Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ"

АКШШЯ НАУК СССР ОРДША ЛЕНИНА ИНСТШ7Т БИОХШШ им. А.Н.БЛХА

J-Z6/&5

На цравах рукописи

1ЮСО.ЙОВ Владимир Васильев»

БЕЛКОВЫЕ ШПЯБИГОРИ ЕРОТЕОЛИТИТ0СКИХ ФЕРМЕНТОВ

( 03.00.04- йиолопивская ипшя )

Автореферат диссертации в& соисканае ученое степенд доктора бжологзческжх наук

Москва - 1979

Работа выполнена в лаборатории белка а нуклеиновых ( яяслот ордена Ленина Института биохиши си* А. Н. Баха Академии наук СССР

Официальные оппоненты; , Доктор биологических наук, профессор Т.С.ЯАСХИНА

.Доктор биологических наук, профессор М.П.ЧЕРНИКОВ Доктор биолопгаесзщх наук 3. Г. ЕВСТИГНЕЕВА

Ведущее предприятие: кафедра «олекулярнсЭ биологии Биологи. ческого факультета МГУ

Защита состоится " * _ 1979 г. в ■

час

на заседании специалк'зировашгого Ученого совета Д 002.96,01 по закате диссертаций на соискание ученой степени доктора • биологических наук при ордена Ленина Институте Оиохимвя гм. А.Н.Баха АН СССР ( 117 071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2). •

I С дгссертхк^ей мехно оззаксжггъся в б^Злаогеке оас—

логической лктёраттрц АЗ СССР (Ленансгай сросле.чг, 33, ксра.1).

' _¿Бгсре^ерзт разделая р^л? 4979 г,

: ГчещйГсекре гарь специализированного совета, кавдздат биологических наук

/К. Д. Глздидан/ <

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PADOTÜ

Актуальность проблемы. Важность изучения механизмов регуляции активности протеолатических ферментов вытекает иа той определяющей рола, которую процессы протеолиза нграот в превращениях белковых веществ. Установлено участие реакций ограниченного протеолиза в образовании активных белков - различите ферментов, гормонов, структурных белков, белков.плазма крова в др.- из юс предшественников '(Neurath , 1975; Stelner «t al.,'1974;Bornstein , 1974 ). Содержание белков в клетке определяется в такой же степени скоростями их протеолитического распада, как и.скоростями их биосинтеза. Особенно существенную роль процессы протеолитического распада играют при перестройке ыетаболязма в результате изменении окружающих условий ( Holser , IS75; Schiidee . Bradley, 1375). Протеолаткческие ферменты принимают активное участие в механизме секреции белковых веществ, защитных реакциях организма и ряде других хизненно важных-процессов ( Blobel ,Dobbertstei» , 1975;. Oav-le ,Fujikawa , 1975; Líeiael , Kukerjl , 1975).

Присутствущяе во всех исследованных тканях животных, растениях и микроорганизмах белковые ингибиторы протеаз способны связи-, вать ферменты с образованием неактивных комплексов а,таким образом, Егравт важнуюроль в регуляции ц^отеолитических процессов. Значение белков-ингибиторов в регуляции активности цротеолатечес-ких ферментов подчеркивается тем фактом, что их недостаточность может приводить к тяжелым нарушениям обмена веществ ( Werl« et al., 1968). Имеются данныз, указывающие на то, что, нарушение * равновесия мезду протеолптическима ферментами и их ингибиторами _ является одним из факторов, способствущих злокачественному пере— ровдещш тканей (Цупвз , I974;weber . 1975). Таким образом, изу чецие свойств и механизма действия ингибиторов.протеаз на ферменты необходимо не только для понимания путей регуляции белкового обмена у живых организмов, но и для успешной борьбы.с их нарушениями. В этой связи следует отметить, что ингибиторы протеолдти-ческих ферментов ухе нагили практическое применение в медицине (Цасхина и соавт., 1977; Веремеенко, 1971).

Необходимо также подчеркнуть важность изучения системы щюте-

аза - ингибитор в качестве иодела ддялстааовления^общих законо-

' .* .¡r^üttiitísjiasiiCfcSii.tí- <| t

мерностей внсокоспецифичных белок-белковых' взаимодействий а также механизма реакций протеолиза Blow et ai., 1972; janle, cho-thla ,»1Э76).

I Изучение ингибиторов протсолитяческаг ферцектов, содержащихся в тканях высшая -растений,' тлеет важное значение для оценки шсзе— вше качеств растительных продуктов ( Черников и соавт.,. 1Э78).

Пели и основные задачи работа. Цель настоящей работы - исследование тонких механизмов реакции протеаза-икгябитор. Крайне вал-нш1,как с теоретической,: так .н с . практической точки зрения, пред^ 'ставляется изучение биологических функций ингибиторов протеолиза, особенно у высагах растений,.а также изучение возможностей использования юаюбадазовадных белковш: ингибиторов в качестве бяоепе— пифических сорбентов для выделения протеолитических ферментов из различит объектов методом аф^япвой хроматография!

В связи с этим.были доставлены следующие задачи:.

1. Выделение чистых белков-ингибиторов протеолатических ферментов, изучение их химических и физико-химических свойств, особенностей пространственной организации молекул а т.д.

2. Исследование,. на примере выделенных белков, механизма взаимодействия ингибиторов с ферцентама,- вклшагщес два надрав-, ления: а) изучение строения реактивных центров ингибиторов и б) _ изучение ролл.функциональных. групп активного центра.ферментов в реакции взаимодействия с ингибиторам.

3. Изучепие биологических.функций ингибиторов протеаз'у высших растений.. .

4. Выяснение возможностей ¡использования иммобилизованных белковнх,ингибиторов протеаз для выделения ферментов методой:аф-фшшой хроматография.

Научная новизна а практическая ценность. В процессе работы выделены вовне, ранее ве известные белки-ингибиторы протеолитичес-кюс ферментов. Изучены их химический состав, физико-хтет^еские свойства, а.тгаежо-спектр.действия на ферменты. Исследованы особенности структуры молекул ингибиторов на различных уровнях органи-' зайиа (вторичная, третичная.й;четвертичная структура), а-такзе< " строение реактивных центров - участков молекул, встушшстс в не/ посредственный контакт с актавшога центрами ферментов. На основа-

шга экспериментальных данных и анализа литературы высказано предположение о том, что все белки-ипгибиторы протеаз из растений могут бить отнесены к двум различным типам в зависимости от того вклада, который вносят гидрофобные взаимодействия в стабилизацию их пространственной структуры.

Исследования, проведенные с трипсином и хиыотрипсином, подвер- . гнутыми химической модификации, правела к принципиально важному выводу о том,.что наличие каталитической активности не является обязательный условие« образования устойчивых соединений фсркентов с ингибиторами. Это свидетельствует о том, что основной вклад в стабилизацию комплексов фермент-ингибитор вносят слабые пекова-лентные взаимодействия медду реагирующими поверхностями белковых молекул. Модификация субстратсвязывазкцих (сорбцдопншс) участков в трипсине или химотрипсике во всех случаях сопровождается потерей .способности связывать белковые ингибиторы.

Значение высокого содержания ингибиторов трипсина и хемотрипсина у высших растений долгое время оставалось неясным. В резуль-' тате проведенных исследований удалось установить, что некоторые ингибитора протеаз, содержащиеся в высших растениях, способны подавлять активность ферментов, а также тормозить рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов. Эти данные послужили основанием для предположения о том, что ингибиторы протеаз играют важную роль в заэдте растений от поражения фнтопатогенннми микроорганизмам.

Еольаое внимание уделено исследованиям, связаянюл с возможное- • тяии практического использования природных ингибиторов протеаз для выделения и очистки ферментов. Развитие методов аффинной хроматографии ферментов выдвинуло задачу получения высокоэффективных баоспеци^пческих сорбентов. В качестве таких сорбентов иммобилизованные белковые ингибиторы протеаз имеют ред важных прегглуг;ествр главными из которых являются высокое сродство к ферментам и высокая специфичность. На основе использования иммобилизованных белковых ингибиторов |гротепназ различного происхождения разработаны процедуры очистки рада ферментов, включая трипсин, каллихреан. трипсиноподобную протеазу микроорганизма ег1овиз и некото-

рые другие.

Агтробапдя работы. Отдельные части представленной работы была доложены на 1-м Всесоюзной симпозиуме по хкиия протеоллгических ферментов (Вильнюс, 1973), 1-й Всесоюзном симпозиуме "Получение л применение иммобилизованных ферментов" (Таллин, 1574), 3-ем Всесоюзной биохимическом съезде (Рига, 1974), Х-оЯ конференции ФЕЕО (Парцз, 1375), 11-и Менделеевском съезде по общей и прзклэдноЗ . химии (Аш^а-Ата, 1975), З-еы Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции активных центров ферментов" (Пущино-на-Оке, 1976),*2-м Всесоюзном симпозиуме "Получение и применение иммобилизованных ферментов" (Ереван,- 1977), 4-ом Всесоюзном симпозиума по химии белков и пептидов (Минск, 1977), 2-м Всесоюзном совещании по ферментам микроорганизмов (Упнск, 1078), Всесоюзном симпозиуме "Азотный и белковый обмен растений" (Тбилиси, 1978), на заседаниях Московского отделения Всесоюзного биохимического общества и научных конференциях Института биохимии им. А. Н. Бага.

Публикации. По1материалам диссертации опубликована 41 печатная работа, в том числе одна монография. .

Структтра У[ объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), экспериментальной "части, вклотащей 5 глав, заключения, выводов а списка цитированной литературы ( 667 наименований на русском и иностранных языках). Рабата изложена на-395 страницах мзеинописного текста и ийлюстрирована 62 рисунками и 53 таблицами. В обзоре литературы рассмотрены вопросы распространения ингибиторов протеаз, методы шс выделения и очистки, особенности химического состава, физико-химические свойства, первичная структура и пространственная организация молекул. Специальный раздел посвящен рассмотрению строения реактивных центров ингибиторов протеаз и механизма их действия.

, ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БШКОВ-ИИП-ДЖОРОВ ПРОТВОЛИТИ-ЧЕСКИХ ОЕгаЫГГОВ -

Ингибиторы трипсина и хшотрипсипа из Фасоли ( ^Шаоеогцз > уид^апа ь.). Как было установлено, семена фасоли обыкновенной по содержанию ингибиторов протеолитнческих ферментов не уступают такому традиционному объекту, каким является соя (Абрамова, Черников, 1964). В связи с достаточно широким распространением культуры фасола в вашей стране, она может служить удобным объектом для: получения белковых ингибиторов протеаз в препаративном касэтабе.

Высокоактивная препарат ингибиторов трипсина и химотрипсина из фасоли бил получен с помощью простой процедуры, включающей экстракцию белков 60^-нки этанолом и гель-фальтрацию на колонке с 'сефздексоы & -75 в кислой среде. Выход составлял около 1,5 г активного ингибитора из I кг семян. В таблице I приведены даяние, характеризующие активность ингибиторов протеиназ, выделенных из различных растений семейства бобовых. Как видно из таблицы, икги- ■ бзторн из>фасола обыкновенной по своей способности цодавлять активность трипсина не'уступают другим белком, а по действию на хи-иотрлпсш! даже превосходят некоторые из них. ■_ .

Суммарный препарат ингибиторов трипсина и хямотрипсина из фасоли содержит 3-4 белковых компонента» облэдакцих в одинаковоЯ степени высокой ингибиторной активностью по отношению к обоим ферментам . Выделение индивидуальных белков-ингибиторов может бить осуществлено с поиодью цетода ионообменной хроматографии или изоалектрзсческого фокусирования в градиенте плотности сахарозы '( Мосолов и:соавт., 1376; 1977).

Два ингибитора (ингибиторы II и Ш-Б) бала выделены в гомогенном виде с помощью ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ-сефадексом. Но своему аминокислотному, составу белки-ингибитора сильно отличашся от основных запасных белков семян легукяна и вдги'гд"-4 (таблодд2). Особенно большие различая наблвдаются в содержания цастина. Попытка обнаружить свободные сульфгвдрильпые группы в белках дала отрицательные результаты.-Таким образом, молекула каждого белка-ингибитора с.молекулярным весом около 10 ООО содерззт 7 дасульфздных мостиков. Близость аминокислотного состава ингибиторов из фасоли и некоторых других ингибиторов,-

Та&дида I

Активность ингибиторов протеиназ, выделенных из растений семейства бобовыг

Источник /фермент . Активносп^ Авторы

Phaseolus vulgaris трипсин 2,8 Иосолов и со-

хииотрицсин 2,5 авт., 1976

Iba во ol\is angularis трипсин 2,07 Yoohtda, Yoahl-

химотрипскн 2,58 kawa, 1975

Doliohoe lablab трипсин - 2,5 t Furusawa et

muo трипсин 2,5 al., 1974

Phaseolus lunatue трипсин 2,5—2,6 - Haynes,

i ' кшотрппсин í ^ Feeney, 1967

Glycine max ^рипсин 1.3 Laskowski,

(и* Кунитца) хииотрипскн нестехио- ■ I^ekowski, 1954

метрич.

Glycine ntax ~ трипсин 2,0 . ' * Tunoer et al,,

(и. Баушиа-Еирк) тимотрапсин 3,0 1975.,

"^Активность в иг связанного фермента па I иг ингибитора.

выделенных из растений семейства бобовых, особенно близкое содержание остатков цкстяна, позволяет предположить, что все эти белки принадлежат к одной структурной группе. Подобное предположение согласуется.с результатами изучения спектров кругового дихроизма белков С Рис.1). Общий характер спектров ингибиторов из фасоли обыкновенной напоминает спектры ингибиторов из сои (типа Баумана-Блрк) и ллыскоЗ фасоли С Uceda et al, , I96Ó; Кау , I976X NHg—и СООН-концевые последовательности ингибиторов II и Ш-Б, * определенные с применение» метода Эдаана и гидролиза карОокси-пептидазаш А и В, имеют вид: 1

U Gly-Gly-Leu-Pro-Aop-Ser-Gla-...-Lya-Phe-Ser-Leu ffl у; Ser-Glj-Leu-Pro-Aap-Ser-Clx-,..-Arg-Fhe-Ser-Leu

Таблица 2

Анганокаслотннй; состав Йелков из сешга фасоли (шяь %)

.Аминокислота Бедок Ингибитор II: Дзгуиив*' ЬишшйГ*^

Аспарагнновая кислота 15,5 9,5 Ю;8

Треонин 5.8 4,9 3,4

Серия • ■ 14,6 7,3 7,7

Глутаыпновая кислота- 11.6, 13,1 11,7

ПрОДИН: 7.8 5,1 3.0

Глихщн ■ 3,9 8,0 4.7

Алании 3.8 6,9 4,2

Цасгин/2 13,6 0,6 0.3

Бзлин 0 7,0 5,3

Ыатяошш 0 ■ 1.5 0.5

ИзолеЯши • 3.8 4,9 5.0

ЛеЙшга ' 2.9 9.7 8.0

Тирозин 1.0 2.9: - . 2,1

Фенялалалжн Х.з, з;е 4.5

Лизин. 4,а 3,0 1.9

Гастадин 5.8 3,0 1,9

Аргиная' . 2.3 4.8 3,2

Триптофан 0 0.7 0.4

** 1>егЪувЫг« ^ а1., 1976г 1970.(

Такта! обраэои, ингибитор Ю-Б, содержащий на 4 аминскисдотнвх остатка меньше, не мог возникнуть в результате отщепления:четн-рехчлекдого пептида, от молекулы ингибитора. II. На этом основании обе форгды можно считать истинными изоингибиторами, различающимися по свое^первзгда^ структуре. .

Определение молекулярных весов ингибиторов из фасолз с помощью иетодатель-фмьтраяяа-дало величину М,.» 19 ООО при нейтральна* значениях рН. Прй рН 2,0 подучено значение Мг» 10 ООО. Последняя величина Слззка к шдекулдрному:весу ингибиторов, рассчитанному. на основаяга их реакти с - трипсином (Посолов и соавт.,

. . * ( 1

Рас. Г. Спектра кругового дихроизма белков-ингибиторов протеаназ из фасоли (А) и картофеля (Б). I,- натввннЯ белок, 2 - белок в присутствии

додецилсульфата натрия (О.ОЗ Ы). > *

1976). Эта результаты показывают, что иолекулы ингаЗаторов из фа- • соли ойяадают сильно выраженной способностью к ассоциации в присутствуют в водках растворах при нейтральных значениях pH преимущественно в дшгерной форие.

Анализ) спектров кругового дихроизма ингибиторов нэ фасоли показал, что из. молекулы характеризуются низкий содержанием упоря-• дочеяннх структур, в частности, содержание ©¿-спиральных участ-*ков на прзвЕсгает 4-7$ (Рас.ХА^,

Изучение шшяния различных денатураруташх факторов на ингибиторы из фасоли показало, 'что белки обладают высокой терко- а кисло-.тостаблльиость», а также устойчива к действию кочевала, гуанвдпн-хлорада, додецдлсульфата натрия и переваривании пепсином ( Мосолов и соавт. , 1977). В то же вреиа продолжительная инкубацая в целочноЗ среде (pH 12,5) вазнвает серьезные конфориацаоннае пзае-Еенкя. - •

• Как.показали опыты по химической модификации и ограниченному протеолиэу, ингибиторы из фасоли содержат различные центры, ответственные за связывание трипсина и химотрипсяна и, таким образом^ относятся к группе двуглавых ингибиторов протеиназ. Б центре ингибиторов, ответственном за связывание трипсина, содержатся остатки лизина. Интересной особенностью ингибиторов из фасоля является способность связывать, при определенных условиях, две молекулы трипсина. При этом вторая молекула трипсина связывается менее прочно и может вытесняться из соединения о ингибитором в присутствии- субстрата, обладающего высоким сродством к ферменту (Мосолов и соавт., 1977). Тая'как ингибиторы из фасоли, как уже отмечалось, принадлежат.к типу двуглавых ингибиторов,. следует . считать,.что вторая молекула трипсина присоединяется к центру, ответственному за связывание хямотрипсина. В отличие от этого, хн- ' мотрипсин.способен связываться только с одним центром в молекуле ингибитора ( (.'.осолоб, Федуркина,' 1973). На основании полученных данных высказано предположение, что ингибиторы из фасоли обыкновенной представляют собой переходную форму от примитивных двуглавых ингибиторов, образовавшихся в результате дупликации н слияния генов одноцентровых,ингибиторов, к истинным двуглавым ингибиторам, содержащим цептры с четко разграниченной специфичностью, одновременно, полученные результаты.позволяют предположить, что предшественник современных /Двуглавых ингибиторов протеиназ из растений семейства бобовых обладал активностью ингибитора трипсина..

' Ингибиторы' протеаз из картофеля. Представители семейства пасленовых ( 5о1аюасеае ) занимают второе место среди высших растений по содержанию ингибиторов протеолитических ферментов. Особенно высоким содержанием ингибиторов характеризуется картофель, у которого ингибиторы протеаз присутствуют как в клубнях, так и в надземных .частях растения (йуап ,. Ни1шпап , 1967). Основная: касса ингибиторов из картофеля представлена термо- и-кислотоста-бильнкми белками, р связи с этим, в качестве исходного материала для выделения ингибиторов был использован препарат термостабаль— ных белков, который получали прогреванием экстракта из клубней при 60° в течение 5 шн. Изоэлектриче ское фокусирование терыоста-бдльных белков изюгубнеЗ картофеля сорта Любимец показало вали—

чиепо крайней мере 8 компонентов.с активность» ингибиторов трипсина и химотрипсина. Один из белко® (белок с р! 7,3), характерз-зуютйсяв равной , степени высокой лгагибиторной активностью как-ло отношению к трипсину,, так и по отношение к.хямотрадсину,. бця по-дуч ев в гомогенном состоянии с помощь» изозяектрического фокусирования в градиенте плотности сахарозы ( Мосолов и соавт.1975).

Некоторые физико-химические, свойства вщелекаого белка приведены в таблице.3. ■

Таблица 3

Физико-химические свойства белка-ингибитора с р! 7,3,

гель-фильтрация- * 31 500

' ' * седиментационное равновесие виз -электрофорез 52 500 " 15 000

ультрацевтрифуги-рование * . 2,8 8

г/гь : гель-фильтрация.. 1.М

V аминокислотный ■ состав 0,71 Мл/г

р! изозлектрическое фокусирование * » 7,3

Результаты определения молекулярного веса с помощь» различных методов позволяет сделать,заклотепие, что молекула белка с молекулярным весом 32 ООО состоит из двух одинаковых субъедкниц с величиной = 15 ООО. Диссоциация молекулы ингибитора на субгедишпш происходит как: в присутствии дсдешитсульфата натрия, , так и-при-киотах;значениях ( Мосолов и соавт., 1273). На этом основании-мозспо предположить», что связь ыезду субьедотгацаии определяется в первую очередь гидрофобными и ионными взаимодействиями.

Спектр кругового дихроизма ингибитора с.р1 7,3 характеризуется отсутствием полос ».области 208 и-222 ни» которые свойственны спектрам белков, содержащих структуры типа ¿¿-спирали - (Гас.1Б). Проведенные расчета показали,. что основными элементами вторшой..

структуры белха являются р> -складчатый слой я неупорядоченные участки. Молекула проявляет высокую устойчивость при кислых и щелочных значениях рН, а:также в присутствии гуанядигослорида. В то же время, додещлсульфат натрия вызывает глубокие конформаодон-ные изменения в белке (Вис.1Б).. Характер этих изменений типичен . для белков,.в:стабилизации структуры которых важную роль играют гидрофобные взаимодействия ( Лгеедаояа , 1973).

Таблица 4

Аминокислотный состав ингибиторов протеиназ из.картофеля

Ингибитор

Аминокислота PI 713 *)

гимотриц-сина I tt-a(rr-B)

Аспарагиновая кислота II ' 9 II ' * 11(9)

Треонин^ 9. 3 3 6(5)

Серил 9 '4 4 7(6) .

Глутаиинавая кислота II 9 8. 8(8)

Пролин " 7 5 5 6(9)

Глишш 16 6 7 .13(12)

Алании 1 • 6 5 2 5(6)

Цястия/2 i - 14 2 2 12(12)

Валин 4 . 8 9 2(1)

Метионин I I 0 0(0)

Изолейщш 6 6 9 ' '4(4)

Лейцин 6 8: 10 3(3)

Тирозин В I I 6(6)

фенялалаяив. 3 2 3: 3(3)

Лизин 9 5 !5 8(10)

Гистидан 2 I . I 0(1)

Аргинин: Триптофан i 4 4 4 3(2)

0 0 I. 0

Общее число остатков 126 79 85 . 97

*> Uelvllle, Ryan, **#)Iwaeait et al. 1972;. ***' Kiyohara «t al., 1973.

,1972.

По своему- аминокислотп'оцу составу белок-ингибитор с р1 7,3 существенно отличается от ингибиторов протеиназ из картофеля,', выделенных другими авторама: (таблица 4). Для белка характерно ( высокое содержание цзстпна,.. аспарагиновой и:глутаминовой: кислот. -а тшеже глициыа,. лизина п-тирозина.,

Ингибптор с р! 7,3 способен-подавлять активность.трипсина, хи—-мотрнпсина, плазмина и реда сериновых.протеиназ микробного ироис- ' хозденая, включая.субталпзин и тркпезно— и химотрипсиноподобные. .ферменты г*г.£г1зеи8. В то же.время,.ингибитор.не оказывает влияния на активность пепсина и-пападва.. На основании . патутштац данных-выделенный ингибитор можно классифицировать как специфический ингибитор сериновых протеиназ,.обладающий весьма широкий: спектром действия. ,. .

Исследование стехиометрии реакции ингибитора с р! 7^3 с трип-сипоы и химотрипсаном позволяет сделать заключение, что каддая из двух субъединзц,/образующих молекулу ингибитора, содержит по-одному центру связывания для.хаждого,фермента. Тем .не менее,- взаимодействие о:ферментами не:сопровождается'диссоциацией:молекулы янтабитора. Дреоблддащеа формой комплекса-ингибитора с. трипси-яом^.хдлотрипсином и субтилизяном является комплекс,, содержащий недиссодаированную молекулу ингибитора и:одну молекулу-фермента.. Только при высоком относительном содержании протеаназы удается' наблюдать образование более тяжелых костлексов(Мосолов и соавт.,, 197В).

Белок о р! 7,3 теряет'способность связывать трипсин в ре зуль-тате обработки малеиновым ангвдридом, однако,, его активность по ^ отнесению к химотрипсину при этом пе изменяется ( Валуева, Мосолов, 1976). Это свидетельствует о двуглавом характере ингибитора,, а также указывает, на наличие остатков лизина в центре, ответ от- . венпом за связывание трипсина.Как известно, белковые ингибиторы трипсина и химотрипсина могут бить специфически расщеплены, ферментами в кислой среде по пептиднойхвяэл, расположенной в реактивном центре ингибитора (Оааша ,1ааЬоивк1,196б)'. В СВЯЗИ С этим белок-ингибитор с р! 7,3 подвергали действию трипсина а хи-котрипелна. при рНЗ, 0. Модифицированный'ингибитор обрабатывали: надмуравыгаой кислотой и полученные. пептидные фрагменты . раздела- -а о. помощи гель-фальтрацаи на. колонках с. сефадексом ( Валуева, '

• ' . ' - '

Мосолов, 1976; Балуева, Зюпчева, Посолов, 1977).-Анализ аминокислотного состава полученных пептидов, а также результаты определения NHg- а СОСН-концевых групп в пептидах позволили идентифицировать аминокислотные остатки, входящие в состав д вух реактивных центров ингибитора, а также установить положение реактив-ню: центров в молекуле бедка С Рис. 2).

Три псинсдозыд ающ а й

{ центр

Рис. 2*. Строение и локализация реактивных центров в коле-куле ингибитора из картофеля с р1 7,3.

Применение аффинной хроматографии для выделения ингибиторов протеиказ. Народу с обычными методами выделения белков, для получения вксокоочшценных препаратов ингибиторов протеиназ бил использован метод аффинной хроматографии. С цомагцыз аффинной хро-ттографии на колобах с иммобилизованным трипсином и химотрип-сином получены высокоактивные препараты ингибиторов из сеглп фасоли а клубней картофеля ( Ыосолов, Оедуркана, 1974; Иевлева, Ыосолов, 1975). Хэрошие результаты дано применение метода аффинной хроматографии для ввделекия ингибиторов цротеиназ из яичного

белка различных- вадов ггпщ, в особенности, для получения чистого овоингябитора. Последний присутствует в белке куриных яиц в виде минорного компонента и:его выделение сильно затруднено ввиду бли--зоста 1 физшсо-хишческих свойств с овомуковдои - количественно, вреобладакщта алтипротеолитнческиа кошонентом.. Поскольку из двух указанных белков только овозпгпбитор действует на химотрипсин, дляего выделения бкла использована аффинная хроматография'на колонке с иммобилизованным хкиотрипсииоы ( Мосолов и соавт., 1974), - За одну стадию достигается очистка приблизительно в 60 раз,, полученный ингибитор бал свободен от примеси посторонних белков.. ■

ВКЛАД СТПШИОНАДМЫХ ГРУПП-АКТИВНОГО .ЦЕНТРА ЗШШВТОБ В РЕ-АКДШ, В5А{ШЛ&1СПШ С БЕЖШЬШ №1ГИБИГ0РАУИ

^КИ^-котщеоого остатка изолеЛцдна! ' Освобождающаяся в процессе активации химотрлпсиногена или ,* трипезаoreна сС-аминогруппа остатка изолейцина-^б образует внутренний солевой мостик с карбоксильной группой аспарагиновой кис-лотк-194 (номера остатков в последовательности химотряпсяногена), В результате индуцированных копформацаонных изменений завершается форырованае субстратсвя знкшдего участка активного центра ферментов (Freer eV &1* ,1970; Stroud etal., 1974)..Соответственно модификация амотогрушш остатка изолейдана приводит к утрате способности связавать специфические субстраты (Dixon ,Bofaann , 1970; Oppeahelner et al. , 1966).

Способность ¿¿-Х1Е£отряпсина, у которого NEj-концевой и золе i!-сста подвергнут кодифжацдп посредством обработки азотистой кислотой,, образовывать комплексы с белками-ингибиторами исследовалась с помощью методов гель-фпльтрацшг и ультрацентрифугярования.

На рисунке 3 показано влияние продолжительности обработки азотистой кислотой на.способность фериента взаимодействовать с соевым ингибитором Йуиатца.. Со мере увеличения временя инкубации С-азотистой кислотой химотрипсин постепенно утрачивает способность связнвать ингибитор. При исследования з ультрацентрифуге смоси, содержащей натзвный химотрипсин и овоиукожд из утиного

балда, обнаруживается один белковый компонент, иыещиа: коэффициент седиментация'3,3 s »который соответствует комплексу фермента с ингибитором. В отлитое от этого, на седиментограммах смесей, содердапиг химотрппспн, обработанный азотистой кислотой, присутствует только материал с коэффициентом седиментации 2,0-2,I s , что соответствует коэффициентам седиментации свободного фермента и овомуковда. Аналогичные результаты были,получены при исследовании в ультрацентрифуге смесей дезаминированного шштрипсана с ингибитором из картофеля.

Полученные результаты позволяют сделать заключение, что моди-фжация ei-амшюгрутш остатка изолейшта-16 в химотряпсине приводит к потере способности.связывать белковые ингибиторы. Пос-•кольку обработка белка азотистой кислотой может сопровождаться некоторыми:побочными реакцсяшД Diacon , Hörnern , 1970), били проведены также экспериментах химотрипсиноы, аминные группы которого подвергнуты ацетклированию при помоет обработка уксусным ангидридом. Фермент с блокированными я-аг.'ашогруппама остатков лизина получала путем "быстроЯ" активации трипсином хииотршсзщо-гена,. предварительно обработанного уксусным апгадрвдом ( Oppen-he leer et al.. 1966). Полученный в результате активации мотрипсип, у которого все амкпнце группы, за исключением вновь освободденпрй «¿-аминогруппы изоле2цяна-16,. ааетилированы, обладает высокой ферментативной-активностью. Однако повторная обработка фермента уксусным ангидридом приводит к полной инактивации. Способность двух форм ацетилировшшого химотрипсина взатюдейст-•вовать с ингибиторами из фасоли, сои и картофеля исследовалась с. nouoaa.il метода гель-Фильтрации. Полученные результаты показывают, что фермент с ацетилировашшми £-аминогруппами сохраняет способность образовывать устойчивые комплексы со всеми исследован— тела ипгибиторада ( Мосолов и соавт., 1976). В отличие от этого,, хиыотркпеин, у которого блокирована «¿-аминогруппа Nüj-конце-вого остатка изолейцина,.не взаимодействовал ни с одшы из изу--ченных белков-ингибиторов.

Аналогичные исследования были;проведены с различными ацил--произвещными трипсина. Известно,,что обработка трипсина: ангидридами органических кислот в водной среде приводит к образование акия-трипезшов, полностью сохранявших.ферментативную активность

- IS

••Г' ~ " .

Элюат, мл » *

Rae; 3. Гель-флльтрацня смесей, содержащих «¿-яимотрип-сив и соевый ингибитор Кунатца. А - нативннй фермент, Б а В - фермент, подвергнутый обработке азо- ■ тистой кислотой-в течение 3 и IÖ часов. I - белок .по Лоури (Ag56). 2 - протеолитаческая активность

( Иосолов,-Душшкова,. ISS6; Laboueeoe ..Gervais: ,-1967)..

В этих условиях происходит исключительно модификация. ¿-аминогрупп остатков лизина в белке. Блокирование «¿-аминогруппы. ИНд-концевого изолейцина в трипсине может быть осуществлено только в условиях мягкой обратимой денатурации фермента и сопро--важдается потерей активности ( Chevallier et al., 1969).

Модификацию £-аминогрупп в трипсине осуществляли с: помощью 1 обработки. уксусным или янтарным ангидридом.. Фермент. с блокированной -аминогруппой получали при.повторной обработке ацетилтрип--, сина уксуснЫ ангидридом в присутствии 2 U мочевины.

Способность различных ацал-производных трипсина взаимодействовать с белковыми ингибиторами исследовали с_помощью метода аффинной хроматографии. В качестве биоспецифического сорбента* использовался куриный овоыукоид, : ковалентно присоединенный к сефа-розе. На колонку, с иммобилизованным овомуковдоа наносила раствора трипсина или соответствующего производного:при.рЦ 8,0. После тщательного отмывания стартовым раствором злвцию связанного на колонке белка производили при pH 2,0 т.е. в условиях, вызываниях диссоциацию комплекса трипсин-ингибитор. Как видно из результатов,, представленных на рисунке 4А, болызая часть белкового материала, содержащегося в препарате трипсина,,ацетплированкого по £-аки- * ногруппам,. задерживается на колонке с иммобилизованным ингибитором при рн 6,0..При этом вся ферментативная активность препарата оказывается сосредоточенной в материале, злюирутеемся при кислях •значениях pH (компонент П). Полученный результат свидетельствует о. способности трипсина с ацетилированныг,1и. s. -аминогруппами образовывать прочные комплексы с иммобилизованным ингибитором.. Сходные результаты били получены с сукцннялтрипсином,-с.тем отличием, что удельная активность материала, здшрупщегося кислотой, была в этом случае несколько ниже (.последнее связано с : введением большого числа отрицательных: зарядов/"в молекулу фермента). В отличие от упомянутых вше производных,. трипсин, у которого) ацетилирована

«¿-аминогруппа Ш^концевого аминокислотного остатка, „пе взаимодействует с иммобилизованным 1шгабитороц : (небольшое количество материала, .задерозшавдегося на колонке при pH 8,-. рбусловлепо'примесью активного фермента). Таким.образом, также как и в случае с химотрипсизои, , кодификация. об-аминогруипн остатка изолейцина ■ в

трипсине сопровождается утратой"-способности связывать белковые

ингибиторы.

(

^290 Я ж I ■ в-

- - +

0,5 _ ' / ;

\ рН2 рпг.

П / VI, Л \.Г\\

20 40 БО 20 40 00

Злюат, мл

Рис. 4. Взаимодействие адил-пропзводншс трицсщш с шгмоби-лизованным белковым. ингибитором {овоыуковд). А - трипсин,. ацетилировапный по £-аминогруппам, Б - трипсин, ацетилированкнЯ по оС -аминогруппе.

Значение остатков, образуд^пх каталитический центр Ферментов.

Ко времени начала исследований широкое раснроотранение получил взгляд,. согласно которому комплексы трипсина и хлиотрипсина о белковыми ингибиторами'построены по тому же типу как соединения ацил-фераент, образукциеся в процессе реакции ферментов с обычными субстратами ( Хдокопгвк! , БеаХоск , 1971). . . , * «

Радой авторов была исследована способность образовывать соединения с ингибиторами для производных, трипсина л химотрипсина,, у которых. остатки серина в активном центре подвергнуты химической1 кодификации. Полученные результаты были в значительной степени , щютшзрречзвыыи*

С одной , стороны, боло показано, что ферменты;

обработанные dfp или .pusf , не взаимодействуют с беляовьсги нзгибиторами.С.Черников». Епикитер, IS55; Felnstein , Peeney , 1966 ). С-другой стороны, ангкдро-производные трипсина и хжотри-вс.тна, у которых остатки серина в активном центре заменены на.остатки. депщроаланина, образуют устойчивые комплексы с шгибито-рами ( Ыосолов и соавт., 1972;. Afeo et al., 1972)., IZo-tho предположить, что утрата в ряде случаев способности связывать белковые ингибиторы не столько является прямым следствием потери каталитической -активности, сколько результатом экранирования' области активного центра фермента замеакшцкми. группами. Для окончательного v решения вопроса было весьма ваяно провести исследования с другими каталитически неактивными.производными ферментов,-не содэржа--дикд глссивншс замечающих группировок..

В связи с поставленной задачей,.в качестве объекта исследований бил избран.химотрипсия, у которого к атому нег остатка. гистидипа-57 присоединена метилыюя группа.: Такой метилированный фермент (метнлхимотрипснн) обладает весьма низкой каталитической: активностью, однако по своей.копформацки и способности связывать конкурентный ингибитор профлавин он не отличается.от нативяого химотрипсипа С Антонов, Воротшщева, 1972; Веойегвоп , 1971). Метилированный.фермент.получали путем обработки - «¿-гсмотрипсииа метиловым эфиром п-нитробензолсульфокислоты ( Hakagawa , Bender 1970). «

На рисунке 5 представлены результаты опытов по гель-фильтра-ции.смесей нативного и.метилированного химотрипсина с ингибитором, ввделенным из фасоли. На'основании величины молекулярного веса С 33 ООО) и характера расаределениягингибиторноЗ активности по отпотеют к.трипсину тяжелы.! компонент, присутствующий в смеси с метилированным химотрипскпом,, может.быть идентифицирован как.комплекс фермента с ингибитором. Сходные результаты:получены с ингибитором из картофеля и ингибитором Баукана-Бирк из семян 'сои.-С целью определения значений Касс .для соединений метилированного ú¿-гимотрипсина с.белковыми ингибиторами,, была про- 1 ведены опыты по вытеснению дативного химотрипсива вз коштлексов с. ингибиторами: в присутствии метилированного, фермента.. Опыты, проводились в двух вариантах. В первом .варианте, эквимолекулщрнве количества ■ нативного: химотрипсива: и ингибитора. смешивались при

30 -чо Злюат, мп

юо Дт

60 -0,4

» о.э

60 $ '

40 с М

з

20 1?'

О 1'

80 | № § „

$О Ф

НО . 0,2

го 0,1

О

о

I

I

40 во

.Злюат}мл

Рис, 5. Гель-зальтроция алее эй нативного

(А)"и метилированного (Б) тгатрип-сина с ингибитором из фасоли.

Ркс. 6, Гель-фильтрация смесей нативного

(А) и метилированного (Б) химотрип-сина о основным панкреатичзскзм ингибитором трипсина:

■ 1 ~ ^280* 2 -^агкбировение 'трипсина.

рН, 8. К смеси добавлялся метилхимотрипсин и процесс вытеснения прослеживался по нарастанию ферментативной активности во Семени. Во втором варианте опыта нативншЧ фермент добавляли в смеб|, содержащую комплекс метилированного химотрипсина с ингибиторам. В этом случае вытеснение метилхикотркнсина сопровождалось стечением ферментативной активности, вследствие связывания натив!;^'го фермента с ингибитором. Оба процесса' приходят к одинаковому ^увновес-ноку состоянии, прз котором приблизительно 30£ ингибитораУуахо-датся в виде комплекса с метилхимотрипсинсм и около 70? виде комплекса с нативным ферментом ( Рис.7). Рассчитанные величина ^асс. приведены в таблице 5. следует из полученных дашщх, химотрипоин, метилированный по остатку гистидаша-Ь7, обра^от с ингибиторами.комплексы, которые характеризуются высокими ^аче-

НТГЯМК

80

§

<6 £ 20

Г-

• 1

«г

-----—

| во

|

^ 20

к

____

*

---

л.

V е

дрема, часы

.3

24

Рис. 7. Вытеснение химотрипсина из комплекса с' ингибитором ¡в присутствии метлхимотрипсина (I) и вытеснение метвлхимотрипсана нативным ферментом-(2). А - утиный овоыукоид, Б - картофельный ингхбитор.

■ В то же время, в каждом конкретном.случае значения К^^ иске для комплексов -с. метилированным химотрипсином, по сравнению с на-тивным ферментом. Это указывает на то, что модификация остатка ' гистшшпа в ферменте: приводит к определенному снижению прочности комплексов, образуемы!:с природными ингибиторами.. Более того,, как показала последухеие эксперименты, металхимотрипсан. вообще, не:образует стабильных, комплексов о некоторыми ингибиторами.. К числу последних относятся соевый ингибитор Кунитца и основной панкреатический ингибитор трипсина С йис; 6)..

Таблица 5

Взаимодействие-белковых ингибиторов.протеиназ с нативнъщ. и ■метилированным, химотрипсином.

' _Касс^М"1)_

Ингибитор. Ымотрипсин-Метдпхимотрипсин _

Утиный:овоаукоид 5,6 х Ю8 0,9 х.Ю7

Картофельный.ингибитор. . 0,2 хЮ8 . • 0,4 х Ю7

Кщ-лбитор из фасоли - 2,6 X Ю10 0.3 х Ю9 .

Ингибитор Кунитца Ьз сои 2,0 х IQ6 не взаимодействует

Основной панкреатический" ингибитор трипсина. 1,0 х Ю8 не взаимодействует

Полученные. результаты представляют интерес: с двух точек зрения. .Во первых,, ота подтверждают представление о том, что наличие каталитической активности не является обязательным условием образования прочных комплексов ферментов:с ингибиторами.. Таким . образом,- можно считать установленным,, что основной вклад в ста-билизалив комплекса протеиназа-инглбитор' вносят.слабые:некова-лентные:взаимодействия между реагзрумдаи поверхностями белковых' молекул. Во-вторнх» они. указывают на вероятное существование различий в механизме образования комплексов ферментов с разными ■ ан- ■ гибиторами. В связи с этим интерес представляет тот факт, что не,

образуют комплексов с метиляимотрипсином одноцентровые ингибиторы. У обоих исследованиях белков этого типа - ингибитора Кунитаа из сои и основного панкреатического ингибитора - в положении Pj реактивного центра содержатся остатки основных аминокислот. Ta-i кзм образом,, взаимодействие с субстратсвязывающим участком химо-трипсипа у этих ингибиторов значительно ослаблено. В этих условиях вклад групп, расположенных в каталитическом центре фермента, в образование .соединения.с ингибитором может быть весьма значительным. Подобное предположение находится в соответствии с результатами рентгепоструктурного анализа комплексов, которые указывают на вероятное прямое участие боковых цепей остатков гдсти-дша, расположенных в активном центре трипсина и химотрипсина,в ,связывании указанных ингибиторов (Blow et ai, , 1972; Sweet et al., 1974). В"случае двуглавых ингибиторов, к которым принадле-жат-.все ингибиторы, образующие стабильные.донплексы с метзлхсмо-трипсиноа, олределящий вклад вносят.взаимодействия,с.субстрат-связывавдим участком фермента.

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ФУНКЦИЯ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕАЗ У ВШШГ

РАСТЕНИЯ • ' •

Широко известка'та активная роль,.которую играют.протеолити-ческие ферменты в процессах мобилизации запасных белков у растений ( Бах, Опарин, '1922; Кретович, 1948). Важное значение имеет протеолитический распад белков при старении растительных тканей,, а также при:перемещении белковых веществ из вегетативных частей •растения в семена и ; другие запасаадие органы { Jiatlle ,, 1975;: Peterson ,. Huifaker :, 1975;.Storey.. Вееvers , 1977). В СВЯЗИ с этим, следует предположить наличие в тканях:растений специфических механизмов, контрагирувдгх действие цротеалитических ферментов и, таким.образом, предохраняющих.белки и,.в частности запасные белки семян, от преждевременного разрушения. Широкое распространение белков-ингибиторов протеолитических фераёнтов у высших растений согласуется с представлением о том,.что oint играют важную роль в регуляции процессов протеолиза.

Однако, только некоторые из ингибиторов протеаз,.присутствующих в растениях, способны оказывать.влияние.на активность собственных ферментов (Sbaln , шуег , 1965 ; Mlkola, Enari , 1970 ; Royer

et al., 1974; Baungartaer Cbriapeele , 1976). Подавляющее большинство ингибиторов протеаз из.высших растении представлено. ингибиторами трипсина и химотрипсина. В связи с этим, кажется: оправданным предположение,. что: действие этих ингибиторов направлено на подавление активности чужероднга ферментов... Действительно, в литературе смеются указания на.то, что некоторые ингибиторы протеаз из высэих растений способны подавлять активность ферментов насекомых и микроорганизмов ( Birk 1268; Вуая, , 1973).. -Однако,, до сих. пор исследования ограничивались протеазами микроорганизмов, не патогенных или слабо патогенных для растений. •

В задачу исследований^.результаты которых приведены ниже, входило изучение возможности действия ингибиторов протеаз из высших растений на ферменты фитопатогенных микроорганизмов.!

■ч

Действие ингибиторов трипсина и химотрипсина на -протеолити-ческпе «Ьерменты. рост и "развитие флтопатогеннтпс шткрооргапизмов. .' В работе били использованы чистые культуры грибов Fusarium ealani , Fusarium culmorura , Fusariua .avenaceum и Botrytis cinerea «.Все указанные микроорганизмы при выраовании-на ялдкой питательной среде продуцировали;активные зкзопротеазы, способные гпдролизовать казеин при нейтральных или слабощелочных значениях pH С Бенкеп и соавт.,. 1976).,В числе ферментов, п^одухщруеьмх грибом F.solaai ,,присутствовала трзпеиноподобпоя протеаза,гтщ-ролизухадая: Bz-Arg-pKA . Как следует из данных,, приведенных .в таблице 6;.экстракты.из семян фасоли.различных видов содержат вещества,., способные угнетать активность протеолитических ферментов грибов F.solani и F.culiaorun . При этом наблкщается известный параллелизм между тормозящим действием экстрактов из семян.различных вздов фасоли и содержанием в них ингибиторов трипсина.

Дальнейшие исследования показали; Что очищенный ингибитор трипсина а хлмотрзпеана из фасоли обыкновенной также способен подавлять активность экзоцротеаз гриба P.eolanl ..При этом особенно сильное действие ингибитор оказывает.на активность трппсиноподоб-ноЯ протеаза. С:помощью метода аффинной хроматографии было пока--зано, "что протеаза образует -с'ингибитором комплекс,.который ус- ■ . тойчив при нейтральных. значениях рН'и диссоциирует при pH 2- (Ко-eolov.et al. 1976)..Подавление активности экэопротеаз в присут-

сгвяи ингибиторов - должно приводить к нарушению нормального питания гриба и, в конечном итоге, оказывать неблагоприяное воздействие, на его рост и развитие. В связи с этим, проводилось изучение влияния очищенного ингибитора трипсина л химотрипсина из семян фасоли на рост мицелия храбов Р.во1аю1, р.си1шогшв л ^ВсЛгу^а с!пегва на твердой питательной среде. Как показали опыты, внесение ингибитора в■питательную среду сильно замедлнет рост мицелия. При этом действие ингибитора'отчетливо проявляется при кон- ' ■ центрацкя 50 шсг/шг С Бенкен я соавт., 1976). В связи с этим интересно отметить» что фитоалексины, являющиеся важнейшими комао— 1, вентами защитной система растений, оказывают угнетающее действие на рост фятопатогенных грибов в сравнимой концентрации ( Метлид-кий, 1976).

' Таблица 6

Влияние экстрактов из семян фасоли на активность протеаз грибов Р. 801ап1 и р. сиХшогги»

Вад фасоли Содержание ингибиторов трипсина (мкг/мл) > Ингибнроваяие, г/

7. во1ал1 Р«си1тогит

вг-агг-рКА казеин казеин

Р. аси41Го11ия 37,0 86,7 38,7 41,4

>ги1£&г1в __ 67,5 96,7 48,4 50,4

Р. 1ишИ;иа 158,5 93,3 58,1 43,3

Поскольку фузариозы поражают растения различных видов, бшто изучено влияние на активность протеаз гриба р.ео1ав1 ингибиторов трипсина и хкмотрппсина, ввделеннкх из различных растений. Все "исследованные ингибиторы подавляли активность экзопротеаз гриба. При'этом казеинолитическая активность угнеталась лдпъ частачно,что_ указывает на присутствие, народу с чувствительными, ферментов, устойчивых к действию ингибиторов.' Что касается трипсиноподобной протеазв, то ее активность подавлялась в наибольшей степени ингибитором из картофеля и в наименьшей - ингибитором Кунитца из сои

\

Ряс. 8. Влияние ингибиторов трипсина и хдмотрипсина на активность трипсиноподобной протеазы F. solanl. I - ингибитор Кунитца из сои; 2 -ингибитор из лим-ской фасоли; 3 - ингибитор Баумана-Еирк.из сои;: 4 - ингибитор из картофеля. * '

Специфический ингибитор протеаз гриба Colietotrichurn Xlndcmr^-** * thianua . Гриб с.lindenuthlавим является возбудителей антрак-ноза у бобовых. В отличие от грибов рода Fuearium, он не поражает растения других систематических групп. При-выращивании на жидкой питательной среде гриб продуцярует активные протеазы, гидро-лизуткяе, казеин с оптимумом, лежадям в щелочной зоне pH (S-II). Активность ферментов полностью подавляется при обработке dpp и ;pus? . Таким образом, _ протекназы гриба относятся к ферментам се-ринового типа.. . * i

Ингибиторы трипсина и химотрипсина, выделенные из семян сои.и; фасоли, не оказывают угнетающего действия на ферменты гриба c,lindeauthl&num . В то же время, неочищенные водные экстракты, кз семян фасоли оказывала сильное тормозящее действие.. Это наводило на мнель о наличии в семенах специфических веществ, дейст—

'1 I

* - 29 -

вупцих как ингибиторы грибной протеазы л отличных от ингибиторов трипсина и хидатраяскяа. Такое предположение получило подтверждение в опытах,, в которых экстракты из сешш фасоли подвергалась хроматографии на колонках с иммобилизованным трипсином или шо-трипсином. Как ввдно из результатов, приведенное в таблице 7 и на рисунке Э, вещества, обладавдяе активностью ингибиторов грибной протеазы, не задерживаются на колонке.с иммобилизованным трипсином при рН7,6 и, таким образом, могут быть отделены от ингибиторов -рипсина л химотрипсина.

Таблица 7.

Иягабировалие протеаз экстрактами из семян фасоли идраящими, полученными после аффинной хроматографии

Протеолитическая активность

Образец С Агао ^

Трипсин ТрНПСИН Грибная протеаза

I. Свободшй фермент 0,58 1,05 0,44

2. Фермент экстракт 0,05г 0,23 0,07

3. Фермент + алтат рН 7,6 0,56 1,02' . 0,11

4. Фермент + алтт рН 2,0 0,0 0,02 0,44

В даяьнейпеы был разработан способ выделения высокоочвдешгаго препарата ингибитора вротеаз гриба* с. 11н<1 еяи^Ывиига , который вклхчал гель-фильтрацию, изоэлектрическое фокусирование и аЦинкую хроматографии на колонке с иммобилизованным трипсином. На основании своих свойств ингибитор^может быть охарактеризован как белок, по молекулярному весу, положению изозлектрияеекой точки и аминокислотному составу близкий-к ингибиторам трипсина и хкмо-трипсяна.. Этопозволяет высказать предположение, что ингибитор грибной протеаза и ингибиторы трипсина к: химотрипсина ведут свое происхождение от одного общего предшественника.

'il'.

Рис. 9, Отделение ингибиторов' протеазы гриба с.хшавюи- .

tblamun от ингибиторов трипсина на колонке с иммобилизованным трипсином. I и 2 - ингкбиторная активность соответственно по отношении к трипсину и грибной протеаэе. 3 - ^ао* Стрелкой обозначено начало зладди кислым раствором ( рН 7,6—*piï 2,0).

В свете полученных данных присутствие во многих растениях множественных форм ингибиторов трипсина и химотрипсипа может получить рациональное объяснение. Представляется вероятный,1 что как- * дая форма спевдфачна по отношение к определенной протеаэе или груше протеаз насекомых к микроорганизмов. Те из них, которые сохраняет способность подавлять активность протеаз животных,вос-. принимаются как кзознгибиторы трипсина или хжмотршсина. В тех же случаях, когда соответствующий фермент отличается по строению активного центра от животных протеиназ, ингибиторы воспринимают--ся как "специфические". В действительности, я в том и в другом случае речь, по-видимому, идет о группе родственных белков, свя-'эанных общность» происхождения.

По всей вероятности, протеолитические ферменты, продуцируемые фитопатогешшми .микроорганизмами, способна оказывать разнообразные воздействия на растение, начиная с разруеения белков клаточ— , кой стенки я кончая действием âa заяитный аппарат растений.

. Принимая во внимание все сказанное выше,, можно высказать предположение,..что.белковые ингибиторы.протеолитических ферментов, наряду с другими веществами растительного происхождения (фи-тоалексинами, лектинами,-фенолами и др.),,принимают активное учас тие в защите растений от поражения патогенными микроорганизмами;.

ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВЫХ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕДЗ ДЛЯ ВЫЛЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТОВ

Классические:методы очистки ферментов базируются на различиях : в физико-химических : свойствах ■ выделяемого фермента и сопутствующих веществ.. Неизбежным, следствием такого подхода является многоступенчатость процедуры очистки,, приводящая к низкому выходу . конечного продукта.

Принципиально иной подход мбжет быть основан на использовании; специфических свойств ферментов:- их:способности взаимодействовать с субстратами, кофакторами или ингибиторами.. Именно такие-взаимодействия лежат в основе метода'биоспецифической или аффинной .хроматографии.ферментов.

Первые попытки использовать для очистки протеиназ их способность связываться.на нерастворимых : высокомолекулярных субстратах были предпринята в.50-е годы ( Орехович и соавт.,,. 1959;, Grant .,■ Robblne , 1957; .Callop et al> , X957)• Однако широкое развитие: метод аффинной : хроматографии протеаз получил после 1953 г , когда в качестве сорбентов были впервые использованы слптетические конкурентные.ингибиторы ферментов, присоединенные к полимерной • матрице ( Cuatreeaeae «t al., 1963).. Одновременно были,начаты работы по применению в качестве сорбентов для аффинной хроматографии: иммобилизованных белковых.ингибиторов протеиназ ( Мосолов,. Лртникова, 1969;,Prit» et al. , 1966).

Белковые ингибиторыв качестве лигандов для аффинной хромато-грфии протеолитических ферментов имеют ряд существенных преимуществ.. Главкыми:из них являются исклшительно высокое сродство к: ферментам.и высока^ избирательность действия. Это дает возможность осуществлять.вщедение ферментов», присутствующих в очень малых: количествах;. а также - разделять. ферменты, обладающие весьма близкими свойствами.. Устойчивость большинства белков-ингибиторов

. ■ ? - 32.— : : ■■ : ' ,'.•• - •; •• • • • ! к различного рода денатурируицш факторам', а также относительная легкость получения в препаративных количествах открывают широкие перспективы для их.практического использования как В лабораторных условиях, так и в ферментной промышленности.

Ниже приводятся некоторое примеры, иллюстрирующие возможности ' применения белковнх ингибиторов протеаз для выделения и очистки ферментов. •

. Получение высокоочищенных препаратов трипсина. Несмотря на • большое лисло способов очистки трипсина, описанных в литературе,-* проблема получения высокоочищенных. препаратов фермента не утрати-. ла своей остроты., Большинство продажных препаратов фермента со' держит от 25 до Ь0% неактивных примесей, значительную часть которых составляют продукты самопереваривашя, образующиеся ,в процессе выделения и очистки С Мосолов, 1971). Специфические особеннос-' 'ти метода аффинной хроматографии позволяли надеяться на получение -препаратов, не загрязненных продуктами самопереваривания.

В качестве баоспецдфяческого сорбента был использовал соевый ■ ингибитор Куватца, присоединенный к целлюлозной матрице ( Цосо-лов,.. Лушникова,, 1969; 1970). В таблице 8 приведены результаты; опытов,. характеризующих специфичность реакции трипсина с иммобилизованным ингибитором.

Таблица _8

Взаимодействие, трипсина -о иммобилизованным соевым ингибитором Кунатца

, Состав белковой смеси- Связанный фермент,£

Г. Трипсин Х00,0

г; ИР ' -Трипсин * 25,8

3. Трипспн + ингибитор. Кунитца • 8,0 • (

Трипсин + яичный альбумин 82,8

5. Трипсин + сывороточный альбумин: 100,0.

. ■ < ■ *

Полученные данные согласуется с представлением о том, что во взаимодействии с иммобилизованным.ингибитором.непосредственное ■ участие приникает активный центр фермента. Поскольку, как уже отмечалось, значительную часть примесей, загрязняющих препараты трипсина,, составляют продукты самопереварпваяая, были цоставле-вы специальные опыты.с целью показать возможность их.отделения с помощью аффинной хроматографии. Искусственно полученные авто-лизаты. трипсина подвергали фракционированию с применением иммобилизованного соевого ингибитора. Из данных, предствлевных в таблице 9, вццно, что материал, полученный из автализатов с до- ^ мощью,связывания на иммобилизованном ингибиторе п. последуетей алшции кислым раствором, имеет, высокую удельную активность и не содержит'визкомслекуляряшс примесей,.о чем можно судить на основании низкого содержания аминного азота.

Таблица 9-

Освобождение трипсина от продуктов автолиза о помощью иммобилизованного соевого ингибитора Кунитоа

Материал Ферментативная активность,% • Содержание . Ы^-грудл

Исходный трипсин 100,0 12,0

Двтолиэат 30 кия 58,8 20,0

60 кан 41,2 '23,2

. Автолазат 30 мин после 122,7 12,6

обработки ингибитором

• 60 мин '113,0 12,5

Иммобилизованный соевый ингибитор был использован в дальнейшем для очистки различных препаратов трипсина. Удельная активность повышалась в результате очистки:в среднем на 40-50$ к достигала значения около 80 мкэквивалентов гцдролизоазнного Вг-Агк-ОЕЛ -в минуту на I мг балка, что, цо-вздзшому, соответствует активности чистого бцчьйго трипсина .

.i -Vi т ; > . i • f j ft • • ■

: : i -Ц—i ■ f

: . 4 . i' •! • > t

Очистка панкреатического калликреина. Наиболее распространенные, способа иммобилизации; белковых веществ основаны на реакции амянкык групп с активными группами носителя С Мосолов, Лупнико-' ва, 1973). Б тех случаях, когда ^присутствие свободных акинных ' групп важно для сохранения.активности белка, подобная процедура может сопровождаться заметным снижением активности.в процессе иммобилизации. С этим обстоятельством приходится считаться при иммобилизации белковых ингибиторов протеаэ, содержащих $ реактивном' центре остатки лизина. К этому распространенному типу принадлежит, в частности, основной панкреатический ингибитор - единств венный-природный ингибитор, способный подавлять активность тканевых калликреинов. В связи с этим был разработан способ заняты ' реактивного центра ингибитора, основанный на образовании комплекса с трипсином, у которого £-аминогруппы были, предварительно ацетштрованы уксусным ангидридом ( ¡Досолов и соавт., 1976). Присоединение комплекса к сефарозе, активированной снвг . осуществляется исключительно через амянные группы ингибитора, не входящие в состав реактивного центра. Последующая диссоциация иммобилизованного комплекса в кислой среде приводит к получению активного ингибитора, присоединенного к сефарозе, и свободного аце-тилтрипсина. *

Процедура очистки калликреина включала предварительное отде- . леняе примеси трипсина путем связывания с иммобилизованным ово-мукоидом. Освобоздениый от трипсина материал наносили на колонку, содержащую иммобилизованный панкреатический ингибитор, и после тщательного промывания; буфером при pH ö,0 для удаления балластных белков, связанный калликреин элшровали буфером с pH 4,0.

Результаты опытов представлены в таблице 10.-Как показала результаты опытов по изоэлектрическому фокусированию калликреина, очищенного с помощью аффинной хроматографии, препарат практичес— : ка.содержит один белковый компонент с изоэлектрической точкой 4,12. Согласно данным,.имеющимся в литературе, изо электрические точки различных форм панкреатического калликреина лежат-в1 интервале pH 4,05-4^32 (?iedler et al.» 1970).

Таблица 10

Очистка калликрекна на колонке с иммобилизованным панкреатическим ингибитором

Опыта Удельная активность (мкэкв. в мин/мг белка) Выход,% (по активности)

до очистки после очистки

- I 0,4 27,9 -

2 1 . * . 33,8 73,5

3 38,4 89,0

4 0,3 41,6 __ 1 •

'Внкалепие .трипсютопо^обпоД протеази 51г.кпазив .

Способность двуглавого ингибитора протеиназ из фасоли связывать химотрипсин понижается в результате иммобилизации. При этом белок утрачивает способность даовременно присоединять молекулы трипсина и химотрипсина. Более того, как показали специальные опыты, трипсин может вытеснять хямотрипсап из соединения с иммобилизованным ингибитором (1ь>эо1о* »1, , 1978). Эта особенность ингибитора била использована при выделении тршсицоподоб-ноЯ протеаэа микроорганизма 51г.£г1вецз . Препарат "Пролаза", . который использовался в качестве источника протеазы, растворяли в буфере при рН 8,0 и фильтровала через колонку с иммобилизованным ингибитором из фасоли. Связанную протеазу элшровала кислым раствором при рН. 2,0. Удельная активность фермента увеличивалась за одну стадии в 10-15 раз. Полученный катериал 6ем гомогенен по данным электрофореза в ползакриламидном геле, а также по содержанию К^-копцевоЗ аминокислоты. Свойства очищенной протеазы ■ (значение р1г^2о>ж »природа концевой аминокислот^, действие ингибиторов) не отличались от свойств фермента, выделенного с помощью обычной процедуры (01&Геоа е4 а1» , 1975),

Несколько более.низкая удельная активность фермента, очищенного с помощью аффинной хроматография, компенсируется весьма высоким выходом,- который достигает 70-90^ (по активности), а также

простотой предложенной процедуры. Наряду с рассмотренными ферментами, аффашгая хроматография.; с использованием имиобилизованннг белковых ингибиторов была применена для очистки протеиназ.из микроорганизмов Ас^Гга<11ае, Авр.огугав иАсЛ .врКего1йев С Мосолов, Лутаншсова, 1970;- Кестере а соавт., 1373; крейер а соавт.1978). /

Применение шлмобклизованных ингибиторов для остановки реакций щкзтеолиза. Возможность прекращения реакции протеолиза без пршленения жестких воздействий может иметь ватное практическое значение. Использование для этой цели аффинных сорбентов, способных избирательно связывать фермент,-имеет ряд важных преимуществ. Среда них главными.являются: а) отсутствие побочного действия на другие ферменты; б) возможность получения продуктов протеолиза,. свободных от следов. пратеиназы;в) возможность регенерации фермента.. Если вопрос повторного использования фермента в лабораторных условиях обычно не является актуальным,. то в условиях промыпленноств проблема реутилизации ферментов представляется весьма ватной.

Схема модельного опыта, иллистргруицего возможность использования иммобилизованных белковых-ингибиторов для остановки реакции протеолиза, приведена на рисунке 10. Триптический гидролизах делился на две равные части. - К одной из них добавлялась суспензия иммобилизованного" ингибитора, вторую - оставляли без изменений. При последующей инкубации гидролизата, обработанного иммобилизованным ингибитором, не происходит дальнейшего увеличения содержания аминогрупп, что' указывает на полноту, связываания, трипсина. . •

. Не менее существенное значение возможность избирательного 'удаления протеаз может иметь при выделении ферментов и других веществ белковой.природа из различных природных источников.. Ак--тявность-протеолнтическизс.ферментов в:процессе выделения или.хра нения может;приводить к образовании модифицированных форм ферментов или к их инактивации ((Кеика. ,Рг1св■ , 1974;Рг1пе1в . ,. 1075). В лабораторной. практике для инактивации сопутствующих протеаз довольно' часто- используются;химические ингибиторы такие как. ерр .или иезр" .-Однако юс применение'ограничено ввщцг

ЙЛЬБУМИН + ТРИПСИН

2 чясд,25' (ад.7)

гч/Цй5* *

(570)

РАСТВОР 2чдм,25Г

ММИЛИЗПШДОЬЙ* ИЙГШИТОР

иЕН]РИШУГИР03йШЕ .

осййш

I

рН2

(^7.2)

ТРИПСИН ИНГИБИТОР

(РДСТЕОР) (ОСДШН)

Рис. 10. Схема опыта по остановке процесса протеолиза с применением иммобилизованного соевого ингибито-. ра Кунитца. Цифры в скобках - содержание свободных аминных групп / моль белка

высокой токсичности и возможного побочного действия. Использование растворенных белковых ингибиторов сопряжено с необходимость» их последующего отделения. В этом отношение применение иммобилизованных ингибиторов имеет несомненные преимущества. Дополнительным их достоинством является возможность получения присутствующей протеазы в очищенном виде. ■ .

Ао-Туг-ОЕг Ва-Агб-ОЕг Вг-Агц-рНА ГРР , П13Р

' Принятые сокращения: Ы-Ацетил-ь -тирозин этиловый эфир МеС-Вензошг-ь -аргинин этиловый эфир Ы^-Бензоил- Ыг-арглкин п-нитроанилвд Диизоаропзлфторфосфат ФекЕлметзлсульфонилфторид

в ы вод ы

1. Выделены новые, ранее не описанные белки-ингибиторы се-риповых протеиназ из семян.фасоли С Fhaeeoius vulgaris ) и клубней картофеля. Исследованы шс химический состав, физико-химические свойства и специфичность действия на ферменты. ■

2. Белки-ингибиторы из фасоли представлены несколькими изо-формаии,.высидка одинаковый молекулярный вес ( 10 ООО), но различавдюася по положению изоточек и строению NHg- и СООН- —^ концевых последовательностей. Белки принадлежат к типу двуглавых ингибиторов протеиназ и содержат в центре, ответственном за связывание трипсина,, остатки лизина.Высказано предположение, что ингибитора из.фасоли представляют собой переходную форму от примитивных двуглавых ингибиторов, содержащих два одинаковых реактивных центра, к пстпннш двуглавым ингибиторам, содержащим центры

с четко разграниченной специфичностью.

3. Молекула термостабильного ингибитора из картофеля с pi 7,3 и молекулярным весом 32 ООО состоит.из двух одинаковых субъе-диняц. Каждая субъединица содержит два реактивных центра и представляет собой как бы самостоятельную молекулу двуглавого ингибитора. Исследовано строение и локализация обоих реактивных-центров. В состав трипсипсвязнзаюцего центра входят остатки Ьуадб-_С1п47 и в состав химотрипсинсвязывавдего центра -Leu75-Val76.

4. На основании полученных-экспериментальных данных и анализа литературы сформулировано представление о том, что все ингибиторы протеаз растительного происхождения могут быть разделены на два класса в зависимости от того вклада,. который вносят гидрофобный взаимодействия в стабилизацию их пространственной структуры.

5. Разрыв внутреннего солевого мостика между «¿-аминогруппой* изолейцина-16 и остатком аспарагиновой кислоты-194 в хпмо-трипсине и аналогичного мостика в трипсине.приводит.к пойцой утрате способности связывать белковые ингибиторы. Полученный результат согласуется, с представлением о ведущем вкладе субстратсвязн-■ вашего участка фермента в образование стабильных комплексов с ингибиторами.

6. Производное химотрипсипа, у которого остаток гистиди-на-57 превращен в остаток'метилгиствдина, сохраняет способность к связывании белковых ингибиторов. Эти данные свидетельствуют о том, что наличие высокой каталитической активности не является обязательным условием образования стабильных.комплексов с ингибиторами. Вместе с тем, полученные результаты указывают на вероятное существование различий в тонком механизме взаимодействия отдельных ингибиторов (пли групп ингибиторов) с ферментаьл.

7. Установлено, что ингибиторы протеоллтически^ ферментов, содержащиеся в тканях высших растений, способны подавлять активность ферментов фзтопатогенных микроорганизмов, угнетать процессы их роста и развития. Высказано предположение, что ингибиторы протеаз," народу с некоторыми другими веществами (флтоалексипаыз, феноламз и др.), могут играть важную роль в общем механизме фито-инадунитета.

8. Высокое сродство к ферментам и высокая специфичность белковых ингибиторов открывают шрокие перспективы для их практического использования в иммобилизованном' состоянии в качестве биоспецифических сорбентов для аффинной хроматографии протеаз как в лабораторных'условиях, так и в промышленности.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Баскова И.П., Черкесова Д.У., Мосолов В.В.' 1976. Очистка ^ гирудина методом изоэлектрического фокусирования. - Биохимия, '

4Г, 939-941.

2. Бенкен И.И., Мосолов В.В., Федуркина Н.В. 1976. Влияние ингибитора протеиназ из фасоли на фитодатогенные грибы. — Никол, и фатопатол., 10» 198-201.

3. Валуева Т.А., Ззмачева A.B., Мосолов B.B. 1977. Химотрип-синсйязывавдий центр ингибитора сериновых протеиназ аз картофеля? - Ейоорган.химия, 3, 1273-1279.

4. Валуева Т.А., Знмачева A.B., Мосолов B.B. 1977. Локализа- ' ция трипсинсвязызавдего центра в молекуле ингибитора сериновых протеиназ из картофеля. - Докл. АН СССР. 237. I5I3-:I5I5.'

5. Валуева Т.Д., Мосолов B.B, 1976. ТрапсинсвязывающЗ центр ингибитора сериновых протеиназ из картофеля. - Биоорган.химия,

2, 1339-1394.

6. Иевлева Е.В., Мосолов В.В. 1975. Некоторые свойства иммобилизованных трипсина и Ы. -хтлотрипсина и их применение для очи- * стка ингибиторов протеиназ из картофеля.. - Прикл.биохим.мзкро-биол., П, 427-432.

7. Кестере А.Я., Иевлева Е.В., Мосолов B.B. 1978; Выделение, и очистка протеиназ плесневого гриба Авр.огугав . 2-е Всесовзн. coBeni.no ферментам микроорганизмов. Тезисы докл., стр. 139.

8. Крейер В.Г., Иевлева Е.В., Чуенкова U.E., Мосолов В.В., Егоров Н.С. 1978. Ввделенпе комплекса фибринолитических ферментов > из кулътуралыюй жидкости Actinomycea epheroldea методом аффинной хроматографии, - Тезисы Всесовзн.симп. "Методы получения вы-сокоочшп.ферментов". Вильнис. ■ стр.81.

9. Лусникова Е.В.,. Федуркина Н.В., Соколова Е.В., Кротова Л., Мосолов B.B. 1975. Получение иммобилизованных ферментов. Еаоспецифическая хроматография. — В кн. "Методы соврем.биохидаш". Москва. "Наука", стр; 5-8. 1

10. Малова' E.JL, Шульмина А.И., Мосолов В.В. 1975. Изучение 'теркостабяльных белков картофеля методом изоэлектрического фокусирования. - Прикл.биохим.микррбиол., IT, 576-579. \

11. Макова.Б.Л.* Логинова И.Д., Беикек И.И., Мосолов В.В. 1978. Выделение специфического белка-ингибитора, протеаз флтопа-тогенкого граба C.liodeiciitiiiaeuat . - Всесоюзн. сиш.. "Азотный и белковый обмен растений1'. Тбилиси.. Тезисы докл., стр. 78-79. »

12. Мосолов В.В., 1971. Цротеолитическпе ферменты. Косква. "Наука4.

13. Мосолов В.В. 1974. Мстительные белки - регуляторы активности ферментов. - З-иЯ Всесоюзн. биохим. съезд; Тезасы сияяо-зиалыидокл., стр.138-139.

14. Мосолов В.В. 1975. Аффинная хроматография с ершовых протеина з. - Всесоюзн.совещ, "Кристаллические ферменты; методы получения, их характеристика и использование". Вильнюс. Тезисы докл., стр. 28-31.

15. Мосолов В.В.. 1975. Растительные белки-ингибиторы ферментов.-В кн. "Растительные белки.и их баосгштез". Москва. "Наука", стр. 172-184. ^

16. Мосолов В.В., Валуева Т.Д., Зимачева А.В. 1977. Строение' реактивных центров белка-ингибитора сериновыг протеиназ. - .

4-й Всесоизя.сиш. по химии белков и пептидов. Минск. Тезисы докл., стр. 79.. .

17. Мосолов В.В., Валуева:Т.А., Соколова Е.В., Антонов В.К. . 1975. Взаимодействие о£-химотрипсииа,. метилированного по гисти-дину-57, с природными ингибиторами,.- Докл.АН СССР, 221, 484-486,

18. Мосолов В.В., Васькоиа Л.р,, Кротова 1.И. 1974. Влияние дезаминированая па реакшш химотрипсина с: природными ингибиторами. - Биохимия, 39, 725-731.

19. Цосодов В.В., Васькова Л.П.,. Пульмана А. И.Кадшева Е. Л. 1972. О механизма взаимодействия серкновых протеиназ с картофельным ингибитором. - Докл.АН СССР..204. 1002-1005. -

20. Мосолов В.В., Иевлева Е.В., Катерников- В.А,,., Саменкова Н.Ф. 1976. Очистка панкреатического калликреина методом а^иниой хроматографии.- — Прикл.бйохим.кикробиол., 12, 572-577.

21.. Мосолов В^В., Кротова Л. И.,. Соколова Е. В. 1974. Ацдл-^рипсины. Очистка методом аффинной хроматографии и взаимодействие: с белками ингибиторами. - Докл.АН СССР, 215, 470-473.

22.-Мосолов В.В.,, Лушникова Е.В. *1966. Влияние поверхностно-

активных вецеств на ферментативную активность трипсина, ацетил-трипсина и сукцивалтрипсана. - Локл.АН СССР, 167, 454-456.-

23. Мосолов В.В., Лушникова Е.В, 1969: Адсорбент для очистка фермептпых препаратов. - Авт. сведет. № 252266.

24. Мосолов В.В., Лушникова Е.В. 1970. Принцип очистки пеп-f тидпщролаз, основанный па применении нерастворимых ингибиторов

белковой природы. - Биохимия, :35, 440-447.

25. Носолов В.В., Лушткова Е.В. 1970. Остановка протеолзза при помощи нерастворимых ингибиторов. - Докл.АН СССР, 191. 951-952.

' 26. Мосолов В.В., Лушникова Е.В. 1973., Нерастворимые ферменты, их получение, свойства и применение. - Успехи биологич. химии,.14» 14&-171.

27. Мосолов В.В., Малова Е.Л., Валуева Т.А., Щульмина А.И. 1975. Свойства ингибитора сериновых протеиназ из картофеля. -Биоорган.химия, X, 1449-1457. -

28. Мосолов В.В., Соколова Е.В., Валуева Т.А. 1976, Участие-групп активного центра химотрипсина в реакции с природными ингибиторами. - 3-Й Всесоюзн.симп. "Структура и функции активных центров ферментов"; Цущпно-на-Оке. Тезисы докл., стр.20.

29. Мосолов В.В., Федуркина Н.В. 1374. Выделение ингибитора трипсина из фасоли с помощью специфического связывания на трип-син-агарозе. - Биохимия, 39, 624-629..

30. Мосолов В.В., Федуркина Н.В.. 1978. Стехиометрия взаимо-, действия белка-ипгибитора протеаз из фасоли с трипсином и химо-трапсяном. - Докл. АН СССР. 241, 1214-1216.

31. Мосолов В.В., Федурклна Н.В., Валуева Т. А. 1977. Выделение и свойства изоингибиторов трипсина из фасоли. - Биохимия, 42, 1201-12X1.

32. Мосолов В.В., Федуркина Н.В., Валуева X.А., Соколова Е.В.-1976..Спирторастворимый ингибитор трипсина из фасоли. -Прикл.биохим.микробиол., К., 37-44.

33. Мосолов В.В., Федуркина Н.В., Иевлева Б.В. 1974. Очистка и свойства ингибиторов протеиназ из яичного белка некоторых видов птиц. - Прикл.биохт*.микробиод., 10, 415-419. • '

34. Мосолов В.В., Шульмина А.И., Дровова Л.А., ЧернякВ.Я. 1978. Взаимодействие белка-ицгибнтора из картофеля (белок р! 7,3) с протепназама. - Биохимия, 43, 1079-1085.

35. Мосолов В.В., Кульмана А.И., Малова E.JL 1974. Ввделе-ние из клубней картофеля ингибитора трипсина и химотрипсина. -Биохимия, 39, 956-363.

36. Шулынна А.И., Дронова JT.A., Назайкинский В.Е., Шубяк

■ В.В., досолов В.В. 1979. Спектры кругового дихроизма, белков-ингибиторов протеиназ. - Биохимия, 44, 514-520.

37. Шульмина А.И., Черняк 'В. Я., Кзгрегова Н.Н., Малова E.JT,, Дронова Л.А., Мосолов В.В. 1976. Изучение физико-химических свойств белка- ингибитора сериновых протеиназ из картофеля. -Биохимия, 4t, 1229-1234.

38. Uoeolov V.V., Fedui-kina H.V., Valuera Т.Д. 1578. Interaction of trypsin-Ilke protease from Streptomyoee grieeus with an immobilized inhibitor from kidney bean. - Blochim.Bio-phys.Acta, 522. 187-194.

39. Mosolov V.T., Loginova U.D., Mai ova E.L., BecJcen I.I. 1579. A specific inhibitor of Colletotrichum Ilndemuthianum protease fro» kidney bean ( Phaseolus vulgaris ) seeda. -

Planta,1 ,ZfcS-Zfr9.

40. Mosolov T.V., Xoglnova U.S., Fedurklna li.V., Benken I.I. 1976. The biological significance of proteinase inhibitога 1» plants. - Plant Sei.letters, X» 77-80.

41. Hosolov V.V., Ualova B.L., Sfcmlmina A.X., Valusva T.A. 1975. Isolation and properties of serine proteases Inhibitor from potatoes. - ¿ FEBS Meeting. Paris. Abstracts, Я753.

T- 0 T_X2(/2r I2Z2_ Ei___________Эак^^в_______Тир, goo

Типография ХОЗО Госплана СССР