Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез, выделение и характеристика внеклеточной сериновой протеиназы Bacillus intermedius 3-19

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ицкович, Елена Лазаревна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Основные принципы классификации протеолитических ферментов; сериновые протеиназы микроорганизмов.

2. Секретируемые сериновые протеиназы микроорганизмов; физико-химические свойства и субстратная специфичность субтилизинов.

3.Тиолзависимые сериновые протеиназы микроорганизмов - особое подсемейство субтилизинов.

3.1. Отличительные признаки тиолзависимых протеиназ.

3.2. Характеристика тиолзависимых протеиназ, выделенных из различных источников.

4. Структура и строение активного центра субтилизинов.

4.1. Первичная, вторичная и третичная структуры субтилизинов.

4.2. Механизм действия и строение активного центра субтилизинов.

4.3. Источники стабильности субтилизинов.

5. Участие субтилизинов в синтезе пептидных связей.

5.1. Возможности пептидных синтезов в присутствии субтилизинов.

5.2. Использование сложных эфиров в пептидных синтезах с помощью субтилизинов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Оптимизация состава питательной среды и условий культивирования для получения максимальной продукции протеиназы.

1.1. Влияние неорганического фосфата и источников углерода на биосинтез протеиназы В.ШегтесИш.

1.2. Оптимизация состава среды для получения протеиназы.

1.3. Влияние аминокислот и субстратов протеиназы на биосинтез фермента.

1.4. Изучение динамики роста культуры, биосинтеза протеиназы и спорообразования В.ШетесИш 3-19.

2. Выделение и очистка протеиназы ВяШегтесИш 3-19.

2.1. Выбор оптимальных условий очистки фермента.

2.2. Получение гомогенного препарата протеиназы из культураль-ной жидкости В.тТегтесИт 3-19.

3. Характеристика протеиназы.

3.1. Спектральная характеристика, молекулярная масса, изоэлектри-ческая точка и кинетические параметр протеиназы.

3.2. Оптимум рН-действия фермента.Температурный оптимум и термостабильность протеиназы.

3.3. Влияние ионов Са на термостабильность фермента;действие ионов двухвалентных металлов на протеолитическую активность.

3.4. Субстратная специфичность протеиназы В. МегтесИж 3-19.

3.5. Влияние ингибиторов и денатурирующих агентов на протеолитическую активность.

3.6. Действие органических растворителей на активность протеиназы.

3.7. Участие протеиназы В.МегтеШт 3-19 в ферментативном синтезе пептидной связи.

3.8. Аминокислотный состав и 14-концевая последовательность протеиназы

В. IШегтесИш 3-19.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтез, выделение и характеристика внеклеточной сериновой протеиназы Bacillus intermedius 3-19"

Актуальность проблемы

За последние годы значительно расширились знания о свойствах и механизме действия протеолитических ферментов, а также о функциях протеолиза у животных, растений и микроорганизмов. Установлено, что протеолиз не только играет ключевую роль в белковом обмене живых организмов,но и принимает активное участие в формировании и распаде биологически активных белков и пептидов - ферментов, гормонов, токсинов, нейропептидов и т.д. Особое значение приобретает изучение протеолитических ферментов микроорганизмов.Поиск и изучение новых ферментов с ранее неизвестными свойствами из различных источников важны в теоретическом аспекте, позволяют определить функционально важные элементы их структуры, а также способствуют развитию эволюционных представлений. С другой стороны, благодаря большому разнообразию свойств и возможности их получения в значительных количествах, протеолитические ферменты микроорганизмов нашли широкое применение в научных исследованиях, в народном хозяйстве, в производстве моющих и лекарственных средств, кожевенной и пищевой промышленности (Дж.Бейли и др,1989; Кретович В.Л.,1986). Протеиназы, выделенные из различных источников, применяются во многих областях медицины. В настоящее время в лечебных целях используют препараты протеиназ животного происхождения: трипсин, химотрипсин, химопсин, панкреатин и растительного: папаин, лекозим, ранидаза. Они применяются в ортопедии при лечении поясничных остеохондрозов, грыж поясничных дисков, при пролежнях, гнойных ранах, и в косметологии при лечении рубцов (Сахаров И.Ю. и др,1993). Протеиназы микроорганизмов, обладающие более узкой субстратной специфичностью (фибринолизин, террилитин, стрептокиназа), применяются в тромболитической терапии (Андреенко Г.В.,1985). Было показано, что протеиназы могут сыграть важную роль в борьбе с раковыми заболеваниями. Разработан метод ферментативного (с помощью папаина) синтеза фрагмента ламинина - пентапептида, который конкурентно связываясь с рецептором ламинина опухолевых клеток, может блокировать их метастазирование (Терентьева Е.Ю. и др,1993). Поэтому выделение и исследование свойств протеиназ микроорганизмов, в частности их каталитических свойств и субстратной специфичности , представляет значительный практический интерес.

Среди прокариот наиболее удобными объектами для изучения и промышленного использования являются представители рода Bacillus. Бациллы привлекают внимание исследователей как не патогенные, легко культивируемые промышленные продуценты внеклеточных ферментов, в том числе и чужеродных мутантных белков (Дебабов В.Г, и др., 1989; ХарвудК., 1992).

Нами было установлено, что бактерии Bacillus intermedius, наряду с другими гидролазами (рибонуклеаза,фосфатаза) еекретируют сериновую протеиназу. Представлялось интересным изучить этот фермент. Описание его пополнит сведения о сериновых протеиназах бацилл и позволит расширить общие представления о субтилизинах, отдельные подсемейства которых (например, тиолзавиеимые еубтилизины с необычными свойствами) еще недостаточно изучены.

Цель и задачи исследования Данная работа проведена с целью характеристики нового фермента -внеклеточной протеиназы Bacillus intermedius 3-19, включая изучение физико-химических и биологических свойств.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие экспериментальные задачи:

1 .Оптимизация состава питательной среды и условий культивирования для получения максимальной продукции протеиназы

2. Разработка лабораторного метода выделения и очистки протеиназы из культуральной жидкости; получение гомогенного препарата фермента

3.Изучение основных физико-химических и биологических свойств протеиназы

Научная новизна работы

Впервые обнаружена внеклеточная тиолзависимая сериновая протеиназа B.intemedius .Найдены оптимальные условия продукции протеиназы. Разработан эффективный лабораторный метод препаративного выделения гомогенного препарата протеиназы B.intermedius, основанный на ВЭЖХ. Определены биохимические и физико-химические характеристики фермента. Полученные результаты в совокупности позволяют пополнить новым, ранее неизученным бациллярным ферментом группу тиолзависимых протеиназ.

Практическая ценность работы

Оптимизированы условия биосинтеза и разработан метод очистки тиолзависимой сериновой протеиназы B.intermedius 3-19 , с помощью которого можно получать гомогенный препарат фермента в количестве 20 мг из 1 литра культур альной жидкости.

Выявление у протеиназы B.intermedius 3-19 антикоагулянтной и тромболитической активностей in vitro позволяют подойти к изучению вопросов, связанных с влиянием фермента на различные компоненты крови, на систему гемостаза, т.е. к изучению действия тиолзависимой протеиназы in vivo. Подобные исследования являются очень важными и перспективными, т.к. широкое распространение тромботических заболеваний требует расширения арсенала тромболитических средств.

Нами показано, что тиолзависимая сериновая протеиназа B.intermedius 3-19 может быть использована как катализатор образования пептидных связей, что является важным направлением в современной химии пептидов. Установлено, что протеиназа B.intermedius 3-19 - устойчивый к действию органических растворителей и доступный фермент с широкой специфичностью, что делает его особенно перспективным при масштабировании процессов синтеза пептидов, а также для других областей практического применения: в качестве добавок к стиральным порошкам, для получения дрожжевых гидролизатов и т.п.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ицкович, Елена Лазаревна

выводы

1. Установлено, что синтез фермента подавляется глюкозой и смесью аминокислот, активируется при добавлении в среду органических субстратов - казеина и желатина. Неорганический фосфат среды увеличивает выход фермента

2.Разработан метод очистки и выделения внеклеточной протеиназы B.intermedius 3-19 из фильтрата культуральной жидкости бактерий ионообменной хроматографией на КМ -целлюлозе и ВЭ5КХ, позволяющий получить гомогенный препарат фермента с выходом 25%

3.Впервые выделена и охарактеризована протеиназа В. intermedius 3-19, имеющая молекулярную массу 32,5 кДа, изоэлектрическую точку 9,1-9,3, максимальную активность при pH 10,0 и 50°, которая по физико-химическим свойствам сходна с субтилизином Карлсберг

4. Протеиназа B.intermedius 3-19 эффективно гидролизует белковые субстраты, синтетические специфические субстраты субтилизинов, В-цепь инсулина. Фермент полностью ингибируется специфическими ингибиторами сериновых протеиназ DFP и PMSF, а также чувствителен к реагентам на тиоловые группы - п-ХМБ и солям ртути, что позволяет классифицировать исследуемый фермент как субтилизиноподобную тиолзависимую сериновую протеиназу

5. В условиях in vitro протеиназа B.intermedius 3-19 обладает дозозависимой тромболитической и антикоагулянтной активностью, что позволяет подойти к изучению действия протеиназы in vivo

6. N-концевая последовательность аминокислот фермента на 80 % гомологична последовательностям субтилизинов Карлсберга и BPN'. По аминокислотному составу тиолзависимая сериновая протеиназа B.intermedius 3-19 более близка протеиназе К и тиолзависимой протеиназе из Streptomyces thermovulgaris, чем субтилизинам бацилл

7. Протеиназа способна катализировать синтез пептида Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA и, следовательно, может быть использована в качестве катализатора образования пептидных связей

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ицкович, Елена Лазаревна, Казань

1.Акпаров В.Х., Белянова Л.П., Баратова Л.А., Степанов В.М. Субтилизин 72 - сериновая протеаза Bacillus subtilis штамм 72, близкая субтилизину Карлсберг // Биохимия.-1979.-Т.44,N5.-С.886-891.

2. Акпаров В.Х., Степанов В.М. Внеклеточная сериновая протеиназа Bacillus licheniformis // Биохимия.-1982.-Т.47,Nll.-СЛ 825-1830.

3. Андреенко Г. В. Развитие исследований по физиологии и патофизиологии системы фибринолиза // Биологические науки.-1985.-N10.-C.5-19.

4. Безбородов А.М., Астапович Н.И. Секреция ферментов у микроорганизмовМ.: НаукаД984.-С .43-55.

5. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии.-М.:МирД989.

6. Ваганова Г.И., Иванова Н.М., Степанов В.М. Вьщеление и свойства "кислой" металлопротеиназы Aspergillus oryzae Ц Биохимия.-1988.-Т.53.-С.1344-1351.

7. Ваганова Г.И., Иванова Н.М., Ходова О.М., Воюшина Т.Л., Степанов В.М. Выделение и свойства сериновой протеиназы Aspergillus oryzae // Биохимия.-1991.-T.56,N1.-С. 125-135.

8. Васильева Л.И., Руденская Г.Н., Крестьянова И.Н., Ходова О.М., Бартошевич Ю.Э., Степанов В.М. Протеиназа I из Acremonium chrisogenum сериновая протеиназа нового типа // Биохимия.-1985.-Т.50.-С.355-362.

9. Воюшина Т.Л., Люблинская Л.А., Степанов В.М. Синтез пептидов, катализируемый сериновыми протеиназами. Применение эфировацилпептидов в качестве карбоксильного компонента // Биоорг.химия.-1985.-Т.11,К6.-С.738-743.

10. П.Воюшина Т.Л., Терентьева Е.Ю., Позднев В.Ф., Гайда A.B., Гололобов М.Ю., Люблинская Л.А., Степанов В.М. Ферментативный синтез ацилпептидов, содержащих п-нитроанилиды основных аминокислот // Биоорг.химия.-1991.-Т. 17.-С. 1066-1073.

11. Гололобов М.Ю., Морозова И.П., Степанов В.М. Влияние температуры и pH на стабильность и каталитическую активность сериновой протеиназы Bacillus subtilis шт.12 // Биохимия.-1991.-T.56,Nl.-C.33-40.

12. Гололобов М.Ю., Морозова И.П., Воюшина Т.Л., Тимохина Е.А., Степанов В.М. Субстратная специфичность сериновой протеиназы Bacillus subtilis пгг.72 // Биохимия.-199L-T.56,N2.-C.230-240.

13. Дебабов В.Г., Лившиц В.А. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов.-М.:Высшая школа, 1989.

14. Детерман Г. Гель-хроматография.-М.:Мир,1970.

15. Долгих М.С. Протеиназы дрожжеподобных грибов рода Candida // Успехи сов.биол.-1990.-Т.110,Ш.-С.48-60.

16. Егоров Н.С., Лория Ж.К., Брюкнер Б. Регуляция синтеза внеклеточных протеолитических ферментов у микроорганизмов // Успехи микробиологии. -1977.-N12.-С.59-79.

17. Имшенецкий A.A. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз.-М.:Наука, 1979.

18. Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз // Прикл.биохимия и микробиология.-1971.-T.7,N2.-С.225-228.

19. Казанская Н.Ф., Кост O.A. О строении активного центра субтилизина 72 // Биохимия.- 1982.-T.47,N5.-C.834-841.

20. Калугер C.B., Боровикова В.П., Лавренова Г.И., Степанов В.М., Шпокене Л.П., Гурьева М.П. Внеклеточная сериновая протеиназа А Streptomyces rutgersensis // Биохимия.-1983.-Т.48,N9.-С. 1483-1490.

21. Калунянц К.А., Стрельникова Л.И., Штейн И.В. Влияние источников углерода, азота, фосфора на синтез протеазы культурой Bacillus subtilis // Прикл.биохимия и микробиология.- 1979.-Т. 15,N1.-С.57-62.

22. Кол ев Д. А. Репрессия синтеза экзопротеиназ у штамма 90R -формы Bacillus mesentericus аминокислотами // Микробиология.-1986.-N4.-C.295-300.28 .Кочетов Г. А. Праьсгическое руководство по энзимологии.-М.:Высшая школа, 1980.-С.26-28.

23. Крейер В.Г., Руденская Г.Н., Ландау Н.С., Покровская С.С., Степанов В.М., Егоров Н.С. Субтилизиноподобная протеиназа SSPB из Streptomyces spheroides шт.35 // Биохимия.-1983.-Т.48,N8.-С.1365-1373.

24. Крейер В.Г., Руденская Г.Н., Ландау Н.С., Смирнов Л.В., Тимохина Е.А., Егоров Н.С., Степанов В.М. Внеклеточная химотрипсиноподобная протеиназа Streptomyces spheroides 35 // Биохимия.-1984.-Т.49.-С Л 890-1898.

25. Кретович В.Л. Введение в энзимологию.-М.:Наука,1986.

26. Лавренова Г.И., Гульник C.B., Калугер C.B., Боровикова В.П., Ревина Л.П., Степанов В.М. Внеклеточная кислая сериновая протеиназа Д Streptomyces rutgersensis f j Биохимия,- 1984.-T.49.-C.531 -539.

27. Лагутина Л.С., Петрова И.С., Слепах М.Е. Трипсиноподобная протеиназа Actinomyces fradiae 119 // Биохимия.-1982.-Т.47.-С.1818-1824.

28. Ленинджер А. Биохимия.-М.:Мир,1976.

29. Лещинская И.Б., Клейнер Г.И., Волкова Т.И., Балабан Н.П., Шарипова Ф.Р. Метод выделения и очистки щелочной рибонуклеазы Bacillus intermedius // Прикл. биохимия и микробиология.-1981.-T.17,N2.-C.241-246.

30. Логинова Л.Г., Усайте И.А., Серегина Л.М. Штамм Th.vulgaris ИНМИ-4а продуцент протеиназы, обоадающей литической активностью.-A.c. 756839 СССР, 1980. Опубл. в Б.И.-1981,ШЗ.

31. Люблинская Л .А., Якушева Л.Д., Степанов В.М. Синтез пептидных субстратов субтилизина и их аналогов // Биоорг.химия.-1977.-Т.З,№.-С.273-279.

32. Люблинская Л.А., Воюшина T.JI., Степанов В.М. Ферментативный синтез пептидных субстратов сериновых протеиназ // Биоорг.химия.-1982.-T.8,N12.-C. 1620-1623.

33. Люблинская Л.А., Хайду И., Баландина Г.Н. П-нитроанилиды пироглутамилпептидов хромогенные субстраты сериновых протеиназ // Биоорг. химия.- 1987.-T.13,N6.-C.748-753.

34. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты.-М.:Наука,1971.

35. Мосолова О.В., Руденская Г.Н., Степанов В.М., Ходова О.М., Цаплина И.А. Glu,Asp-специфичная протеиназа актиномицетов // Биохимия.-1987.-Т.52.-С.414-422.

36. Нестерова Н.Г., Черкесова Г.В., Кириллова Н.Ф. Субстратная специфичность ферментов Bacillus mesentericus // Микробиология.-1989.-T.58,N4.-C.553-557.

37. Новикова Т.М., Выборных С.Н., Егоров Н.С., Лория Ж.К. Внеклеточная протеаза Bacillus alvei В-724 // Прикл.биохимия и микробиология.-1986.-Т.22,К6.-С.772-777.

38. Новикова Т.М., Парыгин Е.В. Влияние аминокислот на образование экзопротеаз Bacillus alvei // Тез. докл. конф. мол. ученых "Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов".-Рига,1987.-С.153.

39. ЗО.Остерман АЛ. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. -М.:НаукаД985.-С.104-109.

40. Павлова И.Н., Жолнер Л.Г. Сериновая протеиназа с литическими свойствами // Микробиология.-1988.-Т.57,Ш.-С.398-405.

41. Павлова И.Н., Жолнер Л.Г. Сериновые протеиназы термофильных бацилл // Микробиология.-1994.-Т.63,Ш.-С.8-16.

42. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток.-М.:МирД980.-331с.

43. Плохинский H.A. Математические методы в биологии.-М.:Изд-во МГУД 978.-С.9-65.

44. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов.-М.гМир, 1987.-115е.

45. Руденская Г.Н., Ревина Л.П., Грязнова Ю.Б., Лысогорская E.H., Оксенойт Е.С., Филиппова И.Ю., Степанов В.М., Иванова И.И. Сериновая протеиназа архебактерии Halobacterium mediterranei -аналог субтилизина эубактерий // Биохимия.-1992.-Т.57,N8.-СЛ230-1241.

46. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизинов // Биоорг.химия.-1994.-Т.20,Ш.-С.475-484.

47. Руденская Г.Н. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ // Биоорг.химия.-1998.-T.24,N4.-C.256-261.

48. Сахаров И.Ю., Литвин Ф.Е. Протеазы из гепатопанкреаса Камчатского краба и перспективы их использования в медицинской практике // Тез. докл. симп. "Химия протеолитических ферментов".-Москва Д993.

49. Селезнева A.A., Лукницкая О.Ф. Карбоксильная протеаза из базидиального гриба // Прикл.биохимия и микробиология.-1989.-T.25,N4.-C.451-457.

50. Степанов В.М., Руденская Г.Н., Нестерова Н.Г., Куприянова Т.Н., Хохлова Ю.М., Усайте И.А., Логинова Л.Г., Тимохина Е.А. Сериновая протеиназа Thermoactinomyces vulgaris шт.ИНМИ-4а // Биохимия.-1980.-Т.45,Ш0.-С.1871-1879.

51. Степанов В.М., Руденская Г.Н., Васильева Л.И., Крестьянова И.Н., Ходова О.М., Бартошевич Ю.Э. Сериновая протеиназа II из Acremonium chrysogenum // Биохимия.-1986.-T.51,N9.-C.1476-1483.

52. Стронгин А .Я., Степанов В.М. Внутриклеточные сериновые протеиназы спорообразующих бацилл // Биохимия.-1981.-Т.46, N8.-С.1347-1363.

53. Тепляков A.B., Куранова И.П., Аругюнян Э.Г., Фроммель К., Хене В. Кристаллическая структура термитазы и стабильность субтилизинов // Биоорг.химия.-1990.-Т.16,М4.-С.437-447.

54. Терентьева Е.Ю., Воюшина Т.Л., Степанов В.М. Ферментативный синтез фрагмента ламинина AC-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg // Тез. докл. симп. "Химия протеолитических ферментов".-МоскваД993.

55. Филлипович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии.-М.:Просвещение, 1975.-С.70.

56. Хайдарова H B., Руденская Т.Н., Ревина Л.П., Степанов В.М., Егоров Н.С. Gill, Asp-специфичная протеиназа из Streptomyces thermovulgaris // Биохимия.-1989.-Т.54.-С.46-52.

57. Хайдарова Н.В., Руденская Т.Н., Ревина Л.П., Степанов В.М., Егоров Н.С. Тиолзависимая еериновая протеиназа Streptomyces thermovulgaris // Биохимия.-1990.-Т.55,К6.-С.1110-Ш8.

58. Харвуд К. Бациллы. Генетика и биотехнология.-М.: Мир, 1992.-С.143-163.

59. Честухина Г.Г., Епремян A.C., Гайда A.B., Остерман А.Л., Ходова О.М., Степанов В.М. Тиолзавиеимые сериновые протеиназы.Н.Внеклеточная еериновая протеиназа Bacillus cereus // Биоорг.химия.- 1982.-T.8,N12.-C. 1649-1658.

60. Честухина Г.Г., Загнитько О.П., Ревина Л.П., Клепикова Ф.С., Степанов В.М. Внеклеточные сериновые протеиназы подвидов Bacillus thuringiensis эволюционируют существенно медленнее соответствующих 8-эндотоксинов // Биохимия.-1985.-Т. 50,N10.-С. 1724-1732.

61. Шагинян К.А., Алехина И.А., Денисова Н.П. Сериновая протеиназа высших базидиомицетов Coprinus genus 11 Биохимия.-1990.-T.55,N8.-C. 1387-1395.

62. Шарипова Ф.Р., Вершинина В.И., Балабан Н.П., Лещинская И.Б. Синтез и секреция фосфогидролаз и протеазы Bacillus intermedius Ц Микробиология.-1987.-Т.56,К5.-С.805-811.

63. Экспериментальные методы исследования белков и нуклеиновых кислот.-Ред.Прокофьев М.А.-М.:Изд-во МГУД985.-С.7-23.

64. Astrup T., Mullertz S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity //Arch. Biochem. Biophys.-1952.-40.-P.346-351.

65. Bachovchin W.W. 15 N NMR spectroscopy of hydrogen-bonding interactions in the active site of serine proteases: evidence for a moving histidine mechanism // Biochemistry.-1986.-25.-P.7751-7759.

66. Barbas C.F., Matos J.R., West J.B., Wong C.H. // J.Amer.Chem.Soc.-1988.-110.-P.5162-5166.

67. Bech L.M., Sorensen S.B., Breddam K. Significance of hydrophobic S4-P4 interactions in subtilisin 309 from Bacillus lentus // Biochemistry.-1993.-32,N11.-P.2845-2852.

68. Sl.Behnke U., Schalinatus E., Ruttloff H., Hohne W.E., Frommel C. Characterization of a protease from Thermoactinomyces vulgaris (thermitase). I. Purification of thermitase j I Acta biol.et med.germ.-1978.-37,N8.-S.l 185-1192.

69. Betzel C., Pal G.P., Saenger W. Three-dimensional structure of proteinase K at 0,15-nm resolution // Eur.J.Biochem.-1988.-178.-P.155-171.

70. Betzel C., Klupsch S., Branner S., Wilson K.S. Crystal structures of the alkaline proteases Savinase and Esperase from Bacillus lentus // Adv.Exp.Med.Biol.-1996.-379.-P.49-61.

71. Bode W., Papamokos E., Musil D. The high-resolution X-ray crystal structure of the complex formed between subtilisin Carlsberg and elgin C, an elastase inhibitor from the leech Hirudo medicinalis // Eur J.Biochem.-1987.-155.-P.673-693.

72. Borgia P., Campbell L. Properties of two homologous alkaline proteases from Streptomyces rectus j I Journal of bacteriology.-1974.-120.N3,-P. 11091115.

73. Bott R., Ultsch M., Kossiakoft A. The three dimensional structure of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin at 1,8 A° and an analysis of structuralconsequences of peroxide inactivation // J.BioLChem.-1988.-263,N16.-P.7895-7906.

74. Bott R,, Dauberman J., Wilson L., Ganshaw G., Sagar H., Graycar T., Estell D. Structural changes leading to increased enzymatic activity in an engineered variant of Bacillus lentus subtilisin // Adv.Exp.Med.Biol.-1996.-379.-P.277-283.

75. Briedigkeit L., Frommel C. Calcium ion binding by thermitase // FEBS.1989.-253.-P.83-87.

76. Chen C.C., Cleary P.P. Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes // J.Biol.Chem.1990.-265.-P.3161-3167.

77. Drapeau G.R. Cleavage at glutamic acid with staphylococcal protease // Methods in Enzymol.-1977.-47.-P. 181-191.

78. Durham D.R., Stewart D.B., Stellwag E.G. Novel alkaline-and heat-stable serine proteases from alkalophilic Bacillus sp. strain GX 6638 // Jn.Bacteriol.-1987.-169,N6.-P.2762-2768.

79. Eder J., Rheinnecker M., Fersht A.R. Folding of subtilisin BPN': role of the pro-sequence // J.Mol.Biol.-1993.-233.-P.293-304.

80. Enzyme Nomenclature.-1984.-Academ.Press.,N.York.

81. Flayek K.I., Sanaa T. El-Sayed. Some properties of two purified fibrinolytic enzymes from Bacillus subtilis and B.polymyxa fj Zeitschrift fur Allgemeine Mikrobiologie.-1980.-20,N6.-P.383-387.

82. Fujiwara N., Masui A., Imanaka T. Purification and properties of the highly thermostable alkaline protease from an alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp // J.Biotechnol.-1993.-30,N2.-P.245-256.

83. Gron H., Meldal M., Breddam K. Extensive comparison of the substrate preferences of two subtilisins as determined with peptide substrates which are based on the principle of intramolecular quenching // Biochemistry.-1992.-31,N26.-P.6011-6018.

84. Gros P., Betzel Ch., Dauter Z., Wilson K.S., Hoi W.G.J. Molecular dynamics refinement of a thermitase-eglin-C complex at 1,98 A0 resolution and comparison of two crystal forms that differ in calcium content // J.Mol.Biol.-1989a.-210.-P.347~367.

85. Gros P., Fujinaga M., Dijkstra B.W., Kalk K.H., Hoi W.G.J. Crystallographic refinement by incorporation of molecular dynamics: thermostable serine protease thermitase complexed with eglin C // Acta Crystallogr. -1989b.-5-P.488-499.

86. Gros P., van Gunsteren W.F., Hoi W.G.J. Inclusion of thermal motion in crystallographic structures by restrained molecular dynamics // Science.-1990.-249.-P. 1149-1152.

87. Gros P., Kalk K.H., Hoi W.G.J. Calcium binding to thermitase. Crystallographic studies of thermitase at 0,5 and 100 mM calcium // J.Biol.Chem.-1991.-266-P.2953-2961.

88. Horikoshi K., Watanabe K. Enzymes from alkalophilic microorganisms.-In:Alkalophilic microorganisms. Tokyo:Kaimeisha.-1983.-P.30-33.

89. Jacobs M., Eliasson M., Uhlen M., Flock J. Cloning, sequencing and expression of subtilisin Carlsberg from Bacillus licheniformis // Nucleic Acids Res.-1985.-13.-P.8913-8926.

90. Jany K.D., Mayer B. Proteinase K from Tritirachium album Limber. ¡.Molecular mass and sequence around the active serine residue // Hopper Seyler.-1985.-366.-P.485-492.

91. Kitadokoro K., Tsuzuki H , Okamoto H., Sato T. Crystal structure analysis of a serine proteinase from Streptomyces fradiae at 0,16-nm resolution and molecular modeling of an acidic-amino-acid-specific proteinase // Eur.J.Bioehem.-1994.-224.-P.735-742.

92. Klapper B.F., Jameson D.M. Factors affecting the synthesis and release of extracellular protease of Aspergillus oryzae NRRL. 2160 I I Biochim. et biophys. Acta.-1973.-304,N2.-P.513-519.

93. Kleine R. Properties of thermitase, a thermostable serine protease from Thermoactinomyces vulgaris // Acta Biol.Med.Ger.-1982.-41.-P.89-102.

94. Laemmli H.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature.-1970.-227.-P.680-685.

95. Leshchinskaya I.B., Shakirov E.V., Itskovich E.L., Balaban N.P., Mardanova A.M., Sharipova M.R., Viryasov M.B., Rudenskaya G.N., Stepanov V.M. Glutamyl endopeptidase of Bacillus intermedins, strain 3-19 // FEBS Lett. -1997. -404. -P.241-244.

96. Mantsala P., Lalkin H. Extracellular and membranebound proteases from Bacillus subtilis // J.Bacteriol.-1980.-141.-P.493-501.

97. Markland F.S., Smith E.L. Subtilisins: primary structure, chemical and physical properties.-In: Enzymes. N.Y.-London: Aead.Press.-1971.-3.~ P.561-608.

98. McPhalen C.A., James M.N.G. Structural comparison of two serine proteinase protein inhibitor complexes: eglin-C-subtilisin Carlsberg and CI-2-subtilisin Novo // Biochemistry.-1988.-27.-P.6582-6598.

99. Meloun B., Baudys M., Kostka V., Hausdorf G., Frommel C., Hohne W.E. Complete primary structure of thermitase from Thermoactinomyces vulgaris and its structural features related to subtilisin-type proteinases // FEBS Lett-1985.-183.-P. 195-200.

100. Mizuno K., Nakamura T., Ohshima T., Tanaka S., Matsuo H. Yeast KEX 2 genes encodes an endopeptidase homologous to subtilisin-like serine proteases // Biochem.Biophys.Res.Commun.-1988.-156.-P.246-254.

101. Morihara K., Oka T., Tsuzuki H. Subtilisin BPN': kinetic study with oligopeptides // Arch. Biochem. and Biophys.-1970.-138.-P.515-525.

102. Morihara K., Tsuzuki H., Oka T. // Biochem. and Biophys. Res. Communs.-1971.-42.-P. 1000-1006.

103. Morihara K, Oka T. Peptide bond synthesis catalysed by subtilisin, papain and pepsin // J.Biochem.-1981.-89,N2.-P.385-395.

104. Neurath H. Evolution of proteolytic enzymes // Science.-1984.-224.-P.350-357.

105. North M.J. Comparative biochemistry of the proteinases of eucaryotic microorganisms // Microbiol.Rev.-1982.-46,N.3.-P.308-340. 128.0ttesen M., Svedsen I. The subtilisins // Meth.Enzymol.-1970.-19.-P.199-215.

106. Pantoliano M.W., Whitlow M., Wood J.F., Dodd S.W., Hardman K.D., Rollence M.L., Bryan P.N. Large increases in general stability for subtilisin BPN' through incremental changes in the free energy of unfolding // Biochemistry.-1989.-28.-P.7205-7213.

107. Russell A.J., Thomas P.G., Fersht A.R. Electrostatic effects on modification of charged groups in the active site cleft of subtilisin by protein engineering // J.Mol.Biol.-1987.-193.-P.803-813.

108. Sidhu S.S., Kalmar G.B., Willis L.G., Borgford T.J. Protease evolution in Streptomyces griseus. Discovery of a novel dimeric enzymes // J.Biol.Chem.-1995.-270,N13.-P.7594-7600.

109. Siezen R.J., de Vos W.M., Leunissen J.A.M., Dijkstra B.W. Homology modelling and protein engineering strategy of subtilases, the family of subtilisin-like serine proteinases // Protein Engineering. -1991. -4,N7. P.719-737.

110. Simonen M., Palva I. Protein secretion in Bacillus species // Microbiological Reviews.-1993.-57,N1.-P.109-137.

111. Sluyterman L.A.A., Elgersma O. Chromatofocusing: isoelectric focusing on ion-exchange columns. I.General principles // J.Chromatogr.-1978.-150.-P.17-30.

112. Stepanov V.M., Rudenskaya G.N. Affinitive chromatography of proteinases on bacitracin-sepharose // Appl. Biochemistry.-1983.-5.-P.420-428.

113. Stepanov V.M., Rudenskaya G.N., Revina L.A., Gryaznova Y.B., Lysogorskaya E.N., Filippova I.Yu., Ivanova I.I. A serine proteinase of an archaebacterium Halobacterium mediterranei // Biochem.. 1992.-283.-P.281-286.

114. Stoeva S., Klunschmidt T., Mesrob B., Braunitzer G. Primary structure of a zinc protease from Bacillus mesentericus strain 76 // Biochem.-1990.-29,N2.-P.527-534.

115. Takagi H., Morinaga Ya., Ikemiira H., Inouye M. The role of Pro-233 in the catalysis and heat stability of subtilisin E I I J.Biochem.-1989.-105.-P.953-956.

116. Tange T., Taguchi S., Kojima S., Miura K., Momose H. Improvement of a useful enzyme (subtilisin B PN') by an experimental evolution system // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1994.-41 ,N2. -P.239-244.

117. Terada I., Kwon S.T., Miyata Y., Matsuzawa H., Ohta T. Unique precursor structure of an extracellular protease, aqualysin 1, with NH -and COOH-terminal pro-sequences and its processing in Escherichia coli // J.Biol.Chem.-1990.-265.-P.6576-6581.

118. Vitale L., Renko M., Lenarcic B., Turk V., Pokomey M. Isolation and characterization of Streptomyces rimosus proteases // Sympos. Biolog. Hungarica.-1984.-25.-P.413-424.

119. Vos P., Simons G., Siezen R.J., de Vos W.M. Primary structure and organization of the gene for a procaryotic all-envelope-located serine proteinase // J.Biol.Chem.-1989.-264.-P.13579-13585.

120. Wells J.A., Ferrari E., Henner D.J., Estell D.A., Chen E.Y. Cloning, sequencing and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis // Nucleic Acids. Res.-1983.-li.-P.7911-7925.

121. Wells J.A., Cunningham B.C., Graycar T.P., Estell D.A. Recruitment of substrate-specificity properties from one enzyme in to a related one byprotein engineering // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1987a.-84.-P.5167-5171.

122. Wells J.A., Powers D.B., Bott R.R., Graycar T.P., Estell D.A. Designing substrate specificity by protein engineering of electrostatic interactions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1987b.-S4.-P.1219-1223.

123. Wells J.A., Estell D.A. Subtilisin an enzyme designed to be engineered // Trends Biochem. Sci. -1988. -13.- P.291 -297.

124. Wright C.S., Alden R.A., Kraut J. Structure of subtilisin BPN' at 2,5 A° resolution // Nature.-1969.-221.-P.235.

125. Yamagata Y., Isshiki K., Ichishima E. Subtilisin Sendai from alkalophilic Bacillus sp.: molecular and enzymatic properties of the enzyme and molecular cloning and characterization of the gene, apr S // Enzyme Microb. Technol.-1995.-17,N7.-P.653-663.

126. Yamagata Y., Sato T., Hanzawa S., Ichishima E. The structure of subtilisin ALPI from alkalophilic Bacillus sp. NKS-21 // Curr. Microbiol.-1995.-30,N4.-P.201-209.

127. Yamagata Y., Yoshida N., Noda K., Ito A. Purification and characterization of a new serine proteinase from Bacillus subtilis with specificity for amino acids at PI and P2 positions // Biochim. Biophys. Acta.-1995.-1253,N2.-P.224-228.