальция активировали раннюю и позднюю протеиназу, но в разной степени- активность позднего фермента увеличивалась на 70%, тогда как активность раннего фермента - только на 15-20%. Различное влияние ионов двухвалентных металлов на активность фермента, возможно, связано с особенностями в структуре белка Стабилизация поздней протеиназы в присутствие Са2+, может быть обусловлена тем, что в поздней стационарной фазе роста необходима такая упаковка белковой глобулы, которая обеспечивала бы максимальную стабильность фермента и защищала бы от воздействия неблагоприятных факторов среды.
А Б
Мк
Рис. 6. Влияние ионов металлов на активность субтилизиноподобной протеиназы В ¡Мегтескш, секретируемой рекомбинантным штаммом
В ьиЫйк
За 100% принята активность в отсутствие ионов металлов А — ранняя протеиназа, Б - поздняя протеиназа, 1 - 5 мМ, 2- 10 мМ, 3 - 20 мМ
Ранняя и поздняя субтилизиноподобные протеиназы являются продуктами одного гена, механизм регуляции экспрессии которого различается на разных стадиях роста бактерий [Sharipova et al, 2007]. Мы предполагаем, что разное влияние ионов кальция на активность ранней и поздней протеиназы AprBi связано с особенностями белковой глобулы, что в свою очередь, может отражать изменения в физиологии бактерий Секреция ранней протеиназы соответствует ранним стадиям споруляции бактериальной культуры, когда потребность в кальции не столь велика, как для поздней стационарной фазы, когда Са2+ активно транспортируется внутрь клетки для образования зрелых спор [Errmgton et al, 1993]
Одним из способов стабилизации белковой глобулы является образование димерных форм Димерные формы белков описаны для внутриклеточных субтилизинов В subtihs, В hchemformis и В amyloliquefaciens [Strongm et al., 1979, Strongin et al, 1979, Strongin and Stepanov, 1981, Kurotsu et al., 1982, Koide et al, 1986] Показано, что они нуждаются в кальции для поддержания активности и стабильности
Гель-фильтрация на сефадексе G-100 препаратов протеиназы, показала, что при проведении гель-фильтрации ранняя протеиназа элюируется единственным пиком, которому соответствует белок с молекулярной массой 27 кДа (рис 7) Гомогенный препарат позднего белка элюировался с образованием двух протеолитических пиков с молекулярными массами 27 и 54 кДа, каждый из которых обладал специфической протеолитической активностью Это позволило нам предположить образование димерной формы белка Таким образом, обнаруженные нами изменения в каталитических константах могут быть связаны с образованием димерной формы протеиназы AprBi, соответствующей поздней стадии роста бацилл
Т 1.21 §1,4 т
н -- 1 и 1 е в .„« -- 0,8s £ - - 0,6"»! ^ 1,2 -Л . -
1 " ■ 0,8 --0,6-
-•0,4 0,4 --
-0,2 0,2 --
4- 0 0 4
145 176
Рис 7 Гель-фильтрация субтилизиноподобной протеиназы В т!егтеЛи,ч рекомбинантного штамма В ьиЫйи на Сефадексе в-100 А - ранняя протеиназа, Б - поздняя протеиназа, 1 - количество белка, 2 - активность
Для выяснении природы образования димерных форм протеиназы АргВ! проводили электрофорез раннего и позднего белка в неденатурирующих условиях. Электрофорез в неденатурирующих условиях показал присутствие только одной полосы для обоих препаратов протеиназы (рис. 8), Мы предположили, что формирование димерной формы поздней протеиназы, выявленное с помощью гель-фильтрации, связано с электростатическим взаимодействием между мономерными формами, которое может осуществляться за счет ионов кальция.
Нами установлено, что увеличение концентрации ионов кальция в реакционной смеси приводило к активации поздней протеиназы в большей степеии, чем ранней. Для выяснения роли ионов кальция в формировании димероз мы провели исчерпывающий диализ препаратов фермента против буфера, содержащего ЭДТА. Препараты ранней и поздней протеиназы после диализа против буферного раствора с ЭДТА, были подвергнуты гель-фильтрации на сефадексе С-100.
Рис. 8. Электрофорез субтилизи но подобной протеиназы В intermedium рекомбинантного штамма В. subtilis в нативных условиях, 1 - ранняя протеин аза, 2 - поздняя протеиназа, М - маркеры: лизоцим (14,4 кДа), фосфатаза (56 кДа), гемоглобин (68 кДа),
Как видно из рис. 9, оба препарата протеиназы элюировались с образованием одного пика, соответствующего молекулярной массе 27 кДа. Лишенная ионов кальция поздняя протеиназа AprBi не только не образует димеров, но и полностью теряет каталитическую активность (рис. 9Б). Активность ранней протеиназы снижалась на 70% по сравнению с активностью белка а присутствии ионов кальция (рис, 9 А и 7 А). Следовательно, ионы кальция могут образовывать связи между двумя белковыми глобулами и быть основой для формирования димерных структур. Утрата кальция в кальций-связывающих сайтах димерных структур приводит к дестабилизации димерной фермента. В этом случае, лишенная ионов кальция молекула теряет и каталитическую активность.
мл мл
Рис 9 Гель-фильтрация обессоленной субтилизиноподобной протеиназы В intermedius рекомбинантного штамма В subtilis.
А - ранняя протеиназа, Б - поздняя протеиназа, 1 - количество белка, 2 - активность
Итак, мы предполагаем, что различие каталитических и энзиматических свойств ранней и поздней протеиназы AprBi обусловлено формированием димерных форм С физиологической точки зрения, димеризация может рассматриваться как особенность фермента, фолдинг которого происходит при лимитации по ионам кальция, которые активно поглощаются клеткой в условиях созревания эндоспор По-видимому, такая структура белка обеспечивает более высокий уровень протеолитической активности фермента
С помощью программ SwissProt и YASARA нами построена модель третичной структуры протеиназы AprBi на основании аминокислотной последовательности Каталитическая триада активного центра протеиназы AprBi включает в себя близко расположенные остатки Asp32, His64 и Ser221 (рис 10) Такая ориентация активного центра присуща большинству субтилизинов бактерий
Стабильность многих субтилаз поддерживается благодаря Са-связывающим сайтам на поверхности молекулы белка [Betzel et al., 1988] В модели протеиназы AprBi идентифицированы два Са-связывающих, что укладывается в рамки существующих предстаблений о структуре субтилизинов Из двух сайтов один относится к «сильным» сайтам связывания. Он образован 2, 41 и 76-81 аминокислотными остатками в Са-содержащей петле Эти аминокислотные остатки, как правило, Asp/Asn, иногда Glu/Gln [Siezen, Leunissen, 1997]. У протеиназы AprBi сайт формируют аминокислотные остатки Asp76, Asn77, Gln2, Asp41 Положение других сайтов связывания кальция у субтилаз не консервативно Второй кальций-связывающий сайт протеиназы AprBi, по-видимому, относится к числу «слабых» сайтов связывания. Кальций-связывающие сайты протеиназы
В ¡МегтеЖиз, по-видимому, играют ведущую роль в формировании димерных структур и стабилизации белковой глобулы.
Ионы
Активный центр
Иены С а2*
Са-свяэывакнций сайт Рис. 10. Модель третичном структуры лротеина зы А ргВ:
Таким образом, субтили з и но подобная сериновая протеиназа В тгетесНиз секретируется в раннюю и позднюю стационарную фазу роста рекомбинантного штамма В. зиЬШа. Гомогенные препараты фермента, соответствующие 28 (ранняя протеиназа) и 48 (поздняя протеиназа) ч роста бактерий характеризуются идентичным аминокислотным составом, их М- и С- концы совладают. Биохимические свойства обеих нротеиназ отличаются по энзиматическим свойствам, а также кинетическим параметрам. Подобные отличия, вероятно, связаны с образованием Са-зависимых димерных форм белка. Различия в структуре протеин азы разных фаз роста бактерий могут быть связаны с изменением в физиологическом состоянии культуры и, в частности, с изменениями в обмене кальция между бактериальной клеткой И средой. Проведенное впервые сравнительное изучение свойств белка, экспрессия которого происходит в течение всей стационарной фазы, включая споруляцию, ггоказа/!о, что поздняя протеиназа, в отличие, от ранней способна образовывать димеры в рас-гворах, В период поздней стационарной фазы роста бактерий ионы кальция активно поглощаются клеткой с целью образования хелата дипиколиновой кислоты и кальция [Егпл^оп, ¡993]. В этих условиях жизнедеятельности происходит димеризация поздней протеиназы. Такая особенность позднего белка обеспечивает выполнение протеиназой разнообразных функций, в том числе в период клеточной дифференцировки на этапе освобождения эндоспор. Формирование такой структуры может служить специфическим механизмом, выработанным
клеткой в процессе эволюции для повышения специфичности белка обеспечения его устойчивости к неблагоприятным условиям среды
выводы
1 Подобран состав питательной среды, обеспечивающий высокий уровень активности ранней (28 ч роста) и поздней (48 ч роста) протеиназы Bacillus intermedius в культуральной жидкости рекомбинантного штамма Bacillus subtihs
2 Из культуральной жидкости рекомбинантного штамма Bacillus subtihs выделена субтилизиноподобная протеиназа Bacillus intermedius, соответствующая разным часам роста, со степенью очистки, составляющей 711 для ранней и 745 - для поздней протеиназы и выходом по активности 9,6 и 16,4%, соответственно
3 Методом масс-спектрометрии установлено, что ранняя и поздняя протеиназа AprBi имеют идентичную последовательность аминокислот, их N- и С- концы совпадают
4 Выявлены различия в каталитических свойствах протеиназы AprBi, секретируемой в раннюю и позднюю стационарную фазу роста
5 Установлено, что поздний фермент образует димеры, в формировании которых участвуют ионы кальция
Работы, опубликованные по теме диссертации
1 Кириллова Ю M Условия роста культуры и биосинтеза субтилизиноподобной сериновой протеиназы Bacillus intermedms рекомбинантным штаммом Bacillus subtihs /ЮМ. Кириллова, Е.О. Михайлова, А.М. Марданова, Н.П. Балабан, А.Р. Каюмов, Г H Руденская, С В Костров, M Р Шарипова // Микробиология -2006 -Т73 -№2 -С 1-7
2. Кириллова Ю.М. Особенности биосинтеза субтилизиноподобной сериновой протеиназы Bacillus mtermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtihs / ЮМ. Кириллова, Е.О. Михайлова, A M Марданова, Н.П. Балабан, ГН. Руденская, C.B. Костров, МР Шарипова // Микробиология. - 2006 - Т 73. - № 2 - С. 8-14.
3. Михайлова Е.О. Выделение и характеристика субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedms, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtihs AJ73 на разных фазах роста бацилл / Е О Михайлова, A M Марданова, H П. Балабан, Г H Руденская, M Р Шарипова//Биохимия -2007 -Т.72.-№2 - С 228-235
4. Михайлова Е.О. Стабильность субтилизиноподобной протеиназы Bacillus mtermedius / Е О Михайлова, M Р Каримова, M Р Шарипова // Ученые записки Казанского государственного университета, сер «Естественные науки». - 2007. - Т.149. - № 2. - С.105-114
5 Михайлова Е.О. Влияние d] - факторов на рост культуры и продукцию су&гилизина рекомбинантным штаммом Bacillus subtihs / Е О Михайлова, Л А Маликова, HB Феоктистова, AM. Марданова Н «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», Труды молодых ученых - Казань, 2004 -С. 124-128
6. Кириллова ЮМ Биосинтез субтилизиноподобной протеиназы В mtermedius рекомбинантным штаммом В subtihs /ЮМ Кириллова, Е.О. Михайлова, M Р. Шарипова // Материалы 9-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» - Пущино, 2005 - С 203
7 Кириллова Ю M Закономерности биосинтеза протеиназы Bacillus mtermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis AJ73 /ЮМ Кириллова, Е.О. Михайлова, А Р. Каюмов, M Р. Шарйпова // Материалы XIII международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов структура, функции, применение» - Казань, 2005. -С 44-45
8 Михайлова Е.О. Особенности биосинтеза субтилизиноподобной сериновой протеиназы Bacillus mtermedius в рекомбинантном штамме Bacillus subtihs / Е О Михайлова, Ю M Кириллова, M Р Шарипова // Материалы V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука Инновации Бизнес» -Казань, 2005 - С. 72-73
9 Кириллова Ю М Биосинтез субтилизиноподобной сериновой протеиназы В, intermedius рекомбинантным штаммом В subtilis AJ73 / Ю М Кириллова, Е.О. Михайлова, Н П Балабан, М Р Шарипова // Материалы V научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов НОЦ КГУ «Материалы и технологии XXI века» - Казань, 2005 -С 51.
10 Михайлова Е.О. Биосинтез субтилизиноподобной сериновой протеиназы В intermedins рекомбинантным штаммом В subtilis AJ73 / Е О Михайлова, Ю М. Кириллова, М Р. Шарипова // Материалы Молодежной школы конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». - Москва, 2005. - С 97-98
11 Байрамов Р А Биосинтез внеклеточных сериновых протеиназ Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis /РА Байрамов, Е.О. Михайлова, А Р Сабирова, Ю М Кириллова // Материалы XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» - Новосибирск, 2005 - С 89-90
12 Kayumov A R The prediction of regulation of subtilisin-like proteinase gene from Bacillus intermedius through its regulatory sequence analysis / A.R. Kayumov, J M Kirillova, E.O. Mikhailova, N.P Balaban, M R Sharipova // BGRS-2006 Proceedings of the fifth international conference on Biomformatics of Genome Regulation and Structure - Novosibirsk, 2006 -P 65-69
13.Каримова M.P. Характеристика субтилизиноподобных протеиназ Bacillus intermedius, секретируемых рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis AJ 73 / Е.О. Михайлова, MP Каримова, M.P. Шарипова II Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006» - Москва, 2006 — С 108
14 Михайлова Е.О. Субтилизиноподобные протеиназы Bacillus intermedius, серетируемые рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / ЕО Михайлова, MP Каримова, ГН Руденская, MP Шарипова // Материалы 10-й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» - Пущино, 2006 - С 71
15.Каримова М Р Выделение и некоторые свойства субтилизиноподобных протеиназ Bacillus intermedius, секретируемых рекомбинатным штаммом Bacillus subtilis AJ73 /МР Каримова, Е.О. Михайлова, М Р Шарипова // Материалы VI научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов НОЦ КГУ «Материалы и технологии XXI века» - Казань, 2006 - С 55
16 Михайлова Е.О., Каримова М Р , Шарипова М Р Характеристика субтилизиноподобных протеиназ Bacillus intermedius, секретируемых рекомбинатным штаммом Bacillus subtilis AJ73 / Е О Михайлова, М Р Каримова, MP Шарипова // Материалы VI научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов НОЦ КГУ «Материалы и технологии XXI века» - Казань, 2006 - С 78
17 Михайлова Е.О. Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / Е О Михайлова, Г Н Руденская, М Р Шарипова // Тезисы докладов VI Симпозиума «Химия протеолитических ферментов» - Москва, 2007 -С 69-70
18 Михайлова Е.О. Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus intermedius физико-химические свойства / Е О Михайлова, О В Митрофанова, К П Федорова, М Р Шарипова И Материалы VII научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов НОЦ КГУ «Материалы и технологии XXI века» - Казань, 2007 - С 78
19 Михайлова Е.О. Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtihs AJ73' физико-химические свойства / Е О Михайлова, М Р Каримова, МР Шарипова // Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» - Москва, 2007 - С 27-28
Соискатель Михайлова Е О
Заказ Тираж 100 экз
Офсетная лаборатория Казанского государственного технологического университета
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Михайлова, Екатерина Олеговна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Основные принципы классификации протеолитических И ферментов
2. Сериновые протеиназы
2.1 Классификация сериновых протеиназ
2.2. Эволюция сериновых протеиназ
2.3. Субтилазы - субтилизиноподобные сериновые протеиназы
2.4. Структура и механизм катализа субтилизиноподобных протеиназ
2.5. Свойства субтилизиноподобных протеиназ
2.6. Многообразие физиологических функций сериновых протеиназ
4. Применение субтилизиноподобных протеаз
5. Генная инженерия субтилизиноподобных протеаз бацилл 47 Заключение
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Объект исследования и условия его культивирования
2. Определение протеолитической активности
3. Выделение и очистка протеиназы рекомбинантного штамма
4. Электрофорез в ПААГ
5. Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF)
6. Аминокислотный анализ
7. Определение субстратной специфичности
8. Влияние ингибиторов на активность субтилизиноподобной 60 протеиназы
9. Физико-химические и энзиматические свойства 60 субтилизиноподобной протеиназы
10. Спектральный анализ препаратов субтилизиноподобной 62 протеиназы
11. Гель-фильтрация
12. Биоинформационный анализ
13. Математическая обработка результатов 63 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Подбор питательной среды для эффективной продукции 64 протеиназы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis
2. Выделение и очистка и субтилизиноподобной протеиназы В. intermedius, соответствующей разным стадиям роста рекомбинантного штамма
3. Масс-спектрометрический анализ
4. Анализ первичной структуры протеиназы
5. Влияние ингибиторов на активность протеиназы AprBi
6. Субстратная специфичность препаратов фермента
7. Кинетические параметры
8. Температурный оптимум и термостабильность
9. рН-оптимум и рН-стабильность протеиназ
10. Стабильность препаратов протеиназы в присутствие различных 92 агентов
11. Спектральный анализ препаратов протеиназы В. intermedius, 93 соответствующей разным стадиям роста
12. Влияние ионов двухвалентных металлов на препараты 99 протеиназы
13. Гель-фильтрация препаратов протеиназы, соответствующих 101 разным стадиям роста
14. Электрофорез препаратов протеиназы в нативных условиях
15. Гель-фильтрация после исчерпывающего обессоливания 104 препаратов протеиназы В. intermedius
16. Построение модели третичной структуры субтилизиноподобной Ю протеиназы В. intermedins
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
I. Подбор среды культивирования, выделение и очистка 108 протеиназы, соответствующей разным стадий роста
II. Свойства препаратов протеиназы разных стадий роста ИЗ
III. Особенности структуры протеиназы, секретируемой на разных 124 стадиях роста
ВЫВОДЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus Intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus Subtilis на разных фазах роста"
Актуальность проблемы. Субтилизиноподобные сериновые протеазы - группа протеолитических ферментов, которые обнаружены на всех ступенях эволюционной лестницы: вирусах, бактериях, археях, грибах и высших эукариотах [Rawlings, Barett, 1994]. Несмотря на высокую степень филогенетической удаленности организмов, синтезируемые ими протеиназы имеют немало общего в строении и функциях, что позволяет сделать заключение об эволюционном родстве этих ферментов. Для многих субтилаз известна третичная структура. Распространенность субтилаз в природе свидетельствует о том, что они являются жизненно-важными ферментами. Разнообразие этих белков находит отражение в функционировании субтилаз. Круг процессов, в которые вовлечены эти ферменты, обширен благодаря отсутствию узкой специфичности, сохранению каталитической активности в широких пределах рН и температур, а также различной клеточной локализации. Доказано их участие в процессах эмбриогенеза эукариот, а также в различных патологических состояниях: от болезни Альцгеймера и рака до лихорадки Эбола и ВИЧ [Henrich et al., 2003; Thomas, 2002]. Современная наука располагает данными более чем о 550 прокариотических субтилизиноподобных протеиназ, их число постоянно растет [Siezen et al., 2007]. В клетках прокариот они участвуют в разнообразных физиологических процессах, включая клеточную дифференцировку. Тем не менее, сведения о механизмах вовлечения протеаз в различные процессы, и, в частности, в формирование клеточного ответа в стационарной фазе роста, ограничены. Дальнейшие исследования в этой области будут способствовать пониманию молекулярных механизмов участия этих ферментов в реакциях адаптации микроорганизмов к меняющимся условиям среды.
Ранее показано, что бактерии Bacillus intermedius секретируют различные протеиназы, среди которых доминирует субтилизиноподобная сериновая протеиназа (AprBi); ее доля составляет до 80% от пула внеклеточных протеиназ, выделяемых этими бактериями в среду [Шарипова с соавт., 2000]. Ген субтилизиноподобной протеиназы клонирован в мультикопийную плазмиду pCS9, его экспрессия изучена в рекомбинантном штамме Bacillus subtilis [Sharipova et al., 2007]. Показано, что накопление фермента Bacillus intermedins в культуральной жидкости рекомбинантного штамма достигает максимального значения на 28 (ранняя протеиназа) и 48 ч (поздняя протеиназа) роста. Установлено, что в процессе роста культуры происходит смена механизмов регуляции экспрессии гена протеиназы.
Целью работы явились выделение и характеристика субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedins, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus snbtilis в ранней и поздней стационарной фазе роста.
Основные задачи исследования:
1. Подбор условий культивирования для выделения протеиназы Bacillus intermedins из рекомбинантного штамма Bacillus subtilis на ранней (ранняя протеиназа) и поздней (поздняя протеиназа) стационарной фазе роста культуры.
2. Очистка субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedins, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на ранней и поздней стационарной фазе роста культуры.
3. MALDI-TOF и BLAST анализ аминокислотных последовательностей протеиназы раннего и позднего стационара.
4. Исследование физико-химических свойств субтилизиноподобной протеиназы, соответствующей разным стадиям роста рекомбинантного штамма.
5. Выяснение роли ионов кальция в стабилизации структуры протеиназы, соответствующей разным стадиям культивирования рекомбинантных бактерий.
Научная новизна. Впервые выделена и охарактеризована внеклеточная субтилизиноподобная протеиназа В. intermedins, соответствующая разным стадиям роста рекомбинантного штамма В. subtilis. Впервые проведена сравнительная характеристика свойств протеиназы, секретируемой бациллами в начале и конце стационарной фазы. Установлено, что, обладая идентичной аминокислотной последовательностью, ферменты различаются по каталитическим свойствам. Получены приоритетные данные о способности протеиназы, секретируемой в позднюю стационарную фазу, образовывать димеры. Предполагается, что ведущая роль в формировании димеров принадлежит ионам кальция в кальций-связывающих центрах на поверхности белковой глобулы. На основании аминокислотной последовательности протеиназы предложена модель третичной структуры.
Практическая значимость результатов: Подобраны условия культивирования бактерий для эффективной продукции фермента, секретируемого на ранней и поздней стационарной фазе роста и разработаны условия очистки этих ферментов. Результаты могут быть использованы при разработке стратегии синтеза ферментов промышленными штаммами бактерий. Получение гомогенных препаратов ферментов увеличивает арсенал белков, используемых в научных исследованиях и в практических целях. Данные по стабильности белка открывают возможность применения протеиназы AprBi в качестве добавок к различным детергентам, фармацевтике и в генноинженерных исследованиях.
Связь работы с научными программами: Работа выполнялась в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.02.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования поддержаны грантами РФФИ 05-04-48182-а, Академии наук РТ № 03-3.5-20 и Аналитической Ведомственной Целевой Федеральной Программы РНП 2.11.1005. Положения, выносимые на защиту.
1. Выделена и охарактеризована субтилизиноподобная сериновая протеиназа Bacillus intermedius рекомбинантного штамма Bacillus subtilis, секретируемая в раннюю и позднюю стационарную фазу роста.
2. Ранняя и поздняя протеиназы рекомбинантного штамма Bacillus subtilis имеют идентичную аминокислотную последовательность и близкие энзиматические свойства, но отличаются по каталитическим характеристикам.
3. Поздняя протеиназа Bacillus subtilis, в отличие от ранней, образует димеры, в формировании которых участвуют ионы кальция. Апробация работы: Матерйалы диссертации доложены и обсуждены на международных, всероссийских и региональных конференциях: "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2005, 2006, 2007), школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005, 2006), Всероссийской научной конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004), Всероссийской научной конференции "Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение" (Казань, 2005), V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес» (Казань, 2005), Международной конференции аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», (Москва, 2005, 2006, 2007), Материалах XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» секция биология (Новосибирск, 2005), BGRS-2006: Proceedings of the fifth international conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (Novosibirsk, 2006), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 19 научных работ. Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, включает 10 таблиц, 21 рисунок. Библиография содержит 293 наименований российских и зарубежных авторов.
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Михайлова, Екатерина Олеговна
выводы
1. Подобран состав питательной среды, обеспечивающий высокий уровень активности ранней (28 ч роста) и поздней (48 ч роста) протеиназы Bacillus intermedius в культуральной жидкости рекомбинантного штамма Bacillus subtilis.
2. Из культуральной жидкости рекомбинантного штамма Bacillus subtilis выделена субтилизиноподобная протеиназа Bacillus intermedius, соответствующая разным часам роста, со степенью очистки, составляющей 711 для ранней и 745 - для поздней протеиназы и выходом по активности 9,6 и 16,4%, соответственно.
3. Методом масс-спектрометрии установлено, что ранняя и поздняя протеиназа AprBi имеют идентичную последовательность аминокислот, их N- и С- концы совпадают.
4. Выявлены различия в каталитических свойствах протеиназы AprBi, секретируемой в раннюю и позднюю стационарную фазу роста.
5. Установлено, что поздний фермент образует димеры, в формировании которых участвуют ионы кальция.
Заключение
Субтилизиноподобные сериновые протеазы, обнаруженные у животных и растений, архей и грибов, бактерий и вирусов, представляют собой интереснейший объект как с точки зрения физиологии, так и промышленного применения. Потребность в этих белках у про- и эукариот, а также широкий спектр, выполняемых ими функций, характеризуют субтилизиноподобные протеазы как эволюционно древние ферменты. В течение миллиардов лет физиологическая и молекулярная адаптация прокариотических организмов обеспечили им возможность выживания в любой экологической нише, даже там, где никакие другие формы жизни не могли бы существовать. Определенную роль в этом событии сыграли субтилазы. Участие в патологических состояниях, процессах образования спор и других покоящихся форм могут сделать субтилизиноподобные ферменты незаменимым помощником в решении многих проблем современной биологии и медицины. Обладая разнообразием свойств: широкой субстратной специфичностью, стабильностью при высоких и низких температурах, высокой каталитической активностью в щелочных средах, субтилазы представляют собой основу для создания биотехнологических производств. Микробы - наиболее предпочтительный источник этих ферментов ввиду их быстрого роста, методов культивирования и возможности создания генно-инженерных штаммов и белков. Открытие за последние десятилетия огромного количества прокариотических субтилаз, изучение механизмов экспрессии генов и биохимических свойств этих протеаз, тем не менее, оставляют немало вопросов относительно физиологической роли этих ферментов. Именно поэтому, изучение структурных особенностей субтилизиноподобных протеиназ и механизмов их участия в различных метаболических процессах, включая клеточный ответ в период стационарной фазы, необходимо для понимания функционирования этих белков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Объект исследования и условия его культивирования
Объектом исследования являлся рекомбинантный штамм Bacillus subtilis. Он получен путем трансформации плазмиды pCS9 в протеазо-дефицитный штамм В. subtilis AJ73, из хромосомы которого делегированы гены внеклеточных протеиназ (штамм любезно предоставлен проф. Ю Йомантасом). Мультикопийная плазмида pCS9, сконструированная на основе вектора рСВ22, несет полный ген субтилизиноподобной сериновой протеиназы В. intermedius под собственным промотором (плазмида pCS9 получена в ИМГ, РАН и предоставлена для работы проф. С.В. Костровым).
Pstl(6) НтШ (14)
Ndel (231)
Hindlll (12102)
Ват HI (11276)
Hindlll (11223)
REP 19035
Ndel (10211) J aprBi pCS9
13666 bp
Nco I (9970) Bsp 1191(9583) promoter aprBi
7249(d1) coRV (8281)
Hindlll (7796)
EcoRV (7231) coRI (2649)
Eel 13611 (2657) Kpn I (2665) Sma 1(2667)
EcoRl (3024) Hindlll (3055)
Hindlll (4859) £coRV (5017)
EcoRI (6258)
Sal I (6504)
Рис. 1. Плазмида pCS9 Трансформацию клеток В. subtilis плазмидной ДНК проводили по методу [Anagnostopolous et al., 1961]. Рекомбинатный штамм В. subtilis культивировали в колбах объемом 100 мл при соотношении объема среды к объему колбы 1:5 на качалке 200 об/мин при 30°С. Для культивирования клеток В. subtilis AJ73 (pCS9) были использованы среды следующего состава о): бактериологический пептон («Sigma») - 2, СаС12-2Н20 - 0,06,
MgS04-7H20 - 0,05, NaCl - 0,3, NH4CI - 0,02, MnS04 - 0,01, Na2HP04 - 0,035, pH - 8,5 (пептон-содержащая среда); L-бульон (среда LB, Лурия-Бертани): триптон -10 г/л; дрожжевой экстракт -5 г/л; NaCl -5 г/л; рН 8,5 [Sambrook et al., 1989]. Для получения максимальной продукции субтилизиноподобной протеиназы использовали колламин в концентрации 1, 2% в качестве добавки к среде LB и пептон-содержащей среде. Также производили замену пептона («Sigma») на ферментативный пептон в концентрациях 10-30 г/л. В среды культивирования непосредственно перед посевом добавляли эритромицин в концентрации 20 мкг/мл, так как плазмида pCS9 несет ген устойчивости к данному антибиотику. Посевным материалом служила 18-часовая культура. Среды стерилизовали при 1 атм. Раствор неорганического фосфата стерилизовали при том же давлении и вносили в среды культивирования непосредственно перед посевом.
Контроль за ростом культуры осуществляли, определяя изменение оптической плотности (DonT) культуры. Прирост биомассы определяли нефелометрически на ФЭК-56 ПМ со светофильтром 9 при длине волны 590 нм. За единицу биомассы принимали поглощение в 1-см кювете.
Белок определяли спектрофотометрически (Экспериментальные методы исследования белка и нуклеиновых кислот, 1985), считая, что концентрация белка 1 мг/мл соответствует A2so = 1 оптической единице (опт. ед.) в кювете толщиной 1 см, а также по методу Брэдфорд [Bradford, 1976]. 2. Определение протеолитической активности Определение казеинолитической активности
Протеолитическую активность определяли, используя в качестве субстрата казеин по методу Каверзневой [Каверзнева, 1971]: Казеин в концентрации 2% растворяли в 0,1 М Трис-HCl буфере, рН 9,0. Смесь из 1 мл казеина и 1мл культуральной жидкости инкубировали 15 мин при 37°С, затем добавляли 2 мл 5%-ной ТХУ и инкубировали при той же температуре еще 20 мин. Смесь пропускали через фильтр. К 1 мл фильтрата добавляли 5 мл 6%-ной Ыа2СОз и 1 мл реактива Фолина. Смесь ставили на 20 мин в темноту для полного проявления окраски, а затем измеряли оптическую плотность при длине волны 670 нм на ФЭКе. Параллельно ставили контроль на свободный тирозин следующим образом: смешивали 1 мл культуральной жидкости и 2 мл 5%-ной ТХУ и инкубировали 20 мин при 37°С, после чего добавляли 1 мл 2%-ного казеина и выдерживали еще 15 мин при той же температуре. С фильтратом поступали, как описано выше. Протеолитическую активность рассчитывали по формуле:
ПА = (да,где
Do-Dk - разность поглощения опытной и контрольной пробы при 670 нм; 28 - коэффициент, учитывающий все разведения в процессе определения активности,
Р - предварительное разведение ферментного раствора, 15 - время инкубации, мин.
За единицу казеинолитической активности принимали количество фермента, необходимое для образования 1 мкМ тирозина за 1 мин на 1 мл ферментного раствора.
Определение протеолитической активности на азоказеине
Активность на азоказеине определяли по отщеплению красителя от азоказеина («Sigma», США). Субстратом являлся 1% раствор в 0, 05 М Т-НС1 буфере, рН 8,5. К 200 мл фермента добавляли 400 мкл субстрата. Смесь инкубировали при 37°С. Реакцию останавливали 5% ТХУ и выдерживали в ледяной бане в течение 5 мин. Далее центрифугировали при 13000 об/мин в течение 3 мин. Затем к 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 4Н NaOH и измеряли поглощение при длине волны 410 нм. Расчет проводили по формуле: -2-дс-ЮОО
A=-iis- где
30-200
2 - пересчет на 1 см кювету
1000 - коэффициент пересчета на 1 мл ферментного раствора 30 - время инкубации, мин х - предварительное разведение
За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в данных условиях 1 мкл субстрата за 1 мин.
Определение специфической протеолитической активности
Специфическую активность субтилизиноподобных протеиназ определяли по расщеплению хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa по методу Люблинской и др. [Люблинская с соавт., 1987]. Реакционная смесь состояла из 500 мкл субстрата (0,5 мг/мл) Z-Ala-Ala-Leu-pNa, растворенного в диметилформамиде, 2 мл 0,05 М Трис-HCl буфера, рН 8,5 и 50 мкл раствора фермента. Смесь инкубировали при 37°С от 2 до 60 минут до появления соломенно-желтого окрашивания. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл 50%-й уксусной кислоты. В контрольную пробу, содержащую 500 мкл субстрата и 200 мкл уксусной кислоты, после инкубации при 37°С одновременно с опытной пробой добавляли 50 мкл фермента, и измеряли на спектрофотометре SmartSpec Plus (BioRad, USA) оптическую плотность опытной пробы против контрольной при 410 нм в 1 см кювете.
Активность рассчитывали по формуле: где ПА - активность, мкМ/мин на 1 мл ферментного раствора; D - поглощение раствора при 410 нм; Р = 1000 (расчет на 1 мл раствора фермента); К = 0,37 - коэффициент, учитывающий молярную экстинкцию субстрата;
В - объём пробы фермента в реакционной смеси; Т - время инкубации, мин. За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 мкмоль субстрата за 1 мин. Удельную активность выражали в ед/мг белка.
3. Выделение и очистка протеиназы рекомбинантного штамма
Выделение субтилизиноподобной протеиназы В. intermedins, на разных фазах роста культуры, из 1 л культуральной жидкости В. subtilis проводили с помощью ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе и в системе FPLC на колонке Mono S. В культуральной жидкости рН доводили до 6,3. Культуральную жидкость освобождали от клеток центрифугированием в течение 50 мин при 3000 об/мин на центрифуге К-70 (Janetzki, Польша). Супернатант разбавляли дистиллированной водой в 10 раз и добавляли к КМ-целлюлозе, уравновешенной 0,015 М Na-ацетатным буфером, рН 6,3. Ионообменную хроматографию на КМ-целлюлозе проводили в объеме в течение 35-45 мин, постоянно перемешивая ионообменник. Затем КМ-целлюлозу помещали на колонку, промывали тем же буфером и элюировали белки 0,2 М Na-ацетатным буфером, рН 6,3. В собранных фракциях определяли количество белка и специфическую активность. Фракции с высокой протеолитической активностью объединяли, разбавляли водой в 12 раз и наносили на колонку Mono S 5/5 в системе FPLC «Pharmacia» (Швеция), уравновешенную Na-ацетатным буфером, рН 6,3, содержащим 0,5 мМ СаС12. Элюцию проводили линейным градиентом NaCl (0 - 0,5 М) в том же буфере со скоростью 1 мл/мин. В собранных фракциях определяли специфическую протеолитическую активность и количество белка.
4. Электрофорез в ПААГ Электрофорез в денатурирующих условиях
Степень чистоты полученных белковых препаратов и их молекулярную массу определяли электрофоретически. Электрофорез проводили в 12,5% ПААГ в присутствии SDS по методу Лаэммли [Laemmli, 1970].
Концентрация акриламида в геле составляла 12,5%, бисакриламида -0,12%. Электродный буфер содержал 20,6 мМ т-НС1 и 0,24 М глицина, рН 8,3 -8,4. В верхний буфер добавляли SDS до концентрации 0,1 %. Пробу готовили следующим образом: к раствору белка добавляли равный объем раствора, содержащего 24% глицерина, 4% SDS, 10% меркаптоэтанола и инкубировали 5 мин при 100°С. Оптимальное количество белка, наносимого на одну дорожку геля, равно 5 мкг. Электрофорез проводили в следующем режиме: первые 30 мин сила тока была равна 20 мА, затем силу тока увеличили до 40 мА. Фиксировали гель в растворе, содержащем 45 % этанола и 10% уксусной кислоты в течение часа. Затем гель окрашивали Кумасси ярко-голубым (0,2% Кумасси «Serva», 45% метанола или этанола, 10% уксусной кислоты) в течение 15-20 мин, после чего отмывали в 7% уксусной кислоте и высушивали. В качестве маркеров использовали РНКазу (Биназу) (12,3 кДа), лизоцим (14,4 кДа), РНКазу А (15,7 кДа), ингибитор трипсина (21,5 кДа), пероксидазу (40 кДа) и БСА (бычий сывороточный альбумин) (66 кДа).
Электрофорез в нашивных условиях
Электрофорез белков в нативных условиях проводили по методу, описанному на сайте http://wolfson.huji.ac.il/purification/Protocols/PAGEAcidic.html).
Электрофорез белков проводили в кислых условиях, так как изоэлектрическая точка лежит в щелочной области [Balaban et al., 2004]. Концентрация акриламида в геле составляла 10,0%, бисакриламида - 0,8%. Электродный буфер содержал 35 мМ /3-аланин, 14 мМ уксусную кислоту, рН 4,3. Верхний буфер содержал 1,5 М Na-ацетатный буфер, рН 4,3 и 50% глицерин. Пробу готовили следующим образом: к раствору белка добавляли равный объем раствора, содержащего 50 % глицерина, 25 мМ Na-ацетатный буфер, рН 6,8 и метиленовый зеленый. Электрофорез проводили в режиме, аналогичном электрофорезу в денатурирующих условиях. В качестве маркеров использовали лизоцим (14,4 кДа), фосфатазу (56 кДа) и гемоглобин (68 кДа).
5. Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF)
Очищенные белковые фракции, соответствующие разным стадиям роста культуры (28 и 48 ч), анализировали с помощью метода масс-спектрометрии. Растворы протеиназы В. intermedius обрабатывали трипсином по методике, изложенной на сайте (http://www.biochem.unitzh.ch /services/protocol/ ingeldigestion.pdf). Полученные пептиды различной молекулярной массы идентифицировали на масс-спектрометре Vision 2000 TOF («ThermoBioanalysis», Великобритания). Полученные данные обрабатывали с помощью программ Peptide Mass Fingerprint (http://www.matrixscience.com.) и Peptide Mass (http://cn.expasy.org).
6. Аминокислотный анализ
Аминокислотный состав протеиназ определяли после гидролиза 5,7 Н HCI при 105° в течение 48 часов на аминокислотном анализаторе Hitachi 835 (Япония). Остатки полуцистина и метионина определяли после их окисления надмуравьиной кислотой, триптофан - после гидролиза белка метансульфоновой кислотой в присутствии 0,2%-ного триптамина.
7. Определение субстратной специфичности
Субстратную специфичность полученных фракций ферментов определяли на синтетических и-нитроанилидных субстратах Glp-'Ala-Ala-Leu-pNa, Glp-Phe-Ala-Ala-pNa, Z-Ala-Ala-Val-pNa, Glp-Phe-Gly-pNa, Z-Ala-Ala-Leu-pNa, Z-Glu-pNa, растворенных в 20%-ном ДМФА в конечной концентрации 2 мг/мл, как описано ранее. Расщепление синтетических олигопептидов проводили в 0,05 М Трис-HCI буфере, рН 8,5 при 37°С до появления соломенно-желтого окрашивания. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл 50%-й уксусной кислоты.
Специфичность протеиназ изучали по действию на В-цепь окисленного инсулина овцы как описано в работе [Ицкович с соавт., 1997]. К растворам субстратов в концентрации 1 мг/мл в 0,025 М Трис-HCI, рН 8,5 с 5 мМ СаС12 добавляли 10 мкл раствора фермента (1 мкг/мл) в том же буфере и инкубировали 4 часа при 37°С. Высушенные гидролизаты разделяли в режиме FPLC на колонке (4,6 х 250 мм) Ultrasphere Octyl, используя линейный градиент вода - 70% ацетонитрила в присутствии 0,1% CF3COOH. Элюаты регистрировали при 215 и 280 нм и анализировали на аминокислотном анализаторе Hitachi 835 (Япония) [Leshchinskaya et al., 1997].
8. Влияние ингибиторов на активность субтилизиноподобной протеиназы
Влияние различных ингибиторов на активность субтилизиноподобной протеиназы изучали с помощью овомукоида, ингибитора из морской анемоны, ингибитора трипсина и о-фенантролина в соотношении фермент: ингибитор 1:10, а также PMSF, DTT, пХМБ, бензамидина, ЭДТА в соотношении 1:1000. Раствор белка инкубировали с ингибитором в течение 1 ч при 37°С в Трис-HCl буфере, рН 8,5, специфическую протеолитическую активность определяли в отношении хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa, как описано выше.
9. Физико-химические и энзиматические свойства субтилизиноподобной протеиназы рН-оптимум и рН-стабильность
Для определения рН-оптимума активность ферментов по отношению к Z-Ala-Ala-Leu-pNa определяли в 0,1 М универсальном буфере и 0,05 М Трис-HCl буфере. 0,1 М универсальный буфер содержал 0,04 М растворы СНзСООН, Н3Р04 и Н3ВО3, рН доводили 0,2 М NaOH. Для определения рН-стабильности проводили инкубацию растворов белков в универсальном буфере в течение 1 ч при 25°С, далее добавляли раствор Z-Ala-Ala-Leu-pNa в 20%-ном ДМФА и определяли активность при 37°С, как описано выше. Температурный оптимум и термостабилъностъ
Для определения температурного оптимума активность ферментов по отношению к субстрату Z-Ala-Ala-Leu-pNa измеряли при температуре от 0 до 65°С. Для изучения термостабильности растворы ферментов в 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 8,5, инкубировали при температурах от 0 до 70°С в течение 30 мин, затем добавляли раствор Z-Ala-Ala-Leu-pNa в 20%-ном ДМФА и определяли активность при 37°С, как описано выше. Изучение влияния ионов Са2+ на термооптимум и термостабильность белковых фракций проводили в Трис-HCl буфере, содержащем 5 мМ СаС12, как описано выше. Кинетические константы
Кт для полученных белковых фракций В. intermedius, секретируемых В. subtilis определяли по гидролизу специфического хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa с использованием двулучевого спектрофотометра Lambda 35 «Perkin Elmer» (США). Расчеты проводили при помощи графика, построенного в координатах Лайнуивера-Берка в программной среде «Excel». Каталитическую константу &кат рассчитывали по формуле: ^кат — Vmax/[E] ■> где [Е] - концентрация фермента. Влияние ионов металлов на активность субтилизиноподобной протеиназы
Для изучения влияния ионов двухвалентных металлов на активность субтилизиноподобной протеиназы растворы ферментов инкубировали в 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 8,5, содержащем Mn2+, Ni2+, Cu2+, Со2+, Са2+ и Mg2+ в концентрации от 5 до 20мМ в течение 30 мин при 37°С. Далее добавляли раствор Z-Ala-Ala-Leu-pNa в 20%-ном ДМФА и определяли активность при 37°С, как описано выше. За 100% принята удельная активность фермента без внесения металлов.
Влияние Н2О2 на активность субтилизиноподобной протеиназы
Для изучения влияния Н202 на активность препаратов фермента, соответствующего разным фазам роста, проводили прединкубацию растворов фермента в 0,05 М Трис-НС1-буфере, содержащем 10, 20 и 40 мМ Н202 в течение 1 и 24 ч при 37°С, далее добавляли раствор Z-Ala-Ala-Leu-pNa в 20%-ном ДМФА и определяли активность, как описано выше. Влияние С2Н5ОН на активность субтилизиноподобной протеиназы
Изучение влияния этанола на активность протеиназ проводили в 0,05 М Трис-НС1-буфере, содержащем 5, 10, 25 и 50% С2Н5ОН. После прединкубации ферментных растворов с растворами этанола, активность определяли, как описано выше.
Влияние NaCl на активность субтилизиноподобной протеиназы
Для изучения влияния различных концентраций NaCl на стабильность препаратов протеиназы проводили прединкубацию ферментативных растворов в 0,05 М Трис-НС1-буфере, содержащем 0,5, 1, 2, 5, 10, 15 и 20% NaCl, в течение 1 и 24 ч при 37°С, далее добавляли раствор субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa в 20%-ном ДМФА и определяли активность, как описано выше.
10. Спектральный анализ фракций субтилизиноподобной протеиназы
Спектры гомогенных препаратов белка снимали на двулучевом спектрофотометре Lambda 35 «Perkin Elmer» (США) в диапазоне от 200 до 500 нм.
11. Гель-фильтрация протеиназы
Гель-фильтрацию ферментных растворов проводили на колонке с сефадексом G-100 («Pharmacia», Швеция). В качестве буфера использовали 50 мМ Трис-HCl, содержащий 120 мМ КС1, рН 8,5. В качестве маркеров использовали лизоцим (14,4 кДа), ингибитор трипсина (21,5 кДа), пероксидазу (40 кДа) и БСА (66 кДа). Свободный объем колонки детектировали с помощью голубого декстрана.
Диализ белковых растворов для удаления ионов Са из ферментных растворов проводили против 50 мМ Трис-HCl буфера, содержащего 1% ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), рН 8,5.
12. Биоинформационный анализ
Выравнивание аминокислотной последовательности протеиназы AprBi с последовательностями других субтилизиноподобных протеиназ, а также построение филогенетического древа фермента проведено с помощью программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Процентное соотношение аминокислот в последовательности субтилизиноподобной протеиназы В. intermedius, а также Индекс нестабильности, алифатический индекс и GRAVY индекс рассчитаны с помощью программы ProtParam (www.expasy.org) [Ikai, 1980; Kyte, Doolittle, 1982; Guruprasad et al., 1990].
Модель третичной структуры построена на основании аминокислотной последовательности протеиназы AprBi в программах SwissProt (www.au.expasy.org/spdbv) и YASARA (www. yasara.org). 13. Математическая обработка результатов
Результаты многофакторных экспериментов обрабатывали с помощью программы STATGRAPHICS для персональных компьютеров, позволяющей выводить на экран уравнение регрессии, степень достоверности модели и графические изображения поверхности отклика.
Математическую обработку результатов проводили с помощью программы Microsoft Excel путем расчета среднеквадратичного отклонения (а). Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении а< 10%. В качестве критерия достоверности получаемых разностей использовали критерий Стьюдента, принимая Р<0.05 за достоверный уровень значимости.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Подбор питательной среды для эффективной продукции протеиназы B.intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом В. subtilis
После трансформации плазмиды pCS9, несущей ген сериновой протеиназы В. intermedius в протеазо-дефицитный штамм В. subtilis AJ73 изучали экспрессию гена в рекомбинантном штамме. Накопление протеиназы В. intermedius (протеиназы AprBi) в культуральной жидкости рекомбинантного штамма начинается в фазе замедления роста, достигает максимального значения на 28 и 48 ч роста и зависит от состава питательной среды. Проводили подбор питательной среды для эффективной продукции протеиназы, соответствующей этим часам роста. Для этого варьировали концентрации основных источников азота - пептона и триптона в составе среды культивирования. Наряду с ними использовали колламин в качестве более дешевой замены пептона и триптона в условиях масштабирования процесса очистки. Как видно из таблицы 1, максимальный уровень активности субтилизиноподобной протеиназы в культуральной жидкости отмечен для пептон-содержащей среды и среды LB без внесения дополнительных компонентов и замен одного источника азота на другой: пептона и триптона - на колламин, бактериологического пептона - на ферментативный пептон. Активность фермента в пептон-содержащей среде составила для ранней протеиназы - 0,54 ед/мг, для поздней протеиназы - 1,24 ед/мг, в среде LB - 0,51 и 1,17 ед/мг соответственно. Замена пептона на колламин, а также внесение последнего в качестве дополнительного источника питания снижали активность протеиназы, более чем в 2 раза (0,230,35 ед/мг - для ранней протеиназы, 0,5-0,64 ед/мг - для поздней протеиназы). Использование ферментативного пептона в концентрациях 1030 г/л вместо бактериологического пептона приводило к снижению активности субтилизиноподобной протеиназы, но в меньшей степени, чем при использовании колламина (0,38-0,42 ед/мг - для ранней протеиназы, 0,70,76 ед/мг - для поздней протеиназы). Таким образом, применение колламина и ферментативного пептона в составе питательной среды нецелесообразно. Поэтому для очистки субтилизиноподобной протеиназы из культуральной жидкости рекомбинантного штамма использовали среду LB и пептон-содержащую среду.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Михайлова, Екатерина Олеговна, Казань
1. Акайзин Е.О. Гетерогенность популяции Escherichia coli в процессе индуцированного автолиза / Е.О. Акайзин, С.Е. Воскун, Л.А. Панова, С.Г. Смирнов // Микробиология. - 1990. - Т. 59. - С. 283-288.
2. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз // Под ред. Имшенецкого А.А. М: Наука, 1979. - С. 125-148.
3. Головлёв Е.Л. Другое состояние неспорулирующих бактерий / Е.Л. Головлев // Микробиология. 1998. - Т. 67. - № 6. - С. 725-735.
4. Дилакян Э.А. Цистеиновые протеиназы при неопластической трансформации / Э.А. Дилакян // Материалы конференции «Структура и функции протеолитических ферментов» / Вопросы медицинской химии.- 2000. № 5. / http://www.medi.ru.
5. Иваница В.А. Влияние аминокислот как единственного источника азота на биосинтез экзопротеаз Aspergillus candidus / В.А. Иваница, Н.С. Егоров, М.А. Аль-Нури // Микробиология. 1978. - Т. 74. - № 3. - С. 424-429.
6. Ильинская О.Н. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия /
7. Н. Ильинская, А.И. Колпаков, М.А. М.А. Шмидт, Е.В. Дорошенко, А.Л. Мулюкин, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. 2002. - Т. 71. - №1.-С. 23-29.
8. Люблинская Л.А. р-нитроанилиды пироглутамилпептидов -хромогенных субстратов сериновых протеиназ / Л.А. Люблинская, Т.Л. Воюшина, В.М. Степанов // Биоорганическая химия. 1987. - Т. 13. - № 6.-С. 748-753.
9. Немова Н.И. Эволюция протеолитических ферментов / Н.И. Немова, Л.А. Бондарева, Е.И. Кяйвяряйнен // VI Симпозиум «Химияпротеолитических ферментов». Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, 2007. - С. 5.
10. Новикова Т.М. Внеклеточная протеаза Bacillus alvei 5-724 / Т.М. Новикова, С.Н. Выборных, Н.С. Егоров // Прикладная биохимия и микробиология. 1986. - Т. 22. - № 6. - С. 772-777.
11. Ротанова Т.В. Энергозависимый внутриклеточный протеолиз // Материалы конференции «Структура и функции протеолитических ферментов» / Т.В. Ротанова // Вопросы медицинской химии. 2001. - № 1. / http://www.medi.ru.
12. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизинов / Г.Н. Руденская // Биоорган, химия. 1994. - Т. 20. - № 5. - С. 475-484.
13. Сафонова М.Е. Особенности роста и продукции внеклеточных протеиназ Lactobacillusplantarum ИМ-9/138 / М.Е. Сафонова, Н.И. Астапович, И.А. Буряко // Микробиология. 1999. - Т.68. - № 4. - С. 396-403.
14. Соловьева Н.И. Матриксные металлопротеиназы: регуляция активности и роль в процессе онкогенеза // Материалы конференции «Структура и функции протеолитических ферментов» / Вопросы медицинской химии.- 2000. № 5. / http://www.medi.ru.
15. Степанов В.М. Сериновая протеиназа из Thermoactinomyces vulgaris INMI-4a / В.М. Степанов, Г.Н. Руденская, Н.Г. Нестерова, Т.И. Куприянова, Ю.М. Хохлова, И.А. Усайте, Л.Г. Логинова, Е.А. Тимохина //Биохимия.- 1980. -Т.45.-№ 10.-С. 1871-1880.
16. Хайдарова Н.В. Тиолзависимая сериновая протеиназа Streptomyces thermovulgaris / Н.В. Хайдарова, Г.Н. Руденская, Л.Р. Ревина, В.М.
17. Степанов, Н.С. Егоров // Биохимия. 1990. - Т. 55. - № 6. - С. 11101118.
18. Харвуд К. Бациллы. Генетика и биотехнология. / К. Харвуд // М.: Мир, 1992. С.143-163.
19. Честухина Г.Г., Тиолозависимые сериновые протеиназы / Г.Г. Честухина, А.С. Епремян А.С., Гайда А.В. // Биоорганическая химия. -1982. Т. 8. - № 12. - С. 1649-1658.
20. Шарипова М.Р. Локализация протеолитических ферментов в клетках Bacillus intermedius / М.Р. Шарипова, Е.В. Шакиров, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова, М.А. Шилова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. 2000. - Т. 69. - № 5. - С. 660-667.
21. Шарипова М.Р. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedius / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова, М.А. Шилова, Ю.М. Кадырова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. 2002. - Т. 71. - № 4. - С. 494-499.
22. Aizenman E. An Escherichia coli chromosomal "addiction module" regulated by 3', 5'-bispyrophosphate: a model for programmed bacterial cell death / E. Aizenman, H. Engelberg-Kulka, G. Glaser // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996.-V. 93.-P. 6059-6063.
23. Altschul S.F. Basic local alignment search tool / S.F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, D.J. Lipman // J. Mol. Biol. 1990. - V. 215. - P. 403410.
24. Amann R.I. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. / R.I. Amann, W. Ludwig, K.H. Schleifer // Microbiol. Rev. 1995. - V. 59. - P. 143-169.
25. Anagnostopolous C. Requirements for transformation in Bacillus subtilis / C. Anagnostopolous, J. Spizizen // J. Bacteriol. 1961. - V. 81. - P. 741-746.
26. Aoyama M. Soybean-milk-coagulating activity of Bacillus pumilus derives from a serine proteinase / M. Aoyama, M. Yasuda, K. Nakachi, N. Kobamoto, H. Oku, F. Kato // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. - V. 53. - P. 390395.
27. Arima K. Isolation and characterization of a serine protease from the sprouts of Pleioblastus hindsii / K. Arima, T. Uchikoba, H. Yonezawa, M. Shimada, M. Kaneda // Nakai Phytochemistry. 2000. - V. 54. - № 6. - P. 559-565.
28. Агтоп A. Consurf: An algorithmic tool for the identification of functional regions in proteins by surface mapping of phylogenetic information / A. Armon, D. Graur, N. Ben-Tal // J. Mol. Biol. 2001. - V. 307. - P. 447-463.
29. Arnorsdottir J. Crystal structure of a subtilisin-like proteinase from a psychrotrophic Vibrio species revals structural aspects for cold adaptation / J. Arnorsdottir, M.M. Kristjansson, R. Ficner // FEBS J. 2005. - V. 272. - P. 832-845.
30. Aronson A.J. Regulation of extracellular protease production in Bacillus cereus T. Characterization of mutants producing altered amounts of protease / A.J. Aronson, N. Angelo, S.C. Holt // J. Bacteriol. 1971. - V. 106. - P. 1016-1017.
31. Asif-Ullaha M. Purification and characterization of a serine protease from Cucumis trigonus Roxburghi / M. Asif-Ullaha, K.-S. Kimb, Yu Y. Gyu // Phytochemistry. 2006. - V. 67. - № 9. - P. 870-875.
32. Bagga S. Reconstructing the diversification of subtilisins in the pathogenic fungus Metarhizium anisopliae / S. Bagga, G. Hu, S.E. Screen, RJ.S. Leger // Gene.-2004.-V. 324.-P. 159-169.
33. Baker D. Protease pro region required for folding is a potent inhibitor of the mature enzyme / D. Baker, J.L. Silen, D.A. Agard // Proteins: Struct. Funct. Genet. 1992. - V. 12. - P. 339-344.
34. Barrett A.J. Proteolytic enzymes: serine and cystein peptidases / A.J. Barret // Methods Enzymol. 1994. - V. 244. - P. 1-15.
35. Barett A.J. Proteolytic enzymes: aspartic and metallopeptidases / A.J. Barret // Methods Enzymol. 1995. - V. 248. - P. 183-196.
36. Barrett A.J. Perspectives in biochemistry and biophysics. Familes and clans of serine peptidases / A.J. Barret, N.D. Rawlings // Arch. Biochem. Biophys. -1995. V. 318. - № 2. - P. 247-250.
37. Barros R.J. Enhancement of immobilized protease catalyzed dipeptide synthesis by the presence of insoluble protonated nucleophile / R.J. Barros, Wehtje E., P. Adlercreutz // Enzyme Microb. Technol. 1999. - V. 24. - P. 480-488.
38. Beg Q.K. De-repression and subsequent induction of protease synthesis by Bacillus mojavensis under fed-batch operations / Q.K. Beg, R.K. Saxena, R. Gupta // Process Biochem. 2002. - V. 37. - P. 1103-1109.
39. Beg K.Q. Purification and characterization of an oxidation-stable, thiol-dependent serine alkaline protease from Bacillus mojavensis / Q.K. Beg, R. Gupta // Enzyme Microb. Technol. 2003. - V. 32. - P. 294-304.
40. Berger D. A subtilisin-like serine protease involved in the regulation of stomatal density and distribution in Arabidopsis thaliana / D. Berger, T. Altmann // Genes Dev. 2000. - V. 14. - P. 1119-1131.
41. Bergmann M. The role of specificity in the enzymic synthesis of proteins: synthesis with intracellular enzymes / M. Bergmann, H. Frankel-Conrat // J. Biol. Chem. 1937. - V. 119. - P. 707-720.
42. Betzel C. Three-dimensional structure of proteinase К at 0.15-nm resolution / C. Betzel, G.P. Pal, W. Saenger // Biochemistry. 1988. - V. 27. - P. 155171.
43. Blundell T.L. Comparisons of the sequences, 3-D structures and mechanisms of pepsin-like and retroviral aspartic proteinases / T.L. Blundell, J.B. Cooper, A. Sali, Z. Zhu. // Adv. Exp. Med. Biol. 1991. - V. 306. - P.443-453.
44. Bode W. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases / W. Bode, R. Huber // Eur. J. Biochem. 1992. - V. 204. - P. 433-451.
45. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.
46. Bromme D. Substrate specificity of thermitase, a thermostable serine proteinase from Thermoactinomyces vulgaris / D. Bromme, R. Kleine // Curr. Microbiol. 1984.-V. 11.-P. 93-100.
47. Brenner S. The molecular evolution of genes and proteins: a tale of two serines / S. Brenner // Nature. 1988. - V. 334. - P. 528-530.
48. Burlini N. A heat stable serine proteinase from the extreme thermophilic archaebacterium Sulfolobus solfataricus / N. Burlini, P. Magnati, A. Villa, F. Macchi, P. Tortora, A. Guerritore // Biochem. Biophys. Acta. 1992. - V. 1122.-P. 283-292.
49. Chan Ch.-K. Cytomegalovirus assemblin (pUL80a): Cleavage at internal site not essential for virus growth; Proteinase absent from virions / Ch.-K. Chan, E.J. Brignole, and W. Gibson // J. Virol. 2002. - V. 76. - № 17. - P. 86678674.
50. Cheng Y.E. Alteration of sporecoat processing and protein turnover in Bacillus cereus mutants with defective postexponential intracellular protease / Y.E. Cheng, A.I. Aronson. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1977. - V. 74. -P. 1254-1258.
51. Clapes P. Peptide bond formation by the industrial protease, neutrase, in organic media / P. Clapes, E. Pera, J.L. Torres // Biotechnol. Lett. 1997. -V. 19.-P. 1023-1026.
52. Czapinska H. Structural and energetic determinants of the SI-site specificity in serine proteases / H. Czapinska, J. Otlewski // Eur. J. Biochem. 1999. -V. 260. -№3.- P. 571-595.
53. Dalev P.G. Utilization of waste feathers from poultry slaughter for production of a protein concentrate / P.G. Dalev // Bioresour. Technol. 1994. - V. 48. -P. 265-267.
54. Dancer B.N. Production and possible function of serine protease during sporulation of Bacillus subtilis / B.N. Dancer, J. Mandelstam // J. Bacterid. -1975.-V. 121.-P. 406-410.
55. Durham D.D. Novel alkaline and heat-stable serine proteases from alkalophilic Bacillus sp. Strain 6638 / D.D. Durham, D. Stewart, E.J. Stellawg // J. Bacteriol. 1987. - V. 169. - P. 2762-2768.
56. Durham D.R. The Elastolytic properties of subtilisin GX from alkalophilic Bacillus sp. strain 6644 provides a means of differentiation from other subtilisins / D.D. Durham // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. - V. 194.-№3.-P. 1365-1370.
57. Eder J. Folding of subtilisin BPN': role of the pro-sequence / J. Eder, M. Rheinnecker, A.R. Fersht // Mol. Biology. 1993. - V. 233. - P. 293-304.
58. Errington J. Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expressionand control of morphogenesia / J. Errington // Microbiol. Rev. 1993. - V. 57. -P. 1-33.
59. Esposito R.E. The molecular biology of the yeast Saccharomyces. Life cycle and inheritance. In J.N. Strathern, E.W. Jones, J.R. Broach (ed.) / R.E. Esposito, S. Klapholz // NY.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1981. P. 211-287.
60. Exterkate F.A. Role of calcium in activity and stability of the Lactococcus lactis cell envelope proteinase: applied and environmental / F.A. Exterkate, A.C. Alting // Microbiology. 1999. - V. 65. - № 4. - P. 1390-1396.
61. Enzyme Nomenclature / N.Y.: Academ. Press. 1984. - 862 P.
62. Faraco V. A new subfamily of fungal subtilases: structural and functional analysis of a Pleurotus ostreatus member / V. Faraco, G. Palmieri, G. Festa, M. Monti, G. Sannia, P. Giardina 11 Microbiology. 2005. - V. 151. - P. 457466.
63. Fastrez J. Demonstration of the acyl-enzyme mechanism for the hydrolysis of peptides and anilides by chymotrypsin / J. Fastrez, A.R. Fersht // Biochemistry. 1973. - V. 12. - P. 2025-2034.
64. Feller G. Psychrophilic enzymes: hot topics in cold adaptation / G. Feller, C. Gerday // Nat. Rev. Microbiol. 2003. - V. 1. - P. 200-208.
65. Freeman S.-A. Characterization of a chelator-resistant proteinase from Thermus strain Rt4A2 / S.-A. Freeman, K. Peek, M. Prescott, R. Daniel // Biochem. J. 1993. - V. 295. - P. 463-469.
66. Fontanini D. SEP-1 a subtilisin-like serine endopeptidase from germinated seeds of Hordeum vulgare L. / D. Fontanini, B.L. Jones // Planta. - 2002. - V. 215.-№6. -P. 885-893.
67. Fox T. Potent slow-binding inhibition of cathepsin В by its propeptide / T. Fox, E. de Miguel, J.S. Mort, A.C. Storer // Biochemistry. 1992. - V. 31. -P. 12571-12576.
68. Fujiwara N. Purification and properties of the highly thermostable alkaline protease from an alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp. / N. Fujiwara, A. Masui, T. Imanaka // J. Biotechnol. 1993. - V. 30. - № 2. - P. 245-256.
69. Georgieva D. Catalytic efficiencies of alkaline proteinases from microorganisms / D. Georgieva, N. Genov, W. Voelter, C. Betzel // Z. Naturforsch С. 2006. - V. 61. - № 5-6. - P. 445-452.
70. Gerze A. Partial purification and characterization of protease enzyme from Bacillus subtilis megatherium / A. Gerze, D. Omay, Y. Guvenilir // Biochem. Biotechnol. 2005. - V. 121-124. - P. 335-345.
71. Giddey K. Closely related dermatophyte species produce different patterns of secreted proteins / K. Giddey, B. Favre, M. Quadroni, M. Monod // FEMS Microbiol Lett. 2007. - V. 267. - № 1. - p. 95-101.
72. Govind N.S. Protease and carotenogenesis in Blakeslea trispora / N.S. Govind, B. Mehta, M. Sharma, V.V. Modi. // Phytochemistry. 1981. - V. 20.-P. 2483-2485.
73. Greer J. Comparative modeling methods: Application to the family of mammalian serine proteases / J. Greer // Proteins Struct. Funct. Genet. 1990. -V.73.-P. 317-334.
74. Gron H. Extensive comparison of the substrate preferences of two subtilisins as determined with peptide substrates which are based on the principle of intramolecular quenching / H. Gron, M. Meldal, K. Breddam // Biochemistry. 1992.-V. 3.-P. 6011-6018.
75. Gould G.W. Role of an expanded cortex in resistance of bacterial endospores. Spores VI / G.W. Gould, G.I. Dring // Washington D.C. Amer. Soc. Microbiol. 1975. - P. 541-546.
76. Guinto E.R. Unexpected crucial role of residue 225 in serine proteases / E.R. Guinto, S. Caccia, T. Rose, K. Futterer, G. Waksman, E. Di Cera // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. - V. 96. - № 5. - P. 1852-1857.
77. Gupta R. Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications / R. Gupta, Q.K. Beg, P. Lorenz // Applied Microbiology and Biotechnology. 2002. - V. 59. - P. 15-32.
78. Hall M.R.T. Cytomegalovirus assemblin: the amino and carboxyl domains of the proteinase form active enzyme when separately cloned and coexpressed in eukaryotic / M.R.T. Hall, W. Gibson // Cells Journal of Virology. 1996. -V. 70.-№8.-P. 5395-5404.
79. Hamilton J.M.U. Aral2 subtilisin-like protease from Arabidopsis thaliana: purification, substrate specificity and tissue localization / J.M.U. Hamilton,
80. D.J. Simpson, S.C. Hyman, B.K. Ndimba, A.R. Slabas // Biochem. J. 2003. -V. 370.-P. 57-67.
81. Han X.Q. Stability of protease Q against autolysis and in sodium dodecyl sulfate and urea solutions / X.Q. Han, S. Damodaran // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. - V. 240. - № 3. - P. 839-843.
82. Hartley B.S. Proteolytic enzymes / B.S. Hartley // Annu. Rev. Biochem. -1960.-V. 29.-P. 45-72.
83. Henner DJ. Expression of cloned protease genes in Bacillus subtilis / D.J. Henner, M. Yang, L. Band, J.A. Wells // Proceedings of the 9th International Spore Conference. 1985. - P. 95-103.
84. Heusipp G. HreP, an in vivo-expressed protease of Yersinia enterocolitica, is a new member of the family of subtilisin/kexin-like proteases / G. Heusipp, G.M. Young, V.L. Miller // J. Bacterid. 2001. - V. 183. - № 12. - P. 35563563.
85. Hibbs M.S. Biochemical and immunological characterization of the secreted forms of human neutrophil gelatinase / M.S. Hibbs, K.A. Hasty, J.M. Seyer, A.H. Kang, C.L. Mainardi // J. Biol. Chem. 1985. - V. 260. - P. 2493-2500.
86. Hodgson J. The changing bulk catalysis market: recombinant DNA techniques have changed bulk enzyme production dramatically / J. Hodgson // Biotechnology. 1994. - V. 12. - P. 789-790.
87. Hoffman B. Disruption of the subtilase gene, albinl, in Ophiostoma piliferum / B. Hoffman, C. Breuil // Applied and Environmental Microbiology. 2004. - V. 70. - № 7. - P. 3898-3903.
88. Hu T.T. Cloning and diversity analysis of microorganism genes from alkalescence soil / T.T. Hu, C.J. Jiang, X. Liang, W.J. Long, B. Wu // Yi Chuan. 2006. - V. 28. - № 10. - P. 1287-93.
89. Inouye M. Intramolecular chaperone: the role of the pro-peptide in protein Folding / M. Inouye // Enzyme. 1991. - V.45. - P. 314-321.
90. Isono Y. Enzymic peptide synthesis using a microaqueous highly concentrated amino acid mixture / Y. Isono, M. Nakajima // Process Biochem. -2000.- V. 36.-P. 275-278.
91. Jacobs M. Cloning, sequencing and expression of subtilisin Carlsberg from Bacillus licheniformis / M. Jacobs, M. Eliasson, M. Uhlen, J.-I. Flock // Nucleic Acids Res. 1985. - V. 13. - P. 8913-8926.
92. Jacobson J.W. Composition for cleaning drains clogged with deposits containing hairs / J.W. Jacobson, J.L. Glick, K.L. Madello // US Patent. -1985.-4, 540,506.
93. Jaeger K.-E. Directed evolution and the creation of enantioselective biocatalysis / K.-E. Jaeger, T. Eggert, A. Eipper, M.T. Reetz // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 55. - P. 519-530.
94. Jany K.D. Amino acid sequence of proteinase К from the mold Tritirachium album Limber / K.D. Jany, G. Lederer, B. Mayer // FEBS Lett. 1986. - V. 199.-P. 139-144.
95. Jang J.S. Molecular cloning of a subtilisin J gene from Bacillus stearothermophilus and its expression in Bacillus subtilis / J.S. Jang, D.O. Kang, M.J. Chun, S.M. Byun // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. -V. 184.-№ l.-P. 277-282.
96. Jin Jang H. A novel subtilisin-like serine protease from Thermoanaerobacter yonseiensis KB-1: its cloning, expression, and biochemical properties / H. Jin Jang, B. Chan Kim, Y. Ryang Pyun, Y. Sam Kim // Extremophiles. 2002. -V. 6.-P. 233-243.
97. Johansen G.T. The degradation of the B-chain of oxidized insulin by two subtilisins and their succinylated and N-carbamylated derivatives / G.T. Johansen, M. Ottesen, I. Svedsen, J. Wylrandt // C.R. Lab.Carlsberg. 1968. -V. 36.-P. 365-384.
98. Johnson D.E. Noncaspase proteases in apoptosis / D.E. Johnson // Leukemia. -2000.-V. 14.-P. 1695-1703.
99. Joo H.S. Optimization of the production of an extracellular alkaline protease from Bacillus horikoshi / H.S. Joo, C.G. Kumar, G.C. Park, K.T. Kim, R.P. Seung, C.S. Chang // Process Biochem. 2002. - V. 38. - P. 155-159.
100. Joo H.S. Oxidant and SDS-stable alkaline protease from Bacillus clausii 152: production and some properties / H.S. Joo, C.G. Kumar, G.C. Park, S.R. Paik, C.S. Chang // J. Appl. Microbiol. 2003. - V. 95. - P. 267-272.
101. Jorda L. Local and systemic induction of two defense-related subtilisin-like protease promoters in transgenic Arabidopsis plants. Luciferin induction of PR gene expression / L. Jorda, P. Vera // Plant Physiol. 2000. - V. 124. - № 3.-P. 1049-1058.
102. Kazan D. Purification and characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE 42 / D. Kazan, A.A. Denizci, M.N.K. Oner, A. Erarslan // J. Indust. Microbiol. Biotechnol. 2005. - V. 32. - № 8. - P. 33544.
103. Kim K. Role of proteases in host cell invasion by Toxoplasma gondii and other Apicomplexa / K. Kim // Acta Trop. 2004. - V. 91. - № 1. - P. 69-81.
104. Kim S.H. Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacillus sp. st. DJ-4 screened from Doeng-Jang / S.H. Kim, N.S. Choi // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. - V. 64. - № 8. - P. 1722-1725.
105. Kinal H. A Processing and secretion of a virally encoded antifungal toxin in trans-genic tobacco plants: evidence for a kex2p pathway in plants / H. Kinal, C.-M. Park, J.O. Berry, Y. Koltin, J.A. Bruenn // Plant Cell. 1995. - V. 7. -P. 677-688.
106. Kise H. Protease-catalyzed synthetic reactions and immobilization-activation of the enzymes in hydrophilic organic solvents / H. Kise, A. Hayakawa, H. Noritomi // J. Biotechnol. 1990. - V. 14. - P. 239-254.
107. Klenk H.D. Host cell proteases controlling virus pathogenicity / H.D. Klenk, W. Garten // Trends Microbiology. 1994. - V. 2. - P. 39^3.
108. Koide Y. Cloning and sequencing of the major intracellular serine protease gene of Bacillus subtilis / Y. Koide, A. Nakamura, T. Uozumi, T. Beppu // J. Bacterid. 1986. - V. 167.-№1.-P. 110-116.
109. Kojima M. Isolation and characterization of a feather-degrading enzyme from Bacillus pseudofirmus FA30-01 / M. Kojima, M. Kanai, M. Tominaga, S. Kitazume, A. Inoue, K. Horikoshi // Extremophiles. 2006. - V. 10. - P. 229-235.
110. Kraus E. The specificity of proteinase К against oxidized insulin В chain / E. Kraus, H.-H. Kiltz, U.F. Femfert // Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 1976. -V. 357.-P. 233-237.
111. Krem M.M. Molecular markers of serine protease evolution / M.M. Krem, E. Di Cera // EMBO J. 2001. - V. 20. - № 12. - P. 3036-3045.
112. Krem M.M. Ser214 is crucial for substrate binding to serine proteases / M.M. Krem, S. Prasad, E. Di Cera // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - № 43. - P. 40260-40264.
113. Kumar C.G. Novel enzyme-based detergents: an Indian perspective / C.G. Kumar, R.K. Malik, M.P. Tiwari // Curr. Sci. 1998. - V. 75. - P. 1312-1318.
114. Kumar C.G. Purification and characterization of a thermostable alkaline protease from alkalophilic Bacillus pumilus / C.G. Kumar // Letters in Applied Microbiology. 2002. - V. 34. - № 1. - p. 13-17.
115. Kurotsu Т. Characterization of an intracellular serine protease from sporulating cells of Bacillus brevis / T. Kurotsu, M.A. Marahiel, K.-D. Muller, H. Kleinkauf // J. Bacterid. 1982. - V. 151. - № 3. - P. 1466-1472.
116. Kyte J. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein / J. Kyte, R.F. Doolittle // J. Mol. Biol. 1982. - V. 157. - P. 105-132.
117. Laemmli H.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / H.K. Laemmli // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.
118. Landgraf R. Three-dimensional cluster analysis identifies interfaces and functional residue clusters in proteins / R. Landgraf, I. Xenarios, D. Eisenberg //J. Mol. Biol. -2001. -V. 307. P. 1487-1502.
119. Laplaze L. Characterization of a Casuarina glauca nodule-specific subtilisin-like protease gene, a homolog oiAlnus glutinosa agl2 / L. Laplaze,
120. A. Ribeiro, C. Franche, E. Duhoux, F. Auguy, D. Bogusz, K. Pawlowski // MPMI. -2000. V. 13.-№ l.-P. 113-117.
121. Larcher G. A 33 kDa serine proteinase from Scedosporium apiospermum / G. Larcher, B. Cimon, F. Symoens, G. Tronchin, D. Chabasse, J.-P. Bouchara // Biochem. J. 1996. - V. 315. - P. 119-126.
122. Leduc R. Activation of human furin precursor processing endoprotease occurs by an intramolecular autoproteolytic cleavage / R. Leduc, S.S. Moloy,
123. B.A. Thorne, G. Thomas // Biological Chemistry. 1992. - V. 267. - P. 14304-14308.
124. Leng W.C. Analysis of secreted proteases of Trichophyton rubrum / W.C. Leng, L.L. Wang, C.D. Wei, J. Yang, Q. Jin // Wei Sheng Wu Xue Bao. -2005. V. 45. - № 4. - P. 601-605.
125. Leshchinskaya I.B. Glutamyl endopeptidase of Bacillus intermedius, strain 3-19 / I.B. Leshchinskaya, E.V. Shakirov, E.L. Itskovich et al. // FEBS Lett. -1997.-V. 404.-P. 241-244.
126. Lesk A.M. Conservation and variability in the structures of serine proteinases of the chymotrypsin family / A.M. Lesk, W.D. Fordham // J. Mol. Biol. 1996. - V. 258. - P. 501-537.
127. Lewis J.C. Dormancy. The bacterial spores / J.C. Lewis // London: Academic Press, 1969. P. 301-352.
128. Lim H.A. Hydrolysis of polyesters by serine proteases / H.A. Lim, T. Raku, Y. Tokiwa // Biotechnol Lett. 2005. - V. 27. - № 7. - P. 459-64.
129. Lipkind G.M. A model for the structure of the P domains in the subtilisin-like prohormone convertases / G.M. Lipkind, A. Zhou, D.F. Steiner // Proc. Natl. Acad. Sci. USA Biochemistry. 1998. - V. 95. - P. 7310-7315.
130. Maeda H. Alkaline-resisitance model of subtilisin ALP I, a novel alkaline subtilisin / H. Maeda, O. Mizutani, Y. Yamagata, Ichishima E., T. Nakajima // J. Biochem. 2001. - V. 129. - P. 675-682.
131. Markland F.S. Subtilisins: primary structure, chemical and physical properties. In: The Enzymes, vol. 3 / F.S. Markland, E.L. Smith // London: Academic Press, 1971. P. 561-608.
132. Masui A. Stabilization and rational design of serine protease AprM under highly alkaline and higly temperature conditions / A. Masui, N. Fujiwara, T. Imanaka // Applied and Environmental Microbiology. 1994. - V. 60. - P. 1383-1391.
133. Maxwell K.N. Overexpression of PCSK9 accelerates the degradation of the LDLR in a post-endoplasmic reticulum compartment / K.N. Maxwell, E.A. Fisher, J.L. Breslow // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102. - № 6. -P. 2069-2074.
134. McCune J.M. Endoproteolytic cleavahe of gpl60 is required for the activation of human immunidificiency virus / J.M. McCune, I.B. Rabin, M.B. Feinberg, M. Lieberman, J.C. Kosek, G.R. Reyes, I.I. Weissman // Cell. -1988.-V. 53.-P. 55-67.
135. McPhalen C.A. Structural comparison of two serine proteinase-protein inhibitor complexes: Eglin-C-subtilisin Carlsberg and CI-2-subtilisin Novo / C.A. McPhalen, M.N.G. James // Biochemistry. 1988. - V. 27. - P. 65826598.
136. Melander W.C. Salt effect on hydrophobic interactions in precipitation and chromatography of proteins: an interpretation of the lyotropic series / W.C. Melander, C. Horvath // Arch. Biochem. Biophys. Acta. 1977. - V. 183. - P. 200-215.
137. Menon A.S. Protein substrates activate the ATP-dependent protease La by promoting nucleotide binding and release of bound ADP / A.S. Menon, A.L. Goldberg. // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262. - P. 14929-14934.
138. Miyaji T. Purification and molecular characterization of subtilisin-like alkaline protease BPP-A from Bacillus pumilus strain MS-1 / T. Miyaji, Y.
139. Otta, Т. Nakagawa, Т. Watanabe, Y. Niimura, N. Tomizuka // Lett. Appl. Microbiol. 2006. - V. 42. - № 3. - P. 242-247.
140. Morihara K. Using proteases in peptide synthesis / K. Morihara // Trends Biotechnol. 1987. -V. 5. - P. 164-170.
141. Morinaga N. Two distinct cytoxic activities of subtilases cytoxin produced by shiga toxigenic Escherichia coli / N. Morinaga, K. Yahiro, G.Matsuura, M. Watanabe, F. Nomura, J.Moss, M. Noda // Infect. Immun. 2007. - V. 75. -№ 1.-P. 488-496.
142. Morita Y. Properties of cold-active protease from psychrotrophic Flavobacterium balustinum PI04 / Y. Morita, Q. Hasan, T. Sakaguchi, Y. Murakami, K. Yokoyama, E. Tamiya // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. -V. 50.-P. 669-675.
143. Mulder F.A. Altered flexibility in the substrate-binding site of related native and engineered high-alkaline Bacillus subtilisins / F.A. Mulder, D. Schipper, R. Bott, R. Boelens // J. Mol. Biol. 1999. - V. 292. - № 1. - P. 111-123.
144. Nakagawa A. Method for cleaning a contact lens / A. Nakagawa // US Patent.- 1994.-5, 314, 823.
145. Nakagawa M. Maspin expression and its clinical significance in non-small cell lung cancer / M. Nakagawa, H. Katakura, M. Adachi, К. Takenaka, K. Yanagihara, Y.Otake, H. Wada, F. Tanaka // Ann Surg Oncol. 2006. - V. 13.-№ 11.-P. 1517-1523.
146. Nakamura T. Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene, aprN, of Bacillus subtilis (natto) / T. Nakamura, Y. Yamagata, E. Ichishima // Bioscience Biotechnology Biochemistry. 1992. - V. 56. - P. 1869-1871.
147. Nakashima H. Compositional changes in RNA, DNA and proteins for bacterial adaptation to higher and lower temperatures / H. Nakashima, S. Fukuchi, K. Nishikawa // J. Biochem. 2003. - V. 133. - P. 507-513.
148. Nakayama K. Furin: a mammalian subtilisin/Kex2p-like endoprotease involved in processing of a wide variety of precursor proteins / K. Nakayama // Biochemistry. 1997. - V. 327. - P. 625-635.
149. Narinx E. Subtilisin from psychrophilic antarctic bacteria: characterization and site-directed mutagenesis of residues possibly involved in the adaptation to cold / E. Narinx, E. Baise, C. Gerday // Protein Eng. 1997. - V. 10. - P. 1271-1279.
150. North M.J. Comparative biochemistry of the proteinases of eukaryotic microorganisms / M.J. North // Microbiol. Rev. 1982. - V. 46. - P. 308-340.
151. Ollis D.L. The a/(3 hydrolase fold / D.L. Ollis, E. Cheah, M. Cygler, B. Dijkstra, F. Frolow, S.M. Franken, M. Harel, S.J. Remington, I. Silman, J. Schrag // Protein Eng. 1992. - V. 5. - P. 197-211.
152. Orhan E. Partial purification and characterization of protease enzyme from Bacillus subtilis and Bacillus cereus / E. Orhan, D. Omay, Y. Guvenilir // Appl. Biochem. Biotechnol. 2005. - V. 121-124. - P. 183-194.
153. Реек К. Purification and characterization of a thermostable proteinase isolated from Thermus sp. strain Rt41A / K. Peek, R.M. Daniel, C. Monk, L. Parker, T. Coolbear // Eur. J. Biochem. 1992. - V. 207. - P. 1035-1044.
154. Perea A. Preparation and characterization of whey protein hydrolysates: application in industrial whey bioconversion processes / A. Perea, U. Ugalde, I. Rodriguez, J.L. Serra // Enzyme Microb. Technol. 1993. - V. 15. - P. 418-423.
155. Perona J.J. Structural basis of substrate specificity in the serine proteases / J.J. Perona, C.S. Craik // Protein Sci. 1995. - V. 4. - P. 337-360.
156. Phadatare S.U. Evidence for the involvement of serine protease in the conidial discharge of Conidiobolus coronatus / S.U. Phadatare, M.C. Srinivasan, M.V. Deshpande // Arch. Microbiol. 1989. - V. 153. - P. 47-49.
157. Postemsky C.J. Isolation and characterization of Bacillus megaterium mutants containing decreased levels of spore protease / C.J. Postemsky, S.S. Dignam, P. Setlow // J. Bacterid. 1978. - V. 135. - P. 841-850.1. Л I
158. Rawlings N.D. Evolutionary families of peptidases / N.D. Rawlings, A.J. Barrett // Biochem. J. 1993. - V. 290. - P. 205-218.
159. Rawlings N.D. Introduction: clan SB containing the subtilisin family. In A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds), Handbook of Proteolytic Enzymes // San Diego: Academic Press, 1998. P. 284-288.
160. Rao M.B. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases / M.B. Rao, A.M. Tanksale, M.S. Ghatge, V.V. Deshpande // Microbiology and molecular biology reviews. 1998. - V.62. - № 3. - P.597-635.
161. Rose Th. Substrate recognition drives the evolution of serine proteases / Th. Rose, E. Di Cera // J.Biol.Chem. 2002. - V. 277. - № 22. - P. 19243-19246.
162. Ruppen M.E. of Intracellular Serine Protease Expression in Bacillus subtilis / M.E. Ruppen, G.L. Van Alstine, L. Band // J. Bacterid. 1988. - V. 170. -№ l.-P. 136-140.
163. Sadoff H.L. Heat resistance of spore enzymes / H.L. Sadoff // J. Appl. Bacterid. 1970. - V. 33. - P. 130-140.
164. Saeki K. Novel oxidatively stable subtilisin-like proteases from alkaliphilic Bacillus spp.: enzymatic properties, sequences, and evolutionary relationships / K. Saeki, M. Okuda, Y. Hatada, T. Kobayashi, S. Itu, H. Takami, K.
165. Siezen R.J. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like proteases / R.J. Siezen, J.A. Leunissen // Prot. Sci. 1997. - V. 6. - P. 501-523.
166. Siezen R.J. Evolution of prokaryotic subtilases: Genome-wide analysis reveals novel subfamilies with different catalytic residues / R.J. Siezen, B. Renckens, J. Boekhorst // Proteins. 2007. - V. 67. - № 3. - P. 681-94.
167. Silva-Lopez R.E. Leishmania (Leishmania) amazonensis: purification and characterization of a promastigote serine protease / R.E. da Silva-Lopez, S. Giovanni-De-Simone // Experimental Parasitology. 2004. - V. 107. - № 34.-P. 173-182.
168. Shannon J.D. Amino acid sequence of a Crotalus atrox venom metalloprotease which cleaves type IV collagen and gelatin / J.D. Shannon, E.N. Baramova, J.B. Bjarnason, J.W. Fox // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. -P. 11575-11583.
169. Shinde U. Intramolecular chaperones and protein folding / U. Shinde, M. Inouye / // Trends Biochem. Science. 1993. - V. 18. - P. 442-446.
170. Schuliger J.W. Purification and characterization of a novel amylolytic enzyme from ES4, a marine hyperthermophilic archaeum / J.W. Schuliger,
171. H. Brown, J.A. Baross, R.M. Kelly // Mol. Marine Biol. Biotechnol. 1993. -V. 2.-P. 76-87.
172. So J.E. Protease-catalyzed tripeptide (RGD) synthesis / J.E. So, J.S. Shin, B.G. Kim // Enzyme Microb. Technol. 2000. - V. 26. - P. 108-114.
173. Stabile M.R. Probing the specificity of the SI binding site of M222 mutants of subtilisin B. lentus with boronic acid inhibitors / M.R. Stabile, W.G. Lai, G. DeSantis, M. Gold, J.B. Jones. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996. - V. 6. -P. 2501-2506.
174. Stepanov V.M. A serine proteinase of an archaebacterium Halobacterium mediterranei / V.M. Stepanov, G.N. Rudenskaya, L.P. Revina, Y.B. Gryaznova, E.N. Lysogorskaya, I.Y. Filippova, I.I. Ivanova // Biochem J. -1992.-V. 285.-P. 281-286.
175. Strausberg S.L. Directed coevolution of stability and catalytic activity in calcium-free subtilisin / S.L. Strausberg, B. Ruan, K.E. Fisher, P.A. Alexander, P.N. Bryan // Biochemistry. 2005. - V. 44. - № 9. - P. 32723279.
176. Strongin A.I. Intercellular serine proteinases from spore-forming bacilli / A.I. Strongin, V.M. Stepanov // Biokhimiia. 1981. - V. 46. - P. 1347-1363.
177. Su N.-Y. Pen с 1, a novel enzymic allergen protein from Penicillium citrinum. Purification, characterization, cloning and expression / N.-Y. Su,
178. Suzuki M. A novel member of the subtilisi-like protease family from Streptomyces albogriseolus / M. Suzuki, S. Taguchi, S. Yamada, S. Kojima, K.I. Miura, H. Momose // J. Bacterid. 1997. - V. 179. - P. 430-438.
179. Taguchi S. Engineering of a cold-adapted protease by sequential random mutagenesis and a screening system / S. Taguchi, A. Ozaki, H. Momose // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 492-495.
180. Taguchi S. The complete amino acid substitutions at position 131 that are positively involved in cold adaptation of subtilisin BPN / S. Taguchi, S. Komada, H. Momose // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 66. - № 4. -P. 1410-1415.
181. Takami H. Degradation of human hair by a thermostable alkaline protease from alkalophilic Bacillus sp. No. AH-101 / H. Takami, S. Nakamura, R. Aono, K. Horikoshi // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. - V. 56. - P. 1667-1669.
182. Teplyakov A.V. Crystal structure of thermitase at 1.4 A resolution / A.V. Teplyakov, I.P. Kuranova, E.H. Harutyunyan, B.K. Vainshtein // J. Mol. Biol. 1990.-V. 214.-P. 261-279.
183. Tian B. Cloning, expression and deletion of the cuticle-degrading protease BLG4 from nematophagous bacterium Brevibacillus laterosporus G4 / B. Tian, N. Li, L. Lian, J. Liu, J. Yang, K.Q. Zhang // Arch. Microbiol. 2006. -V. 86.-№4. -P. 297-305.
184. Thomas P.G. Tailoring the pH dependence of enzyme catalysis using protein engineering / P.G. Thomas, A.J. Russell, A.R. Fersht // Nature. 1985. - V. 28.-P. 375-376.
185. Thomas G. Furin at the cutting edge: from protein traffic to embriogenesis and disease / G. Thomas // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2002. -V. 3.-№ 10.-P. 753-766.
186. Torsvik V. High diversity in DNA of soil bacteria / V. Torsvik, J. Goksoyr, F.L. Daae // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - P. 782-787.
187. Tsuchiya K. Purification and characterization of a thermostable alkaline protease from alkalophilic Thermoactinomyces sp. HS682 / K. Tsuchiya, Y.
188. Nakamura, H. Sakashita, Т. Kimura // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. -V. 56.-№2.-P. 246-250.
189. Toogood H.S. Daniel Purification and characterization of Ak.l protease, a thermostable subtilisin with a disulphide bond in the substrate-binding cleft / H.S. Toogood, C.A. Smith, E.N. Bake, R.M. Daniel // Biochem. J. 2000. -V. 350.-P. 321-328.
190. Valbuzzi A. A novel member of the subtilisin-like protease family from Bacillus subtilis / A. Valbuzzi, E. Ferrari, A.M. Albertini // Microbiology. -1999.-V. 145.-P. 3121-3127.
191. Varela H. Skin unhairing proteases of Bacillus subtilis: production and partial characterization / H. Varela, M.D. Ferrari, L. Belobradjic, A. Vazquez, M.L. Loperena // Biotechnol. Lett. 1997. - V. 19. - P. 755-758.
192. Van der Laan J.C. Cloning, characterization and multiple chromosomal integration of a Bacillus alkaline protease gene / J.C. Van der Laan, G. Gerritse, L. Mulleners, R. Van der Hoek, W.J. Quax // Appl. Environ. Microbiol. 1991. -V. 57. - P. 901-909.
193. Vielle C. Hyperthermophilic Enzymes: Sources, Uses, and Molecular Mechanisms for Thermostability / C. Vielle, G.J. Zeikus // Microbiol. Mol. Biol. Rew.-2001.-V. 65.-№ l.-P. 1-43.
194. Von der Osten T. Protein engineering of subtilisins to improve stability in detergent formulations / T. Von der Osten, S. Branner, S. Hastrup, L.
195. Hedegaard, M.D. Rasmussen, H.S. Frantzen, S. Carlsen, J.M. Mikkelsen // J. Biotechnol. 1993. - V. 28. - P. 55-68.
196. Wang L. Prodomain mutations at the subtilisin interface: correlation of binding energy and the rate of catalyzed folding / L. Wang, S. Ruvinov, S. Strausberg, D.T. Gallagher, G.L. Gilliland, P.N. Bryan // Biochemistry. -1995.-V. 34.-P. 15415-15420.
197. Wells J.A. In vivo formation and stability of engineered disulfide bonds in subtilisin / J.A. Wells, D.B. Powers // J. Bid. Chem. 1986. - V. 261. - P. 6564-6570.
198. Wells J.M. Cloning, sequencing and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis / J.M. Wells, E. Ferrari, D.J. Henner, D.A. Estell, E.Y. Chen // Nucleic Acids Res. 1983. - V. 11. - P. 7911-7925.
199. Wintrode P.L. Cold Adaptation of a Mesophilic Subtilisin-like Protease by Laboratory Evolution / P.L. Wintrode, K. Miyazaki, F.H. Arnold // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - № 41. - P. 31635-31640.
200. Wright C.S. Structure of subtilisin BPN at 2.5 A resolution / C.S. Wright, R.A. Alden, J. Kraut // Nature. 1969. - V. 221. - P. 235-242.
201. Wong S.S. Chemical crosslinking and the stabilization of proteins and enzymes / S.S. Wong, L.J.C. Wong // Enzyme Microb. Technol. 1992. - V. 14.-P. 866-874.
202. Wu J. Cloning and analysis of WF146 protease, a novel thermophilic subtilisin-like protease with four inserted surface loops / J. Wu, Y. Bian, B. Tang, X. Chen, P. Shen, Z. Peng // FEMS Microbiology Letters. 2004. - V. 230,-№2.-P. 251-258.
203. Yabuta Y. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone. A Functional peptide chaperone designed using sequence databases / Y. Yabuta, E. Subbian, C. Oiry, U. Shinde // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - № 17. -P. 15246-15251.
204. Yamagata Y. Molecular cloning and nucleotide sequence of the 90k serine protease gene, hspK, from Bacillus subtilis (natto) No. 16 / Y. Yamagata, R. Abe, Y. Fujita, E. Ichishima // Curr Microbiol. 1995. - V. 31. - № 6. - P. 340-344.
205. Yoshimoto Т. Cloning and expression of subtilisin amylosacchariticus gene J / T. Yoshimoto, H. Oyama, T. Honda, H. Tone, T. Takeshita, T. Kamiyama, D. Tsuru // Biochem. (Tokyo). 1988. - V. 103. -№ 6. - P. 1060-1065.
206. Yum D. Y. Purification and characterization of alkaline serine protease from an alkalophilic Streptomyces sp. / D.Y. Yum, H.C. Chung, D.H. Bai, D.H. Oh, J.H. Yu // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994. - V. 58. - № 3. - P. 470-474.
207. Zhao H. Directed evolution converts subtilisin E into a functional equivalent of thermitase / H. Zhao, Arnold F.H. // Protein Engeeniring. 1999. - V. 12. -№ l.-P. 47-53.
208. Zhou R., Wei X., Jiano N., Li H„ Dong Y., His K.-L., and Zhao J. Evidence that HetR protein is an unusual serine protease / R. Zhou, X. Wei, N. Jiano, H. Li, Y. Dong, K.-L. His, J. Zhao // Biochemistry. 1988. - V. 95. - P. 49594963.
209. Zhou A., Webb G., Zhu X., and Steiner D.F. Proteolytic Processing in the Secretory Pathway / A. Zhou, G. Webb, X. Zhu, D.F. Steiner // The J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - № 30. - P. 20745-20748.
-
Михайлова, Екатерина Олеговна
-
кандидата биологических наук
-
Казань, 2007
-
ВАК 03.00.07
- Биологические эффекты бациллярных протеиназ
- Механизмы регуляции экспрессии генов сериновых протеиназ Bacillus pumilus 7P
- Выделение и характеристика протеиназ поздней фазы роста Bacillus intermedius 3-19
- Экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius в рекомбинантных штаммах Bacillus subtilis
- Протеиназы и альдолазы: принципиальные подходы к получению практически значимых бактериальных ферментов
