Прогнозирование продуктивности, адаптационных способностей пород и гибридов тутового шелкопряда по ферментным системам и белковым спектрам

Богословский, Василий Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Прогнозирование продуктивности, адаптационных способностей пород и гибридов тутового шелкопряда по ферментным системам и белковым спектрам
ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Прогнозирование продуктивности, адаптационных способностей пород и гибридов тутового шелкопряда по ферментным системам и белковым спектрам"

На правах рукописи

БОГОСЛОВСКИЙ ВАСИЛИЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ПРОДУКТИВНОСТИ, АДАПТАЦИОННЫХ СПОСОБНОСТЕЙ ПОРОД

И ГИБРИДОВ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА ПО ФЕРМЕНТАМ И БЕЛКОВЫМ СПЕКТРАМ

06.02.01 - разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь - 2009

003474314

Диссертация выполнена в ГНУ Республиканская научно-исследовательская станция шелководства Россельхозакадемии

Научный руководитель: доктор биологических наук

Селионова Марина Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

член-корр. РАСХН Тяпугин Евгений Александрович

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чижова Людмила Николаевна

Ведущая организация: ГНУ Научно-исследовательский институт

пчеловодства Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится «3» июля 2009 года в 900 часов на заседании диссертационного совета Д 006.078.01 при Ставропольском научно-исследовательском институте животноводства и кормопроизводства по адресу: 355017, Ставрополь, пер. Зоотехнический, 15,тел./факс: (8652)34-76-88.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Ставропольского научно - исследовательского института животноводства и кормопроизводства.

Автореферат диссертации разослан « 3 » июня 2009 года и размещен на официальном сайте института-http:vAvw.sniizhk.ru «.-3 » июня 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

М.И. Селионова

Общая характеристика работы

1.1 Актуальность темы. Одной из основных задач современной генетики и селекции тутового шелкопряда является создание высокопродуктивных пород и гибридов. Традиционные методы оценки эффективности различных гибридных комбинаций предполагают проведение длительных по времени и трудозатратных в исполнении экспериментальных выкормок. В связи с этим разработка надежных и быстрых в исполнении тестов с использованием современных достижений в области биохимии, молекулярной генетики для раннего прогнозирования продуктивности гибридов и отбор наиболее эффективных для дальнейшего селекционного процесса является актуальной (Коничев A.C., Севастьянова Г.А., 2003; Севастьянова Г.А., 2006; Кутузова Н.М. и соавт., 2007).

В ряде исследований доказана возможность использования активности различных ферментов - амилаз, фосфатаз, аминотрансаминаз, эстераз в тканях и органах куколок, личинок тутового шелкопряда для прогнозирования эффективных вариантов и отбора наиболее гетерозисных комбинаций (Филиппович Ю.Б. и соавт., 1974; 1987; Коничев A.C., Филиппович Ю.Б., 1979; Егорова Т.А., 1983; Коничев A.C., 1991; Клунова С.М., 2005). В то же время известно, что развитие зародыша определяется интенсивностью процесса расщепления запасных белков грены (яйца), что обеспечивается специфическими протеолити-ческими ферментами (Liu X.D. et al., 1996). Однако исследований по установлению связи между их активностью и хозяйственно полезными показателями у гибридов тутового шелкопряда для раннего прогнозирования продуктивности выполнено недостаточно.

Не менее важной проблемой в шелководстпе является повышение устойчивости пород и гибридов к неблагоприятным условиям среды и заболеваниям. Метаболизм тутового шелкопряда, являющегося пойкилотермным организмом, в значительной степени зависит от факторов внешней среды, особенно температуры, которая во многом определяет скорость протекания биохимических процессов (Александров В.Я., 1975). Поэтому воздействие близких к пороговым значениям температур может вызывать изменение внутриклеточных механизмов и биолого-технологических показателей (Головко В.А. и соавт., 1995; Суханов, C.B., 1999). В этом аспекте определенный интерес представляет уровень ферментативной активности, поскольку он может служить критерием оценки физиологического состояния организма (Раушенбах И.Ю.и соавт., 1995; Суханова М.и соавт., 1996). Однако возможность использования активности рибонуклеаз и дезоксирибонуклеаз для прогнозирования устойчивости тутового шелкопряда к тепловым воздействиям и вирусным инфекциям до сих пор изучена недостаточно.

В связи с этим поиск биохимических тестов прогнозирования продуктивности и резистентности у тутового шелкопряда является актуальным и практически востребованным.

Л'

ч ' •

1.2 Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка методов прогнозирования продуктивности гибридов, адаптационных качеств и идентификации пород тутового шелкопряда по ферментативной активности и спектрам растворимых белков.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить сопряженность активности протеолитических ферментов грены с хозяйственно ценными признаками у тутового шелкопряда и разработать биохимический метод тестирования продуктивности гибридного поколения на эмбриональной стадии развития.

2. Изучить влияние стрессов различной природы на продуктивные показатели тутового шелкопряда, белковый профиль, активность рибонуклеаз гемолимфы для прогнозирования адаптационных возможностей тутового шелкопряда.

3. Изучить степень гетерогенности растворимых белков грены и на ее основе разработать метод идентификации морфологически схожих пород тутового шелкопряда.

1.3 Научная новизна исследований. На основе комплексного исследования протеолитических ферментов грены тутового шелкопряда выявлена сопряженность их активности с рядом хозяйственно ценных признаков и впервые разработан биохимический метод отбора перспективных хозяйственно полез-ныминых гибридов на ранней стадии развития.

Впервые изучено влияние пороговых температурных факторов и инфекционного стресса на количественно-качественное изменение электрофоретиче-ской подвижности растворимых белковых фракций гемолимфы и активность рибонуклеаз. Показано, что их активность может служить показателем прогнозирования адаптационных качеств у тутового шелкопряда.

Впервые изучена возможность использования растворимых белков грены для идентификации морфологически трудноразличимых пород тутового шелкопряда.

1.4 Практическая значимость и реализация результатов исследований.

Для практического использования разработаны:

- биохимический метод прогнозирования продуктивности гибридов тутового шелкопряда на ранней стадии эмбриогенеза;

- метод тестирования адаптационных способностей пород тутового шелкопряда на основе сопоставления спектров растворимых белков и активности рибонуклеаз гемолимфы;

- метод идентификации трудноразличимых пород тутового шелкопряда по наборам растворимых белков грены.

Использование методов прогнозирования продуктивности гибридов и отбора наиболее перспективного селекционного материала позволило сократить затраты одного выкормочного сезона на 470,0 тыс. в год.

Ежегодный экономический эффект от использования метода тестирования адаптационных способностей тутового шелкопряда составило 442,5 тыс. руб. за один экспериментальный сезон.

1.5 Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались на заседаниях Ученого Совета ГНУ Республиканской научно-исследовательской станции шелководства Россельхозакадемии (РНИСШ, г. Железно-водск), выездных сессиях Отделения зоотехнии Россельхозакадемии в 20002006 гг., международной научно-практической конференции (Оренбург, 2008), опубликованы в открытой научной печати.

1.6 Связь темы с планом научных исследований. Диссертационная работа выполнена в рамках Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ (1996-2000 гг.; 2001-2005гг, 2006-2010 гг.) и плана НИОКР ГНУ РНИСШ по заданиям: 01.02.01 «Разработать на основе биохимических тестов метод ранней довыкормочной диагностики гетерозисной силы исходного селекционного материала на ранних стадиях эмбриогенеза тутового шелкопряда для выявления гибридных сочетаний с высокой комбинационной ценностью»; 01.01.01 «Усовершенствовать метод оценки адаптационных возможностей пород тутового шелкопряда на основе сопоставления белковых спектров и активности ферментов»; 01.01.02 «Разработать универсальные биохимические тесты для породной идентификации тутового шелкопряда».

1.7 Основные положения, выносимые на защиту:

1. Различия в активности протеолитических ферментов у исходных пород тутового шелкопряда и их гибридов могут служить биохимическим тестом прогнозирования гетерозисных комбинаций.

2. Воздействие пороговых температурных факторов и инфекционного стресса значительно снижает показатели продуктивности, изменяет электрофо-ретическую подвижность растворимых белковых фракций и активность рибо-нуклеаз гемолимфы гусениц у тутового шелкопряда.

3. Активность рибонуклеаз может служить дополнительным критерием оценки адаптационных способностей тутового шелкопряда на стадии гусеницы.

4. Метод изоэлектрофокусирования растворимых белков грены позволяет получить уникальные спектры для идентификации морфологически трудноразличимых пород тутового шелкопряда.

1.8 Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 научных работ, в том числе 2 статьи в научных изданиях из перечня ВАК.

1.9 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного текста, содержит 18 таблиц и 11 рисунков, включает введение, обзор литературы, методическую часть, результаты исследований, выводы и предложения производству, список литературы, насчитывающий 206 источников, в т. ч. 61 зарубежных.

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились в лаборатории шелководства РНИИСШ в период 2000-2008 гг. согласно схеме (рис. 1).

В опыте по изучению активности протеолитических ферментов (2003-2004 гг.) материалом для исследований служила грена (яйца) четырех пород: Кавказ 1 (К-1), Белококонная 1 (Б-1), Шелковистая 4 (Ш-4), Мзиури 2 (Мз-2) и их гибридов: трех прямых - К-1хШ-4; К-1хМз-2; Б-1хШ-4 и трех обратных - Ш-4хК-1; Мз-2хК-1; Ш-4хБ-1.

Протеолитическую активность протеиназ в 4 и 9 суточной грене постдиа-паузного развития (Ei, бластокинез и Е3 стадия почернения гусеницы) и их гетерогенность определяли по методу Ансона (Anson, 1939) в модификации С.М. Клуновой и соавт. (1987) в трехкратной повторности на кафедре биохимии Московского педагогического государственного университета.

Активность трипсино- и химотрипсиноподобных протеиназ определяли спектрофотометрическим методом, используя в качестве субстратов растворы М-бензоил-БЬ-аргинин-и-нитроанилида (BAPNA) и сукцинил-0,Ь-фенилаланин-я-нитроанилида (SUPHEPA) из расчета 5 мг/мл. Диапазон рН от 2,2 до 11,0 единиц обеспечивался различной растворимостью при определенных значениях рН двух природных субстратов - гемоглобина и казеина.

Подклассовую принадлежность ферментов определяли по соответствующим ингибиторам: для сериновых протеиназ - фенилметилсульфонилфторид; цистеиновых - я-хлормеркурибензоат.

В эксперимент по изучению адаптационных способностей было отобрано шесть пород трех контрастных групп: российской - Кавказ 13 (К-13), ПС-5; китайской - Белококонная 2 (Б-2), Сычуань; японской - Японская 107 (Я-107), Даидзо. На гусениц V возраста воздействовали стрессовыми факторами: индуцированным вирусом ядерного полиэдроза (ВЯП), повышенной сублетальной (+40°С), пониженной (+4°С ... +5°С) температурами.

Индуцирование вирусом гусениц вызывали путем скармливания сброженного листа шелковицы. Температурные стрессы вызывали путем помещения гусениц в термостат и холодильную камеру при указанных температурах соответственно на два и шесть часов. Через пять минут после описанных воздействий от каждой партии отбирали по 25 гусениц для консервации гемолимфы. Контролем служили гусеницы тех же пород, выращенные в оптимальных условиях.

Фракционный состав растворимых белков определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле (7,5% ПААГ). Количественное содержание белковых фракций - денситометрированием гелевых пластин с использованием соответствующей компьютерной программы.

Определение РНКазной и ДНКазной активности проводили спектрометрически по модифицированной методике Кога с соавт. (1987).

Рис. 1. Общая схема исследований

Объектом исследования служила грена трех пород - Пятигорская станция (ПС-5), Белококонная 2 (Б-2), HSC-90 второго дня постдиапаузного развития. Инкубацию грены осуществляли в стандартных условиях (температура 23-24°С, относительная влажность 70%).

Для получения растворимых белков навеску грены (1,0 г) и гемолимфы (0,2 г) гомогенизировали при охлаждении (0 + 4°С), белки экстрагировали 2 мл 0Д5М раствора NaCl в течение 15 мин., центрифугировали при 2 ООО об/мин в течение 30 мин.

К полученной надосадочной жидкости добавляли 5% додецилсульфата натрия (SDS) и 5% Р-меркаптоэтанола и выдерживали на водяной бане при 90°С в течение 5 минут.

Проведение экспериментальных выкормок и определение биолого-хозяйственных и технологических показателей пород и гибридов тутового шелкопряда осуществляли в соответствии с «Методикой проведения экспериментальных выкормок тутового шелкопряда» (Росшелкстанция, 1990). Учитывали: биолого-хозяйственные (жизнеспособность гусениц, средняя масса кокона, выход коконов с 1 г гусениц однодневного возраста, шелковая оболочка сырого кокона) и технологические (шелконосность сухих коконов, разматываемость оболочки сухих коконов, выход шелка-сырца сухих коконов, длина непрерывно разматываемой нити, расчетный выход шелка-сырца) признаки,

Статистическую обработку экспериментально полученных данных проводили, используя руководство Н.А. Плохинского (1961).

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Протеолитическая активность протеиназ в грене родительских пород и гибридов тутового шелкопряда

Исследование активности протеиназ позволило установить, что в состав растворимых белков грены исследованных пород и гибридов входит сложный комплекс протеолитических ферментов, функционирующих при различных значениях рН.

Исследование их подклассовой принадлежности по специфичности к модельным субстратам позволило определить цистеиновые (рН 3,0; 3,6; 6,2 и 8,6) и сериновые (рН 6,2; 7,2; 8,6 и 9,0) протеиназы. При этом цистеиновые прогеи-назы с оптимумом рН 3,0; 3,6; 6,2 и 8,6 являлись папаиноподобными, сериновые с оптимумом рН 7,2 - химотрипсиноподобными, а с оптимумом рН 9,0 -трипсиноподобными протеиназами.

Сопоставление уровня их активности у исходных пород и гибридов выявило, что у гибридов в сравнении с исходными родителями при одних значения рН отмечалось повышение энзиматической активности, при других - понижение (табл. 1,2).

Таблица 1 - Разница в активности папаиноподобных протеиназ в грене родительских пород

и гибридов тутового шелкопряда, %

Породы, гибриды Протеолитическая активность, усл. ед/мг белка

Папаиноподобные

рНЗ,0 рНЗ,6 рН 6,2 рН 8,6

I II III I II III I II III I II III

К-1.Ш-4 60,0 ±3,47 21,0 ±0,75 10,0 ±0,02 28,5 ±0,09

К-1x111-4 142,3*** ±7,48 57,8 30,0*** ±0,09 30,0 28,8*** ±2,02 65,2 18,6 ±1,74 -34,7

Ш4хК-1 134,0*** ±8,34 55,2 60,0*** ±5,12 65,0 14,1**± 1,17 29,4 39,0*** ±2,37 26,9

К-1, Мз-2 35,5 ±2,01 9,0 ±0,06 6,0 ±0,01 16,5 ±1,12

К-1хМз-2 55,0** ±4,04 35,4 20,0*** ±1,78 55,0 0 -100 45,8*** ±3,56 63,9

Мз-2хК1 46,0* ±2,98 22,8 22,0*** ±1,46 59,1 0 -100 0 -100

Б-1, Ш-4 65,5 ±4,45 20,5 ±0,05 30,0 ±0,16 12,0 ±0,05

Б-1хШ-4 87,0* ±4,35 24,7 83,0*** ±5,16 75,3 13,0 ±0,08 -56,6 39,0*** ±3,07 69,2

Ш-4хБ-1 88,0* ±3,98 25,5 84,0*** 4,16 75,5 15,0 ±1,17 -50,0 41,0*** ±2,46 70,7

Так, активность папаиноподобных протеиназ с оптимумом рН 3,0 и 3,6 у всех изученных гибридов была достоверно выше среднеродительского показателя. Разница колебалась от 22,8% (Р<0,05) до 75,5% (Р<0,001).

Превышение активности пептидогидролаз с оптимумом рН 8,6 отмечено у прямого и обратного гибридов Б-1 и Ш-4, а также у прямого гибрида К-1 и Мз-2 и обратного - Ш-4 и К-1 (от 26,9 до 70,7%, Р<0,001).

В активности протеиназ с оптимумом рН 6,2 положительная разница выявлена только у прямого и обратного гибридов К-1 и Ш-4 на 29,4% (Р<0,01) и 65,2% (Р<0,001).

Таблица 2 - Разница в а ктивности химо- и трипсиноподобных протеиназ в грене родительских пород и гибридов тутового шелкопряда, %

Породы, гибриды Протеолитическая активность, усл. ед/мг белка

Химотрипсиноподобные Трипсиноподобные

рН 9,0 рН 7,2

I II III I II III

К-1; Ш-4 812,5±38,7 29,0*0,13

К-1 х Ш-4 53,6±4,12 -93,4 0 _-100

Ш-4 х К-1 437,5±18,9 -40,0 0 -100

К-1; Мз-2 619,0±31,6 29,5±0,15

К-1 хМз-2 313,6±18,9 -49,3 41,6 ±2,18*** 41,0

Мз-2 х К-1 613,2±29,4 -0,93 139,0 ±5,36**+ 371,3

Б-1; Ш 4 575,0*28,5 97,0±7,11

Б-1 х Ш-4 76,5±4,16 -86,6 0 -100

Ш-4 х Б-1 143,7±6,23 -75,0 0 -100

Примечание: I - среднеродительский показатель; II - гибрид;

III - разница между показателем протеолитической активности у гибрида и среднеродительским показателем, %

В то же время у всех полученных гибридов отмечено снижение активности химотрипсиноподобных ферментов с оптимумом рН 9,0 (от 0,9% до 93,4%, Р<0,001), у гибридов К-1 и Мз-2, Б-1 и Ш-4 - папаиноподобных протеиназ с оптимумом рН 6,2 (на 50,0-100,0%, Р<0,001), у гибрида Мз-2 хК1 - с оптимумом рН 8,6 и у гибридов К-1 и Ш-1, Б-1 и Ш-4 - с оптимумом рН 7,2 (на 100,0%, Р<0,001).

Таким образом, по превышению в активности протеолитических ферментов выделялись гибриды Ш-4хК-1 и К-1хМз-2, что позволяет выделить их как наиболее перспективные хозяйственно полезныминые сочетания. Наибольшей информативностью в плане прогнозирования гетерозисных сочетаний, на наш взгляд, являются папаиноподобные протеиназьг с оптимумом рН 3,0, 3,6 и 8,6, поскольку у всех гибридов выявлено превышение над среднеродительскими показателями.

Таблица 3 - Сравнение биолого-хозяйственных показателей родительских пород и гибридов тутового шелкопряда, %

Породы, гибриды Биолого-хозяйственные показатели

Жизнеспособность гусениц, % Средняя масса кокона, г Выход коконов с 1 г гусениц однодневного возраста, кг Шелковая оболочка сырых коконов, %

I II III I II III I И III I II III

К-1; Ш-4 92,2 ±0,72 2,0 ±0,01 3,71 ±0,02 20,7 ±0,49

К-1 х Ш-4 95,5* ±0,72 3,4 2,1*** ±0,01 5,0 3 99*** ±0,04 7,5 21,1 ±0,73 1,9

Ш-4 х К-1 94,1 ±0,81 1,9 2,2*** ±0,01 10,0 3,87** ±0,05 43 21,1 ±0,49 1,9

К-1; Мз-2 92,2 ±0,54 2,1 ±0,01 3,75 ±0,02 19,9 ±0,42

К-1 х Мз-2 93,7 ±0,92 1,6 2,1 ±0,01 0 4,18*** ±0,05 »,4 20,5 ±0,62 3,0

Мз-2 х К-1 93,8 ±0,64 1,7 2,0 ±0,01 5,0 4,01*** ±0,04 6,9 20,0 ±0,56 0,5

Б-1; Ш 4 91,2 ±0,63 2,1 ±0,01 3,57 ±0,02 19,9 ±0,50

Б-1 х Ш-4 90,0 ±0,77 1,8 2,1 ±0,01 0 3,89*** ±0,02 8,9 19,9 ±0,51 0

Ш-4 х Б-1 91,0 ±0,59 2,9 2,0 ±0,01 5,0 3,91*** ±0,03 9,5 20,6 ±0,49 3,5

Таблица 4 - Сравнение технологических показателей родительских пород и гибридов тутового шелкопряда, %

Породы, ' гибриды Технологические показатели

Шеяконосность сухих коконов, % Размашваемость оболочки сухих коконов, % Выход шелка-сырца сухих коконов, % Длина непрерывно разматываемой нити, м Расчетный выход шелка-сырца, кг

I II III I II III I II III I II III I II III

К-1; Ш-4 42,1 ±0,68 87,9 ±0,42 37,8 ±0,49 1150 ±5,40 0,560 ±0,17

К-1 х Ш-4 48,8*** ±0,82 15,9 89,7* ±0,34 2,0 40,0* ±0,27 5,8 1159 ±6,17 0,7 0,638* ±0,02 13,9

ТТ* < ТЛ 1 А ГЧ.-1 48,9*** ±0,83 16,1 89.4* ±0,43 1,7 40,4* ±0.32 6,8 1147 ±5.96 -0,3 0,630* ±0,02 12,5

К-1; Мз-2 41,4 ±0,53 88,75 ±0,43 37,6 ±0,48 1108 ± 0,561 ±0,18

К-1 х Мз-2 44,8** ±0,64 8,2 91,6** ±0,51 3,2 39,8* ±0,26 Е О 1089 ±4,83 -1,7 0,688** ±0,01 22,6

Мз-2 х К-1 43,6* ±0,71 5,3 90,6* ±0,48 2,1 38,9 ±0,41 3,4 1078 ±4,64 -2,7 0,623* ±0,02 11,0

Б-1; Ш-4 42,1 ±0,68 87,0 ±0,41 36,1 ±0,47 1072 ±5,10 0,530 ±0,12

Б-1 х Ш-4 42,2 ±0,64 0,2 90,5** ±0,47 4,0 40,2*** ±0,28 из 1123*** ±5,03 4,7 0,632** * ±0,01 19,2

Ш-4 х Б-1 41,0 ±0,59 -2,6 89,2* ±0,36 2,5 39,4*** ±0,31 9,1 1142*** ±4,48 6,5 0,618** ±0,02 16,6

Примечание: *-Р<0,05; **-Р<0,01;***-Р<0,001;

I - среднеродительский показатель; II - показатели гибридов;

III - разница между гибридом и среднеродительским показателем, в % ;

С целью подтверждения сделанного предположения, а также выявления возможной связи между протеолитнческой активностью ферментов и продуктивными качествами тутового шелкопряда были изучены биолого-хозяйственные и технологические показатели гибридов и проведено их сопоставление с показателями родительских пород (табл. 3,4).

В шести гибридных комбинациях выявлена высокодостоверная разница (от 4,4 до 11,4%) по выходу кокона с 1 г гусениц, выходу шелка-сырца сухих коконов (от 3,4 до 4,3%) и его расчетному выходу (12,5 - 22,6%). Несколько меньшая, но во всех случаях положительная разница установлена по жизнеспособности гусениц (на 1,7 - 3,4%), проценту шелковой оболочки (на 0,5 - 3,5%), разматываемости оболочки сухих коконов (на 1,7 - 4,0%).

По таким показателям, как шелконосность сухих коконов и длина непрерывно разматываемой нити у одних гибридов установлено превышение над родителями, у других - понижение. Так, у гибридных сочетаний К-1 хШ-4, Ш-4хК-1 и К-1хМз-2, Мз-2 хК-1 шелконосность сухих коконов была выше на 5,3 -16,1%, в то время как у Б-1x111-4 и Ш-4хБ-1 отмечалось снижение этого показателя на 2,6%.

Сопоставление данных по величине относительного превосходства гибридов над среднеродительскими показателями выявило, что по жизнеспособности гусениц, массе кокона, проценту шелковой оболочки и шелконосности сухих коконов лидирующее положение занимали гибриды, полученные от К-1 и Ш-4.

По разматываемости сухих коконов, выходу шелка-сырца сухих коконов и длине непрерывно разматываемой нити - особи от Б-1 и Ш-4; по выходу коконов с 1 г гусениц и расчетному выходу шелка - гибриды, произошедшие от К-1 и Мз-2.

Таким образом, по активности папаиноподобных ферментов при оптиму-мах рН 3,0, 3,6, 6,2 и 8,6, их повышению по отношению к исходным родительским формам, а также комплексу биологических и технологических показателей можно выделить группу гибридов, полученных при использовании К-1 и Ш-4, К-1 и Мз-2.

3.2 Сопряженность протеолитнческой активности протеиназ с биологическими и технологическими показателями тутового шелкопряда

С целью прогнозирования уровня хозяйственно полезных признаков по протеолитнческой активности были рассчитаны коэффициенты корреляции между активностью протеиназ и основными биологическими и технологическими показателями у изученных пород и гибридов тутового шелкопряда.

Корреляционный анализ выявил как положительную, так и отрицательную связь между сопоставляемыми показателями (табл. 5).

Статистически достоверная корреляция установлена между активностью папаиноподобных протеиназ с жизнеспособностью гусениц, выходом коконов с 1 г гусениц, содержанием шелковой оболочки и длиной непрерывно разматы-

ваемой нити; между активностью трипсиноподобных протеиназ и средней массой коконов и их разматываемостыо, между активностью химотрипсиноподоб-ных протеиназ и жизнеспособностью гусениц и средней массой коконов.

Таблица 5 - Коэффициенты корреляции между активностью протеолитимеских

ферментов в грене и биолого-хозяйственными, технологическими _показателями тутового шелкопряда_

Биолого-хозяйственные и технологические показатели Фермент/ Оптим\ т

Папаиноподобная протеиназа Трип-сино-подобная протеиназа Химот-рипси-иопо-добная протеиназа

рН 3,0 рН 3,6 рН 6,2 рН 8,6 рН 9,0 рН7,2

Жизнеспособность гусениц 0,27 0,43 0,44 0,39 -0,44 0,19

Средняя масса кокона 0,21 0,07 -0,75 -0,34 0,40 0,20

Выход коконов с 1 г гусениц однодневного возраста, кг 0,19 0,23 -0,20 0,27 -0,26 -0,24

Содержание шелковой оболочки в сыром коконе 0,32 0,06 0,05 0,39 -0,01 -0,21

Шелконосность сухих коконов 0,67 0,02 0,20 0,04 -0,34 0,23

Разматываемость оболочки сухих коконов 0,28 0,11 0,12 -0,22 0,34 0Д1

Выход шелка-сырца сухих коконов -0,07 -0,37 -0,02 0,09 -0,02 -0,06

Длина непрерывно разматываемой нити 0,31 0,24 0,55 0,02 -0,76 -0,03

Расчетный выход шелка-сырца с 1 г гусениц 0,10 0,26 -0,03 0,01 0,02 0,12

Отрицательная статистически достоверная корреляция выявлена между активностью папаиноподобных протеиназ с оптимумом рН 3,0, 3,6 и 6,2 и выходом шелка-сырца; активностью папаиноподобных протеиназ с оптимумом рН 6,2 со средней массой коконов, выходом шелка-сырца сухих коконов и его расчетным выходом с 1 г гусениц; активностью папаиноподобных протеиназ с оптимумом рН 8,6 и средней массой коконов и разматываемостыо сухих коконов; активностью трипсиноподобных протеиназ с оптимумом рН 9,0 и жизнеспособностью гусениц, содержанием шелковой оболочки в сыром коконе, выходом шелка, а также активностью химотрипсиноподобных протеиназ с оптимумом рН 7,2 и содержанием шелковой оболочки в сыром коконе и выходом шелка-сырца.

Следовательно, для повышения жизнеспособности гусениц, содержания шелковой оболочки, разматываемое™ коконов следует отбирать породы тутового шелкопряда с повышенной активностью папаиноподобных протеиназ, для

увеличения средней массы кокона - трипсино- и химотрипсиноподобных про-теиназ.

Следует особо подчеркнуть, что активность папаиноподобных ферментов с оптимумом рН 3,0 и 3,6 положительно коррелировала со всеми изученными показателями, за исключением выхода шелка-сырца, что следует учитывать как при отборе исходных пород, так и определении наиболее перспективных гибридных сочетаний.

Обобщение полученных результатов свидетельствует о том, что активность папаиноподобных трипсиноподобных и химотрипсиноподобных протеи-наз может быть использована в качестве биохимических тестов для раннего прогнозирования потенциальной продуктивности у пород тутового шелкопряда и их гибридов.

3.3 Влияние инфекции и температурных стрессов на продуктивность тутового шелкопряда

Исследование влияния стрессов различной природы выявило, что они вызывают значительное снижение как биологических, так и технологических показателей у тутового шелкопряда, при этом наибольшие отрицательные воздействия оказывали вирус полиэдроза и повышенная сублетальная температура.

Так, эти факторы снижали жизнеспособность гусениц на 33,9 - 75,3% (Р<0,001), в то время как переохлаждение - на 19,9 - 64,7 (Р<0,01). При этом следует отметить, что инфекционный стресс увеличивал количество больных коконов в 5 - 10 раз, тогда как температурные факторы всего в 1,5 - 2,5 раза.

Выявлена разница по силе воздействия вызванных стрессов по такому показателю как выход коконов с 1 г гусениц. Так, если при инфекционном индуцировании и сублетальной температуре его уровень снижался на 51,5 - 84,0% (Р<0,001), то при низких всего на 19,7 - 62,7% (Р<0,01; Р<0,001) (табл. 6,7).

Все неблагоприятные факторы высокодостоверно снижали выход коконов с 1 г гусениц. Однако инфекционный стресс и перегрев у большинства пород снижали этот показатель на 72,8 - 84,0% (Р<0,001), в то время как стресс пониженной температуры - 19,7 - 34,4% (Р<0,05; Р<0,01). Аналогичная закономерность наблюдалась и по содержанию шелка в сырых коконах. Индукция ВЯП и высокая температура приводили к уменьшению этого показателя на 9,1 - 14,4%, тогда как при охлаждении - 0,7 -8,6%(Р<0,05).

Следует отметить, что при всех видах стрессовых воздействий наибольшей общей резистентностью обладали К-13 и Даидзо. Снижение уровня хозяйственно полезных показателей (жизнеспособность гусениц, средняя масса кокона и их выход с 1 г гусениц) у них по сравнению с другими породами было наименьшим.

Наименее устойчивой оказалась Б-2, как при инфекционном, так и температурном воздействиях.

Таблица б - Влияние различных стрессов на биологические показатели пород тутового шелкопряда

Порода Жизнеспособность гусениц, % Разница к контролю (-), % Средняя масса кокона, г Разница к контролю (-), % Двойники, % Разница к контролю (-), %

Контроль

К-13 95,2 ± 0,49 - 2,0 ±0,01 - 0,4 ±0,01 -

ПС-5 94,5 ±0,54 - 1,8 ±0,01 - 0,5 ± 0,02 -

Б-2 93,9 ± 0,62 - 2,0 ±0,01 - 0,6 ± 0,02 -

Сычуань 92,4 ± 0,48 - 1,6 ±0,01 - 0,5 ± 0,02 -

Я-107 95,9 ± 0,69 - 1,7 ±0,01 - 1,3 ±0,03 -

Даидзо 94,5 ± 0,56 - 1,6 ±0,01 - 1,2 ±0,03 -

Инфекционный стресс

К-13 45,3 ±0,13"* 52,4 1,7 ±0,01 15,0 5,8 ±0,03*** -

ПС-5 27,0 ±0,17*** 71,4 1,1 ±0,01*** 38,8 10,0 ±0,07*** 190,0

Б-2 25,4 ± 0,21*** 72,9 1,2 ±0,01 40,0 4,2 ±0,02*** -

Сычуань 36,8 ± 0,38*** 60,1 1,2 ±0,01 33,3 0,8 ± 0,03*** 60,0

Я-107 29,4 ±0,12*** 69,3 1,3 ±0,01 30,7 1,9 ±0,02 +30,7

Даидзо 62,4 ± 0,24*** 33,9 1,1 ±0,01*** 31,2 2,4 ± 0,03*** 100,0

Температурный стресс: +40°С

К-13 37,5 ± 0,47*** 60,6 1,7 ±0,01 15,0 0,5 ±0,01** 25,0

ПС-5 24,2 ± 0,38*** 71,3 1,2 ±0,01 33.3 0,2 ± ах»! +60,0

Б-2 23,1 ±0,52** 75,3 1,3 ±0,01 35,0 0,4 ±0,02*** -

Сычуань 28,7 ± 0,48*** 68,9 1,4 ±0,01 12,5 0,3 ±0,07*** -

Я-107 25,3 ± 0,64** 73,6 1,4 ±0,01 17,6 0,4 ±0,01 +69,2

Даидзо 18,1 ±0,71*** 49,1 1,5 ±й,01 6,2 0,3 ±0,01 +75,0

Температурный стресс: +4° ... +5°С

К-13 70,0 ± 0,43*** 26,5 1,8 ±0,01 10,0 0,1 ±0,01 -

ПС-5 39,1 ±0,42*** 58,6 1,5 ±0,01 16,7 0,2 ± 0,01 +60,0

Б-2 27,6 ± 0,52** 70,6 1,6 ±0,01 20,0 0,4 ±0,01 -

Сычуань 37,2 ±0,39*** 59,7 1,3 ±0,01 18,7 0,2 ±0,01 +60,0

Я-107 31,4 ±0,46*** 67,2 1,4 ±0,01 17,6 0,8 ± 0,02 +38,4

Даидзо 76,0 ± 0,56*** 19,6 1,6 ±0,01 - ОД ±0,01

Таблица 7 - Влияние различных стрессов на технологические показатели пород тутового шелкопряда

Порода Больные коконы, % Разница к контролю, (количество раз) Выход коконов с 1 г гусениц однодневного возраста, кг Разница к контролю (-), % Шелковая оболочка сырых коконов, % Разница к контролю (-), %

Контроль

К-13 2,5 ±0,02 - 4,22 ±0,03 - 20,4 ±0,51 -

ПС-5 2,4 ±0,01 - 3,89 ±0,03 - 16,7 ±0,33 -

Б-2 2,6 ±0,02 - 4,26 ±0,04 - 18,5 ±0,64 -

Сычуань 1,7 ±0,01 - 3,51 ±0,02 - 14,2 ±0,46 -

Я-107 1,4 ±0,01 - 3,89 ±0,03 - 18,0 ±0,44 -

Даидзо 2,1 ±0,02 - 3.55 ±0,02 - 13,1 ±0,50

Инфекционный ст| ресс

К-13 10,4 ±0,09*" 4,2 1,71 ±0,02*** 59,4 18,3 ±0,48 10,3

ПС-5 12,0 ±0,10*** 5,0 0,70 ±0,03*** 82,0 14,3 ±0,53*** 14,4

Б-2 20,5 ±0,12*** 7,8 0,71 ±0,03*** 83,5 16,3 ±0,47 11,9

Сычуань 18,0 ±0,09*** 10,6 1,05 ±0,01*** 70,0 12,4 ±0,26** 12,7

Я-107 10,0 ±0,09*** 7,1 0,91 ±0,02*** 76,6 14,3 ±0,16** 9,4

Даидзо 11,5 ±0,10*** 5,4 1,61 ±0,02*** 54,6 11,3 ±0,14** 13,7

Температурный стресс: +40°С

К-13 3,9 ±0,02*** 1,6 1,41 ±0,03*** 66,5 18,7 ±0,49 8,3

ПС-5 3,8 ±0,02*** 1,6 0,67 ±0,02*** 82,8 14,7 ±0,28 11,9

Б-2 4,5 ±0,03*** 1,7 0,68 ±0,02*** 84,0 16,6 ±0,26 10,3

Сычуань 2,4 ±0,02*** 1,4 0,95 ±0,03*** 72,8 12,9 ±0,18 9,1

Я-107 2,2 ±0,02*** 1,6 0,85 ±0,02*** 78,2 17,2 ±0,21 4,4

Даидзо 2,5 ±0,01*** 1,2 1,72 ±0,03*** 51,5 12,4 ±0,17 5,3

Температурный стресс: +4°... +5°С

К-13 10,3 ±0,09*** 4,1 2,79 ±0,02*** 33,8 18,8 ±0,11 7,8

ПС-5 4,3 ±0,08*** 1,8 1,34 ±0,03*** 34,4 13,2 ±0,14 20,9

Б-2 0,9 ±0,06 - 1,01 ±0,03*** 76,3 16,9 ±0,19 8,6

Сычуань 2,2 ±0,04 1,3 1,15 ±0,02*** 67,2 13,4 ±0,17 5,6

Я-107 1,5 ±0,03 - 1,06 ±0,02*** 72,7 17,1 ±0,10 5,0

Даидзо 2,2±0,04 - 2,85 ±0,03*** 19,7 13,0 ±0,14 0,7

3.4 Влияние инфекции и температурных стрессов на белковый спектр и активность рибонуклеаз гемолимфы

В ходе спектрального анализа белков у исследованных пород тутового шелкопряда выявлено, что неблагоприятные воздействия вызывали значительные изменения как в качественном распределении белковых фракций в зависимости от их электрофореткческой подвижности, так и в количественном.

Так, у всех пород (за исключением Даидзо) индуцирование ВЯП вызывало появление белков с высокой молекулярной массой и соответственно низкой подвижностью (Rf = 0,01). У породы Даидзо отмечено появление белков в зоне Rf= 0,22, тогда как у пород ПС-5 - в диапазоне Rf = 0,25 - 0,27 и Б-2 в зоне Rf= 0,27 вирусная инфекция приводила к их исчезновению.

У китайских и японских пород под воздействием этого фактора отмечено значительное увеличение белков со средней молекулярной массой соответственно в диапазонах Rf= 0,35 - 0,55 на 195,6-241,0% и Rf = 0,45 - 0,55 на 150,0 -225,0%, в то время как у российских пород в диапазоне Rf = 0,45 - 0,55 таких белков вообще не обнаружено. В зоне Rf =0,25 у всех пород (за исключением Б-2) выявлено существенное; снижение (на 33,3 - 156,2%) белковых фракций, а при Rf = 0,27 их полное отсутствие.

Воздействие низких и высоких температур, так же как вирусная инфекция, у всех пород, кроме Даидзо, вызывало появление на элекрофореграммах белков с низкой подвижностью (Rf = 0,01).

Переохлаждение практически у всех пород провоцировало снижение содержания средне- и высокоподвижных растворимых белков гемолимфы в диапазоне Rf = 0,25 - 0,45, за исключением Б-2, у которой в зоне Rf = 0,25 - 0,35 отмечено значительное (на 169,5 - 471,4%) их повышение.

У пород Б-2 и Сычуань, как при воздействии низких, так и сублетальных высоких температур, происходило значительное (на 166,6-200,0% и 133,3%) повышение высокомолекулярных белков с низкой подвижностью (в зоне Rf = 0,17), тогда как у К-13 низкие температуры в указанной зоне вызывали снижение содержания белка (на 42,5%), а высокие, наоборот, повышение (на 175,0%).

Таким образом, при значительном разнообразии изменений в белковом спектре гемолимфы гусениц разных пород тутового шелкопряда под воздействием стрессов различной природы общим для всех пород было значительное возрастание количества белков со средней и особенно высокой молекулярной массой. С большей долей вероятности можно предположить, что перестройки в белковом спектре гемолимфы носят приспособительный характер и связаны с синтезом защитных белков (антител).

Другим немаловажным аспектом при изучении адаптационных возможностей тутового шелкопряда является исследование амплитуды пластичности рибонуклеазных ферментов, таких как РНК-азы и ДНК-азы.

Таблица 8

- Влияние стрессовых факторов на активность РНК- и ДНК-аз в гемолимфе различных пород тутового шелкопряда (усл. ед. на 1 мл гемолимфы, 102)

Контроль, стрессовый фактор К-13 ПС-5 Б-2 Сычуань Я-107 Даидзо

РНК-аза

Контроль 22,70±1,39 22,22+1,71 24,95+1,83 23,81+0,96 16,25+1,62 12,50+2,70

ВЯЛ 94,16+3,38*** 83,62+4,62*** 99,82+3,08*** 92,33+5,12*** 61,66+3,91*** 18,33+2,41

Разница к контролю (%) +436,80 +276,31 +300,08 +287,78 +279,45 +46,64

+4° ... +5°С 20,80±1,15 19,46±2,04 21,19+1,97 20,56+2,06 11,70+1,52 12,50+1,87

Разница к контролю (%) -8,37 -12,40 -15,08 -13,65 -28,00 0

+40°С 25,00±1,30 21,38+1,46 20,6+0,96 23,71+1,46 8,75+1,72* 4,13+0,98*

Разница к контролю (%) +10,11 -3,78 -17,43 -0,42 -46,15 -66,96

ДНК-аза

Контроль 23,04±1,13 20,04+0,66 22,86+1,02 21,02+1,82 19,28+0,99 22,23+1,77

ВЯЛ 54,82+2,19*** 41,42+3,13** 49,54+2,47*** 51,83+4,17*** 41,61+3,12** 18,16+2,10

Разница к контролю (%) +137,93 +106,69 +116,71 +146,57 +115,82 -18,31

+4° ... +5°С 17,17±0,78* 19,52+1,26 24,17+1,49 22,24+1,15 14,19+0,86* 21,46+1,48

Разница к контролю (%) -25,48 -2,59 +5,70 +5,81 -26,40 -3,46

+40°С 15,16+1,12** 14,16+0,96** 19,86+1,07 21,00+2,02 12,16+1,87* 16,18+2,13

Разница к контролю (%) -34,20 -29,30 -13,12 -0,09 -36,93 -27,22

Выявлено, что индуцирование вируса ядерного полиэдроза у всех пород вызывало значительное повышение активности РНК и ДНК-азы, при этом наибольшая активация этого фермента отмечена у К-13, Б-2, ПС-5, Сычуань и Я-107 - в 3,7- 4,1 раза (Р<0,001).

Температурные стрессы вызывали изменения, обратные тем, которые отмечались при индуцировании вируса. Переохлаждение и воздействие повышенных температур практически у всех пород приводили к снижению активности ферментов на 12,4 - 41,6% (Р<0,01; 0,001) и 3,4 - 34,2% (Р<0,05).

Сопоставление у изученных пород изменений в уровне продуктивных качеств и активности рибонуклеаз под воздействием стрессов показывает, что большую адаптационную пластичность при вирусной инфекции проявляли породы, у которых отмечалось более значительная активация РНК- и ДНК- ферментов, а при температурных воздействиях - породы, у которых снижение в активности рибонуклеаз была наименьшей. По активности рибонуклеаз и большему сохранению продуктивного потенциала при воздействии неблагоприятных факторов выделялись Б-2 и К-13.

Возможность биохимического тестирования адаптационных способностей тутового шелкопряда к стрессовым факторам по активности рибонуклеаз-ных ферментов подтверждают полученные положительные коэффициенты корреляции между активностью этих ферментов и некоторыми продуктивными показателями тутового шелкопряда (табл. 9).

Таблица 9 - Коэффициенты корреляции между активностью рибонуклеаз гемолимфы и биологическими и технологическими показателями тутового шелкопряда

Показатели Ферменты

РНК-аза ДНК-аза

контроль ВЯП +5°С +40° С контроль ВЯП +5°С +40° С

Жизнеспособность гусениц -0,47 -0,71 -0,21 -0,70 -0,21 -0,62 -0,08 -0,03

Средняя масса кокона 0,59 0,37 0,20 -0,02 0,54 0,56 -0,03 -0,10

Выход коконов с 1 г гусениц 0,49 -0,42 -0,17 -0,40 0,39 -0,25 -0,10 -0,06

Процент шелковой оболочки сырых коконов 0,46 0,67 0,15 031 0,18 0,70 -0,44 -0,39

При нормальных условиях выращивания гусениц активность РНК-азы имела сопряженность со средней массой кокона, выходом коконов с 1 г гусениц и процентом шелковой оболочки. При стрессовых факторах выявленная положительна связь менялась на отрицательную (за исключением коэффициентов корреляции со средней массой кокона и процентом шелковой оболочки при ВЯП и сублетальной температуре).

Активность ДНК-азы положительно коррелировала со средней массой кокона и их выходом с 1 г гусениц в контроле, однако при неблагоприятных условиях коэффициенты корреляции имели отрицательное значение (кроме

связи со средней массой кокона и проценту в них шелковой оболочки при вирусной инфекции).

Обращает на себя внимание тот факт, что активность ферментов отрицательно коррелировала с жизнеспособностью гусениц при нормальных условиях, однако при стрессовых факторах (ВЯП и сублетальной температуре) величина этого показателя значительно возрастала.

Таким образом, процесс адаптации и изменение биохимических реакций при воздействии разных стрессов изменяют вектор взаимосвязи между активностью изученных ферментов и жизнеспособностью гусениц.

Полученные данные по изучению РНКазной и ДНКазной активности белков гемолимфы у пород тутового шелкопряда, их связь при различных условиях позволяют получить дополнительные параметры в оценке адаптационных возможностей при воздействии неблагоприятных факторов. Интенсивность изменения активности рибонуклеаз под воздействием стрессов следует учитывать при отборе пород и получении гибридов, оптимально сочетающих высокую устойчивость к неблагоприятным факторам с высокой продуктивностью.

3.5 Идентификация пород тутового шелкопряда по растворимым белкам грены

Сравнение пород тутового шелкопряда по морфологическим признакам не выявило каких-либо значимых различий по цвету грены, ее форме, зернистости коконов, окраске кожных покровов гусениц, а также биологическим и технологическим показателям - средней массе коконов и их выходу с 1 г однодневных гусениц, содержанию шелковой оболочки в сырых коконах, шелконостности сухих коконов их разматываемое™.

В тоже время исследование белковых спектров трех пород тутового шелкопряда позволило выявить у них достаточный широкий белковый полиморфизм. Выделено от 13 до 18 белковых фракций с различным количественным содержанием белка. Так, наиболее полиморфной оказалась НБС-90, у которой было выявлено 18 белковых фракций, затем следовала Б-2, у которой обнаружено 16 белковых фракций и менее полиморфной из изученных пород оказалась ПС-5 с 13 белковыми вариантами (рис. 2).

Сравнение исследованных пород между собой показало, что у Б-2 в зоне рН 5,3 и 5,6 присутствует белок, в то время как у ПС-5, Н5С-90 в этой зоне белков нет. В зоне рН 7,5 есть белки у Б-2, ИБС -90, в то время как у ПС-5 не выявлено белковых фракций. Белковый полиморфизм в зонах рН 5,7, 6,0, 6,5 и 7,1 характерен только для ИБС - 90.

Таким образом, использование метода изоэлектрофокусирования белков и их электрофоретическое разделение позволяет получить белковые профили, информативность которых является достаточной для проведения идентификации пород тутового шелкопряда. Выявление маркерных белков с определенным значением рН позволит осуществлять своего рода биохимическую паспортизацию пород тутового шелкопряда и иметь объективные показатели для подтверждения чистоты живых коллекций шелководческих станций.

в ПС 5 ЯБ2 а нес 90

юо,г

90,8

85,4

50,4

51,8

46,2

49.5

44,3

10,г

71,8

21,4

23,2

15,3

И 3.9 3,4

П П

5,3

56,1

2,9

ЛЦ-

НЗ

1,5

5Л

21,5

13,8

22,2

11,9

3,7

5,3 5,< 5,5 5,56 5,6 5.65 5.7 5,75 5,8 5,9 5,95 5 6,1 6.2 5,9 6.5 6.55 6.6 6.65 6,7 6.8 5,85 6.9 7 7.1 7.15 7.2 7.25 7.3 7,4 7.45 7,5

изозлекгртескзя точка бела (рН)

Рис. 2. Изоэлектрофокусограммы растворимых белков грены разных пород тутового шелкопряда

3.6 Экономическая эффективность

Стоимость экспериментальных выкормок для оценки хозяйственно-полезных признаков четырех пород и шести гибридов в соответствии с принятой классической схемой селекции и отбор перспективных гибридов по данным научно-производственной деятельности РНИИСШ составила 504 тыс. рублей. Стоимость проведения биохимического тестирования, позволяющего отобрать гибридные комбинации без проведения экспериментальной выкормки, составляет 34 тыс. рублей. Таким образом, предлагаемый метод биохимического прогнозирования продуктивности гибридов и отбора наиболее ценного исходного селекционного материала на ранних стадиях эмбриогенеза позволяет сэкономить 470 тыс. рублей.

Экономия затрат при использовании метода прогнозирования адаптационных качеств тутового шелкопряда по биохимическим показателям за счет сокращения объема выкормок в 8,2 раза составила 442,5 тыс. рублей.

ВЫВОДЫ

1. В составе растворимых белков грены тутового шелкопряда пород Б-1, Ш-4, Мз-2 и их прямых и обратных гибридов выявлен сложный комплекс про-теолитических ферментов, представленный папаино-. трипсино- и химотрипси-ноподобными протеиназами с различной активностью в диапазоне рН от 2,2 до 11,0.

2. Большую продуктивность имели гибриды К-1:хШ-4 и К-1хМз-2: их превосходство над гибридными сочетаниями Ш-4хК-1, Мз-2хК1, Б-1хШ-4 и Ш-4хБ-1 по жизнеспособности гусениц, выходу коконов, их шелконосности и количеству шелка-сырца составило соответственно 2,4 абс. проц., 4,1%, 2,9 абс. проц. и 6,1%. Кроме того, они имели большую разницу по сравнению с родителями по активности протеолитических ферментов, выходу коконов и шелка-сырца, чем другие гибриды соответственно на 16,3%, 2,1% и 3,5 абс. проц.

3. Установлена сопряженность активности папаиноподобных протеиназ с жизнеспособностью гусениц, выходом коконов с 1 г гусениц, содержанием шелковой оболочки и длиной непрерывно разматываемой нити (г=0,19 ...0,67); трипсиноподобных - со средней массой коконов и их разматываемостью (г=0,403; г=0,346), химотрипсиноподобных - с жизнеспособностью гусениц и средней массой коконов (г=0,19), что позволяет рекомендовать активность данных ферментов в качестве биохимических тестов для раннего прогнозирования продуктивности у гибридов тутового шелкопряда.

Наиболее информативными являются папаиноподобные протеиназы с оптимумом рН 3,0, 3,6 и 8,6. Гибриды, у которых их активность выше, чем у исходных родителей, являются перспективными для отбора и последующего использования в селекционном процессе.

нюю массу кокона, выход коконов и процент шелковой оболочки в среднем на 63,2; 25,7; 71,8 и 10,1% соответственно, тогда как пониженная температура на 48,0; 13,8; 49,1 и 7,1%.

5. Неблагоприятные факторы вызывают значительные изменения, как в качественном, так и в количественном распределении белковых фракций в гемолимфе гусениц тутового шелкопряда.

5.1. Вирусная инфекция у всех изученных пород (за исключением Даидзо) приводит к появлению белков с высокой молекулярной массой в зоне Ш=0,01; у китайских и японских пород к повышению на 150,0...241,0% белков со средней молекулярной массой в диапазоне 1^=0,35-0,55, у всех пород (за исключением Б-2) снижению белков на 33,3 - 156,2% в зоне ЯГ=0,25 и полному их отсутствию в зоне ЯГ=0,27.

5.2. Температурные стрессы снижают содержание белков со средней молекулярной массой в диапазоне 1^=0,25-0,45, а также приводят к исчезновению белковых фракций в зоне 11£=0,04 у Даидзо, 1^=0,35 у К-13,11Г=0,45-0,55 у Б-2 и ЯГ=0,48 у Я-107.

6. Стрессовые факторы изменяют активность рибонуклеаз: вирусная инфекция приводит к повышению активности РНК- и ДНК-аз соответственно в 3,7-4,1 (Р<0,001) и 2,1-2,5 раз (Р<0,01), воздействие температур, наоборот, к их понижению на 12,4 - 41,6% (Р<0,01; 0,001) и 3,4 - 34,2% (Р<0,05).

7. Большую адаптационную пластичность при вирусной инфекции проявляют породы, у которых отмечается более значительная активация РНК- и ДНК-ферментов, а при температурных воздействиях - породы, у которых снижение в активности рибонуклеаз была наименьшей. По активности рибонуклеаз и большему сохранению продуктивного потенциала при воздействии неблагоприятных факторов выделялись Б-2 и К-13.

8. Выявлены положительные коэффициенты корреляции между активностью РНК-, ДНК-аз и средней массой коконов (г=0,37-0,59), их выходом с 1 г гусениц (г=0,43-0,63), РНК-азы и процентом шелковой оболочки (г=0,39-0,49), что позволяет использовать активность рибонуклеаз в качестве дополнительных критериев при отборе стресс-устойчивых пород тутового шелкопряда.

9. У морфологически неразличимых пород тутового шелкопряда - ПС-5, Б-2 и ШС-90 выявлены специфичные белковые профили: у Б-2 в зоне рН 5,3 и 5,6 имелись белковые фракции, в то время как у ПС-5, ШС-90 их не обнаружено; у Б-2, ШС-90 в зоне рН 7,5 присутствовали белки, в то время как у ПС-5 нет; белковый полиморфизм в зонах рН 5,7,6,0,6,5 и 7,1 характерен только для ИБС-90.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для ускорения селекционного процесса и сокращения материальных затрат использовать метод биохимического прогнозирования продуктивности гибридов и отбора наиболее ценного исходного селекционного материала на ранних стадиях эмбриогенеза.

2. С целью прогнозирования адаптационных способностей пород тутового шелкопряда использовать метод, основанный на сопоставлении белковых спектров гемолимфы и активности рибонуклеаз.

3. При оградительной и поддерживающей селекции коллекционных пород тутового шелкопряда для идентификации морфологически трудно различимых пород использовать спектры растворимых белков грены,

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ

1. Богословский В.В. Биохимические тесты прогнозирования продуктивности и гетерозиса у тутового шелкопряда И Вестник РАСХН, 2009. №2. С. 84-85.

2. Богословский В.В. Идентификация пород тутового шелкопряда по растворимым белкам грены И Известия ТСХА, Вып. 2. 2009. С. 151-153.

Публикации в других изданиях

3. Ярыгин Д.В., Тарасенко Н.В., Клунова С.Н., Богословский В.В., Филиппович Ю.Б. Субклеточная локализация ферментов и их белковых ингибиторов в яйцах тутового шелкопряда // Сб. научн. тр. МГПУ. Серия: естеств. науки. М.: Прометей, 2000. - С. 249-252 (0,2 п.л., доля авторского участия 20%).

4. Ярыгин Д.В., Лапковский В.В., Богословский В.В., Клунова С.Н., Филиппович Ю.Б. Активность цистеиновых протеиназ и белковых ингибиторов папаина в грене различных по продуктивности пород тутового шелкопряда II Сб. научн. тр. МГПУ. Серия: естеств. науки. М.: Прометей, 2001. - С. 183 - 186 (0,25 пл., доля авторского участия 20%).

5. Крылова И.Д., Ярыгин Д.В., Минькова Д.О.,, Богословский В.В., Клунова С.Н. Активность сериновых протеиназ в грене родительских пород и гибридов тутового шелкопряда // Сб. научн. тр. МГПУ. Серия: естеств. науки. М.: Прометей, 2005. - С. 103 - 106 (0,25 п.л., доля авторского участия 20%).

6. Метод биохимической диагностики гетерозисной силы исходного селекционного материала на ранних стадиях эмбриогенеза тутового шелкопряда / В.В. Богословский / РНИИСШ. Железноводск, 2005. 11 с.

7. Метод тестирования адаптационных способностей пород тутового шелкопряда на основе сопоставления спектров растворимых белков тканей организма / В.В. Богословский, A.C. Коничев, В.А. Лапковский / РНИИСШ. Железноводск, 2006: 16 с. (0,72 п.л., доля авторского участия 70%).

8. Метод идентификации пород тутового шелкопряда по наборам растворимых белков грены» / В.В. Богословский, A.C. Коничев, В.А. Лапковский, П.А. Силин / РНИИСШ. Железноводск, 2005. 12 с. (0,50 п.л., доля авторского участия 60%).

9. Богословский В.В. Основные генетические признаки тутового шелкопряда // Матер, междунар. научно-практич. конф. Вып. 61. T.II, Оренбург, ВНИИМС. 2008. С. 18-22.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman . печ. л. - 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 228 от 02.06.2009 г.

Отпечатано в типографии ООО «Бюро новостей» г. Ставрополь, ул. Лермонтова, 191/43

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Богословский, Василий Васильевич

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Полиморфизм белков и ферментов у тутового шелкопряда • и его использование для идентификации пород

1.2 Использование ферментов в прогнозировании продуктивности и гетерозиса у тутового шелкопряда

1.3 Использование стресс-факторов (температуры, вирусной инфекции) для прогнозирования адаптационных качеств тутового шелкопряда

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Протеолитическая активность протеиназ в грене родитель- • ских пород и гибридов тутового шелкопряда и ее сопряженность с биологическими и технологическими показателями

3.1.1 Протеолитическая активность протеиназ в грене роди- тельских пород и гибридов тутового шелкопряда

3.1.2 Сопряженность протеолитической активности протеиназ с биологическими и технологическими показателями тутового шелкопряда

3.2 Влияние стрессов различной природы на продуктивность ' тутового шелкопряда, белковый спектр и активность ри-бонуклеаз гемолимфы

3.2.1 Влияние инфекции и температурных стрессов на продук- тивность тутового шелкопряда

3.2.2 Влияние инфекции и температурных стрессов на белко- вый спектр гемолимфы

3.2.3 Влияние инфекции и температурных стрессов на актив- ность рибонуклеаз

3.3 Идентификация пород тутового шелкопряда по раствори- мым белкам грены

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Прогнозирование продуктивности, адаптационных способностей пород и гибридов тутового шелкопряда по ферментным системам и белковым спектрам"

1.1 .Актуальность темы. Наибольшее значение среди хозяйственноценных, и, в частности, коконопрядущих насекомых, имеет тутовый шелкопряд. Известно, что этот вид, как ни один из изученных биологических объектов, способен за очень короткий промежуток времени синтезировать огромное количество двух специфических белков шелка — серина и фиброина. Исключительно быстрая смена фаз развития: яйцо (грена) - личинка — куколка - бабочка, доступность биоматериала, делают его чрезвычайно привлекательным объектом для исследований с целью установления закономерностей возникновения и поддержания белкового полиморфизма, функционирования ферментных систем на различных стадиях онтогенеза, биохимических процессов адаптации (Ю.Б.Филиппович, 1980; В.А. Струнников, 1987; В.А.Головко и соавт., 1996; СМ.Клунова, 2005).Одной из основных задач современной генетики и селекции тутового шелкопряда является создание высокопродуктивных пород и гибридов. Традиционные методы оценки эффективности различных гибридных комбинаций предполагают проведение длительных по времени и трудозатратных в исполнении экспериментальных выкормок. В связи с этим разработка надежных и быстрых в исполнении тестов с использованием современных достижений з области биохимии, молекулярной генетики для раннего прогнозирования продуктивности гибридов и отбор наиболее эффективных для дальнейшего селекционного процесса является актуальной (А.С.Коничев, Г.А.Севастьянова, 2003; Г.А.Севастьянова, 2006; Н.М. Кутузова и соавт., 2007).В ряде исследований доказана возможность использования активности различных ферментов — амилаз, фосфатаз, аминотрансаминаз, эстераз в тканях и органах куколок, личинок тутового шелкопряда для прогнозирования эффективных вариантов и отбора наиболее гетерозисных комбинаций (Ю.Б. Филиппович и соавт., 1974; 1987; А.С.Коничев, Ю.Б Филиппович., 1979; Т.А.Егорова, 1983; А.С.Коничев, 1991; СМ.Клунова, 2005). В то же время известно, что развитие зародыша определяется* интенсивностью' процесса расщепления, запасных белков грены (яйца); что обеспечивается* специфическими протеолитическими ферментами (Liu X.D. et al., 1996). Однако;исследований по установлению связи между их активностью и хозяйственно полезными показателями у гибридов тутового шелкопряда для раннего-прогнозирования-продуктивности выполнено недостаточно.Не менее важной проблемой в шелководстве является повышение устойчивости пород и гибридов1 к неблагоприятным условиям: среды w заболеваниям: Метаболизм тутового шелкопряда, являющегося пойкилотермным организмом, в значительной- степени, зависит от факторов внешней среды, особенно температуры, которая во многом определяет скорость протеканиябиохимических процессов (В.Я:Александров; 1975). Поэтому воздействие близких к пороговым значениям температур может вызывать- изменение внутриклеточных механизмов, и биолого-технологических показателей. (В:А. Головко и соавт., 1995; В:Суханов; 1999). В этом аспекте-определенный интерес представляет уровень ферментативной активности, поскольку он может служить критерием- оценки физиологического состояния организма (И.Ю.Раушенбах и соавт., 1995; М. Суханова и соавт., 1996). Однако возможность использования'активности рибонуклеаз и дезоксирибонуклеаз для прогнозирования устойчивости тутового шелкопряда к тепловым воздействиям и вирусным инфекциям до сих пор изучена недостаточно.В" связи с этим поиск биохимических тестов прогнозирования продук> тивности и резистентности у тутового шелкопряда является- актуальным> и практически востребованным.1^ 2 Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка методов прогнозирования продуктивности гибридов, адаптационных качеств и идентификации пород тутового шелкопряда по ферментативной активности и спектрам растворимых белков.Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить сопряженность активности протеолитических ферментов грены с хозяйственно ценными признаками у тутового шелкопряда и разработать биохимический метод тестирования продуктивности гибридного поколения на эмбриональной стадии развития.2. Изучить влияние стрессов различной природы на продуктивные показатели тутового шелкопряда, белковый профиль, активность рибонуклеаз гемолимфы для прогнозирования адаптационных возможностей тутового шелкопряда.3. Изучить степень гетерогенности растворимых белков грены и на ее основе разработать метод идентификации морфологически схожих пород тутового шелкопряда.1.3 Научная новизна исследований. На основе комплексного исследования протеолитических ферментов грены тутового шелкопряда выявлена сопряженность их активности с рядом хозяйственно ценных признаков и впервые разработан биохимический метод отбора перспективных гетерозисных гибридов на ранней стадии развития.Впервые изучено влияние пороговых температурных факторов и инфекционного стресса на количественно-качественное изменение электрофоретической подвижности растворимых белковых фракций гемолимфы и активность рибонуклеаз. Показано, что их активность может служить показателем прогнозирования адаптационных качеств у тутового шелкопряда.Впервые изучена возможность использования растворимых белков грены для идентификации морфологически трудноразличимых пород тутового шелкопряда.1.4 Практическая значимость и реализация результатов исследований.Для практического использования разработаны: - биохимический метод прогнозирования продуктивности гибридов тутового шелкопряда на ранней стадии эмбриогенеза; - метод тестирования адаптационных способностей пород тутового шелкопряда на основе сопоставления спектров растворимых белков и активности рибонуклеаз гемолимфы; - метод идентификации трудноразличимых пород тутового шелкопряда по наборам растворимых белков грены.Использование методов прогнозирования продуктивности гибридов и отбора наиболее перспективного селекционного материала позволило сократить затраты одного выкормочного сезона на 470,0 тыс. в год.Ежегодный экономический эффект от использования метода тестирования адаптационных способностей тутового шелкопряда составил 442,5 тыс. руб. за один экспериментальный сезон.1.5 Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались на ежегодных заседаниях Ученого Совета ГНУ Республиканской научно-исследовательской станция шелководства Россельхозакадемии (РНИСШ, г. Железноводск), выездных сессиях Отделения зоотехнии Россельхозакадемии в 2000 - 2006 гг., международной научно-практической конференции (Оренбург, 2008), опубликованы в открытой научной печати.1.6 Связь темы с планом научных исследований. Диссертационная работа выполнена в рамках Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ (1996-2000 гг.; 2001-2005гг.; 2006-2010 гг.) и плана НИОКР ГНУ РНИСШ по заданиям: 01.02.01 «Разработать на основе биохимических тестов метод ранней довыкормочной диагностики гетерозисной силы исходного селекционного материала на ранних стадиях эмбриогенеза тутового шелкопряда для выявления гибридных сочетаний с высокой комбинационной ценностью»; 01.01.01 «Усовершенствовать метод оценки адаптационных возможностей пород тутового шелкопряда на основе сопоставления белковых спектров и активности ферментов»; 01.01.02 «Разработать универсальные биохимические тесты для породной идентификации тутового шелкопряда».1.7 Основные положения, выносимые на защиту: 1. Различия в активности протеолитических ферментов у исходных пород тутового шелкопряда и их гибридов могут служить биохимическим тестом прогнозирования гетерозисных комбинаций.2. Воздействие пороговых температурных факторов и инфекционного стресса значительно снижает показатели продуктивности, изменяет электрофоретическую подвижность растворимых белковых фракций и активность рибонуклеаз гемолимфы гусениц у тутового шелкопряда.3. Активность рибонуклеаз может служить дополнительным критерием оценки адаптационных способностей тутового шелкопряда на стадии гусеницы.4. Метод изоэлектрофокусирования растворимых белков грены позволяет получить уникальные спектры для идентификации морфологически трудноразличимых пород тутового шелкопряда.

Заключение Диссертация по теме "Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных", Богословский, Василий Васильевич

выводы

1. В составе растворимых белков грены тутового шелкопряда пород Б-1, Ш-4, Мз-2 и их прямых и обратных гибридов выявлен сложный комплекс протеолитических ферментов, представленный папаино-, трипсино- и химот-рипсинородобными протеиназами с различной активностью в диапазоне рН от 2,2 до 11,0.

2. Большую продуктивность имели гибриды К-1хШ-4 и К-1хМз-2: их превосходство над гибридными сочетаниями Ш-4хК-1, Мз-2хК1, Б-1x111-4 и Ш-4хБ-1 по жизнеспособности гусениц, выходу коконов, их шелконосности и количеству шелка-сырца составило соответственно 2,4 абс. проц., 4,1%, 2,9 абс. проц. и 6,1%. Кроме того, они имели большую разницу по сравнению с родителями по активности протеолитических ферментов, выходу коконов и шелка-сырца, чем другие гибриды соответственно на 16,3%, 2,1% и 3,5 абс. проц. .

3. Установлена сопряженность активности папаиноподобных протеиназ с жизнеспособностью гусениц, выходом коконов с 1 г гусениц, содержанием шелковой оболочки и длиной непрерывно разматываемой нити (г=0,19 .0,67); трипсиноподобных - со средней массой коконов и их разматываемо-стью (гЮДОЗ; 1-0,346), химотрипсиноподобных - с жизнеспособностью гусениц и средней массой коконов (г=0,19), что позволяет рекомендовать активность данных ферментов в качестве биохимических тестов для раннего прогнозирования продуктивности у гибридов тутового шелкопряда.

4. Воздействие стрессов различной природы снижает как биологические, так и технологические показатели у тутового шелкопряда, при этом наибольшее отрицательное влияние оказывают вирус полиэдроза и сублетальная повышенная температура, которые уменьшают жизнеспособность гусениц, среднюю массу кокона, выход коконов и процент шелковой оболочки в среднем на 63,2; 25,7; 71,8 и 10,1% соответственно, тогда как пониженная температура на 48,0; 13,8; 49,1 и 7,1%.

5.1. Вирусная инфекция у всех изученных пород (за исключением Да-идзо) приводит к появлению белков с высокой молекулярной массой в зоне Ш=0,01; у китайских и японских пород к повышению на 150,0.241,0% белков со средней молекулярной массой в диапазоне Ш=0,35-0,55, у всех пород (за исключением Б-2) снижению белков на 33,3 — 156,2% в зоне Ш=0,25 и полному их отсутствию в зоне 111=0,27.

5.2. Температурные стрессы снижают содержание белков со средней молекулярной массой в диапазоне Ш=0,25-0,45, а также приводят к исчезновению белковых фракций в зоне 1117=0,04 у Даидзо, ШЧ),35 у К-13, Ш=0,45-0,55 у Б-2 и №0,48 у Я-107.

8. Выявлены положительные коэффициенты корреляции между активностью РНК-, ДНК-аз и средней массой коконов (г=0,37-0,59), их выходом с 1 г гусениц (г=0,43-0,63), РНК-азы и процентом шелковой оболочки (г=0,39-0,49), что позволяет использовать активность рибонуклеаз в качестве дополнителыщх критериев при отборе стресс-устойчивых пород тутового шелкопряда.

9. У морфологически неразличимых пород тутового шелкопряда — ПС-5, Б-2 и Н8С-90 выявлены специфичные белковые профили: у Б-2 в зоне рН 5,3 и 5,6 имелись белковые фракции, в то время как у ПС-5, Н8С-90 их не обнаружено; у Б-2, Н8С-90 в зоне рН 7,5 присутствовали белки, в то время как у ПС-5 нет; белковый полиморфизм в зонах рН 5,7, 6,0, 6,5 и 7,1 характерен только для Н8С - 90.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В создании новых пород и гибридов тутового шелкопряда используются методы синтетической и аналитической селекции, путем получения межпородных гибридов от пород далеких по происхождению в генетическом, географическом, социально-культурном, историческом аспектах. В настоящее время в промышленном шелководстве чистопородное разведение тутового шелкопряда не практикуется. Применяются межпородные гибриды первого поколения. Особенностью синтетического этапа селекции высокопродуктивных пород и гибридов тутового шелкопряда является высокий коэфt фициент размножения особей (300-400) и быстрая смена поколений (45-50 дней). Учитывая высокую трудоемкость и материальные затраты классических методов селекции, не позволяющих оставить для дальнейшей аналитической селекции все полученное потомство, важное значение приобретает вопрос о разработке надежных и быстрых в исполнении биохимических тестов прогнозирования продуктивности потомства на эмбриональной стадии развития тутового шелкопряда (стадии яйца).

Первый раздел данной работы посвящен изучению комплекса протео-литических ферментов на ранней стадии эмбрионального развития тутового шелкопряда с целью разработки метода довыкормочного биохимического тестирования гетерозисной силы исходного селекционного материала и отбора наиболее ценных гибридных сочетаний с высокой комбинационной ценностью.

Рядом исследователей (Т.А.Егорова и соавт., 1979; Ю.П. Филиппович и соавт., 1977; A.C. Коничев и соавт., 1978; С.М.Клунова и соавт., 1987) доказана возможность использования показателей о ферментативной активности в тканях и органах личинок (гусениц) и куколок тутового шелкопряда для прогнозирования эффекта гетерозиса у селекционируемого материала.

Однако, интенсивная динамика развития насекомого затрудняет, во-первых, получение сопоставимых стабильных данных ферментативной активности в его тканях и органах, а во-вторых, не дает существенной эконос мии времени и средств при проведении экспериментальных выкормок, поскольку большая часть затрат, ко времени приведения биохимических анализов, уже произведена.

В то время как показатели ферментативной активности зародыша в яйце на соответствующих стадиях его развития обычно стабильны, сопоставимы, и, в силу особенностей развития зародыша, могут быть получены в произвольное время и мало зависят от условий внешней среды — все это создает условия для получения объективных результатов исследовании. Такой подход позволяет решить,один из важных вопросов практической селекции — браковать большую часть исходного селекционного материала до начала его выращивания - на стадии яйца, что значительно ускоряет и удешевляет селекционный процесс.

В наших исследованиях проведены опыты по изучению сопряженности протеолитической ферментативной активности тканей зародыша с их полезно-хозяйственными показателями на экспериментальных выкормках на четырех породах: Кавказ-1 (К-1), Белококонная-1 (Б-1), Шелковистая-4 (Ш-4), Мзиури-2 (Мз-2) и их гибридах - К-1 х Ш-4, К-1 х Мз-2, Б-1 х Ш-4, Ш-4 х К-1, Мз-2 х К-1, Ш-4 х Б-1. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что активность папаиноподобных протеиназ с оптимумами рН 3,0; 3,6; 6,2 и 8,6, а также активность трипсиноподобных и химотрипсиноподобных протеиназ с оптимумами рН 7,2 и 9,0 в 9-ти суточной грене может быть использована в качестве биохимических тестов для раннего прогнозирования потенциальной продуктивности тутового шелкопряда, а также проявления гетерозиса у гибридов. Это позволяет отобрать наиболее перспективные для использования в селекционном процессе без проведения экспериментальной выкормки и оценки продуктивных показателей. Экономия средств в проведенном эксперименте составила 504 тыс. рублей.

На основе полученных результатов, оценки их экономической эффективности, сделанных выводов для практического использования предлагается «Метод биохимической диагностики гетерозисной силы исходного селекционного материала на ранних стадиях эмбриогенеза тутового шелкопряда».

При рассмотрении влияния стрессов различной природы на продуктивность тутового шелкопряда, белковый спектр и активность рибонуклеаз гемолимфы установили, что основными стресс-факторами, оказывающими влияние на продуктивность тутового шелкопряда, являются инфекции и температура окружающей среды.

Достаточно хорошо изучено влияние стрессов на биологические и технологические показатели у тутового шелкопряда (В.А.Головко и соавт., 1993; В.Г.Шахбазов и соавт., 1996; О.А.Шаламова, 1997). Авторами выявлено, что наибольшее отрицательное влияние оказывает вирус полиэдроза, далее, по степени нежелательного влияния следуют температурные стрессы. Эти неблагоприятные факторы значительно снижают жизнеспособность гусениц, среднюю массу кокона, выход коконов и процент шелковой оболочки.

Поскольку, как отмечалось выше инфекции (вирус ядерного полиэдроза, пебирина), температурные стрессы сказывавались на белковом спектры « гемолимфы и активности рибонуклеаз, то нас интересовали их изменения, как в качественном, так и в количественном распределении белковых фракций в гемолимфе тутового шелкопряда под воздействием неблагоприятных стресс-факторов у различных пород.

В проведенных исследованиях установлено, что у большинства пород вирусная инфекция приводила к появлению белков с высокой молекулярной массой в зоне Ш=0,01, со средней молекулярной массой в диапазоне Ш=0,35-0,55, к снижению белков в зоне Ш=0,25 и полному их отсутствию в зоне №0,27.

Температурные стрессы снижали содержание белков со средней молекулярной массой в диапазоне ЩИ),25-0,45, вплоть до их исчезновения у пород Даидзо в зоне №0,04, К-13 в зоне №0,35, Б-2 - №0,45-0,55 и у Я-107 -№0,48.

Что касается активности рибонуклеаз, то оказалось, что вирусная инфекция приводит к повышению активности РНК- и ДНК-аз соответственно в 3,7-4,1 и 2,1-2,5 раза, в то время как воздействие температур — к их снижению на 12,4-41,6% и 3,4-34,2% (Р<0,05; 0,01).

Проведенные исследования позволяют выявить закономерность — большую адаптационную пластичность при вирусной инфекции проявляют породы с более значительной активацией РНК- и ДНК-ферментов (К-13, Да-идзо), а при температурных воздействиях - породы, с наименьшим снижением активности рибонуклеаз (Б-2, Даидзо, К-13).

Выявленные закономерности использованы при разработке «Метода тестирования адаптационных способностей пород тутового шелкопряда на основе сопоставления спектров растворимых белков тканей организма и активности рибонуклеаз».

Без наличия достаточно обширной коллекции пород тутового шелкопряда не мыслимо создание исходного гибридного материала для отбора перспективных линий, семей - кандидатов породы, поэтому вопросам идентификации пород уделяется большое внимание

Содержание живой коллекции пород тутового шелкопряда требует ежегодных Значительных средств для проведения оградительной и поддерживающей селекции, обеспечивающей чистоту и специфичность пород, популяций тутового шелкопряда.

Поскольку тутовый шелкопряд отличается высоким коэффициентом размножения и быстрой сменой поколений, то тщательность и интенсивность выбраковки полученного потомства - важнейший селекционный прием, однако в этих условиях возможен дрейф пород и потеря породных качеств.

Основанием для идентификации особей служат морфологические, онтогенетические и полезно-хозяйственные признаки разводимых пород. Последние изменчивы в зависимости от условий выкормки и кормовых достоинств листа и поэтому не всегда могут служить отличительным породным признаком.

Выше изложенное послужило основанием для поиска физиолого-биохимических маркеров, обладающих высокой информативностью при идентификации трудно различимых по классическим критериям пород тутового шелкопряда ПС-5, Н8С-90, Б-2. Методом выделения растворимых белков грены с последующим их электрофоретическим изоэлектрофокусирова-нием в различных диапазонах РН выявлен достаточно широкий белковый полиморфизм.

У породы Б-2 в зоне рН 5,3 и 5,6 установлены специфичные белковые профили, в то время как у пород ПС-5, Н8С-90 их не обнаружено. У пород Б-2, Н8С-90 в зоне рН 7,5 присутствовали белки, в то время как у ПС-5 их наличие не установлено. Белковый полиморфизм в зонах рН 5,7, 6,0, 6,5 и 7,1 характерен только для породы Н8С — 90. Наиболее полиморфной оказалась порода Н8С-90 - 18 белковых фракций, наименьший полиморфизм характерен для породы ПС-5 - 13 белковых вариантов.

На основе полученных результатов разработан «Метод идентификации пород тутового шелкопряда по наборам растворимых белков грены».

101

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Богословский, Василий Васильевич, Ставрополь

1. .Айала, Ф. Введение в популяционную и эволюционную генетику / Ф.Айала М.: Мир, 1984. - 232 с.

2. Айала, Ф. Современная генетика. Т.1. / Ф.Айала, Дж. Кайгер — М.: Мир. 1987.

3. Аксенов, С.И. О пределах адаптации жизни к экстремальным условиям (в связи с задачами экзобиологии) / Проблемы космической биологии. М.: Наука, 1972. - Т. 19. - С. 7-98.

4. Активность тирозингидроксилазы у контрастных по реакции на стресс линий БгоБорЫк уптИэ и их гибридов / И.Ю. Раушенбах, Т.М. Хлебодарова, Л.В. Шумная и др. // генетика. 1995. - Т. 31. - №3. -С. 353357.

5. Акименко, Л.М. Отбор высокожизнеспособных семей по чувствительности гусениц к низким температурам / Л.М.Акименко,

6. A.З.Злотин, М.Е.Браславский // Шелк. 1977. - № 4. - С. 11-12.

7. Александров, В.Я. Клетки, макромолекулы, температура /

8. B.Я.Александров. Л.: Наука. - 1975. - 330 с.

9. Алиева, А.И. Белки гемолимфы тутового шелкопряда и их роль в процессах жизнедеятельности: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М. 1967. -21с. .

10. Алтухов, Ю.П. Исследование генотипической обусловленности индивидуальной изменчивости теплоустойчивости изолированных клеток / Ю.П.Алтухов, Э.В.Ратькин // Цитология. 1968. - Т. 10. - № 12. - С. 15461554.

11. Алтухов, Ю.П. Биохимическая генетика популяций и эволюция / Ю.П. Алтухов // Молекулярные механизмы генетических процессов. — М.: Наука, 1982.-90 с.

12. Алтухов, Ю.П. Положительная корреляция между уровнем индивидуальной гетерозиготности и способностью к полному термическомупартекинезу у тутового шелкопряда / ТО.П. Алтухов, В.В.Клименко // Докл: АН СССР. 1978. - Т. 239: - № 2. - С. 460-462.

13. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях / Ю.П. Алтухов М.: Академкнига, 2003. - 431 с.

14. Андронников, В.Б., Терморезистентность клеток пойкилотермных животных;и ее изменение-при тепловом отборе гамет: Автореф. дис. . докт. биол. наук: 03.00.17/ Ии-т цитологии АН СССР. Л, 1989. - 41 с.

15. Астауров, Б:Л: Искусственный партогенез у тутового шелкопряда (Экспериментальное * исследование) / Б.Л.Астауров. MI-Л; : Изд-во АН>СССР, 1940.-240 с.

16. Баганич, Mi И. Влияние фототермических воздействий на развитие тутового шелкопряда: Автореф. дис. канд. биол. наук: Ин-т зоологии АН УССР.-Киев, 1964.- 16 с.

17. Белковые фракции- тутового^ шелкопряда в онтогенезе и при различных физиологических состояниях / Ю.Б. Филиппович, С.М.Клунова, Н.И.Морозова и др. / В. сб. тр. МГПИ им. В.И. Ленина: Биохимия насекомых. -1974.-Вып. 16.-С. 91-100.

18. Белов, П.Ф. Оценка адаптивности пород и гибридов? тутового; шелкопряда к условиям' разносезонного червокормления при государственном испытании // Шелк. — 1984: № 6. - О. 14-15.

19. Берг, PJL Типы, полиморфизма- // Вестник Ленинградского* ун-та. Серия биологическая. 1957.-Вып. 4. - №21. - С. 115-139:

20. Бочкова, А.П. Характеристика' дезоксирибонуклеаз яиц коконопрядущих насекомых: Дисс. . канд. биол. наук. -М. 1982. 194 с.

21. Вашон, Ml Диск-электрофорез гемолимфы биохимический критерий; для систематики скорпионов < / М.Вашон, Ж. Лам и, М.Гауффон // Эволюционная биохимия и физиология. — 1972. —№1. - С. 241

22. Вербицкая^ F.A. Выведение желтухоустойчивых линий тутового шелкопряда способом тепловой обработки гусениц / Г.А.Вербицкая // Шелк. 1971. - № 1. — С.24-26.

23. Винокуров;. К.С. Организация протеолиза в средней кишке насекомых: Автореф. дисс. канд. биол. наук: М;, 2003. - 24 с.

24. Водолеев, A.C. Рибонуклеазная. активность в субклеточных фракциях развивающейся; грены тутового шелкопряда^ J A.C. Водолеев^ A.C. Коничев Г.А. Севастьянова, Ю.Б. Филиппович // Научн. докл. высш. шк., сер. Биол. науки.-1977.-№11.-С. 139;

25. Волкова, Р.И. Эстеразы тканей насекомых: множественные молекулярные формы; ингибиторная специфичность и стереоспецифичность /Р.И.Волкова, Э.В. Титова, Т.Н. Ножко// Сб. тр. IX съездаВсесоюз. энтомол. о-ва. Киев: Наук, думка. 1984; - Т. I. - 95 с.

26. Галанова, Т.Ф. Изучение ферментов у непарного шелкопряда из различных географических зон СССР / Т.Ф. Галанова, В.А. Кобылин // Сб. тр. IX съезда Всесоюз. энтомол. о-ва. — Киев: Наук, думка. 1984. — С.100.

27. Генетический анализ различий в активности щелочной фосфатазы у двух линий Drosophila virilis, различающихся реакций на тепловой стресс / М. Суханова, Л.Г. Гренбэк, Т.М. Хлебодарова и др. // Генетика. — 1996. — Т. 32. -№1.-С. 62-72.

28. Генералова, М.В. Определение летальной дозы у гомо- и гетерозигот по доминантной летальной холодочувствительной мутации Dr. Melanogaster при пермиссивной температуре / М.В. Генералова, E.H. Мясникина // Генетика. 1986. - Т. 22. - №2. - С. 262-267.

29. Гершензон, С.М. Генетический полиморфизм в популяциях животных и его эволюционное значение /С.М.Гершензон // Общая биология. 1974. - XXXV, № 5. - С. 678-682

30. Глазко, В.И. Белковый полиморфизм при искусственном и естественном отборе / В.И. Глазко // Докл. ВАСХНИЛ, 1987. № 3. - С. 2224.

31. Глотов, Н.В. Генетическая гетерогенность природных популяций по количественным признакам: Автореф. дис. . докт. биол. наук.: 03.00.15 ЛГУ.-Л, 1983.-33 с.

32. Головко, В.А. Желтухоустойчивость партеноклонов и гибридов тутового шелкопряда / Головко В.А, Кириченко И.А., Клименко В.В. // Мат. научн.-практич. конф.: Проблемные вопросы развития шелководства. -Харьков, 1993.-С. 146-150.

33. Головко, В.А. Инфекционные болезни тутового шелкопряда в шелководческих регионах мира / В.А. Головко, И.А. Кириченко // Мат. научн.-практич. конф.: Проблемные вопросы развития шелководства. — Харьков; 1993. С.121-125.

34. Головко, В.А. Устойчивость партеноклонов и гибридов тутового шелкопряда к провокации ядерного полиэдроза тепловым шоком / Головко

35. В.А, Кириченко И.А., Клименко В.В. // Мат. научн.-практич. конф.: Проблемные вопросы развития шелководства. — Харьков, 1993. — С.140-144.

36. Толовко, В.А. Характеристика факторов иммунитета у гусениц тутового шелкопряда / В.А. Головко, Ю.Л. Волянский, Н.В. Васильев и др. // Мат. научн.-практич. конф.: Проблемные вопросы развития шелководства. — Харьков, 1993. -С.118-121.

37. Головко, В.А. Пути повышения резистентности тутового * шелкопряда к болезням и неблагоприятным факторам среды / В.А. Головко. — УААН. Изд-во Института шелководства. — Харьков. — 1995. 174 с.

38. Головко, В.А. Об устойчивости тутового и дубового шелкопряда к болезням / В.А. Головко // Мат. научн.-практич. конф.: Проблемы и перспективы паразитоценологии. — Харьков-Луганск, 1997. С.52-53.

39. Гроссман, А.И. Изменчивость локуса алкогольдегидрогеназы в природных популяциях Drosophila melanogaster / А.И. Гроссман, Л.Г. Коренева, Л.Е. Улицкая // Генетика. 1970. - Т 6. - № 2. - С. 91-97.

40. Густелева, Л.А. Оптимизация лабораторного воспитания личинок большого лиственного короеда Ips subnelongatus Nosch. (Coleóptera, Ipidae) на исскуственной среде // Энтомол. обозрение. 1979. — Т. 58. - № 2. - С. 240243.

41. Жученко, A.A. Рекомбинация в эволюции и селекции /i

42. А.А.Жученко, А.Е.Король. М.: Наука, 1985. - 400 с.

43. Егорова, Т.А. Изучение активности некоторых ферментов гемолимфы и грены у родительских пород и гибридов тутового шелкопряда / Т.А. Егорова, В.И. Остапенко, Ю.Б. Филиппович // Биохимия насекомых. — М.: МГПИ. 1977. - Вып. 19. - С. 29-35.

44. Егорова, Т.А. О путях и методах повышения продуктивности тутового шелкопряда / Т.А. Егорова, Т.М. Санкина, Ю.Б. Филиппович, У.Н. Насириллаев // Биохимия насекомых. М.: МГПИ. - 1977. — Вып. 19. - С. 38.

45. Егорова, Т.А. О возможности использования эстеразного теста для целей генетической экспертизы / Т.А. Егорова, JI.E. Васильева, У.Н. Насириллаев // Сб. тр. МГПИ им. В.И. Ленина: Биохимия насекомых. 1978. - Вып. 20. - С. 69-76.

46. Егорова, Т.А. Эстераза в качестве маркера при использовании родительских пар скрещивания в шелководстве / Т.А. Егорова, Е.А. Налетова, Б. Кенжаев // Шелк. 1979. - №6. - С. 8-10.

47. Егорова, Т.А. О перспективах использования эстераз в селекции тутового шелкопряда / Т.А. Егорова, Е.А. Налетова, Н.В. Шуршикова, У.Н. Насириллаев // Сб. тр. МГПИ им. В.И. Ленина: Биохимия насекомых. — 1980. -Вып. 22.-С. 76-82.

48. Егорова, Т.А. Ферментные системы тканей тутового шелкопряда Bombyx mori / в теоретическом и прикладном аспектах: Дисс. . док. биол. наук. М., 1983.-422 с.

49. Жебровский, Л.С. Использование полиморфизма белковых систем в селекции / Л.С.Жебровский, В.Е. Митютко. Л.: Колос, 1979. - 184 с.

50. Желтухоустойчивость партеноклонов и гибридов тутового шелкопряда / В.А.Головко, И.А.Клименко, В.В.Клименко и др // Мат. научн.-практич. конф.: Проблемные вопросы развития шелководства. — Харьков, 1993. С.146-150.

51. Зацепина, О.Г. Изучение комбинированного действия стероидных гормонов и теплового шока на клетки высших организмов: Автореф. дис.канд. биол. наук./ Инст-т молекуляр. биологии АН СССР. М., 1991. — 22с.

52. Захаров, В.М. Анализ стабильности индивидуального развития как метод определения оптимальных условий развития / В.М. Захаров // ДАН СССР. 1982. - Т. 267. - №4. - С. 1016-1018.

53. Захаров, В.М. Влияние температуры на стабильность развития линий " шелкопряда (Bombyx mory L), различающихся по уровнюгетерозиготности / В.М. Захаров, В.Д. Щепоткин // Генетика. 1995. — Т. 31. -№9.-С. 1254-1260.

54. Иванов, В.Г. Белковый комплекс и протеолитические ферменты желточного содержимого грены тутового шелкопряда Bombyx morí L.: Дис. . канд. биол. наук. М. 1985. — 179 с.

55. Иобашвили, М.Е. К вопросу изучения связи между жизнеспособностью и количеством макронуклеоцитов в гемолимфе тутового шелкопряда / М.Е.Иобашвили // Тр. Тбил. НИИШ. Тбилиси, 1995. — С. 2328.

56. Бондаренко, Е.Ф. Испытание метода прогностической инкубации грены для анализа кладок по жизнеспособности гусениц / Е.Ф.Бондаренко, В.Г.Шахбазов, А.П.Попель, Л.М.Чечель // Шелководство. 1976. - С. 72 — 75.

57. Кирпичников, B.C. Генетические механизмы эволюции и гетерозиса / B.C. Кирпичников // Генетика. 1974. - Т 10. - № 4. - С . 165-179.

58. Клименко, В.В. Температурный контроль степени проявления морфологического признака в партеноклонах тутового шелкопряда / В.В.Клименок, Л.И.Воробьева, В.Г.Шахбазов// ДАН СССР. 1980. - Т.252. -№ 3. - С.732-735.

59. Клунова, С.М. Внутриклеточный протеолиз и его, регуляция унасекомых / С.М. Клунова, Д.В. Ярыгин М.: МГПИ, - 2001. - 104 с.

60. Конарев, В:Г. Биохимические и биофизические методы? определения нуклеиновых кислот в растениях / В.Г. Конарев, С.Л. Тютерев — М.: Колос. — 1972: •

61. Конарев, В.Г. Биохимические и молекулярно-генетические аспекты гетерозиса / В.Г. Конарев // Вестник с.-х. наук. Л. 1974. - Т 12. - С. 1-10.

62. Конарев, В.Г. Гетерозис и его проявление по данным, биохимии в популяционной генетики / В.Г.Конарев, Ш.Я.Гилязетдииов, Р.Р. Ахметов // Сельскохозяйственная биология: 1981. - Т. 16. - №31- С 380-386;

63. Коничев, A.C. Рибонуклеазная активность в грене родительских пород и гетерозисных гибридов тутового шелкопряда / A.C. Коничев, A.C. Водолеев^ Г.А. Севастьянова, Ю.Б. Филиппович // Биохимия насекомых. М.: МГПИ. 1979. - Вып. 21.-С. 20-25.

64. Коничев, A.C. Физико-химическая; и функциональная характеристика множественных форм ферментов насекомых: Автореф. дисс. . докт. биол. наук. М., 1991. -48 с.

65. Корочкин, Л.И. Выделение изоферментов эстераз у гибридов Drosophila группы virilis / Л.И.Корочкин, Н.В.Матвеев, М.Б.Евгеньев // Генетика,- 1973.-№12.-С. 55.

66. Корочкин, Л.И. Введение в генетику развития / Л.И.Корочкин — М.: Наука, 1999;-253 с.

67. Майр, Э. Популяции; виды и эволюция / Э. Майр. М.: Мир. - 1974. -460 с. .

68. Майр, Э. Эволюция / Э. Майр. М.: Мир. - 1981.

69. Мамметкулиев, Б. Применение метода раннего прогноза жизнеспособности тутового шелкопряда в селекционной работе / Б.Мамметкулиев / Некоторые вопросы развития шелководства в Туркменистане. Ашхабад: Ылым, 1975. - С. 50 - 90.

70. Машуров, А.М. Генетические маркеры в селекции животных: Автореф. дис. . докт. биол. наук. М. — 1981. 53 с.

71. Меркурьева, Е.К. Генетика с основами биометрии / Е.К. Меркурьева, Г.М. Шангин-Березовский М.: Колос, 1983. - С. 11-28.

72. Минина, Н.И. Молекулярные формы лейцинаминопептидазы, аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы в тканях и органах тутового шелкопряда / Н.И. Минина, С.Н. Клунова, Ю.Б. Филиппович // Уч. Зап. МГПИ им. В.И. Ленина. 1972. - Вып. 15. - С. 5-22.

73. Минина, Н.И. Формы ферментов в тканях исходных пород тутового шелкопряда и полученного из них гибрида / Н.И.Минина, Ю.Б. Филиппович // Биохимия насекомых. М.: МГПИ им. В.И. Ленина. 1974. - Вып. 17. - С. 5-31.

74. Митохондриальный гетерозис и комплементация у гибридов с различным типом цитоплазмы / З.И.Лосева, Э.И.Вахрушева, Н.С.Фомченко и др. // Гетерозис (теория и практика): Мат. конференции (Харьков, 28-29 января 1988 г.). Харьков, 1988. - С. 72-73.

75. Михайлов, E.H. Грена / E.H. Михайлов Ташкент: Госиздат. - 1953. -155 с.

76. Михайлов, E.H. Новое в преобразовании секрета шелкоотделительной железы в шелковину (обзор проведенных исследований и точек зрения на процесс) / E.H. Михайлов // Шелк. 1988. - №1. - С. 9-13.

77. Налетова, Е.А. Изучение полиморфизма некоторых ферментов у различных пород тутового шелкопряда / Е.А. Налетова, Т.А. Егорова, У.Н. Насирилаев, Г.И. Ушакова // Биологические науки. — 1978. — №1. С. 38-42.

78. Насонов, Д.Н. Реакция живого вещества на внешние воздействия / Д.Н. Насонов, В.Я. Александров. М. - Л.: АН СССР, 1940. - 252 с.

79. Остапенко, В.И. Полиморфизм амилазы и гликогенфосфорилазы у родительских пород и гибридов тутового шелкопряда / В.И. Остапенко, Т.А. Егорова, Ю.Б. Филиппович // Шелк. 1974. - №4. - С. 9-11.

80. Пашкова, И.М. Изменение отцовской и материнской доли в наследуемости теплоустойчивости организма и мышц водяного ослика притепловой акклиматизации / И.М.Пашкова // Цитологии. — 1978. — Т.20. — № 10.-С. 1197-1002.

81. Петухов, В.Л. Генетические основы селекции животных / В.Л.Петухов. М.: Агропромиздат, 1989. - 448 с.

82. Полиморфизм природных популяций Бг. ше1апо§аз1ег по уровню метаболизма ювенильного гормона и реакция на тепловой стресс / Н.Е. Грунтенко, Е.М. Хлебодарова, Л.Г. Гренбэк и др. // Генетика. 1995. — Т. 31. - №4. - С. 657-666.

83. Практичний пос1бник по шовювництву / ГО.Кириченко, Г.Д.Тарасов, Б.Ф.Пилипенко, М.Ю.Браславский. К.: Урожай, 1991. 140 с.

84. Проблемы неспецифической устойчивости тутового шелкопряда (Физиологические, генетические, иммунологические и микробиологические аспекты) / В.А. Головко, Ю.Л. Волянский, В.Г. Шахбазов и др. — Харьков: РИН "Оригинал", 1996. 236 с.

85. Ратькин, Э.В. Исследование изменчивости яиц тутового шелкопряда по их способности к термическому партогенезу.: Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.15 / Ин-т биологии развития АН СССР. М., 1973. - 32 с.

86. Реймерс, Н.Ф. Популярный биологический словарь / Н.Ф. Реймерс. М.: Наука, 1991.-544 с.

87. Родина, Е.Ю. Обмен нуклеиновых кислот в грене пород и гибридов тутового шелкопряда в эмбриогенезе: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М. — 1988.- 15 с.

88. Росин, В.Я. Регуляция функций / В.Я. Росин. М.: Наука, 1984. -176 с.

89. Рославцева, С.А. Активность эстераз у различных насекомых / С.А. Рославцева // Энтомологическое обозрение. 1971. - Вып. 1. - С. 32.

90. Рославцева, С.А. О резистентности обыкновенного паутинного клеща к ортену / С.А. Рославцева, Т.А. Спирина // Химия в сельском хозяйстве. 1978. -№3. - С. 69-71.

91. Селье, Г. Очерки об адаптивном синдроме / Г. Селье — М.: Медгиз, 1960.-254 с.

92. Севастьянова, Г.А. Структура генома тутового шелкопряда (теоретический и прикладной аспект): монография. / Г.А. Севастьянова М.: МГПИ.-2001.-91 с.

93. Созинов, A.A. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции / А.А.Созинов. -М.: Наука, 1985. 272 с.

94. Соколов, Г.И. Черно-пятнистая форма ложногусеницы большого березового пилильщика (Cimbex femorata) в Челябинской области / Г.И. Соколов, Н.И. Ковалевская // Зоологический ж. 1980. - Т 59. - №10. - С. 1581-1584.

95. Сривастава, Х.К. Гетерозис и межгеномная комплементация:-митохондрия, хлоропласт и ядро / Х.К. Сривастава / Гетерозис. М.: Агропромиздат, 1987. С. 317-347.

96. Струнников, В.А. Отбор по жизнеспособности, определяемый степеныб устойчивости яиц тутового шелкопряда к неблагоприятнымвоздействиям / В.А.Струнников // Труды САНИИШ. — Ташкент, 1965. С. 42-60.

97. Струнников, В.А. Генетические основы гетерозиса и комбинационной способности у тутового шелкопряда / В.А.Струнников // Генетику. 1986. - Т. 22. - №2. - С. 229-243.

98. Струнников, В.А. Генетические методы селекции и регуляции пола у тутового шелкопряда / В.А.Струнников — М.: Агропромиздат, 1987. — 327 с.

99. Струнников, В.А. Природа гетерозиса и новые методов его повышения / В.А.Струнников. М.: Наука, 19941 - 108 с.

100. Турбин, Н.В. Гетерозис и рекуррентный отбор / Н.В. Турбин, JI.B. Хотылева, Л.И. Калинская // Гетерозис. Минск: Наука и техника. 1982. - С. 39-62.

101. Урванцева, Г.А. Изучение белков гемолимфы личинок некоторых видов стрекоз методом электрофореза в полиакриламидном геле. / Г.А. Урванцева, Н.Б. Жохова Рукопись деп. в ВИНИТИ. - 17 марта 1980.

102. Ушаков, Б.П. Изменение теплоустойчивости организма и мышечной ткани головастиков лягушек при тепловой акклиматизации как стабилизирующая адаптация / Б.П.Ушаков, И.М.Пашков, И.С.Чернокожева // ДАН СССР. 1972. - Т. 203. - № 4. - С. 935-938.

103. Ушаков, Б.П. Физиологический анализ изменения приспособленности особей в. онтогенезе и селективного преимущества гетерозигот / Б.П.Ушаков // Журнал общей биологии. 1982. - Т. 93. - № 2. -С. 302-319.

104. Ушаков, Б.П. Эволюционное значение температурных адаптаций животных / Б.П.Ушаков // Успехи современной биологии. — 1984. Т. 45. - № 5.-С. 602-614.

105. Филиппович, Ю.Б. Исследование растворимых белков; тканей тутового шелкопряда методом электрофореза в полиакриламидном геле / Ю.Б. Филиппович, Л.И. Щеголева // Доклады АН СССР. 1967. - Т 174. -№1. - С. 240-242.

106. Филиппович, Ю.Б. Множественные формы ферментов насекомых и проблемы сельскохозяйственной энтомологии. / Ю.Б. Филиппович, A.C. Коничев -М.: Наука. 1987. - 167 с.

107. Филиппович, Ю.Б. Основы биохимии тутового шелкопряда. / Ю.Б. Филиппович, В.И. Лаптева, И.Л. Никитина М.: Прометей. - 1992. - Т 9. - С. 126-139.

108. Финчем, Дж. Генетическая комплементация. / Дж. Финчем. М.: Мир.- 1968.-184 с.

109. Характеристика факторов иммунитета у гусениц у гусениц тутового шелкопряда / В.А.Головко, Ю.Л. Волянский, Н.В.Васильев и др. // Мат. научн.-практич. конф.: Проблемные вопросы развития шелководства. — Харьков, 1993.-С. 118-121.

110. Шаламова, O.A. Генетичш вщмшност1 порщ i пбрщцв шовковичного шовкопряда в реакцп на терм1чш впливи: Автореф. дис. канд. б1ол. Наук. 03.00.15./ Харювський державний ушверситет. — Харюв., 1997.- 19 с.

111. Шахбазов, В.Г. Гетерозис и теплоустойчивость / В.Г.Шахбазов // Бюл. Моск. общ-ва испытателей природы. Отд. биол. 1966 б. - Т.71. — № 6. -С. 120-127.

112. Шахбазов, В.Г. Физиологические и биохимические проявления *гетерозиса и инбредной депрессии у животных и растений // Гетерозис в животноводстве. Л.: Колос. 1968. -263 с.

113. Шахбазов, В.Г. Динамический аспект изучения природы гетерозиса / В.Г. Шахбазов // Селекция и семеноводство. 1989. — Вып. 67. — С. 64-67.

114. Шахбазов, В.Г. Нова генетична гшотеза на ochobI бюф1зичних дослццв // Оргашзм як система Ким1в. - 1996 а. — С. 98-106.

115. Шкаруба, Н.Г. Возможности повышения продуктивности выкормок шелкопряда с помощью некоторых стимуляторов / Н.Г. Шкаруба // Мат. научн.-практич. конф.: Проблемные вопросы развития шелководства. -Харьков, 1993. С.194-197.

116. Ярыгин, Д.В. Изучение комплекса протеолитических ферментов и белковых ингибиторов в грене тутового шелкопряда: Автореф. канд. . биол. наук. М. МГПУ, 2000. - 16 с.

117. Ahmad S. Larval and adult housefly carboxylesterase: isozymic composition and tissue pattern 11 Insect Biochem. 1976 - V.6. — N5. - P. 541547.

118. Adams C., Rinne R.W. Stress proteins formation: gene expression and environment ineraction with evolutionary significance // Intern. Rev, Cytol. — 1982.-Vol. 79.-P. 305-315.

119. Ayala F.J. Genetic variation in natural populations of five Drosophila species and the hypothesis of the selective neutrality of protein polymorphism // Genetics. 1974. -V. 77. - P. 343-384.

120. Ayala F.J. Genetic variation in natural populations of five Drosophila species and the hypotesis of the selective neutrality of protein polymorphism // Genetics. 1974. -V. 77. - P. 343-384/

121. Ayala F.J., Powell J.B. Enzyme variability in Drosophila willistoni group VI. Levels of polymorphism and the physiological function of enzymes // Biochem? Genet. 1972. -V. 7. -N4. - P. 331-338.

122. Badino G., Celebrano G., Minino A., Ifantidis M. Allosyme variability in Greek honey bees (Apis mellifera) // Apidologie. 1988. -V. 19 - N4. - P. 377386.

123. Baker J.E. Amilase / proteinase ratios in larval midgets of ten stored-product insects //Entomol. exp. et appl. 1986. -V. 40. -Nl. - P. 41-46.

124. Band H.T., Band R.N. Amino acid and allozyme frequency changes in overwintering Chymomyza amoena // Experientia. 1987. - V. 43. - N9. - P. 1027-1029.

125. Beckman L., Johnson F.M. Variation in larval alkaline phosphatase controlled by Aph alleles in Drosophila melanogaster // Genetics. — 1964. — V. 49. -N5.-P. 829-833.

126. Berger E. Esterase of Drosophila II. Biochemical studies of esterases 5 in D. pseudoobscura // Genetics. 1974. - V. 78. - P. 1157-1172.

127. Berger E. Heterosis and maintenance of enzyme polymorphism // American Naturalist. 1976. - V. 110. - N975. - P. 823-839.

128. Bums J.M., Jonson F.M. Esterase polymorphism in the butterfly Hemiargus isola: stability in a variable environment // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -V. 68.-N l.-P. 34.

129. Cao G., Lu W., Long S. Studies on comparison of esterase isozyme of different species of Trichogramma // Collog. INRA. 1988. - N43. - P. 35-44.

130. Dobzhanski Th. Nature and origin of heterosis // Heterosis. Iowa State College Press, Ames. 1952. - P. 218-228.

131. Dobzhansky Th., Levontin R.S., Pavelosky O. The capacity for in crease in chromosomally polymorphic and monomorphik population of Drosophila pseudoobscura // Heredity. 1964. - Vol. 19. - P. 597-614.

132. Dobzhanski Th. Genetics of the evolutionary process. Columbia Univ. Press. N. Y. - 1970. - 505 p.

133. Doira H. Development and sexual differences of blood proteins in the silkworm Bombyx mori L. // Sci. Bull. Fas. Agric. Kyushu Univ., 1968. N 4. - P. 205.

134. East E.M. Heterosis // Genetics. 1936. - V. 21. - N4. - P. 375-397.

135. Eguchi M. Changes in phosphatase zymograms in the silkworm Bombyx mori L. during development // Bull. Fac. Text Fibers. 1965. - V.4. -N 3, P. 351.

136. Eguchi M., Yoshitake N. Genetic studies on isozymes of the integument esterase in the silkworm Bombyx mori L. // J. Japan Genetics. — 1966. N 4. - P. 267.

137. Evans P.R., Bowler K. Thermal death and the denaturation of proteins // Sub.-Cell. Biochem. 1973. - Vol.2. - P. 91-95.

138. Ford E.B. Polymorphism // Biol. Rev. 1945. - V. 20. - P. 73-88.

139. Goyffon M., Stockmann R., Lamy J. Valeur taxonimigue de l'electrophorese en disques des proteins de l'hemolimphe chez le scorpion : etude du genre Buthotus (Buthidae) // C.r. Acad. Sci. 1973. -D 277.- N 1. - P. 61.

140. Haldene J.B.S. The biochemistry of genetics. L.: Allen and Unwin, 1954. -144 p.

141. Huettel M.D. Monitoring the quality of laboratory reared insects: a biological and bhetvioral perspective // Envirom. Entomol. — 1976. Vol. 5. — P. 807-814.

142. Hubby J.L., Lewontin R.C. A molecular approach to the study of genus heterozygostiy in natural populations. I. The number of alleles at different loci in Drosophila pseudoobscura // Genetics. 1966. - V. 54. - N6. - P. 577-594.

143. Johnson G.B. Enzyme polymorphism and metabolism // Science. 1974. -V. 184.- N4132.-P. 28-37.

144. Канарев, Г. Възможности за прогнозироване жизнеността на бубите чрез анализ на хемолимфата им / Г.Канарев // Научн. тр. ВСИ «В.Коларов. -Пловдив. 1980. - Т.25. - С. 89-96.

145. Kageyama Т., Takahahi S.V., Takahahi К. Occurance of tiol proteinases in the eggs of the silkworm Bombyx mori L. // J. Biochem — 1981. — V. N 3. — P. 665-671.«

146. Kimura M., Ohta T. Protein polymorphism as a phase of molecular evolution//Nature, 1971. -V. 229. -№ 5285.

147. Kobara R. Watanobe H. Agarose-gel electrophoresis of haemolymph protein in the silkworm Bombyx mori L. // J. Ser. Sci. Japan, 1969. V. 38. - № 5, P. 386.

148. Kofatos F.S., Williams C.M. Enzimatic mechanism for the escape of certain moths from their cocoons // Science. 1964. - V. 146. — N 3643. - P. 538540.

149. Lees J.H., Ward R.D. Genetic variation and biochemical systematics of British Nemouridae // Biochem. Syst. And Ecol. 1987. - V. 15. - N1*. - P. 117125.

150. Liu X.D., McCarton R.C., Nordin J.H. A cysteine protease that processes insect vitellin-purification and partial characterization- of the enzyme and the proenzyme// J. Biol. Chem. 1996. -V. 271. -№ 52. -P. 33344-33351.

151. Manwell C., Baker C.M. Hybrid proteins, heterosis and the origin of species — I. Unusual variation of polychaete Hyalinoecia // Comp. Biochem. And Physiol. 1969. -V. 28. -N3. - P. 1007-1028.

152. Manwell C., Baker C.M. Molecular biology and the origin of species : heterosis protein polymorphism and animal breeding // Brit. Nat. Bibliogr. — 1970. -P. 21-49.

153. Mckey G. .Genetic and evolutionary principles of heterosis. Heterosis in plant breading. // Proc. 7th Cong. EUCARPIA. Budapest. 1976. - P. 13-33.

154. Mori N., Yamashita O. Purification and characterization of a protease degrading 30 kDa yolk proteins of the silkworm Bombyx mori L. // Insect Biochem. Molec. Biol. 1997. - V. 27. -N 8-9. - P. 721-728.

155. Morohoshi S. The control of growth and development in Bombyx mori. VI. Relative development of male and female moths // Proc. Jap. Akad. 1970. -Vol. 46.-№ 1.-P. 71-76.

156. Nagarajy J., Singh R., Premalftha V. Low temperature induced abdormalites in the silkworm Bombyx mori // Curr. Sci. — 1987. — Vol. 56. № 23.

157. Nei M. Molecular population genetics and evolution, Amsterdam: Noeth-Holland Publ., 1975. - 288 p.

158. Ogita Z. Genetico — biochemical analysis on the enzyme activities krthe housefly by agar gel electrophoresis // Jap. J. Genet. 1962. - V. 37. - N6. - P. 518-521.

159. Palii S.S., Klimenko V.V.' Crossover frequencies in the silkworm Bombyx mori L., are under the influence of stresses experienced in early ontogenesis // Seri-cologia. 1996. - V. 36. - № 3. - P. 423-432.

160. Ross G. C. Bull // Wld. Hlth Org., 1968. -V. 38. № 3. - P. 324.

161. Shiba H., Uchida D., Kobayashi H., Natori M. Involvment of cathepsin B-and L-like proteinases in silk gland histolysis during metamorphosis of Bombyx mori L. // Arch. Biochem. Physiol. 2001'. - V. 182. - P. 880-882.

162. Shull G. Beginning of the heterosis concept // Heterosis. Iowa: State College press. 1952. - P. 15-48.

163. Singh R., Hubby J., Lewontin R.S. Molecular heterosis for heat -sensitive enzyme alleles // Proc. Natl. Acad. Sei. 1974. V. 71. - N6. - P. 18081810.

164. Soul. M. Heterozygosity and developmental stability: another look // Evolution. 1979. - Vol. 33. - P. 396-401.196.*Takahashi S.Y., Yamamoto Y. Activation of the silkworm Bombyx mori //Zool. Sei.- 1993.-V. 10.-N6.-P. 14.

165. Takahashi S.Y., Yamamoto Y., Watabe S., Kageyama T. Autolutic activation mechanism of Bombyx mori acid cysteine proteinase (BCP) // Biochem. Mol. Biol. Int. 1997. - V.42. -N3. -P.561-600.

166. Tanaka Y., Kuseno T., Kobara H., Kawai T. An electrophoretic study on haemolymph amylase in the silkworm Bombyx mori // J. Sericult. Sei. Japan. — 1976. V. 45. - N6. - P. 533-536.

167. Tewari G.C., Pandey N.D. Effect of insecticide-resistance on the tolerance'to variosis anviromentalstress in rice weevil, Sitophilus oryzae Linneus // Bull. Grein. 4. Technol. 1978. - Vol. 16. - № 1. - P.25-28.

168. Tomiuk J., Wöhrmann K. Enzyme polymorphism and taxonomy of aphid species // Z. Zool. Syst. Und Evolutionsforsch. 1983. - V. 21. - N4. - P. 266274.

169. Tomiuk J., Wohrmann K. Enzyme variability in population of aphids // Theor. Appl. Genet. 1980. -V. 57. -Nl. - P. 125-127.

170. Tucic N., Ayala F.I., Marincovic D. Correlation between recombination frequency and fitness in Drosophila melanogaster // Genetica. — 1981. Vol. 56. — № l.-P. 61-69.

171. Wagner R.P., Sellander R.K. Isozymes in insect and their significance // Ann. Rev. Entomol. 1974. - V. 19. - P. 117-138.

172. Veldhuis H. H. W., Asperen K. V. Occurrence and inheritance of esterases in Musca domestica // Ent. Exptl. Appl., 1963, V. 6. № l.-P. 79.

173. Yoshitake N., Akiyama M. Distribution of types, of blood acid-phosphatase in various strains of the silkworm, Bombyx mori L // «J. of Sericult. Sci. Jap, 1965. V. 34. - № 2. - P. 99.

174. Yoshitake N. Origin and differentiation of the silkworm rassen // Japan Agricultural Research Quarterly, 1970. V. 5. - № 4. - P. 38.

Информация о работе

Богословский, Василий Васильевич
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2009
ВАК 06.02.01

Диссертация

Прогнозирование продуктивности, адаптационных способностей пород и гибридов тутового шелкопряда по ферментным системам и белковым спектрам - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы