Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные детерминанты, существенные для функционирования и стабильности протеолитических ферментов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, доктора химических наук, Костров, Сергей Викторович

ВВЕДЕНИЕ. Прикладное значение протеолитических ферментов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Структурно-функциональная организация термолизин-подобных секреторных металлопротеиназ бацилл.

1.1.1. Общая характеристика молекул.

1.1.2. Организация активного центра.

1.1.3. Организация субстрат-связывающего кармана.

1.1.4. Организация сайтов связывания ионов Са2+.

1.2. Про-зависимый фолдинг протеолитических ферментов.

1.3. Роль про-последовательностей в фолдинге термолизин-подобных металлопротеиназ.

1.4. Молекулярные механизмы, определяющие стабильность белков.

1.5. Молекулярные основы стабилизации термолизин-подобных металлопротеиназ.

1.6. Структурно-функциональная организация бактериальных глутамилэндопептидаз.

1.6.1. Общее описание группы сериновых протеиназ.

1.6.2. Основные физико-химические свойства глутамилэндопептидаз.

1.6.3. Субстратная специфичность глутамилэндопептидаз.

1.6.4. Первичные структуры известных глутамилэндопептидаз.

1.6.5. Особенности пространственной организации глутамилэндопептидаз.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Микробные штаммы.

2.2. Культивирование микроорганизмов.

2.3. Трансформация клеток В.яиЫШз.

2.4. Количественное определение белка.

2.5. Определение активности протеолитических ферментов.

2.6. Анализ субстратной специфичности протеиназ.

2.7. Определение амино-концевой последовательности.

2.8. Анализ уровня термостабильности неочищенных ферментов.

2.9. Ингибирование ферментов.

2.10. Определение энзиматических констант.

2.11. Очистка С1и-специфичной протеиназы ТкегтоасНпотусез эр.

2.12. Выделение рекомбинантных металлопротеиназ В. amyloliquefaciens и B.brevis.

2.13. Выделение рекомбинантной глутамилэндопептидазы B.intermedius.

2.14. Определение молекулярных масс ферментов.

2.15. Определение аминокислотного состава.

2.16. Определение рН-оптимумов активности ферментов.

2.18. Анализ термостабильности ферментов.

2.19. Анализ рН-стабильности ферментов.

2.20. Выделение плазмидной ДНК.

2.21. Выделение ДНК бактериальных хромосом.

2.22. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот.

2.23. Ферментативный гидролиз ДНК.

2.24. Конструирование банков генов.

2.25. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.26. Конструирование генетических векторов для получения химерных 101 протеолитических ферментов.

2.27. Сайт-направленный мутагенез.

2.28. Статистическая обработка данных.

2.29. Стереопредставление молекул.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Скрининг микробных штаммов с целью выявления продуцентов протеолитических ферментов, перспективных для практического использования.

3.2. Выделение и характеристика новой Glu,Asp-специфичной глутамилэндопептидазы Thermoactinomyces sp. Ill

3.3. Клонирование генов протеолитических ферментов.

3.4. Предварительная характеристика продуктов экспрессии клонированных генов.

3.4.1. Предварительная характеристика рекомбинантной металлопротеиназы B.cereus.

3.4.2. Предварительная характеристика рекомбинантных металлопротеиназ

В. bervis 2С и В. brevis IX12b.

3.4.3. Предварительная характеристика рекомбинантной металлопротеиназы B.stearothermophilus.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурные детерминанты, существенные для функционирования и стабильности протеолитических ферментов"

Прикладное значение протеолитических ферментов.

Современная биотехнология представляет собой необычайно быстро развивающееся направление исследований, охватывающее все новые технологические процессы - от уничтожения токсичных загрязнений окружающей среды и переработки промышленных отходов до создания новейших лекарственных препаратов, диагностикумов и биоиндикаторов. В огромной степени успехи в развитии биотехнологии связаны с использованием разнообразных ферментов или ферментативных систем, позволяющих, с одной стороны, оптимизировать традиционные производства на основе замены химических подходов энзиматическими или за счет повышения эффективности уже существующих ферментативных процессов, а с другой - развивать совершенно новые направления. При этом, как создание новых энзиматических процессов, так и модификация уже существующих предполагают возможность удачного сочетания характеристик используемых ферментов и параметров проведения реакций. Очевидно, что в большинстве случаев препятствием на пути повышения эффективности реакции являются ограничения, связанные со свойствами ферментов - низкой удельной активностью, несовпадением оптимума активности с реализуемыми условиями, недостаточной стабильностью при желательных значениях рН и температуры и т.п. По-видимому, наилучшим вариантом явилась бы возможность непосредственного конструирования фермента, свойства которого полностью удовлетворяли бы параметрам разрабатываемого процесса, а также возможность последующей модификации его характеристик в соответствии с возникающими изменениями технологической схемы. Успехи современной белковой инженерии, во многом связанные именно с исследованиями, направленными на оптимизацию биотехнологических производств, позволяют надеяться, что уже в достаточно скором времени конструирование фермента "под конкретный процесс" de novo или на основе имеющихся полимерных молекул станет обычной лабораторной практикой. Однако, на настоящее время наши знания о молекулярных механизмах, определяющих структурно-функциональные взаимосвязи в белковых молекулах, не достаточны для направленного конструирования ферментов с заданными свойствами. В связи с этим стандартная стратегия предусматривает поиск природных ферментов, характеристики которых более или менее отвечают требованиям исследователей, и последующую (как правило относительно незначительную) их модификацию методами белковой химии или генетической инженерии.

Привлекательность использования микробных ферментов связана, в первую очередь, с их огромным разнообразием, относительной легкостью скрининга и наработки в количествах, достаточных для детальной физико-химической и энзиматической характеристики, а также с возможностью относительно простого конструирования промышленных суперпродуцентов на основе природных или лабораторных бактериальных штаммов. В настоящее время количество используемых в биотехнологических процессах микробных ферментов насчитывает несколько сотен, а уровень производства некоторых из них достигает сотен тысяч тонн в год. При этом необходимо подчеркнуть, что в последние годы все больший интерес вызывают ферменты микроорганизмов, обитающих в уникальных природных (или искусственно созданных) экосистемах - геотермальных полях, вулканах, гейзерах, вечной мерзлоте, могильниках радиоактивных или токсичных отходов, областях, загрязненных промышленными отходами, системах охлаждения ядерных реакторов и т.п. Одной из основных причин такого интереса является надежда на обнаружение ферментов, проявляющих неизвестные ранее активности, либо способных функционировать в экстремальных условиях. Пожалуй, наиболее высок интерес к термофильным и гипертермофильным микроорганизмам, использование ферментов которых положило начало новому направлению работ - термобиотехнологии. Действительно, одним из ключевых требований, предъявляемым к ферментам, используемым в биотехнологических процессах, является их высокая стабильность, причем во многих случаях именно термостабильность. Хотя среди белков мезофильных микроорганизмов также встречаются термостабильные ферменты, способные функционировать при температуре около такие случаи достаточно редки. В то же время термофильные и гипертермофильные микроорганизмы являются богатейшим источником высокостабильных ферментов, многие из которых представляют значительную ценность для биотехнологии. Несмотря на то, что первые работы по детальной характеристике ферментов гипертермофилов были выполнены совсем недавно, в этой области достигнут значительный прогресс. В настоящее время в распоряжении иследователей имеются данные о первичных и пространственных структурах многих термостабильных ферментов, проведены работы по клонированию и экспрессии соответствующих генов. Однако большинство вопросов, как научных, так и технологических, далеки от разрешения. В первую очередь, несмотря на наличие большого количества разнообразных исследований (результаты некоторых из них будут подробно обсуждены в дальнейшем), остаются неясными молекулярные механизмы, определяющие стабильность белков. Очевидно, что понимание этих механизмов дало бы ученым и технологам огромные возможности для направленного изменения характеристик ферментов и разработки оптимизированных биотехнологических процессов. По-видимому, наиболее перспективным в этом плане направлением исследований, обещающим реальные результаты в данной области, является детальная сравнительная характеристика термостабильных ферментов и их мезофильных или психрофильных аналогов, включая эксперименты по направленному мутагенезу, конструированию химерных ферментов и т.д. Однако исходным условием для осуществления таких работ является наличие значительного количества разнообразных термостабильных ферментов и соответствующих клонированных генов.

Таким образом, весьма существенным вопросом является скрининг коллекций термофильных и гипертермофильных микроорганизмов с целью обнаружения ферментов с заданной специфичностью и клонирование генов, определяющих их биосинтез. При этом анализ гипертермофилов вызывает значительные проблемы, связанные с трудностью их изоляции и культивирования. Одним из способов преодоления этого препятствия является развиваемый в последнее время подход, основанный на выделении суммарной ДНК представителей того или иного микробного сообщества (например, из образцов, полученных в районах геотермальных полей) с последующим клонированием фрагментов этой ДНК и анализом полученных генетических библиотек.

По-видимому, чрезвычайно существенное влияние как на анализ молекулярных механизмов термостабильности белковых молекул, так и на исследование природы термофилии в целом, окажет развитие программ по установлению полных последовательностей геномов микроорганизмов. В настоящее время известны полные нуклеотидные последовательности целого ряда микроорганизмов, в том числе термофильных и гипертермофильных, и их количество быстро растет. Естественное развитие этого процесса должно привести к тому, что вместо биохимического анализа микробных штаммов исследователь будет осуществлять компьютерный анализ банка соответствующих нуклеотидных последовательностей, после чего необходимый ген будет "прицельно" клонироваться из ДНК идентифицированного микроорганизма. Однако анализ секвенированных на настоящий момент геномов термофильных микроорганизмов показал, что лишь небольшая часть их генов кодирует белки, имеющие заметную гомологию с уже охарактеризованными ферментами. Представляется вероятным, что уже в недалеком будущем идентификация класса фермента будет эффективно осуществляться на основе, например, анализа мотивов аминокислотной последовательности. Но, по-видимому, еще в течение довольно значительного времени основным источником высокостабильных ферментов останутся термофильные и гипертермофильные микроорганизмы, идентифицированные при направленном скрининге микробных коллекций, а также сконструированные на базе клонированных генов рекомбинантные продуценты.

Данная работа посвящена анализу микробных коллекций, направленному на идентификацию бактериальных штаммов, продуцирующих перспективные для практического использования ферменты, в том числе характеризующиеся повышенной термостабильностью, а также на изучение молекулярных механизмов, обеспечивающих стабильность и определяющих субстратную специфичность действия протеиназ -пожалуй, наиболее широко используемых в биотехнологии ферментов. Действительно, по текущим оценкам около 60% годового оборота индустриальных ферментов [1] приходится на долю протеиназ. При этом интересно отметить, что основных производителей протеолитических ферментов (таблица 1) совсем немного.

Табл. 1. Основные производители промышленных протеолитических ферментов.

Компания Страна Доля в производстве

Novo industries Дания 40%

Gist-Brocades Нидерланды 20%

Genecor International США 10%

Miles Laboratories США 10%

Другие 20%

Высокий спрос на протеолитические ферменты связан с их крупномасштабным использованием при производстве моющих средств, а также в пищевой и кожевенной промышленности. Так, на долю протеиназ, используемых в стиральных порошках, приходится 25% всего рынка индустриальных ферментов. Напомним, что первый энзиматический стиральный порошок "Burnus" был выпущен на основе грубого панкреатического экстракта рогатого скота в 1913 г. Включение в состав моющих средств бактериальных ферментов началось в 1956 г. (препарат ВЮ-40). В настоящее время практически все популярные энзиматические моющие средства изготовляются на основе сериновых протеиназ, продуцируемых различными видами бацилл (обычно в сочетании с липазами, амилазами и целлюлазами). Такая популярность бациллярных протеиназ связана с хорошим соответствием их свойств требованиям, предъявляемым к "идеальному ферменту для стирки" - широкой субстратной специфичностью, стабильностью в присутствии окисляющих и хелатирующих агентов, активностью при высоких значениях рН. Следует отметить, что выдвигавшиеся до недавнего времени повышенные требования к температурной стабильности фермента сейчас существенно снижены в связи с переходом на низкотемпературные режимы стирки. Следующими по перспективности использования в моющих средствах являются щелочные протеиназы грибов.

Если использованию протеиназ в изготовлении моющих средств насчитывается менее 90 лет, то их применение в пищевой промышленности и, наиболее широко, в сыроделии, гораздо древнее. Традиционным источником ферментов в сыроделии является сычуг - содержимое четвертого отдела желудка питающихся молоком телят. Основной фермент сычуга, необходимый для созревания сыра — химозин, представляет собой аспартильную протеиназу (ЕС 3.4.23.4), специфически расщепляющую в молекуле казеина (основного белка молока) пептидную связь Pheios-Metio6 с образованием рага-к-казеина и макропептида. Все возрастающие объемы мирового производства сыров обусловили возрастание спроса на химозин и привели к необходимости поиска его доступных и дешевых аналогов. Использование в этом качестве микробных протеиназ оказалось не слишком успешным в связи с двумя основными проблемами. Протеиназы микроорганизмов, как правило, не удается полностью инактивировать в процессе пастеризации из-за их достаточно высокой термостабильности и, что еще более существенно, пептиды, образующиеся в результате гидролиза казеина данными ферментами, имеют выраженный горький вкус. Это драматически снижает качество и стоимость сыров. Тем не менее, на базе Mucor michei, Bacillus sabtilis и Endothia parasitica удалось разработать несколько генетически модифицированных штаммов, продукты которых могли отчасти заменить химозин в сыроварении. Принципиальное решение проблемы было получено в 1988 г. и связано с созданием генно-инженерного продуцента химозина (Genecor International). К настоящему времени имеются три коммерчески доступных препарата рекомбинантного химозина, однако, ни один из них еще не получил разрешения на применение в сыроделии.

В то же время проблема горького вкуса, присущего продуктам, образующимся при гидролизе белков различными микробными протеиназами, является достаточно существенной, поскольку ограничивает возможность использования этих ферментов и в других областях пищевой промышленности, например, при создании диетических продуктов на базе соевой муки, при производстве детского питания, фармацевтических питательных смесей и ароматизирующих добавок. Показано, что горький вкус обуславливается в основном образованием пептидов, содержащих на амино- или карбокси- концах остатки гидрофобных аминокислот. В связи с этим начаты разработки ферментативных смесей, содержащих кроме основной протеиназы добавки амино- и карбоксипептидаз. В настоящее время на рынок уже выпущен коммерческий препарат аминопептидазы "Debitrase", предназначенный для снижения горечи гидролизатов.

Говоря об использовании протеолитических ферментов в пищевой промышленности, необходимо также, хотя бы кратко, остановиться на производстве хлебно-булочных изделий и синтезе аспартама. В пекарской промышленности использование протеиназ, в основном, связано с необходимостью ограниченного гидролиза клейковины - нерастворимого белка, присутствующего в пшеничной муке. Применение для этой цели эндо- и экзопротеиназ Aspergillus oryzae позволяет существенно улучшить качество теста, упростить процесс производства и увеличить его продуктивность.

Аспартам, дипептид L-аспарагиновой кислоты и метилового эфира L-фенилаланина, представляет собой некалорийный искусственный подсластитель, одобренный к применению в пищу. Необходимым условием наличия сладкого вкуса у данного соединения является сохранение L- конфигурации обоими аминокислотными остатками, что делает предпочтительным его энзиматический синтез. Промышленное производство аспартама основано на использовании иммобилизованного термолизина -металлопротеиназы Bacillus thermoproteolyticus, или его аналогов. Крупнейшими производителями аспартама являются компании Toya Soda (Япония) и DSM (Нидерланды).

Весьма существенный вклад в мировой оборот протеолитических ферментов вносит их использование в кожевенной промышленности. Технология выделки кож включает ряд последовательных процессов, в том числе, вымачивание, обезволашивание, дубление, смягчение и др. Традиционные методы обработки включают использование высокоактивных химических соединений, что приводит к загрязнению окружающей среды. Использование протеолитических ферментов в процессах обезволашивания и смягчения позволяет значительно снизить экологическую вредность данного производства. При этом протеиназы используются также для избирательного гидролиза неколлагеновых белковых составляющих кож, удаления нефибриллярных белков и т.д. Необходимо отметить, что обработка кож происходит при щелочных значениях рН, на некоторых стадиях в присутствии неионных или анионных детергентов, гашеной извести и других реагентов. В связи с этим наибольшее применение в кожевенной промышленности нашли сериновые протеиназы. Например, на стадии смягчения кож после дубления используется смесь панкреатического трипсина с микробными ферментами Bacillus и Aspergillus, что представляет несомненный прогресс по сравнению с ранними методологиями, предусматривавшими использование в качестве источника ферментов фекалий крупного рогатого скота. Существенным моментом является тот факт, что на разных стадиях обработки представляется удобным использовать различные протеиназы. При этом выбор используемого фермента существенно варьирует в зависимости как от типа и качества обрабатываемых кож, так и от других параметров. Это определяет потребность в разработке различных ферментативных препаратов. Так, например, компания Novo Nordisk в настоящее время производит для кожевенной промышленности три различных фермента - Aquaderm, NUE и Pyrase, используемые при вымачивании, обезволашивании и смягчении кож соответственно.

Еще одной группой протеолитических ферментов, представляющейся исключительно перспективной в плане биотехнологического использования, являются коллагеназы. Основных направлений, связанных с применением коллагенолитических ферментов, на наш взгляд, два. Это деградация коллаген-содержащих отходов и обработка мясных продуктов с целью повышения их сортности.

Напомним, что коллагеновая ткань представляет собой основной компонент внеклеточного матрикса соединительных тканей животных, входящий в состав сухожилий, фасций, тканей костей, зубов и др. Несмотря на значительное количество типов коллагенов, несколько различающихся по структуре и свойствам в зависимости от вида соединительной ткани, возраста и состояния животного, их основу составляет молекула, состоящая из трех полипептидных цепей, свертывающихся вокруг общей оси и формирующих характерную тройную спираль. Структура спирали стабилизируется значительным количеством водородных связей, что обеспечивает ее высокую стабильность и, в том числе, устойчивость к действию протеолитических ферментов. Отличительным свойством коллагеновых молекул является их уникальный аминокислотный состав, характеризующийся значительным содержанием глицина, пролина и оксипролина. Так, более 90% молекулы коллагена занимает повторяющаяся последовательность Gly-Pro-X, где X - любая аминокислота, но в основном -оксипролин.

Отходы производств мясной и кожевенной промышленности характеризуются содержанием значительных количеств нативного или частично денатурированного коллагена. Поскольку в нормальных условиях данный белок, тем более в составе фрагментов соединительной ткани, практически не растворим, то содержащие его отходы имеют форму больших количеств (сотни тонн) обогащенного белком ила, уничтожение которых, как правило, сводится к отстаиванию и захоронению в специально отведенных "могильниках". Проблема переработки коллагенсодержащих отходов, в основном, связана с экономическими и экологическими трудностями, сопутствующими крупномасштабному химическому гидролизу коллагеновых илов. Их биологическая деградация была бы существенно предпочтительней. При этом особенно привлекательной представляется идея использования при утилизации в качестве действующего начала не ферментного препарата, а специализированных микробных культур. Основной проблемой на этом пути является тот факт, что уникальный аминокислотный состава и характерная пространственная структура коллагена существенно сужают спектр протеолитических ферментов, которые могут быть использованы для его эффективного гидролиза [2-7].

Аналогичные проблемы возникают и при разработке методологий протеолитической обработки мясных продуктов. Отметим, что применение в пищевой промышленности препаратов, позволяющих повышать качественные показатели низкосортного мясного сырья и создавать на его основе продукты с улучшенными свойствами, является одним из основных подходов, используемых в мире для преодоления белкового дефицита, составляющего в настоящее время по данным ФАО и ВОЗ около 15 млн. тонн в год. При этом ключевой характеристикой мяса является наличие в нем соединительной ткани (коллагена), от содержания которой зависит сортность и качество вырабатываемой продукции. Чем больше соединительной ткани, тем ниже сорт мяса и качества продукта, тем хуже оно усваивается в организме человека.

В мировой и отечественной практике предпринимались попытки использования протеолитических ферментов для гидролиза коллагена и "умягчения" низкосортного мяса. Широко известны такие препараты как Protease U-200 (Франция), Pronase V-500 (США), Amano (Япония), Протосубтилин Г-20 Ренниномин П10Х, Прототерризин, препарат из гепатапанкреаса краба (Россия), а также протеолит для получения мясного гидролизата, разработанный фирмой Maizema GWbH (ФРГ) на основе микробных протеиназ Bacillus subtilis, Aspergillum niger и Aspergillum melleus. Однако эти препараты, в том числе, и в связи с неоптимальными свойствами использованных ферментов (относительно низкой активностью по отношению к нативному коллагену и высоким значением температурного оптимума протеолитической активности), не нашли широкого применения в практике.

По специфичности действия коллагенолитические ферменты подразделяются на "истинные" и "неспецифические". При этом "истинные" коллагеназы способны гидролизовать только коллаген и его производные, в то время как "неспецифические" проявляют активность и по отношению к другим белковым субстратам. В плане практического использования, для расщепления соединительной ткани в составе мясопродуктов "истинные" коллагеназы представлятся несколько более перспективными, однако определяющее значение при оценке препарата имеет себестоимость фермента, его удельная активность и температурный оптимум действия. Следует особо подчеркнуть, что одним из основных условий, предъявляемых к препаратам коллагенолитиков, используемых в пищевой промышленности, является возможность их эффективного действия при пониженных температурах, определяемых технологиями приготовления и хранения мясопродуктов (4-100 С).

На наш взгляд, наиболее перспективным подходом на настоящий момент является получение коллагеназ на основе природных либо генно-инженерных микробных штаммов. В литературе описан ряд микроорганизмов, продуцирующих высокоспецифические коллагенолитические ферменты. Пожалуй, наиболее известным является препарат коллагеназы Clostridium hystolyticus (Sigma, Serva, Fluka) [8-10]. Данный микроорганизм продуцирует в культуральную жидкость спектр протеолитических ферментов, часть из которых является "истинными", а часть -"неспецифическими" коллагеназами. Эффективный гидролиз коллагеновой ткани, протекающий в ходе патогенеза данного микроорганизма, обусловлен синнергическим действием этих коллагеназ. Аналогичный механизм продемонстрирован также для Clostridium perfringens. Ряд индивидуальных ферментов, формирующих коллагенолитический комплекс данных микроорганизмов, выделен и хорошо охарактеризован. Однако сложность ростовых сред, анаэробные условия выращивания, высокий температурный оптимум активности ферментов и, главное, высокая патогенность данных микроорганизмов исключают возможность их использования в качестве крупномасштабного источника коллагеназ. Это же заключение справедливо и в отношении, например, таких микроорганизмов как Actinomardura, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Porphyromonas gingivalis, также секретирующих значительные количества коллагенолитических ферментов, играющих существенную роль в их патогенезе.

Перспективным источником коллагенолитических ферментов различного назначения могут явиться микроорганизмы родов Streptomyces и Actinomyces [11-13], а также грибы рода Aspergillus, несомненным преимуществом которых является то, что их коллагенолитическая активность определяется, по-видимому, одним конкретным ферментом [14,15].

Необходимо упомянуть также ферменты субтилизинового ряда, способные гидролизовать коллаген по "неспецифическому" типу. Ферменты данной группы продуцируются бациллами и лежат в основе большого количества различных композиций протеолитического направления.

В литературе имеется большое число и других публикаций, посвященных выделению и характеристике коллагенолитических ферментов из различных источников и, в том числе, разнообразных микроорганизмов. Однако до сих пор не идентифицированы микробные ферменты, позволяющие эффективно расщеплять коллагеновые волокна при пониженных температурах. В то же время, широкая распространеность коллагенолитических ферментов среди микроорганизмов, а также протекание всем известных процессов расщепления микробами коллагеновой ткани на холоду (деградация коллагеновых отходов в отстойниках предприятий кожевенной промышленности, порча мяса в холодильных камерах) позволяет твердо надеяться на возможность идентификации перспективных для промышленного использования коллагеназ при достаточно широком направленном скрининге психрофильных микроорганизмов.

Несомненно, что приведенные выше сведения отнюдь не охватывают всех аспектов практического использования протеолитических ферментов, в том числе не затрагивают таких существенных моментов, как применение протеиназ в медицине, парфюмерии и научных исследованиях. Однако использованные примеры не оставляют сомнений в исключительной практической значимости и коммерческой привлекательности ферментов данного класса.

При этом не вызывает сомнений тот факт, что природные источники протеолитических ферментов, как эукариотические так и микробные, как правило, имеют целый ряд серьезных недостатков - в первую очередь, это невысокая продуктивность, сложности в наработке, выделении и очистке ферментов, неоптимальные условия ферментации в случае микроорганизмов и т.д. Все это приводит к необходимости создания генно-инженерных продуцентов протеиназ. В настоящий момент более 50 % всех индустриально привлекательных протеолитических ферментов продуцируются рекомбинантными микроорганизмами. Однако увеличение уровня продукции фермента и понижение его себестоимости - лишь одна сторона вопроса. Другая состоит в том, что физико-химические и энзиматические свойства даже тщательно подобранных ферментов зачастую являются неоптимальными для конкретных биотехнологических процессов. В то же время, доступность соответствующих генов и наличие данных о пространственной структуре многих протеиназ делает эту группу ферментов весьма удобной модельной системой для модификации их свойств методами белковой инженерии.

Основные практические задачи, преследуемые в таких экспериментах, являются достаточно очевидными и, как правило, актуальны и для коммерчески используемых ферментов других групп. Это, в первую очередь, изменение субстратной специфичности, рН и температурного оптимума функционирования и повышение стабильности.

К настоящему времени проведены многочисленные исследования, направленные на изменения этих параметров как у различных протеолитических ферментов, так и на других экспериментальных моделях, и в ряде случаев были получены положительные результаты [16-19]. Однако основным выводом из этих работ является то, что наше понимание структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах и молекулярных механизмов их функционирования весьма далеко от совершенства и эта важнейшая область молекулярной биологии нуждается в дальнейшем развитии.

В последующих разделах литературного обзора будут проанализированы особенности структурно-функциональной организации протеолитических ферментов двух групп, изучению которых посвящена основная часть экспериментальных исследований автора: термолизин-подобных металлопротеиназ и химотрипсин-подобных сериновых протеиназ.

Актуальность работы. Данная работа посвящена анализу микробных коллекций, направленному на идентификацию бактериальных штаммов, продуцирующих перспективные для практического использования ферменты, в том числе характеризующиеся повышенной термостабильностью, а также на изучение молекулярных механизмов, обеспечивающих стабильность и определяющих субстратную специфичность действия протеиназ. Все это определяет ее высокую актуальность. Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований и ГНТП «Новейшие методы биоинженерии».

Цель работы. Целью работы явился поиск новых природных ферментов, перспективных для практического использования, и изучение структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах на модели протеолитических ферментов.

Научная новизна. В ходе данной работы впервые был сконструирован набор гибридных генов, кодирующих функционально активные химерные протеолитические ферменты, и продемонстрирована возможность получения стабильных протеиназ со значительно модифицированной структурой. На основе детального анализа свойств сконструированных химерных ферментов локализованы ранее не идентифицированные районы молекулы, существенные для стабильности и функционирования белка в целом.

На основе анализа установленных первичной и пространственной структур глутамилэндопептидазы Bacillus inter médius - продукта экспрессии клонированного гена, детальной характеристики свойств нативного белка и его мутантного аналога, предложена модель функциональной организации данного фермента и выдвинута гипотеза о существовании функциональных детерминант нового типа, вовлеченных в процесс распознавания глутамилэндопептидазами заряженных субстратов. Практическая значимость. В ходе данной работы проведен широкомасштабный скрининг, направленный на поиск новых протеолитических ферментов, перспективных для научного и практического использования. Идентифицирован ряд микробных штаммов, продуцирующих высокостабильные нейтральные и сериновые протеиназы, коллагеназы, активные при пониженной температуре, и высокоспецифичную глутамилэндопептидазу. Клонирован и экспрессирован набор генов, кодирующих протеолитические ферменты идентифицированных микроорганизмов. Осуществлена характеристика продуктов их экспрессии.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Костров, Сергей Викторович

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенного широкомасштабного скрининга, направленного на поиск новых протеолитических ферментов, перспективных для научного и практического использования, идентифицировано 14 микробных штаммов, продуцирующих высокостабильные нейтральные и сериновые протеиназы, 3 штамма, продуцирующих коллагеназы, активные при пониженной температуре, штамм ТкегтоасНпотусез яр., продуцирующий высокоспецифичную глутамилэндопептидазу и ряд штаммов, продуцирующих протеолитические ферменты со средним уровнем термостабильности. Клонированы и экспрессированы гены, кодирующие следующие протеолитические ферменты идентифицированных микроорганизмов - сериновую протеиназу ТкегтоасНпотухех яр., металлопротеиназы В.х1еаг(ПкегторЫ1ш, В.сегеш и двух различных штаммов В. ЪгехЫ. Осуществлена характеристика продуктов экспрессии клонированных генов.

2. На основе рекомбинации между фрагментами генов секреторных металлопротеиназ В. Ьгеу'м и В.ату1оИдие/ас1ет сконструирован набор гибридных генов, кодирующих функционально активные химерные протеолитические ферменты. Возможность получения стабильных протеолитических ферментов со значительно модифицированной структурой продемонстрирована впервые.

3. Установлена первичная структура шести различных химерных металлопротеиназ. Соответствующие ферменты получены в очищенном виде и детально охарактеризованы. Данные об уровнях термостабильности природных и химерных металлопротеиназ в сочетании с анализом известных первичных и пространственных структур различных ферментов данного семейства позволили локализовать ранее не идентифицированный район молекулы, существенный для термостабильности белка в целом.

4. Анализ энзиматических характеристик химерных протеолитических ферментов показал, что модификация областей молекулы, удаленных от активного центра и субстрат-связывающего района, может влиять на эффективность катализа.

5. Ген глутамилэндопептидазы В. МегтесИт клонирован и экспрессирован в клетках В.яиЪиШ. Определена его полная нуклеотидная последовательность. Соответствующий рекомбинантный фермент выделен и детально охарактеризован.

173

Показано, что глутамнлэндопептидаза корректно процессируется при ее биосинтезе в клетках B.subtilis и по своим физико-химическим и энзиматическим характеристикам не отличается от природного аналога. Анализ первичной и установленной пространственной структуры данного фермента позволил предложить модель функциональной организации глутамилэндопептидазы В. intermedius.

6. С целью изучения молекулярных механизмов, определяющих специфичность действия бактериальных глутамилэндопептидаз, сконструирован мутантный вариант фермента В. int er médius, несущий аминокислотную замену His^/Thr. Функционально активная глутамнлэндопептидаза с модификацией в данной позиции, считавшейся до настоящего момента ключевой в формировании субстратной специфичности ферментов этой группы, получена впервые. Мутантный фермент выделен и детально охарактеризован. Показано, что введенная замена не привела к изменению специфичности его действия. Полученные данные свидетельствуют об ошибочности общепринятой модели, описывающей молекулярный механизм распознавания субстрата бактериальными глутамилэндопептидазами. Анализ совокупности известных и полученных в данной работе данных позволил выдвинуть гипотезу о существовании функциональных детерминант нового типа, вовлеченных в распознавание глутамилэндопептидазами заряженных субстратов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора химических наук, Костров, Сергей Викторович, Москва

1. Godfrey. Т. and S. West. //1996. Industrial enzymology. 2nd ed. Macmillan Publishers Inc. New York, N.Y. P. 3.

2. Burgenson R.E. New collagens, new consept.// 1988.Ann.Res.Cell.Biol. 4:551-557.

3. The Enzymes. Ed.Harihara B. 1960. N.Y. Acad.Press. 4:193-320.

4. Collagenases and Elastases. Adv.Enzymol. Ed.Nord F.F. 1961. N.Y.Acad. Press. 23:163-264.

5. Assays in Biochemistry. Eds.Campbell P.N., Greville C.D: 1969. N.Y.Acad. Press. 5:59-66.

6. Proteolytic Enzymes. Eds. Colowick S.P., Kaplan N.O.// Metods in Enzymology. 1970. 14(B):861-872.

7. Демина H.C., Лысенко C.B. Коллаганолитические ферменты, синтезируемые микроорганизмами.// 1996. Микробиология.65(3):293-304.

8. Susagawara R., Harper Е. Purification and characterization of three forms of collagenase from Clostridium histolyticum. // 1984. Biochemistry. 23:5175-5182.

9. Yiotakis A., Hatgiyannacou A., Dive Y., Toma F. New thiol inhibitors of Clostridium histolyticum collagenase. Important of the P3' position. // 1988. Europ. J. Biochem. 172:761-766.

10. Park K.B., Lable R.C. Purification and characterization of intracellular proteases of Clostridium perfringens type A.//1991. Canad J. Microbiol. 37:19-27.

11. Peszynska-Czoch W., Nordaraki M. Actinomyces enzymes.// 1988. Actinomyces in biotechnol. Ed. Goodfellow M. N.Y.Acad.Press. 219-283.

12. Renco M., Vitale Lj., Kokaly M., Pokorny M. Streptomyces rimosus extracellular proteases. 4. Trypsin-like proteinase. // 1988. Appl. Microbiol. Biotechnol. 31(1):38-41.

13. Galas H., Kalusewaka N.J. Proteinases of Streptomyses fradiae. I. Preliminary characterisation and purification.// 1989. Acta Microbiol. Polonica. 38(34):247-258.

14. Mizaki Т., Yamada Т., Sawada J. Studies on the protease constitution of Aspergillus oryzae.// 1970. Agric.Biol.Chem. 34(9):1383-1392.

15. Barthomeuf C., Pourrat H., Pourrat A. Collagenolytic activity of a new semi-alkaline protease from Aspergillus niger.// 1992. J. Fermentation and Bioengineering. 73:2324.

16. Thomas. P.G., A.J. Russell and A.R. Fersht. Tailoring flu pH dependence of enzvme catalysis using protein engineering. // 1985 Nature 28:375-376.

17. Wells J.A. and D.B Powers. In vivo formation and stability of engineered disulfide bonds in subtilisin. // 1986 J. Biol. Chem. 261 6564-6570.

18. Barett A.J. Proteolytic enzymes: aspartic and metallopeptidases.// 1995. Methods in Enzymol. 248:183-191.

19. Hibbs M.S., K.A. Hasty, J.M. Seyer, A.H. Kang and C.L. Mainardi. Biochemical and immunological characterization of the secreted forms of human neutrophil gelatinase. // 1985. J. Biol. Chem. 260:2493-2500.

20. Okada Y., H Nagase, and E D Harris. A metalloproteinase from human rheumatoid synovial fibrohlasts that digests connective tissue matrix components. Purification and characterization. // 1986 J. Biol. Chem. 261:14245-14255.

21. Shannon J.D., E.N. Baramova, J.B. Bjarnason and J W Fox. Ammo acid sequence of a Crotalus atrox venom metalloprotease which cleaves type IV collagen and gelatin. // 1989 J. Biol. Chem. 264:11575-11583.

22. Weaver L.H., W.R. Kester and B.W. Matthews. A crystallographic study of the complex of phosphoramidon with thermolysin. A model for the presumed catalytic transition state and for the binding of structures. //1977. J. Mol. Biol. 114:119-132.

23. Titani K., Hermodson M.A., Ericsson L.H., Walsh K.A., Neurath H. Amino-acid sequence of thermolysin.// 1972 Nature New Biol. 238:35-37.

24. Nishiya Y.; Imanaka T. Cloning and nucleotide sequences of the Bacillus stearothermophilus neutral protease gene and its transcriptional activator gene. // 1990. J. Bacteriol. 172:4861-4869.

25. Kubo M., Imanaka T. Cloning and nucleotide sequence of the highly thermostable neutral protease gene from Bacillus stearothermophilus.// 1988. J. Gen. Microbiol. 134:1883-1892.

26. Takagi M., Imanaka T., Aiba S. Nucleotide sequence and promoter region for the neutral protease gene from Bacillus stearothermophilus.// 1985. J. Bacteriol. 163:824831.

27. Sidler, W.; Niederer, E.; Suter, F.; Zuber, H. The primary structure of Bacillus cereus neutral proteinase and comparison with thermolysin and Bacillus subtilis neutral proteinase. // 1986. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, 643-657.

28. Kuhn, S.; Fortnagel, P. Molecular cloning and nucleotide sequence of the gene encoding a calcium-dependent exoproteinase from Bacillus megaterium ATCC 14581.// 1993. J. Gen. Microbiol. 139:39-47.

29. Meinhardt F., Busskamp M., Wittchen K.D. Cloning and sequencing of the leu C and npr M genes and a putative spo IV gene from Bacillus megaterium DSM319. // 1994. Appl. Microbiol. Biotechnol. 41:344-351.

30. Takekawa S., Uozumi N., Tsukagoshi N., Udaka S. Proteases involved in generation of beta- and alpha-amylases from a large amylase precursor in Bacillus polymyxa.// 1991. J. Bacteriol. 173:6820-6825.

31. Avakov A.S., Bolotin A.P., Sorokin A.V.; Structure of the Bacillus brevis metalloprotease gene.// 1990. Mol. Biol. (Mosk) 24:1363-1372.

32. Shimada H., Honjo M., Mita I., Nakayama A., Akaoka A., Manabe K., Furutani Y. The nucleotide sequence and some properties of the neutral protease gene of Bacillus amyloliquefaciens.// 1985. J. Biotechnol. 2:75-85.

33. Yoshimura K., Miyazaki T., Nakahama K., Kikuchi M. Cloning and partial nucleotide sequence of neutral protease gene from Bacillus amyloliquefaciens.// 1985. Takeda Kenkyusho Ho 44:42-50.

34. Vecerek B., Kyslik P. Cloning and sequencing of the neutral protease-encoding gene from thermophilic strain of Bacillus sp. // 1995. Gene 158:147-148.

35. Yang M.Y., Ferrari E., Henner D.J. Cloning of the neutral protease gene of Bacillus subtilis and the use of the cloned gene to create an in vitro-derived deletion mutation.// 1984. J. Bacteriol. 160:15-21.

36. Winters P., Caldwell R., Enfield L., Ferrari E. The ampS-nprE (124 degrees-127 degrees) region of the Bacillus subtilis 168 chromosome: sequencing of a 27 kb segment and identification of several genes in the area.// 1996. Microbiology 142:3033-3037.

37. Lee S., Yoon K., Nam H., Chae K. Sequence from n.a. species B.S.Amylosacchariticus. // 1995. Submitted to the EMBL/GenBank/DDBJ databases.

38. Tran L., Wu X.C., Wong S.L. Cloning and expression of a novel protease gene encoding an extracellular neutral protease from Bacillus subtilis. Strain 168.// 1991. J. Bacteriol. 173:6364-6372.

39. Seror S. Sequence from n.a.rx medline; 98015415.// 1996. Submitted to the EMBL/GenBank/DDBJ databases.

40. Medina N. Vannier F., Roche B., Autret S., Levine A., Seror S.J. Sequencing of regions downstream of addA (98 degrees) and citG (289RT degrees) in Bacillus subtilis. // 1997. Microbiology 143:3305-3308.48