Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика протеолитического комплекса ферментов хроматина тутового щелкопряда

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика протеолитического комплекса ферментов хроматина тутового щелкопряда"

РГб 0/1

. МОСКОВСКИЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИ!! ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени В. II. ЛЕНИНА

Специализированный Совет К 053.01.01

На правах рукописи

ПАЗАРОГ? Андрей Юрьевич

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ФЕРМЕНТОВ ХРОМАТИНА ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА

Специальность 03.00.04 — биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

Работа выполнена в Московском педагогическом государственном университете им. В. И. Ленина.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор 10. Б. ФИЛИППОВИЧ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Т. А. ВАЛУЕВА

доктор биологических наук А. В. ВАСИЛЬЕВ

Ведущая организация: Институт биологии развития Российской академии наук.

Защита диссертации состоится «A3...... г... 1993 г.

в часов на заседании (специализированного совета

К 053.01.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических паук в Московском педагогическом государственном университете им. В. И. Ленина по адресу: Москва, ул. Кибальчича, д. 6, корп. 5, ауд. 50G.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МПГУ им. В. И. Ленина (119435, Москва, Малая Пироговская, д. 1).

Автореферат разослан М- .» ОиллА%wMlS.. 1993 г.

: Ученый секретарь специализированного совета,

доктор биологических наук, профессор А. П. ОЖИГОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ . ТЕ?,И. Изучению протеолитических ферментов хроматина и ядерного матрикса в последнее время уделяется достаточно большое внимание. Это связано с тем, . что протеолиз считают одним из факторов регуляции активности генома и структурных перестроек хроматина. Детальное изучение протеаз хроматина способно пролить свет на проблему механизма активации генома.

За последние 20 лет накоплен значительный объем Данных' о протеазах хроматина и •■ ядерного, матрикса. Выяснены физико-химические характеристики ряда анзимов. Установлено, что протеазы хроматина различных организмов проявляю? специфичность как в отношении гистонов, так и различны! кегистоновых белков.' Предполагается, что протеазы хроматина принимают участие, в процессинге ряда ферментов. Однако ни в одной из работ _нет данных о получении хотя бы одного протеолитлческого энзима хроматина в гомогенном состоянии и детальной характеристике его физико-химических свойств. Никто не предпринял попытку подробного анализа протеолитических фермеМ'бй- хроматина как целостного комплекса. Практически ГголйоСТЫя отсутствует информация о протеазах хроматина насекойй» йякей также не ставилось задачи установить коррелящюшус аазггсййость мекду активностью протеаз в хрома-гай я йййкмиг-либо хозяйственно-полезными признаками

В свете вышесказанного, яэучеййе ПротейЯКТйчв ского комплекса хроматина тутового шелкопряда представляет значительный интерес как в теореЯ^Чбсйой, так и в> срзктическом аспектах.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ* Основной целью дайййго йссдадования была детальная характеристике Кротеолитичесгеюг комплексов хроматина грены и ¡геЖббГДеЯНельиоЙ далей* тутового шелкопряда, выделение . Я Лйр&стёрйсМ»® огдемгш ензшов,

входящих б его состав, и изучение связи активности ферментов в хроматине с хозяйственно-полезными признаками тутового шелкопряда. Для достижения етой цели были поставлены следующие задачи:

I. Выявить спектр протеолнтичеоких ферментов, входящих в состав протеолнтичеоких комплексов хроматина грены и ' шелкоотделительной железы тутового шелкопряда, зависимость их активности от рН среды.

'а. Изучить характер изменения активности протеаз хроматина грены - в процессе эмбрионального развития, а также протеаз хроматина шелкоотделительной железы - на заключительной стадии личиночного развития тутового шелкопряда.. х

3. Осуществить выделение и очистку ряда ферментов, входящих в состав протеолитического комплекса хроматина тутового шелкопряда, причем некоторых из них - до гомогенного йли близкого к нему состояния.

4. Охарактеризовать физико-химические свойства и ' . субстратную специфичность протеаз хроматина тутового

шелкопряда. Провести сравнение етих ' свойств с цитоплазматическими протеазами, имеющими сходный оптимум рН.

5. Изучить связь* активности протеаз хроматина тутового шелкопряда с некоторыми хозяйственно-полезными признаками втого насекомого.

■ НАУЧНАЯ НОВИЗНА. РАБОТЫ, Впервые дана подробная -характеристика протеолитического комплекса хроматина .хозяйственно-полезного насекомого - тутового шелкопряда. Установленаего тканевая специфичность. Показано, что изменение активности" протеаз . хроматина грены в процессе вмбркогенеза коррелирует с такими-существенными ' биохимическими процессами, как органогенез ■ и биосинтез нуклеиновых ' кислот, а протеаз хроматина шелкоотделигельной железы в течение пятого личиночного возраста - о процессами эшшфпсэции' генов и усилением интенсивности синтеза белкоз аелка. Впервые получен гомогенный- препарат

протеазы хроматина шелкоотделигельной железы тутового шелкопряда. Изучены физико-химические ■ свойства и субстратная специфичность втого энзима. Впервые установлена положительная корреляционная зависимость мекду активностью протеаз хроматина н шежоносностыо пород тутового шелкопряда,

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Разработаны орипшалыше методики выделения и очистки протеолитических ферментов хроматина. Впервые для етой цели использованы такие современные биохимические методы, как аффинная хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография. Установленная наш положительная корреляционная зависимость между активностью протеаз хроматина грены и шелкоотделительной железы тк шелкокосностыо пород тутового шелкопряда позволяет использовать данные об активности протеаз хроматина в качестве энзиматического теста в селекции.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты диссертационной работы докладывались на Международном симпозиуме "Актуальные проблемы мирового шелководства" (Мерефа, 1991), на координационном совещании шелководов стран СНГ (Мерефал 1393) и ежегодно - на заседаниях кафедры органической и биологической химии МПГУ им». Ленина (1389-1393 г.).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертационной работы опубликовано 3 статьи и тезисы сообщения на Международном симпозиума -"Актуальные проблемы мирового шелководства".

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Работа состоит из введения, обзора литературы, отражающего современные представления о структуре хроматина и роли' протеолитических ферментов в его состава» описания материалов и методов исследования, 3-х глав, содержащих результаты собственного исследования и их

"

обсуждение, заключения, выводов • и библиографического списка. Диссертационная работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 19 рисунков. Список цитируемой литературы включает 133 наименования, из которых 92 - йа иностранных языках. '

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Материалом для исследования служила грена.- и шелкоотделительная железа тутового шелкопряда ряда гибридов и контрастных по . продуктивности пород. Грена гибрида Еелококонная-2хБелококонная-1 была, получена с Георгиевского гренажного завода, а грена контрастных по продуктивности пород - из Среднеазиатского НИИ шелководства. Шелкоотделительная железа тутового шелкопряда гибрида Теграгибрид-3, а также' контрастных по продуктивности пород была изолирована из личинок, полученных в Среднеазиатском НИИ шелководства.

Выделение ядер и хроматина из грены тутового шелкопряда. осуществляли по методике, разработанной Курановой - и . др. (Куранова и др., 1385). Выделение ядер из клеток' .фиброинового отдела шелкоотделительной .келезы • осуществляли по методике Иаинуры и др. (Iohinura et al, 1935). Выделение хроматина из ядер клеток фиброинового отдела осуществляли по методике Курановой и др..

Протеолитическую активность в .'грене и'' всех фракциях, полученных из нее, определяла по методу Ансона (Anson, 1939)» модифицированному для определения протеолитическрй активности в тканях тутового шелкопряда (Клунова и да., ISB5). Протеолитическую активность в велкоотделительной железе и Bcei фракциях, полученных из нее, осуществляли . по методика, предложенной фирмой ДЙА-М для определенияч протеолитической активности по азоальбунину, но с использованием азоказеина в качестве субстрата, •' •

гроу?,тогрпй.г>а - , осуществляли на

бацитрацлн-сефарозе, синтезированной наш, а также на домбисорб-грамицидине - носителе, изготовленном фирмой ДИА-М.

Для гель-фшьтрацш использовали ТСК-гель марки HW-55.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (KPL0) проводили на приборе марки "Hitaohi-635" с использованием колонки фирменного изготовления, заполненной носителем ТСК-ДЕАЕ--5Р'г7.

Аналитический електрофорез осуществляли по методу Девиса (Bavis, 1964). Определение молекулярной массы фермента вели электрофоретическкм методом по прописи Ламмли (baemmly, 1970),

Определение концентрации ДдК при характеристике чистоты хроматина, полученного из шелкоотделительной железы, проводили по методу Бартонэ (Burton, 1956).

Концентрацию белка во всех случаях определяли по методу Лоури (Lowry et al, 1951).

Характеристика ггротеолитаческого комплекса хроматина грены тутового шелкопряда

Результаты определения протеолитической активности в составе лабильно связанных белков хроматина грены приведены на рис. I . Видно, что в составе хроматина грены присутствует достаточно сложный комплекс протеолитических ■ ферментов, функционируют« при разнообразных значениях рН (оптимуш рН 3,4; 6,2; 7,В и 9,3). 3'iO согласуется с имеющимися в литературе данными о присутствии в хроматине еукариот протеаз с оптшумом в широком диапазоне рН (от 4 до II). Преобладание- "кислых1* протеаз в составе хроматина греки соответствует данным о преобладают сходных ферментов в протеолитнческом комплексе, осуществляющем гидролиз запаишх белков грены, что мотет говорить о тесной связи данных протеолитических комплексов, Ь хроматине .других организмов не обнаруживается преобладания протеолитической активности в кислой области рН.

Нами прослежено (рис. 2) изменение активности щше&э с

среды. По оси эбсЦ/Ос - знач'скпе рН, по оси 'ординат активность протеьз ^с/.. ед.). ■

4 6 .8 9'

Рис. 2. Изменение удельной активности гтротэаз с оптимумэми рН 3,4 (А) и Б, 2 (В) в ходе постдиапаузного развития грены тутового шелкопряда: о-в. '- грена (белки, растворимые в 0,35М ИаСЬ)

0-0 - ядра (белки, растворимые в 0,351.1 НаОХ)

х-х - хроматин (экстракт лабильно связанных белков)

¿-А ■ - хроматин (экстракт прочно связанных белков)

По оси абсцисс - дни постдиапаузного развития греш

По оси ординат-удельная активность ферментов (усл.ед./мг белка)

сштшуыом рН 3,4 и 6,2 в развивающейся грене в составе лабильно связанных и прочно связанны! белков хроматина. Активность протеазы с оптимумом рН 3,4 в составе лабильно связанных белков хроматина возрастает к Б-му дню весеннего развития грека (стадия форы; -ТрОБЭКИЯ белой гусеницы). Это ■ коррелирует с' ускорением умножения числа клеток и роста эмбриона, а также с накоплением ЛЖ и РНК и усилением новообразования аминокислот и белков. На основании приведенных данных напрашивается предположение о ведущей роли в развитии вибриона тутового шелкопряда протеазы с оптимумом рН 3,4.

На рис. 2 также ясно видно, что переход протеазы с оптимумом рН 5,2 из прочно связанного в лабильно связанное состояние соответствует 4 дню ембрионального развития (стадия укорочения 5«родшаа), Этот период характеризуется усилением интенсивности биосинтеза ДНК, изменением структурного состояния и метаболической активности хроматина. Поетому можно допустить, что протеаза о оптимумом рН Б,2 имеет отношение к процессам активации генома, предшествующим дифференцировке и органогенезу у тутового шелкопряда.

Ул предприняли попытку выделения протеазы с оптимумом рН 3,4, максимально представленной в протеолитическом комплексе хроматина грены, "методом аффинной хроматографии на бацитрации-сйфарозе. Hai.ni был получен ¿¡врыент, очищенный б 145 раз. Элэктрэ^оретический анализ полученного препарата фермента показал, что протеаза с оптимумом рН 3,4 была получена в состоянии, близком к гомогенности.

Ккгибиторный анализ показал, что протеаза с 'оптимумом рН 3,4 мо;;;от быть отнесена к подклассу цисте иловых протеинаэ (КФ 3.4.23). Протеаза же с оптимумом рН 3,3 монет быть отнесена '{с подклассу серяновнх протеиназ (КФ 3.4.21).

ПротеолитическиЙ комплекс хроматина грены тутового шелкопряда ооде^ич', таким образом, как- сериновые, так и цистегагавке щу.те.лвзч, яроявл.тсзие различную активность на

различкых стадиях эмбрионального развитая. Можно й высокой степенью достоверности предположить, что комплекс протеаз хроматина грены, выполняет различные функции в процессе эмбриогенеза.

Характеристика протеоллтического комплекса хроматина

шелкоотделигельной железы тутового шелкопряда В первую очередь наш . было показано, что хроматин из клеток фнброикоБОГо отдела шелкоотделительной железы, получаемый нами, соответствует общепринятым • стандартам (соотношение.-белок/ДНК в препаратах хроматина составляет 1,3).

Предварительные експериментн по определению- . протеолитической активности в хроматине шелкоотделительной . • келезн показали, что протеолитпческая активность при рЯ 3,4, максимально проявлякцаяся в хроматине грены тутового ыелиопряда, крайне слабо представлена в хроматине . шелкоотделительной железы. Напротив, протеазы, имеющие оптимум рН- в щелочной области, проявляют .сравнительно■•-высокую активность в хроматине етого органа.Результата более тонкого анализа возможных значений оптимума рН в щелочной области приведены на рис, 1 . Приведенные результаты говорят о том, что обнаруживается по меньшей мере три оптимума рЯ действия протеолитических ферментов хроматина шелкоотделительной железы в щелочной области; они'лежат при рН 7,5; 9,0 и II,0.

Данные, приведенные на рис. 3 , демонстрируют сходство динамики активности протеаз хроматина шелкоотделительной велезн при различных значениях рН в течение У. личиночного возрзйта. Обращает на себя внимание увеличение, .удельной активности всего спэктрз щелочных протеаз в составе лабильно связанных белков хроглатина к концу У ■ -личиночного 'возраста. Эти данные »'орре.-пфуют с динамикой синтеза белков шелка, в связи с - чем' • от:о. • до:.-уотать возможность активного , „участия -всех туочрсазша протеа? в' активации фн^рожювых генов. Активность к-хи-еэг- го йракщг? «рау© .свезвзянх" • ,<5елков хроматина

? . 3

Рис.3.Динамике удельной активности протеэз фракции лабильно (А) и прочно (Б) сья&анных белкоь хроматина иелкоитделительной железы. По оси абсцисс - дни У.личиночного возраста, по оси ор-дийат - удельняя активность (упл. ед./мг белка);

х-г - рН7,5; м-к - рКЗ.О; о-о - рНП.О.

значлтелыга возрастает в середине У личиночного возраста, что соответствует моменту амплификации генов у личинки. Напрашивается предположение о том, что протеазы, прочно ассоциированные; с хроматином, входят в состав аппарата репликации ДНК.

Выделение протеазы с оптимумом рН 3,0 из безъядерного экстракта шелкоотделительиой хелезы осуществляли . "методом гель.-фяльтращш и аффинной хроматографии' ■ на ' домбисорб-грашцидине. В результате ' был получен '. препарат фермента, очищенный в 430 раз. Ингибиторный анализ, 'показал/' . что исследуемая . протеаза из безъядерного экстракта-шелкоотделительиой железы является сериковой протеиназой (КФ . • 3.4.31). Молекулярная масса этого фермента, определенная ' методом гель-фильтрации, составила 30 кДа.

Выделение протеазы с оптимумом рН 3,0 из хроматика фиброгагоБого отдела шелкоотделительиой аелезы вели из фракции лабильно связанных-белков хроматина методом высокоэффективной ■ жидкостной хроматографии, осуществляя елюцию о колонки ТСК-ДЕАЕ-5РИ7 ступенчатым градиентом МаОЬ (от 0 до 1,3 Н, 10 ступеней). Один из белковых пиков, елюируемый примерно 0,6 М НаСЬ, содержал фермент в гомогенном состоянии. Препарат фермента был очшвен етим методом в 33 раза. Схемы денситограмм электрофоретических спектров фракции лабильно связанных белков хроматина и гомогенного препарата протеазы приведены на рис. 4. ••' ■■

Молекулярная масса еязима, . определенная методом' електрофореза а ПААГ, состарила. 33 кДа. Ингибиторный анализ почазал принадлежность исследуемой • протеазы к подклассу cnpimoBux .протеиназ ' (КФ 3.4.31).' Анализ субстратной сдац^пчнэсти фзрмеитз показал, что исследуемая протеайа,' . ранее исследованным протеззрм, хроматина, не л^'.швляет опе:.> ^чиоста в ovncaemm синтетических субстратов. . Из Ослюних eyivipbTOb фершчт а болыгей -отепени гидролизует

АБЗЗ 2,5

Я

4 время (шт)

833 3,5

¿5

Т время(мин)

Т

Рис.4. Схемы денеигограмм ьяектрофэретических спектров фракции •лабильно связанных белков хроматина (А) и препарата протеазы •хроматина шелкоотделительной железы (оптимум рН 9,0), очищенной методом КРЬО (Б).

• • • -13-

гистоны, нежели негистоноше белки и казеин. Эп! данные

согласуются о гипотезой об участии ¡троте аз в превращениях

гистонов, происходящих в процессе репликации и транскрипции.

Нами показано такке, что активность исследуемого фермента

2+ ?4-

увеличиваетса примерно в 1,5 раза#в присутствш{' Са и % . .

(ю~3м). • • ■ • . ' ;

Таким образом, протеззз.с оптимумом рН 3,0 из -хроматина шелкоотделительиой железы .тутового шелкопряда и протезза с аналогичным оптимумом рН из безъядерного • экстракта иелкоотделительной келезн сходны по ряду .свойств. . " Но все жй нет основания считать их одним и тем же • ферментом, поскольку их динамика в процессе - ембрногенеза . различна. * *

Характеристика протеаз, связанных с хроматином, у различных по. продуктивности пород тутового шелкопряда ■ Нами проанализирована активность протеаз в хроматине грены тутового шелкопряда> при рН 3,4 и в хромаише • фибротоюго отдела иелкоотделительной жэлезн тутового шелкопряда - при" рН 3,0 у контрастных по продуктивности пород тутового шелкопряда. При этом было, установлено, что активность • протеолитических ферментов в - хроматине коррелирует •с таким ваянейшим хозяйствекно-шлезнш ттризнакои, как шедконосность порода. Ковффивдент корреляции, рассчитанный для протеаз хроматина грены, составил +0,?5, а для протеаз хроматина иелкоотделительной яелезы - +0,??. Данные об ' активности-ферментов и велконосности контрастных .по." продуктивности •' пород .тутового шелкопряда, исследованных..в.данной работе, приведены в табл. Г . •'

Таблица I

Активность протеэз в хроматине грены и шелкоотделительной железы тутового шелкопряда у различных по продуктивности пород

Название порода Шелконосность (в процентах на свежий вес кокона)

Активность протеаз в хроматине грены (усл. ед. на I яйцо)

Активность про-теаз в хроматине шелкоотделительной железы (усл.ед.на I личинку)

Советская-5 25,6

САКШ-30 22,4

СШШ-е 21,7

Белококонная-I 19,0

Китайская-!15 17,0

-0Р0 15,5

17.8*1,4

25,2Н),8 13,5И,5 11,641,3 . 2,243,3 В,243,8

ЗЮ,С£Б,О

243,8^8,5 205, ОИ 5 227,5г15 140,0г5,5 97,5-3,0

вывода

I. В результате исследования . состава и свойств протеолитических комплексов хроматина грены и велкоотделительной железы тутового шелкопряда установлено, что в протеолитическом комплексе хроматина грены преобладают кислые протеазы, ь в одноименной комплексе хроматшв шелкоотделительной железы - «елочные протеазы, • что свидетельствует об их тканевой специфичности.

. 2. Изменение активности ферментов протеолитического комплекса в эмбриогенезе тутового иелкопряда свидетельствует о наличии взаимосвязи ыеаду активностью протеазы с оптимумом рН 3,4 и ростовыми процессами, в протеазы о оптиыуши рН 6,2 - с процессами дкфференцировки и органогенеза у зародыша. На заключительной фазе личиночного развития тутового шелкопряда , активность щелочных протеаз фракции прочно связанных белков хроматина корреспондирует с процессами амплификации генов у личинки.

3, Положительная корреляционная зависимость между активностью протеазы хроматина грены с оптимумом рН 3,4 и

протеазы хроматина шелкоотделительной железы с оппшуйом рН 3,0

и продуктивностью ' пород тутового шелкопряда открывает возможность использования данных об активности протеаз в

хроматине для прогнозирования продуктивности пород тутового

шелкопряда на самой ранней фазе его развития. .

Осуществлена очистка ряда' ферментов протеолитического комплекса хроматина гренн и шелкоотделительной железы, ъ также одного из ферментов безъядерного экстракта шелкоотделительной келезы тутового шелкопряда: ...

--методом аффинной хроматографии на бацитрацин-сефарозе . фермента из хроматина грены тутового шелкопряда (оптимум рН_ 3,4) - в 145 раз до состояния, близкого к гомогенности;

-методом гель-фильтрации и аффинной хроматографии на • домбисорб-грчмнцидине - фермента из безъядерного экстракта шелкоотделительной :келезы ту том го шелкопряда (оптимум рН 3,0) в 430 раз; ,

. -методом высоко эффективной .жидкостной хроматографии на' ТСК-ДЕАЕ - фермента из хроматина шелкоотделительной-" жадезы тутового (оптимум рН 9,0) - в 93 раза, до гомогенного состояния.

5. Осуществлен анализ физико-химических ' свойств, установлена подклассовая принадлежность и субстратная специфичность ряда ферментов протеолитического комплекса хроматина грены и шелкоотделительной етлезы:

-фермент из хроматина грены тутового шелкопряда . с ' оптимумом рН 3,4, по всей вероятности, ■ является цистеиновой-протенназой; *. .

-фермент из безъядерного -екст'ракта шелкоотделительной железы тутового шелкопряда" (оптимум. рН 3,0), по-видимому, 'является сёршовой протёшэзой. Его молекулярная масса, -определенная петодом гель-фильтрации, составляет 30000 Да;_

-Фзрг;ент из хрома тина шелкоотделительной келезы тутового елкегтрлда (оптшум. рН 3,0), очищенный _ до гомогенного

-ТВ-

состояния, является сериновой протеиназой; его молекулярная ыасса, определенная методом влектрофореза в присутствии SDS, равна 23000 Да; фермент предпочтительнее гидролизует эндогенные гастоны 'в сравнении с негистоновыми бедками и екзогенныы субстратом (казеином).

-Ни один из изучении! ферментов хроматина., тутового шелкопряда не проявляет активности по отношении к синтетическим субстратам (п'-нитрс&нилидвм соответствующих пептидов), что согласуется с данными *о специфичности протевз хроматина из других биологических объектов.

Основное • содержание диссертации отражено в следующих работах:

1. Клунова С.М., Тарасенко Н.В., Назаров A.D. Определение общей протеолитической активности в гемолимфе тутового шелкопряда спектрофотометрическими методами // Ыэтода анализа белков и нуклеиновых кислот в тканях и органах насекомых. Методические разработки, М., "Прометей", I3B8. С. 57-61.

2. Клунова С.М., Назаров А.Ю. Очистка пептидогидролазы из хроматина греки тутового шелкопряда // Биохимия насекомых. М., "Прометей", 1983. С. 3846.

3. Назаров A.D., Клунова С.Ы. Изучение комплекса протеолитических' ферментов хроматина шелкоотделительной Евлезы тутового _ шелкопряда JJ МеадународныЙ симпозиум "Актуальные проблемы мирового шелководства". Тезисы докладов. Царефз, 1993. С. 70-71.

4, Клунова С.Ы., Назаров A.B., Филиппович D.E. Исследование пептадогидролаз в хромайте., грены тутового иелкопрядв в ходе ее лостдиапаузного развития Ц Онтогенез. 1993. Т. 2А. ЯГ. С. 43-47.