Экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius в рекомбинантных штаммах Bacillus subtilis

Кириллова, Юлия Марсельевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius в рекомбинантных штаммах Bacillus subtilis
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius в рекомбинантных штаммах Bacillus subtilis"

На правах рукописи

КИРИЛЛОВА ЮЛИЯ МАРСЕЛЬЕВНА

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА СУБТИЛИЗИНОПОДОБНОЙ ПРОТЕИНАЗЫ Bacillus intermedius В РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММАХ Bacillus subtilis

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2006

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии ГОУВПО Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Шарипова Маргарита Рашидовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный

сотрудник Коксин Владимир Петрович (РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ, г. Казань)

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Давыдова Марина Николаевна (Казанский институт биохимии и биофизики РАН, г. Казань)

Ведущая организация: Московский государственный университет,

кафедра микробиологии, г. Москва

Защита диссертации состоится Д 2006 г. в. /3* _часов на заседании

Диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете, 420008, г.Казань, ул.Кремлевская, 18

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета

Автореферат разослан ^ _2006 г.

И.о. ученого секретаря

диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

З.И.Абрамова

/ЖЛ

Актуальность проблемы. В основе механизма адаптации бактерий лежит способность экспрессироватъ гены, которые обеспечивают максимальный рост в неблагоприятных условиях их существования. Для мониторинга и ответа клетки на разнообразие внешних сигналов служит сложноорганизованная сеть сигнальной трансдукции, в основе которой лежит двухкомпонентная система регуляции экспрессии генов. Бактерии, относящиеся к роду Bacillus, реагируют в ответ на изменившиеся условия синтезом различных внеклеточных ферментов для всестороннего использования альтернативных источников питания, секрецией антибиотиков, индукцией подвижности и, в конечном итоге, инициацией споруляции. Бактериальное спорообразование является простой моделью клеточной дифференцировки и характеризуется последовательными и радикальными изменениями в физиологии бактериальной клетки, обусловленными активацией определенных генов регуляторной системой SpoOA-фосфопередачи. Оценить роль этой системы в контроле экспрессии генов можно с использованием штаммов, мутантных по составляющим ее регуляторным белкам. Поскольку протеиназы бацилл, относящиеся к «поздним» белкам, широко используются в практическом отношении, знание молекулярных механизмов регуляции синтеза этих ферментов позволит целенаправленно влиять на уровень их продукции. Результаты исследования регуляции экспрессии соответствующих генов могут быть использованы в биотехнологии, например, для повышения выхода целевых белков путем клонирования и модификации соответствующих генов.

Грамположительные спорообразующие бактерии В intermedius секретируют различные сериновые протеиназы, одна из которых относится к груше субтилизиноподобных сериновых протеиназ, обладающих широкой субстратной специфичностью (Балабан с соавт., 1993). Фермент был выделен из культуральной жидкости, очищен до гомогенного состояния, изучены его физико-химические свойства Клонирование гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы В. intermedius открыло возможность для исследования механизмов регуляции синтеза фермента и его взаимосвязи с клеточной физиологией.

Целью работы явилось выяснение механизмов контроля экспрессии гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы В. intermedius, продуцируемой рекомбинантными штаммами В subtilis на разных стадиях роста бактерий.

В работе решались следующие задачи:

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.-Петербург ОЭ 20(# акт ^ Ц

1. Изучение регуляции биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы В.intermedins рекомбинантным штаммом B.subtilis.

2. Определение значимости катаболитной репрессии в регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius на разных фазах роста рекомбинантным штаммом B.subtilis.

3. Выяснение роли регуляторных белков - компонентов сигнально-сенсорной системы KinA/SpoOF/SpoOA в регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы В. intermedins.

4. Определение вклада SpoOE, SpoOK - белков, участвующих в инициации спорогенеза, в регуляцию экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius рекомбинантными клетками B.subtilis

5. Исследование влияния спороспецифичных ан и стЕ-факторов транскрипции на экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius.

Исследования поддержаны грантами РФФИ 01-04-48037, 05-04-48182, Академии Наук Республики Татарстан 03-3.10-295 и программой CRDF Rec 007.

Научная новизна. В работе установлены основные закономерности экспрессии гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius, которая синтезируется и секретируется в период стационарного роста рекомбинантного штамма B.subtilis. Впервые показано, что в поздней стационарной фазе роста экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы не регулируется по типу катаболитной репрессии, в отличие от фермента, синтезируемого в начале стационарной фазы роста. Получены приоритетные данные, свидетельствующие о том, что экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius подвергается позитивной регуляции со стороны регуляторных белков - компонентов системы сигнальной трансдукции KinA/SpoOF/SpoOA и спороспецифичных он и «7е -факторов транскрипции. Выявленные закономерности расширяют представления о функционировании субтилаз у бацилл.

Практическая ценность работы. Полученные нами сведения о механизмах контроля экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы на разных стадиях роста, включая переход к клеточной дифференцировке, могут быть полезны при разработке стратегии синтеза ферментов промышленными штаммами бацилл. Данные о механизмах функционирования регуляторных систем катаболитных генов, экспрессия которых продолжается при переходе клеток в состояние анабиоза, могут

послужить основой для направленной модификации промоторной области гена с целью получения высокопродуктивных штаммов в условиях ограниченного роста бацилл. Разработаны среды культивирования для выделения протеиназ, соответствующих разным стадиям роста бацилл.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на Международном конгрессе FEMS "Bacillus-2003" (Словения, 2003), Международном конгрессе "Биотехнология - состояние и перспективы развития" (Москва, 2002), Международных научных студенческих конференциях "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2002, 2003, 2005), научных конференциях программы CRDF "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2000, 2001, 2003, 2005), школах-конференциях для молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003), ХП юбилейной конференции "Ферменты микроорганизмов" (Казань, 2001), Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу (Томск, 2002), IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов республики Татарстан (Казань, 2001), республиканском конкурсе научных работ среди студентов и аспирантов на соискание премии им. Н.И. Лобачевского (Казань, 2001,2002). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 38 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовали штамм B.intermedius 3-19 из коллекции Казанского государственного университета, штамм B.subtilis AJ73, дефектный по собственным внеклеточным протеиназам, любезно предоставлен для работы проф. Ю.Йомантасом (Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов), штаммы B.subtilis, дефектные по spoO-, kin-, s ig- генам, а также соответствующие им штаммы с полноценными системами регуляции получены из Bacillus Genetic Stock Center (уаиверситет Охайо, США). В работе использовали мультикопийную плазмиду pCS9, сконструированную на основе вектора рСВ22, с геном субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius под собственным промотором, которая получена и любезно предоставлена для работы проф. C.B. Костровым, Институт молекулярной генетики РАН.

Культивирование мутантных штаммов В subtilis проводили на среде LB (Sambrook et al., 1989). При культивировании клеток рекомбинантного штамма B.subtilis AJ73 (pCS9) в качестве исходной использовали среду следующего состава (%): пептон - 2.0; дрожжевой экстракт - 1.0; СаС12х2Н20 - 0.1; MgS04x7H20 - 0.05; NaCl - 0.3; MnS04 - 0.01; NH4CI - 0.01; Na2HP04 - 0.035; pH - 8.5. При культивировании клеток B.intermechus 3-19 в качестве исходной использовали среду следующего состава (%): пептон - 2.0; СаС12х2Н20 - 0.06; MgS04x7H20 - 0.05; NaCl -0.3; MnS04- 0.01; NH4C1 - 0.02; Na2HP04 - 0.02; pH - 8.5.

В среду добавляли эритромицин в концентрации 20 мкг/мл, т.к. плазмида pCS9 несет ген устойчивости к данному антибиотику. Раствор неорганического фосфата (Ка2НР04), растворы NH4C1 и СбНб07(КН4)2, желатина, казеина, дрожжевого экстракта, глюкозы (1%) и других углеводов, цитрата натрия, а также растворы аминокислот (в конечной концентрации L-аминокислоты - 50 мг/л, DL-аминокислоты - 100 мг/л) и солей металлов вносили стерильно перед посевом.

Прирост биомассы измеряли нефелометрически на КФК-2 при 590 нм. Удельную активность определяли как отношение активности фермента в культуральной жидкости к количеству биомассы и выражали в условных единицах или процентах. Активность субтилизиноподобной протеиназы определяли по гидролизу синтетического хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa (Люблинская с соавт., 1977). Активность Р-галактозидазы определяли по методу, описанному в работе (Миллер, 1976).

Для выявления эндоспор мазок окрашивали по Граму (Гусев, Минеева, 1992). Подсчет клеток со спорами проводили в режиме фазово-контрастной микроскопии не менее чем в 5-ти полях зрения. Подсчитывали общее количество вегетативных и спорулирующих клеток (100%), число последних выражали в процентах. Споры также выявляли с помощью метода, основанного на обработке хлороформом, при последующем высеве на чашку титрования и подсчета жизнеспособных колоний (Ferrari et al., 1988). Фазы спорообразования рассчитывали, как описано в работе (Шлегель, 1987).

Выделение плазмид проводили стандартными методами (Гловер, 1988). Трансформацию клеток B.subtilis проводили, как описано в работе (Anagnostopolous, Spizizen, 1961).

Статистическую обработку результатов проводили в программной среде Microsoft Exel путем расчета среднеквадратичного отклонения (а). Результаты

считали достоверными при среднеквадратичном отклонении ст<15%. В качестве критерия достоверности получаемых разностей использовали критерий СТьюдента, принимая Р <.0.05 за достоверный уровень значимости.

Наряду с традиционными методами исследования влияния экзогенных факторов проводили многофакторные эксперименты. Обработка результатов экспериментов проводилась с помощь» программы STATGRAPHICS Plus for Windows.

Регуляторную область гена apr Bi (AY754946) анализировали при использовании программы BLAST network (Altschul et al., 1997), представленной на сервере the .„National Center for Biotechnology Information's (NCBI) (http://www.ncbi ,n 1m ,ni h. gov).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Закономерности синтеза субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius рекомбинантным штаммом B.subtilis

1. Динамика роста бактерий, биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius и спорообразования рекомбинантного штамма B.subtilis. На рис. 1 представлены динамика роста и накопления активности протеиназы в культуральной жидкости рекомбинантного штамма B.subtilis AJ73 (pCS9). Характер роста и накопления активности фермента сохраняются такими же, как у исходного штамма В. intermedius 3-19: обнаружены два пика протеолитической активности на 28-й и 48-й ч, что соответствуют ранней и поздней стационарной фазе роста бактерий. Эти результаты свидетельствуют о корректном протекании процессов биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius в рекомбинантных клетках B.subtilis и об адекватности использованной нами векторной системы для изучения экспрессии гена протеиназы. Удельная скорость накопления субтилизиноподобной протеиназы

(ё) в культуральной жидкости рекомбинантного штамма нарастала в период, когда удельная скорость роста культуры (ц) падала (рис. 1). Уровень накопления "позднего" фермента в 3 раза превышает таковой в ранней стационарной фазе.

6 14 22 30 38 46 54 6 16 26 36 46 56

Время, ч Время,ч

Рис. 1. Динамика роста (1), протеолитической активности (2), удельной скорости роста (р.) (3), и удельной скорости накопления фермента (е) (4), спорообразования (5), (3-галактозидазной активности (6) и количество спор (7), полученных путем титрования хлороформустойчивых форм, рекомбинантного штамма В тЬНШ АЛЗ (рСБ9) (ст < 10%)

С применением репортерного белка Р-галактозидазы, нами установлено, что второй пик протеолитической активности не является результатом накопления белка в культуральной жидкости вследствие лизиса клеток, а секретируется рекомбинантным штаммом В.виЬНШ АЛЗ (рСБ9) и по времени соответствует стадиям созревания эндоспоры (стадии У-У1, рис, 1). Итак, образование первого пика протеиназы рекомбинантным штаммом соответствует стадии инициации споруляции, второго - стадии созревания эндоспор и автолиза спорангия. 2. Влияние факторов среды на экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы В-ШегтесИю рекомбинантным штаммом ВлиЬНШ. Для выяснения условий биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы В. ШегтесНих рекомбинантным штаммом В.зиЫШй провели исследование влияние ряда факторов среды на эффективность продукции фермента в стационарной фазе роста. Влияние пептона и неорганического фосфата на экспрессию гена протеиназы. В результате постановки многофакторных экспериментов установлены различия в содержании основных компонентов питательной среды - пептона и неорганического фосфата. В ранней стационарной фазе роста рекомбинантного штамма для синтеза

фермента требуется меньшая концентрация неорганического фосфата (0,24 г/л) в среде и большая концентрация пептона (30 г/л), чем для 'биосинтеза фермента исходным штаммом В. Шегте&ш. Потребность в пептоне для продукции фермента рекомбинантным штаммом, как в ранней, Так и в поздней стационарной фазе возрастает по сравнению с исходным штаммом в 1,1-1,4 раза. Возможно, это объясняется большей потребностью в источниках питания для клеток рекомбинантого штамма. Нами показано, что для биосинтеза протеиназы в поздней стационарной фазе роста потребность бактерий в фосфоре и пептоне незначительно отличается от соответствующих данных для синтеза фермента в раннем стационаре того же штамма.

Влияние белковых субстратов и дрожжевого экстракта на экспрессию гена протеиназы. Удельная активность бактерий В.яиЫШз АПЗ (рСБ9) в отношении синтеза протеиназы первого и второго пика увеличивается при внесении в питательную среду казеина И желатина в концентрациях 0,5% и 1% (рис. 2). Однако для активации биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы рекомбинантным штаммом в поздней стационарной фазе роста (на 48-й час) необходимы более низкие концентрации добавок по сравнению с "ранним" ферментом.

При исследовании влияния дрожжевого экстракта на экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы рекомбинантным штаммом, установлено, что его внесение в среду культивирования в концентрации 0,5% оказывало положительный эффект на синтез "раннего" фермента (увеличение в 1,5 раза) и незначительно

Рве. 2. Влияние желатина (1) и казеина (2) на продукцию субтилизиноподобной протеиназы рекомбинантным штаммом В subtilis на 28-й (А) и 48-й (Б) часы культивирования. За 100 % приняты значения удельной активности на среде, не содержащей органических субстратов.

Дальнейшее увеличение концентрации дрожжевого экстракта до 2% приводило к снижению удельной активности фермента на 60% - 90%. По-видимому, низкие концентрации дрожжевого экстракта необходимы рекомбинантному штамму В.Шегтес1ш в качестве дополнительного фактора роста. Однако его более высокие концентрации, возможно, регулируют синтез фермента по типу репрессии конечным продуктом. Изменения в уровне экспрессии гена арг В! на разных стадиях роста под влиянием различных экзогенных факторов свидетельствуют о возможных изменениях в регуляции синтеза фермента на разных фазах роста. Влияние Сахаров на экспрессию гена протеиназы. Для сериновых протеиназ описана репрессия синтеза ферментов глюкозой. У рекомбинантных штаммов потребность в легкоусвояемых источниках углерода может быть иной, чем у исходного штамма. При исследовании воздействия различных моносахаридов (глюкоза, галактоза, маннит) и дисахаридов (сахароза, мальтоза, лактоза) на продукцию рекомбинантным штаммом субтилизиноподобной протеиназы ВлЫегтейш, нами установлено, что во всех случаях рост рекомбинантного штамма интенсифицировался, параллельно снижалась удельная активность субтилизиноподобной протеиназы (рис. 3).

А Б

Í 120 -i

о 2

1 100 -

3 80 ■

8 60 -

40 -

20 ■

0 -

■ галактоза □ глюкоза

»маннит

,140

■ сахароза □ лактоза

И мальтоза

0,5

Концентрация углевода, % 28 ч 48ч 28 ч 48ч 28 ч 48ч

Рис. 3. Влияние моно- (А) и дисахаридов (Б) на продукцию субтилизиноподобной протеиназы рекомбинантным штаммом В subtilis на 28-й и 48-й часы культивирования За 100% приняты значения удельной активности на среде, не содержащей Сахаров.

Ингибирующее действие более выражено в отношении глюкозы и мальтозы. Повышение концентрации экзогенных Сахаров до 2 %, приводило к увеличению эффекта инунбирования синтеза фермента. Эффект репрессии в большей степени наблюдался по отношению к субтилизиноподобной сериновой протеиназе ранней стационарной фазы роста. В меньшей степени понижение удельной активности субтилизиноподобной протеиназы на обеих фазах роста вызывали лактоза, галактоза и маннит (30-60%). Низкие концентрации сахарозы (0,5 %) оказывали стимулирующее действие на биосинтез фермента в раннем и позднем стационаре (на 20-40%), увеличение ее концентрации до 2 % приводило к снижению удельной активности фермента в полней стационарной фазе роста (на 10%). По нашим данным, экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы регулируется по механизму катаболитной репрессии глюкозой. Возможно, что невысокие концентрации (0,5%-1%) других легкоусвояемых источников углерода, таких как сахароза и маннит, необходимы для роста и синтеза фермента рекомбинантным штаммом в качестве дополнительного источника углерода.

Влияние ионов двухвалентных металлов на экспрессию гена протеиназы. Ионы двухвалентных металлов и, в частности, ионы Са2т играют важную роль при формировании каталитически активной конформации протеиназ (Siezen et al., 1991). В третичной структуре субтилаз (термитазы и протеиназы К) обнаружены три поверхностных Ca - связывающих сайта (Betzel et al., 1990). Ионы Са2+ стабилизируют третичную структуру фермента, повышая термостабильность и препятствуя частичному разворачиванию белковой глобулы. Последовательное удаление поверхностных Са-связывающих сайтов из структуры белковой глобулы путем делеций образующих их аминокислотных остатков приводило к снижению молекулярной активности субтилизина на 10-20%, вследствие неправильного сворачиваний белка (Leloup et al., 1997). Нами изучено влияние ионов двухвалентных металлов на накопление субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius рекомбинантным штаммом B.subtilis в ранней и поздней стационарной фазе роста. Оптимальным условием для биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы ранней стационарной фазы является присутствие в среде ионов Са2+ (5 мМ) (рис. 4). Активация ионами Са2+ эффективнее выражена в отношении фермента, синтезируемого рекомбинантными клетками на 48-й ч роста.

20 -

1 2 5 10 15 Концентрация, мМ

2 5 10 15 Концентрация, мМ

Рис. 4. Влияние ионов двухвалентных металлов на продукцию субтилизиноподобной протеиназы рекомбинантным штаммом В ,гиА//7« АЛЗ (рС89) на 28-й (А) и 48-й (Б) часы культивирования.

Интересные данные получены при исследовании влияния ионов и Мп2+: оба подавляли активность фермента в раннем стационаре и не влияли на уровень активности протеиназы на 48 час роста. Остальные ионы металлов Хп2+, Со2+, Бе2+ и Си2+(1-15 мМ) подавляли рост и биосинтез протеиназы в ранней и поздней стационарной фазе роста (рис. 4).

Влияние аминокислот на экспрессию гена протеиназы. Протеиназы целесообразно рассматривать не только как деградативные ферменты, но и как ферменты, создающие запасы аминокислот для биосинтетических целей. Исследовали влияние на экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы В. ШегтесИш рекомбинантным штаммом индивидуальных аминокислот и их комплексов. Установлен стимулирующий эффект на синтез фермента цистеина (180%), гистадина (150%), аспарагина (140%), триптофана (140%), глутамина (130%), и глутамата (130%) (рис. 5). Лейцин стимулировал биосинтез фермента ранней стационарной фазы и не влиял на продукцию позднего фермента. Остальные аминокислоты не оказывали влияния на синтез фермента (рис. 5).

Нами показано, что казаминовые кислоты в концентрации 0,1-1% стимулировали продукцию протеиназы рекомбинантным штаммом на 20-50%.

123456789 10

Аминокислоты

Рис. 5. Влияние индивидуальных аминокислот на продукцию субтилизиноподобной протеиназы рекомбинантным штаммом В^иЬиШ АЛЪ (рС89) на разных фазах роста. За 100% принята удельная активность культуры в отношении синтеза протеиназы без добавления аминокислот в среду 1- Ь-аланин; 2 - Ь-валин; 3 - ЭЬ-лейцин; 4 - РЬ-цистеин; 5 - ОЬ-аспарагин; 6 - ЭЬ-глутамин; 7 - ОЬ-триптофан; 8 - БЬ-гистидин; 9 - БЬ-глутаминовая кислота; 10 - Ь-аспарагиновая кислота (Ь - 50 мг/л, БЬ -100 мг/л).

Увеличение концентрации до 2 % приводило к ингибированию синтеза фермента. Стимулирующий эффект аминокислот и их комплексов, по-видимому, связан с их использованием бактериями в качестве дополнительного источника азота необходимого для культивирования рекомбинантного штамма.

Таким образом, закономерности синтеза субтилизинподобной протеиназы В ШегтесИш рекомбинантными клетками В.яиЫШз в стационарной фазе роста не отличаются от таковых для синтеза других сериновых протеиназ бактерий: биосинтез фермента активируется в присутствии белковых субстратов - казеина и желатина, неорганического фосфата, ионов кальция. Однако каждый из исследуемых экзогенных факторов не одинаково влияет на синтез фермента на разных стадиях, и это может быть отражением смены механизмов регуляции фермента в стационарной фазе роста. Характерной особенностью «шляется отсутствие подавления синтеза фермента в поздней стационарной фазе роста легкометаболизируемыми источниками углерода по типу катаболитной репрессии, что также свидетельствует в пользу предположения о смене механизмов регуляции экспрессии гена протеиназы в поздней стационарной фазе роста.

П. Взаимосвязь синтеза внеклеточной субтилизиноподобной сериновой

протеиназы со спорообразованием

Образование стратегических ферментов - внеклеточных протеиназ, участвующих в белковом обмене между клеткой и средой, связывают с различными физиологическими процессами бактерий, и в частности, со споруляцией. Спорообразование - это сложный процесс клеточной дифференцировки, приводящий к образованию материнской клеткой зрелых эндоспор, которые затем освобождаются в среду. Обычно процесс эндогенного спорообразования стимулируется недостатком питательных веществ в среде. По нашим данным в период перехода вегетативных клеток к спорообразованию бациллы продолжают эффективно секретировать протеиназы.

1. Роль катаболитной репрессии в регуляции экспрессии гена протеиназы на разных фазах роста рекомбинантного штамма и спорообразовании. Нами установлено, что добавление 1% глюкозы к исходной среде до начала культивирования или в период ранней стационарной фазы роста вызывало снижение количества спор на 90 %. Внесение глюкозы на 26-й час роста и далее приводило к снижению количества спор на 8-10 %. Таким образом, наличие глюкозы в среде до стадии инициации приводит к полному или частичному подавлению споруляции по механизму катаболитной репрессии, внесение глюкозы после инициации спорообразования не оказывает влияния на дальнейшее осуществление процесса цитодифференцировки.

При исследовании влияния глюкозы (1 %), внесенной в питательную среду на разные часы роста культуры, на экспрессию протеиназы рекомбинантным штаммом В.зиЬиНх, нами установлено, что ее добавление в среду до начала культивирования или в период ранней стационарной фазы роста на 21-й, 24-й и 26-й часы роста резко снижало уровень синтеза фермента (рис. 6). Внесение глюкозы в среду культивирования на 28-й ч и позже после инициации процесса спорообразования не вызывало последующего снижения уровня удельной активности протеиназы. Из полученных данных следует, что катаболитная репрессия регулирует биосинтез "раннего" фермента и не влияет на синтез "позднего". Эти данные свидетельствуют, что при переходе бактерий к клеточной дифференцировке происходит смена механизмов регуляции экспрессии поздних генов, которые также активны в период стационарного роста, но их активация, по-видимому, происходит иными способами, чем в период вегетативного роста.

Время, ч

Рис. 6. Влияние глюкозы на удельную активность субтилизиноподробной протеиназы рекомбинантного штамма В ¡иЬШЬ АЛЗ (рС89) Стрелками указано время внесения глюкозы (1%-й) в среду культивирования. 1 - удельная активность на среде без глюкозы, 2 - удельная активность на среде с глюкозой, 3-9 - удельная активность на средах с глюкозой, внесенной на разные часы роста.

2. Влияние яроОА мутаций на экспрессию гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы В.ШеттеНия. При переходе бактерий к споруляции ключевая роль принадлежит регуляторному белку вроОА. Синтез многих клеточных белков, экспрессия которых продолжается в этот период, находится под его положительным контролем. Представляло интерес провести поиск вроОА-боксов (ТОГСОАА) в промоторной области гена арг В! субтилизиноподобной протеиназы В ШегтесИш.

Анализ нуклеотидной последовательности позволил выявить участки с 70-86% гомологией для взаимодействия со специфическим регуляторным белком БроОА (рис. 7). Они располагаются в виде прямых тандемных повторов. Такое строение промоторной области должно способствовать увеличению частоты инициации транскрипции в условиях активации БроОА-белка.

Выявленные сайты регуляции в промоторной области гена арг В1 позволили предположить возможное участие двухкомпонентной системы БроОА-фосфопередачи в регуляции экспрессии гена арг Вк

1 СМТСйААССТССТТСАТТАСААССТССТСАСССАТТТАСТССАТССТССССТТ 1 2 55 тт[гааасаа|сстсттаттбтаасассттктттттмад|тсссааа1ассаааааат

109 аататтттттта|гатссаа|аттс6ааатасатсста0ас0тттстасстатттта

164 ас6сттттсс05[гатсеаа|татттстсссаааатебатсатаасааааааа6сас

219 асттсстттттаатасатаас|с6ст6аа|аса6са6аасааасататтттсссаас б

21А 6тттссаас|тсастта|аттссссааттттссстассастттсасаааааттсс66

7 8 9

329 тстастсттатт)т6сстас[ТТСССТТАААСТСААТА|тасасаф'аатс|ааас6аа|

-35 10__-Ю БЭ

384 тсагтсатата6а|стассаа1тсаттаттстсадагадааааааасосатст66ат

439 ТбТССвТвАААААСАААААТБТбАТС

Ряс. 7. Промотор гена арг Вь Последовательность Шайна-Дельгарно (БО), сайт инициации трансляции (ОТв) выделен жирным, -10 и -35 области обозначены жирным, курсивом и подчеркнуты. Потенциальные ЗроОА-боксы выделены рамкой. Участки с 86% гомологией к ЗроОА-боксу: (2; 3; 4; 7; 8; 9; 10), участки с 71% гомологией: (1; 5; 6). ТСКСОАА -ЗроОА-бокс.

Система БроОА-фосфопередачи, участвующая в инициации споруляции, основана на фосфорилировании БроОА фактора транскрипции путем передачи фосфата от множественных гистидин киназ на переносчики фосфата 8роОР и ЭроОВ и затем на вроОА белок (рис. 8). 8роОА~Р специфически дефосфорилируется фосфатазой БроОЕ, а 8роОР~Р - фосфатазами Кар-семейства (Реге£о, Вгапш§ап, 2001), последние ингибируются специфическими олигопептидами, поступающими в клетку через цитоплазматическую мембрану (Я^гег е1 а!., 1997). Транспорт олигопептидов в клетку контролируется мембраносвязанным белком ЗроОК (Регейо, Вгапт§ап, 2001).

КтВ КтА КтС КтБ КтЕ

SpoOK -* PhrA, С, Е —| RapA, В, Е -|*Spo0F

SpoOB

SpoOA SpoOE Sporuldtion

Рис. 8. Инициация спорообразования. (Piggot, Hilbert, 2004).

Исследовали характер экспрессии гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы в различных штаммах В.зиЬЛШ, мутантных по гену эроОА, трансформированных плазмидой рСЭ9 (рис. 9). Установлено более чем 98%-ое ингибирование протеолитической активности субтилизиноподобной протеиназы по сравнению с контрольным штаммом с полноценным геном зроОА. По-видимому, ЭроОА белок, участвует в позитивной регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы В. ШегтесНия.

90 т

spoOA

22 26 30 34 38 42 46

50 54 58 Время, ч

Рис. 9. Экспрессия гена apr Bi субтилизиноподобной протеиназы В intermedius в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов B.subtilis, дефектных по регуляторному белку SpoOA.

3. Влияние супрессорной spoOAabrB мутации на экспрессию гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы. Исследовали характер экспрессии гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы в супрессорных штаммах B.subtilis, мутантных одновременно по двум генам spoOAabrB, в которых abrB-мутация компенсирует дефект spoOA-гена, (рис. 10). В двойных мутантах spoOA 12abrB23 экспрессия гена apr Bi восстанавливается и превышает уровень контроля в среднем в 2 - 3 раза (рис. 10). Полученные данные подтверждают участие SpoOA - белка в позитивной регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы В intermedins, а также позволяют нам сделать предположение о репрессирующем действии регуляторного белка AbrB на экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы.

250 -г

1 200 -j 1

I 150 -

се §

3 ioo -

50 -

0 T I-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1

22 26 30 34 38 42 46 50 54 58

Время, ч

Рис. 10. Экспрессия гена apr Bi в мутантных штаммах ьроОАаЬгВ

4. Влияние kinA мутаций на экспрессию гена субтилизиноподобной ссриновой протеиназы. Для выяснения роли гистидин киназы KinA, участвующей в регуляторной системе SpoOA - фосфопередачи, в активации гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы В intermedius исследовали характер экспрессии гена apr Bi в штамме В subtilis, мутантном по гену ШЛ82 (рис. 11).

22 26 30 34 38 42 46 50 54 58

Время, ч

Рис. 11, Экспрессия гена apr Bi рекомбинантного штамма В bublihs. дефектного по регуляторному белк> KinA

Нами установлено 95% ингибирование протеолитической активности в мутантном штамме по сравнению с контрольным вариантом. Таким образом, результаты свидетельствует о возможном участии гистидин киназы КлпА в позитивной регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы В МегтесНиз 5. Влияние ьроОГ и ¿/»»ОЯ-мутаций на экспрессию гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы ВлМегтеШт. Чтобы выяснить участвуют ли компоненты регуляторной системы вроОА - фосфопередачи в активации гена арг В1 изучали экспрессию данного гена в вроОР и вроОВ-мутантах. В штамме, В яиЬйУм Ш649, мутантном по фосфотрансферазе БроОР, уровень экспрессии гена субтилизинопоодобной протеиназы снижался на 85-90% (рис. 12), по сравнению со штаммом с полноценным белком БроОР. После трансформации плазмиды в вроОВ -мутантный штамм уровень протеиназной активности в среде оставался низким при культивировании в течение 50 часов и составил 10% от контроля.

80 -г

70 -

в 60 -

а 50 -

40 -

сЗ $ 30-

к =г 20 -

10 -

0 -■

¡роОР221

24 28 32 36 40 44 48

Время, ч

Рис. 12. Экспрессия гена арг В1 рекомбинантных штаммов В ¡иЪШк, дефектных по регуляторным белкам ЭроОР и БроОВ.

Таким образом, белки БроОР и ЭроОВ, компоненты регуляторной системы БроОА - фосфопередачи, должны быть в функционально-активном состоянии для положительной экспрессии гена арг В!. Результаты свидетельствуют, что данная регуляторная система может участвовать в контроле экспрессии гена протеиназы. Более того, из этих данных следует, что белок 5роОА, выполняющий роль фактора транскрипции, должен находиться в фосфорилированном состоянии. Именно в активации этого белка участвуют вроОР и 8роОВ-белки, осуществляя это в процессе

последовательных фосфотрансферазных реакций (рис. 8). Полученные нами данные подтверждают важную роль фосфотрансфераз БроОР и вроОВ в потоке фосфата на регулятррный йроОА - белок.

б. Влияние щроОЕ и «ровАГ-мутаций на экспрессию гена субтилизиноподобной сернновой протеиназы В.ШегтеШш. Поток фосфата через систему БроОА-фосфопередачи может быть остановлен специфическими фосфатазами, к которым относится БроОЕ фосфатаза, участвующая в дефосфорилировании белка БроОА-Р. В штамме В.зиЬНШ Ш647, мутантном по гену яроОЕ, уровень экспрессии гена арг В1 снижался в среднем до 20% (рис. 13 А). Полученные нами данные свидетельствуют о слабом влиянии зроОЕ мутации на экспрессию гена арг Вь

о X а

х ►а

I I I I I I

spoOE12 i i i i i i i i

24 28 32 36 40 44 48 52 58 Время, ч

24 28 32 36 40 44 48 52 56

Время, ч

Рис. 13 Экспрессия гена арг ЕН рекомбинантных штаммов ВзиЫШз, дефектных по белкам БроОЕ (А) и вроОК (Б).

В штамме, дефектном по вроОК белку, который участвует в транспорте олигопептидов, экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы ингибировалась на 90% (рис. 13 Б). Отсутствие протеолитической активности в штамме, дефектном по вроОК белку, свидетельствует о зависимости экспрессии гена арг В1 от ЭроОК-регуляторного белка. Возможно, протеиназа участвует в деградации и процессинге специфических олигопептидов, предназначенных для транспорта внутрь клетки, на наружной стороне мембраны. Ранее установлено, что в процессе секреции в среду каталитически активная форма субтилизиноподобной протеиназы ВЛпХегтесНиз обнаруживается в мембране и отсутствует в цитоплазме (Шарипова с соавт., 2000).

На этом основании можно предположить, что субтилизиноподобная протеиназа может выполнять регуляторную роль в функционировании системы БроОА-фосфопередачи.

7. Влияние спороспецнфичных я" и лЕ факторов транскрипции на экспрессию гена субтилнзиноподобной сериновой протенназы. Наряду с двухкомпонентной системой контроль спорогенеза осуществляется путем системной регуляции спороспецифичными сигма - факторами транскрипции. В работе использовали штамм В.БиЬПШ Ш651, содержащий мутацию в гене sigH81. В штамме с инактивированным сгн фактором транскрипции экспрессия гена арг В1 снижалась более чем на 90% по сравнению со штаммами с полноценным геном йроОН (рис. 14 А). Эти данные указывают на влияние &роОН мутаций на экспрессию гена субтилнзиноподобной протеиназы. В штамме В. ¡иЬИИя, не способном к синтезу протеазы, необходимой для процессинга стЕ фактора транскрипции, (рис. 14 Б) наблюдалось 90%-ное снижение уровня экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы.

sigH81

22 26 30 34 38 42 46 50 54 Время, ч

Время, ч

Рис. 14. Экспрессия гена арг ЕИ рекомбинантных штаммов В яиЫШз, мутантных по спороспецифичным он -фактору транскрипции (А) и 0е -фактору транскрипции (Б).

Можно предположить, что регуляция экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы зависит от активации спороспецифичного стЕ - фактора транскрипции.

Возможно на стадиях созревания эндоспор и автолиза спорангия субтилизиноподобная сериновая протеиназа участвует в расщеплении структурных белков, образующих поверхность материнской клетки, и способствует освобождению эндоспор.

Таким образом, анализ промоторной области гена apr Bi и исследования с использованием мутантных штаммов, позволили нам установить что в регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы В. íntermedius участвует система сигнальной трансдукции SpoOF/SpoOA-фосфопередачи, ответственная за инициацию спорообразования, а также механизмы глобальной регуляции -катаболитная репрессия, AbrB-репрессия и спороспецифичные а-факторы транскрипции.

ВЫВОДЫ

1. Штамм B.subtilis AJ73, дефицитный по собственным внеклеточным ферментам, после трансформации в него плазмиды pCS9 с геном субтилизиноподобной протеиназы В. íntermedius (apr Bi), выделяет фермент в среду в стационарной фазе роста с максимальной активностью на 28-й и 48-й часы роста. Первая фракция соответствует стадии инициации споруляции (0 стадия), вторая - завершению формирования эндоспор и выходу зрелых спор в среду (V-VII).

2. Основные закономерности экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы В. íntermedius рекомбинантным штаммом В subfilis сохраняются на стадиях раннего и позднего стационара - активация в присутствии ионов Са2+, неорганического фосфата и белковых субстратов. Установлены изменения в уровне экспрессии гена apr Bi в присутствии экзогенных факторов на разных стадиях роста (ионы Mg+2 и Мп+2, белковые субстраты, сахара).

3. Экспрессия гена протеиназы и спорообразование корегулируются катаболитной репрессией в начале стационарной фазы роста и не регулируется этим механизмом в поздней стационарной фазе роста рекомбинантного штамма.

4. В позитивном контроле экспрессии гена apr Bi участвуют белки - компоненты регуляторной системы SpoOA-фосфопередачи: уровень экспрессии в штаммах B.subtilis, мутантных по SpoOA, SpoOB, SpoOF белкам снижается более, чем на 90%. Использование супрессорных штаммов spoOAabrB позволило установить, что регуляция экспрессии гена apr Bi осуществляется по механизму АЬгВ-репрессии.

5. Экспрессия гена apr Bi не зависит от SpoOE - фосфатазы, участвующей в специфическом дефосфорилировании SpoOA фактора транскрипции, и подвергается позитивной регуляции со стороны SpoOK регуляторного белка, участвующего в транспорте регуляторных олигопептидов.

6. Спороспецифичные он и аЕ факторы транскрипции способны участвовать в положительном контроле экспрессии гена субтилизиноподобной сериновой

протеиназы В.íntermedius в клетках B.subtilis.

Публикации по теме диссертации Кадырова Ю.М. Экспрессия гена субтилизина Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / Ю.М. Кадырова, И.А. Зубахина, М.Р. Шарипова // Тезисы докладов II научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века". - Казань, 16-17 марта, 2001.-С.83.

Кадырова Ю.М. Биосинтез внеклеточной фосфатазы и спорообразование у бактерий Bacillus intermedius / Ю.М. Кадырова, И.А. Курнева, М.Р. Шарипова // Тезисы докладов I научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века". - Казань, 20-21 октября, 2001.-С.45.

Зубахина И.А. Синтез нейтральной протеиназы и субтилизина В intermedius рекомбинантньтми клетками В subtilis / И. А. Зубахина, Ю. М. Кадырова, М. Р. Шарипова // Тезисы докладов "IV Республиканская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов". - Казань, И-12 декабря, 2001. -С.122.

Шарипова М.Р. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedius / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, JI.A. Габдрахманова, М.А. Шилова, Ю.М. Кадырова, Т.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 2002 -Т.71. - №4. - С. 494-499.

Шарипова М.Р. Бациллы - продуценты внеклеточных протеиназ / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, A.M. Марданова, Л.А. Габдрахманова, Ю.М. Кадырова, C.B. Костров, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // 1-й Международный конгресс "Биотехнология-состояние и перспективы развития". - Москва, 14-18 октября, 2002. - С. 224-225.

Кадырова Ю.М. Внеклеточные протеиназы и спорогенез Bacillus intermedius / Ю.М. Кадырова, И.А. Зубахина, O.P. Латыпов // Материалы XL Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс". -Новосибирск, 2002. - С. 80.

Кадырова Ю.М. Экспрессия в Bacillus subtilis гена субтилизина Bacillus intermedius / Ю.М. Кадырова //Сборник тезисов итоговой конференции Республиканского конкурса научных работ среди студентов и асприрантов на соискание премии им. Н. И. Лобачевского. - Казань, 1-2 марта, 2002.-С. 165. Kadyrova J.M. Expression of Bacillus intermedius serine protease in Bacillus subtilis recombinant strains / J.M. Kadyrova, M.R. Sharipova, N.P. Balaban, A.M.

Mardanova, L.A. Gabdrakhmanova, S.V. Kostrov, G.N. Rudenskaya, I.B. Leshchinskaya // FEMS Congress of European Microbiologist "Bacillus-2003". -Ljubljania, Slovenia, 1-3 July, 2003. - P.29.

9. Кириллова Ю.М. Биосинтез субтилизиноподобной сериновой протеиназы В intermedins рекомбинантным штаммом B.subtilis / Ю.М. Кириллова, Е.О. Михайлова, М.Р. Шарипова Н Сборник тезисов 9-й Пущинской школы-конференции молодых ученых ''Биология - наука XXI века". - Пущино, 18-22 апреля, 2005. - С. 203.

10. Кириллова Ю.М. Закономерности биосинтеза протеиназы Bacillus intermedins рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis AJ73 / Ю.М. Кириллова, Е.О. Михайлова, А.Р. Каюмов, М.Р. Шарипова // Материалы ХП1 международной научной конференции "Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение". - Казань, 4-8 апреля, 2005. С. 44-45.

11. Михайлова Е.О. Особенности биосинтеза субтилизиноподобной сериновой протеиназы Bacillus intermedins в рекомбинантном штамме Bacillus subtilis / Е.О. Михайлова, Ю.М. Кириллова, М.Р. Шарипова // Материалы V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Наука. Инновации. Бизнес". - Казань, 9 июня, 2005. - С. 72-73.

12. Кириллова Ю.М. Биосинтез субтилизиноподобной сериновой протеиназы В intermedins рекомбинантным штаммом В. subtilis AJ 73 / Ю.М. Кириллова. Е.О. Михайлова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова // Материалы V научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века". - Казань, 26-27 апреля, 2005. - С. 51.

13. Михайлова Е.О. Биосинтез субтилизиноподобной сериновой протеиназы В intermedins рекомбинантным штаммом В subtilis AJ 73 / Е.О. Михайлова, Ю.М. Кириллова, М.Р. Шарипова // Материалы Молодежной школы конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии". - Москва,1-3 ноября, 2005. - С. 97-98.

14. Байрамов P.A. Биосинтез внеклеточных сериновых протеиназ Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / P.A. Байрамов, Е.О. Михайлова, А.Р. Сабирова, Ю.М. Кириллова // Материалы XLIII международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс". - Новосибирск, 2005. - С. 89-90.

15. Кириллова Ю.М. Условия роста культуры и биосинтеза субтилизиноподобной сериновой протеиназы Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / Ю.М. Кириллова, Е.О. Михайлова, Н.П. Балабан, Марданова A.M.,

Руденская Г.Н., Костров C.B., Шарипова М.Р. //Микробиология. -2006. - Т.75.

- №2. - С. 172-178.

16. Кириллова Ю.М. Особенности биосинтеза субтилизиноподобной сериновой протеиназы Bacillus intermedins рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / Ю.М. Кириллова, Е.О. Михайлова, Н.П. Балабан, Марданова A.M., Каюмов А.Р., Руденская Г.Н., Костров C.B., Шарипова М.Р. // Микробиология. -2006. - Т.75.

- №2. -С. 179-185.

17. Sharipova M. The expression of the serine proteinase gene of Bacillus intermedins in Bacillus subtilis / M. Sharipova, N. Balaban, A. Kayumov, Y. Kirillova, L. Gabdrakhmanova, A. Mardanova, I. Leshchinskaya, G. Rudenskaya, T. Akimkina, D.Safma, I. Demidyuk, S. Kostrov // Microbiol. Res. - 2006. (принята в печать).

Автор выражает глубокую благодарность профессору кафедры микробиологии, д.б.н. Маргарите Рашидовне Шариповой за постоянное внимание к работе, в.н.с., канд. биол. наук Нэлли Павловне Балабан и доценту кафедры микробиологии, канд. биол. наук Айсылу Миркасымовне Мардановой за оказанную помощь в работе, профессору Сергею Викторовичу Кострову (Институт молекулярной генетики РАН) за любезное предоставление плазмиды pCS9, использованной в работе, и возможность пройти научную стажировку в возглавляемой им научной лаборатории генной инженерии, профессору (Института генетики и селекции промышленных микроорганизмов) Ю. Йомантасу за предоставленный штамм В subtilis AJ73, профессору Д. Зайглеру из Bacillus Genetic Stock Center (университет Охайо, США) за предоставленные для работы штаммы В.subtilis, дефектные по spo - генам.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 03.05.2006 г. Усл. п.л 1,5. Заказ М К-4476. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

НИ 0 7 22

A-

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кириллова, Юлия Марсельевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Протеиназы и их роль в метаболизме клетки. ф 1. Основы классификации протеиназ.

2. Основные свойства и характиристика сериновых протеиназ.

2.1. Классификация субтилизиноподобных ферментов.

2.2. Структура, свойства и характеристика субтилаз.

3. Субтилизиноподобная сериновая протеиназа B.intermedius.

II. Механизмы регуляции биосинтеза протеиназ.

1. Регуляция экспрессии генов B.subtilis на уровне транскрипции.

2. Механизмы регуляции синтеза внеклеточных протеиназ.

2.1. Механизм сигнальной трансдукции.

2.2. Система SpoO-фосфопередачи.

2.3. Системная регуляция сигма-факторами.

2.4. Катаболитная репрессия.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius в рекомбинантных штаммах Bacillus subtilis"

Актуальность проблемы. Изменчивость и адаптация - ключевые характеристики организмов, обладающих способностью выживать и пролифилировать в широком разнообразии условий окружающей среды. Бактерии содержат большой объем генетической информации, кодирующей пути преодоления различных критических ситуаций. В ходе эволюции представители рода Bacillus выработали сложную регуляторную систему, которая включает направленную транскрипционную модификацию генов, контролирующих клеточную дифференцировку, индукцию стрессовых белков, а также синтез ферментов деградации. В основе узнавания специфических сигналов лежит механизм сигнальной трансдукции, а именно, двухкомпонентная система регуляции экспрессии генов. С помощью модельных систем с мутациями в регуляторных белках можно оценить вклад разных систем регуляции в контроль экспрессии гена. Определение молекулярных механизмов регуляции синтеза гидролитических ферментов позволит направленно влиять на уровень продукции тех из них, которые интересны в практическом отношении.

Грамположительные спорообразующие бактерии В .intermedins секретируют различные сериновые протеиназы, одна из которых относится к группе субтилизиноподобных сериновых протеиназ, обладающих широкой субстратной специфичностью (Балабан с соавт., 1993). Фермент был выделен из культуральной жидкости, очищен до гомогенного состояния, изучены его физико-химические свойства. Клонирование гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius открыло возможность для исследования механизмов регуляции синтеза фермента и его взаимосвязи с клеточной физиологией.

Целью работы явилось выяснение механизмов контроля экспрессии гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius, продуцируемой рекомбинантными штаммами B.subtilis на разных стадиях роста бактерий.

В работе решались следующие задачи:

1. Изучение регуляции биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius рекомбинантным штаммом B.subtilis.

3. Выяснение роли регуляторных белков - компонентов сигнально-сенсорной системы KinA/SpoOF/SpoOA в регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius.

4. Определение вклада SpoOE, SpoOK - белков, участвующих в инициации спорогенеза, в регуляцию экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius.

5. Исследование влияния спороспецифичных ан и аЕ-факторов транскрипции на экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius.

Научная новизна. Новизна работы заключается в использовании качественно нового подхода к изучению механизмов регуляции биосинтеза протеиназы, основанного на методах генной инженерии. Впервые установлено, что субтилизиноподобная сериновая протеиназа активно синтезируется и секретируется на стадии стационарного роста. Выявлено две пиковые фракции, из которых вторая превышает первый в 3 раза. Разработаны условия для активной экспрессии каждого из пиков, соответствующих фазе вегетативного роста и формированию эндоспоры. Использование рекомбинантного штамма дало возможность показать, что ферменты обеих фракций являются результатом экспрессии одного гена. Впервые проведено изучение механизмов контроля экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius во взаимосвязи с процессом спорообразования, с применением мутантов по 5/?о-генам. Нами впервые установлено, что в поздней стационарной фазе роста экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы не регулируется по типу катаболитной репрессии, в отличие от фермента на стадии вегетативного роста бактерий. Получены приоритетные данные, свидетельствующие о том, что экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы В .intermedins подвергается позитивной регуляции со стороны регуляторных белков — компонентов системы сигнальной трансдукции KinA/SpoOF/SpoOA, ан и аЕ - факторов транскрипции.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на Международном конгрессе по микробиологии FEMS "Bacillus-2003" (Словения, 2003), 1-ом Международном конгрессе "Биотехнология — состояние и перспективы развития" (Москва, 2002), ежегодных Международных научных студенческих конференциях "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2002, 2003, 2005), научных конференциях CRDF "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2000, 2001, 2003, 2005), школах-конференциях для молодых ученых "Биология -наука XXI века" (Пущино, 2003, 2005), XII юбилейной конференции "Ферменты микроорганизмов" (Казань, 2001), во Всероссийском конкурсе, на лучшую научную работу студентов по естественным, техническим и гуманитарным наукам (Томск, 2002), на IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов республики Татарстан (Казань, 2001), в республиканском конкурсе научных работ среди студентов и аспирантов на соискание премии им. Н.И. Лобачевского (Казань, 2001, 2002).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. Протеиназы и их роль в метаболизме клетки 1. Основы классификации протеиназ

Согласно современной классификации протеолитические ферменты относятся к классу гидролаз и образуют особый подкласс пептид-гидролаз (КФ 3.4.). Классификация протеиназ основана на их каталитических свойствах, а именно на структуре активного центра. В соответствии с ней протеиназы делят на четыре большие группы: сериновые, цистеиновые, аспарагиновые и металлопротеиназы (Hartley, 1960). Эти группы протеиназ различаются по чувствительности к различным ингибиторам. Так, сериновые протеиназы ингибируются фенилметилсульфонилфторидом (PMSF) и диизопропилфторфосфатом (DFP). Металлопротеиназы - хелатирующими агентами ЭДТА и о-фенантролин; цистеиновые протеиназы - тяжелыми металлами и иодацетамидом; аспарагиновые протеиназы - пепстатином. Классификация протеиназ хорошо коррелирует с их рН-оптимумом действия. Сериновые протеиназы имеют рН-оптимум в щелочной зоне, цистеиновые и аспарагиновые протеиназы - в кислой области рН, а металлопротеиназы - в нейтральной области.

Металлопротеиназы продуцируют бактерии, актиномицеты и микроскопические грибы. Ферменты имеют молекулярную массу 40-50 кДа, в состав их молекул входит двухвалентный металл, чаще всего цинк. Для

2+ стабильности белков необходимо присутствие ионов Са . Металлопротеиназы в пептидах предпочтительно гидролизуют связи между аминогруппой лейцина и фенилаланина. Ингибиторами нейтральных протеиназ являются хелатирующие агенты (ЭДТА и о-фенантролин), которые блокируют ионы металлов, что приводит к нарушению каталитической активности фермента, которая максимальна при рН 7,0.

Цистеиновые (тиоловые) протеиназы в мире микроорганизмов встречаются относительно редко. Хорошо изученны экстрацеллюлярные ферменты этого типа - протеиназа гемолитических стрептококковстрептококковая пептидаза А и фермент из Clostridium histolyticum -клостридиопептидаза В. Активность обоих ферментов подавляется сульфгидрильными ядами и ионами металлов, ЭДТА оказывает стабилизирующее действие.

Аспарагиновые протеиназы встречаются редко и преобладают у грибов. В активном центре этих протеиназ содержится остаток аспарагиновой кислоты, что обуславливает инактивацию подобных ферментов природными ингибиторами-пепстатином и специфическими -диизокарбонильными соединениями и эпоксидами. Хорошо изучены аспергиллопептидаза А из Aspergillus saitoi и протеиназа из Penicillum janthinellum. Аспарагиновые протеиназы активны, устойчивы в кислой среде и быстро инактивируются при нейтральных рН, представляют одну полипептидную цепь в 300-400 аминокислот с молекулярной массой 30-40 кДа, почти не имеющую ос - спиралей. По своим свойствам некоторые кислые протеиназы микроорганизмов близки к пепсину животных.

Внеклеточные сериновые протеазы из спорообразующих бактерий рода Bacillus обладают широкой специфичностью. Молекулы стабильны и имеют оптимум рН 9,5. При рН 5,0 и ниже ферменты быстро и необратимо инактивируются. Молекулярный вес сериновых протеиназ от 15-18 кДа до

60-80 кДа, в активном центре содержится каталитическая триада, состоящая из серина, гистидина и аспарагина. Они чувствительны к специфическим ингибиторам, взаимодействующим с остатком серина, например, PMSF, DFP, а также ко многим белковым ингибиторам животного происхождения. Для

2+ многих сериновых протеиназ характерно наличие ионов Са в третичной структуре, которые не участвуют в каталитическом действии, а лишь стабилизируют молекулу фермента, например, при тепловой денатурации и протеолитической деградации (Тепляков с соавт., 1990). Сериновые протеиназы высоко активны в отношении различных белковых субстратов. Сериновая протеиназа B.mesentericus 64 эффективно гидролизирует казеин, гемоглобин, эластин, а также различные синтетические трипептиды (Нестерова с соавт., 1989). Сериновые эндо- и экзо- пептидазы широко распространены и обладают разнообразными функциями. Многообразие сериновых протеаз, сгруппировано в шесть кланов: химотрипсиноподобные, субтилизиноподобные (субтилазы), карбоксипептидазы, D-Ala-D-Ala-пептидазы А, ЬехА-подобные и АТФ-зависимые сериновые пептидазы (Barrett, Rawlings, 1995). Два больших химотрипсинподобный и субтилизинподобный клана имеют сходное рассположение каталитических остатков Asp-32, His-64, Ser-221 в совершенно разных р/р (химотрипсин) и а/р (субтилизин) белковых скелетах. Эти семейства обширны и объединяют протеиназы с отличающимися свойствами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Кириллова, Юлия Марсельевна

выводы

1. Штамм B.subtilis AJ73, дефицитный по собственным внеклеточным ферментам, после трансформации в него плазмиды pCS9 с геном субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius {apr Bi), выделяет фермент в среду в стационарной фазе роста с максимальной активностью на 28-й и 48-й часы роста. Первая фракция соответствует стадии инициации споруляции (0 стадия), вторая - завершению формирования эндоспор и выходу зрелых спор в среду (V-VII).

2. Основные закономерности экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius рекомбинантным штаммом B.subtilis сохраняются на стадиях раннего и позднего стационара - активация в присутствии ионов Са , неорганического фосфата и белковых субстратов. Установлены изменения в уровне экспрессии гена apr Bi в присутствии экзогенных факторов на разных стадиях роста (ионы Mg+2 и Мп+2, белковые субстраты, сахара).

4. В позитивном контроле экспрессии гена apr Bi участвуют белки -компоненты регуляторной системы SpoOA-фосфопередачи: уровень экспрессии в штаммах B.subtilis, мутантных по SpoOA, SpoOB, SpoOF белкам снижается более, чем на 90%. Использование супрессорных штаммов spoOAabrB позволило установить, что регуляция экспрессии гена apr Bi осуществляется по механизму АЬгВ-репрессии.

6. Спороспецифичные ан и оЕ факторы транскрипции способны участвовать в положительном контроле экспрессии гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius в клетках B.subtilis.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бактерии - высоко адаптивные организмы, способные к росту на различных углеродных и азотных источниках и занимающие большое разнообразие экологических ниш. Одним из условий выживания бактерий является способность быстро реагировать на вне- и внутриклеточные сигналы, отражающие изменения в окружающей среде. Адаптация бактерий к меняющимся условиям существования включает в себя широкий круг явлений, в том числе синтез и секрецию гидролитических ферментов. В случае перехода бактерий к спорообразованию запускается программа дифференциальной генной экспрессии, некоторые, из регуляторных механизмов которой установлены. Отдельные аспекты этой программы остаются неясными, в том числе вопрос о вкладе в ее реализацию гидролитических ферментов, продуцируемых бациллами в период спорообразования. Протеолитические ферменты выполняют в бактериальной клетке ряд жизненно важных функций: участвуют в деструктивных катаболических процессах, функционируют на этапе посттрансляционного процессинга белков, осуществляют селективный протеолиз белков, связанный с изменением метаболизма. В литературе накапливаются данные о корегуляции экспрессии генов, отвечающих за синтез внеклеточных протеиназ, с физиологическими событиями, происходящими с клетками бацилл.

Бактерии B.intermedius секретируют в среду протеиназы, среди которых доминирующим ферментом является субтилизиноподобная сериновая протеиназа. В настоящее время изучены структура, физико-химические и каталитические свойства этого фермента. Обнаружено, что фермент секретируется на всех стадиях роста бактерий. Остается неясным являются ли протеиназы, соответствующие разным стадиям роста бактерий, продуктами одного или разных генов? Каковы особенности экспрессии этих ферментов? На решение этих вопросов направлено данное исследование.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. В качестве объектов исследования использовали: штамм B.intermedius 3-19 (5Уг-50ф-стрептомицинустойчивый мутант дикого штамма B.intermedius 7Р из лаборатории Казанского университета. В качестве штамма-реципиента для плазмид с геном субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius использовали штамм B.subtilis AJ73, дефектный по собственным внеклеточным протеиназам (штамм любезно предоставлен для работы проф. Ю.Йомантасом, Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов). Бактериальные штаммы B.subtilis, дефектные по spo-, kin-, sig-генам, а также соответствующие им штаммы, с полноценными системами регуляции получены из коллекции Bacillus Genetic Stock Center (Ohio State University, U.S.A.): 168 (trpC2); JH642 (pheAl trpC2); JH646 (spoOA 12 pheAl trpC2); 667 (spoOAA677); JH648 (spoOB136 pheAl trpC2); JH647 (spoOEll pheAl trpC2)\ JH649 {spoOF221 pheAl trpC2); JH651 (sigH81 pheAl trpC2); B4NA (sigHstr trpC2); Z31 (<oppl41 trpC2); 41.1 {spoIIG41 leuB8 tal-1); R15-13 (spoOA 12 abrB23 pheAl trpC2); 279.6 (spoIIG279 cysC7 furA2)\ SCR372 (spoOA 12 absB24 trpC2); MB 170 (kinA82).

Наряду с мутантными, плазмиду трансформировали в исходные штаммы, с полноценными системами регуляции, на основе которых были сконструированы мутантные штаммы.

В работе использовали мультикопийную плазмиду pCS9, сконструированную на основе вектора рСВ22, несущую полный ген субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius под соответственным промотором (Sharipova et al., 2006).

Условия культивирования. При культивировании клеток В. intermedius 3-19 и рекомбинантного штамма B.subtilis AJ73 (pCS9) использовали среды следующего состава (%):

B.subtilis AJ 73 (pCS9)

B. intermedius 3-19 пептон дрожжевой экстракт

СаС12'2Н20

MgS04'7H20

NaCl

MnS04

NH4CI

Na2HP04 pH

2.0 1.0 0.1 0.05 0.3 0.01 0.01 0.035 8.5

2.0

0.06 0.05 0.3 0.01 0.02 0.02 8.5

Культивирование штаммов B.subtilis, дефектных no spo-, kin-, s/g-генам, проводили на среде LB (Sambrook et al., 1989) следующего состава (%): триптон - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,5; NaCl - 0,5; pH 8.5. В среду для культивирования рекомбинантных штаммов B.subtilis и 5/70-мутантных штаммов, трансформированных плазмидой pCS9, добавляли эритромицин в концентрации 20 мкг/мл, т.к. плазмида pCS9 несет ген устойчивости к данному антибиотику. В среду для культивирования B.intermedius 3-19 добавляли стрептомицин в концентрации 500 мкг/мл. Культивирование проводили при 30°С на электронном, регулируемом вибростенде (200об/мин) ("Braun", Германия). Растворы неорганического фосфата (Na2HP04), солей аммония NH4C1 и C6H607(NH4)2 (1; 2; 3; 4; 5 мМ), дрожжевого экстракта (0,5; 1; 2%), желатина (0,5; 1; 2%), казеина (0,5; 1; 2%), цитрата натрия (0,5; 1; 2%), глюкозы и других углеводов (0,5; 1; 2%), аминокислот: L-аланина, L-валина, DL-лейцина, DL-цистеина, DL-аспарагина, DL-глутамина, DL-триптофана, DL-гистидина, DL-глутаминовой кислоты, L-аспарагиновой кислоты в конечной концентрации 50 мг/л для L- аминокислот и 100 мг/л для DL-аминокислот, казаминовых кислот (0,025; 0,1; 0,25; 0,5; 1; 2%), а также используемых солей металлов MnS04, MgS04-7H20, СаС12*2Н20, ZnS04, FeS04'7H20, CuCl2 -2H20, СоС12-6Н20 (1; 2; 5; 10; 15 мМ) вносили стерильно перед посевом.

Прирост биомассы измеряли нефелометрически на фотоэлектрокалориметре КФК-2 при 590 нм. За единицу биомассы принимали поглощение в 1см кювете, равное единице. Удельную активность культуры определяли как отношение активности фермента в культуральной жидкости к количеству биомассы и выражали в условных единицах (у. е.).

Удельную скорость роста (ц) и удельную скорость накопления фермента (е) в культуральной жидкости рассчитывали по следующим формулам (Перт, 1980): ц = (lnD)/dt, (ч1)

8 = (lnA)/dt, (ч1)

Для выявления эндоспор мазок окрашивали по Граму (Гусев, Минеева, 1985). Подсчет клеток со спорами проводили в режиме фазово-контрастной микроскопии на микроскопе Carl Zeiss Jena, Германия при увеличении в 1600 раз не менее чем в 5 полях зрения. Подсчитывали общее количество вегетативных и спорулирующих клеток (100%), число последних выражали в процентах. В качестве инокулята использовали 48-часовую культуру, которую перед посевом прогревали при 80°С в течение 8 мин. Фазы спорообразования рассчитывали, как описано в работе Шлегеля (Шлегель, 1987).

Споры выявляли также с помощью метода, основанного на обработке хлороформом, при последующем высеве на чашку титрования и подсчета жизнеспособных колоний (Ferrari et al., 1988). Микроорганизмы выращивали в пробирке, содержащей 5 мл L-бульона при 30°С. Через каждые два часа отбирали пробы культуральной жидкости и готовили серию разведений. Разведенную культуральную жидкость высевали на чашки Петри с L-агаром. Параллельно к 300 мкл культуральной жидкости добавляли по 330 мкл хлороформа, смесь перемешивали 15 секунд. В течение этого времени необратимо повреждается мембрана вегетативных клеток и бактерии погибают. Смесь высевали на чашки Петри с L-агаром. Чашки инкубировали 24 часа при 30°С. Проводили подсчет колоний, выращенных на чашках и определяли соотношение (в %) между колониями, выросшими из спор и вегетативных клеток. За 100 % принимали число вегетативных клеток до обработки хлороформом. Количество КОЕ (колония-образующих единиц) принимали за количество спорулирующих клеток и свободных спор.

Определение протеолитической активности

Казеинолитическую активность определяли по методу Каверзневой (1971). Субстратом служил 2% раствор казеина (казеин по Гаммерстену) в 0,1 М трис-HCl буфере, рН 8,5. Реакционная смесь состояла из предварительно прогретых до 37°С 1 мл казеина и 1 мл ферментного раствора. Инкубацию проводили 15 мин при 37°С, после чего добавляли 2 мл 5%-ной ТХУ и инкубировали при той же температуре еще 20 мин. Смесь отфильтровывали через плотный фильтр. Затем к 1 мл фильтрата приливали 5 мл 6%-ной ЫагСОз и 1 мл реактива Фолина (кислотность 0,6 н). Ставили смесь на 20 мин в темноту, затем измеряли оптическую плотность при длине волны 670 нм.

Параллельно ставили контроль на свободный тирозин следующим образом: смешивали 1 мл ферментного раствора и 2 мл 5%-ной ТХУ, инкубировали 20 мин при 37°С. С фильтратом поступали, как описано выше. За единицу казеинолитической активности принимали количество фермента, необходимое для образования 1 мкг тирозина за 1 мин, на 1 мл ферментного раствора. Протеолитическую активность рассчитывали по формуле:

ОП - Кт) х 28 х Р А= -,

15 где А - протеолитическая активность;

28 - коэффициент всех разведений;

15 - минуты инкубации переводили на 1 час;

ОП - Кт - разность показаний опытной и контрольной пробы.

Активность субтилизиноподобной протеиназы определяли, используя в качестве субстрата синтетический пептид Z-Ala-Ala-Leu-pNa. Реакционная смесь содержала 0,5 мг Z-Ala-Ala-Leu-pNa в 1мл диметилфторамида и 2 мл 0,05М трис-HCl, буфера рН 8,5, а также 50 мкл фермента. Инкубацию проводили при 37°С до появления соломенно-желтого окрашивания. Реакционную смесь останавливали добавлением 0,2 мл 50 % уксусной кислоты и измеряли поглощение раствора при 410 нм.

За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в данных условиях 1 нмоль субстрата за 1 мин (Люблинская с соавт., 1977). Протеолитическую активность рассчитывали по формуле:

DxPxK

ПА =

В x T где ПА - протеолитическая активность, • нмоль/мин на 1 мл ферментативного раствора; D - поглощение раствора при 410 нм;

Р - пересчет на 1 мл раствора фермента;

К=0,37 - коэффициент молярной экстинкции паронитроанилида;

В - объем пробы фермента;

Т - время инкубации, мин;

Активность fi-галактозидазы определяли по методу, описанному в работе (Миллер, 1976). За единицу активности принимали количество фермента, которое вызывало увеличение оптической плотности на 1 оптическую единицу при 420 нм на 1 мл ферментативного раствора за 1 минуту инкубации при 37°С. Удельную активность Р-галактозидазы рассчитывали в единицах на 1 г биомассы.

Для определения оптимума рН действия фермента готовили буферы с рН 7,5; 8,0: 9,0; 9,5, активность определяли по отношению к субстрату Z-Ala-Ala-Leu-pNa согласно методике.

При изучении влияния специфических ингибиторов на протеолитическую активность использовали ЭДТА в конечной концентрации 2,5 мМ, о-фенантролин в 2-пропаноле в конечной концентрации 2,5 мМ. Растворы ингибиторов добавляли к ферментному раствору и выдерживали 20 минут при 18°С. Активность протеиназы определяли по гидролизу синтетического субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa и выражали в процентном отношении к контролю. В контрольные пробы вместо растворов ингибиторов добавляли буфер.

Выделение плазмид и трансформацию клеток B.subtilis проводили стандартными методами (Гловер, 1988).

Выделение плазмидной ДНК

1,5 мл ночной культуры центрифугировали в течение 5 мин на центрифуге Эппендорф, Германия при 4 тыс. об/мин. Осадок ресуспендировали в 200 мкл раствора 1 (50 мМ глюкозу, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ трис-HCl, рН 8,0 и 10 мг/мл лизоцима). Инкубацию проводили в течение 1 часа на вибростенде при 37°С. К смеси добавляли 400 мкл свежеприготовленного раствора 2 (0,2 н NaOH и 1% SDS). Перемешивали содержимое, быстро переворачивая 2-3 раза, выдерживали в ледяной бане. Добавляли 300 мкл охлажденного раствора ацетата калия, рН 4 и инкубировали при -10°С в течение 20-30 мин. Смесь центрифугировали на холоду 15 мин при 13 тыс. об/ мин. К супернатанту добавляли 0,6 объема (540 мкл) изопропанола, инкубировали в течение 15-20 мин при комнатной температуре. Смесь центрифугировали в течение 15 мин при 11 тыс. об/ мин. Осадок промывали 70% этанолом, высушивали при 65°С, ресуспендировали в 200 мкл бидистиллированной воды. К раствору добавляли 100 мкл ацетата аммония и инкубировали при -10°С в течение 40-60 мин. Смесь центрифугировали в течение 15 мин при 13 тыс. оборотов в минуту. К супернатанту добавляли 0,6 V изопропанола (200 мкл), инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем центрифугировали в течение 15 мин при 10 тыс. оборотов в минуту. Осадок промывали трижды 70% этанолом и затем 96% этанолом, просушивали и ресуспендировали в 20 мкл дистиллированной воды. Плазмидную ДНК анализировали с помощью гель - электрофореза и хранили при -10°С.

Электрофорез ДНК в агарозном геле

Электрофорез плазмидной ДНК проводили в 1% агарозном геле по методу Шарпа (Sharp et al., 1973). В качестве электродного буфера был использован 0,04 М трис-ацетат, рН 7,8, содержащий 2 мМ ЭДТА, рН 8,0. Раствор для нанесения проб: 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксилолцианола, 30% глицерина в воде (температура хранения 4°С). Электрофорез проводили при силе тока 50 мА. По окончании электрофореза гель в течение 15 минут выдерживали в растворе бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл. Окрашенный гель просматривался в ультрафиолетовом свете.

Трансформация плазмидной ДНК в клетки Bacillus subtilis

К 4,5 мл теплого раствора Sp I добавляли 500 мкл ночной культуры, инкубировали в течение 4 - 4,5 ч при 37 °С на вибростенде с интенсивностью качания 200 об/мин. К 5 мл теплого раствора Sp II добавляли 750 мкл раствора Sp I с клетками и 40 мкл стерильного раствора сульфата магния. Инкубировали при качании 1, 5 часа и 37°С. В стерильную пробирку вносили около 1 мкг плазмидной ДНК и добавляли 500 мкл раствора Sp II с компетентными бациллярными клетками. Инкубировали 1 час при 37°С, с последующим качанием в течение одного часа при 37°С.

Трансформационную смесь по 250 мкл высевали на чашки Петри с твердой питательной средой L-arap, содержащей 20 мкг/мл эритромицина, и выдерживали их в течение 12 часов при 37°С.

Растворы, используемые для трансформации

Среда Спецайзена I (Sp I) на 100 мл:

Глюкоза - 2 мл

Казаминовые кислоты - 2 мл

Триптофан - 1 мл

Дрожжевой экстракт - 2 мл

Солевая основа - 10 мл

Среда Спецайзена II (Sp II) на 100 мл:

Глюкоза - 2 мл

Казаминовые кислоты - 1 мл

Триптофан - 0,1 мл

Солевая основа - 10 мл

MgS04 - 80 мкл/10 мл среды

Солевая основа для среды Спецайзена на 100 мл:

К2НР04хЗН20 - 18,34 г

КН2Р04 - 6 г

NH4)2S04 - 2 г

Na3C6H507 х 5,5Н20 - 1,2 г Стерилизация при 0,8 атм., рН 7,0

Концентрированные компоненты для среды (стерилизуются отдельно): Глюкоза 40%

Казаминовые кислоты - 200 мг/ 10 мл воды

L- триптофан - 50 мг/ 10 мл воды

Дрожжевой экстракт - 500 мг/ 10 мл воды

MgS04 х7Н 20 - 2 г/10 мл воды

Аминокислоты (для ауксотрофов)

Выявление клонов трансформантов с протеолитической активностью проводилось на идентификационной среде - молочном агаре (голодный агар + стерильное молоко) + антибиотик.

Статистическую обработку результатов проводили в программной среде Microsoft Exel путем расчета среднеквадратичного отклонения (а). Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении а<15%. В качестве критерия достоверности получаемых разностей использовали критерий Стьюдента, принимая Р <0.05 за достоверный уровень значимости.

Наряду с традиционным изучением влияния отдельных факторов использовали многофакторные эксперименты. Обработка результатов экспериментов проводилась с помощью программы STATGRAPHICS Plus for Windows (Version 2.1) для персональных компьютеров, позволяющей выводить на экран уравнения регрессии, выводы о степени достоверности модели, графическое изображение поверхности отклика.

Регуляторную область гена apr Bi (AN AY754946) анализировали с использованием пакета программ BLAST (Altschul et al., 1997), представленных на сервере the National Center for Biotechnology Information's

NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и пакета программ Vector NTI Suite 8.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ I. Закономерности синтеза субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius рекомбинантным штаммом B.subtilis

Исходный штамм B.intermedius 3-19 обладает способностью синтезировать субтилизиноподобную сериновую протеиназу с молекулярной массой 30 кД, изоэлектрической точкой 9,1-9,3 (Балабан с соавт., 1993). Полный ген фермента был клонирован на мультикопийной плазмиде pCS9 (производная плазмиды рСВ22). Выбор в качестве объектов исследования рекомбинантного штамма обусловлен тем, что нативный штамм B.intermedius секретирует в среду несколько внеклеточных протеолитических ферментов -субтилизиноподобную протеиназу, глутамилэндопептидазу и металлопротеазу. При изучении путей регуляции биосинтеза индивидуальной протеиназы наложение пула ферментов затрудняет процесс исследования и искажает полученные результаты. Напротив, из хромосомы штамма B.subtilis AJ73, использованного нами в качестве реципиента для плазмиды с геном субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius, делетированы гены внеклеточных протеиназ, что позволяет оценить влияние экзогенных факторов на модели, когда синтезируется и секретируется только один из этих белков. Представляло интерес исследовать экспрессию гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius в клетках рекомбинантного штамма B.subtilis, в период вегетативного роста и споруляции.

1.1. Динамика роста, биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius и спорообразования рекомбинантного штамма B.subtilis

Плазмида pCS9, несущая ген субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius, была трансформирована в протеазо-дефицитный штамм B.subtilis AJ73. Анализировали протеолитическую активность в рекомбинантном и бесплазмидном штаммах. При культивировании бесплазмидного штамма B.subtilis AJ73 на богатой питательной среде, протеолитическая активность, как на казеине, так и на синтетических пептидах (Z-Ala-Ala-Leu-pNa - субстрат для субтилизиноподобных протеиназ, Z-Glu-pNA - субстрат для глутамилэндопептидаз) отсутствовала. После трансформации в этот штамм плазмиды pCS9 активность в культуральной жидкости определялась при гидролизе казеина и Z-Ala-Ala-Leu-pNa и отсутствовала по отношению расщепления специфического субстрата для глутамилэндопептидаз Z-Glu-pNA.

Таким образом, согласно полученным данным, рекомбинантный штамм B.subtilis AJ73 (pCS9) способен секретировать протеиназу, гидролизующую казеин и специфический хромогенный субстрат для субтилизиноподобных протеиназ Z-Ala-Ala-Leu-pNa.

Изучали влияние специфических ингибиторов на активность внеклеточной протеиназы рекомбинантного штамма (табл. 1).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кириллова, Юлия Марсельевна, Казань

1. Балабан Н. П. Щелочная внеклеточная протеиназа Bacillus intermedius. Выделение, очистка и некоторые свойства фермента / Н. П. Балабан, М. Р. Шарипова, А. М. Усманова, Е. А. Ицкович, И. Б. Лещинская // Биохимия. -1993. - Т. 58. - №. 12. - С. 1923-1928.

2. Балабан Н. П. Секретируемая сериновая протеиназа спорообразующих бактерий Bacillus intermedius 3-19 / Н.П. Балабан, М. Р. Шарипова, Е. Л. Ицкович, И. Б. Лещинская, Г. Н. Руденская // Биохимия. 1994. - Т. 59. -№9. - С. 1393-1400.

3. Гловер Д. М. Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ./ Д.М. Гловер. -М.: Мир, 1988.-538 с.

4. Головлев Е. Л. Введение в биологию стационарной фазы бактерий: механизм общего ответа на стрессы / Е. Л. Головлев // Микробиология. -1999. Т. 68. - №5. - С. 623-631.

5. Гусев М. В. Микробиология / М.В. Гусев, Л. А. Минеева. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1985.-376 с.

6. Демина Н. Н. Сенсорно-регуляторные системы бактерий / Н. Н. Демина, С. Г. Камзолова // Успехи современной биологии. 1992. - Т. 26. - С. 1338-1349.

7. Ерохина Л. И. Щелочные протеиназы рода Bacillus / Л.И. Ерохина, Е.О. Добржанская // Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. Под. ред. А. А. Имшнецкого. М.: Мир, 1979. - С. 244 - 280.120

8. Иваница В. А. Влияние аминокислот как единственного источника азота на биосинтез экзопротеаз Aspergillus candidus / В. А. Иваница, Н. С. Егоров, М. А. Аль-Нури // Микробиология. 1978. - Т. 74. - № 3. - С. 424429.

9. Ицкович Е. Л. Биосинтез щелочной внеклеточной протеиназы B.intermedius 3-19 / Е. Л. Ицкович, Л. В. Знаменская, Н. П. Балабан, Т. А. Ершова, И. Б. Лещинская // Микробиология. 1995. - Т. 64. - №5. - С. 623-629.

10. Каверзнева Е. Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз / Е. Д. Каверзнева // Прикладная биохимия и микробиология.-1971.-Т. 7. №2. - С. 225-228.

11. Колев Д. А. Репрессия синтеза у штамма 90-11-формы Bacillus mesentericus аминокислотами / Д. А. Колев // Микробиология. 1986. - Т. 55.-№4.-С 295-300.

12. Люблинская Л. А. Синтез пептидных субстратов субтилизина и их аналогов / Л. А. Люблинская, Л. Д. Якушева, В. М. Степенов // Биоорг. Химия. 1977. - Т. 3. - №2. - С. 273-279.

13. Миллер Д. Ж. Эксперименты в молекулярной генетике / Д. Ж. Миллер. -М.: Мир, 1976.-436 с.

14. Мосолов В. В. Протеолитические ферменты / В. В. Мосолов. М.: Наука, 1971.- 404с.

15. Нестерова Н. Г. Субстратная специфичность ферментов Bacillus mesentericus / Н. Г. Нестерова, Г. В. Чернесова, Н. Ф. Кириллова // Микробиология. 1989. - Т. 58. - №. 4. - С. 553-556.

16. Новикова Т. М. Влияние аминокислот и ионов аммония на образование экзопротеаз / Т. М. Новикова, Е. В. Портин // Тезисы докладов конференции молодых ученых «Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов». Рига. - 1987.

17. Олескин А. В. Действие серотонина (5-оксатриптамина) на рост и дифференцию микроорганизмов / А. В. Олескин, Т. А. Кировская, И. В. Ботвинко, Л. В. Лысак // Микробиология. 1998. - Т. 67. - № 3. - С. 306311.

18. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С. Дж. Перт. М.: Мир, 1980. - 331 с.

19. Прист Ф. Промышленные продукты бацилл и их применение / Ф. Прист // Бациллы. Генетика и биотехнология. Под. ред. Харвуда К. М.: Мир, 1992.-С. 236-298.

20. Тепляков А. В. Кристаллическая структура термитазы и стабильность субтилизинов / А. В. Тепляков, И. П. Курамова, Э. Г. Арутюнян, К. Фроммель, В. Хене // Биоорг. химия. 1990. - Т. 16. - № 4. - С. 437-447.

21. Цаплина И. А. Синтез нейтральных протеаз микроорганизмами / И. А. Цаплина // Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. Под. ред. Имшнецкого А. А. М.: Мир, 1979. - С. 197-244.

22. Шарипова М. Р. Локализация протеолитических ферментов в клетках

23. B.intermedius / М. Р. Шарипова, Е. В. Шакиров, Н. П. Балабан, Л. А. Габдрахманова, М. А. Шилова, Г. Н. Руденская, И. Б. Лещинская // Микробиология. 2000. - Т. 69. - №5. - С. 680-697.

24. Шарипова М.Р. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedins / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова, М.А. Шилова, Ю.М. Кадырова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. 2002. - Т.71. - №4. - С. 494-499.

25. Шлегель Г. М. Общая микробиология / Г. М. Шлегель. М.: Мир, 1987.1. C. 76-81.

26. Altschul S. F. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs / S. F. Altschul, T. L. Madden, A. A. Schaumluffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller, D. J. Lipman // Nucleic. Acids Research. 1997. -V. 25.-P. 3389-3402.

27. Appleby J. Signal transduction via the multistep phosphorelay: not necessarily a road less traveled / J. L. Appleby, J. S. Parkinson, R. B. Bourret // Cell. -1996.-V. 86.-P. 845-848.

28. Balaban N. Selection of cultivation medium for production of late stationary phase serine proteinases from Bacillus intermedins / N. Balaban, L. Gabdrakhmanova, M. Sharipova, E. Sokolova, L. Malikova, A. Mardanova, G.

29. Rudenskaya, I. Leshchinskaya // J. Basic Microbiology. 2004 - V. 44. - №6 -P. 415-423.

30. Banerjee A. Induction of secretory acid proteinase in Candida albigans / A. Banerjee, K. Ganesan, A. Datta//J. Gen. Microbiol. 1991. - V. 137. - P. 24552461.

31. Barr P. J. Mammalian subtilisins: The long-sought dibasic processing endoproteases / P. J. Barr//Cell. 1991.-V. 66.-P. 1-3.

32. Barrett A. J., Rawlings N. D. Families and clans of serine peptidases / A. J. Barrett, N. D. Rawlings // Arch Biochem Biophys. 1995. - V. 318. - № 2. - P. 247-250.

33. Betzel C. X-ray and model-building studies on the specificity of the active site of proteinase К / С. Betzel, M. Belleman, G. P. Pal, J. Bajorath, W. Saenger, K. S. Wilson // Proteins Strucr. Funcr. Genet 1988a. - V. 4. - P. 157-164.

34. Betzel C. Three-dimensional structure of proteinase К at 0.15 nm resolutions / C. Betzel, G. P. Pal, W. Saenger // Eur. J. Biochem. 1988b. - V. 78. - P. 155171.

35. Betzel C. Thermitase and proteinase K: a comparison of the refined three-domension structure of the native enzymes / C. Betzel, A. V. Teplyakov, W. Saenger, K. S. Wilson//Protein engineer. 1990. - V. 3 - №3.-P. 161-172.

36. Booth M. C. Structural analysis and proteolytic activation of Enrerococcus faecalis cytolysin,a novel lantibiotic / M. C. Booth, Ch. P. Bogie, H. G. Sahl, R.

37. J. Siezen, К. L. Hatter, M. S. Gilmore // Mol. Microbiol. 1996. - V. 21. - P. 1175-1184.

38. Branda S. S. Fruiting body formation by Bacillus subtilis/ S. S. Branda, J. E. Gonzalez-Pastor, S. Ben-Yehuda, R. Losick, R. Kolter // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98. - P. 11621-11626.

39. Bruckner R. Carbon catabolite repression in bacteria: choice of the carbon source and autoregulatory limitation of sugar utilization / R. Bruckner, F. Titgemeyer // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - V. 209. - P. 141-148.

40. Burbulys D. The initiation of sporulation in Bacillus subtilis is controlled by a multicomponent phosphorelay / D. Burbulys, K. A. Trach, J. A. Hoch // Cell. -1991.-V. 64.-P. 545-552.

41. Burkholder W. F. Replication initiation proteins regulate a developmental checkpoint in Bacillus subtilis / W. F. Burkholder, I. Kurtser, A. D. Grossman // Cell. 2001. - V. 104. - P. 269-279.

42. Cazemier A. E. Effect of sporulation and recoveiy medium on the heat resistance and amount of injury of spores from spoilage bacilli / A. E. Cazemier, S. F. Wagenaars, P. F. ter Steeg // J. Appl. Microbiol. 2001. - V. 90. - № 5. - P. 761-770.

43. Chauvaux S. CcpB, a novel transcription factor implicated in catabolite repression in Bacillus subtilis / S. Chauvaux, I. T. Paulsen, M. H. Jr. Saier // J. Bacteriol. 1998.-V. 180. P. 491-497.

44. Core L. J. A free terminal carboxylate group is required for PhrA pentapeptide inhibition of RapA phosphatase / L. J. Core, S. Ishikawa, M. Perego // Peptides. -2001.-V. 22.-№10.-P. 1549-53.

45. Core L. TPR-mediated interaction of RapC with ComA inhibits response regulator-DNA binding for competence development in Bacillus subtilis / L. Core, M. Perego // Mol. Microbiol. 2003. - V. 49. - P. 1509-1522.

46. Darbon E. Phosphotransfer functions mutated Bacillus subtilis HPr-Iike protein Crh carrying a histidine in the active site / E. Darbon, A. Galinier, D. Le Coq, J. Deutscher// J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 3. - P. 439-444.

47. Davail S. Cold adaptation of proteins / S. Davail, G. Feller, E. Narinx, C. Gerday // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269 - P. 1744-17453.

48. Dubnau D. Genetic competence in Bacillus subtilis / D. Dubnau // Microbiol. Rev. 1991. - V. 55. - №3. - P. 395-424.

49. Egger L. A. Signal transduction via the histidyl-aspartyl phosphorelay / L. A. Egger, H. Park, M. Inouye // Genes-Cells. 1997. - V. 2. - P. 167-184.

50. Errington J. Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expression and control of morphogenesis // Microbiol. Rev. 1993. - V. 57. - №1. - P. 1-33.

51. Errington J. Establishment of cell-specific transcription during sporulation in Bacillus subtilis / J. Errington, N. Uling // Mol. Microbiol. 1993. - V. 6. - №6. -P. 689-695.

52. Fabret C. Two-component signal transduction in Bacillus subtilis: how one organism sees its world / C. Fabret, V. A. Feher, J. A. Hoch // J. Bacteriol. -1999.-V. 181.-P. 1975-1983.

53. Fawcett P. The transcriptional profile of early to middle sporulation in Bacillus subtilis / P. Fawcett, P. Eichenberger, R. Losick, P. Youngman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - P. 8063-8068.

54. Ferrari E. Trascription of Bacillus subtilis subtilisin and expression of subtilisin in sporulation mutants / E. Ferrari, D. J.Henner, M. Perego, J. A. Hoch // J. Bacteriolog. 1988. - V. 170. - P. 289-295.

55. Fisher S. L. Walsh. Cross-talk between the histidine protein kinase VanS and the response regulator PhoB / S. L. Fisher, W. Jiang, B. L. Wanner, С. T. Walsh //J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 23143-23149.

56. Gallagher T. Calcium-independent subtilisin by design / T. Gallagher, P. Bryan, G. L. Gilliland // Proteins. 1993. - V. 16. - P. 205-213.

57. Gallagher T. The prosegment-subtilisin BPN' complex: Crystal structure of a specific 'foldase' / T. Gallagher, G. Gilliland, L. Wang, P. Bryan // Structure. -1995. V. 3. - P. 907-914.

58. Gonzalez-Pastor J. E. Cannibalism by sporulating bacteria / J. E. Gonzalez-Pastor, E. C. Hobbs, R. Losick// Science. 2003. - V. 301. - P. 510-551.

59. Gonzy-Tr'eboul G. Phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferasesystem of Bacillus subtilis: nucleotide / G. Gonzy-Tr'eboul, M. Zagorec, M. C. Rain-Guion, M. Steinmetz//Microbiol. 1989.-V. 3.-P. 103-112.

60. Greer J. Comparative modeling methods: Application to the family of mammalian serine proteases / J. Greer // Protein Struct. Funct. Genet. 1990. -V. 7.-P. 317-334.

61. Haldenwang W. G. The sigma factors of Bacillus subtilis / W. G. Haldenwang // Microb. Rev. 1995. - V. 59. - №1. - P. 1-30.

62. Hamoen L. W. The Bacillus subtilis transition state regulator AbrB binds to the -35 promoter region of comK / L. W. Hamoen, D. Kausche, M. A. Marahiel, D. van Sinderen, G. Venema, P. Serror //FEMS Microbiol. Lett. 2003. - V. 218. -№2. - P. 299-304.

63. Hartley B. S. Proteolitic Enzimes / B.S. Hartley // Annu. Rev. Biocem. 1960. - V. 29. - P. 45-72.

64. Hazes B. Model building of disulfide bonds in proteins with known three-dimensional structure / B. Hazes, B. W. Dijkstra // Protein Eng. -1988. V. 2. -P. 119-125.

65. Helmann J. D. Homologous metalloregulatory proteins from both Gram-positive and Gram-negative bacteria control transcription of mercury resistanceoperons / J. D. Helmann, Y. Wang, I. Mahler, С. T. Walsh // J. Bacterid. -1989. V. 171. -№1. - P. 222-229.

66. Henkin Т. M. Catabolite repressionof a-amylase gene expression in Bacillus subtilis involves a trans-acting gene product homologous to the Escherichi acoli

67. Ф lacl and galR repressors / Т. M. Henkin, F. J. Grundy, W. L. Nicholson, G. H.

68. Chambliss // Mol. Microbiol. 1991. - V. 5. - P. 575-584.

69. Henkin Т. M. The role of CcpA transcriptional regulator in carbon metabolism in Bacillus subtilis / Т. M. Henkin // FEMS Microbiol. Lett. 1996. - V. 135. -P. 9-15.i

70. Henner D. J. Location of targets of the hpr-91, sacU32 (Ну), and sacQ36 (Ну) mutations in upstream region of the subtilisin promoter / D. j. Henner, E. Ferrari, M. Perego, J. A. Hoch // J. Bacterid. 1988. - V. 170. - №1. - P. 2961. Ф 300.

71. Hoch J. A. Keeping Signals Straight in Phosphorelay Signal Transduction / J.ь A. Hoch, К. I. Varughese // J. of Bacteriology. 2001 - P. 4941-4949.

72. Hueck C. J. Cloning, expression and functional analyses of the catabolite control protein CcpA from Bacillus megateriu / C. J. Hueck, A. Kraus, D. Schmiedel, W. Hillen // Mol. Microbiol. 1995. - V. 16. - P. 855-864.

73. Chesnut, E. Sharkova, M.F. Duggan, N. Kapp // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. -№5. -P.1348-1358.

74. Inada T. Mechanism responsible for glucose-lactose diauxie in Escherichia coli: challenge to the cAMP model / T. Inada, K. Kimata, H. Aiba // Genes

75. Ф Cells. 1996. - V. 1. - P. 293-301.

76. Ishikawa S. Biochemical characterization of aspartyl phosphate phosphatase interaction with a phosphorylated response regulator and its inhibition by a pentapeptide / S. Ishikawa, L. Core, M. Perego // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277.-P. 20483-20489.

77. Jaaks K. J. Identification and characterization of genes controlled by the sporulation-regulatory gene spoOH in Bacillus subtilis / K. J. Jaaks, J. Healy, R. Losick, A. D. Grossman // J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - P. 4121 -4129.

78. Jacob F. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of protein / F. Jacob, J. Monod// J. Mol. Biol. 1961. - V. 3. - P. 318-356.

79. Jain S. C. The crystal structure of an autoprocessed Ser221Cys-subtilisin E-propeptide complex at 2-0 A resolution / S. C. Jain, U. Shinde, Y. Li, M. Inouye, H. M. Barman // J. Mol. Biol. 1998. - V. 284. - P. 137-144.

80. Jault J. M. The HPr kinase from Bacillus subtilis is a homo-oligomeric enzyme, which exhibits strong positive cooperativity for nucleotide and fructose 1,6-bisphosphate binding / J. M. Jault, S. Fieulaine, S. Nessler, P.

81. Gonzalo, A. Di. Pietro, J. Deutscher, A. Galinier // J. Biol. Chem. 2000. - V.• 275.-P. 1773-1780.

82. Jin S. Bacillus subtilis genes that code for enzymes involved in acetyl-CoA metabolism. / S. Jin, A. L. Sonenshein // Presented at the Int. Conf. on Bacilli, 6th, Stanford, Caif. 1991.г

83. Jonas R. M. The Bacillus subtilis spoIIG operon encodes both о and gene necessary for oE activation / R. M. Jonas, E. A. Weaver, T. J. Kenney, C. P. Jr. Moran, W. G. Haldenwang //J. Bacteriol. 1988.- V. 170.-P. 507-511.

84. Jones В. E. Binding of the catabolite repressor protein CcpA to its DNA targetis regulated by phosphorylation of its corepressor HPr / В. E. Jones, V.

85. Dossonnet, E. Kuster, W. Hillen, J. Deutscher, R. E. Klevit // J. Biol. Chem. -1997. V. 272. - P. 26530-26535.

86. Klier A. Distinct control sites located upstream from the levansucrase gene of Bacillus subtilis / A. Klier, A. Fouet, M. Debarbouille, F. Kunst, G. Rapoport

87. Ф // Mol. Microbiol. 1987. - V. 1. - №2. - P. 233-241.

88. Klier A. Positive regulation in the gram-positive bacterium: Bacillus subtilis / A. Klier, T. Msadek, G. Rapoport // Ann. Rev. Microbiol. 1992. - V. 46. - P. 429-459.

89. Kraulis P. J. MOLSCRIPT: A program to produce both detailed and schematic plots of protein structure / P. J. Kraulis // J. Appl. Crystal. — 1991. — V. 24.-P. 946-950.

90. Kundig W. Phosphate bound to histidine in a protein as an intermediate in a novel phosphotransferase system / W. Kundig, S. Gosh, S. Roseman // Proc. Natl. Acad Sci. USA. 1964. - V. 52. - P. 1067-1074.

91. Kunitate A. Purification and characterization of a termostable serine proteasefrom Bacillus thuringiensis / A. Kunitate, M. Okamoto, I. Ohmori // Agric. > • Biol. Chem.- 1989.-V. 53.-P. 3251-3256.

92. Kuster E. Immunological crossreactivity to the catabolite control protein

93. CcpA from Bacillus megaterium is found in many gram-positive bacteria / E.

94. Kuster, E. J. Luesink, W. M. de Vos, W. Hillen // FEMS Microbiol. Lett -1996.-V. 139.-P. 109-115.

95. Kwon S. T. Nucleotide sequence of the gene for aqualysin I (a thermophilic alkaline serine protease) of Thermits aquaticus YT-I and characteristics of theф deduced primary structure of the enzyme / S. T. Kwon, I. Terada, H.

96. Matsuzawa, T. Ohta // Eur. J. Biochem. 1988. - V. 173. - P. 491-497.

97. Lai X. Discoveryof a ptsHI operon, which includes a third gene (ptsT), in the thermophile Bacillus stearothermophilus / X. Lai, L. O. Ingram // Microbiology.-1995.-V. 141.-P. 1443-1449.

98. Leloup L. Characterization of the rate-limiting step of the secretion of Bacillus subtilis a-amilase overproduced during the exponential phase of growth / L. Leloup, R. Chambert, M. F. Petif-geatron // Microbiology. 1997. -V. 143.-P. 3295-3303.

99. Lenski R. E. Stability of recombinant DNA and its effects on fitness / R. E. Lenski, Т. T. Nguen // Trends Biotechnol. Ecol. Evol. 1988. - V. 6. - P. 5153.

100. Lerner C. J. Stimuli that induce production of Candida albicans extracellular aspartyl proteinase / C. J. Lerner, R. C. Yoldman // Gen. Microbiol. 1991. -V. 139.-P. 1643-1651.

101. Leshchinskaya I. B. Glutamylendopeptidase of Bacillus intermedius, strain 319 / I. B. Leshchinskaya, E. V. Shakirov, E. L. Itskovitch, N. P. Balaban, A.

102. M. Mardanova, M. R. Sharipova, M. B. Viryasov, G. N. Rudenskaya, V. M.

103. Stepanov // FEBS Lett. 1997. - V. 404. - P. 241-244.

104. Levit M. N. Stimulus response coupling in bacterial chemotaxis: receptor dimers in signaling arrays / M. N. Levit, Y. Liu, J. B. Stock. // Mol. Microbiol. 1998. - V. 30. - P. 459-466.

105. Lilley G. Amino acid and DNA sequences of an extracellular basic protease of Dichelobacter nodosus show that it is a member of the subtilisin family of proteases / G. Lilley, D. J. Stewart, A. A. Kortt // Eur. J. Biochem. 1992.• V.210.-P. 13-21.

106. Lipkind G. Molecular modeling of the substrate specificity of prohormone convertases SPC2 and SPC3 / G. Lipkind, Q. Gong, D. E. Steiner // J. Biol. Chem. 1995. -V. 270. - P. 13277-13284.

107. Losick R. Cascades of sigma factors / R. Losick, J. Pero // Cell. 1981. - V. Ф 25. - P. 582-584.

108. Losick R. Crisscross regulation of cell-type-specific gene expression during development in Bacillus subtilis / R. Losick, P. Stragier // Nature. 1992. -V. 355.-P. 601-604.

109. Martin J. Identification of a new locus, sacV, involved in the regulation ofmlevansucrase synthesis in Bacillus subtilis / J. Martin, M. Debarbouille, A. Klier // FEMS Microbiol. Lett. 1987. - V. 44. - P. 39-43.

110. Martin-Verstraete I. Two different mechanisms mediate catabolite repression of the Bacillus subtilis levanase operon / I. Martin-Verstraete, J. Stulke, A. Klier, G. Rapoport // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 6919-6927.

111. Matsumura M. Substantial increase of protein stability by multiple disulphide bonds / M. Matsumura, G. Signor, B. W. Matthews // Nature. 1989. - V. 342.-P. 291-293.

112. McEvoy M. M. Two binding modes reveal flexibility in kinase/response regulator interactions in the bacterial chemotaxis pathway. / M. M. McEvoy, A. C. Hausrath, G. B. Randolph, S. J. Remington, F. W. Dahlquist / Proc.

113. Mitchinson С. Protein engineering of disulfide bonds in subtilisin BPN' / C. Mitchinson, J. A. Wells // Biochemistry. 1989. -V. 28. - P. 4807-48 15.

114. Miwa Y. Catabolite repression of the Bacillus subtilis gnt operon exerted by two cataboliteresponsive elements / Y. Miwa, K. Nagura, S. Eguchi, H.

115. Fukuda, J. Deutscher, Y. Fujita // Mol. Microbiol. 1997. - V. 23. - P. 12031213.

116. Mizuno T. Compilation of all genes encoding bacterial two-component signal transducers in the genome of the cyanobacterium, Synechocystis sp. strain

117. PCC 6803 / T. Mizuno, T. Kaneko, S. Tabata // DNA Res. 1996. - V. 3. - P. 407-414.

118. Mizuno T. Compilation of all genes encoding two-component phosphotransfer signal transducers in the genome of Escherichia coli / T. Mizuno // DNA Res.- 1997. V.4. - P. 161-168.

119. Molle V. The SpoOA regulon of Bacillus subtilis / V. Molle, M. Fujita, S. T. Jensen, P. Eichenberger, J. E. Gonzalez-Pastor, J. S. Liu, R. Losick // Mol. Microbiol. 2003a. - V. 50. - P. 1683-1701.

120. Molle V. Additional targets of the Bacillus subtilis global regulator CodY identified by chromatin immunoprecipitation and genome-wide transcript analysis / V. Molle, Y. Nakaura, R. P. Shivers, H. Yamaguchi, R. Losick, Y.

121. Fujita, A. L. Sonenshein//J. Bacteriol. -2003b. -V. 185.-P. 1911-1922.

122. Parkinson J. S. Communication modules in bacterial signaling proteins / J. S. Parkinson, E. C. Kofoid // Annu. Rev. Genet. 1992. - V. 26. - P. 71-112.

123. Partridge S. The role of a1' in prespore-specific transcription in Bacillus subtilis / S. Partridge, D. Foulder, J. Errington I I Mol. Microbiol. 1991. - V. 5. - P. 757-767.

124. Perego M. Pentapeptide regulation of aspartyl-phosphate phosphatases / M. Perego, J. A. Brannigan // Peptides. 2001. - V. 22. - P. 1541-1547.

125. Perego M: A new family of aspartyl phosphate phosphatases targeting the sporulation transcription factor SpoOA of Bacillus subtilis / M. Perego // Mol. Microbiol. 2001. - V. 42. - P. 133-143.

126. Piggot P. J, Hilbert D. W. Sporulation of Bacillus subtilis / P. J. Piggot, D. W. Hilbert // Curr. Opin. Microbiol. 2004. - V.12. - №7 (6). - P. 579-586.

127. Postma P. W. Phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase systems of bacteria / P. W. Postma, J.W. Lengeler, G.R. Jacobson // Microbiol. Rev. 1993.-V. 6. - P. 543-594.

128. Predich M. Bacillus subtilis early sporulation genes kinA, spoF, and spoOA are transcribed by the RNA polymerase containing о11 / M. Predich, G. Nair, I. Smith//J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 2771-2778.

129. Priest F. G. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacilli / F.G. Priest // Bacteriol. Rev. 1977. - V. 41. - P. 711-753.

130. Qian Q. AbrB is a regulator of the sigma (W) regulon in Bacillus subtilis / Q. Qian, C. Y. Lee, J. D. Helmann, M. A. Strauch // FEMS Microbiol. Lett. -2002. V. 211. - №2. - P .219-223.

131. Rather P.N. Negative regulator of cG-controlled gene expression in stationary-phase Bacillus subtilis / P.N. Rather, R. Coppolecchia, H. DeGrazia, C.P.Jr. Moran //J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 709-715.

132. Ratnay ake-Lecamwasam M. Bacillus subtilis CodY represses early-stationary-phase genes by sensing GTP levels / M. Ratnay ake-Lecamwasam, P. Serror, K. W. Wong, A. L. Sonenshein // Genes Dev. 2001. - V. 15. - P. 1093-1103.

133. Reizer J. Characterization of a family of bacterial response regulator aspartyl-phosphate (RAP) phosphatases / J. Reizer, A. Reizer, M. Perego, M. H. Saier // Jr. Microb. Сотр. Genomics 1997. - V. 2. - №2. - P. 103-111.

134. Reizer J. A novel protein kinase that controls carbon catabolite repression in bacteria / J. Reizer, C. Hoischen, F. Titgemeyer, C. Rivolta, R. Rabus, J. Stulke, D. Karamata, M. H. Saier, Jr. W. Hillen / Mol. Microbiol. 1998. - V. 27. - P. 1157-1169.

135. Sahl H. G. Biosynthesis and biological activities of lantibiotics with unique post-translational modifications / H. G. Sahl, R .W. Jack, G. Bierbaum // Eur. J. Biochem. 1995. - V. 230. - P. 827-853.

136. Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis. 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

137. Shapiro, L. Protein localization and cell fate in bacteria / L. Shapiro, R. Losick.//Science. 1997.-V. 276.-P. 712-718.

138. Sharp P.A. Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose—ethidium bromide electrophoresis / P.A. Sharp, B. Sugden, J. Sambrook // Biochemistry. 1973. -V. 12.-P. 3055-3063.

139. Siezen R. J. Homology modeling and protein engeneering strategy of subtilases, the family of subtilisin-like serine proteinases / R. J. Siezen, W. M. de Vos, J. A. M. Leunissen, B. W Dijkstra // Protein engineering. 1991. - V. 4.-P. 719-737.

140. Siezen R. J. Homology modelling of the catalytic domain of human furin. A model for the eukaryotic subtilisin-like proprotein convertases / R. J. Siezen, J. W. M. Creemers, W. J. M. van de Ven // Eur. J. Biochemist. 1994. - V. 222.-P. 255-266.

141. Siezen R. J. Homology modeling of the Lactococcus lacris leader peptidase NisP and its interaction with the precursor of the lantibiotic nisin / R. J. Siezen, H. S. Rollema, O. P. Kuipers, W. M. de Vos // Protein Eng. 1995a. -V. 8.-P. 117-125.

142. Siezen R. J. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like serine proteinases / R. J. Siezen, A. M. Leunissen // Protein science. 1997. -V. 6. - P. 501-523.

143. Sonenshein A. L: Control of sporulation initiation in Bacillus subtilis / A. L Sonenshein // Curr. Opin. Microbiol. 2000. - V. 3. - P. 561-566.

144. Stahl M. L. Replecement of the Bacillus subtilis structural Gene with an in vitro Derived Deletion Mutation / M. L. Stahl, T. R. Ferreri // Bacteriol. -1994.-P. 411-418.

145. Stephenson K. PAS-A domain of phosphorelay sensor kinase A: a catalytic ATP-binding domain involved in the initiation of development in Bacillus subtilis / K. Stephenson, J. A. Hoch // Proc. Nat.l Acad. Sci. USA. 2001. -V. 98.-P. 15251-15256.

146. Stock J. B. Protein phosphorylation and regulation of adaptive response in bacteria / J. B. Stock, A. J. Ninfa, A. M. Stock // Microbiol. Rev. 1989. - V. 53. - P. 450-490.

147. Stragier P. Chromosomal rearrangement generating a composite gene for a developmental transcription factor / P. Stragier, B. Kunkel, L. Kroos, R. Losick // Science. 1989. - V. 243. - P. 507-512.

148. Stragier P. Cascades of sigma factors revisited / P. Stragier, R. Losick // Mol. Microbiol. 1990. - V. 4. - P. 1804-1806.

149. Strauch M. A. The SpoOA protein of Bacillus subtilis is a repressor of the abrB gene / M. A. Strauch, V. Webb, G. Spiegelman, J. A. Hoch // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990.-V. 85.-№5.-P. 1801-1805.

150. Strauch M. A. SpoOA activates and represses its own synthesis by binding at its dual promoters / M. A. Strauch, K. Trach, J. Day, J. A. Hoch // Biochimie. 1992.-V. 174.-P. 619-626.

151. Strauch M. A. AbrB modulates expression and catabolite repression of a Bacillus subtilis ribose transport operon / M. A. Strauch // J. Bacteriol. 1995. -V. 177.-P. 6727-6731.

152. Stulke J. PRD—A protein domain involved in PTS-dependent induction and carbon catabolite repression of catabolic operons in bacteria / J. Stulke, M. Arnaud, G. Rapoport, I. Martin-Verstraete // Mol. Microbiol. 1998. - V. 28. -P. 865-874.

153. Stulke J. Carbon catabolite repression in bacteria / J. Stulke, W. Hillen // Curr. Opin. Microbiol. 1999. - V. 2. - P. 195-201.

154. Sun D. Identification of a new sigma-factor involved in a compartmentalized gene expression during sporulation of a Bacillus subtilis / D. Sun, P. Stragier, P. Setlow // Genes Dev. 1989. - V. 3. - P. 141-149.

155. Sun D. Control of transcription of the Bacillus subtilis spoIIIG gene, whichлcodes for the forespore-specific transcription factor a / D. Sun, R. M. Cabrera-Martinez, P. Setlow//J. Bacteriol. 1991. - V. 173- P. 2977-2984.

156. Tanaka Т. PrtR enhances the mRNA level of the Bacillus subtilis extracellular proteases / T. Tanaka, M. Kawata, J. Nagami , H. Uchivama // J. Bacteriol. -1987. V. 169. - №7. - P. 3044-3050.

157. Tchieu J. H. The complete phosphotransferase system in Escherichia coli / J. H. Tchieu, V. Norris, J. S. Edwards, M. H. Jr. Saier // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 3. - P. 329-346.

158. Thomason P. Eukaryotic signal transduction via histidine- aspartate phosphorelay / P. Thomason, R. Kay // J. Cell Sci. 2000. - V. 113. - P. 3141-3150.

159. Trach K. A. Multisensory activation of the phosphorelay initiating sporulation in Bacillus subtilis: identification and sequence of the protein kinase of the alternative pathway / K. A. Trach, J. A. Hoch // Mol. Microbiol. 1993. - V. 8. - P. 67-79.

160. Uhl M. A. Integration of multiple domains in a two-component sensor protein: the Bordetella pertussis BvgAS phosphorelay / M. A. Uhl, J. F. Miller. // EMBOJ.- 1996.- V. 15.-P. 1028-1036.

161. Wang L. F. Complex character of senS, a novel gene regulating expression of extracellular protein genes of Bacillus subtilis / L. F. Wang, R. H. Doi // J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 1939-1947.

162. Warner J. B. A Crh specific function in carbon catabolite repression in Bacillus subtilis / J. B. Warner, J. S. Lolkema // FEMS Microbiol. Lett. -2003.-V. 220.-P. 277-280.

163. Weickert M. J. A family of bacterial regulators homologous to Gal and Lac repressors / M. J. Weickert, S. Adhya // J. Biol. Chem. -1992. V. 267. - P. 15869-15874.

164. Weir J. Regulation of SpoOH, a gene coding for the Bacillus subtilis a11 factor / J. Weir, M. Predich, E. Dubnau, G. Nair, I. Smith // J. Bacteriol. 1991. - V. 173. - P.521-529.

165. Wells J.A. Designing substrate specificity by protein engineering of electrostatic interactions / J. A. Wells, D. B. Powers, R. R. Bott, T. P. Graycar, D. A. Estell // Proc. Narl. Acad. Sci. USA. 1987. - V.84. - P. 12191223.

166. Wells J.A. In vivo formation and stability of engineered disulfide bonds in subtilisin / J. A. Wells, D. B. Powers // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. - P. 6564-6570.

167. Wosten M. M. Eubacterial sigma-factors / M. M. Wosten // FEMS Microbiol. Rew. 1998. - V. 22. - P. 127-150.

168. Wright C. S. Structure of subtilisin BPN' at 2-5 angstrom resolution / C. S. Wright, R. A. Alden, J. Kraut // Nature. 1969. - V. 221. - P. 235-242.

169. Yabuta Y. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone. A functional peptide chaperone designed using sequence databases / Y. Yabuta, E. Subbian, C. Oiry, U. Shinde // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. P. 1524615251.

170. Yabuta Y. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone: propeptide release modulates activation precision of pro-subtilisin / Y. Yabuta, H. Takagi, M. Inouye, U. Shinde // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. P. 44427-44434.

171. York K. SpoOA controls the aA dependent activation of Bacillus subtilis sporulation - specific transcription unit spollE / K. York, T. J. Kenney, S.141

172. Satola, С. P. Moran, H. Poth, P. Youngman // J. Bacteriol. 1992. - V. 174(-P. 2648-2658.

173. Zalieckas J. M. Expression of the Bacillus subtilis acsA gene: position and sequence context affect cre-mediated carbon catabolite repression / J. M. Zalieckas, L. V. Jr Wray, S. H. Fisher // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. -P.6649-6654.

174. Zalieckas J. M. Trans-acting factors affecting carbon catabolite repression of the hut operon in Bacillus subtilis / J. M. Zalieckas, L. V. Jr Wray, S. H. Fisher//J. Bacteriol 1999. - V. 181. - P. 2883-2888.

175. Zheng L. Cascade regulation of spore coat gene expression in Bacillus subtilis /L. Zheng, R. Losick//J. Mol. Biol. 1990. - V. 212. - P. 645-660.

176. Zhu X. The CheZ-binding surface of CheY overlaps the CheA- and FliM-binding surfaces / X. Zhu, K. Volz, P. Matsumura // J. Biol. Chem. 1997. -V. 272.-P. 23758-23764.

Информация о работе

Кириллова, Юлия Марсельевна
кандидата биологических наук
Казань, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius в рекомбинантных штаммах Bacillus subtilis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы