Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование комплекса белковых ингибиторов протеолитических ферментов тканей и органов тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тарасенко, Наталия Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ, ИХ И 13 ФУНКЦИИ И СТРУКТУРА( обзор литературы )

I. I. Роль белковых ингибиторов протеиназ в 13 организме различных таксономических групп

1.2. Механизм действия белковых ингибиторов 16 сериновых протеиназ

1.3. Структура белковых ингибиторов сериновых 17 протеиназ

1.4. Регуляция активности ингибиторов сериновых 21 протеиназ

1.5. Классификация белковых ингибиторов протеиназ

1.6. Белковые ингибиторы протеиназ насекомых

1.7. Белковые ингибиторы протеиназ тутового 33 шелкопряда

1.8. Физиологические функции белковых ингибиторов 38 насекомых.

1.9. Сравнение белковых ингибиторов протеиназ 41 насекомых с ингибиторами других животных

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

11.1. Материал

Н.2. Получение белковых экстрактов тканей и органов 49 тутового шелкопряда

11.3. Определение эндогенной протеолитической 50 активности

11.4. Определение подклассовой принадлежности 51 протеолитических ферментов

11.5. Определение активности эндогенных ингибиторов 51 протеолитических ферментов спектрофотометрическим методом.

11.6.

11.7.

I »-В

11.9.

11.10.

11.10.1 11.10.2 11.10.

1 11.10. 11.11.

Глава III.

Определение термостабильности белковых 53 ингибиторов протеиназ в гомогенате шелкоотделительной железы.

Определение изоэлектрических точек белков 53 методом изоэлектрофокусирования в слое ультродекса.

Фракционирование белков методом аналитического изоэлектрофокусирования в тонком слое полиакриламидного геля Определение спектра белковых ингибиторов 56 трипсина с использованием фотоматериалов (метод желатиновых реплик Конарева). Методы выделения и очистки ингибиторов 56 трипсина.

Гель-фильтрация.

Концентрирование образцов.

Высокоэффективная жидкостная хроматография 57 (НР1С).

Определение молекулярной массы ингибиторов 57 трипсина из серицинового отдела шелкоотделительной железы методом гель-фильтрации.

Статистическая обработка результатов 58 эксперимента

Исследование эндогенного протеолитического 60 комплекса в тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития

III. 1. Гетерогенность эндогенного протеолитического 60 комплекса в функционально связанных органах и тканях тутового шелкопряда. Динамика активности отдельных фракций пептидогидролаз в тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе личиночного развития.

III. 2. Активность эндогенного комплекса пептидогидролаз в тканях и органах тутового шелкопряда в связи с процессами шелкообразования

Глава IV. Комплекс белковых ингибиторов сериновых 77 протеиназ в тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития.

IV. 1. Активность белковых ингибиторов трипсина и химотрипсина в тканях и органах тутового шелкопряда.

IV. 2. Гетерогенность комплекса белковых ингибиторов 79 трипсина в шелкоотделительной железе тутового шелкопряда.

IV.2.1. Определение изоэлектрических точек белковых 79 ингибиторов трипсина шелкоотделительной железы.

IV.2.2. Определение ингибиторов железы.

IV.2.3. Гетерогенность комплекса белковых ингибиторов 84 трипсина из серицинового отдела шелкоотделительной железы по величине молекулярных масс. термостабильности белковых трипсина шелкоотделительной

Определение специфичности частично 88 очищенного ингибитора трипсина из серицинового отдела шелкоотделительной железы.

1\/.2.5. Разделение фракций ингибиторов трипсина, 89 полученных методом гель-фильтрации, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографией на Т8К-ОЕАЕ-5Р\Л/.

Глава V. Выявление возможной протеиназы-мишени для 93 эндогенных белковых ингибиторов трипсина в серициновом отделе шелкоотделительной железы.

V. 1. Сопоставление динамики активности эндогенного 93 комплекса белковых ингибиторов трипсина с активностью протеиназ с оптимумами рН=8,6 и 9,9 на заключительном этапе личиночного развития тутового шелкопряда.

У.2. Определение подклассовой принадлежности 101 протеиназ с оптимумами рН действия 8,6 и 9,9.

У.З Сравнение оптимумов рН щелочной протеиназы и 104 белковых ингибиторов трипсина из серицинового отдела шелкоотделительной железы.

МЛ. Определение молекулярной массы сериновой 104 протеиназы из серицинового отдела с оптимумом рН 9,9.

Глава VI. Активность белковых ингибиторов трипсина у 108 различных по продуктивности пород тутового шелкопряда

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование комплекса белковых ингибиторов протеолитических ферментов тканей и органов тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития"

Актуальность темы

Наиболее древним и широко распространенным механизмом контроля протеолиза является способность белковых ингибиторов образовывать высокоассоциированные и стойкие при физиологических значениях pH комплексы с протеолитическими ферментами, в которых последние обратимо утрачивают активность.

Основная функция белковых ингибиторов протеиназ состоит в предотвращении нежелательного протеолиза (Heimburger, 1975; Laureil and Jeppsson, 1975; Laskowski and Kato, 1980; Travis and Salvesen, 1983). Однако эти уникальные и древние белки (Hunt and Dayhoff, 1980), регулируя активность эндогенных пептидогидролаз, задействованы в огромном числе физиологических процессов у животных, растений и микроорганизмов, таких как коагуляция крови (Pratt and Church, 1993), воспаление тканей (Baumann et al., 1992), образование каскада комплемента (Mott'onen et al., 1992), рост клеток глии (Monard, 1988), процессинг прогормонов (Brandt and Svendson, 1990) и транспорт гормонов (Johnson and Travis, 1977), дифференциация (Baumann et al., 1992) и миграция (Lobermann et al., 1984) клеток, фолдинг белков (Mourey et al., 1990) , фибринолиз (Stein et al., 1990) , восстановление клеточного матрикса (Carrell and Travis, 1985) и многие другие.

Помимо участия в регуляции внутренних процессов в клетке и организме ингибиторы протеиназ выполняют и защитную функцию, предохраняя от действия патогенных микроорганизмов, эндо- и экзопаразитов, блокируя их протеолитические ферменты (Wei et al., 1994, Eguchi, 1993).

Не удивительно, что в последние годы опубликован ряд фундаментальных работ, посвященных белкам, регулирующим протеолиз у человека, животных и растений, описывается их структура, механизмы образования комплексов с модельными ферментами и с ферментами -мишенями, выдвигаются предположения об их физиологической роли и их практическом использовании как тест-маркеров при диагностике ряда заболеваний и при выведении организмов, устойчивых к различным заболеваниям и вредителям, обсуждается их применение в качестве лекарственных препаратов и лигандов для аффинной хроматографии и т.д. (Мосолов, 1983; Валуева, 1990; Мосолов и Валуева, 1993; Potempa et al., 1994).

У насекомых в основном, изучаются серпины из гемолимфы, ингибиторы сериновых протеиназ, в связи с преобладанием ферментов именно этого подкласса в осуществлении биохимических реакций, характерных для большинства отрядов этих самых многочисленных на Земле животных (Ryan, 1990).

Белковые ингибиторы протеиназ тутового шелкопряда Bombyx mori L. (отряд Lepidoptera) изучены в значительной степени, выявлены и описаны найденные в гемолимфе ингибиторы трипсина, химотрипсина, субтилизина, других микробных протеиназ, нейтрофильной и панкреатической эластаз, катепсина G, а также эндогенной протеиназы из кишечника тутового шелкопряда. Исследования проводились в биохимическом, генетическом и физиологическом аспектах. Несколько работ посвящены роли ингибиторов протеиназ в каскаде профенолоксидазной активационной системы при осуществлении иммунных реакции у этого насекомого. Немногочисленны работы, описывающие ингибиторы протеиназ в каркасе, жировом теле и экскрементах тутового шелкопряда. Уделено внимание поискам места синтеза белковых ингибиторов. В частности, опыты по трансплантации яичников показали, что ингибитор трипсина поступает в яйцеклетку из материнской гемолимфы шелкопряда, а не является продуктом синтеза de novo.

Анализ литературных данных позволяет сделать вывод о том, что белковые ингибиторы протеиназ, в частности трипсина, изучены неполно во всех тканях и органах тутового шелкопряда, за исключением гемолимфы. Между тем, на заключительном этапе личиночного развития тутового шелкопряда происходят глобальные процессы перестройки всего I 8 белкового фонда, в ходе которых в шелкоотделительную железу направляются белки, пептиды и аминокислоты из других тканей, постепенно подвергающихся деструкции. Протеолиз становится ключевым процессом во всем организме тутового шелкопряда, но сами клетки шелкоотделительной железы, синтезирующие белки шелка, и клетки тканей, обеспечивающие сопряженные процессы, не должны I подвергаться лизису. Поэтому изучение комплекса ингибиторов протеиназ в шелкоотделительной железе в сочетании с исследованием общей протеолитической активности в тканях и органах тутового шелкопряда на

I - ' этом этапе онтогенеза представляет несомненный интерес.

Обнаружена корреляция между продуктивностью некоторых пород тутового шелкопряда и активности протеиназ в шелкоотделительной ~ железе (Назаров, 1993), однако в литературе отсутствуют данные об уровне активности белковых ингибиторов у этих пород и их взаимосвязи с I

I продуктивностью. т

На основании вышеизложенного изучение комплекса пептидогидролаз в сочетании с исследованием комплекса белковых ингибиторов протеиназ в различных органах и тканях тутового шелкопряда 4 на заключительном этапе личиночного развития представляет бесспорный и значительный интерес.

Цель и задачи исследования I ~ Целью работы является исследование комплекса белковых ингибиторов сериновых протеиназ в шелкоотделительной железе и функционально связанных с ней тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать эндогенный протеолитическйй комплекс в тканях и органах тутового шелкопряда, а именно - оценить степень его гетерогенности и изучить динамику его активности на заключительном I I этапе личиночного развития, а также выявить взаимосвязь активности комплекса пептидогидролаз с процессом шелкообразования

2. Изучить активность ингибиторов сериновых протеиназ - трипсина и химотрипсина в тканях и органах личинок тутового шелкопряда.

3. Проанализировать динамику активности комплекса белковых ингибиторов трипсина в тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе личиночного развития и сопоставить ее с изменениями активности эндогенных протеолитических ферментов в аналогичных точках развития насекомого.

4. Выявить гетерогенность комплекса белковых ингибиторов протеиназ в шелкоотделительной железе по ряду параметров (значения изоточек, пределы термостабильности, величины молекулярных масс); осуществить частичную очистку ингибиторов трипсина из серицинового отдела шелкоотделительной железы.

5. Исходя из сопоставления динамики изменения активности пептидогидролаз и активности блокирующих их ингибиторов в процессе развития тутового шелкопряда, сравнения оптимумов рН действия тех и других, а также ряда других данных обсудить вероятность присутствия эндогенной протеиназы-мишени, специфической для одного из белковых ингибиторов трипсина.

6. Изучить взаимосвязь между активностью ингибиторов трипсина, присущих шелкоотделительной железе, и активностью протеолитических ферментов из этого органа тутового шелкопряда с некоторыми хозяйственно полезными показателями некоторых его пород.

Научная новизна работы.

В динамическом единстве изучены процессы протеолиза и их регуляция при посредстве белковых ингибиторов сериновых протеиназ в тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития.

Охарактеризован спектр протеолитических ферментов, участвующих во внутриклеточном распаде белков в широком диапазоне рН (от 3,4 до

10,9) в гемолимфе, жировом теле, каркасе, фиброиновом и серициновом отделе шелкоотделительной железы в 5-ом личиночном возрасте и в период завивки кокона. Выявлена тканевая и фазовая специфичность пептидогидролаз. Изучена судьба отдельных пептидогидролаз в исследуемый период онтогенеза тутового шелкопряда.

Исследован комплекс белковых ингибиторов сериновых протеиназ (трипсина и химотрипсина) и проанализирована его тканевая специфичность у тутового шелкопряда на заключительном этапе личиночного развития. Впервые обнаружен комплекс белковых ингибиторов трипсина в фиброиновом и серициновом отделах шелкоотделительной железы тутового шелкопряда, и изучена его гетерогенность по ряду физико-химических параметров (Мг; величина р1 и пределы термостабильности). Определена возможная эндогенная протеиназа-мишень ингибиторов трипсина, функционирующих в шелкоотделительной железе тутового шелкопряда.

Исследована динамика изменений активности комплекса белковых ингибиторов трипсина в гемолимфе, фиброиновом и серициновом отделах шелкоотделительной железы, интегументе и жировом теле на протяжении 5-го личиночного возраста и периода завивки кокона. Сопоставление динамики активности белковых ингибиторов трипсина и активности эндогенных протеиназ с оптимумами рН 8,6 и 9,9 в тканях и органах тутового шелкопряда в процессе его развития позволили конкретизировать представление о предполагаемых функциях белковых ингибиторов трипсина у тутового шелкопряда.

Практическое значение работы.

Получены данные о решающей роли пептидогидролаз в процессах использования белков тканей личинки для построения белков шелка и механизмах переключения отдельных этапов программы азотистого обмена в тканях и органах тутового шелкопряда.

Установлена роль каждой из исследованных тканей и отдельных энзимов протеолитического комплекса в мобилизации белков тканей для биосинтеза белков шелка. Показано, что наибольшую связь с процессами в регуляции процессов метаболизма и осуществлении защитных реакций у различных организмов, описания материалов и методов исследования, результатов эксперимента и их обсуждения, заключения и выводов. Диссертационная работа изложена на 141 странице машинописного текста, содержит 15 таблиц, 18 рисунков. Список цитируемой литературы включает 201 название, из которых Шбна иностранных языках. шелкообразования у тутового шелкопряда проявляет протеолитический фермент шелкоотделительной железы с оптимумом рН=6,2 и энзим жирового тела с оптимумом рН=3,4.

Изучена взаимосвязь между активностью белковых ингибиторов трипсина, активностью щелочной протеиназы хроматина шелкоотделительной железы и уровнем продуктивности шести пород тутового шелкопряда, в результате чего и обнаружена обратная зависимость между учтенными показателями. Высказано предположение, что в пуле ингибиторов трипсина есть белки, регулирующие активность протеиназы хроматина шелкоотделительной железы с оптимумом рН=9,0, что сказывается на процессах регуляции шелкообразования, восходящих, по-видимому, к функционированию генома насекомого.

Результаты, полученные в процессе изучения протеолитического комплекса ферментов и их белковых ингибиторов у одного из представителей класса насекомых важны в сравнительно-биохимическом аспекте для более глубокого понимания сущности протеолиза и механизмов его регуляции у живых организмов.

Апробация работы Основные результаты диссертации доложены на научных сессиях по итогам научно-исследовательской работы Московского Педагогического Государственного Университета в 1996 и 1998 году.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 статей и тезисы сообщений на V Европейском энтомологическом конгрессе в Йорке (1994 год) и XX Международном энтомологическом конгрессе во Флоренции (1996 год).

Структура и объем работы

Работа состоит из введения, обзора литературы, отражающего современные представления о белковых ингибиторах протеиназ и их роли

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Тарасенко, Наталия Владимировна

Выводы

1. В гемолимфе, жировом теле, интегументе, фиброиновом и серициновом отделах шелкоотделительной железы тутового шелкопряда на заключительном этапе личиночного развития выявлен комплекс протеолитических ферментов, действующих при кислых (3,4; 6,2), нейтральных (7,0) и щелочных (7,8; 8,6; 9,9; 10,9) значениях рН.

2. Активность протеолитического комплекса ферментов у тутового шелкопряда характеризуется как тканевой, так и фазовой специфичностью: а) В большинстве тканей и органов тутового шелкопряда преобладают пептидогидролазы, активные при рН 3,4; 6,2 и 8,6. Кроме | этого в некоторых тканях наблюдается относительное повышение активности при рН 7,0; 7,8; 9,9 и 10,9. b) На исследуемом отрезке онтогенеза активность пептидогидролаз в шелкоотделительной железе превышает таковую в других тканях и органах тутового шелкопряда, причем во всех точках, кроме конца 5-го возраста, протеолитическая активность фиброинового | отдела превышает таковую в серициновом отделе. Наименьший уровень протеолитической активности присущ гемолимфе. c) Общей тенденцией динамики протеолитической активности в ! тканях и органах тутового шелкопряда является снижение уровня активности всех групп пептидогидролаз к концу завивки кокона.

3. В организме тутового шелкопряда обнаружены тканеспецифичные белковые ингибиторы трипсина и химотрипсина, причем активность белковых ингибиторов трипсина убывает в ряду: гемолимфа (98,10 %), серициновый отдел шелкоотделительной железы (91,25%), фиброиновый отдел шелкоотделительной железы (87,15%) , 1 жировое тело (55,7%), интегумент (6,50%), а активность белковых ингибиторов химотрипсина выявлена лишь в гемолимфе (86,70%) и | серициновом отделе шелкоотделительной железы (5,1 %). I

I 4. Комплекс белковых ингибиторов трипсина в шелкоотделительной железе охарактеризован по следующим параметрам: \ а) Значения изоэлектрических точек ингибиторов трипсина

I серицинового отдела шелкоотделительной железы, определенные методом желатиновых реплик, составляют - 4,00; 4,20 и 7,60, а методом изоэлекгрофокусирования в слое ультродекса - 3,50; 3,80; 4,50; 4,98 и I 7,75; значения р1 ингибиторов трипсина фиброинового отдела шелкоотделительной железы составляют 4,20 при использовании первого метода и 3,80 и 4,73 при использовании второго. b) Белковые ингибиторы трипсина из шелкоотделительной железы при прогревании при 90°С в течение 10 минут сохраняют активность на уровне 85,6% от изначальной. c) В серициновом отделе шелкоотделительной железы присутствуют ингибиторы трипсина, значения молекулярных масс которых, определенные методом гель-фильтрации на ТБК-геле НУ\/-55 составили 38кДа и менее 3,5кДа. Ингибиторная активность тестировалась также в зоне, соответствующей белкам с молекулярной массой 97кДа, но принадлежала, по-видимому, комплексу ингибитор-протеиназа. с!) Показано, что ингибиторы с молекулярной массой около 38 кДа не обладают дополнительной специфичностью по отношению к химотрипсину, папаину и пепсину. е) Методом ионобменной высокоэффективной жидкостной хроматографии на ТЭК- ОЕАЕ-5-РУУ пик, соответствующий белкам с молекулярной массой 38 кДа, разделен на шесть фракций, лишь одна из которых обладала ингибиторной активностью по отношению к трипсину. Низкомолекулярный пик (Ми менее 3,5кДа) также оказался неоднородным (пять фракций, две из которых обладали ингибиторной активностью).

5. Сопоставление динамики активности белковых ингибиторов трипсина и активности протеиназ с оптимумами рН 8,6 и 9,9 в тканях и органах тутового шелкопряда в процессе его развития показало, что функцией белковых ингибиторов трипсина в жировом теле и каркасе является защита белков от деградации в процессе гистолиза, а в шелкоотделительной железе - регуляция активности эндогенных сериновых протеиназ; наличие белковых ингибиторов трипсина в гемолимфе может быть связано с транспортной функцией этой ткани.

6. Обратная взаимообусловленность динамики активности белковых ингибиторов трипсина и сериновой протеиназы с оптимумом рН 9,9 на заключительном этапе личиночного развития, совпадения оптимумов рН фермента и ингибитора и одинаковой локализации зон активности при элюции с геля в процессе гель-фильтрации позволяет считать данный фермент возможной эндогенной мишенью для одного из оптимумов рН фермента и ингибитора и одинаковой локализации зон активности при элюции с геля в процессе гель-фильтрации позволяет считать данный фермент возможной эндогенной мишенью для одного из представителей комплекса белковых ингибиторов трипсина тутового шелкопряда.

7. Активность белковых ингибиторов трипсина шелкоотделительной железы не коррелирует с величиной шелконосности шести различных по продуктивности пород тутового шелкопряда, но коррелирует с активностью эндогенной сериновой протеиназы с оптимумом рН=9,0 из хроматина шелкоотделительной железы личинок данных пород.

Заключение

Активность белковых ингибиторов протеиназ у насекомых может быть направлена на блокирование протеолитической активности как собственных, так и чужеродных ферментов. Исследователи, работающие с энтомологическими объектами, часто обращаются к ингибиторам именно второй группы (ЕдисЫ, 1993). Мы поставили перед собой другую задачу -изучить роль белковых ингибиторов пептидогидролаз во внутренних биологических процессах, и поэтому уделили основное внимание эндогенным протеолитическим ферментам тканей и органов тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития. Этот период развития тутового шелкопряда богат морфо-физиологическими событиями, обусловленными действием различных биологически активных молекул, среди которых ведущая роль, по мнению многих авторов, принадлежит ферментам протеолиза. Проведенное нами исследование показало, что протеолитический комплекс в тканях и органах тутового шелкопряда гетерогенен по оптимумам рН. Максимумы протеолитической активности приходятся на значения рН = 3,4; 6,2 и 8,6, кроме этого в некоторых тканях наблюдается относительное повышение активности при рН 7,0; 7,8; 9,9 и 10,9. Многокомпонентность протеолитического комплекса ферментов у тутового шелкопряда может обеспечивать специфичность деструкции разнообразных белковых субстратов в его тканях и органах.

Тканевая специфичность пептидогидролаз у тутового шелкопряда проявляется в том, что в гемолимфе максимальна активность тех протеолитических ферментов, оптимум действия которых приходится на щелочную область рН ( 7,8 и 10,9), в фиброиновом и серициновом отделах шелкоотделительной железы он как приближается к нейтральным значениям (рН = 6,2), так и сохраняется в умеренно щелочной зоне (рН = 7,8 и 8,6) , а в жировом теле и каркасе тела находится лишь в кислой области (рН =3,4). Характерно, что наиболее высокий уровень протеолитической активности наблюдается в шелкоотделительной железе - органе, характеризующемся исключительной интенсивностью белкового синтеза (Лаптева, 1981). Разные отделы шелкоотделительной железы отличаются по величине протеолитической активности. На всем протяжении исследованного этапа онтогенеза наблюдается превышение уровня протеолитической активности в фиброиновом отделе по сравнению с серициновым, что согласуется с преобладанием роли этого отдела в синтезе основного компонента шелкового волокна - фиброина шелка. Невелика протеолитическая активность в каркасе тела на всем изученном отрезке онтогенеза. Если рассматривать суммарную протеолитическую активность в этой части тела насекомогц то очевидно, что ее уровень снижается к первому дню завивки кокона и вновь возрастает практически вдвое к третьему дню завивки, хотя и не превышает таковую в каждом из двух отделов шелкоотделительной железы. Это может быть связано с процессами гистолиза, активно проходящими в этом образовании. При этом процессы распада структурных белков в значительной мере поставляют материалы для синтеза белков шелка. Активность протеиназ в жировом теле высока в избранных нами точках личиночного возраста и снижается до нулевого уровня в первый день завивки кокона, в то время как количество белковых компонентов в этой ткани уменьшается от середины 5-го личиночного возраста к концу завивки кокона, что по данным Мининой (1973) коррелирует с физиологической активностью жирового тела. Наименьшую протеолитическую активность в нашем эксперименте мы тестировали в гемолимфе. Общей тенденцией динамики активности протеиназ для всех тканей, кроме гемолимфы, является снижение протеолитической активности всех групп ферментов к 3-ему дню завивки кокона, что может быть связано с исчерпанием субстратов для пептидогидролаз в результате активного гистолиза.

Вышеизложенные материалы дают основание сформулировать вывод о существовании в тканях и органах тутового шелкопряда комплекса протеолитических ферментов с разными оптимумами рН, активность которых под действием ряда факторов варьирует, при этом в тканях на разных этапах личиночного развития насекомого лидируют разные группы этих энзимов.

Динамическое равновесие между процессами образования и распада белков осуществляется в клетке при наличии в ней механизмов контроля активности ферментов гидролиза. Высокий уровень ингибирования протеолиза в шелкоотделительной железе указывает на то, что одним из механизмов, регулирующих активность протеолитических ферментов в ней, является наиболее древний из них - с помощью белковых ингибиторов пептидогидролаз. Вследствие широкой представленности и функциональной значимости сериновых протеиназ в метаболизме насекомых мы выбрали в качестве предмета наших дальнейших исследований белковые ингибиторы трипсина и химотрипсина. Активность белковых ингибиторов химотрипсина мы тестировали лишь в гемолимфе, ткани, детально исследованной в этом отношении, и в очень незначительной степени активность ингибиторов химотрипсина проявлялась в шелкоотделительной железе. Целью нашего исследования на следующем этапе стал комплекс белковых ингибиторов трипсина в тканях и органах тутового шелкопряда с преимущественным изучением их в шелкоотделительной железе. В процессе исследования нами также была показана тканевая специфичность исследуемых белков. Оказалось, что наибольший уровень активности белковых ингибиторов трипсина присущ гемолимфе, а также серициновому и фиброиновому отделам шелкоотделительной железы.

Изучение динамики активности ингибиторов трипсина на заключительном этапе личиночного развития тутового шелкопряда показало, что для ингибиторов из всех тканей, кроме гемолимфы, также как и для пептидогидролаз из этих тканей, характерно снижение активности до уровня, близкого к нулю. Деградация личиночных тканей и их компонентов видится нам основной причиной этого события.

Метод изоэлектрофокусирования в слое ультродекса показал наличие в серициновом отделе шелкоотделительной железы I юли11ио- не менее пяти зон ингибиторной активности, а в фиброиновом - двух. Метод желатиновых реплик позволил тестировать активность лишь мажорных пиков : трэд зоны в первом отделе и одной во втором. В серициновом отделе шелкоотделительной железы показана гетерогенность ингибиторов трипсина по молекулярной массе. Среди них преобладают ингибиторы со средней Молекулярной массой 38 кДа, что согласуется с данными других исследователей. Ингибиторы этой группы не проявляют ингибиторной активности к химотрипсину, папаину и пепсину, а высокоспецифичны по отношению к трипсину. Метод ионобменной высокоэффективной жидкостной хроматографии позволил разделить пик на шесть фракций, лишь одна из которых (IV а) обладала ингибиторной активностью. К сожалению, форма профиля элюции свидетельствует о гетерогенности этой фракции. Второй по значимости группой являются низкомолекулярные ингибиторы трипсина, с молекулярной массой ниже 3,5 кДа, которая методом ионобменной высокоэффективной жидкостной хроматографии была разделена на пять белковых пиков, два из которых ^а и Vb) обладали ингибиторной активностью. Степень очистки белковых ингибиторов трипсина пика Ма составила 48,7 раза, Va - 32, 0 раза и Vb -80,0 раз. Кроме этого мы обнаружили незначительную ингибиторную активность в зоне высокомолекулярных белков с молекулярной массой | около 97 кДа. Многие авторы указывают на то, что для насекомых нехарактерно наличие высокомолекулярных ингибиторов протеиназ, и величина молекулярной массы свыше 50 кДа у представителей этого класса свидетельствует о наличии у них комплекса протеиназа-ингибитор (Капоэ!, 1987). Поскольку в дальнейших исследованиях нам удалось тестировать протеолитическую активность при рН=9,9 в районе 100 кДа, то мы предположили, что среди растворимых белков серицинового отдела шелкоотделительной железы имеется некая эндогенная трипсиноподобная протеиназа-мишень, регуляцию активности которой осуществляет полученный ингибитор трипсина. Существенно, что . . протеолитическую активность по отношению к синтетическому субстрату

БАПА нам удалось тестировать лишь после 16-часовой инкубации, в процессе которой может происходить деградация вышеозначенного ! комплекса. Выбор оптимума рН для определения протеолитической активности энзима-мишени был не случаен, этому предшествовала работа по сопоставлению динамик изменения активностей эндогенных I протеиназ и ингибиторов трипсина в тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе личиночного развития, в процессе ! которой удалось выявить взаимную обусловленность динамики активности ингибиторов трипсина и протеиназы с оптимумом рН=9,9. ! Далее была подтверждена принадлежность энзима к подклассу сериновых протеиназ, и выявлено совпадение оптимумов рН действия ингибиторов и данного фермента в узком диапазоне рН, на основании чего именно эту I протеиназу можно предположительно считать мишенью хотя бы для одного из белковых ингибиторов трипсина шелкоотделительной железы.

Близкие значения объемов элюции с геля ингибитора трипсина и | протеиназы может свидетельствовать о том, что элюция данных белков осуществляется в виде комплекса, и может служить еще одним ! доказательством этой возможности. К сожалению, в рамках нашего эксперимента невозможно поставить прямой эксперимент по уточнению этого факта. Подчеркнем, что и в литературе крайне редки случаи прямого доказательства связи эндогенной протеиназы и белкового ингибитора.

Белковые ингибиторы серицинового отдела шелкоотделительной железы термостабильны, как и большинство ингибиторов протеиназ, и сохраняют 85,6 % от изначальной активности при прогревании до 90° в течение 10 минут.

Исследование комплекса ферментов в тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития позволило оценить вклад пептидогидролаз отдельных тканей в процесс шелкообразования. Наибольшую связь с процессами шелкообразования у тутового шелкопряда проявляет протеолитический фермент шелкоотделительной железы с оптимумом рН = 6,2 и энзим жирового тела с оптимумом рН = 3,4. Нам не удалось зафиксировать корреляционной зависимости между активностью белковых ингибиторов трипсина и шелконосностью у шести различных по продуктивности пород тутового шелкопряда, что может объясняться тем, что ингибиторы описываемого нами комплекса имеют различную функциональную направленность, но при рассмотрении зависимости активности ингибиторов и сериновой протеиназы хроматина шелкоотделительной железы с оптимумом рН9,0, описанной Назаровым (1993), мы обнаружили обратную корреляцию этих величин, что может свидетельствовать в пользу того, что контроль активности протеиназы хроматина, участвующей в регуляции экспрессии генома, может осуществляться с помощью белковых ингибиторов протеиназ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тарасенко, Наталия Владимировна, Москва

1. Алцыбеева Т.И., Филиппович Ю.Б. Метаболизм 14С-растворимых белков тканей тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития. II Биохимия. 1980. Т. 45. № 11. сс.2044-2052

2. Амбарцумова С.И. Азотистый обмен у контрастных по продуктивности пород тутового шелкопряда // Дисс.канд.биол.наук. 1968. Ашхабад

3. Богаутдинов Н.Г., Бутенко Г.В., Лаврентьев С.Д., Лавров Н.В., Суханов A.A., Хафизов Н.Р., Хаханов А.И., Янов В.Я. Учебная книга шелковода II М. Колос. 1981. 350 С.

4. Бродский В.Л., Нечаева Н.В. Ритм синтеза белка // М. Наука. 1988. 239 С.

5. Валуева Т.А. Структура и свойства белковых ингибиторов сериновых протеиназ и биоспецифические сорбенты на их основе II Автореф. дисс. докт. биол. наук. М. 1990. 54 С.

6. Валуева Т.А., Ревина Т.А., Мосолов В.В. Белки-ингибиторы протеиназ из клубней картофеля, относящиеся к семейству соевого ингибитора Кунитца// Биохимия. 1997. Т. 62. №12. сс.1600 -1608

7. Егорова Т.А. Ферментные системы тканей тутового шелкопряда Bombyx morí L. (в теоретическом и прикладном аспектах). // Дисс. докт. биол. наук. M. 1983.422С.

8. Жукова Н.И. Закономерности биосинтеза главных аминокислот шелка в шелкоотделительной железе и связь их с шелкообразованием и продуктивностью //Автореф.дисс.канд.биол.наук. М.1974.

9. Жужиков Д. П. Ингибитор сериновых протеиназ в кишечнике пепельно-серого таракана Nauphoeta cinerea // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1997. Т.ЗЗ. №6. сс.592-598.

10. Ю.Иванов В.Г. Белковый комплекс и протеолитические ферменты желточного содержимого грены тутового шелкопряда. // Дисс.канд.биол.наук. М. 1985. 179 С.

11. И.Клунова С.М. Азотистый обмен в шелкоотделительной железе тутового шелкопряда. //Дисс. канд. биол. наук. М. 1969.

12. Клунова С.M., Филиппович Ю.Б. Исследование растворимых белков серицинового и фиброинового отделов шелкоотделительнойжелезы тутового шелкопряда в полиакриламидном геле // Биохимия. 1969.1. Т. 34. № 5. с.937-942.

13. Ковалевская Н.И., Филиппович Ю.Б. Половой диморфизм всодержании растворимых белков в тканях и органах тутового шелкопрядаj Bombyx morí L. , изученный методом электрофореза в полиакриламидномj геле.// Ж. общ. биол. 1970. Т.31. №5. с.650-659.

14. Конарев A.B. Ингибиторы гидролаз и проблемы эволюции j пшеницы и других злаков. // Всесоюзн. совещ. Систематика и эволюциязлаков. Тез. докл. Краснодар. 1991. с. 52-53

15. Конарев A.B. Система ингибиторов гидролаз у злаков -организация, функции и эволюционная изменчивость// Дисс. докт. биол.наук. М.1992. 356 С.

16. Конарев A.B. , Фомичева Ю.В. Ингибиторы гидролаз и сопряженная эволюция злаков и вредных насекомых. // IX Всесоюзн. совещ. Иммунитет растений к болезням и вредителям. Тез. докл. Минск,j 1991а. Т. 2. с. 270-271.

17. Конарев A.B. , Фомичева Ю.В. Перекрестный анализ взаимодействия компонентов а-амилаз и протеиназ насекомых сi белковыми ингибиторами из эндосперма пшеницы // Биохимия. 1991b.j T.56. вып.4. с. 628-638

18. Коничев A.C., Водолеев A.C., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б.

19. Рибонуклеазная активность в грене родительских пород и гетерозисныхгибридов тутового шелкопряда // Биохимия насекомых. М. МГПИ.1979.1. Вып.21. с.20-25

20. Коничев A.C., Филиппович Ю.Б. Активность кислой фосфатазы в легкой митохондриальной фракции и постмитохондриальной фракции родительских пород и гетерозисных гибридов тутового шелкопряда // Биохимия насекомых. М. МГПИ. 1979. Вып.21. с.28-32.

21. Коничев A.C., Филиппович Ю.Б., Водолеев A.C. Активность нуклеаз в тканях личинок исходных пород и полученных при скрещиваниигетерозисных гибридов тутового шелкопряда // Биохимия насекомых. М. МГПИ. 1977. Вып. 19. с.22-28.

22. Коничев A.C., Филиппович Ю.Б., Шамшина Т.Н.Активность кислой фосфатазы в грене родительских пород и гибридов тутового шелкопряда II Биохимия насекомых. М. МГПИ. 1978. Вып.20. с.22-27.

23. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии.// М. Высшая школа. 1980. 272С.

24. Лаптева Т.И. Метаболизм меченых белков в тканях и органах тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития в связи с шелкообразованием и продуктивностью (экспериментальное исследование). // Дисс. канд. биол. наук. М. 1981. 222С.

25. Локшина Л. А. Протеолитические ферменты в регуляции биологических процессов II Биоорганическая химия. 1994.Т.20. №2. сс.134-142.

26. Меркурьева Е.Е., Шангин-Березовский Г.М. Генетика с основами биометрии. II М. 1983. сс. 11-28

27. Минина Н.И. Ферменты в тканях тутового шелкопряда в процессе онтогенеза//Дисс. канд. биол. наук. Москва. 1973. 169 С.

28. Мосолов В В. // Протеолитические ферменты. М. Наука. 1971. 4141. С.

29. Мосолов В. В. Белковые ингибиторы как регуляторы процессов протеолиза. II 36-е Баховские чтения. 1983, М. Наука. 40 С.

30. Мосолов В. В. Ингибиторы белковой природы протеолитических ферментов. // Биоорганическая химя. 1994. Т.20. №2. сс. 153-161

31. Мосолов В. В. Новое о природных ингибиторах протеолитических ферментов // Биоорганическая химия. 1998. Т.24. №5. сс.332-340

32. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Растительные белковые ингибиторы протеолитических ферментов. // 1993. М. Ин-т Биохимии им. А.Н. Баха РАН. 208 С.

33. Мосолов В.В., Федуркина Н.В. Стехиометрия взаимодействия белка-ингибитора протеаз из фасоли с трипсином и химотрипсином // Докл. АН СССР. 1978 V. 241. №5, сс. 1214-1216

34. Назаров А.Ю. // Характеристика протеолитического комплекса ферментов хроматина тутового шелкопряда. Дисс. канд. биол. наук. М. 1993. 159 С.

35. Николаев A.A., Караваев B.C. Выделение с свойства специфического ингибитора трипсина из семенной плазмы человека. // Биохимия. 1990. V. 55. №6. сс. 1066-1072.

36. Зб.Нортроп Д., Кунитц М., Херриотт Р. // Кристаллические ферменты. М.: Ин. лит. 1950. 346 С.

37. Плохинский H.A.// Биометрия. Новосибирск. СОАН СССР. 1961. 364 С.

38. Поярков Э.Ф. II Тутовый шелкопряд Bombyx morí L. Том I . Биология и разведение. Ташкент. 1929. 512 С.

39. Зв.Филиппович Ю.Б. Связь белков и аминокислот гемолимфы с синтезом белков шелка в организме дубового шелкопряда // Уч. зап. МГПИ им. В.И.Ленина, каф.орг. и биол. химии. 1953.Т.77. вып.7. с. 125

40. ЗЭ.Филиппович Ю.Б. Аминокислоты и белковый обмен в организме шелкопряда // Дисс. на соискание ученой степени доктора биологических наук СССР. М. 1963. 439С.

41. Чарыков A.K. Математическая обработка результатовхимического анализа. // Изд-во Химия. Л. 1984. сс.22-26

42. Щеголева Л.И., Филиппович Ю.Б. Динамика свободных1.аминокислот тканей тутового шелкопряда // Уч.зап. МГПИ им.В.И.Ленина.1.1969. № 239. вып. XI. сс. 161-171

43. Anson M.L. The estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with hemoglobin // J.Gen. Physiol. 1939. V.22. №1. pp.79-82.

44. Armstrong P.B. and Quigley J. P. Proteinase inhibitory activity released from the horseshoe crab blood cell during exocytosis // Biochim.Biophys. Acta. 1985. V.827. № 3. pp.453-459

45. Ashida M., Kinoshi T.K., Brey P.T. Prophenoloxydase activation in the mosquito Aedas aegypti L. II Eur.J. Biochem.1990. V.188. №3. pp.507-515.

46. Ashida M. and Yoshida H. Limited proteolysis of prophenoloxidase during activation by microbal products in insect plasma and effect of phenoloxidase on electrophoretic mobilities of plasma proteins. II Insect . Biochem. 1988. V.18. №1. pp.11-19.

47. Barrett A.J. The cystatins: a new class of peptidase inhibitors. // Trends in Biochem. Sci. 1987. V.12.№5. pp.193 -196.

48. Baumann U., Bode W. Huber R., Travis J. Potempa J. Crystall structure of cleaved equine leucocyte elastase inhibitor determined at 1.95 A. resolution. //J.Mol. Biol. 1992. V. 226. №4. pp.1207-1218

49. Baumann U., Huber W., Bode W., Grosse D., Lesjak M. and Laurell C.B. Crystall structure of cleaved human alpha-1-antitrypsin at 2,7 A resolution and its comparison with other serpins // J. Mol.Biol. 1991. V.218. №3. pp. 595606

50. Beatty K., Bieth J. and Travis J. Kinetics of association of serine proteinases with native and oxidized oc-1 -proteinase inhibitor and x-1-antichymotrypsin. J.Biol.Chem.1980. V.255. №9. pp.3931-3934/

51. Beckage N.E., Kanost M.R. Effect of parasitism by the braconid wasp Cotesia Congregata on host hemolymph proteins of the tobacco hornworm, Manduca sexta II Insect Biochem. Molec.Biol. 1993. V.23. №5. pp. 643-653

52. Bheemeswar B., Streenivasaya M. Enzyme systems of the silkmorm, Bombyx mori L. Part I. A preliminary study // J.Sci.lnd.Res.1954. B-13. №2. p. 108-112

53. Bheemeswar B., Streenivasaya M. Enzyme systems of the silkmorm, Bombyx mori L. Part II. A papyrographyc micromethod for the detection and characterization of peptides//J.Sci.lnd.Res.1954. B-13. №3. p.191-198

54. Bian X., Shaw B.D., Han Y. and Christeller J.T. Midgut proteinase activities in larvae of Anoplora glabhpennis ( Coleoptera: cerambycidae) andtheir interaction with proteinase inhibitors // Arch. Ins. Biochem. Physiol. 1996. V.31. №1. pp.23-37.

55. Billings P.C. and Habres J.M. A growth-regulated protease activity that is inhibited by the anticarcinogenic Bowmen-Birk protease inhibitor.// Proc. Natn. Acad. Sci. USA. 1992. V.89. №7. pp.3120-3124

56. Blanton R.E., Licate L.S. and Aman R.A. Characterization of a native and recombinant Shistosoma haematobium serin protease inhibitor gene product. // Molecular and biochemistry parasitology. 1994. V. 63. №1. pp. 1-11

57. Boigegrain R.A., Mattras H., Brechelin M., Paroutaud P. and Coletti-Previero M. Insect immunity: two proteinase inhibitors from hemolymph of Locusta migratoria. II Biochem. Biophys. Res.Commun. 1992. V. 189. №2. pp.790-793

58. Boisen S. Protease inhibitors in cereals. Occurence, properties, physiological role, and nutritional influence. //Acta Agricul. Scand. 1983. V.33. №4. pp.369-381

59. Boisen S., Djurtoft R. Trypsin inhibitor from rye endosperm -purification and properties// Cereal.Chem.1981.V. 58. №3. pp.194-198.

60. Boswell D.R. and Carrell R.W.Genetic engineering and the serpins.// Bioessays . 1988. V.8 . №2-3. pp.83-87

61. Boucias D. G. and Pendland J. C. Detection of protease inhibitors in the hemolymph of resistant Anticarsia gemmatalis which are inhibitori to the entomopathogenic fungus, Nomuraea rileyi. Experientia. 1987. V.43. №3 pp.336-339.

62. Brandt A., Svendson I. and Heigaard J. A plant serpin gene structure, organization and expression of the gene encoding barley protein- Z4 // Eur. J. Biochem. 1990. V.194. №2. pp.499-505

63. Brehelin M., Boigegrain R.A., Drif L. and Coletty-Previero M.-A. Purification of proteinase inhibitor which controls propheloxydase activation in the hemolymph of Locusta migratoria (Insecta) // Biochem.Biophys.Res.Comm. 1991. V. 179. №2. pp.841-846

64. Buller R.M.L. and Palumbo G. J. Poxvirus pathogenesis // Microbiol. Rev. 1991. V. 55. №1. pp.80-122

65. Carrell R. W. and Boswell D.R. Serpins: the superfamily of plasma serin proteinase inhibitors. In Proteinase Inhibitors. ( Ed. by Barrett A.J. and Salvesen G.) 1986. pp.403-419. Elsevier. Amsterdam.

66. Carrell R.W., Travis J. Alpha-1-antitrypsin and the serpins variation and countervariation. Review//Trends Biochem. Sci. 1985. V. 10. №1. pp.2024

67. Carrell R.W., Pemberton P.A. and Boswell D.R. The serpins: evolution and adaptation in a family of protease inhibitors. In Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1987. Lll. pp.527-535.

68. Carrell R.W. and Evans D.L.I. Mobile reactive center of serpins and the control of trombosis.// Nature. 1991 .V.353.№6344. pp.576-578.

69. Chasan R. and Anderson K. The role of easier , an apparent serine protease, in organizing the dorsal-ventral pattern of the Drosophila embryo. II Cell. 1989. V.56. №3. pp.391-400

70. Chen P.S. Amino acid and protein metabolism in insect development. In Advances in insect physiology. 1966. Acad.press. L. and N.-Y. V.3.p.53-61

71. Chimpendale G.M.,Kilby B.A. Relationship between the proteins of the haemolymph and fat body during development of P/'eris brassicae.il J. Insect Physiol. 1969. V.15.№5. p.905-926.

72. Chimpendale G.M. Metamorphic changes in the fat body proteins of the southweatern corn borner, Diatraea grandiosella. II J.Insect Physiol. 1970. V.16. №6. p. 1057-1068.

73. Cohen A.B., Geczy D., and James H.L. Interaction of human alpha-1 -antitrypsin with porcine trypsin II Biochemistry. 1978 . V.17. №3. pp. 392-400

74. Coles G.C. Haemolymph and moulting in Rhodnius prolixus Stal .1/ J. Insect Physiol. 1965.V.11. №10. p. 1317-1323.

75. Creighton T.E. and Darby N.J. Functional evolutionary divergence of proteolytic enzymes and their inhibitors . II Trends Biochem. Sci. 1989. V.14. №8. pp.319-324

76. Davis J.R. Disc electrophoresis. Method and application to human serum proteins//Ann. N-Y.Acad.Sci. 1964. V. 121. №2. pp.404-427

77. Deng L.R., Fujii H., Aratake H., Kawaguchi Y. and Koga K. Isolation and properties of two allelic chymotrypsin inhibitors from the hemolymph of the silkworm Bombyxmori. Insect.Biochem. 1990. V.20. №5. pp. 531-536

78. Desrochers P.E., Jeffrrey J.J. Weiss S.J. J. Interstitial collagenase ( matrix metalloproteinase -1) expresses serpinase activity //Clin. Invest. 1991. V. 87. №6. pp. 2258-2265

79. Eguchi M. Inhibition of the fungal protease by haemolymph protease inhibitors of the silkworm, Bombyx morí. L II AppI.Ent. Zool. 1982. V.17. №4. pp.589-590

80. Eguchi M. Protein protease inhibitors in insects and comparison with mammalian inhibitors. // Comp. Biochem. Physiol. 1993.V. 105B. №3. pp. 449456

81. Eguchi M. and Iwamoto A. Hydrolysis of solubilized fibroin and silk proteins in the midgut of the pharate adult of Bombyx morí. //J. Insect. Physiol. 1975. V.21. №3. pp. 577-588.

82. Eguchi M. and Kanbe M. Changes in haemolymph protease inhibitors during metamorphosis of the silkworm, Bombyx morí L. // Appl. Ent. Zool. 1982. V.17. №2. pp. 179-187

83. Eguchi M. and Shomoto K. Comparison of five chymotrypsin inhibitors from the silkworm haemolymph//Comp.Biochem.Physiol. 1984. V.78B. №3. pp.723-727

84. Eguchi M. and Shomoto K. Purification and properties of a chymotrypsin inhibitor from the silkworm haemolymph. // Comp.Biochem.Physiol. 1985. V.81B. №2. pp.301-307

85. Eguchi M. and Yamamoto Y. Comparison of serum protein inhibitors from various mammals, chicken and silkworms against four proteases. II Comp. Biochem. Physiol. 1988. V. 91B. №4. pp.625-630.

86. Eguchi M. and Yoshida S. Inhibition of protease from muscardine fungus by the inhibitor in the silkworm haemolymph and tissues.// J.Sericult.Sci.Japan. 1986. V.55. №2. pp.531-532.

87. Eguchi M., Furukawa S. and Iwamoto A. Proteolytic enzyme in the 1 midgut of the pharate adult of the silkworm, Bombyx morí L. // J.Insect . ! Physiol. 1972. V. 18. №9. pp. 2457-2467.

88. Eguchi M., Haneda I. and Iwamoto A. Properties of protease inhibitors1.from the haemolymph of silkworms, Bombyx morí , Antheraea pernyi andI

89. Philosamia cynthia rícini. II Comp. Biochem. Physiol. 1982. V. 71B. №4. pp.1.569-576.

90. Eguchi M., Itoh M., Chou L.Y. and Nishino K. Purification andcharacterization of a fungal protease specific protein inhibitor (FPI-F) in the silkworm haemolymph. II Comp.Biochem. Physiol. 1993. V.104B. №4. pp.537-I 543

91. Eguchi M., Matsui Y. and Matsumoto T. Developmental change andthormonal control of chymotrypsin inhibitors in the haemolymph of the silkworm, Bombyx morí L. // Comp. Biochem. Physiol. 1986. V.84B №3. pp.327-332

92. Eguchi M., Ueda K. and Yamashita M. Genetic variants of protease inhibitors against fungal protease and «-chymotrypsin from hemolymph of the silkworm, Bombyx morí. II Biochem.Genet. 1984. V.22. №11. pp. 1093-1102.

93. Engelmann F. Food-stimulated synthesis of intestinal proteolytic enzymes in the cockroach Leucophae maderae. J. Insect Physiol. 1969. V. 15. №2. pp.217-235

94. Engelmann F. and Geraerts W.P.M. The proteases and the protease inhibitor in the midgut of Leucophae maderae. J. Insect Physiol. 1980.V.26. №10. pp.703-710

95. Garciacarreno F.L. Proteinase Inhibitors // Trends Food Sci. Technol. : 1996. V.7. №6. pp. 197-204

96. Gennis L.S. and Cantor C.R. Double headed protease inhibitor from black eyed peas. Purification of 2 new protease inhibitors and endogenousprotease by affinity chromatography//J.Biol.Chem. 1976. V. 251. №3. pp.741 -746

97. Green T.R. and Ryan C.A. Wound- induced proteinases inhibitors in plant leaves. A possible defence mechanism against insects // Science. 1972. V. 175. №4. pp.776-777

98. Guzdek A.,Potempa J., Dubin A. and Travis J. Comparative properties of human alpha-1-proteinase inhibitor glycosilation variants // FEBS Lett. 1990. V.272. №1-2. pp. 125-127

99. Hakkansson H. 0., Borgstrom A., Ohlsson K. Porcine pancreatic cationic pro - elastase. Studies on the activation, turnover and interaction with plasma protein inhibitors // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1991. V. 372. № 7. pp. 465-472

100. Hall L. and Soderhall.K. Isolation and properties of a protease inhibitor in crayfish (Astacus astacus) cuticle. // Comp.Biochem.Physiol. 1983. V. 76B. №4. pp.699-702

101. Heimburger N. Proteinase inhibitors of human plasma. Their properties and control functions. In Proteases and Biological Control (Ed. by Reich E. et al.) 1975. pp.367-386.

102. Hergenhahn H., Aspan A. and Soderhall K. Purification and characterization of a high-Mr proteinase inhibitor of prophenoloxidase activation from crayfish plasma // Biochem.J. 1987. V.248. №1. pp.223-228

103. Hill R.E. and Hastie N.D. Accelerated evolution in the reactive centre regions of serine protease inhibitors. // Nature. 1987. V.326 (6108). pp. 96-99

104. Houseman J.D. Anterior midgut proteinase inhibitor from Glossinia morsitans morsitans Westwood and its effect upon tsetse digestive enzymes. // Can. J. Zool. 1980. V.58. №1. pp.79-87

105. Huber R. and Carrell R.W. Implications of the three-dimensional structure of ai-antitrypsin for structure and function of serpins. // Biochemistry. 1989. V.28.№23. pp. 8951-8966

106. HO.Inagaki T., Miura K., Murashi T. Identification of a proteinase inhibitor from rat peritoneal macrophages as poly (ADP-ribose) // J. Biol. Chem. 1980. V.255. № 16. pp.7746-7750

107. I.Jiang H. and Kanost M.R. Expression and characterization of serpin from an insect Manduca sexta. //Faseb J. 1995. V.9. A1437

108. Jiang H., Mulnix A.B. Kanost M.R. Expression and characterization of recombinant Manduca -sexta serpin-1 B and site directed mutant that change its inhibitory selectivity. // Insect Biochem. Molec.Biol. 1996. V.25. №10. pp1093-1100i

109. Kang S.H. and Fuchs M.S. Purification and partial characterization of

110. J a protease inhibitor from Drosophila melanogaster. // Biochim. Biophys. Acta.1980. V. 611. №1 -2. pp. 379-383