Протеиназы и альдолазы: принципиальные подходы к получению практически значимых бактериальных ферментов

Маликова, Лилия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Протеиназы и альдолазы: принципиальные подходы к получению практически значимых бактериальных ферментов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Протеиназы и альдолазы: принципиальные подходы к получению практически значимых бактериальных ферментов"

На правах рукописи □030В8В02

МАЛИКОВА ЛИЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ПРОТЕИНАЗЫ И АЛЬДОЛАЗЫ: ПРИНЦИПИАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ ПРАКТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2007

003068602

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии биолого-почвенного факультета ГОУВПО «Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина».

Научный руководитель: Кандидат биологических наук, доцент

Марданова Айслу Миркасымовна

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, старший научный

сотрудник Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН Чернова Ольга Александровна

Доктор биологических наук, профессор Казанского государственного университета Селивановская Светлана Юрьевна

Ведущая организация: Институт микробиологии

им. С.Н. Виноградского РАН (г. Москва)

Защита диссертации состоится «26» апреля 2007 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д.212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здание, ауд. 209.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета

Автореферат разослан «_» апреля 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

З.И. Абрамова

Актуальность проблемы. Ферментные препараты, обладающие высокой активностью и специфичностью, являются неотъемлемой частью современных биотехнологических процессов, обеспечивая их эффективность и экологическую безопасность. Альдолазы и протеиназы представляют собой уникальные биологические катализаторы, способные осуществлять реакции расщепления и синтеза молекул. Альдолазы - это эффективные инструменты для синтеза различных Сахаров - предшественников в получении ксилита, некоторых лекарственных, антифунгицидных препаратов и других соединений, используемых в промышленности. Среди альдолаз особый интерес представляют фруктозо-6-фосфат-альдолаза Exolt и трансальдолаза B.subtilis, способные использовать в синтезе различных кето-сахаров недорогой дигидроксиацетон, в отличие от других альдолаз, утилизирующих дорогостоящий фосфодигидроацетон (Shurmann et al., 2001). Одну из важнейших групп индустриальных ферментов представляют протеиназы микроорганизмов, широко используемые в различных областях промышленности, медицины и молекулярной биологии (Gupta et al., 2002; Rao et al., 1998). Интересна способность протеиназ к синтезу олигопептидов, поскольку направленный ферментативный синтез пептидной связи имеет ряд преимуществ перед химическим синтезом. Бактерии B.amyloliquefaciens и B.pumilus являются известными продуцентами сериновых протеаз, в частности, субтилизиноподобных протеиназ, имеющих практическую ценность. Гены некоторых из них клонированы и секвенированы (Wells et al., 1983; Hung et al., 2003; Aoyama et al., 2000; Pan and Huang, 2004). Однако недостаточно исследованы тромболитические, антикоагулянтные, пептидсинтетические свойства, а также закономерности биосинтеза внеклеточных протеиназ этих бацилл.

Практическая ценность альдолаз и протеиназ диктует необходимость получения высокоэффективных продуцентов этих ферментов. Различная локализация в клетке и особенности биосинтеза этих белков определяют выбор стратегии повышения продуктивности культур. Альдолазы - это внутриклеточные ферменты, синтезируемые клеткой в небольших количествах, поэтому для препаративного получения этих белков предпочтительным является использование генно-инженерных методов. Уровень синтеза внеклеточных протеиназ сильно зависит от ряда факторов, в частности, от состава питательной среды, что позволяет значительно повысить выход ферментов за счет оптимизации условия биосинтеза.

Таким образом, перспективы применения протеиназ и альдолаз, в частности, в медицине и для синтеза соединений, используемых в промышленности, определяют актуальность поиска новых продуцентов этих ферментов.

Целью работы явилось выделение и характеристика внеклеточных протеиназ из природных штаммов B.amyloliquefaciens и В pumilus и внутриклеточных альдолаз из рекомбинантных штаммов E.coli с использованием подходов, основанных на оптимизации условий биосинтеза ферментов и генно-инженерных модификациях продуцентов.

Основные задачи исследования:

1. Установить особенности биосинтеза внеклеточных сериновых протеиназ штаммами B.amyloliquefaciens Н2 и B.pumilus КММ 62 и получить высокий уровень продукции ферментов путем оптимизации состава питательных сред.

2. Получить рекомбинантные продуценты внутриклеточных ферментов: трансальдолазы Bacillus subtilis и фруктозо-6-фосфат-альдолазы A129S Escherichia coli и исследовать экспрессию клонированных генов.

3. Выделить и очистить субтилизиноподобные протеиназы и глутамилэндопептидазы природных штаммов B.amyloliquefaciens Н2 и B.pumilus КММ 62, а также трансальдолазу и фруктозо-6-фосфат-альдолазу A129S из рекомбинантных штаммов Е.соИ.

4. Охарактеризовать энзиматические свойства, субстратную специфичность, а также тромболитическую, антикоагулянтную, фибринолитическую и пептидсинтетическую активность протеиназ.

5. Оценить эффективность синтетической активности трансальдолазы и фруктозо-6-фосфат-альдолазы A129S в отношении синтеза Сахаров из различных субстратов.

Научная новизна. Впервые выделены и охарактеризованы глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобные протеиназы, секретируемые штаммами B.amyloliquefaciens Н2 и B.pumilus КММ 62. Определены условия для эффективного биосинтеза ферментов и разработаны питательные среды для получения протеиназ в препаративных количествах.

Впервые установлено, что субтилизиноподобные протеиназы B.amyloliquefaciens и B.pumilus обладают тромболитическими и антикоагулянтными свойствами. Получены приоритетные данные о наличии тромболитической, фибринолитической, антикоагулянтной активности у глутамилэндопептидаз B.amyloliauefaciens.

Впервые показано, что фруктозо-6-фосфат-альдолаза с мутацией в активном центре A129S, выделенная из рекомбинантных клеток E.coli, способна эффективно катализировать реакцию образования ксилулозы из дигидроксиацетона и гликольапьдегида.

Практическая значимость. Примененные в работе подходы по оптимизации состава питательной среды и клонированию генов альдолаз на векторах экспрессии позволили получить эффективные продуценты внеклеточных сериновых протеиназ и внутриклеточных альдолаз. Результаты могут быть использованы при разработке стратегии синтеза ферментов промышленными штаммами бактерий. Получение гомогенных препаратов субтилизиноподобных протеиназ, глутамилэндопептидаз и альдолаз увеличивает арсенал белков, используемых в научных исследованиях и практических целях. Субтилизиноподобные протеиназы B.amyloliquefaciens и B.pumilus обладают высокой тромболитической и антикоагулянтной активностью, что делает эти ферменты перспективными в качестве препаратов для лечения заболеваний, связанных с образованием тромбов. Субтилизиноподобные протеиназы B.amyloliquefaciens могут быть

использованы в синтезе специфических хромогенных субстратов для протеолитических ферментов. Полученные из рекомбинантных штаммов Exoli трансальдолаза и фруктозо-6-фосфат-альдолаза A129S могут быть применены для синтеза ксилулозы, являющейся предшественником в получении ксилита, широко применяющегося в промышленности.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнялась в соответствии с планом НИР КГУ (№ государственной регистрации 01.2.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Научные исследования поддержаны грантами РФФИ 01-04-48037, 05-04-48182, АН РТ фонда НИОКР 03-3.10-295, 03-3.5-20, программой CRDF Ree 007, совместной программой ДААД и Минобрнауки РФ «Михаил Ломоносов» А/05/3903. Все исследования, представленные в работе, выполнены автором.

Положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизация состава питательной среды культивирования обеспечивает высокий уровень продукции субтилизиноподобных протеиназ и глутамилэндопептидаз у природных штаммов B.amyloliquefaciens и B.pumilus.

2. Использование технологии клонирования генов трансальдолазы B.subtilis на рЕТ 22 и фруктозо-6-фосфат-альдолазы A129S Kcoli на векторе pJFl 19ЕН позволяет получить продуценты с высоким уровнем синтеза ферментов.

3. Выделенные ферменты обладают практически значимыми свойствами: протеиназы B.amyloliquefaciens и B.pumilus - фибринолитической, тромболитической, антикоагулянтной активностью; субтилизиноподобные протеиназы B.amyloliquefaciens — пептидсинтетической активностью, трансальдолаза и фруктозо-6-фосфат- альдолаза - ксилулозо-синтетической.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на ежегодных научных конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003-2006 г.г.) и ежегодных школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003-2005 г.г.), Всероссийской научной конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004 г.), XIII международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение», (Казань, 2005 г.), 79-ой Всероссийской студенческой научной конференции (Казань, 2005 г.). V Республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес» (Казань, 2005 г.), научном семинаре стипендиатов программы «Михаил Ломоносов» (Москва, 2006 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 научных работ.

Место выполнения работы и благодарности. Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственного университета. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю кандидату

биологических наук, доценту A.M. Мардановой за внимательное отношение к работе; кандидату биологических наук Н.П.Балабан и профессору М.Р. Шариповой - за консультации по проведению экспериментов и критические замечания. Данные по субстратной специфичности, ингибиторному анализу протеиназ, пептидному синтезу получены автором на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ под руководством профессора Г.Н. Руденской, за что автор выражает особую благодарность. Автор благодарит профессора Шпренгера за предоставление возможности проведения экспериментов по исследованию апьдолаз на базе Института микробиологии г.Штутгарта (Германия). Автор выражает искреннюю благодарность заведующей кафедрой микробиологии Казанского университета проф. О.Н. Ильинской и сотрудникам кафедры микробиологии за помощь и теплую рабочую атмосферу.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, включает 21 таблицу, 36 рисунков. Библиография содержит 260 наименований российских и зарубежных авторов.

Материалы и методы

Объекты исследования. Штаммы, используемые в работе, приведены в табл. 1. Вектора экспрессии рЕТ22, pWH1520, pJF119EH, а также плазмида pUC/saA129S, несущая ген фруктозо-6-фосфат альдолазы A129S (с заменой аланина в позиции 129 на серин), предоставлены проф. Шпренгером, Институт микробиологии, Германия. Плазмиды pET22ta/, pWH1520/a/, pJFl 19/saA129S получены в работе.

Таблица 1. Штаммы, используемые в работе

Штамм Изменения в генотипе Источник

В. amyloliquefaciens Н2 B.pumilus КММ62 природные штаммы Коллекция каф.микробиологии Казанского государственного университета

B.subtilis 168 trpC2

Е coli DH5 a F-, v/80dlacZmi5 (klacZYA -argF) U169, deoR, recAlendAl, hsdR17 (r¿, mù), phoA supE44, X, thi-1, gyrA96, relAI Предоставлены проф. Шпренгером, Институт микробиологии г.Штутгарта, Германия

E.coli BL (DE3) pLysS F-, ompT, hsdSB(r¿, m¿), gal, dem (DE3'), pLysS(CamR)

Культивирование бактерий. Исходной питательной средой для культивирования бактерий В. атуЬИдае/асгет и В ритИт являлась заводская среда (Ицкович с соавт., 1995). Пептон вносили в концентрации 15-45 г/л.

Растворы неорганического фосфата (Na2HP04-12H20 - 0,1-0,4 г/л), цитрата аммония (C5H7O5COONH4 - 1-5мМ), хлорида аммония (NH4C1 - 1-5мМ), стерилизовали при 1 атм и вносили в среду перед посевом. Растворы казеина, желатина, аминокислот, дрожжевого экстракта («Sigma») стерилизовали при 0,5 атм и вносили в среду до конечной концентрации 0,1-1,0%.

Штаммы fí.subtilis 168, E.coli DH5a, E.coli (DE3) pLysS культивировали на среде LB (Sambrook et al., 1989). Для трансформации Bsubtilis использовали среды Спицайзена (Anagnostopolous et al., 1961). При выращивании рекомбинантных штаммов B.subtilis и E.coli в среду вносили соответствующие антибиотики (эритромицин 20 мкг/мл, хлорамфеникол 50 мкг/мл, ампициллин 100 мкг/мл).

Прирост биомассы измеряли нефелометрически на КФК-2 при 590 нм. Протеолитическую активность определяли по гидролизу синтетических субстратов Z-Ala-Ala-Leu-pNA или Z-Glu-pNA (Люблинская с соавт., 1987).

Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса (Sambrook et ai., 1989) с помощью набора реактивов «QIAprep Spin Mini Kit» («Quagen»), Трансформацию клеток E.coli и B.subtilis плазмидной ДНК проводили как описано в работе Anagnostopolous et al., 1961.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с помощью термоциклера фирмы «Biorad» с использованием Pwo- или Taq-полимераз («Roche Applied Science») (Sambrook et al., 1989). Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 0,03-0,04 мкг плазмидной ДНК, 10-30 пкмоль каждого праймера (табл. 2), 200 мкМ смеси dNTP, 2,0 ед. полимеразы в однократном буфере («Roche Applied Science»). Рестрикцию и лигирование ДНК проводили как рекомендовано фирмой производителем («MBI fermentas»).

Определение нуклеотидной последовательности генов tal и /kjA129S в составе плазмид проводили методом терминации цепи дидезоксинуклеотидами, с помощью набора реактивов «Thermo Sequenase Primer Cycle Sequencing Kit». ПЦР проводили согласно схеме, указанной производителем. Продукты реакции анализировали на автоматическом секвенаторе («Pharmacia»),

Таблица 2. Синтетические олигонуклеотиды, использованные в работе (жирным выделены сайты рестрикции - Ше! и ХЬо!)

Назначение праймера Последовательность праймера

Клонирование tal на рЕТ22 (1)GGAATTCATATGACTCACACAGTACCTC (2) TTTTCTCGAGGCGATTTGGATACACCATC

Клонирование tal на pWH1520 ( 1 )GGACTAGTTAAATGTTATTCTTTGATACAGC (2)TCAGCGGCATTGTGCCGTATG

Секвенс рЕТ22га/ TGTGAGCGGATAACAATTCCCCTC GTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAG

Секвенс pWH1520to/ CAAACTAACTCAATTAAGATAGTTGATGG CGCGTCGGATCAATTCATCGATATC

Секвенс pJFl 19/íoA129S GACAATTAATCATGGGCTCGTATAATGTGT CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG

Уровень продукции альдолаз рекомбинантными штаммами B.subtilis и E.coli оценивали следующим образом: к клеточной культуре, достигшей 0,5-0,7 ед. оптической плотности добавляли 1мМ IPTG (изопропил-P-D-тиогапактопиранозид) или 0,5% ксилозы и культивировали еще в течение 3-4, 6-7 или 12 часов. Клетки разрушали при помощи Френч-пресса и центрифугировали при 40000g. В клеточном экстракте анализировали спектр белков с помощью SDS-PAAG электрофореза (Laemmli, 1970) и определяли специфическую активность альдолаз.

Выделение и характеристика ферментов. Очистку альдолаз проводили с использованием хроматографии на Q-сефарозе и гельфильтрации на Superdex или колонке с гидроксиапатитом. Выделение и очистку протеиназ из культуральной жидкости проводили методом ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе и колонке MonoS в системе FPLC.

Свойства ферментов. Влияние ингибиторов на активность протеиназ определяли, используя DFP, PMSF, о-фенантролин, HgCI2, р-СМВ в молярном соотношении фермент:ингибитор 1:100. рН- и Т-оптимум активности, рН- и Т-стабильность протеиназ исследовали по гидролизу синтетических хромогенных субстратов Z-Ala-Ala-Leu-pNA или Z-Glu-pNA.

Субстратную специфичность субтилизиноподобных протеиназ определяли по гидролизу синтетических субстратов GIp-Ala-Ala-pNA, Glp-Ala-Phe-pNA, Z-Gly-Ala-Phe-pNA, Z-Pyr-Phe-Ala-pNA, Z-Ala-Ala-Pro-pNA; специфичность глутамилэндопептидаз определяли по гидролизу Z-Ala-Ala-Met-Glu-pNA, Z-Ala-Ala-Trp-Glu-pNA, Z-Ala-Ala-Phe-Glu-pNA, Z-Ala-Ala-Leu-Glu-pNA, Z-Ala-Ala-Trp-Asp-pNA, Z-Ala-Ala-Leu-Asp-pNA, Z-Ala-Ala-Phe-Asp-pNA, Z-Gly-Ala-Ala-Asp-pNA, Z-Glu-pNA (Люблинская с соавт., 1987).

Фибринолитическую активность протеиназ определяли на фибриновых пластинках как описано в работе Astrup et al., 1952 и выражали в ед/мг белка (1 ед = 1 мм2/ч). Тромболитические и антикоагулянтные свойства протеиназ изучали ш vitro на тромбах, образованных из цитратной плазмы крови кролика и тромбина.

Ферментативный синтез пептида Z-Ala-Ala-Leu-pNA с помощью субтилизиноподобной протеиназы B.amyloliquefaciens проводили из Z-Ala-Ala-ОСНз и Leu-pNA («Sigma») в растворе диметилформамида и этилацетона.

Активность альдолаз определяли спектрофотометрически по скорости восстановления или окисления NADH (М. Shurmann et al., 2001). Синтез ксилулозы с помощью альдолаз проводили в 50мМ глицилглициновом буфере с 1мМ дитиотрейтолом, рН 8,5 с использованием различных субстратов: 1) 100 мМ фруктозо-6-фосфата и ЮОмМ гликольальдегида, 2) 200 мМ дигидроксиацетона и 130 мМ гликольальдегида. Реакционные смеси инкубировали при 37° и отбирали пробы через 0, 2,12, 24 ч. Продукты реакций разделяли на колонке Aminex НРХ87Н («Biorad») в системе HPLC. Спектры регистрировали при 192 нм и анализировали в программе Millenium32.

Математическую обработку полученных данных проводили в программной среде «Microsoft Excel». Результаты многофакторных экспериментов обрабатывали в программе ВЮРТ (Краснов с соавт., 1992).

Результаты исследований и их обсуждение

Оптимизация состава питательных сред для эффективной продукции протеиназ B.amyloliquefaciens и B.pumilus

Широкое использование протеиназ в различных отраслях промышленности и медицины обуславливает неослабевающий интерес к поиску новых продуцентов этих ферментов. Ранее из различных штаммов B.amyloliquefaciens и Bpumilus были выделены и изучены субтилизиноподобные протеиназы, гены некоторых из этих ферментов секвенированы (Wells et al., 1983; Hung et al., 2003; Ayoma et al., 2000). Показано, что различные штаммы одного и того же вида бактерий могут продуцировать протеиназы, различающиеся по физико-химическим свойствам. Так, из разных штаммов Bpumilus выделены субтилизиноподобные протеиназы, различающиеся по рН- и Т-оптимуму действия, стабильности в присутствии различных детергентов (Huang et al., 2003; Аоуаша et al., 2000; Miaji et al., 2006), что может быть важным с точки зрения применения ферментов. Однако в литературе мало данных об особенностях биосинтеза, тромболитических и пептидсинтетических свойствах протеиназ бацилл.

С использованием специфических субстратов Z-Ala-Ala-Leu-pNa и Z-Glu-pNa в культурапьной жидкости B.amyloliquefaciens и B.pumilus нами идентифицированы субтилизиноподобная протеиназа и

глутамилэндопептидаза. В настоящее время арсенал продуцентов глутамилэндопептидаз невелик и немногочисленны сведения об особенностях биосинтеза этих ферментов. Исследование динамики роста культур и биосинтеза ферментов выявило, что синтез субтилизиноподобных протеиназ и глутамилэндопептидаз В amyloliquefaciens и B.pumilus имеет двухфазный характер (рис. 1). Протеиназы обнаруживаются в культурапьной жидкости на стадии замедления роста, затем уровень активности ферментов повышается, достигая двух максимумов, соответствующих ранней и поздней стационарной

Активность (a) OD59o Активность (б) OD59o

субтилизиноподобной Активность субтилизиноподобной Активность

протеиназы.

нмоль/мл 70

глутамилэндопептидазы нмоль/мл

протеиназы.

нмоль/мл 70

глутамилэндопептидазы,

нмоль/мл 20

iiiiiiiiitiit 12 20 28 36 44 52 60 Время, ч

-1—I—I—г-

16 24 32 40 48 56

Время, ч

Рис. 1. Динамика роста (1), накопления субтилизиноподобной протеиназы (2) и глутамилэндопептидазы (3) В. amyloliquefaciens Н2 (а) и B.pumilus КММ 62 (б).

фазе роста культур. Максимумы накопления субтилизиноподобной протеиназы В.атуШ'щие/аЫет приходятся на 28 и 46-48 ч роста, а В.ритИш на 32-34 и 4648 ч. Для биосинтеза глутамилэндопептидаз обеих культур также характерны два максимума накопления внеклеточной активности на 22-24 и 48 ч роста Мы условно обозначили ферменты, соответствующие первому максимуму как субтилизиноподобная протеиназа 1 и глутамилэндопептидаза 1, ферменты, соответствующие второму максимуму - субтилизиноподобная протеиназа 2 и глутамилэндопептидаза 2. Ранее сходные закономерности биосинтеза были выявлены для сериновых протеиназ В. ШегтесИиз (Ицкович с соавт., 1995; Балабан с соавт., 2003). Это позволяет нам заключить, что такой характер накопления внеклеточной активности может быть связан с физиологической ролью ферментов, в частности, с их участием в процессах спорогенеза у бацилл (Егпп^оп е1 а!., 1993; Шарипова с соавт., 2002).

С целью повышения продукции ферментов для последующего их выделения в препаративных количествах, мы подбирали состав питательной среды для эффективного синтеза протеиназ. Для определения оптимальных концентраций пептона и неорганического фосфата проводили двухфакторные эксперименты по плану В2 (Краснов с соавт., 1992). Для максимальной продукции субтилизиноподобных протеиназ 1 и 2 В.ату1оИдие/аЫет концентрация пептона должна составлять 23 г/л, а неорганического фосфата -0,24 и 0,3 г/л (рис. 2), субтилизиноподобных протеиназ 1 и 2 В.ритНш -пептона 35 и 26 г/л, неорганического фосфата - 0,35 и 0,32 г/л соответственно. Высокая продукция глутамилэндопептидаз 1 и 2 В.ату1оНдие/аает наблюдается при содержании в среде 25 и 18 г/л пептона, 0,3 и 0,38 г/л неорганического фосфата соответственно. Полученные нами результаты подтверждают тот факт, что для каждого продуцента необходимо индивидуально подбирать условия эффективной продукции протеиназ (Аётагауапа е1 а1., 2002). Использование оптимизированных сред позволило повысить продукцию глутамилэндопептидаз В.атуЬПдие/асгею и ВритИт в 1,2-1,5 раз, а субтилизиноподобных протеиназ в 2-5 раз.

(а)

(б)

0,35

& о

•е-

0,25

о. 0,15 8 я

20 25 30 Пептон, г/л

0,4 г

Й ■е<

о о -е-

I ^

У У

I { 03 '

1 \

8- 0,2

)

20 25 30 ~ Пептон, г/л

Рис. 2. Линии уровня активности в двухфакторных экспериментах для субтилизиноподобной протеиназы 1 (а) и 2 (б) В. ату1о1'щие[ас1ет

Известно, что наличие в питательной среде дополнительных источников азота существенно влияет на уровень продукции лротсиназ. У B.intermedius уровень накопления глутамилэндо пептидазы увеличивается при сочетании в среде органического (пептона) и неорганического (хлорид аммония) источников азота (Gabdraklimanova et al., 1999). Мы исследовали влияние на биосинтез ферментов цитрата аммония и хлорида аммония, внесенных в среду в качестве дополнительных источников азота. Интересно, что эффект солей аммония на уровень синтеза субтилизиноподобных протеи паз В,amyloliquefaciens и В.pumitas, по-видимому, не зависит от природы аниона (рис. 3 а, б). Однако, уровень продукции глутамилэндонептидаз В,amylo!iquefaciens снижается на 60% в присутствии хлорида аммония, но повышается в присутствии цитрата аммония на 60-100% (рис. 3 в, г). Соли

Л 50

100

Б 50

(а)

□ Субткпизиноподобная иротсиназа J О Субтклюнноподобная протсниаза 2

1 3 5 Хтрид аммония

5 мМ

=••■>00 Й150

0 ¡100

1 50

с о

(б)

□ Су&тилшнноподобнш тфотамнаэа 1

□ Су бтилнзимоп одр о мая upo iCMHaia 2

■Э&

£ 1 i

гЬ

"XI f

.Tí

г£

5 мМ

Цитрат аммония

С-

250

6 200 ¡ 150

I 100

(в)

□ Глу тамилэшюпсгпнлаза Í Я Глутам идхтонелтнгдоа 2

I 3 5 Хлорид аммония Рис, 3. Влияние

л!

^200

¡150

i 100 Ё

6 50 о

Хлорид аммония Цитрат аммония

(г)

■ ГлутамШ1ЭНдоисгт|даза 2

1 3 5ыМ" I 3 5 I 3 5 мМ

Цитрат аммония Хлорид аммония Цитрат аммония

солей аммония на биосинтез сериновых протеин® В ату1оIк/не/ас¡епх (а, га) и В. ритНщ (б, г). За 100% принята продуктивность культуры на среде, не содержащей шлей аммония.

аммония гю-разному влияют на уровень накопления субтилизиноподобных протеииаз В.ритНих ранней и поздней стационарной фазы роста: практически не изменяют уровень синтеза протеиназы 1 и значительно стимулируют синтез протеиназы 2. Это может быть связано с тем, что на поздних стадиях развития культуры пул солей аммония, как легкометаболизируемых источников азота, исчерпан, и возникает необходимость усваивать более сложные субстраты, в том числе белки или пептиды. Для повышения продуктивности культуры целесообразно вносить в срсду 5 мМ хлорида аммония, так как это увеличивает продукцию глутамнлэндопентидазы 1 и субтилизипоподобной протеиназы 2 В.ритИих на 40-45% и 60-70% соответственно, 3-5 мМ цитрата аммония

повышают продукцию су бтил из и но п о доб п о й протеиназы 2 обеих культур на 30-70% и обеих глутамипэндопептидаз В. атуШщuefäciens на 60-100%,

Так как протсиназы являются ферментами деградации, то они могут подвергаться индукции субстратом. Нами выявлено, что 0,5% желатин способствовал увеличению продукции гл у там ил э идо п ептидаз ы 2 ß.pumilus на 30%. Однако, уровень синтеза субтшшз и но подобных протеиназ обеих культур не изменялся или снижался на 70-90% в присутствии желатина и казеина. Внесение в среду дрожжевого экстракта, являющегося источником аминокислот и витаминов, по-разному влияло на продукцию субтили зин о подобных протеиназ обеих культур. Так, синтез субтилизиноподобных протеиназ ß.pumilus интенсифицировался на среде с дрожжевым экстрактом (50-100%) (рис. 4), однако у В. amyloliquefaciens наблюдалась репрессия синтеза этих ферментов на 90%. По-видимому, снижение продуктивности протеиназ В.amyloliquefaciens и BpumiluS в присутствии желатина, казеина или дрожжевого экстракта обусловлено репрессией конечными продуктами азотного метаболизма. Таким образом, включение в состав питательной среды 0,5% дрожжевого экстракта целесообразно только в случае субтилизиноподобных Протеиназ и глутамилэндопептидазы ! B.pumilus.

250 , з, * 200 1 ,

§ 200 " И РЗ й § 150 - к *

| 150- £ ,

!>»■ 1» 8 ¿Ä Й Йч

I*|и1.Jl.Л. 1яI, I , В!

0,1 0,5 1,0 0,1 0,5 1,0

Казеин, желатин, дрожжевой экстракт, % Казеин, желатин, дрожжевой экстракт, %

Рис. 4. Влияний казеина (I), желатина (2) и дрожжевого экстракта (3) па продукцию субтилизиноподобных протеиназ 1 (а) и 2 (б) B.pumilus. За !00% принята продуктивность культуры на среде без белковых субстратов.

Данные по влиянию аминокислот на продукцию субтилизиноподобных протеиназ B.pumihts свидетельствуют о том, что эти соединения могут как активировать, так и ингибировать синтез протеиназ. Наибольший репрессирующий эффе кт оказывали глутамин и глутамат, что, по-видимому, связано с регуляцией синтеза фермента по типу репрессии конечным продуктом. Наиболее выраженный стимулирующий эффект оказывали 0,1% лейцина и 0,1% аспарагина. Активирующее действие аминокислот на биосинтез внеклеточных протеиназ у представителей рода Bacillus описан и другими авторами (Calik et al„ 2003).

Таким образом, влияние компонентой питательной среды на синтез того или иного внеклеточного фермента является сугубо индивидуальным и зависит как от комбинации факторов и их концентраций, так и от физиологических особенностей продуцента и стадии его развития. Полученные нами результаты

позволили разработать оптимальные питательные среды для продукции ферментов и значительно повысить выход протеиназ В.ату1оИцие/ас1ет и В.рит'йт (табл. 3).

Таблица 3. Питательные среды для эффективной продукции протеиназ B.amyloliquefaciens и B.pumilus

Протеиназа Оптимальная питательная среда Увеличение продукт-ти, %

Пептон г/л Неорг. фосфат, г/л Другие компоненты

В amyloliquefaciens Субтилизиноподобная протеиназа 1 Субтилизиноподобная протеиназа 2 23 0,24 цитрат аммония ЗмМ 250

23 0,3 - 250

Глутамилэндопептидаза 1 25 0,3 цитрат аммония ЗмМ 500

Глутамилэндопептидаза 2 18 0,38 цитрат аммония ЗмМ 500

--1 В pumilus Субтилизиноподобная протеиназа 1 35 0,35 дрож.экстракт 5 г/л 1000

Субтилизиноподобная протеиназа 2 26 0,32 хлорид кальция 1мМ 600

Глутамилэндопептидаза 1 42 0,2 дрож.экстракт 5 г/л 200

Глутамилэндопептидаза 2 45 0,4 дрож.экстракт 5 г/л 200

Получение рекомбинантных штаммов-продуцентов трансальдолазы B.subtilis и фруктозо-6-фосфат альдолазы E.coli

Альдолазы являются внутриклеточными белками и синтезируются клетками в небольшом количестве, поэтому для их препаративного получения мы использовали метод клонирования генов ферментов на векторах экспрессии. Ген трансальдолазы (tal) B.subtilis клонировали в рЕТ 22 — векторе экспрессии для E.coli с регулируемым промотором Т7. Поскольку известно, что экспрессия гена может интенсифицироваться при клонировании его в исходный штамм-продуцент, мы клонировали ген tal также в шаттл-векторе экспрессии pWHl 520 с сильным промотором ксилозного оперона Bacillus megaterium.

Ген фруктозо-б-фосфат альдолазы fsa A129S E.coli с заменой аминокислотного остатка аланина в позиции 129 на серии был получен М.Шурманн (Институт микробиологии г.Штутгарт, Германия). Предполагается, что эта замена привела к увеличению сродства фермента к дигидроксиацетону и, как следствие, к способности эффективно катализировать реакции с участием этого субстрата. Поскольку уровень экспрессии гена, клонированного ранее на векторе pUC19, был недостаточно высоким и не позволял получать фермент в препаративных количествах, возникла

необходимость переклонирования гена /заА 129Э на плазм иду, содержащую более сильный промотор. В качестве такого лектора нами был выбран вектор семейства рЛР, содержащий гибридный промотор с -10 последовательностью 1ас-промотора и —35 после до вате л юностью 1гр-промотора. Ген /заА 1295 был переклонирован с вектора рис на рЖ Результаты рестрикционного анализа полученных клонов для каждой конструкции представлены в таблице 4.

Таблица 4. Рестрикционный анализ полученных в работе плазмид

Плазм ид а Рестриктазы для анализа Фрагменты после рестрикции

(¡ET 22 tal Ndc!, Xhof Ndel или Xhol Два фрагмента - 5400 и 1000 к 6 Линейная молекула, 5400 кб

pWH 1520 tal Ndc! Spe 1 Три фрагмента-6946, 1027, 321 кб Линейная молекула, 8300 кб

pJF 119 EH fia AI29S HindIH, Xbai Hindlll или Xbal Два фрагмента - 5287 и 660 кб Линейная молекула, 5950 к б

Секвенирование генов tal И fia А129 S с полученных плазмид показало идентичность их последовательностей с известными из банка данных сайта www.ncbi.nlm.nih.gov. Это указывает на то, что мы получили корректные конструкции, несушис полные гены альдолаз.

Известно, что клонирование генов не всегда сопровождается активным Синтезом соответствующего целевого белка. Условия эффективной экспрессии нелепого белка индивидуальны для каждой полученной рекомбинантной ялазмиды. На следующем этапе работы мы исследовали экспрессию генов альдолаз в рекомбинантных штаммах E.coli и Bsitbtilis (рис. 5). Ген tal эффективно экс пресс и pon алея с вектора рНТ 22 в E.coli\ удельная активность фермента в клеточном экстракте составляла 2-3 ед'мг. В рекомбинантном

(а)

кДа

97.4

66.2 '-Ч

39.2

26.6 .г у

21.5

gÉÜÉ* ш

Ml 2 3

[Рис. 5. SDS-PAAG электрофорез внутриклеточных белков рекомбинатных штаммов E.coli, несущих ген гранеальдолазы (а) и фруктозо-6-фосфат-альдолазы A129S (б), (а) 1,2- E.co/i pET22(ai; 3 - E coU рЕТ22 (иегатишый контроль}, (ñ) 1 - E.coli p.lF/iaA ] 29S; 2, 3 - E.coli pJF (негативный контроль).

штамме E.coli с pJF/iaA129S регистрировался высокий уровень активности фруктозо-6-фосфат альдолазы A129S (25-28 ед/мг). Однако, нам не удалось получить эффективной экспрессии гена tal на шаттл-векторе pWH 1520 ни в клетках E.coli, ни в B.subtilis, поэтому в дальнейшей работе эта конструкция не использовалась.

Уровень синтеза белков может зависеть от концентрации индуктора в среде, а также от времени индукции. Эффективная индукция экспрессии гена tal наблюдалась при внесении в среду культивирования 1 мМ IPTG, а увеличение концентрации IPTG до 5 мМ практически не меняло уровень продукции ферментов, поэтому в дальнейшем мы использовали индуктор в концентрации 1мМ. Время индукции индивидуально для каждой плазмиды (рис. 6). Для рЕТ22 tal оптимальным оказалось 3-4 часа после добавления 1PTG; однако через 6-8 часов индукции специфическая активность в клеточном экстракте снижалась. Для pJFl 19/SaA129S оптимальное время индукции составило 6 часов. Переклонирование гена /saA129S с плазмиды pUC на pJF позволило нам увеличить уровень специфической активности в 3-4 раза.

время, ч время, ч

Рис. 6. Влияние продолжительности индукции на уровень экспрессии генов трансальдолазы B.subtilis (а) и фруктозо-6-фосфат-альдолазы A129S (б) в рекомбинантных штаммах Ecoli.

(а)1 - E.coli рЕТ22tal, 2-Ecoli рЕТ22 (негативный контроль),

(б)1 - E.coli pJF/SaA129S, 2 - Ecoli pJF (негативный контроль).

Таким образом, нами получены рекомбинантные штаммы Ecoli с высоким уровнем продукции трансальдолазы B.subtilis и фруктозо-б-фосфат-альдолазы A129S E.coli.

Выделение и очистка сериновых протеиназ и альдолаз

Сериновые протеиназы ранней и поздней стационарной фазы роста выделяли из культуральной жидкости В amyloliquefaciens и B.pumilus с помощью ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе и хроматографии на колонке Mono-S в системе FPLC. После хроматографии на MonoS были получены две белковые фракции, которые по гидролизу синтетических хромогенных субстратов были идентифицированы как глутамилэндопептидаза и субтилизиноподобная протеиназа (рис. 7а, б). Так как в результате одностадийной высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке MonoS препараты белков были негомогенными, проводили рехроматографию в тех же условиях. За три стадии очистки получили белки со степенью очистки

Л!»Т 0.1

0,2

(а)

а» 0,5 0,4 0,3

(б)

(В)

0.2

NnCI, М 0,1 0.05

жж

IT.CM JJÍHHIHH. мл

I Na

Nail M ■0,1 O.OÍ

Обьсч v:K:;i;:;i mji

протеиназы в. arnyloliquefaciens t ' кД| 31 кДа45! Зб^^ШЩдЛ * Ш протеиназы В pumilus

30 кДа • *26 кДг

Í6Í

1 2 3 4 M 5 6 7 R Рис. 7, Хроматографические профили субтилизиноподобкой протеиназы 1 (а) к глутамшадокдопептидазы 1 (б) ti.amyloliquefacie.ns на колонке Mono К и SDS-PAAG электрофорез протеиназ В. amyloliqmfaciens и В. pumilus (в). I - Л;8о, II - [радист' NaCI (0-0,5М);

1, 2, 3; 4 - глугамилэндопептидазы I и 2, субтилизинеподобные протеи назы I и2 B.amytoliquefaciens, 5, 6, 7, 8 - глутамилэндолептидазы 1 и 2, субтилизииопйжЙные протеиназы 1 и 2 B.pumilus соответственно.

500-800, гомогенность ферментов подтверждена электрофоретически (рис. 7 в). Молекулярные массы протеиназ, «третируемых на разных стадиях развития культуры, идентичны и равны 30 и 31 кДа для субтилизиноподобных протеиназ, 26 и 26,5 кДа мя гпутамкпзндопееггидаз Bamyloliquefacieris и В. pumilus.

Для выделения Внутриклеточных альдол&з из рекомбинантных штаммов E.coli использовали метол хроматографии на Q-сефарозе в системе FPLC и последующей гельфильтрацией (в случае транеальдолазы B.subtilis) или хроматографии на колонке с гидроксиапаз итом (для фруктозо-б-фосфат-альдолазы E.coli). В результате получены препараты альдолаз с выходом ферментов 60-70%. Эпектрофоperкчсск ий анализ подтвердил гомогенность транеальдолазы (рис 8а). В результате двухстацийной очистки получен высокое чищенный препарат фруктозо-6-фосфат-альдолазы A129S (рис. 8 б).

кДа 97,4 66,2

39,2 26,6

21,5 14,4

М 1 2 3 1 М 2 3 4

Рис, 8. SDS-PAAG электрофорез транеальдолазы B.subHlis (а) и фруктою-6-фосфах-аяьдолазщ A129S (О) из рекомбйнантиых штаммов E.coli в процесса очистки.

(а) 1 - клеточный экстракт; 2 - фракция после Q-сефарозы, 3- фракция поеле гель-фильтрация;

(б) 1 - клеточный экстракт; 2, 3 - фракции после Q-сефарозы, 4 - фракция после гидроксишатита.

Характеристика сериновых протеиназ и альдолаз

С помощью специфических ингибиторов подтверждена принадлежность исследуемых ферментов B.amyloliquefaciens и B.pumilus к классу сериновых протеиназ. Энзиматические свойства протеиназ представлены в таблице 5. рН-оптимум и рН-стабильность ферментов сходны с известными для других сериновых протеиназ. Интересно, что температурные оптимумы субтилизиноподобных протеиназ B.amyloliquefaciens (37°) и B.pumilus (30°) ниже, чем для известных субтилизинов (Peng, 2003; Huang et al., 2003).

Таблица 5. Энзиматические свойства сериновых протеиназ В amyloliquefaciens и B.pumilus

Фермент Субтилизиноподобные протеиназы В amyloliquefaciens Субтилизиноподобные протеиназы B.pumilus Глутамил-эндопептидазы B.amyloliquefaciens

Свойства 1 2 1 2 1 2

рН- оптимум 8,5 9,0 8,5 8,2-8,5 8,2-8,5 8,0

рН- стабильность 7,2-9,5 7,2-9,5 7,0-10,0 7,0-10,0 7,2-9,5 7,2-8,5

Температурный оптимум 37° 37° 30° 30° 45° 45°

Термостабильность 22-45° 22-45° 22-45° 22-45° 22-45° 22-45°

Необходимо отметить, что субтилизиноподобные протеиназы B.pumilus обладают протеолитической активностью даже при низких температурах, особенно протеиназа 2, которая сохраняет до 40% активности при температуре +3°. При +10-15° оба фермента сохраняют до 60-80% активности. Интересно, что сходная закономерность характерна и для сериновой протеиназы из психрофильной бактерии Colwellia sp. NJ341 (Wang et al., 2005). Исследуемые нами ферменты В amyloliquefaciens и B.pumilus не отличаются высокой термостабильностью.

Исследование субстратной специфичности субтилизиноподобных протеиназ 1 и 2 B.amyloliquefaciens и B.pumilus показало, что ферменты не гидролизуют специфические субстраты глутамилэндопептидаз (Z-Glu-pNA) и тиоловых протеиназ (Glp-Phe-Ala-pNA). Максимальная активность наблюдается при гидролизе специфических субстратов субтилизиноподобных протеиназ - Glp-Ala-Ala-pNA, Z-Ala-Ala-Leu-pNA, где в положении Р1 находится остаток Ala или Leu, причем остаток Ala играет, по-видимому, определяющую роль в процессе гидролиза, что характерно и для других субтилизиноподобных протеиназ (Люблинская с соавт., 1987, Балабан с соавт., 2004). Удельная активность субтилизиноподобных протеиназ B.amyloliquefaciens и Bpumilus различается при гидролизе синтетических субстратов. Так, для протеиназ B.amyloliquefaciens остаток Phe в положении Р1 (Glp-Ala-Phe-pNA) является наименее предпочтительным, тогда как протеиназа 1 B.pumilus в 2 раза более активна в отношении этого субстрата (табл. 6).

Таблица 6. Субстратная специфичность субтилизиноподобных протеиназ B.amyloliquefacies и B.pumilus на синтетических субстратах

Субстраты Удельная активность, мкмоль/мг

Субтилизин nporei B.amylolic оподобные 1назы mefaciens Субтилизиноподобные протеиназы В pumilus

1 2 1 2

Z-Ala-AIa-Leu-pNA 11 19 0,93 0,78

Glp-Ala-Ala-pNA 31 36 1,85 4,4

Glp-Ala-Phe-pNA 0 0 0 0

Z-Pyr- Pbe-Ala-pNA 0,1 0,2 0,35 0,3

Z-Gly-AIa-Phe-pNA 0 0 0,13 0,04

Z-Ala-Ala-Pro-pNA 0 0 0,033 0,01

Исследование субстратной специфичности глутамилэндопептидаз 1 и 2 B.amyloliquefaciens свидетельствует о том, что эти ферменты проявляют предпочтение к связям, образованным глутаминовой, а не аспарагиновой кислотой, что характерно для ферментов этой группы (Nienaber et al., 1993; Leshchinskaya et al., 1997) (табл. 7).

Таблица 7. Субстратная специфичность глутамилэндопептидаз В. amyloliquefacierts на синтетических субстратах

Удельная активность мкмоль/мг

Субстрат Глутамил- Глутамил-

эндопептидаза 1 эндопептидаза 2

Z-Ala-Ala-Met-Glu-pNA 4,8971 10,338

Z-Ala-Ala-Trp-Glu-pNA 3,0882 3,9054

Z-Ala-Ala-Phe-Glu-pNA 8,9779 17,243

Z-Ala-AIa-Leu-Glu-pNA 11,753 20,095

Z-Ala-Ala-GIu-pNA 3,2 7,05

ZrGlu-pNA 0,7647 1,1081

Z-A!a-Ala-Trp-Asp-pNA 0,2176 0,2162

Z-Ala-Ala-Leu-Asp-pNA 0,1471 0,1216

Z-Ala-Ala-Phe-Asp-pNA 0,0897 0,0757

Z-Gly-Ala-Ala-Asp-pNA 0,3235 0,4054

В связи с распространением заболеваний, связанных с тромбообразованием, в настоящее время проводится активный поиск ферментов, способных эффективно лизировать тромбы. Мы исследовали фибринолитические, тромболитические и антикоагулянтные свойства протеиназ В.ату1о\'щие}ас\ет Н2 и ВритИиз КММ 62. Субтилизиноподобные протеиназы В.ату1оЩие/аЫет обладают высокой фибринолитической активностью в сравнении с другими известными ферментами (рис. 9 а). Интересно, что узкоспецифичные глутамилэндопептидазы В amyloliquefaciens также лизируют фибрин (128 и 104 ед/мг).

Фибринолитическая активность, сл/мг 800

(а)

600

400

200

13 рем я лизиса тромба, мин 250 1

(б)

[Ь

12 3 4 5 тр омбол ити ческая

6 7 Я (б) активность

12 3 4 5 6 Рис. 9. Фи бри политическая (а) сериновых протеи ii аз. 1,2- субтилизиноподобная протеиназа I и 2 В. amyloliquefiiciens, 3-субтилиэиноподаЩая протеиназа I В.intermedins, 4 - протеиназа ThermoactinomyCes vulgaris, 5, 6 - глутамиЛЭ1 щопептидазы 1 и 2 В.amyloliquefaciens, 7, 8 - су бтилз и но подобные протеи пазы ] и 2 B.pumilus.

Исследование тр о мбол ити чес к и х свойств протеинам Д amy}оНц tiej'ac ie ns и B.pumilus показало, что все исследуемые протеиназы в высоких концентрациях (1 мг/мл) эффективно лизировали тромб, при этом наибольшей активностью обладали субти л изиноподобные протеи пазы B.pumilus (1 ч 20 мин и 1 ч), а наименьшей — глутамилэндопептидазы B.amylotiquefaciens (3 ч и 4,5 ч) (рис. 96). Следует отметить, что тромболитичеекая активность исследуемых протеиназ сравнима с активностью известных ферментов Th.vulgaris и B.intermedius (Люгова с соавт., 1990; Ицкович с соавт., 1997). Протеиназы B.pumilus лизируют тромб в низких концентрациях (25-100 мкг/мл), что важно с точки зрения минимизации побочных токсических эффектов. Все исследованные протеиназы и концентрации 0,5-1 мг/мл обладали выраженными анти ко а гу ля нтн ы м и свойствами, сопоставимыми с таковыми для субтилизиноподооной протеиназы В.intermedins (Ицкович, 1997). Полученные данные указывают на перспективность применения протеиназ B.amyloliquefaciens и B.pumilus в качестве тро м б од ит ических препаратов.

Использование протеиназ в качестве катализаторов образования пептидной связи является приоритетным направлением современной химии пептидов. Преимуществами синтеза с участием протеиназ является отсутствие рацемации, возможность работы с минимальным числом защитных группировок, высокая скорость протекания реакций. Иа примере образования пептида Z-Ala-Ala-Leu-pNA из Z-Ala-Ala-ОСПЗ и Leu-pNA в настоящей работе впервые показано, что субти лизиноподобные протеиназы B.amyloliquefaciens способны катализировать синтез пептидных связей с высоким выходом конечного продукта (45%). Полученный трипептид является специфическим хромогенньш субстратом субтилизиноподобных протеиназ и широко применяется для идентификации протеолитических ферментов.

Подобно протеи назам, альдодазы также способны катализировать как прямую, так и обратную реакцию конденсации. Эти ферменты могут как расщеплять, так и синтезировать С-С связи, что позволяет использовать их в

синтезе ряда сахаров-предшественников промышленно важных соединений. Так, продукт альдозной реакции - ксилулоза - применяется в получении ксилита или ксилозы (антифунгицидный препарат) (Kwon et al., 2005; Lu et al., 2003; Takahata et al., 2003). Получение ксилулозы из недорогих субстратов является важной биотехнологической проблемой, которая может быть решена благодаря использованию бактериальных альдолаз с разной субстратной специфичностью.

Ранее для трансапьдолазы В из E.coli показано, что этот фермент способен синтезировать кето-сахара из фруктозо-6-фосфата и формальдегида. Поскольку трансальдолазы обладают сходной специфичностью, нами была исследована способность трансальдолазы B.subtilis, выделенной из рекомбинантных клеток E.coli, к синтезу Сахаров, в частности, ксилулозы. С использованием метода HPLC, нами было показано, что трансальдолаза B.subtilis эффективно катализирует синтез ксилулозы из фруктозо-6-фосфата и гликольальдегида с выходом продукта не менее 60% (рис. 10).

Д|90

6,0 10,0 14.0 18,0 22,0 26,0 30,0

Время элюции, мин

"6.0 Í0.O Т'Г.О '1' 18,0" 22,0 26,0 J0,« Время элюции, мин

Рис. 10. Хроматографические профили реакционной смеси, содержащей фруктозо-6-фосфат (Ф6Ф) и гликольальдегид (ГА), через 24 ч после инициации реакции (в системе НРЬС) (ГАФ - побочный продукт реакции глицеральдегидфосфат).

(а) - в присутствии трансальдолазы В^иЫПЫ,

(б) - в отсутствие трансальдолазы В.зиЫШь (негативный контроль).

Однако используемые в этой реакции фруктозо-6-фосфат и гликольальдегид характеризуются высокой стоимостью. При масштабировании процесса для достижения экономической рентабельности производства необходимо использовать недорогие субстраты. Поэтому в качестве субстратов для синтеза ксилулозы мы взяли дигидроксиацетон и гликольальдегид. Анализ продуктов после окончания реакции (через 24 ч) выявил низкую эффективность синтеза ксилулозы, конечная концентрация которой составляла 8 мМ. Это позволяет нам сделать вывод о низком сродстве трансальдолазы В.йиЫШй к дигидроксиацетону.

Ранее в лаборатории проф. Шпренгера доктором М.Шурманн (Институт микробиологии, г. Штутгарт, Германия) была получена мутантная форма фруктозо-6-фосфат-апьдолазы с аминокислотной заменой в А129Б в активном центре. Предполагалось, что эта замена может привести к увеличению сродства фермента к дешевому дигидроксиацетону. Для выяснения этого вопроса мы

исследовали способность этого фермента к синтезу ксилулозы из дигидроксиацетона и гликольальдегида. Нами показано, что фруктозо-6-фосфат- альдолаза А1295 гораздо эффективнее катализировала эту реакцию, нежели неизмененный фермент дикого типа. При участии белка с мутацией удалось получить 95 мМ ксилулозы, тогда как в тех же условиях с помощью неизмененной фруктозо-6-фосфат-альдолазы синтезировалось всего 10 мМ продукта (рис. 11).

(а)

(б)

А190' 0^

Ofi 0,4

Ofl

^ Дигидрокси-

I ацетон

Ксилулоза 1

(10 мМ)

4 \ V_______

ifi

A|% 0,8'

0 А

0,4

0,3 0 P

Ксилулоза (95 мМ) 1 Дигидрокси-1 ацетон \ ^

. J и С.

30 fi

10,0 13 J0 iOfl 25 p 30J0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0

Время элюции, мин Время элюции, мин

Рис. 11. Хроматографимеские профили реакционной смеси, содержащей дигидроксиацетон и гликольальдегид, через 24 ч после инициации реакции (в системе HPLC).

(а) - в присутствии фруктозо-6-фосфат-альдолазы WT (дикого типа) E.coli,

(б) - в присутствии фруктозо-6-фосфат-альдолазы A129S Е. coli.

Итак, фруктозо-6-фосфат-альдолаза A129S является эффективным катализатором синтеза ксилулозы и способна использовать дигидроксиацетон в отличие от фруктозо-6-фосфат-альдолазы.

Таким образом, использование различных подходов для повышения биосинтетической активности штаммов-продуцентов позволило нам получить внеклеточные сериновые протеиназы бацилл и внутриклеточные альдолазы из рекомбинантных штаммов E.coli в препаративных количествах и изучить их свойства. Показано, что исследуемые ферменты обладают рядом практически важных свойств, что делает их перспективными для использования в различных областях. Так, благодаря узкой субстратной специфичности, глутамилэндопептидазы B.amyloliqaefaciens и Вpumilus могут быть применены для секвенса белков и пептидов. Высокая тромболитическая активность субтилизииоподобных протеиназ определяет возможность использования этих ферментов в качестве тромболитических препаратов. Полученные нами результаты по исследованию ксилулозосинтетической активности апьдолаз показали, что фруктозо-6-фосфат-альдолаза A129S E.coli является более эффективным катализатором синтеза ксилулозы из недорогих субстратов, что может быть принципиально важным при крупномасштабном производстве кето-сахаров.

Выводы

1. Бактерии В.атуТоИциг/аЫепз Н2 и В.ритИих К.ММ62 секретируют в культуральную среду субтилизиноподобные протеиназы и глутамилэндопептидазы с двумя максимумами накопления активности в раннюю и позднюю стационарную фазу роста. Подобран состав питательной среды, обеспечивающий высокий уровень активности протеиназ в культуральной жидкости на разных стадих роста.

2. Получены рекомбинантные штаммы Е.соИ ВЬ21(БЕЗ) рЬувБ рЕТ22/а/ и Е.соИ ОН5а р1Р1 \9fsa с высоким уровнем продукции альдолаз. Подобраны условия для эффективной экспрессии соответствующих генов.

3. Из культуральной жидкости В ату1оЩие/ас'1ет и В.ритИш получены сериновые протеиназы в гомогенном состоянии со степенью очистки 500-800. Из рекомбинантных клеток Е.соИ выделены трансапьдолаза в гомогенном состоянии и высокоочищенный препарат фруктозо-6-фосфат-апьдолазы А129Б со степенью очистки 5-6 и выходом 60-70%.

4. Показано, что исследуемые ферменты В.атуШщие/аЫепя и ВритИт по типу ингибирования относятся к классу сериновых протеиназ. Определены энзиматические свойства и субстратная специфичность протеиназ В.ату1оГщие/аает и В.ритИиь. Ферменты обладают высокой фибринолитической, тромболитической и антикоагулянтной активностью. Субтилизиноподобные протеиназы В.атуМ'щие/аает обладают пептидсинтетической активностью.

5. Показана способность альдолаз к образованию ценного в практическом отношении сахара ксилулозы из различных субстратов. Установлено, что при синтезе ксилулозы из дигидроксиацетона и гликольальдегида с применением фруктозо-6-фосфат-альдолазы А129Б выход конечного продукта в 10 раз выше, чем при использовании нативного фермента.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Balaban N.P. Selection of cultivation medium for production of late phase serine proteinases from B.intermedius / N.P. Balaban, L.A. Gabdrahkmanova, M.R. Sharipova, A.M. Mardanova, E.A. Sokolova, L.A. Malikova, I.B. Leshchinskaya // J. Basic Microbiol. - 2004. - V. 44. -№6.-P. 415-423.

2. Балабан Н.П. Получение и характеристика субтилизиноподобных протеиназ, секретируемых в стационарную фазу роста Bacillus amyloliquefaciens Н2. / Н.П. Балабан, JI.A. Маликова, А.М. Марданова, Г.Н. Руденская, М.Р. Шарипова // Биохимия - 2007. - Т. 72. - Вып. 4. -С. 568-575.

3. Маликова JI.A. Условия биосинтеза внеклеточной субтилизиноподобной протеиназы Bacillus pumilus КММ62. / JI.A. Маликова, A.M. Марданова, O.B. Соколова, Н.П. Балабан, Г.Н. Руденская, М.Р. Шарипова // Микробиология - 2007. - Т. 76. -Вып. 3. - С. 1-8.

4. Маликова Л.А. Особенности биосинтеза внеклеточных субтилизиноподобных протеиназ, секретируемых Bacillus pumilus КММ 62. / Л.А. Маликова, A.M. Марданова, О.В. Соколова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова // Ученые записки Казанского государственного университета, сер. «Естественные науки» - 2006. - Т. 148. - Кн. 2. -С. 90-101.

5. Маликова Л.А. Питательная среда для эффективной продукции глутамилэндопептидаз, секретируемых в стационарной фазе роста Bacillus amyloliquefaciens Н2. / Л.А. Маликова, Н.П. Балабан, Л.А Габдрахманова, A.M. Марданова, М.Р. Шарипова // Ученые записки Казанского государственного университета, сер. «Естественные науки» -2007.-Т. 49.-Кн. 1.-С. 102-112.

6. Михайлова Е.О. Влияние dj - факторов на рост культуры и продукцию субтилизина рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / Е.О. Михайлова, Л.А. Маликова, Н.В. Феоктистова, A.M. Марданова // Сборник статей «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». - Казань, 2004. - С. 82-85.

7. Михайлова Е.О. Биосинтез субтилизиноподобных протеиназ Bacillus pumilus КММ 62 / Е.О. Михайлова, Л.А. Маликова, А.Р. Сабирова, A.M. Марданова II Сборник статей «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». - Казань, 2004. - С. 121-124.

8. Маликова Л.А. Биосинтез субтилизинодобных протеиназ Bacillus amyloliquefaciens / Л.А. Маликова, A.M. Яхъяев, Н.П. Балабан // Сборник тезисов 7-й международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино, 2003. - С. 65.

9. Маликова Л.А., Влияние компонентов питательной среды на накопление субтилизинов в культуральной жидкости Bacillus amyloliquefaciens / Л.А. Маликова, Н.П. Балабан // Тезисы докладов III

конференции научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века". - Казань, 2003. - С. 54.

10. Шамсутдинов Т.Р. Выделение и характеристика субтилизинов Bacillus amyloliquefaciens / Т.Р. Шамсутдинов, JI.A. Маликова, Н.П. Балабан // Тезисы докладов IV конференции научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века". - Казань, 2004. - С. 84.

П.Тимофеева Т.А. Субтилизины Bacillus pumilus / Т.А. Тимофеева, Е.О. Михайлова, О.М. Суетина, JI.A. Маликова // Тезисы докладов IV конференции научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века". - Казань, 2004. - С. 80.

12. Маликова Л.А. Выделение и характеристика внеклеточных сериновых протеиназ Bacillus amyloliquefaciens / Л.А. Маликова, Т.Р. Шамсутдинов, А.М. Марданова, Н.П. Балабан // Материалы XI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2004". - Москва, 2004. - С. 28.

13. Маликова Л.А. Сериновые протеиназы Bacillus amyloliquefaciens / Л.А. Маликова, Н.П. Балабан // Материалы XLII международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс". - Новосибирск, 2004. - С. 37-38.

И.Михайлова Е.О. Сериновые протеиназы Bacillus pumilus / Е.О. Михайлова, О.М. Суетина, Л.А. Маликова // Материалы XLII международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс". - Новосибирск, 2004. - С. 22-23.

15. Маликова Л.А. Субтилизины Bacillus amyloliquefaciens / Л.А. Маликова, Н.П. Балабан // Материалы 8-й международной школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века». — Пущино, 2004.-С. 45.

16. Маликова Л.А. Оптимизация синтеза, получение и характеристика субтилизинов, продуцируемых на разных фазах роста Bacillus amyloliquefaciens / Л.А. Маликова, Т.Р. Шамсутдинов, Н.П. Балабан, A.M. Марданова, М.Р. Шарипова // Материалы конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». — Казань, 2004. - С. 53-54.

17. Маликова Л. А Субтилизиноподобные протеиназы Bacillus amyloliquefaciens / Л.А. Маликова, Т.Р. Шамсутдинов, Г.Н. Руденская, A.M. Марданова, Н.П. Балабан // Материалы XIII международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение». - Казань, 2005. - С. 55-56.

18. Маликова Л.А. Сериновые протеиназы Bacillus pumilus, секретируемые в позднюю стационарную фазу роста / Л.А. Маликова, О.В. Соколова, A.M. Марданова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова // Материалы XIII международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение». - Казань, 2005. - С. 57-58.

19. Соколова О.В. Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus pumilus, секретируемая в позднюю стационарную фазу роста. 1 О.В. Соколова,

JI.A. Маликова, A.M. Марданова // Тезисы докладов V конференции научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века". - Казань, 2005. - С. 80.

20. Соколова О.В. Влияние экзогенных факторов на биосинтез субтилизина Bacillus pumilus. / O.B. Соколова, JI.A. Маликова, Т.А. Тимофеева, A.M. Марданова // Тезисы докладов V конференции научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века". -Казань, 2005. - С. 86.

21. Маликова J1.A. Тромболитические и антикоагулянтные свойства сериновой протеиназы, секретируемой Bacillus amyloliquefaciens in vitro. / JI.A. Маликова, Г.Н. Руденская, JI.B. Лютова, A.M. Марданова II Сборник тезисов докладов 79-ой Всероссийской студенческой научной конференции. - Казань, 2005. - С. 109.

22. Маликова JI.A. Особенности контроля биосинтеза субтилизинов, секретируемых Bacillus pumilus КММ 62 / JI.A. Маликова, Т.Р. Шамсутдинов, О.В. Соколова, A.M. Марданова // Материалы 9-й международной школы-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века». - Пущино, 2005. - С. 201.

23. Соколова О.В., Подбор питательной среды для эффективной продукции протеиназ, секретируемых Bacillus pumilus КММ 62. / О.В. Соколова, Т.С. Тимофеева, JI.A. Маликова, A.M. Марданова // Материалы 9-й международной школы-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века». - Пущино, 2005. - С. 213.

24. Соколова О.В. Влияние экзогенных факторов на биосинтез субтилизина Bacillus pumilus / О.В. Соколова, JI.A. Маликова, A.M. Марданова II Тезисы докладов V конференции научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века". - Казань, 2005. - С. 80.

25. Маликова Л.А. Антикоагулянтная и тромболитическая активности субтилизиноподобных протеиназ, секретируемых Bacillus pumilus КММ 62. / JI.A. Маликова, О.В. Соколова, A.M. Марданова, Н.П. Балабан // Материалы V Республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес». — Казань, 2005.-С. 79.

26. Маликова JI.A. Очистка, характеристика и тромболитические свойства субтилизиноподобной протеиназы Bacillus pumilus КММ 62 / Л.А. Маликова, О.В. Соколова, A.M. Марданова // Тезисы докладов VI конференции научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века". - Казань, 2006. - С. 103.

27. Маликова JI.A. Создание генетических конструкций, обеспечивающих суперпродукцию бактериальных ферментов с практически ценными свойствами. / Л.А. Маликова, Г.А. Шпренгер // Сборник материалов научного семинара стипендиатов программы Михаил Ломоносов 2005/06 года. - Москва, 2006. - С. 122-125.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательского центра Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина Тираж 100 экз. Заказ 3/72

420008, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел.: 231-53-59,292-65-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Маликова, Лилия Александровна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.И

1. Сериновые протеиназы.И

1.1. Характеристика и классификация субтилизиноподобных протеиназ.

1.2. Субтилизины и субтилизиноподобные протеиназы бацилл.

1.3. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов - новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ.

2. Функциональная роль внеклеточных протеиназ микроорганизмов.

3. Особенности биосинтеза бактериальных протеиназ.

4. Применение протеолитических ферментов.

5. Бактериальные альдолазы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Протеиназы и альдолазы: принципиальные подходы к получению практически значимых бактериальных ферментов"

Актуальность проблемы. Ферментные препараты, обладающие высокой активностью и специфичностью, являются неотъемлемой частью современных биотехнологических процессов, обеспечивая их эффективность и экологическую безопасность. Альдолазы и протеиназы представляют собой уникальные биологические катализаторы, способные осуществлять реакции расщепления и синтеза молекул. Альдолазы - это эффективные инструменты для синтеза различных Сахаров - предшественников в получении ксилита, некоторых лекарственных, антифунгицидных препаратов и других соединений, используемых в промышленности. Среди альдолаз особый интерес представляют фруктозо-6-фосфат-альдолаза E.coli и трансальдолаза B.subtilis, способные использовать в синтезе различных кето-сахаров недорогой дигидроксиацетон, в отличие от других альдолаз, утилизирующих дорогостоящий фосфодигидроацетон (Schurmann et al., 2002). Одну из важнейших групп индустриальных ферментов представляют протеиназы микроорганизмов, широко используемые в различных областях промышленности, медицины и молекулярной биологии (Gupta et al., 2002; Rao et al., 1998). Интересна способность протеиназ к синтезу олигопептидов, поскольку направленный ферментативный синтез пептидной связи имеет ряд преимуществ перед химическим синтезом. Бактерии B-.amyloliquefaciens и B.pumilus являются известными продуцентами сериновых протеаз, в частности, субтилизиноподобных протеиназ, имеющих практическую ценность. Гены некоторых из них клонированы и секвенированы (Wells et al., 1983; Hung et al., 2003; Aoyama et al., 2000a; Pan and Huang, 2004). Однако недостаточно исследованы тромболитические, антикоагулянтные, пептидсинтетические свойства, а также закономерности биосинтеза внеклеточных протеиназ этих бацилл.

Целью работы явилось выделение и характеристика внеклеточных протеиназ из природных штаммов B.amyloliquefaciens и B.pumilus и внутриклеточных альдолаз из рекомбинантных штаммов E.coli с использованием подходов, основанных на оптимизации условий биосинтеза ферментов и генно-инженерных модификациях продуцентов.

Основные задачи исследования:

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнялась в соответствии с планом НИР КГУ (№ государственной регистрации 01.2.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Научные исследования поддержаны грантами РФФИ 01-04-48037, 05-04-48182, АН РТ фонда НИОКР 03-3.10-295, 03-3.5-20, программой CRDF Rec 007, совместной программой ДААД и Минобрнауки РФ «Михаил Ломоносов» А/05/3903. Все исследования, представленные в работе, выполнены автором.

Положения, выносимые на защиту:

2. Использование технологии клонирования генов трансальдолазы B.subtilis на рЕТ 22 и фруктозо-6-фосфат-альдолазы A129S E.coli на векторе pJFl 19ЕН позволяет получить продуценты с высоким уровнем синтеза ферментов.

3. Выделенные ферменты обладают практически значимыми свойствами: протеиназы B.amyloliquefaciens и B.pumilus - фибринолитической, тромболитической, антикоагулянтной активностью; субтилизиноподобные протеиназы B.amyloliquefaciens -пептидсинтетической активностью, трансальдолаза и фруктозо-6-фосфат- альдолаза- ксилулозо-синтетической.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 научных работ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Маликова, Лилия Александровна

выводы

1. Бактерии B.amyloliquefaciens Н2 и B.pumilus КММ62 секретируют в культуральную среду субтилизиноподобные протеиназы и глутамилэндопептидазы с двумя максимумами накопления активности в раннюю и позднюю стационарную фазу роста. Подобран состав питательной среды, обеспечивающий высокий уровень активности протеиназ в культуральной жидкости на разных стадих роста.

2. Получены рекомбинантные штаммы E.coli BL21(DE3) pLysS pET22ta/ и E.coli DH5a pJF119/stfA129S с высоким уровнем продукции альдолаз. Подобраны условия для эффективной экспрессии соответствующих генов.

3. Из культуральной жидкости B.amyloliquefaciens и B.pumilus получены сериновые протеиназы в гомогенном состоянии со степенью очистки 500-800. Из рекомбинантных клеток E.coli выделены трансальдолаза в гомогенном состоянии и высокоочищенный препарат фруктозо-6-фосфат-альдолазы A129S со степенью очистки 5-6 и выходом 60-70%.

4. Показано, что исследуемые ферменты B.amyloliquefaciens и B.pumilus по типу ингибирования относятся к классу сериновых протеиназ. Определены энзиматические свойства и субстратная специфичность протеиназ B.amyloliquefaciens и B.pumilus. Ферменты обладают высокой фибринолитической, тромболитической и антикоагулянтной активностью. Субтилизиноподобные протеиназы B.amyloliquefaciens обладают пептидсинтетической активностью.

5. Показана способность альдолаз к образованию ценного в практическом отношении сахара ксилулозы из различных субстратов. Установлено, что при синтезе ксилулозы из дигидроксиацетона и гликольальдегида с применением фруктозо-6-фосфат-альдолазы A129S выход конечного продукта в 10 раз выше, чем при использовании нативного фермента.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю кандидату биологических наук, доценту A.M. Мардановой за внимательное отношение к работе; кандидату биологических наук Н.П.Балабан и профессору М.Р. Шариповой - за консультации по проведению экспериментов и критические замечания. Данные по субстратной специфичности, ингибиторному анализу протеиназ, пептидному синтезу получены автором на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ под руководством профессора Г.Н. Руденской, за что автор выражает особую благодарность. Автор благодарит профессора Шпренгера за предоставление возможности проведения экспериментов по исследованию альдолаз на базе Института микробиологии г.Штутгарта (Германия). Автор выражает искреннюю благодарность заведующей кафедрой микробиологии Казанского университета проф. О.Н. Ильинской и сотрудникам кафедры микробиологии за помощь и теплую рабочую атмосферу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сериновые протеиназы бактерий - одна из наиболее изучаемых групп протеолитических ферментов. В состав этого класса входит семейство субтилизиноподобных ферментов, нашедших широкое применение в различных областях, а также интересная группа протеиназ -глутамилэндопептидазы, обладающие узкой субстратной специфичностью, что делает их чрезвычайно удобными в исследованиях белков и пептидов. Известна структура этих ферментов, их физические и химические свойства. Функции протеиназ весьма разнообразны; доказано участие этих ферментов в катаболизме белков, процессах патогенеза, процессинге белков, клеточной дифференциации и т.д. Обсуждается возможность участия секретируемых протеолитических ферментов в регуляции клеточного метаболизма и в реакциях адаптации на стрессовые условия среды. Закономерности биосинтеза протеиназ в бактериальных клетках к настоящему времени малоизучены. По-видимому, синтез протеиназ может регулироваться углеродной и азотной катаболитной репрессией, а также по механизму индукции субстратом или репрессии конечным продуктом. Одной из перспективных областей применения протеиназ является создание тромболитических препаратов на основе этих ферментов, в связи с чем получение высокоэффективных продуцентов протеиназ остается актуальной проблемой биотехнологии и микробиологии.

Другой чрезвычайно интересной и перспективной с практической точки зрения группой ферментов является класс внутриклеточных бактериальных альдолаз. Подобно протеиназам, которые могут не только гидролизовать, но и синтезировать пептидные связи, альдолазы способны к образованию С-С-связей и стереоселективному синтезу Сахаров из различных компонентов. Особый практический интерес представляют фруктозо-6-фосфат-альдолаза E.coli и трансальдолаза B.subtilis, способные использовать при синтезе Сахаров в качестве субстратов недорогие соединения.

Различная внутриклеточная локализация, особенности биосинтеза в бактериальных клетках определяет выбор стратегии при получении высокоэффективных продуцентов этих ферментов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И'МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Штаммы и плазмиды. В работе использовались следующие штаммы: B.amyloliquefaciens Н2, B.pumilus КММ62, выделенный из морской воды, B.subtilis 168 (trpC2) из коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии Казанского государственного университета. Штаммы E.coli BL(DE3)pLysS (F-, ompT, hsdSB(rB~, mB~), gal, dcm (DES), pbysS(CamR)) (несет плазмиду plysS с геном лизоцима), E.coli DH5a (F-, q80dlacZ /Ш15 (,AlacZYA-argF)U169, deoR, recAlendAl, hsdR17(rk~, m^), phoA supE44, X, thi-1, gyrA96, relAl), («Novagen»), предоставлены проф. Шпренгером, Институт микробиологии г. Штутгарта, Германия. Характеристика плазмид, использованных в работе, приведена в таблице 3.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маликова, Лилия Александровна, Казань

1. Астапович Н.И. Особенности роста и образования внеклеточных протеиназ Bifidobacterium adolescentes 94 БИМ / Н.И. Астапович, А.А. Самапцев // Микробиология. 1997. - Т. 66. -№ 5. - С. 153-159.

2. Балабан Н.П. Щелочная внеклеточная протеиназа Bacillus intermedins. Выделение, очистка и некоторые свойства фермента / Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, A.M. Усманова, Е.А. Ицкович, И.Б. Лещинская // Биохимия. -1993.-Т. 58.-№ 12.-С. 1923-1928.

3. Балабан Н.П. Секретируемая сериновая протеиназа спорообразующих бактерий Bacillus intermedins 3-19 / Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, Е.Л. Ицкович, И.Б. Лещинская, Г.Н. Руденская // Биохимия. 1994. - Т. 59. - № 9. -С. 1393-1400.

4. П.Виссарионов В.А. Новые аспекты системной энзимотерапии / В.А. Виссарионов // М: Триада-Фарм, 2001 С. 23.

5. Габибов А.Г. Антитела протеазы: подходы к индукции каталитического ответа / А.Г. Габибов, А. Фрибуле, Д. Тома // Биохимия. - 2002. - Т. 67. - № 10.-С. 1413-1427.

6. Гловер Д.М. Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ. / Д.М. Гловер. М.: Мир, 1988.-538 с.

7. Головлев Е.Л. Введение в биологию стационарной фазы бактерий: механизм общего ответа на стрессы / Е.Л. Головлев // Микробиология. 1999. - Т. 68. -№5.-С. 623-631.

8. Головлев Е.Л. Физиология микробной клетки и метаболическая инженерия / Е.Л. Головлев, Л.А. Головлева // Микробиология. 2000. - Т.69. - № 2. - С. 149-162.

9. Даниличев В.Ф. Системная энзимотерапия при патологии глаз / В.Ф. Даниличев, Г.Ю. Кнорринг// Кремлевская медицина. Клинический вестник. -2002-№ 3-С. 68-70.

10. Дунаевский Я.Е. Влияние состава среды на количественный и качественный состав внеклеточных протеаз микромицетов / Я.Е. Дунаевский, Т.Н. Грубань, Г.А. Белякова // Микробиология. 1999. - Т. 68. - № 3. - С. 324-329.

11. Егоров С.Н. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / С.Н. Егоров М.: Изд-во МГУ, 1983.-221 С.

12. Добржанская Е.О. К вопросу о регуляции синтеза щелочной протеазы у Bacillus subtilis / Е.О. Добржанская, Л.И. Ерохина // Генетика. 1975. - Т. XI. -№7.-С. 135-144.

13. Знаменская Л.В. Биосинтез внеклеточных ферментов Bacillus intermedins / Л.В. Знаменская, Е.Р. Ромахина, С.В. Филатова // Микробиология. 1986. - Т. 56.-№3.-С. 449-454.

14. Зуева Е.П. Отчет о проведении доклинического исследования противовоспалительной активности препарата «Тромбовазим» для инъекционного применения. / Е.П. Зуева, Е.Н. Амосова, С.Г. Крылова, Т.Г. Разина, А.А. Мыскина. Новосибирск, 2004 - С. 18.

15. Ивлева Е.В. Внеклеточные протеиназы фитопатогенного гриба Fusarium culmorum / Е.В. Ивлева, Т.А. Ревина, Н.Н. Кудрявцева, А.В. Софьин, Т.А. Валуева // Прикл. биохим. микробиол. 2006. - Т. 42. - № 3. - С. 338-344.

16. Ицкович Е.Л. Биосинтез щелочной внеклеточной протеиназы Bacillus intermedins / Е.Л. Ицкович, Л.В. Знаменская, Н.П. Балабан, Т.А. Ершова, И.Б. Лещинская//Микробиология. 1995.-Т. 64.-№5.-С. 623-629.

17. Каюмов А.Р. Биосинтез субтилизиноподобной сериновой протеиназы

18. B.intermedius в условиях солевого стресса / А.Р. Каюмов, Н.П. Балабан, A.M. Марданова, С.В. Костров, М.Р. Шарипова // Микробиология. 2006. - Т. 75. -№ 5. - С. 642-648.

19. Колев Д.А. Репрессия синтеза у штамма 90 R-формы Bacillus mesentericus аминокислотами / Д.А. Колев // Микробиология. 1986. - Т. 55. - № 4 - С. 295-300.

20. Краснов С.И. Комплекс программ "ВЮРТ" для оптимизации в биологических исследованиях / С.И. Краснов, J1.B. Знаменская // Биол. науки. 1992. - № 2.1. C. 15-18.

21. Ландау Н.С. Особенности контроля синтеза протеиназ с плазминоподобной и активаторной активностями у морских бактерий / Н.С. Ландау, О.М. Туликова, Н.С. Егоров // Микробиология. 2000. - Т. 69. - № 2. - С. 185-190.

22. Люблинская Л.А. р-Нитроанилиды пироглутамилпептидов хромогенные субстраты сериновых протеиназ / Л.А. Люблинская, И. Хайду, Г.Н. Баландина // Биоорг. химия. - 1987. - Т. 13. -№> 6. - С. 748-753.

23. Мосолова О.В. Glu, Asp-специфичная протеиназа актиномицетов / О.В. Мосолова, Г.Н. Руденская, В.М. Степанов, О.М. Ходова, И.А. Цаплина // Биохимия. 1987. - Т. 52. - № 3. - С. 414-422.

24. Новикова Т.М. Внеклеточная протеаза Bacillus alvei В-724 / Т.М. Новикова, С.Н. Выборных, Н.С. Егоров, Ж.К. Лория // Прикл. биохимия и микробиология. 1986. - Т. 22. - № 6. - С. 772-777.

25. Плотников М.Б. «Отчет по влиянию тромбовазима на параметры гемореологии и гемостаза»./ М.Б. Плотников, Г.А. Чернышева, О.И. Алиев. -Томск, 2002.

26. Прист Ф. Промышленные продукты бацилл и их применение / Ф. Прист // Бациллы. Генетика и биотехнология. Под. ред. Харвуда К. М.: Мир, 1992. -С.236-298.

27. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизинов / Г.Н. Руденская // Биоорг. химия.- 1994. Т. 20. - № 5. - С. 475-484.

28. Руденская Г.Н. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ / Г.Н. Руденская // Биоорг. химия. - 1998.-Т. 24,-№4.-С. 256-261.

29. Сафонова М.Е. Особенности роста и продукции внеклеточных протеиназ Lactobacillus plantarum ИМ-9138 / М.Е. Сафонова, Н.И. Астапович, И.А. Буряно // Микробиология. 1999. - Т. 68. - № 4. - С. 449-452.

30. Серкина А.В. Структура и функции предшественников бактериальнях протеиназ / А.В. Серкина, А.Б. Шевелев, Г.Г. Честухина // Биоорг. химия. -2001. Т. 27. - № 5. - С. 323-346.

31. Сидоренко Б.А. «Клиническое применение антитромботических препаратов», / Б.А. Сидоренко, Д.В. Преображенский Москва, 1998.

32. Тепляков А.В. Кристаллическая структура термитазы и стабильность субтилизинов / Тепляков А.В., Куранова И.П., Арутюнян Э.Г. // Биоорг. химия,- 1990.-Т. 16.-№4.-С. 437-447.

33. Хайдарова Н.В. Glu, Asp-специфичная протеиназа из Streptomyces thermovulgaris / Н.В. Хайдарова, Г.Н. Руденская, Л.П. Ревина, В.М. Степанов, Н.С. Егоров // Биохимия. -1989. Т. 54. - №. 1. - С. 46-52.

34. Хмель И.А. Регуляция экспрессии бактериальных генов в отсутствие активного роста клеток. / И.А. Хмель // Генетика. 2005. - Т. 41. - № 9. - С. 1183-1202.

35. Шакиров Е.В. Влияние компонентов питательной среда на накопление глутамилэндопептидазы в культуральной жидкости Bacillus intermedius / Е.В. Шакиров, Л.А. Габдрахманова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова // Микробиология 2000. - Т. 69. - № 1. - С. 29-33.

36. Шарипова М.Р. Локализация протеолитических ферментов в клетках Bacillus intermedius / М.Р. Шарипова, Е.В. Шакиров, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова, М.А. Шилова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. 2000. - Т. 69. - № 5. - С. 660-667.

37. Шарипова М.Р. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedius / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова, М.А. Шилова, Ю.М. Кадырова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. 2002. - Т. 71. - № 4. - С. 494-499.

38. Adinarayana K. Response surface optimization of the critical medium components for the production of alkaline protease by a newly isolated Bacillus sp. / K. Adinarayana, P. Ellaiah // J. Pharmaceut. Sci. 2002 - V. 5 - №. 3 - P. 272-278.

39. Ahmed. Z. Production of natural and rare pentose using microorganisms and their enzymes. / Z. Ahmed // Electronic. Journ. Biotechnol. 2001a. - V. 4. - №.2. - P. 103-111.

40. Ahmed. Z. The properties of Candida famata R28 for D-arabitol production from D-glucose / Z. Ahmed // J. Biol. Sci. 20016.- V.l - № 11. - P. 1005-1008.

41. Aoyama M. Sequence of the gene encoding serine proteinase of Bacillus pumilus / C. Toma, M. Yasuda, M. Iwanaga // Microbiol. Immunology 2000a. - V. 4. -1. 5. - P. 389-393.

42. Aoyama M. Soybean-milk-coagulating activity of Bacillus pumilus derives from a serine proteinase / M. Aoyama, M. Yasuda, K. Nakaci, N. Kobamoto, H. Oku, F. Kato // Appl. Microbiol. Biotechnol. 20006. - V. 53. -1.4. - P. 390-395.

43. Asano N. Glycosidase inhibitors: uptake and perspectives on practical use. / N. Asano//Glycobiol.-2003.-V. 13-№ 10.-P. 93-104.

44. Astrup T. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity / T. Astrup, S. Mullertz // Arch. Biochem. Biophys. 1952. - V. 40. - P. 346-351.

45. Baneijee A. Induction of secretory acid proteinases in Candida albicans / A. Baneijee, K. Janesan, A. Dallis // J. Gen. Microbiology. 1991. - V. 137. - P. 2455-2461.

46. Banki K.A. Cloning and expression of the human gene for transaldolase / K. Banki, D. Halladay, A. Perl //J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. -№ 4 - P. 2847-2851.

47. Barret A.J. The Interaction of b2-M with proteinases / A.J. Barret, P.M. Starkey // Biochem. J. 1973. - V. 133 - P. 709.

48. Barret A.J. Familes and clans of serine peptidases / A.J. Barret, N.D. Rawlings // Arch. Biochem. Biophys.- 1995 V. 318. - № 2. - P. 247-250.

49. Barros R.J. Enhancement of immobilized protease catalyzed dipeptide synthesis by the presence of insoluble protonated nucleophile / R.J. Barros, E. Wehtje, P. Adlercreutz // Enzyme Microb. Technol. 1999. - V. 24. - P. 480-488.

50. Betzel C. Synchrotron X-ray data collection and restrained least-squares refinement of the crystal structure of proteinase К at 1.5 A resolution // C. Betzel, G.P. Pal, W. Saenger // Acta Crystallography. 1988. - V. 44. - P. 163-172.

51. Bonger J. Peptide synthesis catalyzed by the Glu/Asp-specific endopeptidase. Influence of the ester leaving group of the acil donor on yield and catalytic efficiensy / J. Bonger, Th. Lambros // Int. I. Peptid Protein Res. 1994 - V. 44 - P. 123-129.

52. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye-binding / M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.

53. Breddam K. Substrate preferences of glutamic-acid-specific endopeptidases assessed by synthetic peptide substrates based on intramolecular fluorescence quenching / K. Breddam, M. Meldal // Eur. J. Biochem. 1992 - V. 206 - P. 103107.

54. Bryan P. Energetics of folding subtilisin BPN' / P. Bryan, P. Alexander, S. Strausberg, F. Schwarz, W. Lan, G. Gilliland, D.T. Gallagher // Biochemistry. -1992.-V. 31.-P. 4937-4945.

55. Calik P. Regulatory effects of alanine-group amino acids on serine alkaline protease production by recombinant Bacillus licheniformis / P. Calik, A. Bayram, Т.Н. Ozdamar // Biotechnol. Appl. Biochem. 2003 - V. 37. - P. 165-171.

56. Cazemier A.E. Effect of sporulation and recovery medium on the heat resistance and amount of injury of spores from spoilage bacilli / A.E. Cazemier, S.F. Wagenaars, P.F. Ter Steeg // J. Appl. Microbiol. 2001. - V. 90. - № 5. - P. 761-770.

57. Chiang L-C. Enzymatic and microbial preparation of D-xylulose from D-xylose. / L.-C. Chiang, H. Hsiao,P.P. Ueng, G.T. Tsao // Appl. Environ. Microbiol. 1981. -V. 42. № l.-P. 66-69.

58. Clapes P. Peptide bond formation by the industrial protease, neutrase, in organic media / P. Clapes, E. Pera, J.L. Torres // Biotechnol. Lett. 1997- V. 19. - P. 10231026.

59. Dalby. A. Crystal structure of human muscle aldolase complexed with fructose 1,6-bisphosphate: mechanistic implications / A. Dalby, Z. Dauter, J.A. Littlechild // Protein. Sci. 1999. - V. 8. - P. 291-297.

60. Dancer B.N. Production and possible function of serine protease during sporulation of Bacillus subtilis / B.N. Dancer, J. Mandelstam // J. Bacterid. 1975. - V. 121. -P.406-410.

61. Demirijan D. Enzymes from extremophiles / D. Demirijan, F. Moris-Varas, C. Cassidy // Curr. Opin. Chem. Biol. 2001. - V. 5. - P. 144-151.

62. Detsch C. Ammonium utilization in Bacillus subtilis: transport and regulatory functions of NrgA and NrgB / C. Detsch, J. Stulke // Microbiology. -2003. -V.149. -P.3289-3297.

63. De Wulf P. Optimized synthesis of L-sorbose by C5-dehydrogenation of D-sorbitol with Gluconobacter oxydans / P. De Wulf, W. Soetaert, E.J. Vandamme // Biotechnol. Bioeng. 2000. - V. 69. - № 3. - P. 339-343.

64. Drapeau G.R. Purification and properties of an extracellular protease of Staphylococcus aureus / G.R. Drapeau, Y. Boily, J.J. Houmard // J. Biol. Chem. -1972. -V. 247. № 20.-P. 6720-6726.

65. Drapeau G.R. The primary structure of staphylococcal protease / G.R. Drapeau // Can. J. Biochem. 1978. - V. 56. - № 6. - P. 534-544.

66. Dubnau D. Two-component regulators and genetic competence in Bacillus subtilis. / D. Dubnau, J. Hahn, M. Roggiani, F. Piazza, Y. Weinrauch // Res. Microbiol.- 1994. V. 145. - P. 403-411.

67. Eaton R.W. /ra;is-o-Hydroxybenzylidenepyruvate hydratase-aldolases a biocatalyst / R.W. Eaton // Appl. Env. Microbiol. 2000. - V. 66 - №6 - P. 26682672.

68. Г02. Errington J. Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expression and control of morphogenesis / J. Errington // Microbiol. Rev. 1993. - V. 57. - № 1. - P. 133.

69. Eschenburg S. Crystal structure of subtilisin DY, a random mutant of subtilisin Carlsberg / N. Genov, K. Peters, S. Fittkau, S. Stoeva, K.S. Wilson, C. Betzel // Europ. Journ. Biochem. -1998. V. 257. -1. 2. - P. 309.

70. Faber K. Biotransformations in organic chemistry. / K. Faber, Springer, 2004 P. 378.

71. Fessner W.D. Enzymatic C-C bond formation in asymmetric synthesis / W.D. Fessner, C.Walter//Top. Curr. Chem. 1996. - V. 184.-P. 194-197.

72. Fessner. W.D. Enzyme mediated C-C bond formation / W.D. Fessner // Current Opinion in Chem. Biol. 1998. - V. 2. - P. 85-97.

73. Fessner. W.D. Biocatalytic synthesis of hydroxylated natural products using aldolases and related enzymes. / W.D. Fessner, V. Helaine // Curr. Opin. Biotechnol.-2001.-V. 12.-P. 574-586.

74. Ferrari E. Trascription of Bacillus subtilis subtilisin and expression of subtilisin in sporulation mutants / E. Ferrari, D.J. Henner, M. Perego, J.A. Hoch // J. Bacteriolog. 1988.-V. 170.-P. 289-295.

75. Fujiwara N. Continuous recovery of silver from used X-ray films using a proteolytic enzyme / N. Fujiwara, T. Tsumiya, T. Katada, T. Hosobuchi, K. Yamamoto // Process Biochem. 1989. - V. 24 - P. 155-156.

76. Fujiwara N. Utilization of a thermostable alkaline protease from an alkalophilic thermophile for the recovery of silver from used X-ray film / N. Fujiwara, K. Yamamoto, A. Masui // J. Ferment Bioeng. 1991 - V. 72 - P. 306-308.

77. Gabdrakhmanova L.A. Biosynthesis and localization of glutamylendopeptidase from Bacillus intermedius 3-19 / L.A. Gabdrakhmanova, E.V. Shakirov, N.P. Balaban, M.R. Sharipova, G.N. Rudenskaya, I.B. Leshchinskaya // Microbios. -1999.-V. 100.-P. 97-108.

78. Gabdrakhmanova L.A. Optimization of Bacillus intermedins glutamylendopeptidase production by recombinant strain of Bacillus subtilis and localization of glutamylendopeptidase in Bacillus subtilis cells / L.A.

79. Gabdrakhmanova, N.P. Balaban, M.R. Sharipova, S.V. Kostrov, T.V. Akimkina, G.N. Rudenskaya, I.B. Leshchinskaya // Enzyme and Microbial Technology 2002. -V. 31.-P. 256-263.

80. Gabdrakhmanova L. Salt stress induction of glutamyl endopeptidase biosynthesis in Bacillus intermedins / L. Gabdrakhmanova, I. Vishniakov, M. Sharipova, N. Balaban, S. Kostrov, I. Leshchinskaya // Microbiol. Res. 2005. - V. 160. - № 3. -P. 233-242.

81. Gijsen H.J.M. Recent advances in the chemoenzymatic synthesis of carbohydrates and carbohydrate mimetics. / H.J.M. Gijsen, L.Qiao, W. Fitz, C.-H. Wong // Chem. Rev.- 1996. V. 96. - № 1. - P. 443-473.

82. Gonzalez-Garcia E. Fluorogenic stereochemical probes for transaldolases./ E. Gonzalez-Garcia, V. Helaine, G. Klein, M. Schurmann, G.A. Sprenger, W.-D. Fessner, J.-L. Reymond // Chem. Eur. J. 2003. - V. 9. - № 4. - P. 893-899.

83. Grapinska R. Structural and energetic determinants of the Sl-site specifity in serine proteases / Grapinska R., Otlewski J. // Eur. J. Biochem. 1999. - V. 206. -P. 103-107.

84. Grigoryev E.G. Immobilized proteinases in the treatment of diffuse purulent peritonitis / E.G. Grigoryev, A.S. Kogan // Int. Surgery 1998. - T. 83. - P. 245 -249.

85. Gupta R. Keratinases and their prospective applications: an overview / R. Gupta, P. Ramnani // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006 - V. 4. - P. 1-13.

86. Haki G.D. Developments in industrially important thermostable enzymes: a review / G.D. Haki, S.K. Rakshit // Biores. Technol. 2003. - V. 89. - P. 17-34.

87. Hameed A. Production of alkaline protease by a new Bacillus subtilis isolate for use as a bating enzyme in leather treatment / A. Hameed, M.A. Natt, C.S. Evans // World. J. Microbiol. Biotechnol. 1996 - V. 12 - P. 289-291.

88. Han X.Q. Stability of protease Q against autolysis and in sodium dodecyl sulfate and urea solutions / X.Q. Han, S. Damodaran // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1997. V. 240. - I. 3. - P.839-843.

89. Harrington D.J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease / D.J. Harrington // Infection and Immunity 1996. -V. 64-№6.-P. 1885-1891.

90. Heine A. Observation of covalent intermediates in an enzyme mechanism at atomic resolution. / A. Heine A., G. DeSantis, J.G. Luz, M. Mitchell, C.-H. Wong, I.A. Wilson // Science 2001. - V. 294. - № 12. - P. 369-374.

91. Hoch J.A. spoO genes, the phosphorelay, and the initiation of sporulation. / J.A. Hoch // Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry, physiology and molecular genetics. A. L. Sonenshein, J. A. Hoch, R. Losick (ed). -Washington,

92. D. C.: American Society for Microbiology, 1993. P. 747-755.

93. Hoffmann U. Activated protein С inhibits the release of macrophage inflammatory protein-l-alpha from THP-1 cells and from human monocytes / U. Hoffmann, L. De Rossi, H. M. Weiler, V. Liebe, S. Lang, J.J. Kaden, M. Borggrefe, K.K. Haase,

94. G. Huhle.//Cytokine-2004-V. 7-№3.-P. 106-13.

95. Horecker B.L. Mechanism of action of transaldolase. / B.L. Horecker, T. Cheng,

96. E. Grazi, C.Y. Lai, P. Rowley, O. Tchola // Fed. Proc. 1962 - V. 21. - P. 10231030.

97. Huang Q. Purification and characterization of an extracellular alkaline serine protease with dehairing function from Bacillus pumilus / Q. Huang, Y. Peng, X. Li,

98. H. Wang, Y. Zhang // Curr. Microbiology. 2003. - V. 46. - P. 169-173.

99. Jackson D.P. Expression of proteolytic enzymes during Dictyostelium discoideum spore germination. / D.P. Jackson, D.A. Cotter. // Arch. Microbiol. 1984. - V.137 - P. 205-208.

100. Jeong Y.K. Purification and biochemical characterization of a fibrinolitic enzyme from Bacillis subtilis BK-17 / Y.K.Jeong, J.U. Park, H. Baek, S.H. Park // World J. Microbiol. Biotechnol. 2001 - V. 17. - P. 89-92.

101. Jia J. Crystal structure of transaldolase В from Escherichia coli suggests a circular permutation of the a/p barrel within the class I aldolase family / J. Jia, W. Huang, U.

102. Schorken, H. Sahm, G.A. Sprenger, Y. Lindqvist, G. Schneider // Structure 1996. -V. 4. №.6.-P. 715-724.

103. Johansen J.T. The degradation of the B-chain of oxidized insulin by two subtilisins and their succinylated and N-carbamylated derivatives / J.T. Johansen, M. Ottesen, I. Svendsen, G. Wybrandt // CR Lab. Carlsberg 1968. - V. 36. - P. 365-384.

104. Ibrahim Y.M. Role of HtrA in the virulence and competence of Streptococcus pneumoniae / Y.M. Ibrahim, A.R. Kerr, J. McCluskey, T.J. Mitchell // Infection and Immunity 2004- V. 72 - №. 6 - P. 3584-3591.

105. Isono Y. Enzymic peptide synthesis using a microaqueous highly concentrated amino acid mixture. / Y. Isono, M. Nakajima // Process Biochem. 2000 - V. 36. -P.275-278.

106. Kim S.H. Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacillus sp. strain DJ-4 screened from Doen-Jang / S.H. Kim, N.S. Choi // Biosc. Biotechnol. Biochem. 2000. - V. 64. - P. 1722-1725.

107. Kitadokoro K. Purification, characterization and molecular cloning of an acidic amino-acid specific proteinase of Streptomyces fradiae ATCC14544 / K. Kitadokoro, E. Nakamura, M. Tamaki, T. Horii, H. Okamoto, M. Shin, T. Sato, T.

108. Fujiwara, H. Tsuzuki, N. Yoshida, H. Teraoka // Biochim. Biophys. Acta. -1993. -V. 1163.-P. 149-157.

109. Ко J. Subtilisin QK, a fibrinolytic enzyme, inhibits the exogenous nitrite and hydrogen peroxide induced protein nitration, in vitro and in vivo / J. Ко, J. Yan, L. Zhu, Y. Qi // J. Biochem. Mol. Biol. 2005. - V. 38 - № 5. P. 577-583.

110. Kojima M. Isolation and characterization of a feather-degrading enzyme from Bacillus pseudofirmus FA30-01 / M. Kojima, M. Kanai, M. Tominaga, S. Kitazume, A. Inoue, K. Horikoshi // Extremophiles 2006. - V. 10. - P. 229-235.

111. Kraus E. The specificity of proteinase К against oxidized insulin В chain / E. Kraus, H.H. Kultz, U.F. Femfert Heppe-Seylers // Z. Physiol. Chem. 1976. - V. 357. -P.233-237.

112. Kudrya V. A. Alkaline serine proteinase and lectin isolation from the culture fluid of Bacillus subtilis / V. A. Kudrya, I. A.Simonenko // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994-V. 41-P. 505-509.

113. Kumaran S. An enigmatic peptide ligation reaction: protease-catalyzed oligomerization of a native protein segment in neat aqueous solution / S. Kumaran, A. Datta., D. Roy // Prot. Sci. 2000 - V. 9. -1. 4 - P. 734-741.

114. Kumar C.G. Novel enzyme-based detergents: an Indian perspective. / C.G Kumar, R.K Malik, M.P. Tiwari // Curr. Sci. 1998. - V. 75. - P. 1312-1318.

115. Kumar C. Microbial alkaline proteases: from a bioindustrial viewpoint. / C.G, Kumar, H. Takagi // Biotechnol. Adv. 1999. - 17. - P. 561-594.

116. Lorentzen E. Mechanism of the schiff base forming fructose-1,6-bisphosphate aldolase: structural analysis of reaction intermediates / E. Lorentzen, B. Siebers, R. Hensel, E. Pohl // Biochemistry 2005. - V. 44. - № 11. - P. 4222-4229.

117. Lotong N. L-erythrulose production by oxidative fermentation is catalyzed by PQQ-containing membrane-bound dehydrogenase. / N. Lotong, K. Matsushita // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. - V. 66. - № 2. - P. 307-318.

118. Lu X. The alkylated imino sugar, ;/-(/j-nonyl)-deoxygalactonojirimycin, reduces the amount of hepatitis b virus nucleocapsid in tissue culture / X. Lu, T. Tran, E. Simsek, T.M. Block //. J. Virol. Nov. 2003. - V. 77. - № 22. - P. 11933-11940.

119. Ma Z. The use of proteolysis to study the structure of nardilysin. / Z. Ma, К. M. Chow, E. Csuhai, L. B. Hersh // Arch. Biochem. Biophys. 2002 - V. 15. - № 2 -P.198-204.

120. Maeda H. Alkaline-resistance model of subtilisin ALP I, a novel alkaline subtilisin / H. Maeda, O. Mizutani, Y. Yamagata, E. Ichishima, T. Nakajima // Biochemistry 2001. - V. 129. - P. 675-682.

121. Macedo A.J. Novel keratinase from Bacillus subtilis S14 exhibiting remarkable dehairing capabilities / A.J. Macedo, W.O. Beys da Silva, R. Gava, D. Driemeier, J.A. P. Henriques,C. Termignoni // Appl. Env. Microbiol. 2005. - V. 71. -№ 1. -P.594-596.

122. Malathi S. Production of alkaline protease by a new Aspergillus flavus isolateunder solid-substrate fermentation conditions for use as a depilation agent / S. Malathi, R. Chakraborty // Appl. Env. Microbiol. 1991. - V. 57. - № 3. - P. 712-716.

123. Meijers R. The crystal structure of glutamyl endopeptidase from Bacillus intermedius reveals a structural link between zymogen activation and charge compensation // R. Meijers, E.V. Blagova, V.M. Levdikov, G.N. Rudenskaya, G.G.

124. Chestukhina, T.V. Akimkina, S.V. Kostrov, V.S. Lamzin, I.P. Kuranova // Biochemistry 2004. - V. 43. - № 10. - P. 2784-2791.

125. Mizanur R.M. Production of L-erythrose via L-erythrulose from erythritol using microbial and enzymatic reactions / R.M. Mizanur, K. Takeshita, H. Moshino, G. Takada, K. Izumori // J. Biosci. Bioeng. 2001. - V. 92. - № 3. - P. 237-241.

126. Moravcova J. Repression of the synthesis of exocellular and intracellular proteinases in Bacillus megaterium / J. Moravcova, J. Chaloupka // Folia Microbiol. 1984.-V. 29.-P. 273-281.

127. Msadek T. DegS-DegU and ComP-ComA modulator-effector pairs control expression of the Bacillus subtilis pleiotropic regulatory gene degQ / T. Msadek, F.Kunst, A. Klier. G. Rapoport//J. Bacteriol.-1991.-V. 173.-P. 2366-2377.

128. Msadek T. When the going gets tough: survival strategies and environmen/a/ signaling networks in Bacillus subtilis / T. Msadek // Trends Microbiol. -1999. -V.7.-P. 201-207.

129. Nakamura T. Nucleotide sequence of the subtilisin NAT, aprN, of Bacillus subtilis (natto) / T. Nakamura, Y. Yamagata, E. Ichishima // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. - V. 56. - P. 1869-1871.

130. Neklyudov A. D. Properties and uses of protein hydrolysates (review). / A.D. Neklyudov, A.N. Ivankin, A.V. Berdutina // Appl. Biochem. Microbiol. 2000. -V. 36. - P. 452-459.

131. Nienaber V.L. A glutamic acid specific serine protease utilizes a novel histidine triad in substrate binding / V.L. Nienaber, K. Breddam, J.J. Birktoft // Biochemistry. 1993.-V. 32.-№43.-P. 11469-11475.

132. Norcross R.D. Enantio- and diastereoselective aldol reactions of achiral ethyl and methyl ketones with aldehydes: the use of enol diisopinocampheylborinates. / R.D. Norcross // Tetrahedron 1990. - V. 46. - P. 4663-4684.

133. Ohara-Nemoto Y. Characterization and molecular cloning of a glutamyl endopeptidase from Staphylococcus epidermidis / Y. Ohara-Nemoto, Y. Ikeda, M. Kobayashi, M. Sasaki, S. Tajika, S. Kimura // Microb. Pathog. 2002. - V.33. - № 1. - P. 33-41.

134. Okazaki S. Surfactant-protease complex as a novel biocatalyst for peptide synthesis in hydrophobic organic solvents / S. Okazaki, M. Goto, S. Furusaki // Enzyme Microb. Technol. 2000 - V. 26. - P. 159-164.

135. Ottesen M. The subtilisins. / M. Ottesen, I. Svendsen. // Meth. Enzymol. 1970. -V. 19.-P. 199-215.

136. Pan J. Gene cloning and expression of an alkaline serine protease with dehairing function from Bacillus pumilus / Pan J., Huang Q., Zhang Y. // Curr Microbiol-2004. V. 49. № 3. - P. 165-169.

137. Biochemistry.-1988.-V. 27.-P. 8311-8317.

138. Perea A. Preparation and characterization of whey protein hydrolysates: application in industrial whey bioconversion processes. / A. Perea, U. Ugalde, I. Rodriguez, J. L. Serra// Enzyme Microb. Technol. 1993. V. 15 P. 418-423.

139. Phadatare S.U. Evidence for the involvement of serine protease in the conidial discharge of Conidiobolus coronatus / S.U. Phadatare, M.C. Srinivasan, M.V. Deshpande // Arch. Microbiol. 1989. - V. 153 - P. 47-49.

140. Postemsky C.J. Isolation and characterization of Bacillus megaterium mutants containing decreased levels of spore protease / C.J. Postemsky, S.S. Dignam, P. Setlow // J. Bacteriol. 1978. - V. 135. - P. 841-850.

141. Povelainen M. Production of D-arabitol by a metabolic engineered strain of Bacillus subtilis / M. Povelainen, A.N. Miasnikov // Biotechnol. J. 2006. - V. 1. -P. 214-219.

142. Power S. Secretion and autoproteolytic maturation of subtilisin / S. Power, R.M. Adams, J.A. Wells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V.83. - № 5. - P. 30963100.

143. Prakasham R.S. Green gram husk an inexpensive substrate for alkaline protease production by Bacillus sp. in solid-state fermentation. / R.S. Prakasham, C.S. Rao, P.N.Sarma// Bioresour. Technol.-2006. V. 97.-№ 13.-P. 1449-1454.

144. Puri S. Optimization of alkaline protease production from Bacillus sp. using response surface methodology./ S. Puri, Q.K. Beg, R. Gupta // Curr. Microbiol. -2002-V. 44-P. 286-290.

145. Rao A. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases / A. Rao, B. Mala, M. Arapna, A Tanksale, S.M. Ghatge, V.V. Deshpande. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V. 62. № 3. - P. 597-635.

146. Raninger A. Accelerated process development for protease production in continuous multi-stage cultures / A. Raninger, W. Steiner // Biotechnol. Bioeng. -V. 82. -№ 5. P. 165-171.

147. Rebeca B.D. Production of fish protein hydrolysates with bacterial proteases; yield and nutritional value. / B.D. Rebeca, M.T. Pena-Vera, M. Diaz-Castaneda // J. Food. Sci. 1991 - V. 56. - P. 309-314.

148. Riva S. Protease-catalyzed regioselective esterification of sugars and related compounds in anhydrous dimethylformamide. / S. Riva, J. Chopineau, A.P.G. Kieboom, A.M. Klibanov // J. Am. Chem. Soc. 1988. - V. 110. - P. 584-589.

149. Rigoulay C. Comparative analysis of the roles of htra-like surface proteases in two virulent Staphylococcus aureus strains. / C. Rigoulay, M. Entenza, D Halpern, E. Widmer, P. Poquet A. Gruss // Infection and Immunity. 2005 - V. 72. - P. 563572.

150. Sahni G. Chemistry of the "molecular trap" of protease-catalyzed splicing reaction of complementary segments of alpha-subunit of hemoglobin A / G. Sahni, S.A. Khan, A.S. Acharya // J. Protein. Chem. 1998. - V. 17 - P. 669-678.

151. Saeki K. New subtilisin family protease / K. Saeki, T. Nonaka, M. Fujihashi, A. Kita, K. Horokoshi, S. Ito, K. Miki // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. -V. 279.-P. 313.

152. Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

153. Sampath P. Physiological and nutritional factor affecting biosynthesis of extracellular protease by Streptomyces sp. G 157 / P. Sampath, J. Chandrakasan // Microbiological. 1998.-V. 21.-№ l.-P. 55-63.

154. Santos A.L. Secretion of serine peptidase by a clinical strain of Candida albicans: influence of growth conditions and cleavage of human serum proteins and extracellular matrix components. / A.L. Santos, I.M. Carvalho, B.A. Silva, M.B.

155. Portela., C.S. Alviano, R.M. Araujo-Soares // FEMS Immunol. Med. Microbiol. -2006. V. 46. - № 2. - P. 209-220.

156. Sareen R. Cloning, functional expression and characterization of an alkaline protease from Bacillus licheniformis. / R. Sareen, U.T. Bornscheuer, P. Mishra // Biotechnol. Lett. 2005. - V. 27. - P. 1901-1907.

157. Schiirmann M. Fructose-6-phosphate aldolase is a novel class I aldolase from Escherichia coli and is related to a novel group of bacterial transaldolases. / M. Schurmann, G.A. Sprenger // J. Biol. Chem. 2001- V. 276. - № 14. - P. 1105511061.

158. Shaw L. The role and regulation of the extracellular proteases of Staphylococcus aureus / L. Shaw, E. Golonka, J. Potempa, S.J. Foster // Microbiology 2004- V. 150-P. 217-228.

159. Seoane G. Enzymatic C-C bond-forming reactions in organic synthesis / G. Seoane // Curr.Org. Chem. 2000. - V. 4. - № 3. - P. 283-304.

160. Setvorini E. Purification and characterization of two novel halotolerant extracellular proteases from Bacillus subtilis strain FP—133 / E. Setvorini, S. Takenaka, S. Murakami, K. Aoki // Biosc. Biotechnol. Biochem. 2006. - V. 70. -№ 2. - P. 433-440.

161. Siezen R.J. Subtilases: the superfamily of subtilisin—like serine proteinases / R.J. Siezen, J.A.M. Leunissen // Protein Sciense. -1997. V. 6. - P. 501-523.

162. Singh J. Purification and characterization of two extracellular alkaline proteases from a newly isolated obligate alkalophilic Bacillus sphaericus / J. Singh, R.M. Vohra, D.K. Sahoo // Journ. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 2. - P. 387 -393.

163. So J.E. Protease-catalyzed tripeptide (RGD) synthesis / J.E.So, J.S. Shin, B.G. Kim // Enzyme Microb. Technol. 2000 - V. 26. - P. 108-114.

164. Soderberg T.C. Transaldolase of Methanocaldococcus jannaschii / T. Soderberg, R.C. Alver // Archaea 2004. - V. 1. - P. 255-262.

165. Sookkheo B. Purification and characterization of the highly thermostable proteases from Bacillus stearothermophilus TLS33 / B. Sookkheo, S. Sinchaikul, S. Phutrakul, S.-T. Chen II Prot. Expres. Purif. 2000. - V. 20. -1. 2. - P. 142-151.

166. Spreer A. Characterization of an extracellular subtilisin protease of Rhizopus microsporus and evidence for its expression during invasive rhinoorbital mycosis / Med. Mycol. 2006. - V. 44. - №8. - P. 723-731.

167. Sprenger G.A. Genetics of pentose-phosphate pathway enzymes of Escherichia coli K-12 / G.A. Sprenger I I Arch. Microbiol. 1995. - V. 164. - № 5. - P. 324330.

168. Sprenger G.A. Transaldolase В of Escherichia coli K-12: cloning of its gene, talB, and characterization of the enzyme from recombinant strains / G.A. Sprenger, U. Schorken, G. Sprenger, H. Sahm // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - № 20. - P. 5930-5936.

169. Srinivasulu A. Product-conformation-driven ligation of peptides by V8 protease / A. Srinivasulu, S. Acharya//Protein Sci.-2002-V. 11 №6.-P. 1384- 1392.

170. St-Jean M. High resolution reaction intermediates of rabbit muscle fructose-1,6-bisphosphate aldolase / M. St-Jean, J. Lafrance-Vanasse, B. Liotard, J. Sygusch // J. Biol.Chem. 2005. - V. 280. - № 29. - P. 27262-27270.

171. Steil L. Genome-wide transcriptional profiling analysis of adaptation of Bacillus subtilis to high salinity / L. Steil, T. Hoffmann, I. Budde, U. Volker, E. Bremer. // J Bacteriol. -2003. -V. 185. -P. 6358-70.

172. Stulke J. Carbon catabolite repression in bacteria / J. Stulke, W. Hillen // Curr. Opin. Microbiol. 1999. - V. 2. - P. 195-201.

173. Suto Y. Cu(I)-catalyzed direct enantioselective cross aldol-type reaction of acetonitrile / Y. Suto, R. Tsuji, M. Kanai, M. Shibasaki //Org. Lett. 2005. - V. 7. -№ 17.-P. 3757-3760.

174. Svensden I. The primary structure of the glutamic acid-specific protease of Streptomyces griseus /1. Svensden, M.R. Jensen, K. Breddam // FEBS Lett. 1991. -V. 292.-P. 165-167.

175. Svensden I. Isolation and aminoacid sequence of a glutamic acid specific endopeptidase from Bacillus licheniformis / I. Svensden, K. Breddam // Eur. J. Biochem. 1992.-V. 204.-P. 165-171.

176. Takahata H. Asymmetric synthesis of the four possible fagomine isomers / H. Takahata, Y. Banba, H. Ouchi, H. Nemoto, A. Kato, I. Adachi // J. Org. Chem. -2003. V. 68. - № 9. - P. 3603-3607.

177. Thorell S. The threedimensional structure of human transaldolase / S. Thorell, Jr. Gergely, K. Banki, A. Perl, G. Schneider // FEBS Lett. 2000. - V. 475. - P. 205208.

178. Toogood H.S. Purification and characterization of Ak.l protease, thermostable subtilisin with a disulphide bond in the substrate-binding cleft / H.S. Toogood, C.A. Smith, E.N. Baker, R.M. Daniel // Biochemistry 2000. - V. 350. - P. 321-328.

179. Trost B.M. Direct asymmetric Zn-aldol reaction of methylvinylketone and its synthetic applications / B.M. Trost, S. Shin, J.A. Sclafani // J. Am. Chem. Soc. V. 127.-P. 862-8603.

180. Varela H. Skin unhairing proteases of Bacillus subtilis: production and partial characterization / H. Varela, M.D. Ferrari, L. Belobradjic, A. Vazquez, M.L. Loperena // Biotechnol. Lett. 1997. - V. 19. - P. 755-758.

181. Vieille C. Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability. / C. Vieille, G.J. Zeikus // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001. -V. 65-№ l.-P. 1^13.

182. Vivek K. Use of nattokinase, a subtilisin—like serine proteinase, to accelerate proteolysis in Cheddar cheese during ripening / K. Vivek, A. Upadhyay, A. Paul, L.H. McSweeney // Lait 2006 - V. 86 - P. 227-240.

183. Wang J.J. Fermentation production of keratinase from Bacillus licheniformis PWD-1 and a recombinant Bacillus subtilis FDB-29 / J.J. Wang, J. Shih // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.- 1999. V. 22. - № 6. - P. 608-616.

184. Wehofsky N. Synthesising protease-stable isopeptides by proteases: an efficient biocatalytic approach on the basis of a new type of substrate mimetics. / N. Wehofsky, M. Alisch, F. Bordusa // Chem.Commun (Camb). 2001. - V. 17-P. 1602-1603.

185. Wells J.A. Cloning, sequensing and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis / J.A. Wells, E. Ferrari, D.J. Henner, D.A. Estel, E.Y. Chen // Nucleic acids. 1983. - V. 11. - P. 7911-7925.

186. Withers-Martinez C. Subtilisin—like proteases of the malaria parasite / C. Withers-Martinez, L. Jean, M.J. Blackman // Molecular Microbiology 2004. - V. 53.-I. l.-P. 55-60.

187. Yokoi К. Genetic and biochemical characterization of glutamyl endopeptidase of Staphylococcus warneri M / K. Yokoi, M. Kakikawa, H. Kimoto, K. Watanabe, H. Yasukawa, A. Yamakawa, A. Taketo, K.I. Kodaira // Gene. 2001. - V. 281. - P.115.122.

188. Zhao H. Directed evolution converts subtilisin E into a functional equivalent of thermitase / H. Zhao, F.H. Arnold // Prot. Eng. 1999. - V. 12. -1. 1. - P. 47-53.

189. Zhou R. Evidence that HetR protein is an unusual serine-type protease / R. Zhou, X. Wei, N.Jang, H. Li, Y. Dong, K.-L. Hsi, J. Zhao // Biochemistry 1998. - V. 95. -P. 4959-4963.

Информация о работе

Маликова, Лилия Александровна
кандидата биологических наук
Казань, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Протеиназы и альдолазы: принципиальные подходы к получению практически значимых бактериальных ферментов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы