Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Теоретические и практические аспекты геномики тутового шелкопряда
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Теоретические и практические аспекты геномики тутового шелкопряда"
на правах
СЕВАСТЬЯНОВА Галина Андреевна
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ГЕНОМИКИ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА
Специальность: 03.00.04 - биохимия 03.00.03 - молекулярная биология
Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва - 2006
Работа выполнена на кафедре органической и биологической химии биолого-химического факультета Московского педагогического государственного университета
Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН,
доктор медицинских наук, профессор Корочкин Леонид Иванович
член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Киселев Федор Львович
доктор биологических наук, профессор Носиков Валерий Вячеславович
Ведущая организация: Институт биохимии
им. А.Н.Баха РАН
Защита диссертации состоится «¿/¿РА**»^ 2006 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 212.154.17 при Московском педагогическом государственном университете по адресу: 129164, г.Москва, ул.Кибальчича, дом 6, корпус 5, ауд. 506.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского педагогического государственного университета по адресу: 119992, г.Москва, ул. Малая Пироговская, д.1.
Автореферат разослан «
.2006 г.
Ученый секретарь . ;
Диссертационного совета Холмогорова Н.В.
Актуальность проблемы
Проблема организации и функционирования генетических систем, особенно таких сложноорганизованных как геном эукариот, является в настоящее время одной из центральных в современной биологии. Благодаря применению новых высокоэффективных методов исследования ДНК уже достигнуты значительные успехи в изучении не только структуры и функции генома эукариот в целом, но и тонкой структуры отдельных генов и регуляции их экспрессии.
Насекомые - самый представительный класс животного царства, характеризующийся . исключительным многообразием. Такие насекомые, как дрозофила и тутовый шелкопряд, давно приобрели статус лабораторных животных, использование которых в качестве биологических моделей привело к ряду выдающихся открытий в области структурной организации генома эукариот (Георгиев и др., 2000; Spradling, 1986; Ashburner, 1989; Adams et al., 2000).
Тутовый шелкопряд Bombyx mori L. (отр. Lepidoptera) проходит в своем развитии четыре фазы метаморфоза - яйцо (грена), личинка, куколка, бабочка, что позволяет использовать его в качестве объекта для изучения дифференцировки и морфогенеза. Необходимость всестороннего изучения генома тутового шелкопряда диктуется важностью данного биологического объекта как сельскохозяйственного животного, продуцирующего огромное количество экскретируемого белка. Клетки стенки шелкоотделительной железы обладают колоссальным политенным геномом, включающим в свой состав 5x10* гаплоидных геномов. Задний отдел шелкоотделительной железы тутового шелкопряда вырабатывает 140 мг фиброина в сутки (38x10й молекул в минуту), что не сопоставимо ни с одним изученным в этом аспекте биологическим объектом (Бродский, Нечаева, 1988). Всё это выдвигает тутового шелкопряда в ряд важнейших модельных объектов для биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии (Jean-Pierre Garel, 1982; Филиппович и др., 1992; Корочкин, 2002; Wu, Cao, 2004).
В гаплоидном геноме тутового шелкопряда у дикого типа содержится 27 хромосом, у домашнего типа - 28; большинство из них являются мелкими образованиями, трудно поддающимися генетическому и цитогенетическому анализу (Астауров и др., 1959; Tazima, 1964; Murakami, Imai, 1974). ДНК из семенников тутового шелкопряда характеризуется температурой плавления, равной 69,7°С, что соответствует 38,6% ПД-пар. Масса гаплоидного генома тутового шелкопряда составляет 0,53 пг (Gage, 1974; Gage et al., 1976), и он насчитывает около 700 млн. п.н., 75% которых в настоящее время секвенированы (Koike et al.,2003; Mita et al., 2003; 2004).B геноме тутового шелкопряда 54,7% составляют уникальные последовательности, 20,8% относятся к умеренным повторам и 24,5% - к часто повторяющимся последовательностям (Gage, 1974; Адо, 1986).
Очень важен, но наименее изучен вопрос об изменении генома в процессе онтогенеза тутового шелкопряда. При изучении динамики содержания ДНК в грене тутового шелкопряда в процессе её развития были зафиксированы значительные изменения, отражающие, по-видимому, специфику отдельных
периодов эмбриогенеза насекомого (Коничев, 1974; Родина, 1988). В этой связи определенный интерес представляют данные о степени сблоченности п иримиди новых олигонуклеотидных последовательностей в ДНК грены тутового шелкопряда в процессе её развития. Этот косвенный метод определения первичной структуры ДНК (Мазин, 1972) дает вполне определенную информацию не только о характере распределения пиримидинов в полинуклеотидной цепи ДНК, но и позволяет установить различия в структурной организации ДНК как у далеко-, так и у близкородственных организмов (Критский "и др., 1980). Сравнительная характеристика блочной структуры ДНК у пород и гибридов тутового шелкопряда на стадии яйца представляет несомненный практический интерес, поскольку именно на самых ранних этапах развития организма закладываются будущие основы его продуктивности.
Повторяющиеся последовательности генома эукариот привлекают повышенное внимание в связи с их возможным участием в регуляции генной активности и жизнедеятельности клеток. Из повторяющихся последовательностей генома эукариот следует особо выделить гены рибосомных РНК (р-гены), которые представляют интерес в двух аспектах: с одной стороны они являются удобной моделью для изучения структуры, функции и эволюции мультигенных семейств (Носиков, Брага, 1982) , с .другой стороны, благодаря своей гетерогенности и высокому уровню полиморфизма, могут быть использованы для решения практических задач селекции. Большой интерес представляет определение соотношения в генотипе пород и гетерозисных гибридов р-генов со вставками и без них, так как потенциально это явление может быть связано с предопределением уровня продуктивности пород и гибридов шелкопряда.
Изучение генетического разнообразия, индивидуальности и родства организмов на уровне анализа вариабельности структуры ДНК является одной из актуальных проблем современной биологии. Широкая распространенность М13-минисателлитоа в живой природе, их гипервариабельность, соматическая стабильность и ядерный тип наследования способствовали разработке универсального варианта геномной дактилоскопии для решения фундаментальных и прикладных проблем (Vassart et al,, 1987; Джинчарадзе и др., 1987; Рысков, 1999 ; Рысков и др., 1988). Для тутового шелкопряда важным является выявление гипервариабельных маркерных локусов его генома, общих и специфических для каждой породы, особенностей их проявления у индивидуумов, в гетерогенной массе яиц (семейная кладка), наследование у гибридов и у потомков партеногенетических клонов, полученных с помощью разных типов партеногенеза, что способствует созданию предпосылок для научно-обоснованной селекции тутового шелкопряда.
Известно, что показателем активности генома является присутствие молекул ДНК, вовлеченных в процесс репликации и транскрипции и находящихся в данный .момент в деспирализованном виде (метаболически активная ДНК) (Дашкевич и др., 1968, 1972; Конарев и др., 1971; Habenes et al., 1970; Mizuno et al., 1971)^ Поэтому, содержание этого вида ДНК представляется реальной характеристикой структурного состояния генома в онтогенезе
насекомого, его тканях и особенно у разных по продуктивное™ пород и гетерозисных гибридов тутового шелкопряда.
Наличие большого спектра коллекционных и промышленных пород, а также гибридов, характеристика структурной организации их геномов на уровне анализа суммарных препаратов ДНК по степени сблоченности пиримидиновых нуклеотидов, полиморфизма р-генов и минисателлитных последовательностей, определение активности генома в онтогенезе, а также в шелкоотделительной железе личинок V возраста может дать существенную информацию относительно молекулярных механизмов продуктивности и гетерозиса у тутового шелкопряда.
Цель исследования
Основной целью данной работы явилось изучение ' организации пиримидиновых олигонуклеотидных последовательностей в геноме тутового шелкопряда, характеристика полиморфизма р-генов в его геноме, выявление гипервариабельных локусов генома тутового шелкопряда с помощью М13-минисателлитов для маркирования генома на уровне отдельных особей, семей, пород, гибридов и потомков партеногенетических линий, полученных с помощью разных типов партеногенеза, а также определение активности генома у пород, гибридов тутового шелкопряда на эмбриональной стадии развития и разработка на этой основе методов прогнозирования продуктивности и эффекта гетерозиса у тутового шелкопряда.
Задачи исследования
1. Исследовать блочную организацию пиримидиновых нуклеотидных последовательностей в ДНК грены периода постдиапаузного развития и ДНК личинки У-ого возраста тутового шелкопряда.
2. Осуществить сравнительное исследование блочной организации структуры ДНК грены пород и полученных при их скрещивании гибридов в период постдиапаузного развития грены тутового шелкопряда.
3. Определить дозу р-генов в геноме тутового шелкопряда в процессе эмбрионального развития; исследовать полиморфизм р-генов в рДНК тутового шелкопряда; выявить межпородный полиморфизм р-генов у различных пород и гибридов тутового шелкопряда; установить распределение и характер наследования повторов рДНК, прерванных элементом ШВт, в геноме тутового шелкопряда,
4. Изучить возможность маркирования генома тутового шелкопряда мечеными олигонуклеотидными зондами, а также М13-минисателлитами.
5. Провести маркирование генома особей, семей и пород тутового шелкопряда, определить характер распределения гипервариабельных фрагментов у индивидуумов, полученных путем ам ей отеческого и мейотического партеногенеза.
6. Определить периоды активного состояния генома тутового шелкопряда в процессе онтогенеза.
7. Сравнить содержание метаболически активной ДНК у различных по продуктивности пород тутового шелкопряда и полученных при их скрещивании гибридов.
Исследования, представленные в работе, выполнены в соответствии с Государственными целевыми программами, включавшими ряд проблем.
• По проблеме: «Разработать биохимические основы и методы прогнозирования гетерозиса на модельных биологических системах посредством биохимических тестов и выдать практические рекомендации по подбору родительских пар для получения высокопродуктивных гибридов с максимальным гетерозисом», включавшей тему «Определить структурное состояние ДНК в грене различных по продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда» (Постановление ГКНТ СССР №373 от 11.07.1975г.);
• По проблеме; «Разработать новые направления исследований генетического аппарата, биополимеров и структур клетки, осуществляющих важнейшие проявления жизнедеятельности, и внедрить достижения молекулярной биологии и молекулярной генетики в медицину, сельское хозяйство, микробиологическую промышленность и другие отрасли народного хозяйства», включавшей тему «Апробировать методы и принципы геносистематики на некоторых группах беспозвоночных животных (насекомые, моллюски, ракообразные); провести оценку филогенетического родства главных классов членистоногих; изучить структуру геномов представителей чешуекрылых и некоторых других отрядов насекомых (в том числе коконопрядущих) для выяснения степени их генетического сходства и возможности использования этих данных в селекционной работе (08.Н4). Постановление ПСНТ СССР и Президиума АН СССР №426/91 от 26.11.76г.
• По проблеме: 0.74,05 «Разработать новые направления исследований генетического аппарата, биополимеров и структур клетки, осуществляющих важнейшие проявления жизнедеятельности, и внедрить достижения молекулярной биологии и молекулярной генетики в народное хозяйство», включавшей тему 08.НЗ «Апробировать методы и принципы геносистематики на некоторых группах беспозвоночных животных. Исследовать структурную организацию и активность генома насекомых» (Постановление ГКНТ СССР, Госплана СССР, АН СССР №24/25/13 от 13.02.81г.);
• По проблеме: 0.74.05, включавшей тему 07.НЗ «Исследовать структурно-функциональную организацию хроматина и хромосом, её изменение при активации генов» (Постановление ГКНТ СССР и АН СССР №26/13 от 03.02.87г.)
• Тема «Изучение полиморфизма ДНК тутового шелкопряда методом геномной дактилоскопии» выполнена в рамках программы «Приоритетные направления современной генетики» (1992-1995гл\).
• По проблеме «Создание центра коллективного пользования «Эволюционная геномика животных» в рамках Федеральной целевой программы «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки*». Государственный контракт №4 0064 ФЦП «Интеграция», 2001-2003 г.г.
Научная новизна и теоретическая ценность диссертационной работы
В результате работы были впервые получены следующие данные:
Показано» что в процессе эмбрионального развития тутового шелкопряда происходит постепенное нарастание степени сблоченности пиримидиновых олигонуклеотидов в ДНК и обогащение их тимидиловой кислотой. Этот процесс в основном заканчивается к моменту завершения органогенеза зародыша и поддерживается на этом уровне в течение личиночного развития.
Гены 285 рРНК не сцеплены с половыми хромосомами, а локализованы на одной из аутосом. Количественное содержание повторов со вставкой Я1Вт наследуется по материнскому генотипу.
Разработана технология геномной дактилоскопии для тутового шелкопряда с использованием рестрикционной эндонуклеазы Мвр1 и меченой ДНК фага М13 в качестве зонда. Выявлено 4 молекулярных маркера для генома тутового шелкопряда и ряд минорных гибридизационных полос, соответствующих минисателлитсодержащим рестрикционным фрагментам ДНК, позволяющим маркировать геном на уровне индивидуума - семьи - породы. У потомков тутового шелкопряда, полученных мейотическим типом партеногенеза (самцы), обнаружен высокий индивидуальный полиморфизм на спектрах гибридизации, позволяющий выявить генотипическую изменчивость.
Образование метаболически активной ДНК (ДНК с деспирализованной вторичной структурой) в онтогенезе тутового шелкопряда происходит циклически, соответствуя основным фазам и этапам развития насекомого (начало и конец постдиапаузного развития грены, начало каждого личиночного возраста, 1-й день завивки кокона (в большей степени у самцов) и на 4-й день развития куколки (в большей степени у самок)).
Практическая значимость работы
Полученные данные позволяют:
- осуществлять тестирование продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда по содержанию экспрес сирую щихся генов 288 рРНК в их геноме;
идентифицировать семьи и партеногенетические клоны, паспортизировать породы, выявлять генотипическую изменчивость, детектировать отдельные локусы различной копийности при анализе гибридных организмов.
- использовать биохимический тест для раннего прогнозирования эффекта гетерозиса у гибридов тутового шелкопряда по содержанию метаболически активной ДНК в их геноме на стадии Д| постдиапаузного развития грены. Инструкция по применению этого теста рекомендована Республиканской научно-исследовательской станции шелководства (пос. Иноземцево Ставропольского края), Среднеазиатскому НИИ шелководства (г.Ташкент) и НПО «Укрплем1рена» (г.Мерефа Харьковской обл.).
На основании проведенных исследований разработаны методические прописи, предназначенные для постановки практикума и спецпрактикума по биохимии и молекулярной биологии (сборник «Методы анализа белков и нуклеиновых кислот» - М.: МГПИ им. В.ИЛенина, 1980, ч.1, с.96-101).
Результаты исследований используются при чтении курса молекулярной биологии и спецкурса «Организация генома эукариот», а также включены в семинарские и практические занятия по биохимии и молекулярной биологии для студентов биолого-химического факультета Московского педагогического государственного университета.
Положения, выносимые на защиту
1. Блочная организация пиримидиновых олигонуклеотидных последовательностей в ДНК грены и личинки V-oro возраста тутового шелкопряда представляется одним из реальных подходов к исследованию структуры генома в процессе индивидуального развития насекомого.
2. Для генома тутового шелкопряда характерен полиморфизм рибосомных генов, обусловленный наличием в структурной части 28S рДНК элементов RIBm н RJIBm. Рибосомные гены тутового шелкопряда не сцеплены с половыми хромосомами; содержание повторов р-генов со вставкой RIBm наследуется по материнскому генотипу.
3. М13-минисателлиты способны детектировать различные типы гипервариабельных локусов генома тутового шелкопряда, что позволяет маркировать геном тутового шелкопряда на уровне отдельных особей, семей, пород и партеногенетических клонов.
4. Содержание метаболически активной ДНК (ДНК с деспирализованной вторичной структурой) является реальным показателем активности генома у тутового шелкопряда.
5. Степень сблоченности пиримидиновых олигонуклеотидов в суммарном препарате ДНК грены тутового шелкопряда, содержание экспрессирующихся р-генов, наличие общих и специфических минисателлитных локусов в геноме, а также активность самого генома могут быть использованы для характеристики геномов пород и гибридов тутового шелкопряда на стадии грены.
6. Содержание экспрессирующихся р-генов в геноме может быть рекомендовано в качестве перспективного молекулярно-биологического теста для прогнозирования в процессе выведения пород и получения гибридов потенциальной продуктивности, а содержание метаболически активной ДНК в грене тутового шелкопряда в качестве биохимического теста оценки эффекта гетерозиса в потомстве у гибридов тутового шелкопряда.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 99 работ, включая 1 монографию и 56 наиболее значимых и приоритетных публикаций.
Апробация диссертационной работы
Основные положения и результаты диссертации были представлены на XIII and XX International Congresses of Entomology, Moscow, 1968, Firenze, Italy, 1996; IX International Congress of Biochemistry, Stockholm, 1973; III Всесоюзном биохимическом съезде, Рига, 1974; VI съезде, Воронеж, 1970 и VII съезде, Ленинград, 1974 Всесоюзного энтомологического общества; на 7-ой, 9-ой, 11-ой,
15-ой, 17-ой Конференциях ФЕБО (Varna, 1971; Будапешт, 1974; Копенгаген, 1977; Брюссель, 1983; Берлин, 1986), 2-ом Всесоюзном семинаре-совещании по генетике и селекции тутового шелкопряда и шелковицы, Ташкент, 1979; IX Всесоюзном симпозиуме «Структура и функция клеточного ядра», Черноголовка, 1987; Международном симпозиуме «Актуальные проблемы мирового шелководства», Харьков, 1991; координационном совещании шелководов стран СНГ, Мерефа, 1993; 5-th and 6-th European Congresses of Entomology (University of York, UK, 1994: Ceske Budejovice, Czech Republic, 1998); 2-ом съезде биохимического общества РАН, Москва, 1997, Ленинских чтениях в МГПИ им.В.И. Ленина, 1991, 1996, научных сессиях по итогам научно-исследовательской работы МПГУ (1975, 1996, 1999-2005).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Материалы и методы изучения организации пирнмидиновых последовательностей в ДНК тутового шелкопряда.
Для работы использовали породы и гибриды тутового шелкопряда в эмбриогенезе (грена на стадии Д|, Е(, Ег, Ез) породы УФ и в грене на стадии Д1 и Е3 пород СК-2, ПС-5 и гибридов СК-2 х ПС-5, ПС-5 х СК-2, а также ДНК личинки V-oro возраста тутового шелкопряда породы УФ. Для определения стадии эмбрионального развития тутового шелкопряда использовали технику приготовления микропрепаратов, предложенную Михайловым (1958).
Весеннюю инкубацию грены проводили при 24° С и относительной влажности воздуха 70%, отбирая грену для анализа на стадии Д) (появление ротовых частей и грудных ножек на передних метамерах), Е] (бластокинез), Е2 (белая гусеница) и Ез (черная гусеница).
Деградацию ДНК до олигопиримидиновых блоков осуществляли по методу Бартона (Burton, 1957) в модификации Критского (Критский и др., 1976), Фракционирование пиримщшновых блоков ДНК на изоплиты с различным числом нуклеотидных остатков в них вели по модифицированному нами методу Петерсена и Ривса (Petersen, Reeves, 1966). Дальнейшее разделение пирнмидиновых изоплитов (от ди- до декануклеотидного) на теоретически возможные по нуклеотидному составу компоненты проводили с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-23-целлюлозе фирмы «Serva» (ФРГ). Идентификацию изоплитов, различающихся соотношением в их составе цитидиловых и тимидиловых нуклеотидных остатков, проводили по прописи Мазина и Ванюшина (1967) в соответствии с величиной суммарного заряда каждого из олигонуклеотидов. При выходе меньше ожидаемого по теории числа компонентов, идентификацию изоплитов проводили спектрофотометрически (Tate, Petersen, 1974). Количественное определение различных фракций изоплитов осуществляли спектрофотометрически при длинах волн 270 и 310 нм. Содержание каждого из олигопиримидиновых фрагментов выражали в процентах, принимая сумму всех пирнмидиновых олигонуклеотидов за 100%.
2. Материалы и методы для изучения структурной организации рнбосомных генов тутового шелкопряда.
Для анализа использовали грену тутового шелкопряда на стадии Е2 постдиапаузного развития пород и гибридов СК-2, ПС-5, СК-2 х ПС-5, ПС-5 х СК-2, пород Украинская-11, Украинская-13, Украинская-14 и полученных при их скрещивании прямых и обратных гибридов; пород: Маргеланская, Бухарская, Японская-В, Советская-5, Советская-12, Японская-112, Украинская-10; гибрида Б1 х Б2, предоставленных НПО «Укрплемгрена». В работе были использованы куколки шелкопряда пород СК2 и ПС5, из которых выделяли семенники и крылья бабочек мужских и женских особей. Ядерную ДНК из грены постдиапаузного развития на стадии Е2 анализируемых пород и гибридов тутового шелкопряда выделяли по прописи Вцдута и Севастьяновой (1980). Высокомолекулярную ДНК тутового шелкопряда обрабатывали рестрикгазами EcoRl и Xbal (НПО «Фермент») в стандартных условиях (Маниатис и др., 1984). Разделение фрагментов ДНК, полученных после рестрикции, проводили в 0,7%-ном агарозном геле, трис-ацетатном буфере, рН 7,5, содержащем 1 мМ ЭДТА. Перенос фрагментов ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизацию с радиоактивным ДНК зондом проводили по методу Саузерна (Southern, 1975). В качестве меченой пробы использовали клонированную 288рДНК вьюна. Включение радиоактивной метки в ДНК осуществляли ник-трансляцией по методу Ригби и др. (Rigby et al, 1977). Сканирование радиоавтографических пленок проводили на приборе «Ultroscan» (LKB, Швеция).
3. Изучение полиморфизма ДНК тутового шелкопряда методом, геномной дактилоскопии.
В работе была использована грена на стадии Ег следующих пород тутового шелкопряда: СК-2 и ПС-5 и их прямых и обратных габридов, породы Даидзо. Мархамат, Китайская 110, Украинская II, 13 и 14, Мерефа 5, Украинская новая (УН), предоставленные НПО «Укрплемгрена»; Советская 5 и 12, Бухарская, предоставленные САНИИШ г.Ташкент; порода Мархамат, партеногенетические клоны: ПК 9 (самцы и самки), ПК44, Fb25 получены нами из Института биологии развития РАН (коллекция акад. В .А. Струнникова). Работу выполняли также на образцах ДНК, выделенных из тканей куколок, личинок V-oro возраста. Для анализа ДНК у личинок брали мышечный мешок, у куколок - зачатки крыльев и гонады.
Выделение суммарной клеточной ДНК проводили с использованием протеинкиназы К, фенола и хлороформа в качестве депротеинизирующих агентов (Видута, Севастьянова, 1980). ДНК осаждали спиртом и растворяли в ТЕ буфере (рН 8,0). Обработку ДНК эндонуклеазами рестрикции проводили в стандартных условиях (Маниатис и др., 1984). Блот-гибридизацию осуществляли по методу Саузерна с использованием меченной 32Р ДНК фага М13, либо олигонуклеотиды: (CAC)j, (ТСС)3, (GACA)j в качестве зонда, меченые с помощью полинуклеотидкиназы. Радиоавтографию проводили при -70°С на пленку РМ-В. Денситогр'аммы получали сканированием радиоавтографов на лазерном денситометре "Ultroscan XL" фирмы "LKB" (Швеция),
Иллюстративный материал получали на сканере "Scan Jet Plus" и лазерном принтере "Laser Jet Plus, series II" (Япония).
4. Материалы и методы изучения активности генома в онтогенезе тутового шелкопряда.
Материалом для определения содержания метаболически активной ДНК, ДНКазной активности растворимых белков, интенсивности включения меченых предшественников в ДНК и РНК, состава белковых компонентов и прочность их связи с ДНК в хроматине проводили на моновольтинной породе тутового шелкопряда СК-2. Для анализа использовали неоплодотворенную, преддиапаузирующую, диапаузирующую, зимующую и развивающуюся после прохождения диапаузы хрену (на стадиях Д] - появление ротовых частей и . грудных ножек на передних метамерах, Е( - бластокинез, Е2 - стадия белой гусеницы, Е3 - стадия черной гусеницы, личинки в начале и конце каждого их пяти возрастов, личинки на стадии завивки кокона (предкуколка), куколки (самки и самцы) во время метаморфоза и только что вышедшие из кокона бабочки.
Для выделения ДНК из организма и тканей тутового шелкопряда использовали фенол-детергентный метод Кирби в модификации Кита (Kit, 1960). Своеобразие объекта и поставленная цель (выделение ДНК с сохранением ее нативной вторичной структуры) побудили нас внести некоторые изменения в методику выделения ДНК, предложенную Китом, выразившиеся в предварительной промывке ткани раствором детергента с целью ингибирования поверхностных нуклеаз, добавление в депротеинизирующую систему додецилсульфата натрия, обработке РНКазой, введении дополнительной депротеинизации с помощью проназы, осаждении ДНК из раствора этанолом (а не этилцеллозольвом) во избежание деградации ДНК. О чистоте препарата ДНК судили по величинам отношений Егбо^Егзо и Егео^всь которые составляли 1,952,03 и 1,92-2,00 соответственно. Степень нативности выделенных препаратов ДНК определяли по величине гиперхромизма (эта величина составляла 37-39%).
Для выявления метаболически активной ДНК использовали реакцию ДНК с формальдегидом (Haselkora, Doty, 1961) и метод фракционирования препарата ДНК хлороформом (Piechowska, Shugar, 1963, 1965).
Определение кислой и нейтральной дезоксирибонуклеазной активности проводили спектрофотометрическим методом, учитывая количество образовавшихся кислоторастворимых продуктов в результате инкубации препарата ДНК с растворимыми белками, выделенными из организма тутового шелкопряда. Дезоксирибонуклеазную активность выражали в условных единицах на 1 мг белка (или 1 г ткани) в 1 минуту, рассчитанных на основании прироста поглощения при 260 нм. По разнице оптических плотностей при 270 нм и 290 нм рассчитывали процентное содержание деполимеризованной ДНК в ДНК исходного раствора.
Интенсивность биосинтеза нуклеиновых кислот в период эмбрионального развития тутового шелкопряда определяли по включению меченных тритием предшественников тимидина и уридина в кислотонерастворимый материал. Инкубацию суспензии клеток с мечеными предшественниками вели в течение 30 минут при 25°С. После инкубации из суспензии клеток удаляли
ислогорастворимую фракцию, осадок растворяли в 86%-ноЙ муравьиной нслоте. Просчет радиоактивности исследуемых образцов осуществляли в омогенной системе с использованием сцинтилляционной смеси на основе олуола на сцинтилляционном счетчике SL-40 фирмы «Интертехник», Франция. 1нтенсивность включения меченого предшественника выражали числом (мпульсов, измеряемых за одну минуту, отнесенных к 1 мг белка клеточной успензии.
Ддерную фракцию из грены получали методом Шово (Chauveau et al, 956) с дополнительной очисткой ее в ступенчатом градиенте сахарозы (1,7М и 1,6М) путем центрифугирования при 65 ООО g в течение 90 минут. Выделение сроматина из ядерной фракции и экстракцию гистонов из хроматина вели по 1егодике, описанной ТуроверовоЙ (1978). Ядерную фракцию суспендировали в буферном растворе и проводили ультразвуковую обработку на ультразвуковом (езинтеграторе УЗДН-2Т при частоте 22 кГц (42 мА). Озвученные препараты фприфугировали, отбирали надосадочную фракцию и определяли в ней удержание ДНК по методу Бартона (Burton, 1956).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Организация пиримидиновых последовательностей в ДНК тутового
шелкопряда
Ранее проведенное исследование степени сблоченности пиримидиновых 1уклеотидов в ДНК насекомых (последняя личиночная стадия) в видовом icneicie (16 видов) показало, что каждый вид характеризуется определенным соличественным содержанием одноименных пиримидиновых изоплитов в ;оставе их ДНК, то есть степень сблоченности нуклеотидов в ДНК насекомых :пецифична как в межвидовом так и в межотрядном аспектах. Особенно сметные контрасты в количественном содержании одноименных шримидиновых изоплитов в ДНК насекомых обнаружены в блоках, длиной от дести до одиннадцати нуклеотидных остатков, тогда как различия по этому юказателю в коротких блоках менее выражены.
В качестве обобщающей характеристики степени сблоченности ДНК тасекомых для удобства сопоставлений в межвидовом и межотрядном аспектах ими введен индекс "К" - отношение суммы процентного содержания коротких тоследовательносгей (с 1-го по 5-ый) к таковой длинных (с 6-го по 11-ый). Он лражает не только количественно соотношение между более короткими и более длинными пиримидиновыми последовательностями в ДНК, но и позволяет шявить реальный уровень сходства и различий в распределении шримидиновых блоков в ДНК анализируемых видов насекомых. Величина индекса "К" варьирует от 4,32 до 7,43, демонстрируя существенные различия в структуре геномов исследуемых видов насекомых по степени сблоченности шримидиновых нуклеотидов в их ДНК, как в межвидовом, так и в межотрядном аспектах. Наибольшей сблоченностью нуклеотидов отличается ДНК лерепончатокрылых ("К"=4,32-4,43), наименьшей (среди изученных нами видов насекомых) - ДНК чешуекрылых ("К"=б,39-7,43); таракановые и жесткокрылые
занимают по этому показателю промежуточное положение ("К"=4,70-5,81 и 5,575,74 соответственно).
В блочной структуре ДНК исследованных нами видов насекомых выявляется определенная тенденция, заключающаяся в том, что по мере возрастания длины ол игону кл еоти дного фрагмента растет частота встречаемости в нем компонентов, составленных преимущественно из тимидиловых остатков. Достоверно установлено, что виды насекомых, характеризующиеся большей степенью сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в их ДНК, содержат в составе ДНК и больше тимидиловых нуклеотидных остатков. Это подтверждает высказанное ранее предположение о том, что в процессе эволюции накопление длинных пиримидиновых последовательностей ДНК животных (Мазин, 1975, 1980) сопровождалось обогащением их тимидиловой кислотой (Лахтин, 1979), что в известной степени связано с возрастанием помехоустойчивости матриц в процессе эволюции (Мазин, 1980; Медников, 1982) и имеет определенный биологический смысл для животных любого таксономического ранга, в том числе и для насекомых.
Определенный интерес представляют данные о динамике содержания пиримидиновых олигонуклеотидных последовательностей в ДНК грены тутового шелкопряда в процессе ее развития, поскольку позволяют выявить более тонкие детали в структурной организации исследуемых ДНК, а следовательно, и уловить имеющиеся различия в блочной структуре ДНК грены тутового шелкопряда на разных стадиях ее развития.
Таблица 1
Содержание пиримидиновых нзоплнтов в ДНК грены и личинки
тутового шелкопряда породы УФ (в процентах от суммы, М±т)
Номера изоплитов Стадии постдиапаузного развития ri №ны Личинка
D, Е, Е2 Е3 V возраст
I 27,76±0,21 24,79±0,00 23,80±0,27 24,78±0,21 24,94±0М
II 24,88±0,17 22,89±0,04 23,27±0,32 23,15±0,28 23,12±0,10
III 18,53±0,И 19,40±0,13 18,35±0,18 17,69±0,17 17,63±0,23
IV 12,12±0,08 13Д9±0,08 12,87±0,11 12,62±0,09 12,81±0,И
V 6,73±0,11 8,1б±0,04 8,!7±0,04 7,75±0,11 7,97±0,09
VI 3,35±0,09 4,39±0,10 4,59±0,0б 4,62±0,09 5,00±0,13
VII 1,86±0,03 2,81±0,05 3,06±0,05 3,10±0,04 3,11 ±0,06
VIII 1,30±0,04 1,77±0,03 1,81 ±0,07 2,14±0,07 2,18±0,09
IX 0,99±0,01 1,12±0,01 1,37±0,04 1,44±0,06 1,59±0,04
X 0,70±0,005 0,61 ±0,003 1,06±0,03 1,00±0,03 0,63±0,06
XI 0,6040,003 0,24±0,001 0,67±0,01 0,67±0,05 1,02±0,09
XII 0,42±0,001 0,14±0,001 0,38±0,02 0,43±0,01 0
XIII 0,75±0,005 0,39±0,001 0,б1±0,06 0,59±0,02 0
К 9,03 7,72 6,39 6,15 6,39
Примечание: I-XII - моно- додекануклеотиды
XIII - олигонуклеотиды, содержащие 13 и более звеньев; К - индекс, характеризующий степень сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в ДНК
__1 + П + Щ + 1У + У
S VI+ VII+ VIII + IX+ X+ XI+ XII + XIII
а
Результаты анализа частоты встречаемости пиримидиновых изоплитов в ДНК породы УФ тутового шелкопряда на стадиях Дь Еь Е2 и Ез постдиапаузного развития грены свидетельствуют о том» что процесс эмбрионального развития этого насекомого сопровождается изменениями в блочной организации пиримидиновых последовательностей ДНК (табл. 1). Эти изменения» в целом» носят закономерный характер: происходит постепенное возрастание степени сблоченности нуклеотидов в ДНК, обусловленное накоплением в структуре ДНК грены длинных пиримидиновых последовательностей, содержащих от 5-ти до 10-ти нуклеотидных. остатков, в то время как изо плиты большей длины не вносят существенного вклада в увеличение сблоченности ДНК.
Степень сблоченности ДНК, оцениваемая на основании индекса "К", увеличивается на стадии Е^ постдиапаузного развития на 41,13%, а к стадии Еэ на 46,83% соответственно, что, по-видимому, свидетельствует о том, что накопление длинных пиримидиновых олигонуклеотидов в ДНК трены тутового шелкопряда, в основном, заканчивается к моменту завершения органогенеза зародыша. Общее число идентифицированных нами изоплитов известного состава(изоплитный каталог)присутствуют в ДНК грены на стадии Е? и в несколько большем количестве (62) по сравнению с таковым в ДНК грены на стадии Д[ и Е( (54 и 59 компонентов соответственно), что свидетельствует о появлении новых пиримидиновых изоплитов в структуре ДНК тутового шелкопряда к концу его эмбриогенеза. При этом в составе ДНК грены стадии Е3 выявляются, вплоть до нанонуклеотидного блока включительно, все теоретически возможные по соотношению нуклеотидных остатков сочетания. В ДНК грены стадии Ди начиная с гептануклеотида в направлении к декануклеотиду зафиксировано отсутствие олигоцитидиловых или обогащенных цитидиловой кислотой последовательностей, таких как ЬЬфв, Ц7Т1Ф9, Ц7Т2Ф10, Ц7Т3Ф1], Цвфэ* Ц8Т1Ф10, ЦвТгфц. Ц9Ф10* Увеличение количества цитидинсодержащих фрагментов в составе тетра-д е кану кл еотидных блоков отмечается на стадии Е| и в наибольшей степени на стадии Ег, что свидетельствует о том» что процесс их накопления, в основном, связан с завершением органогенеза зародыша. Сопоставление данных по содержанию компонентов» включающих в свой состав оба пиримидиновых основания, показало, что на всех этапах эмбрионального развитая тутового шелкопряда эти последовательности представлены в геноме в значительно большем количестве, чем олигомерные блоки ДНК. Характерно, что наибольшим присутствием в составе любого изоплита ДНК отличаются олигопиримидины» составленные преимущественно из тимидиловых нуклеотидов, нежели из цитидиловых. В процессе эмбриогенеза тутового шелкопряда и особенно в ДНК грены на стадии Ез отмечено существенное нарастание содержания олиготимидиловых и обогащенных тимидином изоплитов ДНК в блоках дайной от пяти до десяти звеньев состава Ц^фб, Ц3Т3Ф7, ДзТ4ф8, Ц^фв, Ц4Т5Ф10, ЦэТ6фю, Ц|Т8фю. Ц1Т9Ф]], что, по-видимому, свидетельствует о том, что представительство тимидинсодержащих пиримидиновых блоков в геноме тутового шелкопряда более существенно, нежели цитидинбогатых.
Важность нуклеотидных последовательностей, обогащенных тимидином, в геноме общеизвестна: они являются транскрипционными сигналами как
инициации, так и терминацин процесса (Gaus, SprizI, 1983), нуклеотндная последовательность фТфТфТфТфТфТфЦ входит в состав кодирующей цепи ДНК блока Хогнесса фиброинового гена (фиброиновый модулятор) (Zhou et al, 2000); в состав интрон-экзонного перехода в кодирующей цепи ДНК хорионных генов тутового шелкопряда входит блок Т4ф5 (Eickbush, Burke, 1986); олиготимидиловый блок размером более пяти иуклеотидов входит в состав некодирующей цепи генов, транскрибируемых РНК-полнмеразой I (Сингер, Берг, 1998).
Известно, что ДНК яйца тутового шелкопряда представлена хромосомной ДНК и ДНК, находящейся в цитоплазме в желточных гранулах и в митохондриях. ДНК хромосом и желточных гранул одинаковы по нуклеотидному составу, ДНК митохондрий относятся исключительно к АТ-типу, содержание ГЦ-пар в митохондриальной ДНК насекомых самое низкое -21-25% (Нейфах и Тимофеева, 1977). В процессе развития яйца перед выходом личинки исчезают желточные гранулы, резко увеличивается интенсивность дыхания (в 8-10 раз) и содержание митохондриальных белков в 2,5 раза по сравнению с серединой постдиапаузного развития, что свидетельствует о биосинтезе в этот период митохондрий, определяющих уровень энергетического обмена будущей личинки, К концу первого личиночного возраста происходит постепенное снижение интенсивности дыхания с одновременным уменьшением содержания митохондриальных белков (приблизительно в 3 раза) и эти параметры остаются постоянными в течение всех последующих четырех личиночных возрастов (Радзинская, Никольская, 1986). Определение первичной структуры митохондриальной ДНК (16,15 т.п.н.) тутового шелкопряда показало наличие АТ-богатых участков в ее составе, содержащих протяженные тимидиновые последовательности (Chen Zhi-gi et al., 1991; Ailing Li et al., 2005). В этой связи можно предположить, что увеличение степени сблоченности пиримидиновых олигонуклеотидов в ДНК грены в значительной мере обусловлена синтезом митохондриальной ДНК. Показательно, что степень сблоченности пиримидиновых олигонуклеотидов в препаратах ДНК, выделенных кз личинки V-oro возраста и на стадии Е2 развития грены, одинакова. При этом ДНК личинки V-ro возраста не имеет в своем составе двух изоплитов (XI и XIII), характерных для ДНК грены, содержание трех изоплитов (VI, IX и XI) в ее составе выше, чем в ДНК грены. .
В целом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в процессе эмбрионального развития тутового шелкопряда и сопровождающей его клеточной дифференцировки, могут происходить определенные изменения в блочной организации пиримидиновых последовательностей ДНК. Эти изменения носят строго закономерный характер и отражают специфику отдельных периодов постдиапаузного развития грены.
Блочная организация пиримидиновых нуклеотидных последовательностей в ДНК, пород и гибридов тутового шелкопряда в эмбриогенезе
Исследование организации пиримидиновых последовательностей в ДНК пород и гибридов тутового шелкопряда в эмбриогенезе представляет особый интерес не только для выяснения основ эмбрионального развития этого коконопрядущего насекомого, но и в практическом отношении. Это объясняется тем, что данная биохимическая оценка качества пород и гибридов тутового
шелкопряда на стадии эмбриогенеза может служить одним из надежных критериев раннего прогнозирования гетерозиса у хозяйственно-полезного вида насекомого, поскольку именно на самых ранних этапах развития организма закладываются будущие основы его продуктивности.
Анализ частоты встречаемости пиримидиновых изоплитов в ДНК пород СК-2, ПС-5 и гибридов СК-2 х ПС-5, ПС-5 х СК-2 тутового шелкопряда на стадиях Д1 и Ез постдиапаузного развития грены свидетельствуют о том, что порода СК-2 характеризуется наименьшей степенью сблоченности пиримидинов в ДНК, гибрид ПС-5 х СК-2 - наибольшей, а порода ПС-5 и гибрид СК-2 х ПС-5 занимают по этому показателю промежуточное положение. При этом различия в организации пиримидиновых нуклеотидов выражены в большей степени в ДНК грены пород и гибридов тутового шелкопряда на стадии Ез, чем на стадии Д1 (табл. 2).
Таблица 2
Характеристика пород и гибридов тутового шелкопряда по степени сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в их ДНК и некоторым биологическим и технологическим показателям
Породы и гибриды тутового шелкопряда Показатель «К» Возрастание степени сблоченности ДНК от стадии Dj к стадии Ез эмбриогенеза (в %) Жизнеспособность гусениц, (в%> Средняя масса кокона, (в г) Выход шелка сырца (в кг с 1 г гусениц)
D, Е>
СК-2 8,06 7,02 14,81 96,2 uo 0,380
ПС-5 7,38 6,42 14,95 95,0 1,52 0,407
СК-2 х ПС-5 7,55 6,30 19,84 97,5 (+2,0) 1,54 (+9,2) 0,445 (+13,0)
ПС-5 х СК-2 7,15 5,80 23,18 98,2 (+2,7) 1,60 (+13,5) 0,475 (+20,5)
УФ 9,03 6,13 47,00 1,84 0,385
(+) - прирост соответствующего показателя у гибрида по отношению к среднеродительскому, в процентах.
Существенно, что процесс эмбрионального развития исследованных пород и гибридов тутового шелкопряда сопряжен со строго определенными, свойственными каждой породе и гибриду, изменениями в блочной организации пиримидиновых нуклеотидов в их ДНК. Так, степень сблоченности ДНК, оцениваемая на основании индекса "К" возрастает к стадии Ез постдиапаузного развития грены в ДНК пород СК-2 и ПС-5 на 14,81% и 14,95% соответственно, а в ДНК гибридов СК-2хПС-5 и ПС-5хСК-2 на 19,84% и 23,28% -соответственно. Таким образом, гибридные геномы тутового шелкопряда в большей степени изменяются в ходе постдиапаузного развития грены по степени сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в ДНК, нежели геномы исходных родительских пород. Цри попарном сравнении (табл. 3) содержания отдельных пиримидиновых изоплитов ДНК грены на стадиях Д] и Ез наблюдается достоверное уменьшение количества моно- и дшшримидиновых изоплитов.
Таблица 3
Содержание пирнмидиновых изоплитов различного состава в ДНК грены на разных стадиях постдиапаузного развития (в % от
суммы): М ± т
№ нзоплита СК-2 ПС-5 СК-2 х ПС-5 ПС-5 х СК-2
ЕЗ ш ЕЗ ЕЗ Ш ЕЗ
I ±Й1 щ ад шм ад, ЙР
II ЭР ЯР тШ ш »
III 18,14 ±0,08 18,40 ±0,11 181 Шм ш ^¡(ыИ; мм 48.00
IV 13,04 ±0,14 гЩ 12,88 ±0,15 13,03 ±0,05 * 12,77 ±0,17 13,05 ±0,08
V 7,98 ±0,09 8,06 ±0,06 •7,7*: ¿5,0* 'ЩЙ 8,19 ±0,11 8,14 ±0,11
VI 4,32 ±0,10 4,51 ±0,04 4,60 ±0,02 4,67 ±0,04 4,55 ±0,10 4,89 ±0,05 4,80 ±0,07 5,09 ±0,07
VII '2,49 ±$03 2,90 ±0,06 3,03 ±0,06 •ад,04 3,57 :• .«>,04 тт
VIII ±о,об 1*5 2,17 г,т ±0,03 ±0,02 ¿#0,02 ±0,05
IX № ±0»й1 .±0,0* 1,32 ±0,04 ш ЩЗ:;! М03
X 0,62 ±0,03 0,68 ±0,04 Ш0 ЭЮ'05-. от *<М>2 0,69 ±0,02 0,64 ±0,04 ±0,01 1,05
XI 0,41 ±0,03 0,38 ±0,04 шш. ±о,оз 0,37 ±0,05 0,36 ±0,01 (Ц37 0,53
XII 0,24 ±0,01 0,25 ±0,03 ±0,02 ±0,01 0,17 ±0,04 0,16 ±0,01 ±0,01.
XIII 0,50 ±0,04 0,51 ±0,04 0,30;.. ±0,01 ±0,04 0,64 ±0,05 0,55 ±0,04 ±0,02 Ф0-02
- достоверные различия
Наибольшим количественным изменениям в ДНК трены породы СК-2 и гибрида СК-2хПС-5 подвержены изоплиты, содержащие от 7-ми до 9-ти нуклеотидных остатков, а в ДНК грены породы ПС-5 и гибрида ПС-5хСК-2 изоплиты, содержащие от 8-ми до 13-ти нуклеотидов. В процессе эмбриогенеза а геноме исследованных нами пород и гибридов тутового шелкопряда изменяется содержание сшигомерных блоков, последовательностей, включающих в свой состав оба пиримидивовых основания, а также обогащенных цитидином и тимидином и входящих в состав гепта-декануклеотидных изоплитов ДНК, Характерно, что в составе ДНК гибридов было выявлено гораздо большее число последовательностей, содержание которых существенно меняется в ходе постдиапаузного развития трены. К ним относятся обогащенные цитидином изоплиты (Ц^ф? , Ц<>Т|фз, ЦеТгф?, ЦбТ3ф10, Ц7Т3фц, обнаруженные в ДНК
гибрида СК-2хПС-5 на стадии Дь содержание которых в конце эмбрионального развития уменьшается в 2-6 раз. У гибрида ПС-5хСК-2 в процессе постдиапаузного развития наблюдается лишь некоторое уменьшение содержания в составе его ДНК олигоцигидиловых последовательностей, таких как Шфе» Цбф? и Ц7Ф8. Основным направлением изменений, происходящих в ДНК грены пород и гибридов тутового шелкопряда по мере ее развития, является нарастание содержания олиготимидиловых и обогащенных тимидином изоплитов ДНК. Таким образом, выявлен индивидуальный характер изменения блочной организации пиримидиновых последовательностей в ДНК пород и гибридов тутового шелкопряда, тестирующий гетерозисные гибриды более высоким уровнем нарастания тимидина в составе длинных пиримидиновых изоплитов ДНК (Тбф7, Т7фв, Ц(т6ф8, Ц1Т7Ф9, Тгф9, Ц3Т6ф10, Ц^вфю, Тэфю, Ц,Т9ф„, Тюфц) по сравнению с таковым исходных родительских пород, что вполне согласуется с уровнем изменения степени сблоченности этих нуклеотидов в ДНК грены гибридов тутового шелкопряда в период ее постдиапаузного развития. Отмечена положительная корреляция степени сблоченности пиримидинов в ДНК грены на заключительной стадии ее развития (Ез) с продуктивностью пород и гибридов по массе кокона(г=0,895 при Р=0,040).
Особенно показателен в этом отношении гибрид ПС-5хСК-2, характеризующийся наибольшей степенью сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в ДНК и интенсивностью ее увеличения в эмбриогенезе, а также наибольшей степенью обогащенности генома длинными пиримидиновыми последовательностями, преимущественно содержащими тимидин, и наилучшими биологическими и технологическими показателями. Логическим следствием рассмотренной связи является вывод о том, что характеристика степени сблоченности пиримидиновых нуклеотидов ДНК в грене тутового шелкопряда может быть использована в качестве биохимического теста для раннего прогнозирования эффекта гетерозиса у этого коконопрядущего насекомого.
Структурная организация рибосомных генов тутового шелкопряда
В геноме тутового шелкопряда присутствует 240 копий генов высокомолекулярных рРНК. Они организованы в тандемно повторяющиеся единицы, в составе которых имеются транскрибируемые районы, разделенные нетранскрибируемыми спейсерами (Gage, 1974;Kusuda, 1981),
Единица транскрипции рДНК тутового шелкопряда представлена геном ISSpPHK. внутренним транскрибируемым спейсером, геном 28SpPHK, геном 5,8SpPHK и большим по размеру нетранскрибируемым спейсером.
У ряда представителей эукариот повторяющиеся единицы р-генов могут быть прерваны вставочными последовательностями в районе, кодирующем 28SpPHK (Rae, 1982; Lecanidou et al., 1984). Первоначально рибосомные повторы со вставками в гене 28SpPHK были обнаружены в геноме Drosophila melanogaster (Wellauer, Dawid, 1977). Эти вставки классифицируют на 2 типа (I и II) в зависимости от того, содержат ли они или нет точки рестрикции эндонуклеазы EcoRI (Dawid et al„ 1978). Вставки типа I не содержат точек рестрикции EcoRI, вставки типа II содержат участки узнавания этой
рестрикционной эндонуклеазой, Содержание р-генов со вставками у дрозофилы составляет около 75%. Именно благодаря исследованиям, проведенным на дрозофиле и еще пяти видах Díptera, была получена исчерпывающая информация о структуре, локализации и механизме встраивания вставочных последовательностей в рДНК насекомых. Весьма существенен тот факт, что рибосомные гены со вставками практически не транс1фибируются (Wellauer, Dawid, 1977; Backingham et al., 1982; Lecanidou et al., 1984; Schafer, Kunz, 1985).
Считалось, что все повторяющиеся единицы р-генов тутового шелкопряда однородны по длине (10,8 тыс.п.н.) и не имеют в своем составе вставок. Однако в 1984 году было установлено, что 12-15% р-генов тутового шелкопряда имеют больший, чем 10,8 тыс.п.н. размер, что обусловлено присутствием вставки в области 28S гена, РестрикционныЙ анализ обнаружил наличие вставки двух : типов -типа I и Tima II (Lecanidou et al., 1984; Eickbush et al., 1985), при этом отмечена высокая гомология между обоими типами вставок дрозофилы и шелкопряда (Burke eí al., 1987). Вставки, прерывающие р-гены тутового шелкопряда, получили обозначения как инсерционные элементы RIBm и R2Bm (Eickbushetal., 1985).
Элемент 1-го типа у тутового шелкопряда прерывает ген 28S рРНК на расстоянии приблизительно 2/3 от 5'-конца гена, имеет размер 5,1 тыс.п.н. и фланкирован с двух сторон прямыми повторами из 14 нуклеотидных остатков, которые представляют собой части структурного гена 28S рРНК. Элемент И-го типа прерывает ген 28S рРНК вверх от элемента типа I на 75 п.н., имеет размер 4,2 тыс.п.н. и не фланкирован дупликацией рДНК.
На основе структурно-функционального анализа и способности специфическим образом встраиваться в геном элементы R1 и R2 тутового шелкопряда были отнесены к семейству ретротранспозонов (Xiong, Eickbush, 1988). Они не имеют длинных концевых повторов (ДКП), вследствие чего их выделяют в семейство ретротранспозонов, не содержащих ДКП (Burke et al., 1987; Xiong, Eickbush, 1988).
Встраивание элементов RIBm и R2Bm нарушает целостность структуры 28S гена и экспрессия таких разорванных генов маловероятна (Xiong, Eickbush, 1988).
Мы сочли целесообразным осуществить сравнительное исследование организации рибосомных генов в ДНК разных отечественных пород и гибридов тутового шелкопряда, различающихся по ряду биологических показателей.
Исследование структурной организации р-генов в геноме тутового шелкопряда осуществляли по следующим направлениям:
1) определение дозы р-генов в геноме тутового шелкопряда в процессе его эмбрионального развития;
2) исследование полиморфизма р-генов в рДНК тутового шелкопряда;
3) выявление межпородного полиморфизма р-генов у различных по продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда;
4) установление распределения и характера наследования повторов рДНК, прерванных элементом R1, в геноме тутового шелкопряда.
Определение дозы р-генов в геноме пород СК-2 и ПС-5 и их прямого и обратного гибридов тутового шелкопряда на стадии Вг постдиапаузного развития грены представлены на рисунке (рис. 1). Оказалось, что доза р-генов
одинакова как у пород СК-2 и ПС-5 , так и у гетерозисных гибридов СК-2хПС-5 и ПС-5хСК-2. Определение дозы р-генов в ДНК грены гибрида ПС-5хСК-2,отличающегося высокой степенью гетерозиса, на стадиях Дь Ег и Ез постдиапаузного ее развития продемонстрировало, что от стадии Д1 к стадии Е3 не происходит изменений в дозе р-генов в ДНК гибрида ПС-5хСК-2. Таким образом, количественная характеристика дозы рибосомных генов в геноме исследуемых пород и гибридов тутового шелкопряда не позволяет установить различий в уровне их экспрессии.
Ф » « * # # • • ♦ «-
» »
Рис. 1 Сравнительное определение количества рДНК в геноме тутового шелкопряда пород СК-2 (1), ПС-5 (2) и их гибридов СК-2 х ПС-5 (3), ПС-5 х СК-2 (4) методом дот-гибридизации.
Исследование полиморфизма рибосомных генов тутового шелкопряда было проведено первоначально на ДНК двух пород - Скороспелая-2 (СК-2) и Пятигорская-5 (ПС-5), а также полученных при их скрещивании гетерозисных гибридов (СК-2 х ПС-5 и ПС-5 х СК-2).
Ядерную ДНК, выделенную из грены на стадии Ег постдиапаузного развития перечисленных выше пород и гибридов тутового шелкопряда, расщепляли рестрикгазами ЕсоК1 и ХЬа1, Полученные фрагменты фракционировали в 0,7%-ном агарозном геле. Далее фрагменты переносили на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизовали с меченной [32Р] 285 рДНК вьюна. Результаты блот-гибридизациониого анализа представлены на рис. 2._
Рис. 2. Блот-гибридизация ЕсоШ (а) и ХЬа1 (б)-фрагментов рДНК из двух пород (2, 3) и гибридов (4, 5) тутового шелкопряда В. топ. ДНК выделяли из грены на стадии Е2, обрабатывали эндонуклеазами ЕсоШ или ХЬаТ, фрагменты переносили на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизовали с фрагментом 288 рДНК вьюна. 1 — Нш<11 II-фрагменты фага X; 2 — порода СК-2; 3 — порода ПС-5; 4 — гибрид СК-2х ПС-5, 5 — гибрид ПС-5хСК-2. Размеры фрагментов даны на рисунке слева н справа в т.п.н.
При действии рестриктазы EcoRI на ядерную ДНК тутового шелкопряда образуется шесть фрагментов, гибридизуюгцихся с меченой 28S рДНК вьюна: 16,0; 10,8; 8,5; 7,0; 5,5; 2,7 тпн. Фрагменты протяженностью 10,8 тпн представлены в мажорных количествах, они соответствуют длине одной повторяющейся единицы рДНК и не содержат инсерционных элементов R1 и R2 в структуре гена 28S рРНК. Фрагменты размером в 16 тпн содержат в структурной части гена 28S рРНК элемент типа RIBm, включающий 5,1 тпн. Фрагменты длиной 8,5 и 7,0 тпн соответствуют повторам рДНК с элементом R2Bm, размером 4,6 тпн, имеющим EcoRI-еайт в своей последовательности. Помимо этого обнаружено некоторое количество повторов рДНК с дополнительными участками узнавания рестриктазой EcoRI в структурной части гена 28S рРНК, о чем свидетельствует наличие фрагментов, протяженностью 5,5 1 и 2,7 тпн. Эти результаты, по-видимому, отражают внутригеномную гетерогенность по EcoRI-сайтам рибосомных генов исследуемых пород шелкопряда. Результаты проведенного исследования показывают, что в геномах перечисленных пород и гибридов В. morí присутствуют различные по длине повторы рДНК. Это обусловлено наличием в структурной части 28S рДНК элементов RIBm и R2Bm.
Результаты блот-гибридизации Xbal-фрагм ентов ядерной ДНК анализируемых пород и гибридов тутового шелкопряда подтвердили присутствие вариантных по длине повторов рДНК. ХЬа1-фрагменты рДНК протяженностью 7,7 и 2,7 тпн соответствуют основным, не содержащим инсерционных элементов RIBm и R2Bm, рибосомным повторам; наличие дополнительных фрагментов длиною 10,3 и 2,3 тпн указывает на присутствие повторов с элементом RIBm, а фрагментов в 5,0 и 2,7 тпн - повторов с элементом R2Bm. На рисунке показаны рестрикционные карты мест узнавания для этих двух рестриктаз в рибосомных генах тутового шелкопряда (рис. 3).
Рис 3. Рестрикционные карты повтора рДНК Bombyx morí без вставок (а) и с включением элементов RIBm (б) или R2Bm (в). R - EcoRI, X - Xbal, в скобках указаны дополнительные места рестрикции EcoRI в некоторых повторах, RIBm и R2Bm - инсерционыые элементы (даны не в масштабе)
Содержание повторов рДНК с элементом RIBm заметно различается в геноме пород СК-2 и ПС-5, равно как и их гетерозисных гибридов. В таблице 4 приведены данные по процентному содержанию нормальных и прерванных повторов рДНК у этих пород и гибридов тутового шелкопряда, полученные на
основании обсчета радиоактивности в ЕсоШ - фрагментах и сканирования радиоавтографических пленок. Видно» что содержание повторов рДНК со вставкой типа И (элемент К2Вт) одинаково у разных пород и составляет от 9 до 10%, в то время как содержание повторов со вставкой типа I (элемент ШВш) существенно различно и варьирует от 7,4% у гибрида ПС-5 х СК-2 до 25% у породы СК-2. Таким образом, тутовому шелкопряду присущ межпородный полиморфизм рибосомных генов, являющийся следствием вариантного содержания повторов со вставкой МВт.
Таблица 4
Содержание ЕсоШ-фрагментов в составе рДНК пород и гибридов __ тутового шелкопряда (% от суммы М + ш)
Номер фрагмента Размер фрагментов, тип Порода Гибрид
СК-2 ПС-5 СК-2 х ПС-5 ПС-5 х СК-2
I 16,0 (К1) 25,0+0,90 13,0+0,13 18,0+0,11 7,4+0,08
II 10,8 47,2+0,21 59,5+0,18 52,7+0,23 62,7+0,18
III 8,5 (1*2) 2,9+0,05 2,6+0,01 3,0+0,06 3,1+0,02
IV 7,0 (1*2) 6,0+0,08 6,2+0,06 7,2+0,08 6,9+0,05
V 5,5 12,9+0,11 12,3+0,08 12,5+0,15 13,2+0,03
VI 2,7 6,0+0,03 6,4+0,09 6,6+0,03 6,7+0,04
Результаты блот-гибридизации ЕсоШ фрагментов ДНК, свидетельствующие о широком распространении полиморфизма рибосомных генов по содержанию повторов со вставкой ШВш среди 11 пород и гибридов тутового шелкопряда представлены на рисунке 4.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Рис. 4. Полиморфизм в содержании повторов рДНК со вставкой Я1Вт у разных пород и гибридов тутового шелкопряда:
Маргеланская (2), Бухарская (3), Б1 х Б2 (4), Японская 112 (5), Японская Б (б),СК-2 (7), ПС-5 (8), Украинская-11 (9), Советская-5 (10), Украинская-10 (11), Советская-12 (12), 7 — Нш<ЫП фрагменты фага X. ДНК выделяли из указанных объектов, обрабатывали ЕсоШ и провопили блат-гибридизацию.
У разных пород обнаруживаются существенные различия в содержании повторов рДНК, прерванных элементом ШВт. В целом возможна
вариабельность их относительного содержания от 3 до 25% от общего -количества повторов рДНК. В геноме породы Японская-В повторы со вставкой RIBm отсутствуют вообще, в то время как число повторов со вставкой R2Bm у разных пород и в том числе - в геноме породы Японская-В достигает 8-10%. В геноме пород Советская-5 и Советская-12 (рис. 4) присутствуют повторы рДНК, содержащие дуплицнрованный элемент RIBm в структуре гена 28SpPHK, о чем свидетельствует наличие фрагмента длиной 21 тпн.
Полиморфизм рибосомных генов и продуктивность пород и гибридов тутового шелкопряда. Экспрессия рибосомных генов тесно связана с их структурной организацией. Выявленный нами межпородный полиморфизм рибосомных генов пород и гибридов тутового шелкопряда по содержанию повторов с элементом RIBm, по-видимому, отражает различные потенции транскрибирования кластера рибосомных генов.
Вполне логично допустить, что обнаруженное нами явление межпородного полиморфизма по содержанию повторов рДНК со вставкой типа RIBm, определяет в некоторой степени уровень экспрессии рибосомных генов в геномах взятых в анализ пород и гибридов тутового шелкопряда. В этой связи, соотношение в геноме тутового шелкопряда повторов рДНК с элементами RIBm и R2Bm и без них представляется важным, так как потенциально через экспрессию рибосомных генов это может оказывать влияние на уровень продуктивности пород и гибридов.
Характеристика 17 анализируемых пород и гибридов тутового шелкопряда по содержанию нормальных и прерванных повторов в рДНК и по некоторым биологическим и технологическим показателям (табл. 5). В частности, из рассматриваемых пород тутового шелкопряда низкопродуктивными являются: Маргеланская,, Бухарская и Скороспелая-2 Они характеризуются высоким содержанием в геноме повторов рДНК с элементом RIBm (23,0; 14,2; 25,0 % соответственно). С другой стороны, высокопродуктивные породы: Украинская-14, Украинская-11, гибрид Б1хБ2 имеют низкое содержание разорванных 28S генов (3,0; 5,4; 4,0% соответственно). В геноме высокопродуктивной породы Японская-В и гибрида Укр-14хУкр-13 повторы с элементом RIBm не обнаруживаются, что указывает на самый высокий уровень содержания транскрибируемых повторов рДНК среди анализируемых пород и гибридов B.mori. При этом габрид Укр-14 х Укр-13 и Японская-В обладают наилучшими биологическими и технологическими показателями. Впервые выявлено существование положительной корреляции между содержанием повторов без вставки RIBm в рДНК тутового шелкопряда и массой кокона: коэффициент корреляции ( г) составил 0,797 (при Р=0,0001). По-видимому, найденные различия в содержании повторов рДНК, прерванных вставкой RIBm, в геноме пород и гетерозисных гибридов тутового шелкопряда в определенной мере отражают молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе продуктивности тутового шелкопряда.
Таблица 5
Характеристика пород и гибридов тутового шелкопряда по содержанию нормальных и прерванных элементами Ш и И2 повторов рДНК и по некоторым биологическим и технологическим
показателям
Породы и гибриды тутового шелкопряда Содержание нормальных повторов рДНК,(в%) Содержание повторов рДНКс элементом (в %) Содержание повторов рДНКс элементом К2, (в %) Масса кокона, (в г)
1 Японская-В 90,4 н. о. 9,6 2,19
2 Укр.-14хУкр.-13 89,8 н. 0. 10,2 1,94
3 Украинская-14 88,4 3,0 8,6 2,00
4 Е1 хБ2 87,4 4,0 8,6 1,68
5 Украинская-11 85,8 5,4 8,8 1,85
6 Советская-5 84,8 6,2 9,0 1,76
7 ПС-5 х СК-2 82,0 7,4 10,0 1,60
8 Украинская-13 82,9 7,6 9,5 1,72
9 Украинская-10 83,0 7,8 9,2 2,11
10 Укр.-13 х Укр.-14 82,2 8,2 9,6 1,93
11 Японская-112 77,8 11,0 10,2 1,45
12 Советская-12 80,0 11,5 8.5 1,50
13 Пятигорская-5 78,2 13,0 8,8 1,52
14 Бухарская 76,0 14,2 9,8 1,68
15 СК-2 х ПС-5 71,2 18,0 10,2 1,54
16 Маргеланская 67,0 23,0 10,0 1,42
17 Скороспелая-2 66,1 25,0 8,9 1,30
и.о. - не обнаруживаются
Распределение и характер наследования повторов рДНК. прерванных элементом ЮВт. в геноме тутового шелкопряда. Нами обнаружено еще одно интересное явление, а именно: количественное содержание повторов рДНК со вставкой типа I наследуется по материнскому генотипу. Первоначально напрашивалось предположение, что такой тип наследования обусловлен особенностями набора половых хромосом у мужских и женских особей тутового шелкопряда. У В .топ пол формируется комбинацией Ъ и V/ хромосом; при этом у самок присутствуют хромосомы Ъ и АУ (гетерогаметный тип), а у самцов -только 72. (гомогаметный) (Тагила, 1978). Было высказано мнение, что единственный ядрышковый организатор /ЯО/ у В.топ сцеплен с половыми хромосомами, как это имеет место у дрозофилы. Тогда возможен вариант, при котором ЯО шелкопряда^ локализующийся в половых хромосомах, содержит повторы со вставкой ШВт только в W хромосоме. В этом случае наши данные можно объяснить тем, что только самки шелкопряда имеют определенное количество повторов со вставкой Я1Вш, в то время как в геноме самцов они
вообще должны отсутствовать, В соответствии с этим наследование количественного содержания повторов рДНК с элементом ШВт должно осуществляться только через материнский генотип.
Для решения этого вопроса нами была исследована структурная организация рибосомных генов мужских и женских особей пород СК-2 и. ПС-5 тутового шелкопряда. Из представленных на рис. 5 результатов видно, что как мужские, так и женские особи одной породы шелкопряда имеют одинаковое количество повторов рДНК со вставкой типа RIBm. Таким образом, рибосомные гены тутового шелкопряда не сцеплены с половыми хромосомами, а локализованы на одной из аутосом. К такому же выводу одновременно пришли и японские исследователи при изучении ЯО дикого типа шелкопряда В. mandarina в сопоставлении с ЯО у домашнего вида B.mori (Maekawa et al., 1988).
1
3 4
ui.n. 23,09,496,57-
"r. 'У'-f-r'
■I**? ■
tit , ■ ■ JV-SÍMS.
4.26—
ЙНЯ- fííHvk. >f , -f
Рис. 5. Наличие повторов рДНК со вставкой RIBm (указано стрелкой) у мужских и женских особей тутового шелкопряда. ДНК выделяли из семенников (2, 3) и соматических тканей мужских (4, 5) или женских (6, 7) особей. 1 - Hind Ill-фрагменты фага Я; 2,4,6, - порода СК-2, 3,5,7- порода ПС-5.
Характеристика наследования фракции рибосомных повторов с инсерционным элементом RIBm была получена на основе молекулярно-генетического анализа рДНК генома трех пород тутового шелкопряда: Украинская-11, Украинская-13, Украинская-14 и полученных на их основе прямых и обратных гибридов. На рис. 6 представлены результаты блот-гибридизации EcoRI- фрагментов ДНК двух из перечисленных выше пород и их гибридов.
Рис. 6. Наследование повторов рДНК со вставкой RlBm.
1 - Нтд-Ш-фрагменты фага А,;
2 - порода Украинская-13;
3 - порода Украинская 14; 4- гибрид У1ф.-13 хУкр.-14; 5 - гибрид Укр.-14 х Укр.-13.
Относительное содержание повторов рДНК с элементом RIBm в геноме пород Укр-13 и Укр-14 составляет 7,6 и 3,0%, соответственно. У гибридов, полученных в результате прямого скрещивания, практически сохраняется число рибосомных повторов с элементом RIBm: у гибрида Укр-13хУкр-14 оно составляет 8,2%, а у гибрида Укр-14хУкр-13 такие повторы практически не обнаруживаются, поскольку в материнской породе Укр-14 рибосомные повторы с элементом RIBm составляют лишь 3%. Это, вне всякого сомнения, свидетельствует о том, что количественное содержание повторов со вставкой RIBm наследуется по материнскому генотипу. Полученные данные позволяют высказать предположение о возможности участия материнского генотипа в процессах соматических перестроек хромосомной локализации элемента RIBm в геноме тутового шелкопряда. По нашему мнению данные о структуре рибосомных генов тутового шелкопряда являются удобным молекулярно-генетическим маркером для обнаружения межпородного полиморфизма и могут быть использованы в практической селекции при подборе родительских пар для получения высокопродуктивных гибридов.
Изучение полиморфизма ДНК тутового шелкопряда методом геномной
дактилоскопии
Изучение генетического разнообразия, индивидуальности и родства организмов на уровне анализа вариабельности структуры ДНК является одной из актуальных проблем современной биологии. В значительной мере решению этого способствует разработка технологии геномной дактилоскопии, основанной на использовании высокоэффективных зондов полиморфизма (минисателлитных ДНК), способных детектировать различные типы гипервариабельных локусов генома (Jeffreys et al, 1985; Vassart et al., 1987; Джинчарадзе и др., 1987).
Различные варианты геномной дактилоскопии оказались перспективными для паспортизации пород животных и сортов растений, для оценки генетической вариабельности и родства пород внутри вида (Рысков и др., 1988, 1999). Изучение возможности геномной дактилоскопии для анализа генома, маркирования генофонда и паспортизации пород тутового шелкопряда представляет значительны интерес и оправдано тем, что генетика этого объекта прекрасно изучена, имеется большой спектр коллекционных и промышленных пород и их гибридов, осуществлено получение генетически строго определенных клонов и линий.
Для выбора оптимального варианта геномной дактилоскопии тутового шелкопряда ДНК насекомого обрабатывали различными эндонуклеазами рестрикции, а именно - EcoRI, BamHI, PstI, Smal, HindHI, BspRI, AIuI и Mspl, а в качестве зондов использовали ДНК фага М13, зонд Джеффриса и несколько олигонуклеотидных зондов, сконструированных по типу простых последовательностей: /С AC/j, /ТСС/j, /GACA/4.
При анализе картин гибридизации (рис. 7) оказалось, что наилучший спектр дает ДНК тутового шелкопряда, гидролизованная ферментом Mspl: все высокомолекулярные гибридизующиеся фрагменты попадают в наиболее информационную область от 10 до 2 тыс.п.н., которая имеет достаточно светлый
фон. Переваривание эндонуклеазой рестрикции А1и1 приводит к образованию полос гибридизации с размером менее 3,5 тыс.п.н., что не удовлетворяет требованиям, предъявляемым технологией. Гидролиз остальными ферментами приводил к получению "трудно-читаемых" спеюров из-за того, что основная часть гибридизующихся фрагментов имеет размер выше 10 тыс.п.н., а это перегружает высокомолекулярную область и, как следствие, дает темный фон, затрудняющий детектирование полос.
Полученные с зондами типа простых последовательностей /САС/5 и /ТСС/5 гибридизационные картины для ДНК тутового шелкопряда представлены множеством сливающихся полос, с трудом поддающихся детектированию. Вследствие малой длины олигонуклеотидного зонда, он гибридизуется почти с каждым рестриктом ДНК, фиксированным на фильтре. Частая встречаемость последовательностей, комплементарных этим зондам в геноме тутового шелкопряда, еще больше затрудняет идентификацию полос за счет снижения отношения сигнал/фон. Все эти факты однозначно свидетельствуют о непригодности олигонуклеотидных зондов для выявления полиморфизма ДНК тутового шелкопряда, но позволяют оценить распространение олигонуклеотидных последовательностей в геноме насекомого. В случае /САС/з и /ТСС/5 эти последовательности не кластеризованы и равномерно распространены. Отсутствие гибридизации с меченой последовательностью /О АС АД связано, по всей видимости, с достаточно низкой встречаемостью данной последовательности в геноме тутового шелкопряда.
Таким образом, вариант геномной дактилоскопии с использованием Мэр1 в качестве эндонуклеазы рестрикции и ДНК фага М13 в качестве зонда является наиболее предпочтительным для изучения полиморфизма ДНК тутового шелкопряда.
Наиболее часто встречающиеся четыре типичные мажорные полосы обозначены прописными латинскими буквами А, В, С, О. Для данной системы анализа полиморфизма (эндонуклеаза рестрикции Мер! и зонд ДНК фага М13)
1 2 3
Рис. 7. Гипервариабельные последовательности в Мзр1-гидролизате ДНК грены породы Украинская новая на различых стадиях развития: Е] (1), Е2 (2), Е3 (3).
эти фрагменты можно рассматривать как популяционные маркеры. На дакгилограммах их положение определено с помощью молекулярных маркеров (ДНК фага X, рестрицированная ЕсоМ). Фрагменты А, В, С, Ь расположены на уровне от 2 до 6 тпн. Кроме того, маркированы зоны: а - между 7,4 тпн и фрагментом А, Ъ - между А и В, с - между В и С, с! - между С и О. В области менее 2 тпн, как правило, обнаружены лишь минорные полосы гибридизации, которые далее не рассматривают (рис. 7). Для сопоставления фрагментов гибридизации в одних и тех же зонах, но полученных в разных экспериментах, каждую зону разбивают на одинаковое число секторов: а - на 5, Ь - на 3, с - на 3, д - на 5. Каждому сектору зоны присваивают собственный номер, а фрагментам, находящимся в них, присваивают номер сектора. Полосы с одинаковыми номерами считают совпадающими.
Для выяснения возможности паспортизации промышленных пород тутового шелкопряда анализировали распределение пшервариабельных полос в М$р1-гидролизате клеточной ДНК у индивидуумов, семей и пород. Особенности изучаемого объекта накладывают определенные ограничения на эти эксперименты. ДНК семей и пород, выделенная из сотен и тысяч яиц, представляет собой сложную смесь индивидуальных геномов. В результате на картинах гибридизации должны выявляться наиболее часто встречающиеся совпадающие полосы, а редкие полосы могут либо вообще отсутствовать, либо проявляться как минорные. Таким образом, «разбавление» индивидуальных геномов в препарате ДНК приводит к более четкому выражению общих для всех геномов локусов и, в результате, к менее вариабельным картинам гибридизации (табл. б)
Таблица 6
Представительство М13-минисателлитов в МэрТ-гидролизате
ДНК породы ПС5
Образец Типичные фрагменты Фрагменты в секторах зон
А В С О а Ь с а
Особи породы ПС5
1 + - + + 23
2 + + - + 2
3 + - + + 23
4 - + + + 23
5 + - + + 2,43
6 + + + + 3 1,23,4,5
7 + + + - 2,3 1,2,43
8 + - + + 3 23,4,5
9 + - + + 3 23,4,5
Семьи породы ПС5
1 + + + + 1,2,43 23 233
2 + + - + ■ 1АЗА5 1,2,3 2 1,233
3 + + * + 1,2,4,5 3 23,5
4 + - + + 1Д,4,5 23 23,5
П орода ПС5
1 | + | + * + 1 + 1 1Д4 2 23,5
Буквенное обозначение - АВСОа^гацСгдгдз«^
На рисунке 8 представлены гипервариабельные последовательности в ДНК пород тутового шелкопряда.
В таблице 7 гибридизационные спектры различных пород представлены в виде определенных буквенных сочетаний. Во всех случаях наблюдаются отличия гибридизационных картин как по числу, так и по положению фрагментов. ДНК пород имеют как близкие (Китайская 110 и Украинская 14), так и сильно отличающиеся (Даидзо, Советская 12, Мерефа 5) спектры гибридизующихся фрагментов. Хотя число мажорных полос на картинах гибридизации относительно невелико, представляется возможной идентификация каждой из пород.
Рис. 8. Гипервариабельные последовательности в ДНК пород тутового шелкопряда.
1 - партеноклон ПКА 261; 2-Даидзо; 3-Мархамат, 4 - Китайская 110;5-Украинская 14; 6 - Украинская 13; 7 -Мерефа 5; 8 - Украинская новая; 9 — Украинская 11; 10 - Советская 12; 11 - Советская 5; 12 - Бухарская. Данные независимых экспериментов.
Таблица 7
Паспортизация пород тутового шелкопряда по спектрам гипервариабельных фрагментов М$р1-гидролизата ДНК
Порода. : Набор гибридиэуошихся фрагментов
ПКА 261 $ а в с в в1ага4вэъ1ъ3саа1(12а3(1э
Даидэо а в е2е3
Мархаыаг А Б С I)
Китайская 110 А В С С3
Украинская 14 А в с а2
Украинская 13 А В С В С]С3
Мерефа 3 А В С Р а1а2а4аэЬ2Ъ3е3а1<12(13<1э
Украинская новая а в с с ъ1с3<1|(12(13(1э
Украинская 11 А В С С C2<IJ<I2<I41I5
Советская 12 а С с
Советская 3' А В С Б а2<12
Бухарская А С В а2а3а4Ь2Ь3с2(13
Проблема детектирования отдельных характеристических полос ДНК-фингерпринта особенно важна при анализе гибридных организмов, полученных при различных вариантах скрещивания, в частности, когда необходимо оценить вклад родительского генома в процессе селекции признаков или судьбу его в целом.
Оценка возможности детектирования отдельных локусов различной копийности осуществлена в модельном опыте, В качестве материала для исследования были выбраны две изогенные популяции тутового шелкопряда: ПК-44 и обоеполая, практически полностью гомозиготная линия РЬ-25. Биологический материал в виде генетически идентичной в пределах популяции грены был смешан механически для получения следующих весовых соотношений:
РЬ-25 1 1 1 1
ПК-44 1 4 10 20
Выбор материала для исследования продиктован тем, что изучаемые изогенные популяции генетически значительно отдалены друг от друга. Партеноклон ПК-44 выведен из современной породы Мархамат, тогда как линия РЬ-25 получена от сложного гибрида промышленных пород 30-40-х годов. Это позволяло ожидать значительных различий в распределении гибридизационных полос на радиоавтографе. Действительно, в ходе эксперимента выяснилось, что клон РВ-25 не имеет полосы, обозначаемой в генетическом паспорте "А"' и имеет полосу "В". В противоположность этому, партеноклон ПК-44 лишен
Рис. 9. Выявление гипервариабельных локусов в смеси ДНК двух партеногенетических клонов тутового шелкопряда.
1 - РЬ-25;
2 - РЬ-25:ПК-44 (1:1), 5 -РЬ-25:ПК-44 (1:4);
4 - РЬ-25 :ПК-44 (1:10);
5 - РЬ-25:ПК-44 (1:20); 6-ПК-44.
Результаты эксперимента подтверждают первоначальную гипотезу: с уменьшением дозы генотипа клона РЬ-25 от 50 до 5% наблюдается постепенное снижение яркости гибридизационной полосы "В" вплоть до почти полного ее исчезновения при соотношении геномов 1:20. Интересно отметить, что аналогичные закономерности можно проследить и на примере некоторых
минорных клонспецифических полос (отмечены слева черточками). Одновременно, в случае полосы "А" постепенное увеличение дозы генотипа ПК-44 от 50 до 95% не вызывает столь же постепенного нарастания яркости гибридизанионной полосы. Это явление может быть объяснено тем, что при достижении определенного порогового значения концентрации рестрикга зависимость яркости полосы от экспозиции имеет нелинейный характер, т.е. длительное экспонирование рентгеновского материала приводит к выравниванию оптической плотности радиоавтографа.
Таким образом, продемонстрирована зависимость яркости -гибридизационной полосы от концентрации фрагмента в диапазоне от 5 до 95% от максимальной. Наиболее значительные отличия наблюдаются в дорожках 2-5, что соответствует диапазону концентрации от 50 до 5% от полной для генотипа, несущего полосу "В". Полученные результаты могут быть полезны при анализе гибридных геномов.
Исследование гипервариабельных локусов при скрещивании рассмотрено на блоке пород СК2 и ПС5. На рисунке 10 представлены гибридизационные спектры ДНК пород СК2, ПС5 и их прямого и обратного гибридов. В этих экспериментах использовали формамидную гибридизацию, позволяющую более эффективно детектировать низкомолекулярные фрагменты. Оказалось, что в данных условиях картины гибридизации ДНК пород СК2 и ПС5 практически неотличимы (дор. I и 2). В то же время в ДНК гибридов наблюдаются четкие отличия. Так для ДНК прямого гибрида характерно уменьшение интенсивности двух верхних полос гибридизации (дор. 3). Для обратного гибрида сильно ослабляется интенсивность полосы В и появляется мажорная полоса над А (дор. 4). При сравнении гибридизационных спектров ДНК гибридов (дор. 3 и 4) видно, что число совпадающих фрагментов меньше такового для исходных пород и составляет 75%. Интерпретация этих различий может быть основана на предположении об избирательности наследования определенных генотипов в популяции. Интересно отметить, что некоторые дополнительные полосы гибридизации, обнаруживаемые в ДНК гибридов, характерны либо для материнской, либо для отцовской породы (отмечено звездочкой). Возможно, это связано с преимущественным наследованием определенных гипервариабельных локусов.
Рис. 10. Гипервариабельные последовательности в ДНК пород СК2, ПС5 и их гибридов.
1 - родительская порода СК-2,
2 - родительская порода ПС-5,
3 - гибрид СК-2 х ПС-5,
4 - гибрид ПС-5 х СК-2. Анализировали ДНК суммарной грены
Изучение генотипическнх различий организмов имеет важное значение для исследований как фундаментального, так и прикладного характера. Для этого нами проведен сравнительный анализ МБр1-гидролизата суммарной клеточной ДИК отдельных особей партеногенетического клона №9 тутового шелкопряда, полученных двумя типами партеногенеза.
Образцы ДНК выделены из мышечной ткани отдельных личинок тутового шелкопряда. Для исследования взят партеногенетический клон №9 амейотического типа, у которого анализировались как родительские особи, так и потомки, полученные амейстгическим и мейотическим способами. Как известно, все свободно скрещивающиеся виды, в том числе и тутовый шелкопряд, представляют собой численно бесконечную массу генетически уникальных индивидуумов. При амейотическом типе партеногенеза диплоидное ядро неоплодотворенного яйца, побужденного к развитию прогревом, не претерпевает редукционного деления, как обычно, и развитие яйца протекает с полностью сохранившимся материнским ядром. В результате па;ртеногенетические индивидуумы состоят из генетически идентичных самок, являющихся точными копиями матери (Р $ Аа, ВЬ -> Рр $ Аа, ВЬ). При получении потомков посредством мейотического партеногенеза неопдодотворенное ядро яйца претерпевает оба деления созревания (редукционное и эквационное), в результате выделяется гаплоидный пронуклеус. Его два идентичные ядра, возникшие в результате митотического деления, сливаются вместе, образуя диплоидное ядро, с которым и протекает дальнейшее развитие яйца. Такой цитогенетический механизм приводит к возникновению индивидуумов не сходных между собой (Р $ ZWi Аа -> Ррс? ЪЪКК\ $ ТХш) только одного мужского пола, потому что яйца генотипов WWAA и Wwaa погибают. При этом число типов потомков возрастает пропорционально квадрату гетерозиготных пар аллелей, а особи будут отличаться сочетанием различных аллелей (АА, Аа, аа), и таких гетерозиготных пар обычно имеется очень много.
При анализе распределения гипервариабельных полос в спектрах четырнадцати родительских особей, полученных путем амейотического партеногенеза (самки), обнаруживаются идентичные гибридизационные спектры, которые можно формализовать в следующем виде: АВСРЬчс^сЫэ&^сМтМэ). В спектрах встречаются наиболее типичные фрагменты, описанные нами как популяционные маркеры, характерные для тутового шелкопряда (фрагменты А, В, С, О). Особенностью данного клона является то, что фрагмент В проявляется в виде минорной полосы, плохо детектируемой на картинах гибридизации. В спектрах отсутствуют гибридизующиеся фрагменты в области свыше б тпн, что характерно для ДНК тутового шелкопряда ряда пород, но, в отличие от них, в ДНК индивидуумов партеногенетического клена имеется большое число полос гибридизации в низкомолекулярной области ниже фрагмента О (рис. 11).
Рис. 11 Гипервариабельные последовательности М5р1-гидролизате ДНК ' тутового шелкопряда.
а: 1-3 - родительские особи партеноклона № 9, полученные амейотическим путем партеногенеза; 4-6 - потомки (самки), полученные амейотическим типом партеногенеза;
б: 1-10 - потомки (самцы), полученные мейотическим типом партеногенеза.
В качестве гибридизационного зонда использовали 32Р-меченную ДНК фага М13.
При размножении данного клона таким же амейотическим типом партеногенеза получаются особи (самки), генетически идентичные как родителям, так и друг другу. Это было показано на ДНК 12 потомков. При анализе генома 13 индивидуумов партеногенетического клона, полученных путем мейотического партеногенеза (самцы), были получены индивидуум-специфичные картины гибридизации, отличающиеся друг от друга по числу и характеру распределения гипервариабельных фрагментов. В отличие от самок, полученных амейотическим партеногенезом, в спектрах гибридизации у самцов не обнаруживается типичный фрагмент В, фрагменты А и С встречаются лишь у некоторых особей, типичный фрагмент Р присутствует в ДНК как родителей, так и всех потомков. Определенные отличия имеются по ряду полос в зонах между фрагментами В, С и О (рис. 11, табл. 8).
Таблица 8
Представительство М 13-минисателлитов в МврЬгидролнзате ДНК индивидуумов партеногенетического клона № 9, полученных путем меяотнческого партеногенеза (самцы)_
индивидуум I» ; НаДор гиорилшэуршихся фрагменте»
1 с х> й1«12<13ч4<а5с1влтс1вй9
2 сб <ачав<17
3 а о а,а5а4аа А а о Лга4лв
5 леи 42а4<1вав
в АС <1а<1в
т. ао <15ачаэав
в а о <1в
« а с с а2л3
ю а с х> аэ<14
11 со лглллааай7л9
12 а » л3й4лвав
13 а й йл«4аэав<17
Необходимо подчеркнуть, что геномная дактилоскопия в использованном виде выявляет несравнимо большее число генотипических вариантов по сравнению с традиционными методами, базирующимися на данных о белковом полиморфизме и вариабельности индивидуальных ферментов и их множественных форм у тутового шелкопряда (Егорова, Насириллаев, 1987).
Активность генома в онтогенезе тутового шелкопряда
Передача генетической информации возможна лишь при матричном биосинтезе нуклеиновых кислот. Согласно современным представлениям, процессы репликации и транскрипции, осуществляющиеся на ДНК-матрице, предполагают локальную деспирализацию ее „ вторичной структуры. Функциональная активность генома, таким образом, связана со структурной гетерогенностью ДНК. Появление отдельных молекул ДНК с разрыхленной дестабилизированной вторичной структурой обнаруживается в те периоды жизнедеятельности, которые характеризуются наличием интенсивных синтетических процессов, проходящих на ДНК-матрице. Присутствие молекул ДНК, вовлеченных в синтетические процессы репликации и транскрипции, т.е. содержание метаболически активной ДНК может являться реальным показателем активности генома.
Исследования биосинтеза нуклеиновых кислот в онтогенезе насекомых и тутового шелкопряда, в частности, сводились в основном к их количественному определению (Chino, 1956; ЗбарскиЙ и др., 1959; Коничев, 1974; Furusawa et al., 1984; Konde et al., 1987; Родина, 1988).
Внутри стадий онтогенетического развития насекомых выделяются морфо- фу нкци онал ьны е этапы, которые отличаются замедлением или ускорением процессов органогенеза и изменением общего уровня и направленности метаболизма (линька личинок, гистолиз и гистогенез куколок, половое созревание, размножение и старость имаго).
Данные о содержании молекул ДНК, вовлеченных в процессы репликации и транскрипции, в качестве реального показателя метаболической активности генома побудили нас обратиться к изучению этого явления у тутового шелкопряда в процессе его онтогенеза.
Изменения оптической плотности растворов ДНК, выделенной из организма тутового шелкопряда на разных стадиях его развития, после инкубации с формальдегидом и фракционирования хлороформом представлены на (рис. 12).
Максимальная степень высвобождения метаболически активной ДНК в грене наблюдается через 12 часов после кладки, в период диапаузы и зимовки метаболически активная ДНК в грене отсутствует. Она обнаруживается с самого начала весеннего развития грены, причем ее количество резко возрастает на второй день постдиапаузного развития (ДО, несколько снижается к шестому дню и снова возрастает на девятый день развития (Е3), т.е. перед выходом мурашей.
Рис. 12. Изменение оптической плотности растворов ДНК, выделенной из грены, личинок, куколок и имаго тутового шелкопряда после инкубации с формальдегидом (а) и фракционирования с хлороформом (б). Точками отмечена ДНК самок. Условные обозначения:
Грев*
1- веоидодогворениая грен» 2 - скжмтлспккнк грен»
3-3 час* после кладка
4-12 часов после кладка
5-24 часов после кладки
6-36 часов после кладки
7-диапаузнрую1иая грена
8- начало зимовки
9 - кон tu зимовка 10-стадии разектна D1 11 - ставка развитие El
12-CT ал на развития £2
13-стадия развития ЕЗ Личинка
И- начало I возраста 1! - коней I возраста К - начало II возраста
1? - конец II возраста IS-начало 111 возраста 19- конец III возраста
20 - начало IV возраста
21 - конец IV возраста
22 - начало V возраста
23 - конец V возраста Предку колка
24 - 1-ый день завивки кокоиа
25 - 3-ив лень завивки коком
Куколка
26 • 1-ый день развитая
27 - 4-ый день развитая
28 • 7-ой день развитая
29 - 14-ый день развитая Имаго
30 - бабочка » день вылета нэ кокон*
В ходе личиночного возраста наблюдается цикличность процессов дестабилизации и стабилизации структуры ДНК: наибольшее содержание метаболически активной ДНК характерно для начала каждого возраста (белоголовые гусеницы, только что слинявшие, еще не питающиеся), наименьшее - в конце каждого возраста (сон перед линькой). Ясно вырисовывается тенденция к снижению количества метаболически активной ДНК у только что прошедших линьку гусениц от I к IV возрасту и увеличение этого показателя сразу после линьки на V-ый возраст.
В период окукливания метаболически активная ДНК в первый день завивки кокона представлена в большей степени у самцов, что, вероятно, связано с завершением у них к этому времени процесса сперматогенеза. Количество метаболически активной ДНК несколько уменьшается к моменту образования куколки, а затем существенно возрастает к четвертому дню куколочной фазы развития, но уже в большей степени у самок, у которых как раз в этот период интенсивно протекает процесс овогенеза. С четвертого по седьмой день куколочной фазы развития содержание метаболически активной ДНК несколько снижается, совсем не выявляется в момент завершения линьки на бабочку и характеризуется сравнительно невысоким значением у только что вышедшей из кокона бабочки.
Таким образом, высвобождение метаболически активной ДНК в онтогенезе тутового шелкопряда происходит циклически, соответствуя основным фазам и этапам в развитии насекомого, согласуется с динамикой содержания и интенсивностью биосинтеза ДНК и РНК (Збарский и др., 1959; Niemerko, 1956; Chinzei, Toyo, 1972; Landani, 1972; McDowell et al, 1974; Muller et al, 1974; Кулыев, 1982; Родина, 1988).
Дезоксирибонуклеазная (кислая и нейтральная) активность растворимых белков тутового шелкопряда, выявленная спекггрофотометрическим методом на
разных этапах его развития, весьма незначительна в период эмбрионального развития, максимальна у личинок, снижается к первому дню завивки кокона. В период метаморфоза на стадии гистолиза выявляется кислая ДНКаза, на стадии гистогенеза - нейтральная. Динамика ДНКазноЙ активности в целом не повторяет таковую метаболически активной ДНК, изменения структурного состояния ДНК в онтогенезе тутового шелкопряда не несут отпечатка деградирующего воздействия на ДНК ДНКаз как в клетке, так и в момент выделения ДНК.
Оценка функционального состояния хроматина грены тутового шелкопряда в период постдиапаузного развития по его устойчивости к физическим воздействиям (ультразвук), по соотношению основных компонентов, по степени связывания гистонов с ДНК четко продемонстрировала наименьшую устойчивость хроматина к воздействию ультразвуком, наибольшую степень обогащенности его гистонами и негистоновыми белками, менее прочную связь гистонов с ДНК (обработка хроматина растворами хлорида натрия различной концентрации от 0,4 М до 2.0 М), что характеризует активность генома тутового шелкопряда на стадиях Д] и Е3, для которых характерно наибольшее количество метаболически активной ДНК в грене в период ее постдиапаузного развития (табл. 9).
Таблица 9
Соотношение белковых компонентов хроматина грены тутового __шелкопряда_
Стадии развития грены Содержание белка в весовом отношении к ДНК
Гистоны Негистоновые белки
Зимовка 0,87*0,03 1,40*0,03
Весеннее развитие
^ 1,90±0,05 3,78*0,04
Е| 0,99*0,03 1,45*0,04
Е3 1,98*0,05 2,28*0,05
Объем биосинтеза нуклеиновых кислот в пред- и постдиапаузирующей грене тутового шелкопряда оценивали по интенсивности включения меченых предшественников (3Н-тимидина и 3Н-уридина) в кислотонерастворимую фракцию.
Полученные данные по интенсивности включения меченых предшественников в кислотонерастворимую фракцию грены тутового шелкопряда представлены на (рис. 13). В неоплодотворенной и свежеотложенной грене тутового шелкопряда интенсивность включения меченых предшественников незначительна. Она возрастает через 12 часов после кладки грены, причем в этот период включение 3Н-тимидина является максимальным для всей преддиапаузной стадии. Для трены спустя 24 часа после кладки характерна пониженная интенсивность включения меченых предшественников в кислотонерастворимую фракцию грены.
13.. Интенсивность ■ включения Н-тимидина (-
-) и
Рисунок
3Н-уридина (- - -) в кислотонерастворимую фракцию клеточной суспензии, полученной из грены тутового шелкопряда.
Условные обозначен на:
1 - неоплодотворенна» грен»
2 - свежеотложенная грена
3-12 часов после кладки
4-24 часов после кладки
5-36 часов после кладки
6-48 часов после кладки
7 - энмуюиим грена
8- 1-ыЙ день весеннего развития
9 - 2-ой день весеннего развит» (О^
10 - 3-ий лень весеннего развила
11 - 4-ый день весеннего развит* (Е))
12 - 1-ый лень весеннего развит«
13 - 6-ой день аесеннего раза или
14 - 7-ОЙ день весеннего развита 15-8-9-ыИяень весеннего ртиги» СЕ])
Включение 3Н-тимидина продолжает понижаться по мере увеличения времени с момента кладки, в то время как включение 3Н-уридина обнаруживает значительный подъем в грене спустя 36 часов после кладки, а затем начинает уменьшаться. В литературе имеются данные, свидетельствующие в пользу того, что на ранних стадиях развития синтез ДНК у насекомых тормозится оплодотворением, такой латентный период составляет 1-2 часа (ЗаЬоиг, 1972). В наших исследованиях появление метаболически активной ДНК наблюдается через 3 часа после кладки грены. В раннем развитии отмечен латентный период и для биосинтеза РНК (Еш1у, ОоЬк^зг, 1970; Кикнадзе, 1972; Кафиани, 1975), в течение которого используются запасенные в овогенезе РНК. Обнаруженная в нашем эксперименте меньшая интенсивность включения эН-уридина в свежеотложенной грене по сравнению с неоплодотворенной, по всей вероятности, является отражением синтеза РНК в овогенезе и появлением латентного периода на ранних стадиях развития зародыша. Грена периода 12-ти часов после кладки характеризуется высокой интенсивностью включения обоих предшественников. На этой стадии развития в преддиапаузной грене отмечено также наибольшее содержание метаболически активной ДНК являющейся, по-видимому, выражением суммарной синтетической активности ДНК-матрицы.
Через двое суток после кладки интенсивность включения меченых предшественников снижается. В этот период развитие грены приостанавливается, она темнеет и переходит в состояние диапаузы.
В развивающейся постдиапаузной грене интенсивность включения меченых предшественников максимальна на стадии Д[ для 3Н-уридина и 3Н-тимидина, затем она уменьшается к стадии Е2 и после чего возрастает вновь к моменту выхода мурашей (стадия Е3).
Именно на стадиях Д] и Ез геном зародыша характеризуется наиболее высоким содержанием метаболически активной ДНК, что связано, по всей вероятности, с довольно активными в данный период процессами транскрипции и репликации ДНК. На стадии Е2 геном тутового шелкопряда характеризуется низким уровнем синтетических процессов. К этому периоду в основном закончен органогенез и в течение последних двух дней постдиапаузного развития зародыш начинает быстро расти. Стадия Е2 является переходным моментом от периода органогенеза к дальнейшему интенсивному росту органов и тканей уже в основном сформировавшейся личинки.
Весь комплекс проведенных исследований позволил выявить периоды наибольшей активности генома тутового шелкопряда (грена через 12 часов после кладки, стадии Д[ и Еэ постдиапаузного развития, начало каждого личиночного возраста, личинки первого дня завивки кокона, куколки четвертого дня развития) и установить, что содержание метаболически активной ДНК является одним из реальных показателей этой активности.
Активность генома исходных пород тутового шелкопряда и полученных при их
скрещивании гибридов
Исследования метаболически активной ДНК у гетерозисных гибридов были проведены на весьма ограниченном числе животных (Яковлев, 1968) и растительных (Конарев и др,, 1971; Гилязетдинов и др., 1971) объектов. Показано увеличение содержания ДНК с дестабилизованной вторичной структурой у гибридов по сравнению с родительскими формами. Тутовый шелкопряд является крайне удобным объектом для постановки такого рода работ, так как при скрещивании различных его пород получено значительное количество гибридов, отличающихся разной степенью гетерозиса.
Данные о содержании метаболически активной ДНК в грене тутового шелкопряда на стадии Д] (она наиболее удобна для проведения массовых анализов) в период весенней выкормки гибридов САН 17хСАН 21, САН 21хСАН 17, Таш 12хТаш 13, Таш 13хТаш 12, СК2хПС5, СК5хПС2, УкрПхУН, УНхУкр II представлены втаблице 10. Содержание метаболически активной ДНК у гибридов САН 17хСАН 21 и САН 21хСАН 17 различно и характеризуется наибольшей величиной у второго гибрида, значительно превосходя исходные породы. Высокое содержание метаболически активной ДНК у гибрида САН 21хСАН 17 по сравнению с исходными породами и промежуточное значение его у гибрида САН 17хСАН 21 положительно коррелирует с такими биологически показателями, как масса кокона и жизнеспособность гусениц (по абсолютной величине).
У гибрида САН 17хСАН 21 и у ташкентских гибридов содержание ДНК с дестабилизованной вторичной структурой не превышает такового у исходных пород, они имеют и более низкие биологические показатели, гетерозис выражен крайне слабо или полностью отсутствует. Более детально характер связи между степенью дестабилизации ДНК у исходных пород и гибридов с величиной гетерозиса у последних прослежен нами при работе с породами СК2, ПС5, их гибридами, а также Укр Ц, Укр 13, УН и их гибридами в весеннюю и летнюю выкормки.
Таблица 10
Сопоставление содержания метаболитнческн активной ДНК в грене с показателями жизнеспособности и массы кокона пород н гибридов
тутового шелкопряда
Гибриды А Б Жизнеспособность Гусениц Масса кокона
Весенняя выкормка
САН 17 х САН21 -2,59 -2,83 -1,36 457
САН21 х САН 17 +25,12 +24,82 +3,76 +14,89
Таш12 х Таш13 ■ -1,29 -3,36 -0,99 +8,39
Таш1Э х Таш12 -7,65 -8,60 -8,61 0
СК2 х ПС5 +22,46 +21,38 +3,62 +7,34
ПС5 х СК2 +11,86 +11,47 +2,58 +6,21
Укр11 хУН +24,51 +23,64 +5,80 +12,70
Ун х Укр11 +24,93 +24,02 +6,02 +13,19
Летняя выкормка
СК2 х ПС5 +33,80 +31,32 +6,08 +8,02
ПС5 х СК2 +25,65 +25,62 +5,23 +6,98
Укр13 х УкрП +32,40 +30,82 +14,10 +9,87
УкрП х Укр13 +32,68 +33,41 +15,42 +10,50
Характеристика пород и гибридов тутового шелкопряда Сосенняя выкормка-)
Гибриды Целые гусеницы Шелкоотделительная железа Биологические показатели
А Б А Б Жизнеспособность гусениц Масса кокона
УН х УФ +5,03 +5,94 +16,07 +17,17 +49,59 +15,45
УФхУН +4,07 +4,40 +9,22 +10,58 +41,46 +15,45
А - &Е2бо - после инкубации с формальдегидом Б - дЕзйо - после фракционирования хлороформом
Содержание метаболитическн активной ДНК, жизнеспособность и масса кокона выражена в % к среднеродительским показателям; (+) - увеличение соответствующего показателя;
(-) - снижение соответствующего показателя по отношению к среднеродительскому,
В опытах было подтверждено наличие положительной корреляции между содержанием метаболически активной ДНК и проявлением у гибридов гетерозиса по массе кокона и жизнеспособности, отчетливо обозначена количественная взаимосвязь перечисленных показателей. Характерно, что выявленные в весеннюю выкормку различия в уровне метаболически активной ДНК и степенью гетерозиса сохраняются в течение летней выкормки, но характеризуются большей абсолютной величиной в летнюю выкормку. В правильности данного подхода убеждают опыты по определению метаболически активной ДНК, выделенной из целых гусениц первого дня У-ого возраста и
шелкоотделительной железы пород УН, УФ и их прямого и обратного гибрида в период осенней выкормки. Оба гибрида превосходят родительские породы по содержанию метаболически активной ДНК (от 4,07% в целых гусеницах до 17,77% в шелкоотделительных железах по сравнению со среднеродительским уровнем), а также и по биологическим показателям, в первую очередь, жизнеспособности н массе кокона.
Более детально характер связи между степенью дестабилизации ДНК у исходных пород и гибридов с проявлением гетерозиса у последних прослежен нами при работе с породами СК-2 и ПС-5 и их прямыми и обратными гибридами в весеннюю и летнюю выкормки. Как следует из таблицы 10, на этой группе пород и гибридов только подтверждается наличие корреляции между структурным состоянием ДНК у исходных пород н полученных при их скрещивании гибридов и возрастанием у гибридов гетерозиса по массе кокона (гЮ,<597 при Р=О,01) и жизнеспособности гусениц (г=0,852 при Р=Ю,0004), но и вырисовывается отчетливо точная количественная взаимосвязь перечисленных показателей.
Полученные показатели позволяют сделать вывод о том, что содержание метаболически активной ДНК в грене гибридов тутового шелкопряда может быть использовано в качестве биохимического теста для раннего прогнозирования эффекта гетерозиса. Значение такого теста для практической селекции трудно переоценить, так как он дает возможность решить вопрос о потенциальной возможности проявления гетерозиса без проведения дорогостоящих выкормок гибридов тутового шелкопряда, на что в классической селекционной работе затрачиваются огромные силы и средства.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В представленной работе обобщены результаты многолетнего изучения структуры генома тутового шелкопряда на уровне суммарной ДНК, отдельной группы генов (р-генов) и минисателлитаых последовательностей, а также активности генома насекомого в процессе онтогенеза. Благодаря экономическому значению тутового шелкопряда молекулярные основы его высокой продуктивности издавне привлекали внимание исследователей. В практике селекционных работ с тутовым шелкопрядом на биохимическом уровне внимание уделяется, в основном, изучению тех энзимов, активность которых обеспечивает создание фонда структурных единиц для синтеза специфических белков шелка (Егорова, 1983; Коничев, 1991; Клунова, 2005), Исследования генома в плане изучения проявлений продуктивности и гетерозиса у тутового шелкопряда особенно на ранних стадиях его развития очень ограничены. Проведенный нами анализ сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в ДНК пород н гибридов тутового шелкопряда на разных стадиях постдиапаузного развития выявляет индивидуальный характер организации пиримидиновых нуклеотидов в ДНК пород и гибридов, тестирующий породу ПС5 и гетерозисные гибриды по степени обогащенности их ДНК длинными пиримидиновыми изоплитами. Увеличение степени сблоченности пиримидиновых изоплитов в ДНК сопровождается и обогащением длинных олигонуклеотидных последовательностей (от 5-ти до 10-ти нуклеотидных
остатков) тимидиловой кислотой, ВысокогетерозисныЙ гибрид ПС5хСК2, характеризующийся наибольшей степенью сблоченносга ДНК, содержит в ДНК и больше олиготимидиловых и обогащенных тимидином нуклеотндных последовательностей. ,
Обнаружение межпородного полиморфизма рибосомных генов тутового шелкопряда по содержанию повторов со вставкой I, равномерное распределение их в обеих половых хромосомах 2 и и характер наследования количественного содержания этих повторов через материнский генотип, наличие определенной корреляции между содержанием в геноме пород и гибридов повторов со вставкой типа I и массой кокона открывает возможность использования этой характеристики структуры рибосомных генов в селекции тутового шелкопряда.
Для маркирования генома пород, гибридов, клонов тутового шелкопряда и выявление генотипнческой изменчивости партеногенетических линий, полученных с помощью различных типов партеногенеза подходит предложенный вариант метода геномной дактилоскопии.
С целью дальнейшей интенсификации селекционной работы с тутовым шелкопрядом желательно включить в «Основные положения методики селекции тутового шелкопряда», утвержденные Министерством сельского хозяйства РФ определение отработанных в данном исследовании параметров структурной организации генома и его активности у насекомого на стадии грены (яйца).
В соответствующие разделы учебных пособий по селекции тутового шелкопряда целесообразно включить новые данные об особенностях структурной организации и активности генома у различных по продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда, в том числе о структуре р-генов, наличии минисателлитов в геноме, о сблоченности пиримидиновых изоплитов и об активности генома в онтогенезе тутового шелкопряда.
ВЫВОДЫ
1. Обнаружено, что блочная организация пиримидиновых нуклеотидов в ДНК грены тутового шелкопряда в период ее постдиапаузного развития изменяется: происходит постепенное возрастание степени сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в ДНК, обусловленное накоплением длинных пиримидиновых последовательностей, содержащих от 5-ти до 10-ти нуклеотндных остатков. Этот процесс заканчивается к моменту завершения органогенеза зародыша. На всех этапах постдиапаузного развития грены и особенно на последней стадии ее развития общее содержание олиготимидиловых и обогащенных тимидином фрагментов ДНК значительно превышает таковое ол игоцитад ил овых и обогащенных цитидином последовательностей. К моменту завершения процесса органогенеза зародыша тутового шелкопряда степень сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в ДНК грены становится численно равной таковой в ДНК личинки.
2. Показано, что степень сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в ДНК тутового шелкопряда двух пород и полученных на их основе двух гетерозисных гибридов в начале постдиапаузного развития грены различна; к
концу постдиапаузного развитая она увеличивается, причем скорость ее увеличения выше у гетерознсных гибридов по сравнению с породами, но остается индивидуальной для каждой породы и гибрида. Отмечено достоверное обогащение к концу постдиапаузного развития грены пиримидиновых блоков ДНК тимидиловой кислотой. Характеристика степени сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в грене может быть использована в качестве биохимического теста для раннего прогнозирования эффекта гетерозиса у гибридов тутового шелкопряда.
3. Установлено, что доза рибосомных генов в геноме пород и гибридов тутового шелкопряда одинакова и не меняется в процессе эмбрионального развития. В геноме пород и гибридов тутового шелкопряда
■ присутствуют гетерогенные по длине повторы рДНК, что обусловлено наличием в структурной части 288 рДНК элементов К1Вт и Я2Вт. У разных пород и гибридов тутового шелкопряда содержание повторяющихся единиц р-генов со вставкой ШВш существенно различно (от 3% до 25%), со вставкой К2Вт почти одинаково и составляет от '9 до 10%. Рибосомные гены тутового шелкопряда не сцеплены с половыми хромосомами, а локализованы на одной из аутосом. Количественное, содержание повторов со вставкой Я1Вш наследуется по материнскому генотипу.
Полиморфизм р-генов у пород и гибридов тутового шелкопряда является следствием вариантного содержания повторов со вставкой ШВт, что в определенной мере характеризует молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе продуктивности насекомого.
4. Разработан вариант геномной дактилоскопии с использованием рестрикционной эндонуклеазы М$р1 и меченой ДНК фага М13 для изучения полиморфизма ДНК тутового шелкопряда.
5. Впервые проведено маркирование генома тутового шелкопряда на уровне отдельных особей, семей и пород, партеногенетических клонов Выявлены характерные молекулярные маркеры дня генома тутового шелкопряда. Особенности в наборе гибридизационных полос, свойственных породе, проявляются как в семьях, так и на уровне индивидуальных организмов, а индивидуальные особенности геномов утрачиваются в семьях и породе. Все родительские особи, полученные амейогическим партеногенезом (самки), несмотря на гетерозиготностъ по многим аллелям имеют идентичные фингерпринткые спектры, которые наследуются потомками (самки) при таком же типе партеногенеза. У потомков, полученных мейотическим типом партеногенеза (самцы), происходит расщепление по аллелям, что дает высокий индивидуальный полиморфизм, позволяющий выявить генотипическую изменчивость. Метод геномной дактилоскопии позволяет детектировать отдельные локусы различной копийности при анализе гибридных организмов.
6. На разных фазах развития тутового шелкопряда выявлено наличие ДНК с деспирализованной вторичной структурой. Образование такого типа ДНК в онтогенезе тутового шелкопряда происходит циклически, соответствуя основным фазам и этапам развития насекомого, оно максимально в грене через 12 часов после кладки, в начале (стадия ЭО и конце (стадия Ез) постдиапаузного развития, в начале каждого личиночного возраста, в 1-й день завивки кокона (в большей степени у самцов) и на 4-й день развития куколки (в большей степени у
самок). Динамика дезоксирибонуклеазной активности (кислая, рН 5,2; нейтральная, рН 7,0) растворимых белков тутового шелкопряда, выявленная спекгрофотометрическим методом на разных стадиях его развития, в целом не повторяет таковую для ДНК с деспирализованной вторичной структурой, что указывает на отсутствие деградирующего влияния ДНКаз на ДНК как в клетке, так и в момент ее выделения.
Интенсивность включения меченых предшественников нуклеиновых кислот (3Н-уридина и 3Н-тимидина) в кислотонерастворимую фракцию грены тутового шелкопряда коррелирует с периодами наибольшего содержания ДНК с деспирализованной вторичной структурой. Низкая устойчивость хроматина, выделенного из грены на стадиях Dt и Ез, к ультразвуковой обработке, более лабильная связь ДНК с пистонами в его составе, обогащенность хроматина негистоновыми белками свидетельствуют, что содержание ДНК с деспирализованной вторичной структурой является одним из реальных показателей активности генома и позволяет считать такую ДНК как метаболически активную.
7. Характеристика структурного состояния ДНК у различных по продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда показала наличие корреляции между продуктивностью пород, выраженностью гетерозиса у гибридов и содержанием метаболически активной ДНК у них.
8. Данные о структурной организации пиримидиновых нуклеотидов в ДНК пород и гибридов тутового шелкопряда, о межпородном полиморфизме р-генов, об активности генома у пород и гетерозисных гибридов на ранней стадии эмбрионального развития в определенной мере способствуют расшифровке молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе продуктивности этого хозяйственно-полезного насекомого; с другой стороны, возможность маркировать геном особей, семей, пород, гибридов, потомков партеногенетических линий методом геномной дактилоскопии - все это свидетельствует о создании предпосылок для научно-обосиованной селекции тутового шелкопряда по исследованным параметрам структурной организации и активности его генома.
Соискатель имеет 99 печатных работ по теме диссертации, обьемом 95 п.л., включая 56 наиболее значимых публикаций, отражающих основное содержание работы (личное участие 54,0% или 51,2 п.л.).
Список основных публикаций по теме диссертации: Монографии
1. Севастьянова Г.А. Структура генома тутового шелкопряда (теоретический и практические аспекты). - М.: Прометей, 2001.- 99с. (6,2 пл., авторский вклад 100%).
Статьи в рекомендованных ВАК изданиях
2. Севастьянова Г.А., Баскаков И.С., Гева О.Н., Филиппович Ю.Б., Рысков А.П., Струнников В .А. Геномная дактилоскопия Bombyx mori L,: анализ
гипервариабел ьных локусов в смеси ДНК различных партеногенегических клонов//Доклады РАН, 1995, -Т.344.№5. С.717-718. (0,13 пл., авторский вклад 30%)..
3. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Видута О.Д. Характеристика структурного состояния ДНК в онтогенезе тутового шелкопряда//Доклады АН СССР. - 1974. Т.216. №5. СЛ192-П94. (0.2 пл.,авторский вклад 70%).
4. Коничев A.C., Водолеев A.C., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Выделение, очистка и свойства кислой рибонуклеазы лизосомальной фракции грены тутового шелкопряда//Биохимия.-1980. Т.45. Вып.5. С.821-828. (0.5 п.л., авторский вклад 30%).
5. Тихомирова Т.П., Тимофеева МЛ., Куприянова Н.С., Родина Е.Ю., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Полиморфизм рибосомных генов по содержанию вставок в геноме пород и гетерозисных гибридов тутового шелкопряда//Доклады АН СССР.-1988. Т.303. №1. С.223-226. (0,25 пл., авторский вклад - 40%).
6. Севастьянова Г.А., Смолин А.Н. Свободные нуклеотиды и их производные в организме насекомых//Успехи соврем. биол.-19бб. Т.61. №3. С.321-337. (1,0 пл., авторский вклад 80%).
7. Севастьянова Г.А., Смолин А.Н. Свободные нуклеотиды и их производные в жировом теле личинок дубового шелкопряда Antheraea pernyi О.Ш/Биохимия.-1967. Т.32. №3. С.548-557. (0,6 пл., авторский вклад 80%).
8. Севастьянова ГЛ. Свободные нуклеотиды и их производные в шелкоотделительной железе дубового шелкопряда//Биохимия -1967. Т.32. №6. С. 1260-1270. (0,7 п.л., авторский вклад 100%).
9. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А, Видута О.Д., Ганиева М.Р., Акименко Л.М., Тищенко Г.Н. Структурное состояние ДНК как тест для прогнозирования гетерозиса у тутового шелкопряда/ЛИелк - 1976. №3. C.15-I7. (0,2 пл., авторский вклад 50%).
10. Водолеев A.C., Коничев A.C., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Рибонуклеазная активность в субклеточных фракциях развивающейся грены тутового шелкопряда// Научные доклады высшей школы, биол. науки.-1977. №11. С. 139. (0,06 пл., авторский вклад 30%).
11. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А. Структура и обмен РНК у насекомых/ТУспехи соврем, биол. -1988. Т.106. Вып.2 (5). С.208-225. (1,1 пл., авторский вклад 80%).
12. Тихомирова Т.П., Тимофеева МЛ., Куприянова Н.С., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Молекулярно-генетический анализ полиморфизма рибосомных генов тутового шелкопряда//Генетика.-1992. Т. 28. №8. C.I3-28. (1,0 п.л., авторский вклад 40%).
13. Гречко В.В, Федорова Л.В., Федоров А.Н., Слободянюк СЛ., Рябинин Д.М., Мельникова М.Н., Банникова A.A., Ломов A.A., Шереметьева В.А., Горшков В.А., Севастьянова Г.А., Семенова С.К., Рысков А.П., Медников Б.М., ДаревскиЙ И.С. Рестриктазное картирование высокоповторяющихся последовательностей ДНК в исследовании генетического родства низших
, таксонов живоггных//Молек. биология, 1997 - Т.31. №2. С.244-252. (0,6 п.л.( авторский вклад 10%).
14. Третяк А.П., Рысков А.П., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б., Струнников В.А. Геномная дактилоскопия Bombyx morí L.: выявление генотипической изменчивости партеногенетических клоновУ/Генетика - 1992. Т.28.№5, С.171-175. (0,3 пл., 30%).
15. Третях А.П., Рысков А.П., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Геномная дактилоскопия Bombyx morí Ь.:проблема идентификации особей, семей и пород// Генетика - 1992. Т.28. №2. С.52-62. (0,8 п.л., авторский вклад 40%).
16. Tretjk А.Р., Ryskov А.Р., Sevastyanova G .A., Filippovich Yu.B., Strunnikov B.A. DNA fingerprints of Bombyx mori L. Testing of genotypic variability of parthenogenetic strains.// FEBS Letters.-1992. V.303. Ka 2,3. P.258-260. (0,12 п.л., авторский вклад 30%).
17. Grechko V.V., Fedorova L.V., Fedorov A.N., Slobodyanyuk S.Ya., Ryabinin D.M., Melnikova M.N., Bannikova A.A., Lomov A.A., Sheremet'eva V.A., Gorshkov V.A., Sevastyanova G.A., Semenova S.K., Ryskov A.P., Mednikov B.M., Darevsky l.S. Restriction Endonuclease Analysis of Highly Repetitive DNA as a Phylogenetic Tool // J.Mol. Evol., 1997.-V.45, P.332-336. (0,31 п.л., авторский вклад 10%). Учебник
18. Коничев A.C., Севастьянова Г.А. Молекулярная биология.- М.: Академия, 2003. - 400 с, (25 пл., авторский вклад 50%, 1-ое издание), 2005,- 400 с, (25 пл., авторский вклад 50%, 2-ое издание).
Учебное пособие
19. Филиппович Ю.Б., Коничев A.C., Севастьянова Г.А., Кутузова Н.М. Биохимические основы жизнедеятельности человека. - М.:Владос, 2005 - 407 с. (33 п.л, авторский вклад 25%).
Статьи в сборниках
20. Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б., Медведева Э.Н. Методы количественного определения нуклеиновых кислот в биологическом материале и в тканях насекомых в частности//Биологическая и органическая химия. - М,: МГПИ им. В.И.Ленина, 1970. - Вып.13. с.71-86. (0.93 п.л., авторский вклад 60%).
21. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г,А., Коничев A.C., Водолеев A.C. Рибонуклеазная активность в митохондриальной фракции грены тутового шелкопряда в процессе весенней инкубации//Биохимия митохондрий. Наука, 1976. - с.74. (0,06 п.л., авторский вклад 30%).
22. Севастьянова Г.А., Видута О.Д. Ранее прогнозирование эффекта гетерозиса по структурному состоянию ДНК в грене исходных пород тутового шелкопряда и полученных при их скрещивании гибридов//Сб. Биохимические методы прогнозирования продуктивности, гетерозиса и опенки физиологического состояния полезных и вредных насекомых (методические указания). - М: МГПИ им. В.И.Ленина, 1979. - с.5-11, (0,4 п.л, авторский вклад 70%).
23. Видута О.Д., Севастьянова Г.А. Выделение ДНК из биологического материала хлороформным методом и характеристика препаратов ДНК. В кн. Методы анализа белков и нуклеиновых кислот в тканях и органах насекомых, -М.: МГПИ им. В .И.Ленина, 1980. - чЛ. с.96-101, (0,38 пл., авторский вклад 60%).
24. Видута О.Д., Севастьянова Г.А. Дезоксирибонуклеазная активность растворимых белков в онтогенезе тутового шелкопряда//Биохимия насекомых. Сб. научи, тр. каф. орг. и биол. химии МГПИ им. В.И Ленина. - М..* 1979. - Вып. 21. с. 109-120. (0,8 пл., авторский вклад 60 %).
25. Адо Н.Ю., Видута О.Д., Дерябина O.A., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Термическое фракционирование по составу ДНК пород и гибридов тутового шелкопряда.//Биохимия насекомых. Сб. научн. тр. каф. орг. и биол. химии МГПИ им.В.И.Ленина. - М.: 1979. - Вып. 21. с.98-108. (0,7 пл., авторский вклад 40%).
26. Севастьянова Г.А., Родина Е.Ю. Биосинтез ДНК в период постдиапаузного развития грены тутового шел копряд а//Б иохи мия насекомых (структура хроматина и характеристика продуктов генной активности) - М.: МГПИ им В.ИЛенина, 1987. - с.34-45. (0,8 пл.,,авторский вклад 70%).
27. Тихомирова Т.П., Родина Е.Ю., Севастьянова Г.А., Куприянова Н.С., Тимофеева МЛ. Особенности организации рибосомных генов тутового
шелкопряда//Биохимия насекомых (структура хроматина и характеристика продуктов генной активности) - М: МГПН им. В.ИЛенина, 1987. - с.45-53. (0,56 п.л., авторский вклад 40%).
28. Севастьянова Г.А. Фракционирование РНК грены тутового шелкопряда методом электрофореза в полиакриламидном геле. - Сб. статей «Аминокислотный и белковый обмен у тутового шелкопряда и некоторых микроорганизмов», вып.15, М.: МШИ им.В.ИЛенина, 1972, с.79-86. (0,5 пл., авторский вклад 100%).
29. Севастьянова Г.А., Матвеева В.В., Андрианова Е.П., Энтина Е.В. Солюбилизация хроматина грены тутового шелкопряда постдиапаузного развития под действием ультразвука.// Биохимия насекомых (Регуляция метаболизма). М.:МГПИ им.В.И.Ленина, 1985. - с.3-6. (0,25 п.л., авторский вклад 60%).
30. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Родина Е.Ю. Содержание нуклеиновых кислот в грене пород и гибридов тутового шелкопряда в период постдиапаузного развития«// Биохимия насекомых. Межвузовский сборник научных трудов.- М.: Прометей. 1989. - с.3-12. (0,6 пл.,авторский вклад 60%).
31. Севастьянова Г.А., Родина Е.Ю. Активность а-аманитинустойчивой РНК-полимеразы в развивающейся грене пород и гибридов тутового шелкопряда.// Биохимия насекомых. Межвузовский сборник научных трудов. - М.: Прометей. 1989.- с.12-20, (0,6 п.л., авторский вклад 80%).
32. Видута О.Д., Севастьянова Г.А. Метаболически активная ДНК в жировом теле тутового и дубового шелкопрядов. - В. сб. «Биохимия насекомых», М.: МГПИ им. В.И.Ленина, 1979, вып. XXI, с.121-127. (0,45 пл., авторский вклад 50%).
33. Андрианова Е.П., Севастьянова Г.А. Выделение и фракционирование гистонов из грены тутового шелкопряда. - В сб.: Методы анализа белков и нуклеиновых кислот в тканях и органах насекомых (методические разработки), М.: МГПИ им. В Л.Ленина, 1980, ч.1, с. 17-20. (0,25 п.л., авторский вклад 50%).
34. Севастьянова Г.А., Браславский М.Е., Акименко Л.М. Сравнительное изучение семейных кладок тутового шелкопряда по содержанию ДНК.//С6. научн. тр. МПГУ им.В,И.Ленина. Серия: естественные науки, чЛ. М.: Прометей, 1994. - с. 189-195. (0,4 пл., авторский вклад 80%).
35. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Родина Е.Ю., Урванцева Г.А. Содержание нуклеиновых кислот в грене пород и гибридов тутового шелкопряда в период постдиапаузного развития. - Межвузовский сборн. научн. трудов
«Биохимия насекомых», М.: «Прометей», 1989, с.3-12. (0,6 пл., авторский вклад 60%).
36. Андрианова Е.П., Севастьянова Г.А., Филиппович' Ю.Б. Кислоторастворимые белки в эмбриогенезе тутового шелкопряда.// Межвузовский сборн. научн. трудов. «Биохимия насекомых» (ферменты метаболизма). М., МГПИ им. В.И. Ленина, 1984, С. 142-153 (0,75 п.л., авторский вклад 50%).
37. Севастьянова Г.А., Водолеев A.C. Фосфодиэстеразная активность растворимых белков тутового шелкопряда в процессе его онтогенеза. -Межвузовский сборн. научн. трудов: «Биохимия насекомых (ферменты метаболизма)». М.: МГПИ им. В.И.Ленина, 1984, с.103-107. (0,3 пл., авторский вклад 70%).
38. Медведева Э.Н., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Нуклеиновые кислоты и их обмен у насекомых в норме и при воздействии антиметаболитов нуклеинового обмена.// Биологическая и органическая химия. Учен. зап. № 397 М., МГПИ им. В.И. Ленина, 1970, вып. 13. С. 87-115 (1,8 пл., авторский вклад 70%).
39. Коничев A.C., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Обмен нуклеиновых кислот на ранних стадиях овогенеза и эмбриогенеза животных и насекомых в частности.// Сб. статей «Аминокислотный и белковый обмен у тутового шелкопряда и некоторых микроорганизмов»; вып. 15 М., МГПИ им, В.И. Ленина, 1972, с. 66-78 (0,8 пл., авторский вклад 50%).
40. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Водолеев A.C., Рибонуклеазная активность белков развивающейся трены тутового шелкопряда.// В сб. «Биохимия насекомых», вып XVIII. М., МГПИ им. В.И. Ленина, 1975, С. 190-196 (0,45 пл., авторский вклад 70%).
41. Видута О.Д., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Метаболически активная ДНК в шелкоотделительной железе тутового и дубового шелкопрядов.// Сборн. трудов «Биохимия насекомых», вып. XIX. М., МГПИ им. В .И. Ленина, 1977, С. 11-14 (0,25 пл., авторский вклад 60%).
42. Видута О.Д., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Изучение структурного состояния ДНК у исходных пород тутового шелкопряда и полученных при их скрещивании гибридов с целью разработки теста для прогнозирования гетерозиса.// Сборн. трудов. «Биохимия насекомых», вып. XIX. М., МГПИ им. В .И. Ленина, 1977, С. 14-18 (0,25 пл., авторский вклад 60%).
43. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Водолеев A.C., Коничев A.C. Нуклеазная активность белковых фракций грены тутового шелиопряда в процессе его развития// Сборн. трудов. «Биохимия насекомых», выл 18. М., МГПИ им. В.И. Ленина, 1975, С. 190-199 (0,6 пл., авторский вклад 40%). ;
44. Севастьянова Г.А., Коничев A.C., Филиппович Ю.Б. Биосинтез РНК в эмбриогенезе тутового шелкопряда. Сб. «Биохимия насекомых», М. МГПИ им. В.И.Ленина, 1974, вып.17, с.75-84 (0,6 пл., авторский вклад 60%).
45. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Водолеев A.C. Кислая и щелочная рибонуклеазная активность в организме тутового шелкопряда в процессе его онтогенеза.// Сб. «Биохимия насекомых», вып 19. М,, МГПИ им. В.И. Ленина, 1977, С. 63-66 (0,25 пл., авторский вклад 60%).
46. Видуга О.Д., Оболенкова Л.А., Адо Н.Ю., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Выделение ДНК из грены тутового шелкопряда.// Сб. «Биохимия насекомых», вып. XX. М., МГПИ им. В.И. Ленина, 1978, С. 11-15 (0,3 пл., авторский вклад 50%).
47. Адо Н.Ю., Видута ОД., Дерябина O.A. Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б., Макулин А.И. К вопросу о термическом фракционировании по составу ДНК из организма тутового шелкопряда,// Сб. «Биохимия насекомых», вып XX. М., МГПИ им. В.И. Ленина, 1978, С. 16-22 (0,4 пл., авторский вклад 40%).
48. Водолеев A.C., Севастьянова Г.А. Использование данных о суммарной рибонуклеазной активности растворимых белков грены для ранней прогнозирующей оценки продуктивности пород и полученных при их скрещивании гибридов тутового шелкопряда.// В сб. «Биохимические методы прогнозирования продуктивности, гетерозиса и оценки физиологического состояния полезных и вредных насекомых» (методические указания). М., МГПИ им. В.И. Ленина, 1979, С. 15-17 (0,2 пл., авторский вклад 70%).
49. Коничев A.C., Водолеев A.C., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Рибонуклеазная активность в грене родительских пород и гетерозисных гибридов тутового шелкопряда.// Сб. «Биохимия насекомых», вып XXI. М., МГПИ им. В .И, Ленина, 1979, С. 22-27 (0,4пл., авторский вклад 35%).
50. Водолеев A.C., Севастьянова Г.А. Фосфодиэстеразная активность растворимых белков в тканях личинок и куколок тутового шелкопряда.// Сб. «Биохимия насекомых», вып XXII. М., МГПИ им. В.И. Ленина, 1980, С. 105-110 ( 0,4п.л., авторский вклад 80%)
51. Филиппович Ю.Б., Адо Н.Ю., Алцыбеева Т.И., Банников В.М., Горленко В.А., Грошева М.П., Егорова Т.А., Клунова С.М., Налетова Е.А., Севастьянова
Г.А., Тихомирова Т.П., Ушакова Г.И., Шамшина Т.М. Эчкалов А.П. Некоторые аспекты молекулярных основ гетерозиса, продуктивности и таксономии насекомых У/ Вопр. общ. энтомологии. Тр. Всесоюзн. энтомол. общ. JI., Наука, 1981, Т. 63, с. 175-178 (0,25 пл., авторский вклад 40%).
52. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Банников В.М., Коничев А.С., Кутузова Н.М. Разработка новых эффективных биохимических подходов к регуляции жизнедеятельности насекомых на основании исследования структуры их генома и характеристика конечных продуктов генной активности. Сб. «Биохимия насекомых (структура хроматина и характеристика продуктов генной активности)», 1987, с.3-44 (2,6 пл., авторский вклад 40%).
53. Андрианова Е.П., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Выделение хроматина из грены тутового шелкопряда. Сб. «Методы анализа белков и нуклеиновых кислот в тканях и органах тутового шелкопряда» М. МГПИ им.В.И,Ленина, 1989, с.4-8 (0,3 пл., авторский вклад 60%).
54. Севастьянова Г.А., Тимофеева МЛ., Тихомирова Т.П., Куприянова Н.С. Метод гибридизации ДНК, иммобилизованной на фильтре, с радиоактивными зондами. Сб. «Методы анализа белков и нуклеиновых кислот в тканях и органах тутового шелкопряда». М. МГПИ им В.И.Ленина, 1989, с.74-79 (0,4 пл., авторский вклад 30%).
55. Гева О.Н., Севастьянова Г.А. Фракционирование. фрагментов ДНК насекомых методом электрофореза в полиакриламидном геле. Сб. «Методы анализа белков и нуклеиновых кислот в тканях и органах тутового шелкопряда». М.: МГПИ им.В.И.Ленина, 1989, с.67-71 (0,3 пл., авторский вклад 50 %).
56. Третяк А.П., Баскаков И.С., Севастьянова Г.А., Рысков А.П., Филиппович Ю.Б. Геномная дактилоскопия тутового шелкопряда: использование синтетических олигонуклеотидов в качестве зонда. Сб. научн. трудов МПГУ им.В.И.Ленина. М. «Прометей», 1993, с. 80-87 (0,5 пл., авторский вклад 50%)
Подл, к печ, 04.05.2006 Объем 3 п.л._Заказ №. 114 Тир 100 экз.
Типография МПГУ
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Севастьянова, Галина Андреевна
ВЫВОДЫ
1. Обнаружено, что блочная организация пиримидиновых нуклеотидов в ДНК фены тутового шелкопряда в период ее постдиапаузного развития изменяется: происходит постепенное возрастание степени сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в ДНК, обусловленное накоплением длинных пиримидиновых последовательностей, содержащих от 5-ти до 10-ти нуклеотидных остатков. Этот процесс заканчивается к моменту завершения органогенеза зародыша. На всех этапах постдиапаузного развития фены и особенно на последней стадии ее развития общее содержание олиготимидиловых и обогащенных тимидином фрагментов ДНК значительно превышает таковое олигоцигидиловых и обогащенных цитидином последовательностей. К моменту завершения процесса органогенеза зародыша тутового шелкопряда степень сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в ДНК грены становится численно равной таковой в ДНК личинки.
2. Показано, что степень сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в ДНК тутового шелкопряда двух пород и полученных на их основе двух гетерозисных гибридов в начале постдиапаузного развития грены различна; к концу постдиапаузного развития она увеличивается, причем скорость ее увеличения выше у гетерозисных гибридов по сравнению с породами, но остается индивидуальной для каждой породы и гибрида. Отмечено достоверное обогащение к концу постдиапаузного развития фены пиримидиновых блоков ДНК тимидиловой кислотой. Характеристика степени сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в грене может быть использована в качестве биохимического теста для раннего прогнозирования эффекта гетерозиса у гибридов тутового шелкопряда.
3. Установлено, что доза рибосомных. генов в геноме пород и гибридов тутового шелкопряда одинакова и не меняется в процессе эмбрионального развития. В геноме пород и гибридов тутового шелкопряда присутствуют гетерогенные по длине повторы рДНК, что обусловлено наличием в структурной части 28Б рДНК элементов ИВш и К2Вш. У разных пород и гибридов тутового шелкопряда содержание повторяющихся единиц р-генов со вставкой ШВт существенно различно (от 3% до 25%), со вставкой 112Вт пйчти одинаково и составляет от 9 до 10%. Рибосомные гены тутового шелкопряда не сцеплены с половыми хромосомами, а локализованы на одной из аутосом. Количественное содержание повторов со вставкой ШВт наследуется по материнскому генотипу.
Полиморфизм р-генов у пород и гибридов тутового шелкопряда является следствием вариантного содержания повторов со вставкой ШВт, что в определенной мере характеризует молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе продуктивности насекомого.
4. Разработан вариант геномной дактилоскопии с использованием рестрикционной зндонуклеазы Мэр! и меченой ДНК фага М13 для изучения полиморфизма ДНК тутового шелкопряда.
5. Впервые проведено маркирование генома тутового шелкопряда на уровне отдельных особей, семей и пород, партеногенетических клонов Выявлены характерные молекулярные маркеры для генома тутового шелкопряда. Особенности в наборе гибридизационных полос, свойственных породе, проявляются как в семьях, так и на уровне индивидуальных организмов, а индивидуальные особенности геномов утрачиваются в семьях и породе. Все родительские особи, полученные амейотическим партеногенезом (самки), несмотря на гетерозиготность по многим аллелям имеют идентичные фингерпринтные спектры, которые наследуются потомками (самки) при таком же типе партеногенеза, У потомков, полученных мейотическим типом партеногенеза (самцы), происходит расщепление по аллелям, »по дает высокий индивидуальный полиморфизм, позволяющий выявить генотипическую изменчивость. Метод геномной дактилоскопии позволяет детектировать отдельные локусы различной копийности при анализе гибридных организмов.
6. На разных фазах развития тутового шелкопряда выявлено наличие ДНК с деспирализованной вторичной структурой. Образование такого типа ДНК в онтогенезе тутового шелкопряда происходит циклически, соответствуя основным фазам и этапам развития насекомого, оно максимально в фене через 12 часов после кладки, в начале (стадия Б)) и конце (стадия Ез) постдиапаузного развития, в начале каждого личиночного возраста, в 1-й день завивки кокона (в большей степени у самцов) и на 4-й день развития куколки (в большей степени у самок). Динамика дезоксирибонуклеазной активности (кислая, рН 5,2; нейтральная, рН 7,0) растворимых белков тутового шелкопряда, выявленная спектрофотометрическим методом на разных стадиях его развития, в целом не повторяет таковую для ДНК с деспирализованной вторичной структурой, что указывает на отсутствие деградирующего влияния ДНКаз на ДНК как в клетке, так и в момент ее выделения.
Интенсивность включения меченых предшественников нуклеиновых кислот (3Н-уридина и 3Н-тимидина) в кислотонерастворимую фракцию грены тутового шелкопряда коррелирует с периодами наибольшего содержания ДНК с деспирализованной вторичной структурой. Низкая устойчивость хроматина, выделенного из грены на стадиях Di и Е3, к ультразвуковой обработке, более лабильная связь ДНК с пистонами в его составе, обогащенность хроматина негистоновыми белками свидетельствуют, что содержание ДНК с деспирализованной вторичной структурой является одним из реальных показателей активности генома и позволяет считать такую ДНК как метаболически активную.
7. Характеристика структурного состояния ДНК у различных по продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда показала наличие корреляции между продуктивностью пород, выраженностью гетерозиса у гибридов и содержанием метаболически активной ДНК у них.
8. Данные о структурной организации пиримидиновых нуклеотидов в ДНК пород и гибридов тутового шелкопряда, о межпородном полиморфизме р-генов, об активности генома у пород и гетерозисных гибридов на ранней стадии эмбрионального развития в определенной мере способствуют расшифровке молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе продуктивности этого хозяйственно-полезного насекомого; с другой стороны, возможность маркировать геном особей, семей, пород, гибридов, потомков партеногенетических линий методом геномной дактилоскопии - все это свидетельствует о создании предпосылок для научно-обоснованной селекции тутового шелкопряда по исследованным параметрам структурной организации и активности его генома.
Соискатель имеет 99 печатных работ по теме диссертации, объемом 95 п.л., включая 56 наиболее значимых публикаций, отражающих основное содержание работы (личное участие 54,0% или 51,2 п.л.).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В представленной работе обобщены результаты многолетнего изучения структуры генома тутового шелкопряда на уровне суммарной ДНК, отдельной группы генов (р-генов) и минисателлитных последовательностей, а также активности генома насекомого в процессе онтогенеза. Благодаря экономическому значению тутового шелкопряда молекулярные основы его высокой продуктивности издавне привлекали внимание исследователей. В практике селекционных работ с тутовым шелкопрядом на биохимическом уровне внимание уделяется, в основном, изучению тех энзимов, активность которых обеспечивает создание фонда структурных единиц для синтеза специфических белков шелка (Егорова, 1983; Коничев, 1991; Клунова, 2005). Исследования генома в плане изучения проявлений продуктивности и гетерозиса у тутового шелкопряда особенно на ранних стадиях его развития очень ограничены. Проведенный нами анализ сблоченности пиримидиновых нуклеотйдов в ДНК пород и гибридов тутового шелкопряда на разных стадиях постдиапаузного развития выявляет индивидуальный характер организации пиримидиновых нуклеотйдов в ДНК пород и гибридов, тестирующий породу ПС5 и гетерозисные гибриды по степени обогащенное™ их ДНК длинными пиримидиновыми изоплитами. Увеличение степени сблоченности пиримидиновых изошштов в ДНК сопровождается и обогащением длинных олигонуклеотидных последовательностей (от 5-ти до 10-ти нуклеотидных остатков) тимидиловой кислотой. Высокогетерозисный гибрид ПС5хСК2, характеризующийся наибольшей степенью сблоченности ДНК, содержит в ДНК и больше олиготимидиловых и обогащенных тимидином нуклеотидных последовательностей.
Обнаружение межпородного полиморфизма рибосомных генов тутового шелкопряда по содержанию повторов со вставкой I, равномерное распределение их в обеих половых хромосомах Ъ и и характер наследования количественного содержания этих повторов через материнский генотип, наличие определенной корреляции между содержанием в геноме пород и гибридов повторов вставки типа I и массой кокона открывает возможность использования этой характеристики структуры рибосомных генов в селекции тутового шелкопряда.
Для маркирования генома пород, гибридов, клонов тутового шелкопряда и выявление генотипической изменчивости партеногенетических линий, полученных с помощью различных типов партеногенеза подходит предложенный вариант метода геномной дактилоскопии.
С целью дальнейшей интенсификации селекционной работы с тутовым шелкопрядом желательно включить в «Основные положения методики селекции тутового шелкопряда», утвержденные Министерством сельского хозяйства РФ определение отработанных в данном исследовании параметров структурной организации генома и его активности у насекомого на стадии грены (яйца).
В соответствующие разделы учебных пособий по селекции тутового шелкопряда целесообразно включить новые данные об особенностях структурной организации и активности генома у различных по продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда, в том числе о структуре р-генов, наличии минисателлитов в геноме, о сблоченности пиримидиновых изоплитов и об активности генома в онтогенезе тутового шелкопряда.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Севастьянова, Галина Андреевна, Москва
1. Севастьянова Г. А. Структура генома тутового шелкопряда (теоретический и практические аспекты). М.: Прометей, 2001.- 99с. (6,2 п.л., авторский вклад 100%).
2. Статьи в рекомендованных ВАК изданиях
3. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Видуга О.Д. Характеристика структурного состояния ДНК в онтогенезе тутового шелкопряда//Доклады АН СССР. 1974. Г.216. №5. С.1192-1194. (0.2 п.л.,авторский вклад 70%).
4. Коничев A.C., Водолеев A.C., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Выделение, очистка и свойства кислой рибонуклеазы лизосомальной фракции грены тутового шелкопряда//Биохимия.-1980. Т.4-5. Вьш.5. С.821-828. (0.5 п.л., авторский вклад 30%).
5. Севастьянова Г.А., Смолин А.Н. Свободные нуклеотиды и их производные в организме насекомых//Успехи соврем. биол.-1966. Т.61. №3. С.321-337. (1,0 п.л., авторский вклад 80%).
6. Севастьянова Г.А., Смолин А.Н. Свободные нуклеотиды и их производные в жировом геле личинок дубового шелкопряда Antheraea pernyi G.M.//Bhoxhmhh.-1 967. Т.32. №3. С.548-557. (0,6 пл., авторский вклад 80%).
7. Севастьянова Г.А. Свободные нуклеотиды и их производные в шелкоотделительной железе дубового шелкопряда//Биохимия -1967. Т.32. №6. С. 1260-1270. (0,7 п.л., авторский вклад 100%).
8. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А, Видута О.Д., Ганиева М.Р., Акименко Л.М., Тищенко Т.Н. Структурное состояние ДНК как тест для прогнозирования гетерозиса у тутового шелкопрядаУ/Шелк 1976. №3. С.15-17. (0,2 пл., авторский вклад 50%).
9. Водолеев A.C., Коничев A.C., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Рибонуклеазная активность в субклеточных фракциях развивающейся грены тутового шелкопрядаУ/ Научные доклады высшей школы, биол. науки,-1977. №11. С.139. (0,06 п.л., авторский вклад 30%).
10. Филиппович Ю.Б., Севастьянгова Г.А. Структура и обмен РНК у насекомых//Успехи соврем, биол. -1988. Т. 106. Вып.2 (5). С.208-225. (1,1 пл., авторский вклад 80%).
11. Тихомирова Т.П., Тимофеева М.Я., Куприянова Н.С., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Молекулярно-генетический анализ полиморфизма рибосомных генов тутового шелкопряда//Генетика.-1992. Т. 28. №8. С.13-28. (1,0 пл., авторский вклад 40%).
12. Третяк А.П., Рысков А.П., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б., Струнников В.А. Геномная дактилоскопия Bombyx mori L.: выявление генотипической изменчивости партеногенегических клонов//Генетика 1992. Т.28. №5. С.171-175. (0,3 п.л., 30%).
13. Третяк А.П., Рысков А.П., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Геномная дактилоскопия Bombyx mori L. ¡проблема идентификации особей, семей и пород// Генетика 1992. Т.28. №2. С.52-62. (0,8 пл., авторский вклад 40%).
14. Коничев A.C., Севастьянова Г.А. Молекулярная биология.- М.: Академия, 2003. 400 с. (25 п.л., авторский вклад 50%, 1-ое издание), 2005.- 400 с. (25 п.л., авторский вклад 50%, 2-ое издание).1. Учебное пособие
15. Филиппович Ю.Б., Коничев A.C., Севастьянова Г.А., Кутузова Н.М. Биохимические основы жизнедеятельности человека. М.:Владос, 2005 - 407 с. (33 п.л, авторский вклад 25%).1. Статьи в сборниках
16. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Коничев A.C., Водолеев A.C. Рибонуклеазная активность в митохондриальной фракции грены тутового шелкопряда в процессе весенней инкубации/УБиохимия митохондрий. Наука, 1976. с.74. (0,06 пл., авторский вклад 30%).
17. Видута О.Д., Севастьянова Г.А. Метаболически активная ДНК в жировом теле тутового и дубового шелкопрядов. В. сб. «Биохимия насекомых», М.: МГПИ им. В .И.Ленина, 1979, вып. XXI, с.121-127. (0,45 п.л., авторский вклад 50%).
18. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Родина Е.Ю., "Урванцева Г.А. Содержание нуклеиновых кислот в грене пород и гибридов тутового шелкопряда в период постдиапаузного развития. Межвузовский сборн. научн. трудов
19. Биохимия насекомых», М.: «Прометей», 1989, с.3-12. (0,6 п.л., авторский вклад 60%).
20. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Водолеев A.C., Рибонуклеазная активность белков развивающейся грены тутового шелкопряда.// В сб. «Биохимия насекомых», вып XVIII. М., МГПИ им. В.И. Ленина, 1975, С. 190-196 (0,45 п.л., авторский вклад 70%).
21. Севастьянова Г.А., Коничев A.C., Филиппович Ю.Б. Биосинтез РНК в эмбриогенезе тутового шелкопряда. Сб. «Биохимия насекомых», М. МГПИ им. В.И.Ленина, 1974, вып. 17, с.75-84 (0,6 п.л., авторский вклад 60%).
22. Видута О.Д., Оболенкова Л.А., Адо Н.Ю., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Выделение ДНК из грены тутового шелкопряда.// Сб. «Биохимия насекомых», вып. XX. М„ МГПИ им. В.И. Ленина, 1978, С. 11-15 (0,3 пл., авторский вклад 50%).
23. Водолеев A.C., Севастьянова Г.А. Фосфодиэстеразная активность растворимых белков в тканях личинок и куколок тутового шелкопряда.// Сб. «Биохимия насекомых», вып XXII. М., МГПИ им. В.И. Ленина, 1980, С. 105-110 (0,4п.л., авторский вклад 80%)
24. Филиппович Ю.Б., Адо Н.Ю., Алцыбеева Т.И., Банников В.М., Горленко В.А., Грошева М.П., Егорова Т.А., Клунова С.М., Налетова Е.А., Севастьянова
-
Севастьянова, Галина Андреевна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2006
-
ВАК 03.00.04
- Прогнозирование продуктивности, адаптационных способностей пород и гибридов тутового шелкопряда по ферментным системам и белковым спектрам
- Сравнительная характеристика глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы тутового и дубового шелкопряда
- Экологические и генетико-селекционные основы повышения оплаты корма у тутового шелкопряда Bombyx mori L.
- Характеристика комплекса нейтральных рибонуклеаз яиц некоторых насекомых
- Изучение комплекса протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в грене тутового шелкопряда
