Протеолитические ферменты и их ингибиторы в высших грибах

Гзогян, Люсинэ Айказовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Протеолитические ферменты и их ингибиторы в высших грибах
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеолитические ферменты и их ингибиторы в высших грибах"

УДК. 577.15

На правах рукописи

Гзопян Люсинэ Айказовна

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ И ИХ ИНГИБИТОРЫ В ВЫСШИХ ГРИБАХ

03.00.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар 2005

Работа выполнена на кафедре биохимии и физиологии человека и животных Кубанского государственного университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Проскуряков М.Т.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Сухомлин Клавдия Григорьевна

доктор технических наук, профессор, заслуженный деятель науки и !ехники РФ, Щербаков Владимир Григорьевич

Ведущая организация: ФГУ «Краснодарский биоцентр»

Защита состоится «

■/У » 2005г. в //

часов на заседании

диссертационного совета Д 220.038.09 при Кубанском государственном аграрном университете по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кубанского государственного университета.

Автореферат разослан «

<уШЫ- 2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, дбцент

Чернышева Н. В.

1£4в1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Протеолитические ферменты выполняют разнообразные физиологические функции в живом организме: переваривания белков пищи и запасных белков семян, активация зимогенов, образование гормонов, транспорт белков, защитные реакции. В связи с этим изучение механизмов регуляции активности протеолитических ферментов приобретает особую актуальность. Взаимодействие протеиназ с эндогенными белковыми ингибиторами является одним из главных и наиболее древним в эволюционном отношении механизмов регуляции активности протеиназ у живых организмов.

Процессы протеолиза у бактерий, растений и животных изучен достаточно широко и полно. Однако уровень знаний о протеолитических ферментах грибных организмов неравнозначен. Особое место среди мицелиальных грибов занимают базидиомицеты, которые сегодня по праву рассматриваются как перспективные продуценты кормового белка (Бухало АС., 1988). Дефицит животного сырья и несовершенство .микробных препаратов - стимулировали интерес к базидиальным грибам как возможным продуцентам протеолитических ферментов ( Белова Н.В., 1992). Два обстоятельства оправдывают поиск ферментов пищевого и медицинского назначения среди высших базидиомицетов: наличие среди них большого числа съедобных грибов и отсутствие спороношения в культуре, что уменьшает опасность профессиональных в условиях производства (Псурцева Н.В. с соавт., 1994).

Протеолитические ферменты применяются в пищевой, кожевенной, легкой, молочной промышленности. С увеличением выработки сыров возрос интерес к замене животного химозина ферментами другого происхождения. Исследованы культуры базидиомицетов (Каша1 М., 1973) способных синтезировать молокосвертывающие ферменты и установлено, что виды

1грех 1ас(еич и РогшЧор?!^ ртшсхЛа - образуют п роте азы, являющиеся хорошими заменителями химозина.

Особое внимание обращает на себя роль протеолитических ферментов и их ингибиторов в процессе пищеварения у человека и животных. Ингибиторы протеиназ могут в существенной степени затруднять пищеварение белков. С другой стороны, находящиеся в растениях протеолитические ферменты стимулируют этот процесс.

Данные о содержании протеиназ и их ингибиторов в растениях, обнаруженные нами в литературных источниках, касаются, в основном, представителей семейств бобовых, злаковых, пасленовых и тыквенных, реже - зонтичных и крестоцветных. Еще меньше литературных сообщений об активности протеаз и их ингибиторов в представителях класса базидиомицетов.

Нами впервые обнаружена активность эластолитичсских, трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов, а также ингибиторы трипсина в плодовых телах базидиомицетов. Анализ результатов, приведенных в диссертации, позволяет предположить, что на основании данных о протеолитических ферментах и ингибиторах трипсина и химотрипсина в плодовых телах высших грибов возможна идентификация их принадлежности к таксономическому семейству.

Цели и задачи исследования. Целью работы было детальное исследование протеолитической активности по природным и синтетическим субстратам, количественное определение содержания общего и водорастворимого белка, а также установление активности ингибиторов трипсина и химотрипсина в плодовых телах высших базидиомицетов, наиболее распространенных в Краснодарском крае.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать количество белка, активность

трипсиноподобных, химотрипсиноподобных,

эластолитйческйх, кислых и щелочных протеиназ.

2. Количественно охарактеризовать активность ингибиторов трипсина и химотрипсина

3. Установить характер распределения лротеолитической активности по таксономическим группам.

4. Изучить свойства протеиназ высших грибов: термостабильность, оптимум pH активности, интервал pH стабильности.

Научная новизна. Впервые количественно определена активность протеолитических ферментов по природным и ситетическим субстратам, а также активность ингибиторов трипсина и химотрипсина в 18 видах высших грибов, наиболее распространенных в Краснодарском крае. Изучены свойства протеолитических ферментов: термостабильность, оптимум pH активности, интервал pH стабильности.

Установлена связь уровня протеолитической и ингибиторной активности с ^копого—трофическими свойствами базидиомицетов Наибольшая активность протеиназ и ингибиторов обнаружена у сапротрофов, меньшая у ксилотрофов и минимальная у симбиотрофов.

На основе полученных данных в качес1ве продуцентов молокосвертывающих ферментов, нами рекомендованы виды Boletus edulis, В. castanus, Leccinum auranticum, Cantarellius aurantiaca порядка Boletales и Lactarius piperatus порядка Russulales

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Высшие грибы, наиболее распространенные в Краснодарском крае, относящие к классу базидиомицетов, содержат значительное количество общего и водорастворимого белка

2. В грибах обнаружена протеолитическая активность ферментов по молоку, казеину, гемоглобину, а также по синтетическим субстратам определена активность эластолитических, трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов.

3. Установлена активность ингибиторов трипсина и химотрипсина в исследованных видах грибов.

4. Предложена модификация метода Бредфорд для определения количества водорастворимого белка в образцах, содержащих небелковые, а также интенсивно окрашенные примеси в растительных экстрактах.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на заседании биохимического совета Краснодарского отделения Всероссийского биохимического общества 2005г, на биохимическом симпозиуме « Актуальные проблемы биологии, медицины и Экологии» (Томск, 2004), на XVII межреспубликанской научно -Практической конференции «Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий (Краснодар, 2004).

Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации.

' Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания постановки экспериментов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Работа содержит 12 таблиц и иллюстрировано 8 рисунками. Список использованной литературы включает 127 наименований, в том числе 58 зарубежных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проводилась на кафедре биохимии и физиологии человека и животных Кубанского государственного университета в 2000 - 2005 годах.

В качестве объектов исследования были использованы плодовые тела 18 видов высших грибов, принадлежащих к классу базидиомицетов, порядков Agaricales, Boletales, Russulales, Aphyllophorales. Материалом исследования служил сок плодовых тел базидиомицетов, полученный после

измельчения, замораживания и размораживания. Материал хранили в замороженном состоянии при температуре -18°С.

Химазную (молокосвертывающую) определяли методом Пятницкого Активность выражали в единицах Протеолитическую активность щелочных протеиназ определяли по казеину методом М. Кунитца. Активность кисчых протеи наз, определяли с использованием денатурированного гемоглобина методом М. Ансона Активность ферментов по белковым субстратам выражали в единицах оптической плотности Е28о- Трипсиноподобную и химотрипсиноподобную амидазную активности определяли соответственно по синтетическим субстратам бензоил - п- нитроанилиду (БАПНА) и М-сукцинил-Ь-фенилаланин- п- нитроанилиду (СФПНА). Эластолитическую активность определяли по гидролизу Ы-сукципил-триаланин-п-нитроанилида (СТАПНА). Активность выражали в мкМ расщепленного субстрата я минуту.

Активность ингибиторов трипсина и химотрипсина определяли по остаточной активности ферментов и выражали в мг заингибированного фермента на г гриба.

Количество общего белка определяли методом Кьельдаля, содержание растворимого белка определяли методом Бредфорд.

При определении оптимумов рН активности и стабильности ферментов использовали растворы субстрата и образца приготовленные на универсальной буферной смеси с различными значениями рН. Количественные результаты обработаны методами вариационной статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Количество общего и растворимого белка в соке плодовых тел базидиомицетов. Данные о содержании белка были необходимы нам для оценки их пищевой ценности, степени их очистки и удельной активности ферментов, ингибиторов.

Содержание общего белка, определенное методом Кьельдаля, в плодовых гелах колеблется от 12 до 49 % на сухую массу (табл.1).Вид Boletus edulis был самым богатым по содержанию общего белка, а минимальное содержание обнаружено в Coriolus versicolor - 12 %.

Модифицированный нами метод Бредфорд в грибах позволил нам быстро и достаточно специфично определять количество растворимого белка.

Количество растворимого белка, определенное методом Бредфорд колеблется в диапазоне от 1,3 до 7,2 % на сухую массу. Максимальное содержание в Boletus edulis и минимальное в Pleurotus ostreatus. В порядке Agaricales максимальное количество растворимого белка определено в виде Flammulina vclutipcs - 4,1%, в порядке Russulales - Lactarius pubescenb 2,2 % и в порядке Aphyllophorales у Herricium erinaceus - 4,2 %. Содержание растворимого белка от общего в исследуемых образцах колебалось в пределах от 7 до 17 % в зависимости от вида.

Подводя итог обсуждения определения количества белка в плодовых телах, можно сказать, чго предложенная нами модификация метода Бредфорд позволяет количественно определять белок в окрашенных растворах. Максимальное количество общего и водорастворимого белка обнаружено в Boletus edulis порядка Boletales.

2. Ингибиторы протеолитических ферментов. Активность ингибитора трипсина обнаружена в 18 Исследованных видах порядков Boletales', Aphyllopharales, Agaricales, Russulales (табл.1). Ранее обнаружена у видов Pleurotus ostreatus, Flammulina velutipes, Lactarius piperatus, Macrolepiota procera, Agaricus silvaficus, литературные данные совпали с нашими.

Активность ингибитора трипсина во всех исследованных базидиомицетах, находилась в диапазоне от 0,2 до 5,3 мг/г белка гриба.

Таблица 1. Содержание белка и ингибиторов трипсина и химотрипсина в грибах.

Вид гриба Белок, % на сухую массу Ингибитор, мг/г на сырую массу

общий растворимый трипсина химотрипсина

Boletus edulis 49 2,4 3,7 5,6

Leccinum aurantiacum 42 5,2 1,7 0

Leccinum mclanum 35 5,6 5,3 5,9

Bol.etus castanus 27 3,5 1,8 0

Suillus flavidus 38 7,2 2,3 4,2

Cantarellus aurantiaca 30 1,9 3,6 0

Flammulina velutipes 18 4Д 2,0 0

Armillaria mellea 22 1,9 2,0 ' 7,8

Macrolepiota procera 26 4,5 1,1 0

Agaricus silvaticus 38 1,8 1,0 7,4

Amanita phalloides 25 3,6 1,2 0

Pleurotus ostreatus 20 1,3 1,9 0

Plcurotus cornucopiae 17 1,5 0,6 0

Lactarius pubescens 20 2,2 0,4 0

Rusula veska 17 1,9 0,3 0

Lactarius piperatus 18 1,5 1Д 0

Coriolus versicolor 12 3,2 0,2 7,2

Herricium erinaceus 16 4,2 0,4 0

. В порядке Boletales высокой активностью ингибитора обладал Leccinum melanum - 5,3 мг/г и минимальной Leccinum auranticum - 1,8 мг/г.

В порядке Agaricales высокое содержание ингибитора наблюдалось у видов Flammulina velutipes и Armmilaria rnellea - 2,0 мг/i. Внутри порядка Russulales высокой активностью ингибитора трипсина обладал вид Lactarias piperatus -1,1 мг/r, а в порядке Aphyllophorales вид Coriolus versicolor -0,25 мг/r. Для остальных 12 видов данные об актвиности ингибиторов трипсина получены нами впервые.

Ингибитор химотрипсина определен только в 6 из 18 исследованных видов грибов: Boletus edulis, Leccinum melanum, Suillus flavidus, Armmilaria mellea, Coriolus versicolor (табл.1). Максимальное количество ингибитора химотрипсина у Armmilaria mellea - 7,8 мг/г и минимальное у Suillus flavidus - 4,2 мг/г. У видов порядка Russulales ингибитор химотрипсина не обнаружен. В доступной нам литературе, данных об активности ингибитора химотрипсина в грибах нет.

Таким образом, ингибитор трипсина обнаружен во всех изученных нами видах Установлен закономерный характер распределения активности ингибитора трипсина по таксономическим группам: максимальное содержание у видов порядка Boletales, далее следуют порядки Agaricales, Russulales, Aphyllophorales. Активность ингибитора химотрипсина обнаружена только в 6 из 18 видов. Причем активность от 1,1 до 36 раз выше активности ингибитора гринсина в зависимости от вида, минимальное соотношение у вида Leccinum melanum порядка Boletales и максимальная у вида Coriolus versicolor порядка Aphyllophorales. У всех видов порядка Russullales активности ингибитора химотрипсина нет.

3. Активность ферментов по синтетическим субстратам. Нами была исследована активность трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов по субстратам 1Ч-бензоил-0-Ь-аргинин-п-ниргоанилида (БАПНА) и К-сукцинил-Ь-фениалаланин-п-нитроанилид (СФПНА) соответственно. Активность трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов обнаружена во всех исследованных видах (табл.2).

Активность трипсиноподобных ферментов колебалась в диапозоне от 0,3 до 2,2 мкМ.

Таблица 2. Активность, трипсиноподобных, химотрипсиноподобных и эластоли гических ферментов в грибах, мкМ/мин

Вид гриба БАПНА СФПНА СТАПНА

Порядок Во№а1е$

Во1етх еЛШв (Ут.)Зн^ 2,2 4,8 0,24

Ьесспшт аигаписшп (РЯ) Как! 1,8 3,8 0,11

1хссшигп те1апит (РЯ.) Кагя1 1,5 2,4 0,14

Во1еШя са51апиэ (РЯ.) Ка^ 2Д 1,9 0,12

ЧшНпч Л^'Нич (РЯ) Кчшт 1,9 2,3 0,8

СатагеИиБ аигапйаса (РЯ) Ката 1,4 2,4 0,09

Порядок А§апса1е5

ПаттиНпа уе1иЦре8 (РЯ) Каш 1,3 2,4 0

АгттПапа те11еа (РЯ) Ьипс) 1,1 2,3 0

Масго1ерю1а ргосега (РЯ) Smg 1,2 1,9 0

Agaгicus вИуайсиБ (РЯ) Каге1 0,8 2,2 0

АтапНа рЬакпёев (РЯ) Бопк 0,4 1,9 0

Иеиготя с^гсаШБ (РЯ.) Киттег 0,2 2,2 0

ИеигоШз сотисор^ае (РЯ^ Каш 0,3 1,4 0

Порядок КиззиЫеэ

Ьайапив риЬевсепв (РЯ.) виц* 1,6 2,7 0

Яиввик уевка (Ви11) Мигг 1,2 2,5 0

ЬасЬпиз р1регаШБ (РЯ) ВопсЗ 0,9 2,9 0

Порядок АрЬуПорЬогакя

Согю1ив уегасо1ог (РЯ) Яе1б 1,3 1,3 0

Непстт егтасеиэ (РЯ.) Оие! 2,1 2Д 0

Среди видов четырех порядков наиболее высокая активность обнаружена в порядке Boletales, где максимальная активность у видов Boletus edulis - 2,2 мкМ и минимальная у Cantarellus aurantiaca - 1,4 мкМ. В порядке Agaricales наибольшая трипсиноподобная активность у вида Flammulina velutipes - 1,3 мкМ семейства Tricholomataceae и наименьшая у вида Pleurotus ostreatus - 0,2 мкМ семейства Pleurotaceae. В порядке Russulales максимальное количество трипсиноподобных ферментов наблюдалось у вида Lactarius pubescens - 1,6 мкМ, а минимальное у вида Lactarius piperatus - 0,9 мкМ. В порядке Aphyllophorales активность трипсиноподобных ферментов высокая у вида Hericium

erinaceus - 2,1 мкМ.

Активность химотрипсиноподобных ферментов колебалась от 1,3 до 4,8 мкМ активности. Наиболее высокой обладали грибы порядка Boletales, вид Boletus edulis. В порядке Agaricales высокой активностью отличался вид Flammulina velutipes - 2,4 мкМ; в порядке Russulales Lacatarius piperatus - 2,9 мкМ. Наименьшей химотрипсиноподобной активностью обладали грибы порядка Aphyllophorales, вид Hericium erinaceus -2,1 мкМ.

Между содержанием трипсиноподобных и химотрипсиноподобных фепменгов у всех видов порядков Boletales, Agaricales, Aphyllophorales, Russullales существует положительная корреляционная зависимость г - 0,64. Между трипсинподобными и химотрипсиноподобными ферментами у видов внутри порядков Boletales и Agaricales также наблюдается положительная корреляционная зависимость, г - 0,32 и г - 0,26 соответственно.

Эластолитическая активность обнаружена в самых различных источниках: бактериях, многих видах беспозвоночных и позвоночных животных (Shotton D. М., 1970; Sutherland J. L., et al., 1991). В доступной нам литературе сведений об э ластолитической активности в базидиомицегах нет.

Нами обнаружена эластолитическая активность по субстрату N-сукцинил - триаланин - п-нитроанилиду (СТАПНА) в видах порядка Boletales, которая колебалась от 0,09 до 0,24 мкМ. Высокие значения

активности обнаружены у вила Boletus edulis и минимальные у Cantarellus aurantiaca.

Таким образом, во всех исследованных видах установлена активность трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов. Эластолитическая активность обнаружена только у видов порядка Boletales. Из исследованных видов максимальными значениями активности по всем субстратам обладали виды порядка Boletales и в частности вид Boletus edulis.

3.1 Динамика активности трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов при хранении. Сок, полученный из плодовых тел грибов, хранили при температуре -18°С в течение семи месяцев и при этом наблюдали динамику изменения активности трипсиноподобных ферментов по N-6emowi-D,L аргинин- -п-н итроан ид иду (БАПНА) и химотрипсиноподобных по ]Ы-сукцинил-Ь-фенилаланин-п-нитроанилиду (СФГГНА). В исследованных нами видах активность сохранялась без изменений по сравнению с исходной от 1 до 4 месяцев, в зависимости от вида.

По степени стабильности трипсиноподобных ферментов в замороженном состоянии просматривается 3 группы (рис.1) На рисунке 1 показана динамика изменения активности трипсинподобных ферментов со сроком хранения 1 месяц, 2 месяца и 3 месяца на примере Boletus edulis, Coriolus versicolor, Flammulina velutipes.

К первой группе относятся виды, у которых активность ферментов падала уже на второй месяц: Boletus edulis (рис.la), Suillus flavidus, Lactarius piperatus. Ко второй группе относятся виды, у которых активность трипсиноподобных ферментов сохраняется в течение 2 месяцев: Leccinum auranticum, Cantarellus aurantiaca, Armmilaria mellea, Macrolepiota procera, Agaricus silvaficus, Pleurotus cornucopiae, Lactarius pubescens, Coriolus versicolor, Herricium erinaceus. К третьей группе относятся виды, у которых виды сохраняли активность в течение 3 месяцев: Leccinum melanum, Boletus

castanus, Rammulina velutipes, Amanita phaloides, Pleurotus ostreatus, Russula veska.

« 3 s

¿2-1

III--

~ 1 I I I

0 1 2 3 4 5 6 7 Срок хранения, месяцы

S « 1,5

А 1 •

5 0,5-

< 0-

lllu

0 1 2 3 4 5 6 7 Срок хранения, месяцы

1,5 1 -0,5 О

01234567 Срок хранения,

месяцы

Рис.1 Динамика изменения активности трипсиноподобных ферментов при хранении в течение 7 месяцев: a) Boletus edulis б) Coriolus versicolor в) Flammulina velutipes

В порядке Agaricales у всех видов активность сохранялась в течение 2 месяцев. У вида Flammulina velutipes (рисЛв) активность сохранялась в течение 3 месяцев, затем, постепенно снижалась до 30% от исходной активности. В виде Pleurotus ostreatus активность трипсиноподобных ферментов падала на 50 % от исходной уже на втором месяце хранения. В порядке Russullales максимально стабильны трипсиноподобные ферменты были у вида Russula veska, где активность сохранялась три месяца, далее падает в 2 раза каждый месяц. У вида Lactarius piperatus активность трипсиноподобных ферментов падает до 66% от исходной на 2 месяц хранения. В порядке Aphyllophorales у видов Coriolus versicolor (рис.16) и Herricium erinaceus активность трипсиноподобных ферментов оставалась стабильной в течение двух месяцев и падала до 15 % от исходной.

Активность химотрипсиноподбных ферментов сохранялась намного дольше по сравнению с трипсиноподобными. По степени стабильности в замороженном состоянии просматривается 4 группы (рис.2)

н о о

Ж S3 к

£ <

3 2,5 2

1,5 1

0,5 0

Ilk

0 12 3 4 5 6 7 Срок хранения,

месяцы

0 12 3 4 5 6 7 Срок хранения,

месяцы

0 1 2 3 4 5 6 7 Срок хранения, месяцы

•А

S U

0,5

0 1 2 3 4 5 6 7 Срок хранения, месяцы

Рис.2 Динамика изменения активности химотрипсиноподобных ферментов при хранении 7 месяцев- a) Leccinum melanum б) Amanita phaloides в) Boletus edulis г) Boletus castanus

К первой группе относятся виды, у которых химотрипеиноподобные ферменты сохраняют активность в течение 1 месяца: Leccinum melaum (рис.2а), Flammulina velutipes, Pleurotus cornucopiae, Herricium erinaceus. К второй группе относятся ферменты, где активность сохраняется в ючение 2 месяцев: Amanita phaloides (рис.2б), Coriolus versicolor. К третьей группе относятся виды, у которых активность химогрипсиноподобных ферменюв сохраняется в течение 3 месяцев: Boletus edulis (рис.2в), Leccinum auranticum, Suillus flavidus, Armmilaria mellea, Agaricus silvaficus, Pleurotus ostreatus, Russula veska, Lactarius piperatus. К четвертой группе относятся

виды,где активность сохраняется в течение 4 месяцев: Boletus castanus (рис.2г), Cantarellus aurantiaca, Macrolepiota procera, Lactarius pubescens.

Таким образом, проанализировав динамику изменения активности трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов в исследованных видах базидиомицетов, можно сказать, что стабильность в замороженном состоянии у химотрипсиноподобных ферментов выше, чем трипсиноподобных.

4. Активность протеолитических ферментов по природным субстратам. Нами исследована активность протеолитических ферментов по следующим природным субстратам: молоку, казеину, гемоглобину в 18 исследованных видах базидиомицетов. Во всех изученных грибах наблюдалась активность по всем перечисленным субстратам (табл. 3)

В таблице 3 представлены количественные данные об активности модокосвертывающих ферментов и некоторые их свойства: интервал pH стабильности и действие синтетических ингибиторов на ферменты. Активность по молоку была в диапазоне от 0,2 до 4,9 ед. наиболее высокая молокосвергывающая активность наблюдалась у порядков Boletales несколько ниже у Russulales, Aphylophorales и Agaricales. Внутри порядка Boletales высокая активность отмечена у Boletus edulis - 4,9 ед и минимальная у Leccinum melanura - 1,7 ед. В порядке Russulales выделялся высокой активностью вид Lactarius piperatus - 2,4 ед, а в порядке Agaricales вид Flammulina velutipes - 1,7 ед и Armmilaria mellea - 1,2 ед.

Молокосвертывающая активность у видов порядка Agaricales и Boletales полностью подавлялась фенилметилсульфонилф горидом, кроме Cantarellus aurantiaca, где активность после действия ингибитора составила 66% от начальной активности. В представителях порядка Russullales процент остаточной активности молокосвертывающих ферментов после действия ФМСФ ингибитора составил 21 - 42, а у видов порядка Aphyllophorales 16 -25.

Таблица 3. Активность молокосвертываютцих ферментов (ед/г). интервал pH

стабильности, влияние ингибиторов.

Влияние ингибиторов,

Вид гриба Активность, Интервал pH остаточная активность

ед/г. стабильности ФМСФ МЙА

ед % ед %

Boletus edulis 4,9 6-8 0 - 1,2 24

Leccmum auranticum 2,8 7-9 0 - 0,8 28

Leccinum melanum 1,7 5-8 0 - 0,6 35

Boletus castanus 3,4 7-9 0 - 1,3 38

S mil us flavidus 2,2 6-9 0 - 0,9 40

Cantarellus, aurantiaca 2,4 7-9 1,6 66 0,5 21

Порядок Agaricales

Flammulina velutipes 1,7 7-9 0 - 0,2 12

Armmilaria mellea 1,2 7-10 0 - 0,4 33

Macrolepiota procera 0,6 6-10 0 - од 17

Agaricus silvaficus 0,8 5-10 0 - 0,2 25

Amanita phaloides 0,4 6-10 0 - 0,1 25

Pleurotus ostreatus 0,2 6-9 Ü - 0,08 40

PleurotuS cornucopiae 0,3 7-9 0 - ОД 33

Порядок Russulales

Lactarius pubescens 1,4 7-9 0,3 21 0,8 57

Russula veska 1,2 7-10 0,5 42 0,3 25

Lactarius piperatus 2,4 5-8 0,6 25 1,2 50

Порядок Aphyllophorales

Coriolus versicolor 0.8 8-10 0,2 25 0,3 37

Hericium ennaceus 1,2 8-10 0,2 16 0,4 33

Активность молокосвертывающих ферментов подавлялась также монойодацетатом во всех исследованных видах фибов. Процент остаточной активности составлял от 12 до 57 в зависимости от вида. В порядке Boletales высокий процент остаточной активности наблюдался у вида Suíllus flavidus -40 и низкий у Cantarellus aurantiaca - 21. В порядке Agaricales наименьшая остаточная активность была у вида Flammulina velutipes и составляла 12% от исходной и высокая у Pleurotus ostreatus - 40%. В порядке Russulales максимальный процент остаточной активности был у вида Lactarius pubescens - 57, в порядке Aphyllophorales у вида Coriolus versicolor - 37.

Ни у одного вида молокосвертывающие ферменты не угнетались этилендиаминтетраанетатом. Таким образом, нами установлено, что молокосвертывающие ферменты исследованных грибов относятся к классу сериновых и цистеиновых протеиназ. Среди молокосвертывающих ферментов нет металлопротеиназ.

Нами определен интервал pH стабильности молокосвертывающих ферментов. Просматривается несколько групп базидиомицетов по этому показателю. К первой группе относятся виды: Leccinum auranticum, Boletus castanus, Cantarellus aurantiaca, Flammulina velutipes, Pleurotus cornucopiaea, Lactarius pubesccns интервал pH стабильности находится в диапозоне от 7-9. Ко второй группе относились базидиомицеты, где интервал pH стабильности находился в диапазоне pH 5-8: Leccinum melanum, Agaricus silvaficus, Lactarius piperatus. К третьей группе относились виды с интервалом pH стабильности 8-10: Coriolus versicolor и Herricium erinaceus. У видов Russula veska и Armmilaria mellea интервал pH стабильности молокосвертывающих ферментов в более широком диапазоне pH 7-10.

Виды Boletus edulis, Flammulina velutipes, Macrolepiota procera, Russula veska, Hericium erinaceus, Cantarellus aurantiaca оличались более высокой термостабильностью. В этом плане интересен вид Cantarellus aurantiaca, где активность сохранялась на уровне 50% от исходной при температуре 75°С. Исходя из этого, можно предположить, что молокосвертывающая активность

у вида Cantarellus aurantiaca в значительной мере относится к папаиноподобным ферментам.

Таким образом, молокосвертывающие ферменты обнаружены во всех исследованных видах, причем максимальной активностью обладали виды порядка Boletales дштее следуют порядки Russulales, Agaricales и Aphyllophorales. Соотношение молокосвертываюшей активности сериновых и цистеиновых протеиназ у разных видов отличается. Наиболее перспективными видами для поисков заменителя химозина являются Boletus edulis, В. castanus, Leccinum aurantiaca, Cantarellus aurantiaca порядка Boletales и Lactarius piperatus порядка Russulales. Установлена термостабильность и интервал pH стабильности, молокосвертывающих ферментов и по этим показателям принадлежность их к "классу папаинопОдОбных ферментов.

5. Активность щелочных и кислых протеиназ. Во всех исследованных видах установлена активность щелочных и кислых протеиназ. Высокая активность щелочных протеаз по казеину отмечена у видов порядка Boletales, далее следуют виды в порядках Agaricales, Russulales и наименее выражена в видах порядка Aphyllophorales (табл.4) Внутри порядка Boletales максимальная активность обнаружена в виде Boletus edulis - 0,78 ед и минимальная в Cantarellus aurantiaca - 0,33 ед. В порядке Agaricales активность" по казеину более выражена у" Flammulina velutipes - 0,76 ед и наименее в Pleurotus - ostreatus - 0,14 ед. В порядках Russulales и Aphyllophorales высокой активность по казеину обладали виды Tactarius pubescens - 1,4 ед и Hericium erinaceus - 0,26 ед.

Активность кислых протеиназ по гемоглобину в исследованных видах была в диапазоне от 0,11 до 0,41 ед. В порядке Boletales максимальной активностью кислых протеиназ обладал вид Leccinum auranticum - 0,41ед и минимальной вид Suillus flavidus - 0,22ед.

Таблица 4. Активность протеолитических ферментов по природным субстратам, ед/г и оптимум рН активности

Вид гриба Щелочные Кислые

Казеин рН Гемоглобин рн

Порядок Вожаке

ВокШя есЗцНч 0,78 8,5 0,26 3,5

Ьессшшп аигагШсит 0,64 8,5 0,41 2,5

Ьессшит те!апит 0,57 8,5 0,38 2,5

Вокшв савгапиь 0,67 9,5 0,33 3,0

8ш11ия ЯаУ1ёи5 0,73 8,5 0,22 2,0

Сапйг&Нив аигапНаса 0,33 8,0 0,35 3,5

Порядок Agaricalcs

ИаттиИпа уеЬдЬрев 0,76 8,5 0,22 3,5

АгттПапа те11еа 0,38 8,5- 0,11 5,0

Масго1ерю1а ргосега 0,45 8,0 0,24 3,5

agaricus япуапсив 0,53 9,5 0,25 3,0

АтапЬа phaloides 0,28 8,5 0,12 3,5

ркигошб (ыгеашч 0,14 9,0 0,41 3,0

р1еигот$ согписор1ае 0,28 9,5 0,12 3,0

Порядок Ш^зиНа^

Ьайагшв риЬеэсепя 0,23 8,0 0,13 2,5

яиббик уевка 0,26 8,0 0,17 2,5

Ьайапив рфегаШк 0,33 8,5 0,19 2,5

Порядок АрНу11орЬога1е8

Сопо1и5 уешсс^ог 0,18 8,5 0,12 3,0

Непсшт еппасеив 0,26 9,0 0,16 2,5

У представителей порядка Agarica]es активность кислых протеиназ составляла от 0,11 до 0,41ед, где высокой активностью обладал вид РкигоШв

ostreatus и низкой Armmilaria mcllea. Порядки Aphyllophorales и Russulales схожи по активности расщепления гемоглобина и составляют от tul -0,19ед

Прослеживается положительная корреляционная зависимость между молокосвертывающей и активностью щелочных протеаз г - 0,68, молокосвертываюшей и активностью кислых протеаз г - 0,36, между щелочными и кислыми протеиназами г - 0,37.

Нами установлен оптимум pH активности щелочных и кислых протеиназ. По оптимуму pH нами выделено несколько групп базидиомицетов у щелочных протеиназ по оптимуму pH. На рисунке 3 показана зависимость активности щелочных протеиназ от pH среды Ш примере 4 видов: Boletus edulis, Boletus castanus, Macrolepiota procera и Herriciumerinaceus.

Рис.3 График зависимости активности щелочных протеиназ От рН среды у видов: а) Boletus edulis, б) Boletus castanus в) MacrolepiÓta; procera г) Herricium erinaCéuS

Так к первой группе относятся виды с оптимумом pH активности 8,5: Boletus edulis, Leccinum aurantiacum, Leccinum melanum, Suillus flavidus, Flammulina velutipes, Armrnilaria mellea, Amanita phaloidea, Lactarius piperatus, Coriolus versicolor (табл. 10) Ко второй группе относятся виды, у которых оптимум pH активности 9,5: Boletus castanus, Agaricus silvaficus, Pleurotus cornucopiae. К третьей группе относятся виды с оптимумом pH активности щелочных прогеиназ 9,0: Pleurotus ostreatus, Herricium erinaccus. К четвертой группе относятся виды с оптимумом pH 8,0: Cantarellus aurantiaca, Macrolepiota procera, lactarius pubescens, Russula veska.

6. Протеолитические ферменты и их ингибиторы у вида Amanita phaloides.Среди исследованных нами видов один был ядовитым - бледная поганка (Amanita phalloides). Интересно было сравнить активное гь протеолитических ферментов и их ингибиторов этого вида со съедобными грибами Количество общего бетка, определенное нами в Amanita phalloides составило 25%, растворимого 3,6 мг/мл. Содержание ингибитора трипсина, установленное нами, было 1,2 мг/мл, ингибитор химотрипсина не обнаружен. Активность трипсиноподобных ферментов составляла 0,4 ед, химотрипсиноподобных 1,8 ед. По всем перечисленным показателям вид Amanita phaloides занимал промежуточное положение по сравнению с остальными видами.

По сравнению с другими видами, Amanita phaloides обладал минимальной активностью трипсиноподобных ферментов - 0,4 ед. Однако она сохранялась в течение 5 месяцев хранениия в замороженном состоянии, что являлось отличительным признаком в сравнении с другими видами. Наблюдалась низкая активность молокосвертывающих ферментов - 0,4ед .Интервалом pH стабильности находшея в диапазоне от 6-10. Фермешы полностью ингибировались феиилмегилсульфонилфторидом, после действия монойодацетатом, остаточная активность составила 25% от исходной Активность молокосвертывающих ферментов оставалась неизменной при хранении в замороженном состоянии в течение 4 месяцев. Активность

щелочных протеиназ составила 0,28 ед с оптимумом рН 8,5, кислых - 0,12 ед, с оптимумом рН 3,5.

Таким образом, проанализировав полученные данные у вида Amanita phaloides по сравнению с другими видами, можно сказать, что отличительным признаком была высокая стабильное ib трипсиноподобных ферментов при хранении в замороженном состоянии. По остальным показателям Amanita phalloides не выделялся по сравнению со съедобными

ВЫВОДЫ

1. Исследование базидиомицетов, принимаемых в пищу в Краснодарском крае, показало, что их водные экстракты содержат белок, трипсйноподобные, химотрипсинподобные, эластолитические ферменты, кислые и щелочные протеиназы, а также ингибиторы трипсина и химотрипсина.

2. Содержание общего белка составляет от 12 до 49%, высоким содержанием белка обладали виды порядка Boletales, далее следуют виды порядков Agaricales, Russulales, Aphyllophorales. Водорастворимый белок в плодовых телах грибов составляет от 7 до 17% от общего белка. Предложенная нами модификация метода Бредфорд позволяет количественно определять белок в окрашенных растворах.

3. Высокой активностью трипсиноподобных, химотрипсиноиодобйых,

эластолитйческих, молокосвертывающих ферментов определено у видов порядка Boletales, далее следуют Agaricales, Russullales и Aphyllophorales.

4. Установленные для различных таксономических и экологических групп базидиомицетов закономерности распределения протеолитических ферментов с разной субстратной специфичностью (молоко, казеин, гемоглобин, БАПНА, СФПНА) позволяют прогнозировать поиск видов с заданными биохимическими характеристиками и уточнить систематическое положение отдельных видов базидиомицетов.

5. Высокой протеолитической, в том числе и молокосвертывающей аквностью обладят и виды Boletus edulis, В. castanus, Leccinum aurantiaca, Cantarellu>, auantiaca порядка Boletajes и Lactarius piperatus порядка Russulales.

6 Активность ижибиторов грипсина обнаружена во всех исследованных видах, максимальное содержание у видов порядка Boletales. Активность ишибитора химотрипсина обнаружена в 6 исследованных видах из различных таксономических групп Высокое содержание ингибиюров химотрипсина наблюдалось у вида Armillaria mellea порядка Agaricales.

7 Установлен оптимум pH активности и стабильности щеточных, кислых и молокосвертывающих ферментов. Оптимум активное i и щелочных прогеиназ была в интервале pH от 7,5 до 9,5 Оптимум кислых протсиназ находился при pH от 2,5 до 3,5 Интервал pH стабильности молокосвертывающих ферментов был в диапозоне 7 10.

8. Выявлена динзмикз. изменения эктйвносги грипсиноподобных, химотрипсиноподобных, молокосвертывающих ферментов при хранении в замороженном состоянии в течение 7 месяцев. Химотрипсиноподобные и молокосвертывающие ферменты, в исследованных видах высших грибов, более стабильны, чем трипсиноподобные ферменты.

9. Отличительным признаком ядовитого гриба Amanita phalloides от съедобных, была высокая стабильность трипсиноподобных ферментов при хранении.

10. Прослеживается положительная корреляционная зависимость между щелочными, кислыми, молокосвертывающими, трипсиноподобными, химотрипсиноподобными ферментами, а также между содержанием белка и ингибитора трипсина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гзогян JI.A., Проскуряков М. Т. Молокосвертывающие ферменты и ингибитор химотрипсина в высших грибов // Актуальные проблемы медицин и биологии. Сб. науч. трудов. - Томск-, 2003. - С. 21 - 22.

' 2. Гзогян Л.А., Проскуряков М.Т. Прогеолитические ферменты

высших грибов // Актуальные проблемы медицин и биологии. Сб. науч. трудов. Томск-, 2004., № 1 -3 - С. 73 - 74.

3. Гзогян J1.A., Проскуряков М.Т Определение количества белка в высших грибах // Актуальные проблемы медицин и биологии. Сб. науч. трудов. - Томск-, 2004, Т. 4, № 1 - С. 21 - 22.

4. Гзогян JI. А, Проскуряков М. Т. Разработка метода определения растворенного белка в окрашенных образцах по Бредфорду // Известия высших учебных заведений. Пищевые технологии - Краснодар, 2004. № 5-6. -С. 108-109.

5. Гзогян JI.A, Проскуряков МТ. Ингибиторы протеолитических ферментов высших грибов // Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий. -Краснодар, 2004. - С. 280 - 281.

6. Гзогян J1.A., Проскуряков М.Т, Активность протеолитических ферментов, ингибиторов трипсина и химотрипсина в высших грибах // Известия высших учебных заведений. Пищевая технология - Краснодар, 2005.-№2-3.-С. 61-63.

7. Гзогян Л. А, Проскуряков М.Т. Протеолитическая активность в базидиомицетах //Известия высших вузов. Северо - кавказский регион. Естественные науки, 2005 - №3-4. - С. 15-22.

Бумага тип. № 2. Печать трафаретная. Тираж ШО экз. Заказ № 360 от 05.05.05 г. Кубанский государственный университет.

350040 г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149, Центр "Универсервис", тел. 21-99-551.

I (

• -89 14

РНБ Русский фонд

2006-4 15491

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гзогян, Люсинэ Айказовна

ВВЕДЕНИЕ

1. Обзор литературы.

1.1 Протеолитические ферменты в растениях и их роль.

1.2 Протеолитические ферменты в высших грибах, распространение и их роль.

1.3 Содержание и питательная ценность белков в высших грибах. f 1.4 Ингибиторы протеолитических ферментов, свойства и и распространение в растениях.

1.4.1 Ингибиторы протеиназ из пасленовых.

1.4.2 Ингибиторы протеиназ из злаковых.

1.4.3 Ингибиторы протеиназ из тыквенных и других семейств.

1.4.4 Белки — ингибиторы протеиназ в семенах.

1.4.5 Роль ингибиторов протеолитических ферментов в растениях.

1.5 Ингибиторы протеолитических ферментов в высших и несовершенных грибах.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Определение количества белка.

2.2.1 Определение активности ферментов по природным субстратам.

2.2.2 Определение активности ферментов по синтетическим субстратам.

2.3 Определение ингибитора химотрипсина.

2.4 Определение ингибитора трипсина.

2.5 Определение активности по молоку цистеиновых и сериновых протеиназ.

2.6 Методы изучения физико - химических свойств ферментов.

3. РЕЗУЛЬАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Количество общего и растворимого белка в соке плодовых тел базидиомицетов.

3.2 Ингибиторы протеолитических ферментов.

3.2.1 Ингибиторы трипсина.

3.2.2 Ингибиторы химотрипсина.

3.3 Активность протеолитических ферментов.

3.3.1 Активность ферментов по синтетическим субстратам.

3.3.2 Динамика изменения активности трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов при хранении.

3.4 Активность протеолитических ферментов по природным субстратам.

3.4.1 Молокосвертывающая активность ферментов, действие ингибиторов, физико-химические свойства.

3.4.2 Динамика изменения активности молокосвертывающих ферментов при хранении.

3.4.3 Активность щелочных и кислых протеиназ и их свойства.

3.4.4 Физико - химические свойства щелочных и кислых протеиназ.

3.4.5 Протеолитические ферменты и их ингибиторы у вида

Amanita phalloides.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Протеолитические ферменты и их ингибиторы в высших грибах"

Актуальность проблемы. Протеолитические ферменты выполняют разнообразные физиологические функции в живом организме, начиная с переваривания белков пищи и запасных белков семян до специфических регуляторных процессов, таких как активация зимогенов, образование гормонов и других физиологически активных пептидов из их предшественников, транспорт белков, защитные реакции. В связи с этим изучение механизмов регуляции активности протеолитических ферментов приобретает особую актуальность. Взаимодействие протеиназ с эндогенными белковыми ингибиторами является одним из главных и наиболее древним в эволюционном отношении механизмов регуляции активности протеиназ у живых организмов.

Процессы протеолиза у бактерий, растений и животных изучен достаточно широко и полно. Однако уровень знаний о протеолитических ферментах грибных организмов неравнозначен. Особое место среди мицелиальных грибов занимают базидиомицеты, которые сегодня по праву рассматриваются как перспективные продуценты белка кормового и пищевого достоинства (Бухало А.С., 1988). Дефицит животного сырья и несовершенство микробных препаратов - стимулировали интерес к базидиальным грибам как возможным продуцентам протеолитических ферментов ( Белова Н.В., 1992). Два обстоятельства оправдывают поиск ферментов пищевого и медицинского назначения среди высших базидиомицетов: наличие среди них большого числа съедобных грибов и отсутствие спороношения в культуре, что уменьшает опасность профессиональных заболеваний в условиях производства (Псурцева Н.В. с соавт., 1994).

Протеолитические ферменты применяются в пищевой, кожевенной, легкой, молочной промышленности. С увеличением выработки сыров возрос интерес к замене животного химозина ферментами другого происхождения. Исследованы культуры базидиомицетов (Kawai М., 1973) способных синтезировать молокосвертывающие ферменты и установлено, что виды Irpex lacteus и Fomitopsis pinicola - образуют протеазы, являющиеся хорошими заменителями химозина.

В связи с этим изучение содержания протеиназ и их ингибиторов в пищевых продуктах приобретает особое значение при разработке вопросов питания человека.

Исследование специфичности протеиназ по отношению к синтетическим и природным субстратам у базидиомицетов различных таксономических и экологических групп закладывает научные основы понимания функциональной роли этих ферментов в жизнедеятельности базидиальных грибов, взаимосвязи грибных организмов с другими компонентами биоценозов, позволяет оценить уровень пластичности ферментных систем базидиомицетов в различных экологических условиях.

Способность синтезировать протеиназы трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов в плодовых телах базидиомцетов изучается впервые. Исследование возможностей использования плодовых тел базидиомицетов в качестве продуцентов протеолитических ферментов представляет перспективным направлением экспериментальной микологии.

Цели и задачи исследования. Целью работы было детальное исследование протеолитической активности по природным и синтетическим субстратам, количественное определение содержания общего и водорастворимого белка, а также установление ингибиторной активности трипсина и химотрипсиноподобных ферментов в плодовых телах высших базидиомицетов, наиболее распространенных в Краснодарском крае.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать количество белка, активность трипсиноподобных, химотрипсиноподобных, эластолитических, кислых и щелочных протеиназ.

2) Количественно охарактеризовать активность ингибиторов трипсина и химотрипсина

3) Установить характер распределения протеолитической активности по таксономическим группам.

4) Изучить свойства протеиназ высших грибов: термостабильность, оптимум рН активности, интервал рН стабильности.

Научная новизна. Впервые количественно определена активность протеолитических ферментов по природным и синтетическим субстратам, а также активность ингибиторов трипсина и химотрипсина в 18 видах высших грибов, наиболее распространенных в Краснодарском крае. Изучены свойства протеолитических ферментов: термостабильность, оптимум рН активности, интервал рН стабильности.

Установлена связь уровня протеолитической и ингибиторной активности с эколого-трофическими свойствами базидиомицетов. Наибольшая активность протеиназ и ингибиторов обнаружена у сапротрофов, меньшая у ксилотрофов и минимальная у симбиотрофов.

На основе полученных данных в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов, нами рекомендованы виды Boletus edulis, В. castanus, Leccinum auranticum, Cantarellius aurantiaca порядка Boletales и Lactarius piperatus порядка Russulales.

Основные положения, выносимые на защиту:

3. Установлена активность ингибиторов трипсина и химотрипсина в исследованных видах.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гзогян, Люсинэ Айказовна

выводы

1. Систематическое исследование базидиомицетов, принимаемых в пищу в Краснодарском крае, показало, что их водные экстракты содержат белок, трипсиноподобные, химотрипсинподобные, эластолитические ферменты, кислые и щелочные протеиназы, а также ингибиторы трипсина и химотрипсина.

3.Наиболее высокой активностью трипсиноподобных, химотрипсиноподобных, эластолитических, молокосвертывающих ферментов определено у видов порядка Boletales, далее следуют Agaricales, Russullales и Aphyllophorales.

5. Наиболее высокой протеолитической, в том числе и молокосвертывающей аквностью обладали виды Boletus edulis, В. castanus, Leccinum aurantiaca, Cantarellus auantiaca порядка Boletales и Lactarius piperatus порядка Russulales. Считаем их перспективными для поисков протеиназ, используемых в пищевой промышленности. б.Активность ингибиторов трипсина обнаружена во всех исследованных видах, максимальное содержание у видов порядка Boletales. Активность ингибитора химотрипсина обнаружена в 6 исследованных видах из различных таксономических групп. Высокое содержание ингибиторов химотрипсина наблюдалось у вида Armillaria mellea порядка Agaricales.

7.Установлен оптимум рН активности и стабильности щелочных, кислых и молокосвертывающих ферментов. Оптимум активности щелочных протеиназ была в интервале рН от 7,5 до 9,5. Оптимум кислых протеиназ находился при рН от 2,5 до 3,5. Интервал рН стабильности молокосвертывающих ферментов был в диапозоне 7 - 10.

8. Выявлена динамика изменения активности трипсиноподобных, химотрипсиноподобных, молокосвертывающих ферментов при хранении в замороженном состоянии в течение 7 месяцев. Химотрипсиноподобные и молокосвертывающие ферменты, в исследованных видах высших грибов, более стабильны, чем трипсиноподобные ферменты.

9. Отличительным признаком ядовитого гриба Amanita phalloides от съедобных, была высокая стабильность трипсиноподобных ферментов при хранении

Заключение

В результате проделанной нами работе исследовано 18 видов высших базидиомицетов, наиболее распространенных в Краснодарском крае. Установлено было наличие химотрипсинподобных, трипсиноподобных, молокосвертывающих, эластолитических, кислых и щелочных протеиназ, а также ингибиторной активности трипсина и химотрипсина.

Определено количество общего и водорастворимого белка в исследованных видах, установлено что растворимый белок от общего составляет от 7 до 17% в зависимости от вида. Сравнивая данные, полученные методом Лоури и Бредфорд, с использованием калибровочного графика, построенного по казеину, пришли к заключению, что метод Лоури дает значительно завышенные, не реальные результаты количества растворимого белка по сравнению с данными, полученными методами Кьельдаля. Таким образом, метод Лоури не позволяет определить белок в интенсивно окрашенных продуктах без калибровочной, полученной по очищенному белку грибов. Максимальное количество общего и водорастворимого белка обнаружено в Boletus edulis порядка Boletales. Предложенная нами модификация метода Бредфорд позволяет количественно определять белок в окрашенных растворах.

Ингибиторы трипсина и химотрипсина в исследованных видах обнаружены впервые. Ингибиторы протеолитических ферментов затрудняют пищеварение белков и приводит к отрицательным физиологическим показателям, поэтому полученные данные имеют большое значение при составлении рационов питания человека.

Ингибиторы трипсина обнаружены во всех видах и установлен закономерный характер распределения активности ингибитора трипсина по таксономическим группам: максимальное содержание у видов Boletales, далее следуют порядки Agaricales, Russullales, Aphyllophorales.

Активность ингибиторов химотрипсина обнаружена в 6 из 18 видов и от 1,1 до 36 раз выше активности ингибитора триписна в зависимости от вида, минимальная разница у вида Leccinum melanum порядка Boletales и максимальная у вида Coriolus versicolor порядка Aphyllophorales. У видов порядка Russulales активность ингибитора химотрипсина не обнаружено.

Наличие активности трипсиноподобных, химотрипсиноподобных и эластолитических ферментов было обнаружено впервые. Максимальной активностью по синтетическим субстратам обладали виды порядка Boletales, которые по типу эколого — трофических связей относятся к сапротрофам.Установлена динамика изменения активности трипсиноподобных, химотрипсиноподобных и молокосвертывающих ферментов в течение 7 месяцев при хранении в замороженном состоянии. Проанализоировав динамику изменения активности протеиназ в исследованных видах базидиомицетов, можно сказать, что стабильность в замороженном состоянии у химтрипсиноподобных ферментов выше, чем трипсиноподобных, но ниже молокосвертывающих.

Во всех видах установлена активность молокосвертывающих ферментов, максимальная активность наблюдалась в видах порядка Boletales. Можно предположить, что наиболее перспективными видами для поисков заменителями химозина являются Boletus edulis, В. Castanus, Leccinum auranticum, Cantarellius aurantiaca порядка Boletales и Lactarius piperatus порядка Russulales. Ингибиторный анализ молокосвертывающих ферментов показал, что во всех исследованных видах установлена активность цистеиновых и сериновых протеиназ, причем активность сериновых протеиназ более выражена. Проанализировав характер распределения протеолитической активности по таксономическим группам можно сказать, что наиболее активными по природным и синтетическим субстратам являлись виды порядка Boletales, далее следуют Agaricales, Russulales и Aphyllophorales.

Нами выявлена и количественно измерена активность кислых и щелочных протеиназ у видов порядка Boletales и Agaricales и менее выражена у видов порядка Russulales и Aphyllophorales. Максимальную активность щелочных протеиназ наблюдали у видов Boletus edulis и Flammulina velutipes, кислых у вида Leccinum auranticum и L. melanum. Установлена положительная корреляционная зависимость между щелочными и кислыми протеиназами.

Впервые рассчитаны интервал рН стабильности и оптимум рН активности по природным субстратам. Проанализировав распределение протеолитической активности с учетом трофических связей базидиомицетов установили, что биосинтез протеиназ более выражен у макромицетов с сапротрофным типом питания, тяготеющих органикой к древесным или богатым органикой (лигнино - целлюлозными компонентами) субстратам.

Проанализировав полученные данные у вида Amanita phaloides по сравнению с другими видами, нами установлено, что отличительным признаком была высокая стабильность трипсиноподобных ферментов при хранении в замороженном состоянии. По остальным показателям Amanita phaloides не выделялся по сравнению со съедобными

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гзогян, Люсинэ Айказовна, Краснодар

1. Абрагимов Е.П. Протеолитические ингибиторы фасоли, их получение и свойства / Е. П. Абрагимов // Автореф. для канд. биол. наук -1967.- 18 с.

2. Алехина И.А. Сериновая протеиназа из высшего базидиомицета рода Coprinus / И. А. Алехина, Н.П. Денисова., К.А., Шагинян // Биохмия -1990. Т. 55, №8. - С. 1387 - 1395.

3. Бабицкая С. В. Физиологические соединения и биологическое действие глубинного мицелия базидиомицета Ganoderma Lucidum / Бабицкая С.В., Хлюстов Л.В., Пленина В.В // Биотехнология 2003, №4. -С. 35-44.

4. Белова Н.В. Базидиомицеты источники биологически активных веществ / Н.В. Белова // Раст. ресурсы. - 1991. - №2. - С. 23 - 27.

5. Белозерский М.А. Выделение и свойства протеиназ из семян гречихи / М.А. Белозерский, И.А. Ельцева, Т.А. Курсанова // Тезисы симпозиума «Химия протеолитических ферментов» Вильнюс. - 1973.- С. 99.

6. Белозерский М.А. Полная аминокислотная последовательность анионного ингибитора протеаз BWI 4а из семян гречихи / М.А. Белозерский, Я.Е. Дунаевский, А.Х. Мусомолямов, Ц.А. Егоров // Биохимия - 2000. - Т.65, №10. - С. 1347 - 1352.

7. Белозерский М.А. Регуляция активности протеаз, осуществляющих гидролиз запасных белков у растений / М.А. Белозерский, Я.Е. Дунаевский // В кн.: Тезисы III симпозиума «Химия протеолитических ферментов» -1993.- 37с.

8. Бухало А.С. Высшие базидиомицеты продуценты пищевого белка в глубинной культуре // Тез. докд. всесоюзн.конф. и мицелиальные грибы. Пущино- 1983.- 99с.

9. Бухало А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре /

10. A.С. Бухало. Киев: Наукова думка, 1988. - 125с.

11. Валуева Т.А. Белки — ингибиторы протеолитических ферментов у растений / Т.А. Валуева, В.В. Мосолов // Прикладная биохимия и микробиология 1995.- Т.31, №6. - С.579 - 589.

12. Валуева Т.А. Роль ингибиторов протеиназ в защите картофеля / Т.А. Валуева, Т.А. Ревина, E.JI. Гвоздева, Н.Г. Герасимов, О.Л. Озерцковская // Биоорганическая химия. 20003. - Т.29, №5. - С. 499 - 504.

13. Валуева Т.А. Белки ингибиторы протеиназ в семенах. 1. Классификация, распространение, структура и свойства / Т.А. Валуева,

14. B.В. Мослов // Физиология растений. 1999. - Т. 46, №3. - С. 362 - 378.

15. Веселов А.П. Активность щелочных протеиназ прорастающих семян пшеницы при тепловом стрессе / А.П. Веселов, И.В. Александрова, Т.Н. Алексеева // Тезисы V симпозиума «Химия протеолитических ферментов» М. - 2002. - 25с.

16. Виноградов С.П. Биосинтез гидролитических ферментов при совместном культивировании макро- и микромицетов / С.П. Виноградов,

17. C.Н. Кушнир // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т.39. -С. 652-655.

18. Вовчук С.В. Выделение и свойства ингибитора пшеницы / С.В. Вовчук, Е.А. Волчявская, А.П. Левицкий, В.Г. Адамовская // Прикладная биохимия и микробиология. 1993.- Т. 29, №1. - С 91 -96.

19. Воскобойникова Н.Е. Ингибитор металлопротеиназы из покоящихся семян гречихи / Н.Е. Воскобойникова, Я.Е. Дунаевский, М.А. Белозерский // Биохимия. 1990. - Т.55 - С.839 - 847.

20. Гаспаров B.C. Определение белка по связыванию с красителем кумасси бриллиантовым голубым G- 250 / B.C. Гаспаров, В.Г. Дегтярь // Биохимия. 1994.- Т.59, №26- С. 456-466.

21. Гайбаров Х.Г. Ферментные свойства дереворазрушающих высших базидиальных грибов / Х.Г. Гайбаров // Тез. Докл.1 всес. конф., Ташкент. -1988.-С. 48 —49.

22. Денисова Н.П. Протеолитическая активность культур высших базидиомицетов / Н.П. Денисова // Микология и фитопатология. — 1982. -Т. 16, С.-458-465.

23. Денисова Н.П. Протеолитические ферменты базидиальных грибов, таксономические и экологические аспекты их изучения / Н.П. Денисова // Автореф., дисс., на соис. канд., биол., наук. 1991.- 31с.

24. Денисова Н.П. Природа и биологическая роль протеиназ базидиальных грибов / Н.П. Денисова // Микология и фитопатология. — 1984.- Т.2,№2. С. 116 - 119.

25. Денисова Н.П. Ферментативная активность препарата из зимнего опенка Flammulina velutipes / Н.П. Денисова, Н.Н. Фалина // Микология и фитопатология. 1981.- Т. 15, № 2.- С. 123- 125.

26. Домаш В.И. Протеолитические ферменты и белки ингибиторы люпина / В.И. Домаш, О.В. Буснюк, Т.Ф. Сосновская // В кн.: Тезисы V симпозиума «Химия протеолитических ферментов». - М. - 2002.- С. 81.

27. Дунаевский Я.Е. Сульфигидрильная протеиназа в эндосперме прорастающих семенах ржи / Я.Е. Дунаевский, М.А. Белозерский // В кн.: Тезисы симпозиума «Химия протеолитических ферментов». — Углич. -1979.-С. 70-71.

28. Дунаевский Я.Е. Протеиназа из семян гречихи, гидролизующая основной запасной белок этих семян / Я.Е. Дунаевский, М.А. Белозерский, Е.Н. Элпидина // Биохимия. 1983. - Т. 48. - С. 572 - 576.

29. Зимачева А.В. Ингибитор триписна из листьев амаранта / А.В. Зимачева, В.В. Мосолов, Е.В. Иевлева // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. -Т. 36. - С. 541 - 544.

30. Зобенко В.Я. Аспартильная протеаза клубней картофеля / В.Я. Зобенко, М.Т. Проскуряков // В кн.: Тезисы III симпозиума «Химия протеолитических ферментов». — Москва. 1993. - С. 67 - 68.

31. Ибрагимов Р.И. Ингибиторы экзопротеиназ патогенного гриба Fussarium sp., в семенах и вегетативных органах растений / Р.И. Ибрагимов // Прикладная биохимия и микробиология. 1998.- Т. 34, №34. С. 666 - 669.

32. Ибрагимов Р.И. Активность и молекулярная множественность ингибиторов трипсина и химотрипсина в семенах злаков / Р.И. Ибрагимов, Р.Г. Ахметов // Вестник Башкирского университета. 1996.- №21. -С. 37 — 40.

33. Иевлева Е.В. Новая протеиназа из прорастающего зерна ячменя / Е.В. Иевлева, А.В. Зимачева, В.В. Мосолов // В кн.: Тезисы III симпозиума «Химия протеолитических ферментов». — Москва. 1993.- С. 44 — 45.

34. Иевлева Е.В. Ингибитор трипсина из листьев амаранта / Е.В. Иевлева, Ю.А. Руденская, А. В. Зимачева, В.В. Мосолов // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - Т. 36,№ 5. - С.541 - 544.

35. Иевлева Е.В. 7,5 кДа ингибитор цистеиновых протеиназ из семян тыквы / Е.В. Иевлева, Ю.А. Руденская, Я.Е. Дунаевский, В.В. Мосолов // В кн.: Материалы IV симпозиума «Химия протеолитических ферментов».-Москва.-1997.-91с.

36. Касымова Т.Д. Протеазы хлопчатника / Т.Д. Касымова, Л.Г. Петросян, М.А. Кученкова, П.Х. Юлдашев // В кн.: Тезисы симпозиума «Химия протеолитических ферментов». — Углич. 1979.- 51с.

37. Ковалева О.В. Протеолитические ферменты и ингибиторы протеиназ из растений их влияние на пищеварительные протеиназы позвоночных животных / О.В. Ковалева // Автореф., дисс., на соис. канд. биол. наук.-1998.-220с.

38. Кононков П.Г. Амарант перспективная культура XXI века / П.Г. Кононков // Фитоэкология. - 1988. - 296с.

39. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А. Кочетов. — Москва: Высшая школа, 1980. — 282с.

40. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин // Высшая школа, 1990. 135с.

41. Леонтьева Т.А. Тромбоолитическая активность базидиомицета Flammulina velutipes / Т.А. Леонтьева // Актуальные проблемы патофизиологии- 1997.-Т.2, С. 19-21.

42. Маттисон Н.А. Протеолитическая активность аффилофоровых грибов в поверхностной культуре / Н.А. Маттисон, Н.Н. Фалина // Микология и фитопатология 1973.- Т.7, С. 394 - 399.

43. Маслова Р.А. Производство высших съедобных грибов в ССС Р / Р.А. Маслова. Киев: 1978. - 86 с.

44. Мосолов В.В. Растительные белковые ингибиторы протеолитических ферментов / В.В. Мосолов, Т.А. Валуева. — Москва: Наук.-1993.-207с.

45. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты / В.В. Мосолов. М. Наук.-1971.-414с.

46. Мосолов В.В. Ингибиторы протеолитических ферментов белковой природы / В.В. Мосолов // В кн.: Тезисы III симпозиума «Химия протеолитических ферментов». 1993. — М. - С. 22 — 29.

47. Мосолов В.В. Новое о природных ингибиторах проетолитических ферментах / В.В. Мосолов // Биоорганическая химия. 1998. -Т.24, №5. -С. 332-340.

48. Москвич И.А. Защитная роль ингибиторов протеаз из семян подсолнечника современных сортов / И.А. Москвич // Пищевая технология.- 2003.- №2-3. С.35 -39.

49. Низковская О.П. К сравнительно физиологической характеристике грибов из порядка афиллофоровых и агариковых грибов / О.П. Низковская, Н.М. Милова // В кн.: Кормовые белки и физиологически активные вещества для животноводства. М.: Наука.- С.6 - 11.

50. Нотроп Д. Кристаллические ферменты / Д. Нортроп, М. Кунитц. -Изд.ин.лит. 1950.- 346с.

51. Онивоги О.П. Протеолитические ферменты и их ингибиторы в традиционных пищевых продуктах Гвинеи / О.П. Онивоги // Автореф. дисс. канд. биол. наук. — Краснодар. 1983. - 21с.

52. Попов Е.М. Механизм действия аспартатных протеиназ / Е.М. Попов // В кн.: Материалы IV симпозиума «Химия протеолитических ферментов» 1997. - С.69.

53. Псурцева Н.В. Биотехнологические возможности использования коллекционных культур базидиомицетов / Н.В. Псурцева, Н.В. Белова, И.А. Алехина // Биотехнология. 1994.-№7, С. - 35 - 39.

54. Псурцева Н.В. Культуральная характеристика и активность экзопротеиназ базидиомицетов рода Flammulina. I. Поверхностное культивирование / Н.В. Псурцева, А.Я. Мнухина // Микология и фитопатология. 1996.-Т. 30, №1,- С. 44- 49.

55. Пятницкий Н.П. Определение активности химотрипсина по скорости створаживания молочно ацетатной смеси / Н.П. Пятницкий, М.Т. Проскуряков // В кн.: Материалы 17 научной конференции физиологов Юга РСФСР. - Ставрополь. - 1969.- Т. 2, С. 80 -82.

56. Ревина Т.А. Выделение и характеристика ингибитора трипсина и химотрипсина из клубней картофеля / Т.А. Ревина, Т.А. Валуева // Биотехнология. Т.60, №11. - С. 1845 - 1850.

57. Ротарь В.И. Цистеиновые протеиназы прорастающих семян фасоли / В.И. Ротарь, В.И. Сенюк, К.М. Хорстман, И.А. Вайтрауб // В кн.: Материалы IV симпозиума «Химия протеолитических ферментов». — М. — 1997.-С. 50.

58. Руденская Г.Н. Карбоксильная протеиназа из базидиального гриба Russula decolorans / Г.Н. Руденская, А.В. Гайда, А.В. Степанов // Биохимия. 1980.- Т.45, №3, С. 54 - 56.

59. Руденская Г.Н. Сериновая протеиназа плодов Maclura ponifera / Г.Н. Руденская, В.М. Степанов, Е.А. Богданова, Л.П. Ревина // В кн.: Тезисы III симпозиума «Химия протеолитических ферментов». М. - 1993. — С. 54.

60. Соболев A.M. Запасание белка в семенах растений / A.M. Соболев. -Москва.: Наука, 1985. 112с.

61. Степанов В.М. Эволюция протеиназ. Аналогии и параллели / В.М. Степанов // В кн.: Материалы IV симпозиума «Химия протеолитических ферментов». 1998. - С.5

62. Трутнева И.А. Ферментные системы высших базидиомицетов / И.А. Трутнева, Н.В. Даниляк, В.Д. Семичаевский. Киев: Наук. Думка, 1989.-247с.

63. Туманьян Н.Г. Активность и свойства протеолитических ферментов в прорастающих семенах риса / Н.Г. Туманьян, М.Т. Проскуряков // Физиология растений. 1989.-Т.36, №37, - С. 520 - 525.

64. Фалина Н.Н. Некоторые итоги изучения базидиальных грибов как источника получения кормового белка и дефицитных аминокислот / Н.Н. Фалина, Р.А. Маслова, П.А. Якимов, С.М. Андреева, Е.В. Алексеева // Растительные ресурсы. 1965. - №1, С. 122 - 127.

65. Феофилова Е.П. Современные направления в изучении биологически активных веществ базидиальных грибов / Е.П. Феофилова // Прикладная биохимия и микробиология. 1998.-Т. 34, №6. - С. 597 - 608.

66. Федорова JI.H. Динамика протеолитической активности в культурах высших грибов / J1.H. Федорова, А.Н. Шифрина // Микология и фитопатология. 1975,- Т.7, №6. - С. - 542 - 544.

67. Федорова JI.H. Протеолитическая активность высших грибов в поверхностной и погруженной культуре / JI.H. Федорова // Микология и фитопатология. Т.7, №6. - С. 542 — 544.

68. Федорова JI.H. Протеазы сычужного действия в культурах высших грибов / JI.H. Федорова, А.Н. Шифрина // Микология и фитопатология. -1974. -Т.8, №1. -С.22 -25.

69. Федорова Л.Н. Биосинтез молокосвертывающего фермента базидиальных грибов Russula decolorans / Л.Н. Федорова, Т.Н. Дроздова, В.П. Гаврилов // Микология и фитопатология. 1974. - Т.8, №1. - С.22 -25.

70. Хлуднев Д.В. Ингибитор химотрипсина и субтилизина из эндосперма зерновок пшеницы / Д.В. Хлуднев, Н.В. Пивненко, В.В. Мосолов // Биохимия. - 1992. - Т. 52, №12. -С. 1974 - 1978.

71. Цыбина Т.А. Катионные ингибиторы сериновых протеиназ из семян гречихи / Т.А. Цыбина, Я.Е. Дунаевский, А.Х. Мусомолямов, Ц.А. Егоров, М.А. Белозерский // Биохимия. 2001. - Т. 66, №9. -С. 1157 - 1164.

72. Цыбина Т.А. Катионные ингибиторы сериновых протеиназ из семян гречихи: изучение взаимодействия с экзогенными ферментами / Т.А. Цыбина, Н.А. Попыкина, Н.И. Ларионова, Я.Е. Дунаевский, М.А. Белозерский // Биохимия. 2004. -Т 5, №3. -С. 1127 - 1134.

73. Шутов А.Д. Цистеиновая протеиназа из прорастающих семян пшеницы: частичная очистка и гидролиз клейковины / А.Д. Шутов, Н.К. Белтей, И. А. Вайнтрауб // Биохимия. 1984. - Т. 49, №7. - С. 1171 - 1177.

74. Элпидина Е.Н. Обнаружение SH протеиназной активности в белок -запасающих органеллах проростков гречихи / Е.Н. Элпидина, Я.Е. Дунаевский, М.А. Белозерский // Биохимия. 1992. -Т. 57, №10.- С. 1527 -1534.

75. Anson М. The estimation of pepsin, trrypsin, papain and cathepsin with hemoglobin / M. Anson // J. Gen. Physiol. 1938. - Vol. 22, №1. - P. 79 - 89.

76. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitaion of microgram quantities of protein utilizing of protein dye bindig / M.M. Bradford // Anal. Biochim. - 1976. - Vol. 72, №2. - P. 127 - 129

77. Birk Y. Trypsin Inhibitor from Garden Bean (Phaseolus vulgaris) / Y.Birk // In.: Methods in Enzymology. - Vol. 45. - N. Y. - S.F. - L.: Acad. Press. -1976.-P. 710-716.

78. Bode W. Natural Protein Proteinases Inhibitors and Their intraction with Proteinases / W. Bode, R. Huber // Eur. J. Biochem. 1992. - Vol. 204. P. 433 -451.

79. Burton K.S. Purification and characterization of a serine proteinase from senescent sporophores of the commercial mushroom (Agaricus bisporus) / K.S. Burton, Z. Wood // J.of Gen. Microbiology. Vol. 139., P. 1379 1386.

80. Crisans E. The Biology and cultivation of edible mushrooms / E.Crisans, A. Sands // New. York etc. Acad. Press. 1978. - P. 137 - 168.

81. Chabala J. Inhibitor of trypsin and chymotrypsin in winged / J. Chabala, A. Reseday // Agr. And food chem. 1981. -№ 29. - P. 884 - 880.

82. Caricia Olneedo F. Plant Proteinaseous inhibitor of Proteinase and Amylase / F. Caricia - Olneedo, G. Saleedo, Sanches - Monge, L. Gomez, J. Royo, P. Carbonero // Oxford surveys of Plant Molecular and Cell Biology. -1987. P. 275-334.

83. Dixon B. / Biotehnology. 1995. - Vol. 13, №1.-P. 120-121.

84. Denisova N.P. Proteinases of higer basidiomycetes / N.P. Denisova // 10 th. Congr. of eur. Mycol, Tallin, Estonian SSR, Aug. 1989. - P. 26 - 32.

85. Erlanger B.F. The action of chymotrypsin on two New Chromogenic Substrates / B.F. Erlanger // Arch. Biochem. Biophys. 1996. - Vol. 115.- P. 206-210.

86. Feller V. Pattents of proteolytic enzyme activities in different tissues of germination corn / V. Feller, T.S. Soong, R.H. Hageman // Planta. 1978.- Vol. 170, №2.-P. 155-162.

87. Feng F. The Amino Acid Sequence of double headed trypsin from the sees of Momordica chantia Linn., Cucurbitaceae / F. Feng, R. Qian, Y. Wang // Acta Chim. - Sin. - 1989.- Vol. 1. - P. 79 - 85.

88. Harvey B.M. The hydrolysis of endosperm protein in zea mays / B.M. Harvey, A. Daks // Plant Physiol. 1974. - Vol. 53, №3. - P. 453 - 457.

89. Hayes W.A. Ediblemushrooms / W.A. Hayes, S. Wright // Microbiol. Biomass. London. - 1979. - P. 41 - 76.

90. Hearder J. Squach trypsin inhibitors from Momordica cochinchinensis exhibitat atyp cal macrocyclic structure / J. Hearder, J. Gagnon, L. Chiche // Biochemestry. 2000. - Vol. 39, №19. - P. 5722 - 5730.

91. Hirayama K. Purification and characterization of three cystein proteinase inhibitors from seeds of Wistaria florubunda / K. Hyrayama, F. Ogata, I Hirashiki, S. Miksumu // Mem. Fal. Sci. Kyushu Univ. Ser. C. - 1989.- Vol. 17.-P. 87-100.

92. Janos V. Trypsin inhibitor activity of basidiomycetous mushrooms / V. Janos // Eur Food. Res Technol. 2000. - Vol. 211. - P.346 - 348.

93. Kalisa H. M. Some characteristics of extracellular proteinase from Coprinus cenereus / H. Kalisa, D. A. Wood, D. Moore // Mycol. Res. 1989.-Vol. 92, №3. - P. 278-285.

94. Kawai M. Productivity of proteolytic enzymes and distribution of its milk clothing activity among the Basidiomecetes / M. Kawai // J. Agr. Chem. Soc. Japan. - 1973. - Vol. 47, №8. - P. 467 - 472.

95. Kawai M. Studies on milk clotting enzymes produced by Basidiomycetes / M. Kawai // Agr. Boil. Chem. 1971. - Vol. 35. P. 1517 - 1525.

96. Kekeawa F. Antitumor polisacharides of Flammulina velutipes / F. Kekeawa // J. Pharmacol. -Dyn. 1982.- Vol. 5, №8, P. 576 - 581.

97. Kojima S. Requiriment for hydrophobic Phe residues in Plreurotus ostreatus proteinase A inhibitor 1 for stable inhibition / S. Kojima, Y. Hisano // Protein Eng. 2002. - Vol. 15, №4. - P. 325 -329.

98. Micola J. Purification and properties of a trypsin inhibitor from barley / J. Micola, E. Suolinna // Europ J. of Biochem. 1969. - Vol. 9, №4. - P. 555 -560.

99. Meyer H.J. Occurrence of an inhibitor of Tissue Type Plasminogen Activation in seeds and in vitro cultures of Erytrina caffa Thunb / H. J. Meyer, J. Staden // Plant Physiol. - 1991. - Vol. 96. - P. 1150 - 1156.

100. Mannen J. F. Nodulin specifically expressed in Senscent Nodulles of Winged of Winged Bean is a pritease inhibitor / J.F. Mannen, P. Simon, J. Slofen, M., Osteras // Plant Cell. 1991. - Vol. 44, P. - 953 - 955.

101. Maeda K. The complete Amino. Acid. Sequence of the Endogenous Amylase inhibitor in Wheat / K. Maeda // Biochem. Biophys. Acta. 1986. -Vol. 871.-P. 250 - 256.

102. Odani S. Proteinase inhibitor from a Mimosoideae legume. Albizza julibrissin Homologues of soybean trypsin inhibitor / S. Odani, T. Onot, T. Ikenaka // J. Biochem. 1979. - Vol.86. - P. 371 - 375.

103. Odani S. Trypsin inhibitors. Isolation and Structural characterization ofЬsingle headed and double - inhibitors of the Bowman Birk Type / S. Odani, T. Koide, T. Ono // J. Biochem. - 1986. - Vol. 100. - P. 975 - 983.

104. Oliva M.L. Purification and Partial characterzation of thiol proteinase inhibitor from Enterlobium contorisiliquum Bean // Biol. Chem. Hoppe. 1988. -Vol. 369.-P. 229-232.

105. Prybylowier P. Shiitake growers handbook. Dubuque: Kendol / P. Pry by lower, J. Donoghae // Hunt Publ. Co. 1991. - 217p.

106. Pham T.C. Purification and characterization of the trypsin inhibitor from Cucurbita pepo var. partissonina fruits / T.C. Pham, J. Leluk, A. Polanowski, T. Wilusz // Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1985. - Vol. 366, № 10. - P. 939 - 944.

107. Polanows K.A. A new family of serine proteinase inhibitors from Squash seeds / K.A. Polanows, Otlewski, J. Leluk, T. Wilusz // Biol. Zentralb. 1988. -ш Vol. 107, P. 45-49.

108. Puszai A. // Planta. 1972. - Vol. 107, №1. - P. 121 - 129. Piligrim H. Untersuchungen zur inhibitorsichen wirkung von wabrigen Evtraktcn aus Basidiomyceten aur trypsin / H. Piligrim, M. Darwaza // Pharmazie 40. - 1985. - Vol. 3. - P. 655.

109. Pilgrim H. Trypsin inhibitor activity of Basidiomycetes / H. Pilgrim, S. Haasman, K. Schroder // Zentralb. Microbiol. -1992. Vol. 147. - P. 400 - 404.

110. Richardson M. Proteinase inhibitors of Plants and Microorganisms / M. Richardson // Phytochemistry. 1977.- Vol. 16. - P . 159 - 169.

111. Ryan C.A. // Ann. Rev. Phytopatol. 1990. - Vol. 28. - P. 425 - 449. Shin H. Purification and characterization of cysteine protease from Pleurotus ostreatus / H. Shin, H. Choi // Biosci., Biotechnol. And Biochem. -1998. - Vol. 62, №7. - P. 1416 - 1418.

112. Shinobu S. Isolation and characterization of a proteinase inhibitor from spinach leaves / S. Shinobu, S. Emi., W. Tsuneo, F. Tadashi // Phytochemistry.1995. Vol. 24, №3. - P. 419 - 423.

113. Saarikoski P. Wound inducible gene from Salex viminales Coding for a trypsin inhibitor / P. Saarikoski, D. Claphon, S. Arnold // Plant Mel. Biol.1996. Vol. 31. -P. 465-478.

114. Svedsen I. Isolation and characterization of a trypsin inhibitor from the Seeds of kohlarabi Belonging to the Napin Family of storage proteins / I. Svedsen, D. Nicolova, I. Goshev, N. Genov // Carlsberg Res. Commun. 1989. -Vol.54.-P. 231-239.

115. Sonne U. Targeting and glycosylation of papain the maior potato tubers protein in leaves of transgenic tobacco / U. Sonne, A. Sturnn, M. Chrispeels, J. Willmitzer // Planta. 1989. - Vol. 179, №2, P. 171 - 180.

116. Terashita Т. Purification and some properties of carboxyl proteinase in mycelium of Lentinus edodes / T. Terashita, K. Oda, M. Kono, S. Murao // Agr. Biol. Chem. 1981. - Vol. 15, №9. - P. 1929 - 1935.

117. Terada S. Purification and characterization of three Proteinase inhibitors from Canavalia lineata / S. Terada, S. Fujimura, S. Kimoto // Biotech. Biochem. 1994.- Vol.58. - P. 371 - 375.

118. Tashiro M. The complete Amino Acide Sequence of Major trypsin inhibitor from seeds of Fox tali / M. Tashiro, T. Asao, C. Hirata, K. Takashi, M. Kamamori // J. Biochem. -1990. - Vol. 108.- P. 669 - 672.

119. Tuppy H. Amino soure-p- nitroanilide als substrat fur aminopeptidasen and andere proteolytycs fement / H. Tuppy, U. Wiessbauer, E. Winterberger // Hoppe Selers. Z. Physiol. Chem. - 1962. - Vol. 329, №6. - P. 278 - 288.

120. Volpicella M. Functional expression on bacteriophage of the nustard trypsin inhibitor MTI 2 / M. Volpicella, R. Galeerani, A. Marten // Biochem. And Biophys. Res. Commun. - 2001. - Vol. 280, №3. - P. 813 - 887.

121. Wong P.P. Kuo Т., Ryan C.A. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1975. Vol. 63, №1. - P. 121 - 125.

122. Zeng H. Механизм SP I ингибирования активности кислой протеазы и объяснения стимулирования с его помощью образования плодовых тел / Н. Zeng, G. Xianghong, Z. Xuebao // Acta mycol. Sin. 1994. -Vol.13, №3.-P. 223-228.

Информация о работе

Гзогян, Люсинэ Айказовна
кандидата биологических наук
Краснодар, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Протеолитические ферменты и их ингибиторы в высших грибах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Протеолитические ферменты и их ингибиторы в высших грибах ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеолитические ферменты и их ингибиторы в высших грибах"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гзогян, Люсинэ Айказовна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Протеолитические ферменты и их ингибиторы в высших грибах"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гзогян, Люсинэ Айказовна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гзогян, Люсинэ Айказовна, Краснодар

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Протеолитические ферменты и их ингибиторы в высших грибах
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия