Расшифровка механизмов регуляции генов сериновых протеиназ бацилл

Тойменцева, Анна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Расшифровка механизмов регуляции генов сериновых протеиназ бацилл
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Расшифровка механизмов регуляции генов сериновых протеиназ бацилл"

ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

ТОЙМЕНЦЕВА АННА АЛЕКСАНДРОВНА

РАСШИФРОВКА МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ ГЕНОВ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ БАЦИЛЛ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

1 О ЯНВ 2013

005048169

Казань-2012

005048169

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор

Шарипова Маргарита Рашидовна

Официальные оппоненты: Доктор ветеринарных наук,

профессор кафедры микробиологии и вирусологии факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО "Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана" Госманов Рауис Госманович

Кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник лаборатории молекулярных основ патогенеза ФГБУН "Казанский институт биохимии и биофизики" Казанского научного центра РАН Давыдова Марина Николаевна

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится « 27 » декабря 2012 г. в {¿ СО ч на заседании диссертационного совета Д.212.081.08 при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здание, ауд. 211. Факс: 8(843)238-71-21,233-78-40. E-mail: ToimencevaAA@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета

Автореферат разослан ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д- б- н> 3. И. Абрамова

Актуальность проблемы. Секретируемые белки составляют до 50% от общего количества белковых компонентов клеток бацилл. Многие из них участвуют в гидролизе природных полипептидов и синтезируются в ответ на изменения в окружающей среде. Среди них особое внимание привлекают протеиназы. Эти ферменты вовлечены в важнейшие физиологические процессы клетки, например, участвуют в катаболизме субстратов, споруляции, расщеплении и круговороте белков. Бактериальные протеиназы широко используются в пищевой промышленности, для производства моющих средств и имеют большой потенциал применения в качестве фармакологических препаратов, например, для лечения расстройств пищеварения или болезней сердечнососудистой системы [Gupta R., et al., 2002]. Как правило, в качестве продуцентов протеиназ используются различные штаммы бацилл. Однако, наличие комплекса внеклеточных протеиназ у бацилл создает большую проблему в генной инженерии и биотехнологии, поскольку снижает накопление гетерологичных белков в культуральной жидкости продуцентов [Westers L., et al., 2004]. Решение этой проблемы требует создания новых штаммов-продуцентов и экспрессионных систем, основанных на индуцибельных бациллярных промоторах.

Одной из наиболее интересных групп протеолитических ферментов является класс сериновых протеиназ. Они обнаружены у прионов, бактерий, вирусов, простейших и высших эукариот [Rawlings N.D., et al., 2012]. Сериновые протеиназы эукариот участвуют во многих процессах, в том числе, в эмбриогенезе и развитии патологических состояний. В связи с этим, исследование прокариотических аналогов этих ферментов является удобной моделью при разработке новых лекарственных средств для борьбы с заболеваниями человека. Расшифровка механизмов регуляции генов прокариотических сериновых протеиназ может стать основой для новой стратегии получения гетерологичных белков и создания высокоэффективных систем их экспрессии, что является актуальным направлением современной молекулярной биотехнологии.

Несмотря на объём знаний, накопленных о сериновых протеиназах бацилл, функция этих ферментов в клетке и механизмы их регуляции изучены недостаточно. Для выяснения физиологической функции белка часто используют метод направленной инактивации гена. Штаммы с инактивированными генами протеиназ служат для получения гетерологичных белков, поскольку инактивация внеклеточных ферментов позволяет достичь выхода продукта в количествах, необходимых для применения в биотехнологии. Для разработки эффективных рекомбинантных штаммов и новых систем экспрессии необходимы знания о механизмах регуляции генов. Анализ регуляторных областей, выяснение промоторной специфичности и расшифровка механизмов экспрессии генов является основой клонирования генов в составе экспрессионных систем.

Целью работы являлись расшифровка механизмов регуляции генов сериновых протеиназ бацилл, выяснение роли этих белков в физиологии микробной клетки и разработка системы экспрессии для клонирования их генов. Основные задачи исследования:

1. Определить длину регуляторной области генов субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы Bacillus pumilus',

2. Определить влияние транскрипционных факторов (SpoOA, DegU, SigD, плейотропных репрессоров) на функционирование промоторов;

3. Установить роль протеиназ в физиологии бацилл путём инактивации генов сериновых протеиназ;

4. Разработать систему экспрессии для получения гетерологичных белков на основе антибиотико-индуцибельного промотора двухкомпонентной системы LiaRS Bacillus subtilis-,

5. Оценить эффективность экспрессии репортёрного гена gfp и генов сериновых протеиназ в составе новой экспрессионной системы.

Научная новизна. Все результаты, изложенные в диссертационной работе, получены впервые.

1. Впервые изучена зависимость экспрессии генов сериновых протеиназ от длины промоторного региона генов на основе репортёрных fusion-конструкций (Раргвр-gfp, РgseBp-gfp)- Установлены области регуляции генов протеиназ В. pumilus, свидетельствующие, что длина промотора обусловлена вкладом фермента в физиологию бацилл.

2. Разработаны новые беспротеазные штаммы В. pumilus с инактивированными генами субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы. Получены приоритетные данные, свидетельствующие, что инактивация генов протеиназ привела к изменениям в клеточной морфологии, ускорению лизиса клеток, частичному изменению в способности разлагать углеводы и изменению уровня секреции других гидролаз.

3. Разработана новая эффективная система экспрессии генов на основе lial промотора В. subtilis, который регулируется двухкомпонентной антибиотико-индуцибельной системой LiaRS (LIKE система - от нем. LIa-Kontrollierte Expression). При клонировании рекомбинантных генов в состав LlKE-системы показано, что в течение 30-60 мин после индукции экспрессия рекомбинантных внутриклеточных генов возрастает в 100-1000 раз. Делеция на хромосоме отдельных элементов lialH-оперона приводит к дополнительному увеличению экспрессии генов. Показано, что эффективная продукция внеклеточных ферментов в составе LIKE системы происходит в течение 4-5 часов после добавления индуктора.

Практическая значимость результатов. Данные о структуре промоторов и контроле экспрессии генов сериновых протеиназ (aprBp, gseBp) В. pumilus 3-19 необходимы при клонировании генов под собственными промоторами, а также могут быть использованы при конструировании новых систем экспрессии на основе модификации промоторов.

Беспротеазные штаммы В. pumilus, полученные в работе, могут служить в качестве реципиентов для получения гетерологичных белков, повышения уровня их продукции и качества целевого белка за счет снижения протеолитической деградации. Эти штаммы могут применяться в биотехнологии, генной инженерии и, в частности, быть использованы для получения минорных компонентов спектра внеклеточных протеаз В. pumilus.

Впервые разработанная новая LIKE экспрессионная система позволяет получить высокий выход гетерологичных белков в клетках бацилл и может быть использована при получении промышленно важных микробных препаратов.

Положения, выноашые на защиту:

1. Гены гидролаз бацилл имеют различную длину промоторов, которая определяется их функцией в физиологии бактерий.

2. Формирование пула внеклеточных гидролитических ферментов В. pumilus зависит от функциональной активности субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы.

3. Новая антибиотико-индуцибельная система экспрессии на основе промотора Р;,а/ В. subtilis эффективна для продукции гетерологичных белков, включая протеиназы бацилл.

Связь работы с научными программами. Работа выполнена в соответствии с планом НИР Казанского (Приволжского) федерального университета (№ гос. регистрации 01:02.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования выполнены при поддержке грантов РФФИ № 09-04-99044-р_офи, Германской службы академических обменов DAAD 2009-2011 гг.: № А/08/75088, № А/09/84065, Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» 2009-2013 гг.: ГК № П344, ГК № П406, ГК № П323, ГК № 815, ГК № 1053, ГК№ 16.740.11.0741.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на IV Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Казань, РФ, 2009), XIV Международной конференции "Ферменты микроорганизмов в биологии и медицине" посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха (Казань, РФ, 2009), Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии», (Казань, РФ, 2009), 3-й совместной конференции Немецкого общества гигиены и микробиологии (DGHM) и Ассоциации по общей и прикладной микробиологии (VAAM) (Ганновер, Германия, 2009), X Научной конференции молодых учёных, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского (Приволжского) федерального университета (Казань, РФ, 2011), Ш Ежегодной Международной научно-практической конференции по биологии студентов, магистрантов и аспирантов Тбилисского государственного университета им. Иванэ Джавахишвили (Тбилиси, Грузия, 2011), Итоговой научно-образовательной конференции студентов Казанского (Приволжского)

федерального университета (Казань, РФ, 2011), XIX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «ЛОМОНОСОВ-2012», МГУ, (Москва, РФ, 2012), XI Научная конференция молодых учёных, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского (Приволжского) федерального университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, РФ, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 работ, из них 5 статей в центральных отечественных и зарубежных рецензируемых журналах.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 2 таблицы, 28 рисунков. Библиография содержит 184 наименований российских и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Штаммы бактерий, плазмидные вектора и условия культивирования.

В работе использовали штаммы и плазмиды из музея лаборатории Биосинтеза и Биоинженерии Ферментов КФУ: стрептомицинустойчивый штамм В. pumilus 319, протеазо-дефицитный штамм В. subtilis BG2036 (предоставлен проф. Eugenio Ferrarri, Genencor Int. Inc., USA), штамм В. subtilis W168 (trpC2), вектора pSC9 и pCB22 (для синтеза гена erm), p58.21, pUC19, pGEM-T Easy (для создания штаммов, нокаутированных по генам сериновых протеиназ). Использовали штаммы и плазмиды, любезно предоставленные Dr. Prof. Т. Mascher (Мюнхенский университет Людвига-Максимилиана, г. Мюнхен, Германия): В. subtilis W168 degU::kan (ТМВ124), В. subtilis W168 spoOÂv.tet (ТМВ205), В. subtilis W168 sigD::spec (TMB225), В. subtilis W168 amyE:: pSJ5101 (P^f-gíp) (TMB408), В. subtilis W168 АР„^lialH (ТМВ604), Е. coli DH5cc (recA 1 endAX gyrA96 thi hsdRl7(rK- mK+) relAl supE44 []80A/acZAM15 A{lacZYA-argF)U169), вектора - pDG1662, pGP380, pSG1151 (для синтеза гена gfpmutl), pMAD (для создания штаммов, не содержащих гены lia оперона), pGFPamyE (для изучения регуляторных участков генов сериновых протеиназ).

Культивирование бактерий проводили на среде LB (%): триптон - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,5; NaCl - 0,5; pH 8.5 [Sambrook et al., 1989], агаризованная среда LB включала дополнительно 2% агара. Среды для трансформации штаммов В. subtilis включали солевую основу среды Спицайзена, (Спицайзена I/II) [Anagnostopolous, Spizizen, 1961]. Идентификационная агаризированная среда для отбора клонов, способных секретировать протеиназу, включала 30% обезжиренного молока и 2% агара. Среды стерилизовали при 1 атм. в течение 30 мин, pH доводили перед стерилизацией среды 40%-ным раствором NaOH до значения 8.5. В среду при необходимости добавляли антибиотики в конечных концентрациях (мкг/мл): стрептомицин - 10,

ампициллин - 20, эритромицин - 20, линкомицин - 20, хлорамфеникол - 5, канамицин - 10, тетрациклин - 10, спекциномицин - 100.

Получение рекомбннантных конструкций. Процедуры по получению рекомбинантной плазмидной/хромосомной ДНК проводили в клетках Е. coli, как описано в [Sambrook et al., 1989]. Праймеры конструировали с помощью программного обеспечения Oligo Cale

(http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html) на основании последовательностей промоторов и генов: aprBp (AN AY754946.2), gseBp (AN Y15136.1) В. pumihis 3-19, lialHGFSR-оперона (AN AL009126.3) В. subtilis 168. Синтез праймеров и секвенирование проводила фирма «Синтол» (Москва). Для клонирования использовали ферменты фирмы «Сибэнзим» (Москва). Выделение геномной ДНК, рекомбинантной плазмидной ДНК, очистку продуктов ПЦР реакции проводили с помощью наборов реактивов фирмы Fermentas (Латвия). При КОНСТруИрОВаНИИ реПОртёрНЫХ fuSÍOn-КОНСТруКЦИЙ (?aprBp^gseBp+gfP^t3) фрагменты ДНК (промоторы генов aprBp, gseBp В. pumihts 3-19) клонировали в вектор pGVVamyE как описано в работе [Bisicchia Р. et al., 2010]. Для изучения влияния транскрипционных факторов на экспрессию генов сериновых протеиназ В. pumihis, генные мутации по соответствующим факторам транскрипции совмещали с полученными репортёрными fusion-конструкциями. Трансформацию клеток В. subtilis плазмидной ДНК проводили, как описано в работе [Anagnostopolous et al., 1961].

Конструирование новой LIKE-снстемы экспрессии и определение активности рекомбинантного промотора V¡¡aI. Для конструирования интегративного и репликативного векторов новой экспрессионной системы в регуляторной области lialH-оперона В. subtilis оптимизировали участок рибосом-связывающего сайта. Оптимизированный промотор (P/M/(optSD))> полученный с помощью ПЦР реакции, клонировали в векторы pDG1662, pGP380 с образованием плазмид pLIKE-int и pLIKE-rep соответственно. Амплификаты генов gfpmutl, aprBp, gseBp клонировали в полученные экспрессионные векторы. Промотор Pftal индуцировали добавлением в среду антибиотика бацитрацина (30 мкг/мл). Активность промотора (A=dGFP/dt/OD600) определяли как описано в работе [Botella Е., et al., 2010]. При определении активности рекомбинантного GFP белка, сумма естественной флуоресценции штамма дикого типа (В. subtilis 168) вычиталась из суммы флуоресценции штаммов с репортёрными конструкциями (Pl,al(0ptSD)+gfP>mi'l; PaprB¡/PgseBp+gíPtnilt3).

Определение протеолитической активности. Общую протеолитическую активность рекомбинантных штаммов определяли по расщеплению азоказеина (Sigma, США) [Charney J. et al., 1947]. Специфическую активность субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы определяли по расщеплению хромогенных субстратов Z-Ala-Ala-Leu-pNa и Z-Glu-pNa соответственно, по методу [Люблинская Л.А. с соав., 1987]. Активность внеклеточной щелочной рибонуклеазы определяли по кислоторастворимым продуктам гидролиза РНК [Лещинская И. Б. с соавт., 1980].

Фосфомоноэстеразную активность определяли по расщеплению р-нитрофенилфосфата («Serva», Германия) [Лещинская И. Б. с соавт., 1980].

Секвенирование и геноинформатика. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программного пакета Clone Manager 6 version 6.00 (SciEdCentral). Выравнивание последовательностей проводили с помощью on-line программного обеспечения NCBI/BLAST.

Математическая обработка результатов. Для статистического анализа экспериментальных данных использовали программу Microsoft Excel, путём расчёта среднеквадратичного отклонения (с). Результаты считали достоверными при о < 10%. При расчёте достоверности получаемых разностей использовали критерий Стьюдента, принимая Р < 0.05 за достоверный уровень значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. In silico характеристика промоторов генов еериновых протеиназ В. punulus. Поскольку структура и длина регуляторных цис-элементов генов протеиназ В. piimilus может значительно различаться, 5'-фланкирующие межгенные регионы генов аргВр и gseBp анализировали с использованием online программы NCBI/BLAST. Выравнивание промоторных областей размером 445 п.о. для гена аргВр и 1149 п.о. для гена gseBp, соответствующих ранее определенным 5'-межгенным регионам, показало высокую степень гомологии с нуклеотидными последовательностями штамма В. pumilus SAFR-032. Небольшая область (58 п.о.) 5'-межгенного региона гена аргВр (-445...+1) имела слабую гомологию с последовательностью гена фермента фосфоглицератмутазы (yhfR, AN СР000813.1). Напротив, в регуляторном регионе гена gseBp (-1149...+1) обнаружили протяжённую последовательность (905 п.о.) с высокой степенью гомологии к гену NADPH-редуктазы (yrhJ., AN СР000813.1, 91% гомологии). Полученные результаты on-line выравнивания позволили предположить наличие открытой рамки считывания внутри 5'-межгенного региона гена gseBp (в положении -1094.. .-189 относительно сайта инициации транскрипции гена) (рис. 1)-

SinR ScoC

-ф-фчф—

-445 п.о.

aptBp У

gfpmut3~y gfpiivjt3~y gfpmut3 У

gseBp "> gfpmut3~y orpl-mili У gfpmut3~~У

Рис. 1. Создание репортёрных конструкций для определения регуляторных участков генов аргВр (а) и gseBp (б). Изогнутыми линиями обозначена область начала транскрипции генов. Фрагмент длиной 905 п.о. с 91% гомологией к гену ЫАОРН-редуктазы штамма В. ритЛш 8АРЯ-032 найденный в 5'-межгенном регионе гена %ьеВр обозначен в виде серого пятиугольника. Линией обозначены участки 5'-межгенных регионов (потенциальных промоторов), использованные для создания ¡^шоп-конструкций.

Определение регуляторного участка (промотора), необходимого для полноценной экспрессии генов сериновых протеиназ. Для определения регуляторного участка генов аргВр и gseBp сконструировали репортёрные fusion-конструкции на основе гена зелёного флуоресцентного белка GFP и промоторных участков генов протеиназ В. pumilus 3-19 разной длины. Три варианта каждого промотора (включающие -445 п.о., -310 п.о., -280 п.о. для гена аргВр; -150 п.о., -122 п.о., -100 п.о. - для гена gseBp) были транскрипционно соединены с маркёрным геном gfpmut3 (рис. 1). Динамика роста и накопление флуоресценции полученных конструкций представлены на рисунке 2 А1/В1. Флуоресцентный сигнал появлялся во всех клетках в переходной фазе развития культуры (на 5-8 часы роста). Анализ РаргВр-фтЫЗ fusion-конструкций показал, что уменьшение 5'-регуляторной области гена субтилизиноподобной протеиназы АргВр (с -445 п.о. до -310 п.о.) приводит к значительному подавлению экспрессии репортёрного гена gfpmut3 (рис. 2 А1/А2). Укорочение промоторного региона до -280 п.о. относительно сайта инициации транскрипции гена аргВр приводило к практически полному ингибированию активности белка GFPMUT3.

ХАЛ

j 1400000 10

Г 1200000

1000000 V 1

800000

-- 600000

400000 о 0.1

-- 200000

S 0 0,01

fB 1L

11 14 17 20 22 25 Бремя, ч

0 3 5 8

11 14 17 20 22 25 28 Вреш), ч

т 800000

ft, 700000

- sooooo

500000

г 400000 п.

Я 300000 и. о

200000 ч

Л 100000

1 0

(А 2)

(В 2)

< §

8 11 14 17 20 22 25 Время, ч

0 3 S 8 11 14 17 20 22 25 28 Время, «з

Рис. 2. Динамика роста, накопление флуоресценции (Al, В1) и экспрессия гена gfpmuti (А2, В2) в штаммах содержащих fusion-конструквдш РаргВр-gfpmiitl (Al/2), PgseBp-gfpmul3 (В1/2). Обозначения конструкций: длина промотора субтилизиноподобной протеиназы А-РаргВр 445, О-РаргВр 310, П-РаргВр 280; ДЛИНа ПрОМОТОра глутамилэндопептидазы А-РgSeBp 150, O-PgseB;» 122, □-РgseBp loo- Рост штаммов обозначен без символов.

Изучение fiision-конструкций с промотором гена глутамилэндопептидазы показало, что при длине регуляторной области (PgxBp) менее 150 п.о. экспрессия репортёрного гена резко снижается (рис. 2 В1/В2). Таким образом, были определены промоторные участки, необходимые для полноценной экспрессии генов сериновых протеиназ В. pumilus 3-19: 150 п.о. для гена глутамилэндопептидазы и 445 п.о. для гена субтилизиноподобной протеиназы.

Экспрессия fusion-конструкций содержащих промоторы сериновых протеиназ в регуляторных мутантах. При лимитации источников питания в клетках почвенных бактерий формируется адаптивный ответ, направленный на выживание. В частности, клетки начинают активно синтезировать различные гидролитические белки (протеазы) [López D., et al., 2010]. Такой процесс обусловлен синтезом в клетке определённых транскрипционных факторов (регуляторов), которые взаимодействуют с отдельными промоторами генов протеаз и активируют их экспрессию. Поэтому, мы исследовали репортёрные fusion-конструкции РaprBp-фтиЗ и РgseBp-фтиЗ, содержащие промоторы генов аргВр и gseBp в штаммах дефектных по регуляторным белкам. Показано, что белки DegU и SpoOA оказывают позитивный эффект на активность генов обеих протеиназ, т.к. удаление этих регуляторов подавляет экспрессию в репортёрных конструкциях: делеция гена degU - полностью, делеция гена spoOA - частично (рис. 3, 4).

Вреікя.ч ..............иреми.ч..........-.............

Рис. 3. Экспрессия ?4451,РгВР-фтШЗ (А), ¥,50ехВр-фтив (В) ^іоп-конструїщий в рекомбинантных штаммах: с дефектом гена регуляторного белка ОеЕи {0е8и\ :кагі) - □; штамм

без мутаций - Л. ..................................................................................................................................

...................І....................ГІІІЖІІІІ1.......а о 5оо ...............-............шх....._..........- ...........

I § воо & ° £ д

° к «пп і Щ 1 3 400

1 в 500 ЛІ \ I 1 А

о! 400 - .¡ІЇШ \ Р 3 300 М М& V

Рис. 4. Экспрессия Р445сргВр-фтШЗ (А), Р«о^вР-фтиЧ (В) &5Юп-конструкдий в рекомбинантном штамме с дефектом гена регуляторного белка вроОА (¡ро0А::Ш) - О; штамм без мутаций - А.

Продукция гидролитических ферментов может конкурировать с другими адаптационными механизмами клетки (например, клеточной подвижностью). В СВЯЗИ с чем изучали экспрессию репортёрных fusion-конструкций РaprBp-gfPmu3> PgseBp-gfpmu3 в мутантном штамме с делецией по регуляторному белку альтернативного сигма фактора - о°. Функционирование SigD регулятора обеспечивает в клетках бацилл сборку жгутикового скелета и синтез автолизинов. В результате клетки способны к движению и не связаны между собой [West J.T., et al., 2000]. Данные, представленные на рисунке 5 показали, что в мутантном штамме (sigDv.spec) сильная экспрессия репортёрного гена под контролем промоторов обеих сериновых протеиназ В. pumilus начинается в начале переходной фазы.

(А) _ (В)

Время, ч Время, ч

Рис. 5. Экспрессия Р u5aprBp-Sfpmut3 (А), Р i5ogscBP-sfp>nut3 (В) fusion-конструкций в рекомбинантном штамме с дефектом гена регуляторного белка SigD - О; штамм без мутаций -Л.

По-видимому, клетки с инактивированным геном альтернативного сигма фактора транскрипции sigD, неспособные к экспрессии генов жгутикового оперона, более интенсивно секретируют в среду протеолитические ферменты.

Таким образом, характеристика промотор-специфичности генов сериновых протеиназ В. pumilus показала, что обе протеиназы имеют сложный механизм регуляции. Промоторы доминирующей и минорной протеиназ различны по длине и организации: промотор гена доминирующей протеиназы АргВр более протяженный (445 п.о.) и содержит большое количество консенс-усных ДНК-сайтов связывания регуляторных белков по сравнению с промотором (150 п.о.) гена минорной протеиназы GseBp. Кроме того, различаются биохимические характеристики и функции данных ферментов В. pumilus: доминирующая в протеолитическом пуле протеиназа (70% активности) неспецифически расщепляет пептиды, белковые субстраты, минорная глутамилэндопептидаза (10% активности) гидролизует гидрофильные пептиды по строго заданным сайтам и является узко-специфичным белком.

II. Получение Ii характеристика штаммов с нокаутированными генами сериновых протеиназ. Для получения штаммов с инактивированными генами использовали подход, основанный на гомологичной рекомбинации между участками экзогенной и геномной ДНК, приводящей к нарушению открытой рамки считывания генов аргВр и gseBp В. pumiliis. Были созданы рекомбинирующие конструкции, в которых ген эритромицина (егт) встроен в гены сериновых протеиназ. После трансформации полученными конструкциями клеток В. pumilus 3-19 проводили отбор мутантов на чашках с эритромицином. Колонии, выросшие на чашках с антибиотиком, тестировали на молочном агаре по уменьшению зон гидролиза казеина вокруг колоний. Выраженные зоны просветления наблюдали у исходного штамма В. pumilus 3-19. У модифицированных штаммов зоны протеолиза отсутствовали, что указывало на инактивацию генов секретируемых протеолитических ферментов. Наличие остаточных зон гидролиза соответствует активности оставшихся секретируемых ферментов протеолитического спектра. В результате отобрали рекомбинантные штаммы В. pumilus МК10 (aprBpv.erm) и В. pumilus 2А-5 (gseBp::erm), которые при тестировании на молочном агаре показали отсутствие протеолитической активности.

Морфология рекомбинантных штаммов (МК10 и 2А-5) по сравнению с диким штаммом (3-19) отличалась: длина клеток МК10 и 2А-5 составляла около 14 мкм (против 8 мкм для дикого штамма); поверхность колоний при росте на агаризованной среде была шероховатая, колонии имели неровные края (по сравнению с более гладкими, ровными краями и слизистыми колониями исходного штамма). На стандартной питательной среде LB показано, что экспоненциальный рост и накопление биомассы для всех трёх штаммов одинаковы. Штаммы одновременно переходили в стационарную фазу, однако склонность к лизису особенно сильно наблюдали у штамма В. pumilus 2А-5 (gseBp::erm) (рис. 6А). У обоих мутантных штаммов (по сравнению с исходным) нарушено спорообразование: появление свободных спор происходило к 36 часу, а на 45 час их количество составляло -5% (рис. 6А).

При повышении температуры культивирования до 42°С в обоих штаммах сокращалась продолжительность стационарной фазы и происходил почти одновременный переход к лизису культуры (рис. 6В). Полученные данные свидетельствуют, что инактивация генов внеклеточных субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэнодопептидазы оказывает эффект на спорообразование и продолжительность стационарной фазы роста. Усиление лизиса клеток у мутантных штаммов, по-видимому, свидетельствует об участии сериновых протеинз в гидролизе автолизинов. Такой процесс описан для клеток В. subtilis и нескольких видов стафилококков [Kodama Т. et al., 2007; Rice К. et al., 2001; Yokoi K.J. et al., 2012].

1 9 18 27 36 45 Время, ч

О 9 18 27 36 45 Время, ч

Рис. 6. Динамика роста и спорообразования исследуемых штаммов, выращенных в жидкой среде LB. (А) Рост/спорообразование клеток В. pumilus: исходный штамм 3-19 (1/4); нокаутированный по гену aprBpv.erm МК-10 (2/5), нокаутированный по гену gseBpv.erm 2А-5 (3/6). (В) Рост клеток при температурах 42°С/15°С: В. pumilus 3-19 (1/4); штамм МК-10 (2/5), штамм 2А-5 (3/6).

Характеристика секретируемых гидролаз нокаутированных штаммов. Известно, что вклад обеих протеиназ, глутамилзндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы, в общую протеолитическую активность штамма В. pumilus 3-19 различен - на АргВр протеиназу приходится около 70%, на глутамилэндопептидазу GseBp до 10% [Sharipova M.R., et al., 2007; 2008]. Мы наблюдали эффект снижения активности различных протеиназ в клетках, содержащих отдельные мутации по генам сериновых протеиназ аргВр и gseBp. По уровню общей протеолитической активности на азоказеине модифицированные штаммы МК10 и 2А-5 уступали исходному штамму 3-19 в -2,5 раза (рис. 7А). У инактивированных штаммов активность на соответствующих нокауту субстратах отсутствовала. При этом, активность в отношении субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNA практически отсутствовала у обоих мутантных штаммов (рис. 7В), тогда как в отношении субстрата Z-Glu-pNA активность не выявлялась у мутанта 2А-5 {gseBp'), но определялась, хотя и на низком уровне у мутанта МК-10 {аргВр) (рис. 1С). По-видимому, функционально-активная субтилизиноподобная протеиназа играет важную роль в формировании минорного фермента глутамилзндопептидазы. Глутамилэндопептидаза, в свою очередь, влияет на формирование пула внеклеточной субтилизиноподобной протеиназы.

Изучение активности РНКазы в штаммах с делециями показало, что инактивация протеазных генов не приводила к изменению её активности (рис. 7D), т.е. созревание фермента не зависит от присутствия субтилизиноподобной протеиназы и глутамилзндопептидазы. В тоже время инактивация генов обеих сериновых протеиназ приводила к изменению уровня активности внеклеточной фосфатазы. По сравнению с исходным (3-19) штаммом активность фосфатазы в штамме 2А-5 повышалась в 3-6 раз на разных стадиях культивирования клеток (рис. 7Е). Штамм с нокаутированным геном аргВр (МК-10) показал менее выраженное увеличение уровня фосфатазы, однако активность фермента была

выше в ~2 раза в стационарной фазе по сравнению с исходным немодифицированным штаммом. Было сделано заключение, что глутамилэндопептидаза может участвовать в созревании фермента фосфогидролазы. В целом, полученные нами данные указывают на сбалансированность содержания протеиназ в общем пуле внеклеточных ферментов и их корегуляцию.

Азокаэемн

(В) Z-Ala-Ala-Leu-pNa

Время, ч

р-Нитрофемилфоефат

8 7

6 s

1 « =

-3 S 2 < 1 О

18 27 36 45 Время, ч

Рис. 7. Динамика роста и активность гидролитических ферментов в

беспротеазных штаммах (МК-10, 2А-5) и исходном штамме (3-19) на различных субстратах. Рост клеток В. ритИт. исходный штамм 3-19 (1); штамм нокаутированный по гену аргВр/.егт МК-10 (2), штамм нокаутированный по гену ^еВр:.егт 2А-5 (3). Активность ферментов в исследуемых штаммах: 3-19 (4); МК-10 (5), 2А-5 (6).

Время, ч РНК

900 750 600 450 300 150

0,2 0,18 0,16 с 0,14 f 0,12 | 0,1 | 0,08 "2 0,06 s 0,04 < 0,02 0

Время, ч Z-Glu-pNa

-0,05 2 <

-0,1 С

Полученные штаммы В. pumilus МК10 (аргВр::егт) и В. pumilus 2А-5 (,gseBpwerm) могут быть рекомендованы для биотехнологических разработок в качестве штаммов-реципиентов для получения гетерологичных белков.

III. Разработка новой экспрессионной системы для получения гетерологичных белков в клетках В. subtilis. Известно, что присутствие в среде гликопептидных антибиотиков (например, бацитрацина, низина, ванкомицина и др.) нарушающих целостность клеточной мембраны, индуцирует в клетках бацилл работу четырёх сигнальных систем - альтернативного сигма фактора ом, и трёх двухкомпонентных систем (LiaRS, BceRS, YvcPQ) [Jordan S., et al., 2008]. Гены lialH-оперона имеют наибольший уровень экспрессии. В отсутствии индуктора, например в логарифмической фазе роста, промотор этого оперона (Р ца1) является «молчащим» (не проявляет базальный уровень экспрессии). В условиях индукции антибиотиками, детергентами, органическими растворителями и др. веществами может достигаться 100- или 1000-кратное увеличение уровня экспрессии генов в течение 5-10 мин. Строгая регуляция данного промотора определяется функционированием ответного регулятора LiaR. На основе промотора lialH-оперона нами сконструирована новая экспрессионная система (LIKE-система, от нем. Lla-Kontrollierte Expression) для получения рекомбинантных белков в клетках В. subtilis. Получены два типа плазмид, несущих индуцируемый промотор Р/ю/ (рис. 8).

Рис. 8. Схема плазмид pLIKE-int и pLIICE-rep, несущих индуцируемый Рш промотор В. subtilis.

Сконструированные векторы различаются копийностью. Вектор pLIKE-int, при трансформации в клетки В. subtilis, позволяет интегрировать рекомбинантную конструкцию (промотор P,to/ + ген интересуемого белка) в хромосому за счёт содержания в его составе участков гена амилазы (атуЕ-Ьаск и amyE-front). Эти участки ограничивают ген резистентности к антибиотику хлорамфениколу (cat) и индуцибельный Pto/ промотор. Вектор рЫКЕ-гер, реплицирующийся в клетках как плазмида (шатл Е. coli/B. subtilis), позволяет получить несколько копий ДНК на клетку. Длина регуляторного участка lialH оперона (промотора, Р,/а/) в составе обоих векторов составляет 156 п.о., включает

ІлаІІ ДНК-связывающую последовательность для индукции ЬіаЯЗ-зависимых генов, -35...-10 область инициации транскрипции, 5В область инициации трансляции. Дня увеличения продукции интересуемых белков провели оптимизацию рибосом-связывающей области регуляторного участка ІіаІН оперона до канонической БВ-последовательности (-taaggagg-), характерной для бациллярных генов (рис. 9).

■ЯШИШ.З-SD

_Шт91_

jmil

PklKI-ini vector CGTAAGGftGGftTC АТС g|&T GGA ТСС TAG AAG CTT АТС GAA TTC...

Sail

JfflmiMtLSD,

Xbal

PstL

JSgilL

_kML

p,UKI-rep vector ...CGTAAGCSAGG!\T TCT AG ft GTC GAC CTG CAG GCA TGC AAG CTT

Рис. 9. Часть регуляторной последовательности lialH оперона, входящей в состав разработанных экспрессионных векторов. P/m/(optSD) содержит оптимизированный канонический сайт Шайна-Дальгарно (выделен жирным шрифтом) и полилинкер. В рамку выделена область из 7 нуклеотидов, расположенных до стартового кодона ATG.

Получение рекомбинантных штаммов В. subtilis для усиления активности Р/,-„/ промотора. На основе структурной организации lialH-liaGFSR регулона и его функционирования предположили, что активация РДа/ промотора приводит к усилению экспрессии генов liaGFSR локуса, за счёт «проскакивания» РНК-полимеразы через терминатор [Mascher Т., et al., 2004]. Тогда удаление терминатора будет способствовать усилению активности индуцируемого Р/ю/ промотора и позволит добиться повышенной продукции рекомбинантных белков. С другой стороны показано, что гиперпродукция LiaH белка в клетках приводит к снижению уровня трансляции (сокращение аминокислот и рибосом), что нежелательно для производства рекомбинантных белков. Основываясь на этих данных, мы получили коллекцию реципиентных рекомбинантных штаммов В. subtilis, предполагая, что дополнительные регуляторные области на хромосоме (промотор, ген и терминатор) будут влиять на экспрессию рекомбинантного гена в составе LIKE системы экспрессии и, в конечном счёте, на выход целевого продукта. Схема lialH-liaGFSR регулона полученных рекомбинантных штаммов представлена на рисунке 10.

Характеристика новой LIKE-системы на основе экспрессии генов рекомбинантных белков. В качестве индуктора LIKE-системы экспрессии был выбран антибиотик бацитрацин. Бацитрацин оказывает наибольший индуцирующий эффект на Рца/ промотор в клетках В. subtilis, в тоже время, максимальный уровень активности промотора достигался при низких концентрациях этого антибиотика [Rietkotter Е., et al, 2008], В качестве репортёрного гена для изучения экспрессии в составе новой LIKE-системы выбрали ген gfpmutl. При сравнении активности Pto/(0ptSD) промотора в составе pLIKE-int и pLIKE-rep плазмид во всех исследуемых рекомбинаитных штаммах наблюдали быстрое (в течение 30 мин) накопление флуоресценции после добавлении бацитрацина (30 мкг/мл) в среду культивирования (рис. II А/А1). Максимальный уровень активности Р/ш/íoptSD) промотора наблюдали в штаммах содержащих репликативный pLIKE-rep вектор по сравнению со штаммами несущими в клетках одну хромосомную копию рекомбинантной конструкции (т.е. в составе pLIKE-int вектора) (рис. 11 В/В1).

Результат оптимизации рибосом-связывающего сайта наблюдали при сравнении продукции белка GFP в двух штаммах - W168 и ТМВ408, содержащих интегративную конструкцию - pLIKE-int+g/p (рис. 11 А/В). Показано, что оптимизация сайта Шайна-Дальгарно приводит к увеличению продукции белка в ~6 раз.

Делеция нативного Р/,я/ промотора на хромосоме штамма ТМВ604 приводила к снижению активности P/rá/(0ptsD) промотора в составе экспрессионного интегративного вектора в 1,5 раза, а в составе репликативного -в 3 раза по сравнению со штаммом, имеющим генотип дикого типа (рис. 11 В/В1). Делеция элементов lialH- оперона, но сохранение нативного Pn¡rf промотора на хромосоме (ТМВ1151/1152), приводила к незначительному увеличению активности рекомбинантного Pfe/(optsD) промотора (в 1,5 раза) при использовании pLIKE-int и pLIKE-rep векторов (рис. 11 В/В1).

WT168 504

<.<LiaHj •«• ~ | aLiaH [

pLIKE-int+g/^

115000 10

95000

75000 1

£L J

55000 § g 35000 S 0,1 15000

pLIKE-rep+g/53

995000 795000 595000 £ 395000 » 195000 -5000

1600

«D1400 ° §1200 о тз

Щ ^1000 £ s

% S 800

л 0> t 5 600 О ф

£ §-400 к >.

Ё 5 200 < §

60 110 160 210 260 310 360 Время, мин

11000 — -a 0000 §• О 9000 Ё § 8000 | | 7000

с ? 6000 fi ? 5000

о » 4000 ■■ | о 3000 ё 5 2000 * 2.1000

0 Ш 10

110 160 210 260 310 360 Время, мин

Рис. 11. Рост, показания флуоресценции (А/А1) и активность промотора (В/В1) в штаммах несущих трансляционные конструкции PiianopiSDrgfpmutl. Кривые роста показаны без символов. Обозначения экспрессии в разных штаммах: (о) (W168), (□) (ТМВ604), (0) (ТМВ1151), (Д) (ТМВ1152) (•) (ТМВ408 Рш-фтш1). Вертикальной пунктирной линией показано время добавление индуктора (OD60o~0.4-0.5, бацитрацин 30 мкг/мл). (C/Cl) Western blot анализ цитоплазматической фракции клеток, содержащих полученные конструкции с использованием антител к белкам LiaH и GFP. Обозначения: 1,2 - экспрессия конструкций с нативного промотора 3-10 - экспрессия конструкций Рвдсрво) в отсутствии (-) и

присутствии (+) бацитрацина (концентрация 30 мкг/мл).

Для подтверждения полученных результатов, провели Western blot анализ с использованием антител к белку GFP и белку LiaH (рис. 11 С/С1). Показали, что оба белка не наблюдались в клетках до их индукции бацитрацином. Это свидетельствует о строгом контроле активности P/M/(0ptSD) промотора в клетках В. subtilis. После добавления антибиотика в среду белки GFP и LiaH накапливались в клетках в различной концентрации, что соответствовало генотипу полученных конструкций (рис. 10, рис. 11 С/С1).

Таким образом, нами разработан эффективный инструментарий - L1KE-система экспрессии В. subtilis, основанная на стресс индуцибельном промоторе ІіаІН-оперона и ряд штаммов с делециями lialH-liaGFSR регулона на хромосоме. Разработанная система позволяет направленно экспрессировать интересуемые гены как в составе плазмидного элемента - репликативная конструкция (pLIKE-гер), так и в составе генома клеток - интегративиая конструкция (pLIKE-int). Показано, что в составе интегративной конструкции P//CT/(optSD) промотор становится активным уже через 20-30 мин, достигая максимума в течение часа после индукции. Напротив, в составе вектора pLIKE-rep промотор становится активным в течение часа, а пик активности фиксируется через 120 мин после индукции.

LIKE-система для продукции генов сериновых протеиназ. Для тестирования новой системы экспрессии бацилл использовали гены сериновых протеиназ В. pumilis 3-19. Известен потенциал этих ферментов в биотехнологии и медицине [Ицкович Е.Л. с соавт., 1998], что определяет необходимость получения чистого продукта в большом количестве. Гены глутамилэндопептидазы (gseBp) и субтилизиноподобной протеиназы (аргВр) клонировали в репликативный вектор pLIKE-rep под контроль P/i„/(optSD) промотора. Плазмидами рАТ3804 и рАТ3805 трансформировали беспротеазный штамм В. subtilis BG2036 и получили рекомбинантные штаммы ТМВ1246 и ТМВ1247 соответственно. Исследовали протеолитическую активность рекомбинантных штаммов на молочном агаре, и с применением специфических субстратов. Как видно из рисунка 12 (А), после 16 ч инкубирования рекомбинантных ТМВ1246, ТМВ1247 и нативного В. pumilus 3-19 штаммов на молочном агаре с добавлением бацитрацина, клетки рекомбинантных штаммов продуцировали протеиназы в среду эффективнее природного штамма.

Далее, с применением специфических субстратов исследовали активность протеиназ (АргВр, GseBp) в рекомбинантных штаммах (ТМВ1246 и ТМВ1247) по сравнению с нативным штаммом В. pumilus 3-19. Как видно из рисунка 12 В/С, после добавления индуктора (с интервалом в час) в культуральной жидкости штаммов ТМВ1246 и ТМВ1247 наблюдалась активность сериновых протеиназ. На 9 ч культивирования в штамме В. subtilis ТМВ1246 активность АргВр фермента увеличивалась в ~2,5 раза по сравнению с нативным штаммом В. pumilus 3-19. Активность глутамилэндопептидазы почти не обнаружена на протяжении с 6 по 9 часы культивирования у бактерий В. pumilus 3-19, однако обнаруживалась в штамме ТМВ1247 (P/ra/(oPtSD)+gsei3p). Таким образом, LIKE система эффективна в отношении экспрессии генов внеклеточных белков.

2-Su-pMa

4 8 6 7 8 Врамя, ч

Z-Ala-Ala-Leu-pWa

0,02 0,018 0,016 0,ОМ 1 0,012 1 0,01 | 0,008 | 0,006 < 0,004 0,002 О

0,1 0,09 0,08 0,07 J 0,06 | 0,06 j 0,04 | 0,03 < 0,02 0,01 О

S 7 Время, ч

Рис. 12. (А) Колонии нативного В. ритИнз 3-19 и рекомбинантных штаммов В. зиЬШи (ТМВ1246 и ТМВ1247), содержащих репликационные вектора с конструкциями УпаЦоеъщ+аргВр и Рш(оР вт+В*еВр соответственно, на молочном агаре с бацитрацином (30 мкг/мл) после 16 ч инкубирования. (В) Активность АргВр протеиназы нативного (3-19) и рекомбинантного (ТМВ1246 (Р/шдо аю>+аргВр)) штаммов. (С) Активность ОяеВр протеазы нативного (3-19) и рекомбинантного (ТМВ1247 (Ршсорйщ+^В^)) штаммов

Обозначения: нативный штамм (В. ритйш 3-19) показан в белом цвете. Рекомбинантные штаммы при добавлении бацитрацина - в черном цвете, без добавления индуктора - в сером цвете. Стрелочкой указано время добавления индуктора.

Итак, нами установлена протяженность промоторной области генов сериновых протеиназ В. pumilus\ показано, что её размер коррелирует с количеством включенных сайтов регуляции, которые активизируются в определенную фазу развития культуры. Доминирующая протеиназа имеет более сложную регуляторную область гена по сравнению с регуляторной областью гена минорного фермента. С помощью гибридных конструкции установлена ведущая роль факторов DegU и SpoOA в активации исследуемых генов. Впервые показано, что инактивация протеолитических генов В. pumilus приводит к изменению морфологии клеток, их способности метаболизировать экзогенные сахара, задержке споруляции и снижению экзогенного пула протеолитических ферментов. Для гетерологичной экспрессии генов сериновых протеиназ впервые сконструирована новая стресс-индуцибельная LIKE экспрессионная система, основными характеристиками которой являются: (1) строго регулируемый промотор P/,a/(0ptSD) неактивный в экспоненциальной фазе роста, а также в отсутствии стимула; (2) индукция промотора происходит в течение 20-60 мин и может достигать 1000-кратного уровня; (3) оптимизация SD региона, следующего за промотором Ры, позволяет повысить уровень рекомбинантного белка в составе LIKE системы в ~6 раз; (4) P/M/(0PtsD) промотор эффективен для

экспрессии как внутриклеточных, так и внеклеточных генов белков; (5) для активации промотора может быть использован широкий спектр индукторов. Разработанная система экспрессия позволила получить рекомбинантные сериновые протеиназы В. pumilus в ранней стационарной фазе в количестве пригодном для анализа.

ВЫВОДЫ

1. Установлена регуляторная область генов протеиназ Bacillus pumilus, необходимая для полноценной экспрессии: для гена субтилизиноподобной протеиназы (аргВр), оптимальный промотор составляет 445 п.о.; для гена глутамилэндопептидазы (gseBp) -150 п.о.

2. С помощью fusion-конструкций с репортёрным геном gfp показано, что факторы транскрипции DegU и SpoOA оказывают позитивное влияние на экспрессию генов протеиназ. Мутация по гену sigD повышает активность промотора гена gseBp в 1,5-2,5 раза и незначительно влияет на активность промотора аргВр протеиназы.

3. Инактивация генов протеолитических ферментов бацилл приводит к плейотропному эффекту: изменяется спектр внеклеточных гидролаз, частично морфология и биохимические характеристики.

4. Сконструирована новая ЬПСЕ-система экспрессии на основе антибиотико-индуцибельного промотора LiaRS двухкомпонентной системы Bacillus subtilis.

5. Новая LIKE экспрессионная система эффективна в отношении экспрессии генов внутриклеточного белка GFP и внеклеточных сериновых протеиназ.

Публикации по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Toymentseva A.A. The LIKE system, a novel protein expression toolbox for Bacillus subtilis based on the lial promoter / A.A. Toymentseva, K. Schrecke, M.R. Sharipova, T. Mascher // Microbial Cell Factories. -2012. -V.ll. -No.l. -P.143. (перечень ВАК), автора - 0,84 пл.

2. Шарипова М.Р. Новое филогенетическое положение штамма Bacillus intermedins 3-19 / М.Р. Шарипова, A.A. Тойменцева, А.Р. Сабирова, А.Д. Мухаметзянова, А.И. Ахметова, A.M. Марданова, Н.П. Балабан // Микробиология. -2011. -Т. 80. -№ 3. -С. 424-426. (перечень ВАК) автора - 0,05 пл.

3. Тойменцева A.A. Bacillus intermedins с нокаутированным геном субтилизиноподобной протеиназы / A.A. Тойменцева, М.Р. Каримова, A.A. Ризванов, Е.И. Шагимарданова, М.Р. Шарапова // Учен. Зап. Казан, ун-та. Сер. Естеств. науки. -2010. -Т. 152, кн. 4. -С. 143-155. (перечень ВАК), автора - 0,5 пл.

4. Тойменцева A.A. Влияние делений в промоторе на экспрессию гена глутамилэндопептидазы Bacillus intermedins / A.A. Тойменцева, Е.И. Шагимарданова, А.Р. Каюмов, М.Р. Шарипова // Учен. зап. Казан, ун-та. Сер. Естеств. науки. -2010.-Т. 152. кн. 3. -С. 149-158. (перечень ВАК), автора-0,5 пл.

5. Черёмин A.M. Выделение регуляторных белков, активирующихся в условиях ограниченного роста бацилл / A.M. Черёмин, A.A. Тойменцева, А.Р. Сабирова, А.Р. Каюмов, А.Б. Маргулис, М.Р. Шарипова // Учен. зап. Казан, унта. Сер. Естеств. науки. -2010. -Т. 152. кн. 4. -С. 156-168. (перечень ВАК), автора — 0,27 пл.

Другие публикации по теме диссертации:

6. Нямсурэн Ч. Модификация бактериальной системы экспрессии на основе подбора сигнального пептида / Ч. Нямсурэн, A.A. Тойменцева И Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «ЛОМОНОСОВ-2012». - Москва, 2012. -С.161.

7. Тойменцева A.A. Регуляция экспрессии генов протеаз Bacillus pumilus на основе репортёрной конструкции / A.A. Тойменцева, М.Р. Шарипова // XI Научная конференция молодых учёных, аспирантов и студентов научно-образоватльного центра Казанского (Приволжского) федерального университета «Материалы и технологии XXI века» - Казань, -2012. -С.67.

8. Нямсурэн Ч. Конструирование системы экспрессии для В. subtilis на основе //я-промотора / Ч. Нямсурэн, A.A. Тойменцева, М.Р. Шарипова // XI Научная конференция молодых учёных, аспирантов и студентов научно-образоватльного центра Казанского (Приволжского) федерального университета «Материалы и технологии XXI века». -Казань, 2012. -С.51.

9. Нямсурэн Ч. Экспрессия fusion-конструкции на основе гена бетта-галактозидазы под промотором гена глутамилэндопептидазы Bacillus pumilus / Ч. Нямсурэн, A.A. Тойменцева, М.Р. Шарипова И Итоговая научно-образовательная конференция студентов Казанского (Приволжского) федерального университета. -Казань, 2011. -С.15-16.

10. Гончарова A.B. Экспрессия fusion-конструкции под контролем промотера гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus pumilus 3-19 в регуляторных мутантах / A.B. Гончарова, О.Н. Игонина, A.A. Тойменцева, М.Р. Шарипова // Итоговая научно-образовательная конференция студентов Казанского (Приволжского) федерального университета. -Казань, 2011. -С.6-7.

11. Nyamsuren С. Study of the Impact of Major Transcription Factors on Gene Expression of Serine Proteases from Bacillus pumilus 3-19 by Using Fusion-Design / C. Nyamsuren, O. Igonina, A. Goncharova, A. Toymentseva, M. Sharipova // Students, Masters and PhD Students Ш Annual International Scientific Conference in Biology. Ivane Javakhishvili Tbilisi State University. -Tbilisi, Georgia, 2011. -P.69-70.

12. Тойменцева A.A. Влияние факторов транскрипции на экспрессию генов сериновых протеаз Bacillus pumilus 3-19 / Ч. Нямсурэн, О.Н. Игонина, A.B. Гончарова, A.A. Тойменцева, Е.И. Шагимарданова, М.Р. Шарипова // X Научная конференция молодых учёных, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского (Приволжского) федерального университета. Казань, 2011. -С.77.

13. Тойменцева A.A. Филогенетическое положение штамма Bacillus intermedia 3-19 / A.A. Тойменцева, А.Д. Мухаметзянова, А.И. Ахметова, М.Р.

Шарипова // Сборник тезисов Российской школы для молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии». Казань, 2010.-С.59.

14. Toymentseva А.А. The Expression of aprBi and gseBi genes under Control of different DNA-binding Proteins in Bacillus intermedins / A. Toymentseva, M. Sharipova, T. Mascher // "3rd Joint Conference of the German Society for Hygiene and Microbiology (DGHM) and the Association for General and Applied Microbiology (VAAM)". -Hannover, Germany, 2009. -P.121.

15. Cheryomin A.M. The purification of Bacillus subtilis DegU and SpoOA regulatory proteins from cells lysate of the Escherichia coli / AM. Cheryomin, A.R. Kayumov, A.A. Toymentseva, N. Pina, M.R. Sharipova // Materials of IV Russian symposium called "Protein and Peptides". -Kazan, 2009. -P.310.

16. Cheryomin A.M. The purification of Bacillus subtilis DegU and SpoOA regulatory proteins from the Escherichia coli recombinant strains / A.M. Cheryomin, A.R. Kayumov, A.A. Toymentseva, N. Pina, M.R. Sharipova // 14th international conference "Microbial enzymes in biotechnology and medicine". -Kazan, 2009. -P.72.

17. Cheryomin A.M. The purification of Bacillus subtilis DegU and SpoOA regulatory proteins from the Escherichia coli recombinant strains / A.M. Cheryomin, A.R. Kayumov, A.A. Toymentseva, N. Pina, M.R. Sharipova // XIV international conference "Microbial enzymes in biotechnology and medicine" devoted to the 20th anniversary of partnership between Kazan State University and Justus-Liebig Giessen University. -Kazan, 2009. -P.12.

18. Toymentseva A.A. Inactivation of serine proteinase genes from Bacillus intermedins / A.A. Toymentseva, A.A. Akhmetova, M.R. Karimova, A.R. Kayumov, A.A. Rizvanov, M.R. Sharipova // XIV international conference "Microbial enzymes in biotechnology and medicine" devoted to the 20th anniversaiy of partnership between Kazan State University and Justus-Liebig Giessen University. -Kazan, 2009. -P.65.

19. Sharipova M.R. The role of microbial proteinases in stress response of Grampositive bacteria: from signaling to regulatory networks / M.R. Sharipova, A.A. Toymentseva, A.R. Kayumov, A.A. Rizvanov, E.I. Shagimardanova // XIV international conference "Microbial enzymes in biotechnology and medicine" devoted to the 20th anniversary of partnership between Kazan State University and Justus-Liebig Giessen University. -Kazan, 2009. -P.58.

20. Toymentseva A.A. Genetic modification of Bacillus intermedins glutamyl endopeptidase gene promoter / A.I. Akhmetova, A.A. Toymentseva, A.R. Kayumov, M.R. Sharipova // XIV international conference "microbial enzymes in biotechnology and medicine" devoted to the 20th anniversary of partnership between Kazan State University and Justus-Liebig Giessen University. -Kazan, 2009. -P. 18.

21. Sharipova M.R. Characteristic of functional regulation activity and proteases* genes expression in stress conditions of bacillus / M.R. Sharipova, A. A. Toymentseva, A.R. Kayumov, A.R. Sabirova, N.L. Rudakova, N.P. Balaban // Materials of IV Russian symposium called "Protein and Peptides". -Kazan, 2009. -P.96.

22. Akhmetova A.I. Identification promoter area of gseBi required for potential expression of this enzyme / A.I. Akhmetova, A.A. Toymentseva, A.R. Kayumov,

M.R. Sharipova // Materials of IV Russian symposium called "Protein and Peptides". -Kazan, 2009. -P.329.

23. Karimova M.R. Construction genes of glutamyl endopeptidase Bacillus intermedius with deletion in the regulation of area and analysis their expression in Bacillus subtilis cells / M.R. Karimova, A.A. Toymentseva // Materials of XLVI international scientific conference of students "Scientific-and-technological advance". -Novosibirsk, 2008. -P.38-39.

24. Тойменцева A.A. Экспрессия гена глутамилзндопептидазы Bacillus intermedius, модифицированного в области промотора в клетках Bacillus subtilis / A.A. Тойменцева, М.Р. Каримова, М.Р. Шарипова // XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «ЛОМОНОСОВ-2008». -Москва, 2008.

25. Toymentseva A.A. Specificity of an expression of the modified genes Bacillus intermedius in Bacillus subtilis cells / A.A. Toymentseva, M.R. Karimova, МЛ. Sharipova // International scientific and technical conference "SCIENCE AND EDUCATION-2008". -Murmansk, 2008. -P.5 85-586.

26. Тойменцева A.A. Экспрессия гена глутамилзндопептидазы Bacillus intermedius модифицированного в области промотора в клетках Bacillus subtilis / A.A. Тойменцева, М.Р. Каримова, Е.И. Шагимарданова, М.Р. Шарипова // Материалы докладов XIV международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» Международный молодёжный научный форум «Ломоносов -2007». -Москва, 2007. -С.45.

27. Шагимарданова Е.И. Получение гена глутамилзндопептидазы Bacillus intermedius с модифицированной областью регуляции и изучение его экспрессии в клетках Bacillus subtilis / Е.И. Шагимарданова, А.А. Тойменцева, М.Р. Каримова, М.Р. Шарипова // Тезисы докладов и стендовых сообщений VI симпозиума «Химия портеолитических ферментов». —Москва, 2007.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. профессору М.Р. Шариповой за внимательное отношение к работе и обсуждение полученных результатов; к.б.н., доц. A.M. Мардановой и к.б.н., с.н.с. Н.П. Балабан за постоянные консультации и обсуждение результатов; профессору Т. Masher за сотрудничество по созданию новой антибиотико-индуцибельной системы и предоставление для работы лабораторных штаммов и плазмид, а также за возможность проведения части экспериментов в лаборатории Мюнхенского университета Людвига-Максимилиана (LMU, Германия). Автор выражает искреннюю благодарность заведующей кафедрой микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета, профессору О.Н. Ильинской и сотрудникам кафедры микробиологии за помощь и доброжелательную рабочую атмосферу.

Отзывы на автореферат просим высылать по адресу: Казань, 420008, ул. Кремлевская, 18, Казанский университет, отдел аттестации, Ученому секретарю Диссертационного совета Д 212.081.08 Абрамовой Зинаиде Ивановне и по факсу: (843) 238-76-01

п і \

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 12.11.2012 г. Печ.л.1,5 Заказ М К-7209. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать -ризография.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тойменцева, Анна Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Протеолитические ферменты бацилл

1.1. Субтилазы

1.2. Глутамилэндопептидазы бактерий

1.3. Сериновые протеазы В. pumilus 3

2. Адаптационные процессы в бациллах

2.1. Регуляторная сеть бацилл

3. «Нокаутирование» генетического материала

4. Генно-инженерная биотехнология бактерий

Введение Диссертация по биологии, на тему "Расшифровка механизмов регуляции генов сериновых протеиназ бацилл"

Актуальность проблемы. Секретируемые белки составляют до 50% от общего количества белковых компонентов клеток бацилл. Многие из них участвуют в гидролизе природных полипептидов и синтезируются в ответ на изменения в окружающей среде. Среди них особое внимание привлекают протеиназы. Эти ферменты вовлечены в важнейшие физиологические процессы клетки, например, участвуют в катаболизме субстратов, споруляции, расщеплении и круговороте белков. Бактериальные протеиназы широко используются в пищевой промышленности, для производства моющих средств и имеют большой потенциал применения в качестве фармакологических препаратов, например, для лечения расстройств пищеварения или болезней сердечнососудистой системы [Gupta et al., 2002]. Как правило, в качестве продуцентов протеиназ используются различные штаммы бацилл. Однако, наличие комплекса внеклеточных протеиназ у бацилл создает большую проблему в генной инженерии и биотехнологии, поскольку снижает накопление гетерологичных белков в культуральной жидкости продуцентов [Westers et al., 2004]. Решение этой проблемы требует создания новых штаммов-продуцентов и экспрессионных систем, основанных на индуцибельных бациллярных промоторах.

Одной из наиболее интересных групп протеолитических ферментов является класс сериновых протеиназ. Они обнаружены у прионов, бактерий, вирусов, простейших и высших эуе67кариот [Rawlings et al., 2012]. Сериновые протеиназы эукариот участвуют во многих процессах, в том числе, в эмбриогенезе и развитии патологических состояний. В связи с этим, исследование прокариотических аналогов этих ферментов является удобной моделью при разработке новых лекарственных средств для борьбы с заболеваниями человека. Расшифровка механизмов регуляции генов прокариотических сериновых протеиназ может стать основой для новой стратегии получения гетерологичных белков и создания высокоэффективных систем их экспрессии, что является актуальным направлением современной молекулярной биотехнологии.

Основные задачи исследования:

1. Определить длину регуляторной области генов субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы Bacillus pumilus;

3. Установить роль протеиназ в физиологии бацилл путём инактивации генов сериновых протеиназ;

4. Разработать систему экспрессии для получения гетерологичных белков на основе антибиотико-индуцибельного промотора двухкомпонентной системы LiaRS Bacillus subtilis;

Научная новизна. Все результаты, изложенные в диссертационной работе, получены впервые.

1. Впервые изучена зависимость экспрессии генов сериновых протеиназ от длины промоторного региона генов на основе репортёрных fusion-конструкций (Раргвр-gfp, РgseBp-gfp)• Установлены области регуляции генов протеиназ В. pumilus, свидетельствующие, что длина промотора обусловлена вкладом фермента в физиологию бацилл.

3. Разработана новая эффективная система экспрессии генов на основе lial промотора В. subtilis, который регулируется двухкомпонентной антибиотико-индуцибельной системой LiaRS (LIKE система - от нем. Lla-Kontrollierte Expression). При клонировании рекомбинантных генов в состав LIKE-системы показано, что в течение 30-60 мин после индукции экспрессия рекомбинантных внутриклеточных генов возрастает в 100-1000 раз. Делеция на хромосоме отдельных элементов lialH- оперона приводит к дополнительному увеличению экспрессии генов. Показано, что эффективная продукция внеклеточных ферментов в составе LIKE системы происходит в течение 4-5 часов после добавления индуктора.

Практическая значимость результатов. Данные о структуре промоторов и контроле экспрессии генов сериновых протеиназ (аргВр, gseBp) В. pumilus 3-19 необходимы при клонировании генов под собственными промоторами, а также могут быть использованы при конструировании новых систем экспрессии на основе модификации промоторов.

Положения, выносимые на защиту: 1. Гены гидролаз бацилл имеют различную длину промоторов, которая определяется их функцией в физиологии бактерий.

3. Новая антибиотико-индуцибельная система экспрессии на основе промотора Рuai В. subtilis эффективна для продукции гетерологичных белков, включая протеиназы бацилл.

Связь работы с научными программами. Работа выполнена в соответствии с планом НИР Казанского (Приволжского) федерального университета (№ гос. регистрации 01:02.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования выполнены при поддержке грантов РФФИ № 09-04-99044-рофи, Германской службы академических обменов DAAD 2009-2011 гг.: № А/08/75088, № А/09/84065, Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» 2009-2013 гг.: ГК № П344, ГК № П406, ГК № П323, ГК № 815, ГК № 1053, ГК № 16.740.11.0741.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на IV Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Казань, РФ, 2009), XIV Международной конференции "Ферменты микроорганизмов в биологии и медицине" посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха (Казань, РФ, 2009), Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии», (Казань, РФ, 2009), 3-й совместной конференции Немецкого общества гигиены и микробиологии (DGHM) и Ассоциации по общей и прикладной микробиологии (VAAM) (Ганновер, Германия, 2009), X Научной конференции молодых учёных, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского (Приволжского) федерального университета (Казань, РФ, 2011), III Ежегодной Международной научно-практической конференции по биологии студентов, магистрантов и аспирантов Тбилисского государственного университета им. Иванэ Джавахишвили (Тбилиси, Грузия, 2011), Итоговой научно-образовательной конференции студентов Казанского (Приволжского) федерального университета (Казань, РФ, 2011), XIX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «ЛОМОНОСОВ-2012», МГУ,

Москва, РФ, 2012), XI Научная конференция молодых учёных, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского (Приволжского) федерального университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, РФ, 2012).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Тойменцева, Анна Александровна

выводы

1. Установлена регуляторная область генов протеиназ Bacillus pumilus, необходимая для полноценной экспрессии: для гена субтилизиноподобной

•u.U. протеиназы (аргВр) оптимальный промотор составляет1445 п.о.; для гена глутамилэндопептидазы (gseBp) - 150 п.о.

4. Сконструирована новая LIKE-система экспрессии на основе антибиотико-индуцибельного промотора LiaRS двухкомпонентной системы Bacillus subtilis.

5. Заключение

Уникальные свойства бациллярных сериновых протеаз позволяют их использование в различных областях, включая медицину и фармокологию. Для эффективного внедрения этих ферментов в практику требуются знания о структуре, свойствах, функциях ферментов и регуляции экспрессии их генов. Так, продуцируемые бактериями В. pumilus 3-19 сериновые протеазы -субтилизиноподобная и глутамилэндопептидаза, перспективны для медицины вследствие их высокой активности по гидролизу тромбообразований (фибринолитическая, антикоагулянтная активности). Несмотря на продолжительные исследования этих белков до сих пор остаётся открытым вопрос о конкретной физиологической роли данных ферментов в клетках бацилл. Кроме того, хотя выявлены основные регуляторные механизмы, участвующие в активации протеаз в клетке (транскрипционные о Г . ■у ? ■ факторы - DegU, 8роОА, АЬгВ, ЭсоС, БпЛ и др.), не доказано их прямое взаимодействие с промоторами генов аргВр и gseBp. Анализ работ с описанием получения аналогичных продуцентов позволяет сделать несколько обобщающих выводов: знания о механизмах регуляции позволяют исключить нежелательную репрессию интересуемых генов; информация о физиологической функции ферментов в клетке необходима при создании штаммов-суперпродуцентов, поскольку высокая концентрация фермента может быть токсичной для клетки; эффективной стратегией для получения рекомбинантных белков является применение индивидуальных экспрессионных систем, имеющих специальные элементы - сильные промоторы, активаторы, полилинкеры и т.п. В связи с этим, в настоящей работе были сформулированы следующие задачи: расшифровать регуляторные механизмы генов сериновых протеиназ на основе изучения протяженности промоторов и создания йшоп-конструкций. А также получить новую эффективную систему экспрессии генов на основе знаний о механизмах регуляции и апробировать её на моделях протеаз бацилл.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Штаммы бактерий, плазмидные вектора и условия культивирования г

В работе использовали штаммы и плазмиды из > музея лаборатории Биосинтеза и Биоинженерии Ферментов КФУ: стрептомицинустойчивый штамм В. pumilus 3-19, протеазо-дефицитный штамм В. subtilis BG2036 (предоставлен проф. Eugenio Ferrarri, Genencor Int. Inc., USA), штамм В. subtilis W168 (trpC2), вектора pSC9 и pCB22 (для синтеза гена erm), p58.21, pUC19, pGEM-T Easy (для создания нокаутированных по генам сериновых протеиназ штаммов). Использовали штаммы и плазмиды, любезно предоставленные научной группы Dr. Prof. Т. Mascher (Мюнхенский университет Людвига-Максимилиана, г. Мюнхен, Германия): В. subtilis W168 sinRv.spec (ТМВ079), В. subtilis W168 scoCv.tet (ТМВ081), В. subtilis W168 abrBv.kan (TMB082), В. subtilis W168 degUv.kan (TMB124), В. subtilis W168 spoOA:\tet (TMB205), B. subtilis W168 sigDwspec (TMB225), B. subtilis W168 amyEv. pSJ5101 (Phargfp) (TMB408), B. subtilis WT168 APharliaIH clean deletion (TMB604), E. coli DH5a (recA 1 endAX gyrA96 thi hsdRllfamK+) relA 1 supE44 c|>80A/acZAM15 A(lacZYA-argF)U169), вектора - pDG1662, pGP380, pSG1151 (для синтеза гена gfpmutl), pMAD (для создания штаммов не содержащих гены На оперона - clean delition), pGFPатуЕ (для изучения регуляторных участков генов сериновых протеаз). Полученные рекомбинантные штаммы и плазмиды перечислены в таблице 1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тойменцева, Анна Александровна, Казань

1. Большой практикум по микробиологии / Под ред. проф. Г.Л. Селибера. М.: Высшая школа, 1962.

2. AI 587156 SU С12К1/00, C12D13/10. Штамм бактерий продуцент щелочной внеклеточной рибонуклеазы / И.Б. Лещинская, P.A. Сайманова, Р.Ш. Булгакова, М.Н. Карпанова, H.A. Голубенко // Опубликовано: 05.01.1978. Заявка: 2389167 от 01.08.1976.

3. Ицкович ЕЛ. Биосинтез щелочной внеклеточной протеиназы В.intermedius 3-19 Текст. / Е.Л. Ицкович, Л.В. Знаменская, Н.П. Балабан, Т. А. Ершова, И. Б. Лещинская // Микробиология. 1995. - Т. 64. - №5. - С. 623-629.

4. Ицкович Е.Л. Тромболитические и антикоагулянтные свойства тиолзависимой сериновой протеиназы Bacillus intermedius 3-19 Текст. / Е.Л.

5. Люблинская Л.А. Р-нитроанилиды пироглутамилпептидов -хромогенных субстратов сериновых протеаз Text. / Л. А. Люблинская, Т.Л. Воюшина, В.М. Степанов // Биоорганическая химия. 1987. - Т. 13. - №. 6. -С. 748-753.

6. Мильготина Е.И. Глутамилэндопептидазы. Страктура, функции, практическое использование Текст. / Е.И. Мильготина, Т.Л. Воюшина, Г.Г. Честухина // Биоорганическая химия. 2003. - Т. 29. - №. 6. - С. 563-576.

7. Михайлова Е.О. Выделение и характеристика субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом

8. Bacillus subtilis AJ 73 на разных фазах роста бацилл Текст. / Е.О. Михайлова, А.М. Марданова, Н.П. Балабан, Г.Н. Руденская, М.Р. Шарипова // -Биохимия. -2007. -Т. 72. -№.2. -С. 228-236.

9. Мосолова О.В. Glu, Asp-специфичная протеиназа актиномицетов Текст. / О. В. Мосолова, Г. Н. Руденская, В. М. Степанов, О. М. Ходова, И. А. Цаплина // Биохимия. 1987. - Т.52. - №3. - С. 414 - 422.

10. Руденская Г.Н. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ Текст. / Г.Н. Руденская // Биоорганическая химия. - 1998. - Т. 24. - №. 4. - С. 256-261.

11. Шарипова М.Р. Влияние источников углерода и мононуклеотидов на продукцию внеклеточной щелочной фосфатазы Bacillus intermedius Текст. / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, Н.В. Нехотяева, И.Б. Лещинская // Микробиология. 2000. - Т. 69. -№. 10. - С. 191-.196.

12. Шарипова М.Р. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedius Текст. / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, J1.A. Габдрахманова, М.А. Шилова, Ю.М. Кадырова, Т.Н. Руденская, И.Б. Лещинская //Микробиология. 2002. - Т. 71. - №. 4. - С. 494-499.

13. Шарипова М.Р. Продукция внеклеточной щелочной фосфатазы антибиотикоустойчивыми штаммами Bacillus intermedius Текст. / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, И.Б. Лещинская // Микробиология. 1994. -Т. 63. -Вып. 1. - С. 52-58.

14. Abe S. Regulation of Bacillus subtilis aprE expression by glnA through inhibition of scoC and sigma(D)-dependent degR expression Text. / S. Abe. A Yasumura, T. Tanaka // J. Bacteriol. 2009. - V. 191. - No. 9. - P. 3050-3058.

15. Anagnostopolous C. Requirements for transformation in Bacillus subtilis Text. / C. Anagnostopolous, J. Spizizen [Text] // Journal of Bacteriology. 1961. -V. 81.-P. 741-746.

16. Aoyama M. Soybean-milk-coagulating activity of Bacillus pumilus derives from a serine proteinase Text. / M. Aoyama, M. Yasuda, K. Nakaci, N. Kobamoto, H. Oku, F. Kato // Applied Microbial. Biotechnology. 2000. - V. 53. -No. 4.-P. 390-395.

17. Arnaud M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, gram-positive bacteria Text. / M. Arnaud, A. Chastanet, M. Débarbouillé // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. - No. 11. -P. 6887-6891.

18. Barrett A.J. Handbook of Proteolytic Enzymes. New York: Academic Press, 1998.

19. Belitsky B.R. Contributions of multiple binding sites and effector-independent binding to CodY-mediated regulation in Bacillus subtilis Text. J. B.R. Belitsky, A.L. Sonenshein // J. Bacterid. 2011. - V. 193. - No. 2. - P. 473-484.

20. Bierbaum G. Analysis of nucleotide pools during protease production with Bacillus licheniformis Text. / G. Bierbaum, U.E. Giesecke, C. Wandrey // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991. - V.35. -P. 725-730.

21. Bisicchia P. Suite of novel vectors for ectopic insertion of GFP, CFP and IYFP transcriptional fusions in single copy at the amyE and bglS loci in Bacillus subtilis Text. / P. Bisicchia, E. Botella, K.M. Devine // Plasmid. 2010. - V. 64. -P. 143-149.

22. Biswas I. High-efficiency gene inactivation and replacement system for grampositive bacteria Text. / I. Biswas, A. Gruss, S.D. Ehrlich, E. Maguin // J. Bacteriol. 1993. - V. 175.-No. 11.-P. 3628-3635.

23. Bongers R.S Development and characterization of a subtilin-regulated expression system in B. subtilis: strict control of gene expression by addition of subtilin Text. / R.S. Bongers, J.W. Veening, M. Van Wieringen, O.P. Kuipers, M.

24. Kleerebezem // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71. - No. 12. - P. 88188824.

25. Borgmeier C. Genetic analysis of the Bacillus licheniformis degSU operon and the impact of regulatory mutations on protease production Text. / C. Borgmeier, J. Bongaerts, F. Meinhardt // J. Biotechnol. -2012. -V.159. -P. 12-20.

26. Botella E. pBaSysBioII: an integrative plasmid generating gfp transcriptional fusions for high-throughput analysis of gene expression in Bacillus subtilis Text. /

27. E. Botella, M. Fogg, M. Jules, S. Piersma, G. Doherty, A. Hansen, E.L. Denham, L. Le Chat, P. Veiga, K. Bailey, P.J. Lewis, J.M. van Dijl, S. Aymerich, A.J. Wilkinson, K.M. Devine // Microbiology. 2010. -V. 156. - No. Pt 6. - P. 16001608.

28. Chai Y. Bistability and biofilm formation in Bacillus subtilis Text. / Y. Chai,

29. F. Chu, R. Kolter, R. Losick // Mol. Microbiol. 2008. - V. 67. - No. 2. - P. 254263.

30. Charney J. A colorimetric method for the determination of the proteolytic activity of duodenal juice Текст. / J. Charney, R.M. Tomarelli // J. Biochem. -1947.-V. 177.-P. 501-505.

31. Chastanet A. Just-in-time control of SpoOA synthesis in Bacillus subtilis by multiple regulatory mechanisms Text. / A. Chastanet, R. Losick // J. Bacterid.2011. V. 193. - No. 22. - P. 6366-6374.

32. Connelly M.B. Extracellular proteolytic activity plays a central role in swarming motility in Bacillus subtilis Text. / M.B. Connelly, G.M. Young, A. Stoma//J. Bacterid. 2004. - V. 186.-No. 13. - P. 4159-4167.

33. Cormack B.P. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP) Text. / B.P. Cormack, R.H. Valdivia, S. Falkow // Gene. 1996. - V. 173. -P. 33-38.

34. Dahech I. Partial purification of a Bacillus licheniformis levansucrase producing levan with antitumor activity Text. / I. Dahech, K.S. Belghith, H. Belghith, H. Mejdoub // Int. J. Biol. Macromol. -2012. -V.51. -No.3. -P.329-335.

35. Dixit M. Epr is transcribed from a final sigma(D) promoter and is involved in swarming of Bacillus subtilis Text. / M. Dixit, C.S. Murudkar, K.K. Rao // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - No. 2. -P. 596-599.

36. Drapeau G.R. Cleavage at glutamic acid with staphylococcal protease Text. / G.R. Drapeau // Methods Enzymol. 1977. - V.47. - P. 189-191.

37. Errington J. Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expression and control of morphogenesis Text. / J. Errington // Microbiol. Rev. 1993. - V. 57. -No. l.-P. 1-33.

38. Ferrari E. Trascription of Bacillus subtilis subtilisin and expression of subtilisin in sporulation mutants Text. / E. Ferrari, D.J. Henner, M. Perego, J.A. Hoch // J. Bacteriolog. 1988. - V. 170. - P. 289-295.

39. Fleming A.B. Extracellular enzyme synthesis in a sporulation-deficient strain of Bacillus licheniformis Text. / A.B. Fleming, M. Tangney, P.L. Jorgensen, B. Diderichsen, F.G. Priest // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - No. 11.-P. 3775-3780.,

40. Fujita M. Evidence that entry into sporulation in Bacillus subtilis is governed by a gradual increase in the level and activity of the master regulator SpoOA Text. / M. Fujita, R. Losick // Genes Dev. 2005. - V. 19. - No. 18. - P. 2236-2244.

41. Fujita M. The master regulator for entry into sporulation in Bacillus subtilis becomes a cell-specific transcription factor after asymmetric division Text. / M. Fujita, R. Losick // Genes Dev. 2003. - V. 17. - No. 9. - P. 1166-1174.

42. Geissendorfer M. Regulated expression of heterologous genes in B. subtilis using the TnlO encoded tet regulatory elements Text. / M.Geissendórfer, W. Hillen / Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. - V. 33. - No. 6. - P. 657-663.

43. González-Pastor J.E. Cannibalism by sporulating bacteria Text. / J.E. González-Pastor, E.C. Hobbs, R. Losick [Text] / // Science. 2003. - V. 301. -No. 5632.-P. 510-513.

44. Guberman J.M. PSICIC: noise and asymmetry in bacterial division revealed by computational image analysis at sub-pixel resolution Text. / J.M. Guberman, A. Fay, J. Dworkin, N.S. Wingreen, Z. Gitai // PLoS Comput. Biol. 2008. - V. 4. -No. 11. ЄІ000233.

45. Gupta R. An overview on fermentation, downstream processing and properties of microbial alkaline proteases Text. / R. Gupta, Q.K. Beg, S. Khan, B. Chauhan // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 60. - No. 4. - P. 381-395.

46. Hambraeus G. A 5' stem-loop and ribosome binding but not translation are important for the stability of Bacillus subtilis aprE leader mRNA Text. / G. Hambraeus, K. Karhumaa, B. Rutberg // Microbiology. 2002. - V. 148. - Pt. 6. -P. 1795-1803.

47. Handke L.D. Interaction of Bacillus subtilis CodY with GTP Text. / L.D. Handke, R.P. Shivers, A.L. Sonenshein // J. Bacteriol. 2008. - V. 190. - No. 3. -P. 798-806.

48. Harwood C.R. Molecular Biological Methods for Bacillus / C.R. Harwood, S.M. Cutting // John Wiley & Sons, Chichester, 1990.

49. Heermann R. Stimulus perception and signaling in histidine kinases // Bacterial Signaling Text. / R. Heermann, K. Jung // Eds. Krämer R., Jung K. Wiley-VCH. 2009. - Chap. 8. - P. 135-161.

50. Ho K.M. Co-expression of a prophage system and a plasmid system in B. subtilis Text. / K.M. Ho, B.L. Lim // Protein Expr. Purif. 2003. -V. 32. - No. 2. -P. 293-301.

51. Houmard J,,// Eur. J. Biochem. 1967. - V. 68. - P. 621-628.=,,

52. Jan J. Characterization of the 5' subtilisin (aprE) regulatory region from Bacillus subtilis Text. / J. Jan, F. Valle, F. Bolivar, E. Merino // FEMS Microbiol. Lett.-2000.-V. 183.-No. l.-P. 9-14.

53. Johnson B.T. Extracellular proteolytic activities expressed by Bacillus pumilus isolated from endodontic and periodontal lesions Text. / B.T. Johnson, L.N. Shaw, D.C. Nelson, J.A. Mayo // J. Med. Microbiol. 2008. -V. 57. - Pt. 5. -P. 643-651.

54. Jung K. Heermann R. Histidine kinases and response regulators in networks Text. / K. Jung, L. Fried, S. Behr // Curr. Opin. Microbiol. 2012. - V. 15. - No. 2.-P. 118-124.

55. Kallio P.T. The transition state regulator Hpr of Bacillus subtilis is a DNA-binding protein. Text. / P.T. Kallio, J.E. Fagelson, J.A. Hoch, M.A. Strauch // J. Biol. Chem. 1991; -V. 266.-P. 13411-13417.

56. Kawamura F, Doi RH. Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient in extracellular alkaline and neutral proteases Text. / F. Kawamura, R.H. Doi//J. Bacteriol.- 1984,-V. 160.-No. 1. P.442-444.

57. Kayumov A. Inactivation of the general transcription factor TnrA in Bacillus subtilis by proteolysis Text. / A. Kayumov, A. Heinrich, M. Sharipova, O. Iljinskaya, K. Forchhammer // Microbiology. 2008. - V.154. - No. Pt 8. - P. 2348-2355.

58. Kobayashi K. Gradual activation of the response regulator DegU controls serial expression of genes for flagellum formation and biofilm formation in Bacillus subtilis Text. / K. Kobayashi // Mol. Microbiol. 2007. - V. 66. - No. 2. - P. 395-409.

59. Kodgire P. A dual mode of regulation of flgM by ScoC in Bacillus subtilis Text. / P. Kodgire, K.K. Rao // Can J. Microbiol. 2009. - V. 55. - No. 8. - P. 983-989.

60. Kodgire P. ScoC and SinR negatively regulate epr by corepression in Bacillus subtilis Text. / P. Kodgire, M. Dixit, K.K. Rao // J. Bacterid. 2006. - V. 188. -No. 17.-P. 6425-6428.

61. Kumar C.G. Purification and characterization of a thermostable alkaline protease from alkalophilic Bacillus pumilus Text. / C.G. Kumar // Lett. Appl. Microbiol. 2002. - V. 34. -No. 1. - P. 13-17.

62. Kunst F. Salt stress is an enviromental signal affecting degradative enzyme synthesis in Bacillus subtilis Text. / F. Kunst, G. Rapoport. // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - No. 9. - P. 2403-2407.

63. Lee S.J. Development of a stationary phase-specific autoinducible expression system in B. subtilis Text. / S.J. Lee, J.G. Pan, S.H. Park, S.K Choi // J. Biotechnol. 2010. - V. 149. - No. 1-2. - P. 16-20.

64. Leighton T.J. The relationship of serine protease activity to RNA polymerase modification and sporulation in Bacillus subtilis Text. / T.J. Leighton, R.H. Doi, R.A.J. Warren, R.A. Kelln // J. Mol. Biol. 1973. - V. 76. - P. 103-122.

65. Levine J.H. Pulsed feedback defers cellular differentiation Text. / J.H. Levine, M.E. Fontes, J. Dworkin, M.B. Elowitz // PLoS Biol. 2012. - V. 10. -No. I.el001252.

66. Lopez D. Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis Text. / Lopez D., Fischbach M.A., Chu F., Losick R., Kolter R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2009. V. 106. - No. 1. P. 280-285.

67. Lopez D., Kolter R. Extracellular signals that define distinct and coexisting cell fates in Bacillus subtilis Text. / D. Lopez, R. Kolter // FEMS Microbiol. Rev. 2010. - V. 34. - No. 2. - P. 134-149.

68. Lu X. Limited proteolysis induces woodchuck hepatitis virus infectivity for human HepG2 cells Text. / X. Lu, T. Hazboun, T. Block // Virus Res. 2001. -V. 73.-No. l.-P. 27-40.

69. Lutz R. Independent and tight regulation of transcriptional units in E. coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/Il-I2 regulatory elements Text. / R. Lutz, H. Bujard // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - No. 6. - P. 1203-1210.

70. Ma J. Correlations between Shine-Dalgarno sequences and gene features such as predicted expression levels and operon structures Text. / J. Ma, A. Campbell, S.J. Karlin // Bacterid. 2002. - V. 184. - №. 20. - P. 5733-5745.

71. Maamar H. Noise in gene expression determines cell fate in Bacillus subtilis Text. / H. Maamar, A. Raj, D. Dubnau // Science. 2007. - V. 317. - No. 5837. -P. 526-529.

72. Mascher T. Cell wall stress responses in Bacillus subtilis: the regulatory network of the bacitracin stimulon Text. / T. Mascher, N.G. Margulis, T. Wang, R.W. Ye, J.D. Helmann // Mol. Microbiol. 2003. -V. 50. - P. 1591-1604.

73. Ming L.J. Structure and function of "metalloantibiotics" Text. / L.J. Ming // Med. Res. Rev. 2003. - V. 23. - No. 6. - P. 697-762.

74. Ming Y.M. Development of a B. subtilis expression system using the improved Pg/V promoter Text. / Y.M. Ming, Z.W. Wei, C.Y. Lin, G.Y. Sheng // Microb. Cell Fact. 2010. - V. 9. - No. 55. - P. 1-8.

75. Mirouze N. Spo0A~P imposes a temporal gate for the bimodal expression of competence in Bacillus subtilis Text. / N. Mirouze, Y. Desai, A. Raj, D. Dubnau // PLoS Genet. 2012. -V. 8. - No. 3. el002586.

76. Molle V. The SpoOA regulon of Bacillus subtilis Text. / V. Molle, M. Fujita, S.T. Jensen, P. Eichenberger, J.E. Gonzalez-Pastor, J.S. Liu, R. Losick // Mol. Microbiol. 2003a. - V. 50. - P. 1683-1701.

77. Molle V. The SpoOA regulon of Bacillus subtilis Text. / V. Molle, M. Fujita, S.T. Jensen, P. Eichenberger, J.E. González-Pastor, J.S. Liu, R. Losick // Mol. Microbiol. 2003. - V. 50. - No. 5. - P. 1683-1701.

78. Msadek T. When the going gets tough: survival strategies and environmental signaling networks in Bacillus subtilis Text. / T. Msadek // Trends Microbiol.1999. V. 7. - No. 5. - P. 201-207.

79. Pan S.H. Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3) Text. / S.H. Pan, Malcolm B.A. // Biotechniques.2000. V. 29. - No.6. - P. 1234-1238.

80. Pan X. The genetical effects of degUS gene in Bacillus subtilis Ki-2-132 Text. / X. Pan, Y. Zhang, M. Tang // Yi Chuan Xue Bao. 1997. - V. 24. - No. 3. -P. 282-288.

81. Rawlings N. D. Evolutionary families of peptidases Text. / N.D. Rawlings, A. J. Barrett // J. Biochem. 1993. - V. 290. - P. 205-218.

82. Rawlings N.D. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors Text. / N.D. Rawlings, A.J. Barrett, A. Bateman // Nucleic. Acids Res. 2012. -V. 40. - P. 343-350.

83. Reder A., Gerth U., Hecker M. Integration of gB activity into the decisionmaking process of sporulation initiation in Bacillus subtilis Text. / A. Reder, U. Gerth, M. Hecker // J. Bacteriol. 2012. - V.194. - No. 5. - P. 1065-1074.

84. Resnekov O. Changes in the stability of specific mRNA species in response to growth stage in Bacillus subtilis Text. / O. Resnekov, L. Rutberg, A. von Gabain //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990. - V. 87. - No. 21. - P. 8355-8359.

85. Rietkötter E. Bacitracin sensing in Bacillus subtilis Text. / E. Rietkötter, D. Hoyer, T. Mascher // Mol. Microbiol. 2008. - V. 68. - No. 3. - P. 768-785.

86. Sambrook J. Molecular Cloning a laboratory manual Text. / J. Sambrook, D.W. Russell // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold. - 2001.

87. Sánchez A. Bacillus subtilis transcriptional regulators interaction Text. / A. Sánchez, J. Olmos // Biotechnol. Lett. 2004. - V. 26. - No. 5. - P. 403-407.

88. Shoer R. Analysis of a Bacillus subtilis proteinase mutant Text. / Shoer R., H.P. Rappaport. // J. Bacteriol. 1972. - V. 109. - P. 575-583.

89. Siezen R.J. Evolution of prokaryotic subtilases: genome-wide analysis reveals novel subfamilies with different catalytic residues Text. / R.J. Siezen, B. Renckens, J. Boekhorst // Proteins. 2007. - V. 67. -No.3. - P.681-694.

90. Siezen R.J. Homology modeling and protein engeneering strategy of subtilases, the family of subtilisin-like serine proteinases Text. / R.J. Siezen, W.M. de Vos, J.A.M. Leunissen, B.W Dijkstra // Protein engineering. 1991. - V. 4.-P.719-737.

91. Siezen R.J. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like serine proteinases Text. / R.J. Siezen, A.M. Leunissen // Protein science. 1997. - V. 6. - P. 501523.

92. Sloma A. Gene encoding a minor extracellular protease in Bacillus subtilis Text. / A. Sloma, A. Ally, D. Ally, J. Pero // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - No. 12.-P. 5557-5563.

93. Smits W. K. Stripping Bacillus: ComK auto-stimulation is responsible for the bistable response in competence development Text. / W.K. Smits, C.C. Eschevins, K.A. Susanna, S. Bron, O.P. Kuipers, L.W. Hamoen // Mol. Microbiol. 2005. -V. 56.-P. 604-614.

94. Smits W.K. The transcriptional regulator Rok binds A+Trich DNA and is involved in repression of a mobile genetic element in Bacillus subtilis Text. / W.K. Smits, A.D. Grossman // PLoS Genet. 2010. - V.6. el001207.

95. Stahl M.L. Replacement of the Bacillus subtilis subtilisin structural gene with an In vitro-derived deletion mutation Text. / M.L. Stahl, E. Ferrari // J. Bacteriol. -1984.-V. 158.-No. 2. P. 411-418.

96. Steinmetz M. Induction of saccharolytic enzymes by sucrose in Bacillus subtilis: evidence for two partially interchangeable regulatory pathways Text. / M. Steinmetz, D. Le Coq, S. Aymerich // J. Bacteriol. -1989. -V.171. -N.3. -P. 15191523.

97. Stephenson K. Cellular lysis in Bacillus subtilis; the effect of multiple exrtacellular protease deficiencies Text. / K. Stephenson, S. Bron, C.R. Harwood // Lett. Appl. Microbiol. 1999. - V. 29. - P. 141-145.

98. Stewart B. The lonS gene regulates swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus Text. / B. Stewart, J.L. Enos-Berlage, L.L. McCharter // J. Bacteriol. 1997. - V. 179. -P. 107-114.

99. Stock A.M. Two-component signal transduction Text. / A.M. Stock, V.L. Robinson, P.N. Goudreau // Annu. Rev. Biochem. 2000. - V. 69. - P. 183-215.

100. Storm D.R. Complex formation between bacitracin peptides and isoprenyl pyrophosphates. The specificity of lipid-peptide interactions Text. / D.R. Storm, J.L. Strominger // J. Biol. Chem. V. 248. - No. 11. - P. 3940-3945.

101. Strauch M.A. Transition-state regulators and sentinels of -Bacillus subtilis post-exponential gene expression Text. / M.A. Strauch, J.A. Hoch. // 1993. Mol. Microbiol. -V.l.- P. 337-342.

102. Studier F.W. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes Text. / F.W. Studier, B.A. Moffatt // J. MoL Biol. 1986. -V.189. - No. l.-P. 113-130.

103. Subbian E. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone: intrinsically unstructured propeptide modulates stochastic activation of subtilisin Text. / E. Subbian, Y. Yabuta, U.P. Shinde // J. Mol. Biol. 2005. - V.347. - No. 2.-P. 367-383.

104. Suntharalingam P. The LiaFSR system regulates the cell envelope stress response in Streptococcus mutans Text. / P. Suntharalingam, M.D. Senadheera, R.W. Mair, C.M. Levesque, D.G. Cvitkovitch // J. Bacteriol. 2009. - V.191. -No. 9. - P. 2973-2984.

105. Svendsen I. Isolation and amino acid sequence of a glutamic acid specific endopeptidase from Bacillus licheniformis Text. /1. Svendsen, K. Breddam // Eur. J. Biochem. 1992.- V.204. - No. l.-P. 165-171.

106. Terpe K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems Text. / K. Terpe, // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. - V.72. - No. 2. - P. 211222.

107. Tsukahara K. Characterization of DegU-dependent expression of bpr in Bacillus subtilis Text. / K. Tsukahara, M. Ogura // FEMS Microbiol. Lett. -2008b.-V. 280.-No. l.-P. 8-13.

108. Tsukahara K. Promoter selectivity of the Bacillus subtilis response regulator DegU, a positive regulator of the flalche operon and sacB Text. / K. Tsukahara, M. Ogura // BMC Microbiol. 2008a. - V. 15. 8:8.

109. Uehara H. Thermosensitive, extracellular neutral proteases in Bacillus subtilis: isolation, characterization, and genetics. Text. / H. Uehara, K. Yamane, B. Maruo // J. Bacterid. 1979. -V. 139. -P. 583-590.

110. Urtz B.E. Purification and characterization of a novel extracellular protease from Beauveria bassiana Text. / B.E. Urtz, W.C. Rice // Mycol. Res. 2000. - V 104.-P. 180-186.

111. Utsumi R. Two-component Signal Transduction as Attractive Drug Targets in Pathogenic Bacteria Text. / Utsumi R., Igarashi M. // Yakugaku Zasshi. 2012. -V. 132.-No. l.-P. 51-58.

112. Valbuzzi A. A novel member of the subtilisin-like protease family from Bacillus subtilis Text. / A. Valbuzzi, E. Ferrari, A. M. Albertini // Microbiology. -1999.-V. 145.-P. 3121-3127.

113. Vavrova L. Comparison of different Bacillus subtilis expression systems Text. / L. Vavrova, K. Muchova, I. Barak // Res. Microbiol. 2010. - V. 161. -No. 9.-P. 791-797.

114. Veening J.W. Phosphatases modulate the bistable sporulation gene expression pattern in Bacillus subtilis Text. / J.W.Veening, L.W. Hamoen, O.P. Kuipers // Mol. Microbiol. 2005. - V. 56. - P. 1481-1494.

115. Vellanoweth R.L. The influence of ribosome-binding-site elements on translational efficiency in Bacillus subtilis and Escherichia coli in vivo Text. / R.L. Vellanoweth, J.C. Rabinowitz // Mol. Microbiol. 1992. -V. 6. - No. 9. -P. 1105-1114.

116. West J.T. Relative roles of the fla/che P(A), P(D-3), and P(sigD) promoters in regulating motility and sigD expression in Bacillus subtilis Text. / J.T. West, W. Estacio, L. Márquez-Magaña // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - No. 17. - P. 48414848.

117. Westers H. The CssRS two-component regulatory system controls a general secretion stress response in Bacillus subtilis Text. / H. Westers, L. Westers, E. Darmon, J.M. van Dijl, W.J. Quax, G. Zanen // FEBS J. 2006. - V. 273. - No. 16.-P. 3816-3827.

118. Westers L. Bacillus subtilis as cell factory for pharmaceutical proteins: a biotechnological approach to optimize the host organism Text. / L. Westers, H. Westers, W.J. Quax // Biochim. Biophys. Acta. 2004. -V. 1694. - No. 1-3. - P. 299-310.

119. Wiegert T. Alkaline shock induces the Bacillus subtilis ow regulon Text. / T. Wiegert, G. Homuth, S. Versteeg, W. Schumann // Mol. Microbiol. 2001. - V. 41.-P. 59-71.

120. Wolz C. The synthesis and function of the alarmone (p)ppGpp in firmicutes Text. / C. Wolz, T. Geiger, C. Goerke // Int. J. Med. Microbiol. 2010. -V. 300. No. 2-3.-P. 142-147.

121. Wray L.V.Jr. Bacillus subtilis glutamine synthetase controls gene expression through a protein-protein interaction with transcription factor TnrA Text. / L.V.Jr. Wray, J.M. Zalieckas, S.H. Fisher // Cell. 2001. - V. 107. - No. 4. - P. 427-435.

122. Wu C.M. Construction and characterization of nisin-controlled expression vectors for use in Lactobacillus reuteri Text. / C.M .Wu, C.F. Lin, Y.C. Chang, T.C. Chung // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006. - V. 70. - No. 4. - P. 757-767.

123. Yabuta Y. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone. A functional peptide chaperone designed using sequence databases Text. / Y. Yabuta, E. Subbian, C. Oiry, U. Shinde // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 15246-15251.

124. Yang M.Y. Cloning of the neutral protease gene of Bacillus subtilis and the use of the cloned gene to create an in vitro-derived deletion mutation Text. / M.Y. Yang, E. Ferrari, D.J. Henner//J. Bacterid.- 1984.-V. 160.-No. 1.- P. 15-21.

125. Штаммы Время, мин Max, ед. GFP

126. М/168 (без конструкции) 0

127. ТМВ408 168: не опт. 5Ь) индукция 0

128. ТМВ408 (IV 168; не опт. 50) + индукция 264

129. ТМВ1172 М/ 168 индукция 0

130. ТМВ1172. И/ 168 + индукция ■ ■■ ■ ■ «я 1440

131. ТМВ1174 ТМВ604 (ДР//а11а1Н) индукция 0

132. ТМВ11741 ТМВ604 (ДР//а11а1Н) + индукция ■ щр ■ 958

133. ТМВ1153 ТМВ1151 (Д11а1Н) индукция 0

134. ТМВ1153 ТМВ1151 (Д|1а1Н) ♦ индукция 1080

135. ТМВ1318. ТМВ1152 (ДИаШТегт) индукция 0

136. ТМВ13181 ТМВ1152 (Д||а1НТегт) + индукция 14161. Colour legend025 0.0375 0 05 0109375 016875 0 228125 0 2875 0 346875 0 40625 0 465625 0 525 0 534375064375 0.703125 0

137. Анализ активности Р/ю^бо) промотора на основе экспрессии гена £//? в составе рЫКЕ-Ш вектора в различных рекомбинантных штаммах В. яиЫШБ.юрЫКЕ-гер+^лш!/s

Информация о работе

Тойменцева, Анна Александровна
кандидата биологических наук
Казань, 2012
ВАК 03.02.03

Диссертация

Расшифровка механизмов регуляции генов сериновых протеиназ бацилл - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы