Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение комплекса протеолитических ферментов при воздействии токсинов различной химической структуры в печени живородки речной

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Изучение комплекса протеолитических ферментов при воздействии токсинов различной химической структуры в печени живородки речной"

На правах рукописи Посвящается моим родителям

400/575

Конин Дмитрий Николаевич

ИЗУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ТОКСИКАНТОВ РАЗЛИЧНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ В ПЕЧЕНИ ЖИВОРОДКИ РЕЧНОЙ

03.02.08 - Экология (биологические науки). АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2.0 ОКТ 2011

Москва 2011

4857575

Работа выполнена на кафедре органической и биологической химии биолого-химического факультета Московского педагогического государственного университета.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Коничев Александр Сергеевич

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор Генгин Михаил Трофимович Кандидат биологических наук, доцент Гераскина Галина Валентиновна Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский городской педагогический университет»

Защита состоится «10» ноября 2011 года в /5Г12о На заседании Диссертационного совета Д.212.155.13. при Московском государственном областном университете по адресу 141014, Московская обл., г. Мытищи, ул. Веры Волошиной, д. 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного областного университета по адресу: 105005, Москва, ул. Радио, д. 10а

Автореферат разослан Ю_ октября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук

Т.А. Снисаренко

Актуальность темы. В настоящее время уделяется значительное внимание биохимическому тестированию воздействия различных экотоксикантов на живые организмы [Антонов В.К., 1991; Бондарева ДА., 2002; Егорова Т.А., 2004]. В свою очередь любые нарушения в жизнедеятельности организма начинаются с изменения присущих ему в норме биохимических процессов. Рост и развитие щдробионтов, и их ответные реакции на воздействие внешней среды опосредуется совокупностью метаболических процессов в их организме. Процессы метаболизма в свою очередь, как известно, контролируются ферментами [Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е., 1999; Reich Е., Rifldn D.B., Shaw Е., 1975].

Одним из наиболее перспективных приемов индикации загрязнения является изучение реакции на него протеолитических ферментов, как инструментов протеолиза - непременного фундаментального процесса обмена веществ в организме животных, обеспечивающего распад белков, пополняющего аминокислотный фонд клеток, участвующего в росте, делении и гибели клеток [Куцый Н.П., Кузнецова Е.А., Газиев А.И., 1999; Нейфах A.A., Тимофеева М.Я, 1977].

В последние годы был проведен ряд экспериментальных работ, в которых установлено, что моллюски представляют собой весьма перспективный тест-объект изучения воздействия различных групп токсикантов (галогенорганические соединения, фенольные соединения, ионы тяжелых металлов и пр.) на ферментные системы шдробионтов, что может быть использовано для оценки уровня загрязнений водной среды. Соответствующие данные были получены в отношении нуклеаз, фосфатаз и дегидрогеназ [Попов А.П., 2002; Цветков И.Л., 2009]. В тоже время ферменты белкового обмена у гидробионтов мало изучены. Мы продолжили исследование в этом направлении, и основной целью

3

данной работы стала характеристика изменения протеолитической активности ферментов живородки речной УМрагш \iviparus под воздействием токсикантов различной химической природы.

Исследование протеолитического комплекса ферментов в печени живородки речной представляет интерес не только для выяснения их роли в процессе токсикации организма загрязнителями антропогенной природы, но важно и в практическом отношении. Однако пептидогидролазы в экологическом аспекте у живородки речной практически не исследованы.

Цели и задачи исследования. Целью работы является исследование протеолитических ферментов в процессе интоксикации в печени живородки речной.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать эндогенный протеолитический комплекс в печени живородки речной и оценить степень его гетерогенности.

2. Изучить состав комплекса пептидогидролаз в печени живородки речной.

3. Проанализировать динамику активности протеолитического комплекса при различной продолжительности воздействия на него экотоксикантов различной химической природы.

4. Изучить структуру комплекса протеолитических ферментов, классовую принадлежность его компонентов.

5. Изучить спектр растворимых белков печени живородки речной в норме и при воздействии экотоксикантов различной химической природы.

Научная новизна работы. Отработаны методы исследования комплекса протеолитических ферментов, предназначенные для используемого тест -

объекта живородки речной УЫрагиз уЫрагиз Ь.

Охарактеризован комплекс протеолитических ферментов, участвующих во внутриклеточной деструкции белков в диапазоне рН от 2,2 до 9,6 в печени живородки речной УЫрагиз \Мрагш I.

Впервые исследована динамика активности протеолитического комплекса ферментов в норме и при различных концентрациях экотоксикантов основных групп загрязнителей, при различной продолжительности воздействия на него экотоксикантов различной химической природы.

Проведен ингибиторный анализ активности протеиназ и установлена структура комплекса протеолитических ферментов.

Практическое значение работы. Полученные данные о высокой активности и многокомпонентности протеолитических ферментов в печени живородки речной свидетельствуют о фундаментальной роли пептидогидролаз в обменных процессах белков при токсикации организма гидробионта.

Анализ полученных данных позволяет конкретизировать данные о биохимических функциях исследованных пептидогидролаз в процессе токсикации живородки речной.

Установлена взаимосвязь между уровнем активности протеиназ в печени моллюска в норме и при отравлении, что в перспективе позволит использовать их в качестве биохимического теста для фиксирования уровня загрязнения окружающей среды.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на научных сессиях по итогам научно-исследовательской работы МПГУ в 2004-2011 году, а так же на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биоэкологии» в 2008 году и VI

5

Симпозиуме химии протеолитических ферментов в 2007 году. Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 9 печатных работах из них 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, отражающего современные представления о протеолитических ферментах у моллюсков, описание материалов и методов исследования, результатов эксперимента и их обсуждения, заключения и выводов. Диссертационная работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 41 рисунок. Список цитируемой литературы включает в себя 125 названия, из которых 43 на иностранных языках.

Биологический материал. Моллюсков собирали в прибрежной зоне реки Вязь в районе деревни Тишково Московской области и транспортировали в лабораторию в сосудах, заполненных взятой из реки водой. Собранные животные (150-200 особей) до опыта культивировались в аквариуме объемом 60 литров, содержащим лабораторные и взятые из реки растения нескольких видов, таких как Elodea canadensis, Vallisneria spiralis, Lemna trisulca. Воду в аквариуме периодически подменивали на 1/3 объема водопроводной водой, отстоянной в течение трех суток. При необходимости животных подкармливали листьями одуванчика, капусты, салата, как это рекомендуется для лабораторного содержания моллюсков.

Токсикологическому эксперименту во всех случаях предшествовал период акклимации, характеризующийся стабилизацией значений внешних факторов. Моллюсков содержали при умеренном освещении, ежедневной двадцатичасовой аэрации воды и регулярной, раз в трое суток, подмене воды в течение одного месяца. Этого времени, по литературным данным, вполне достаточно для стабилизации физиолого-биохимических процессов

в организме культивируемых гидробионтов. [Браун А.Д., Моженок Т.П., 1987; Егорова Т.А., 2004; Коничев A.C., Попов А.П., Цветков И.Л., 2007].

Ввиду малых величин предельно-допустимых концентраций (ПДК) поллютантов, готовили их более концентрированные (матричные) растворы, разбавлением которых получали необходимые для опыта концентрации растворенного в воде токсического вещества [Грушко Я.М, 1982], По окончании периода акклимации экспериментальных моллюсков подвергали воздействию различных токсических веществ. (Таб. 1-2)

Таблица 1

Использованные в работе токсиканты

Токсикант Концентрация матричного раствора, мг/л Разбавление Конечная концентрация токсиканта, мг/л Величина ПДК, мг/л

рыбохоз.1 гигиенич/

Си2+* 50 :500 :10 :500 :100 0,01 0,001 0,001 токе. 0,1 общесан.

Zn2+* 10 : 100 : 1000 0,1 0,01 0,01 токе. 1,0 общесан.

Fe2*' 5 :100 :1000 0,05 0,005 0,005 токе. 0,5 орг.

Cd"' 5 : 100 :1000 0,05 0,005 0,005 токе. 0,01 сан.-токс.

Kg"' 5 : 100 : 1000 0,05 0,005 0,005 токе. 0,01 сан.-токс.

Фенол (карболовая кислота) 50 :50 :1000 0,001 0,001 рыб. хоз. 0,001 орг.

Бензин (АИ-95) 500 : 10000 0,05 0,05** рыб. хоз. 0,1 орг.

Примечание: 1 - лимитирующий признак вредности (ЛПВ) для воды водоемов, имеющих рыбохозяйственное значение; 2 - ЛПВ для воды водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования; ЛПВ: токе. -токсикологический, рыб. хоз. - рыбохозяйственный, общесан. - общесанитарный, сан,-

токс. - санитарно-токсикологический, орг. - органолептический. * металлы использовались в виде солей: СиС12 • 2Н20, Си304 ■ 5Н20, гп304 ■ 7Н20, Ре304 • 7Н20, Сс1С12 • 2 'Л Н20; ** для поверхностно-активных веществ.

Таблица 2

Галогеиорганические токсиканты, использованные в работе

Токсикант Матричный раствор, мкл/мл НгО или С2Н5ОН Вносимый объем, мкл/л Конечная концентрация токсиканта, мг/л Величина ПДК, мг/л

рыбохоз. гигиенич.

Хлорбензол 90,3/9,910 100 0,001 0,001 токе, 0,02 сан. -токе.

124,1 /0,734 100 0,010

Ъромбензол 20,1 / 29,980 100 0,0001 0,0001 токе. -

94,7 / 9,642 100 0,0010

Иодбснзол 54,4 / 9,946 100 0,001 - -

785 / 8,945 100 0,010

Тетрахлорэтан 20 / 9,980 2800 7,5 - 7,5

19/9,710 84 112,5

Трихлорметан 20 / 9,980 21 0,05 0,005 токе. 0,06

240 0,5

Тетрахлорметан 3/15,0 925 0,3 - 0,3 сан.-токс.

295,8 3,0

Примечание: то же, что к табл.1

Основные методы исследования. Для биохимического анализа из отдельных органов исследуемых животных готовили водно-солевые экстракты. У моллюсков путем вивисекции извлекали печень (гепатопанкреас), промывали ее 0,15М NaCl и растирали в охлажденной льдом фарфоровой ступке в течение 5мин с кварцевым песком. В качестве экстрагирующей жидкости использовали 0,15М раствор NaCl, прибавляемый в десятикратном по отношению к навеске ткани объеме. Растворы, содержащие однородную среду, получали, объединяя органы от

5 особей, что, согласно результатам специальных исследований по биохимическому тестированию, существенно снижает коэффициент вариации показателей ферментативной активности [Попов А.П., Цветков И.Л., Коничев А.С., 2006; Юровицкий Ю.Г., Сидоров B.C., 1993].

Полученные экстракты, для отделения не растворившегося материала очищали центрифугированием при 10000g (4°С) в течение ЗОмин на рефрижераторной центрифуге К-24. Супернатанты декантировали и хранили при -10°С.

В полученных экстрактах определяли содержание белка по методу Лоури и активность ферментов, которую выражали в стандартных единицах активности - Е или единицах удельной активности - Е/мг белка. Ферментативную активность у опытных животных оценивали по отношению к контрольным и выражали в процентах. Все измерения производили в 3 - 6 повторностях, статистическую достоверность результатов оценивали с вероятностью 0,95 (в некоторых специально указанных случаях - 0,99) [Клунова С.М., Ярыгин Д.В. , 2001; Клунова С.М., Тарасенко Н.В., Киреева З.В., 1987; Anson M.L., 1939].

Протеолитическую активность определяли по стандартным методикам [Клунова С.М., Ярыгин Д.В. , 2001; Клунова С.М., Тарасенко Н.В., Киреева З.В.,1987; Anson M.L., 1939], отрабатывая оптимальные условия опытным путем (рН инкубационной среды, время инкубации, содержание белка в пробе и количество вносимого субстрата). Исходя из выявленных оптимальных параметров, использованная нами методика приобрела следующий вид: 0,3мл разбавленного в 10-15 раз белкового экстракта печени моллюсков инкубировали с 0,05мл раствора субстрата (1%-ный раствор гемоглобина), 0,1мл дистиллированной воды и 0,55мл 0,05М фосфатно-цитратного буфера (рН = 3,2) в течение 1ч при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 0,24мл холодного 10%-ого раствора

трихлоруксусной кислоты. Пробы помещали на 20мин в холодильник для формирования осадка, который отделяли центрифугированием при 800(^ в течение 15мин. Далее к 0,4мл супернатанта добавляли 0,8мл 0,1М №ОН и 0,36мл 1н реактива Фолина. Измеряли оптическую плотность супернатантов при 750нм против контроля, в который 0,2мл экстракта вносили после раствора трихлоруксусной кислоты. За единицу активности принимали такую каталитическую активность, которая вызывает увеличение оптической плотности при 750нм на 1 единицу в течение 1ч при данных условиях реакции.

Электрофорез (ЭФ) проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) по методике Вебера и Осборна, усовершенствованной Лэмли в 1970 году. В работе использовали прибор для ЭФ в вертикальных колонках ПААГ диаметром 4мм и длинной 8см. ПААГ готовили из стандартных растворов реактивов для ЭФ. При определение молекулярных масс субъединиц белков концентрация ПААГ составляла 10%, содержащем 0,1% ДЦС-Ыа. В качестве электродного буфера использовали раствор 0,1М трис-глициновый буфер, рН 8,3; 0,1% ДДС-Ыа.

По окончании ЭФ гелевые колонки переносили в стеклянные пробирки и заливали фиксирующим раствором (ТХУ, изопропанол, дистиллированная вода в соотношении 2:1:1), выдерживали в нем 2-Зч при комнатной температуре. Белки на колонках окрашивали 0,1%-ым раствором кумасси 0-250 1ч при 37°С, промывали колонки дистиллированной водой и отмывали в растворе: 96%-ный этанол, ледяная уксусная кислота, дистиллированная вода в соотношении 15:6:40 для удаления несвязавшегося красителя.

В качестве ингибиторов протеиназ нами были использованы: пепстатин (на аспартильные протеиназы), и-хлормеркурийбензоат (ПХМБ - на тиоловые протеиназы), фснилметилсульфонилфторид (ФМСФ - на

ю

сериновые протеиназы), этилендиаминтетраацетат (ЭДТА - на металлопротеиназы).

Результаты и их обсуждение.

На начальном этапе работы основной задачей стала оценка чувствительности ферментных систем выбранного тест - объекта к токсическому воздействию. С этой целью был проведен ряд токсикологических экспериментов с использованием тяжелых металлов.

В результате было установлено, что ионы РЬ2+, Сс12+, Ре2+ и Си2+ вызывают незначительное уменьшение суммарной активности к 48ч экспозиции с последующим увеличением к 72ч. Исключение составляет лишь опыт ионами Си2+ (1 ПДК) где наблюдается обратная картина. Удельная активность при 1 ПДК для всех ионов тяжелых металлов -уменьшается, тогда, как при более высокой концентрации токсикантов она либо увеличивается (РЬ2+), либо изменяется скачкообразно (%2+), возрастая к 48 часам и уменьшаясь к 72. Катионы кадмия, меди, железа и свинца не оказывают сильного воздействия на комплекс протеолитических ферментов (Рис. 1), что подтверждается анализом зон протеолитической активности методом энзим - электрофореза в ПААГе. (Рис.2)

150

140

^ 130 й

Й 120 о

й но

¡00 ОС

ВО

са--

рь--•12.Е

-3.se

о 1 ПДК

■ ю пдк

си5- в! . 1 69

контроль

-6.11

-11,14 -10.43

Рис.1 Влияние ионов тяжелых металлов на активность протеиназ, в % по отношению к контролю, активность которого принята за 100% (Экспозиция 72 ч)

Рис.2 Схема энзим - электрофореграмм протеолитической активности белков печени моллюсков в контроле и при воздействии ионов металлов (Экспозиция 48ч): I - 1 ПДК, 11-10 ПДК, К-контроль; 1, 2, 3 - зоны активности протсиназ

На следующем этапе эксперимента мы изучали воздействие хлорорганических соединений на активность протеаз живородки речной. Моллюсков подвергали воздействию хлорорганических соединений с концентрацией в 1 ПДК и 10 ПДК на протяжении 24, 48 и 72ч. Проведенные определения показали, что в ряде вариантов опытов под влиянием хлорорганических токсикантов наблюдается повышение удельной активности протеаз в печени моллюсков. Так при концентрации 1 ПДК (24ч экспозиции) наблюдался резкий рост протеолитической активности, что, видимо, связано с попыткой организма адаптироваться к токсикантам, но в дальнейшем (48ч экспозиции) активность резко падала, а к 72ч экспозиции падала до минимальных значений, что, вероятно, свидетельствует об отравлении моллюсков.

В дальнейшем мы исследовали влияние галогенопроизводных ароматических соединений на активность протеаз живородки речной. Моллюсков подвергали затравке в растворах хлорбензола, бромбензола и йодбензола с концентрацией в 1 ПДК и 10 ПДК на протяжении 24, 48 и

12

72ч.

Проведенные эксперименты показали, что при низких концентрациях токсикантов (1 ПДК) активность ферментов возрастала на 21-30% к 24ч и 27-40% к 48ч, что, вероятно, связано с процессом адаптации. Как и в ряде других опытов, описанных выше, более продолжительное воздействие повлекло резкое снц^ецие активности протеолитических ферментов (43-65%), подтверждая, вероятно, неспособность ферментной системы моллюсков приспособиться к данным токсикантам. (Рис. 3)

24 48 72

время экспозиции, ч

Рис.3 Влияние хлорбензола (10 ПДК) на протеолитическую активность экстрактов печени живородки речной

При более высоких концентрациях (10 ПДК) мы наблюдали снижение активности протеаз на этапе 24ч экспозиции на 14-17%, а на более поздних этапах активность продолжала снижаться, достигая

минимальных значений через 3 суток.

Следующей частью нашего исследования стало определение воздействия фенола и бензина на активность протеаз живородки речной. Проведенные определения в случае фенола показали увеличение удельной активности в интервале от 3-х до 24ч экспозиции. В дальнейшем уровень удельной активности снижался к 48ч экспозиции, к 72 часам оставался практически не изменялся, оставаясь на низких значениях. (Рис. 4)

Время экспозиции, ч

Рис.4 Влияние фенола и бензина на удельную активность экстрактов печени живородки речной, за 100% принята активность у контрольных моллюсков

В этом варианте опыта большинство (70%) моллюсков погибало к 72ч экспозиции, чему предшествовали необратимые изменения в их морфологических признаках.

Следующий этап исследования был посвящен изучению гетерогенности протеолитических ферментов исследованных нами моллюсков. Для этого мы испытали воздействие специфических ингибиторов различных протеиназ (ФМСФ, ПХМБ, пепстатина и ЭДТА) на протеолитическую активность в печени моллюсков. Полученные данные указывают на различное представительство аспартильных,

тиоловых, сериновых и металлопротеиназ в комплексе протеолитических ферментов изученного вида моллюсков. (Таб. 3)

Таблица 3

Влияние ингибиторов на активность протеолитических ферментов в печени живородки речной

Пепстатин ПХМБ

Удельная активность, ед/мг белка % к контролю Удельная активность, ед/мг белка % к контролю

0,572±0,14 46,95% 1,22±0,081 96,05%

ФМСФ ЭДТА

Удельная активность, ед/мг белка % к контролю Удельная активность, ед/мг белка % к контролю •

0,83±0,121 87,52% 0,32±0,14 67,88%

структуру исследуемого комплекса протеиназ, представленную на рисунке 5.

1

-52%

Рис.5 Состав комплекса протеолитических ферментов живородки речной, определенный по результатам ингибиторного анализа: 1 -Аспартильные протеиназы, 2 -Тиоловые протеиназы, 3 - Сериновые протеиназы, 4 - Металлопротеиназы

Заключительная часть работы посвящена изучению спектра полипептидов в печени моллюсков в норме и при токсическом воздействии. У контрольных моллюсков методом электрофореза с ДДС-№ нами были обнаружены 19 белковых фракций. Определение спектра полипептидов в печени моллюсков, подвергшихся воздействию токсикантов позволило зафиксировать распад ряда полипептидов, что соотносится с падением концентрации белка в печени при длительном воздействии ионов кадмия (10 ПДК). Не были обнаружены высокомолекулярные белки и два низкомолекулярных белка. Подобная картина обнаружена и при воздействии других токсикантов снижающих количество белка в пробах (ионы ртути, хлорорганические соединения,

фенол). (Рис. 6)

Рис.6 Фотографии электрофореграмм белкового спектра печени моллюсков в контроле и при воздействии ионов кадмия (10 ПДК): А - контроль, Б -

СсГ (10 ПДК). 1,... 19 - номер фракции

А

Б

В дальнейшем мы использовали маркерные белки с известными значениями молекулярных масс с целью определения молекулярных масс белков печени живородки речной. Смесь маркеров состояла из: БМР-Ь-

аланина (Мг=225Да), миоглобина (Мг=17800Да), бычьего сывороточного альбумина (Мг=67000Да) и ферритина из селезенки лошади (Мг=450000Да) (Protein Molecular Weight Standards, Kit MS II, SERVA). (Таб. 4)

Таблица 4

Значения молекулярных масс белков печени живородки речной (А-контроль, Б - опыт Cdî+)

А Б

№ фракции ОЭП Mr (Да) № ОЭП Mr (Да)

1. 0,005 533 300 1. 0,032 431 500

2. 0,010 512 900 2. 0,038 412 100

3. 0,025 456 000 3. 0,071 318 400

4. 0,035 421 700 4. 0,114 227 500

5. 0,050 375 000 5. 0,185 108 300

6. 0,055 360 500 6. 0,218 101 000

7. 0,068 325 800 7. 0,404 23 700

8. 0,126 207 500 8. 0,420 20 700

9. 0,187 128 800 9. 0,573 6 300

10. 0,198 118 000 10. 0,612 4 700

11. 0,257 74 500 11. 0,672 2 900

12. 0,308 50 000 12. 0,841 960

13. 0,570 6 500

14. 0,601 5 000

15. 0,621 4 300

16. 0,727 1 900

17. 0,757 1 500

18. 0,828 870

19. 0,883 560

Полученные данные указывают на то, что воздействие испытанных токсикантов приводит к распаду ряда высокомолекулярных белков на фоне возрастания активности протеиназ. При этом существенно возрастает количество пептидов с молекулярной массой около 870Да. Таким образом, выявлено влияние токсикантов на изменение наборов белков печени моллюсков, связанного с повышением активности протеолитических ферментов,

Выводы.

1. Воздействие in vivo различных токсикантов (тяжелые металлы, фенол, бензин, галогенпроизводные бензола, алифатических углеводородов) вызывает в различной степени выраженные изменения активности протеолитических ферментов в печени живородки речной. Эти изменения имеют фазный характер, совпадающий со стадиями адаптационного синдрома, и однотипны в отношении различных представителей одной группы загрязняющих веществ, что свидетельствует о развитии в организме моллюсков процессов неспецифической адаптации.

2. Под влиянием ионов тяжелых металлов (1ПДК) происходит уменьшение удельной активности протеиназ в печени моллюсков, а при высокой концентрации токсикантов (10ПДК) - увеличение.

3. Под влиянием хлороргаиических токсикантов наблюдается повышение удельной активности протеиназ в печени моллюсков (1ПДК, 24ч экспозиции), но в дальнейшем (48ч экспозиции) происходит уменьшение активности.

4. При низких концентрациях галогенароматических соединений (1ГГДК) активность протеиназ возрастала на 21-30% к 24ч и 27-40% к 48ч, что вероятно связано с процессом адаптации организмов к изменяющимся условиям окружающей среды. При

более высоких концентрациях (10ПДК) происходит снижение активности протеиназ через 24ч экспозиции на 14-17%. На более поздних этапах экспозиции активность продолжала снижаться на 9498% по отношению к контролю.

5. Фенол и бензин оказывают наиболее существенное воздействие на активность комплекса протеолитических ферментов. Выявлено увеличение активности на отрезке от 1ч к 24ч экспозиции с последующим резким снижением активности к 48-72ч, при этом большинство (70%) моллюсков погибает после 72ч воздействия данных токсикантов.

6. Впервые методом электрофореза с ДДС-Иа исследован белковый спектр печени моллюсков и определены молекулярные массы их полипептидных цепей, которые варьируют от 560Да до 533кДа. Под влиянием С61+ (ЮПДК) на фоне увеличения протеолитической активности происходит распад полипептидов с молекулярными массами 375-512кДа и одновременно увеличивается число пептидов с массой около 960Да, что свидетельствует о распаде высокомолекулярных белков.

7. Разработан метод выявления протеолитической активности белков гепатопанкреаса после электрофореза в ПААГе. Высокая электрофоретическая подвижность белков, обладающих протеиназной активностью, свидетельствует об их небольшой молекулярной массе. В контроле выявлены 3 зоны активности, а под влиянием Н£2+, происходит исчезновение одной из зон, обладающей наименьшей электрофоретической подвижностью.

8. Впервые охарактеризованы степени ингибирования для различных подклассов протеиназ, что позволяет определить состав комплекса протеолитических ферментов в печени исследованного вида

моллюсков: аспартильные протеиназы ~ 52%, металлопротеиназы ~ 32%, сериновые протеиназы = 12% и тиоловые протеиназы ~ 4%.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы: Статьи и журналы из перечня ВАК:

1. Конин Д.Н. Влияние ингибиторов на протеолитические ферменты печени моллюсков Viviparus viviparus L. // Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». - 2010. - М.: МГОУ - №1. - С. 33-35.

2. Конин Д.Н., Коничев A.C. Влияние ионов тяжелых металлов на протеолитическую активность в печени моллюсков Viviparus viviparus L. II Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». - 2007. -М.: МГОУ - №1. - С. 3-6.

3. Конин Д.Н., Коничев A.C., Селедкин А.Ю. Влияние хлорорганических соединений на протеолитическую активность в печени моллюсков Viviparus viviparus L. II Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». - 2007. - М.: МГОУ - №2. - С. 3-7.

Материалы конференций:

4. Конин Д.Н. Влияние фенола на протеолитическую активность в печени моллюсков Viviparus viviparus L. И Актуальные проблемы биоэкологи. Сборник материалов Международной научно-практической конференции. - 2008. - М.: МГОУ. - С. 61.

5. Конин Д.Н. Влияние ионов тяжелых металлов на протеолитическую активность в печени моллюсков Viviparus viviparus L. II тез. докладов к VI симпозиуму: Химия протеолитических ферментов. М., ИБХ РАН, 2007. С. 123.

6. Конин Д.Н., Гаверова Ю.Г., Гева О.Н., Иванов В.Г., Коничев A.C. Влияние хлорпроизводных метана на множественные формы гидролаз живородки речной. // Научные труды МГТГУ, Серия

«Естественные науки». -2004. -М.: Прометей. С. 335-337.

7. Конин Д.Н., Гаверова Ю.Г., Гева О.Н., Иванов В.Г., Коничев А.С. Влияние бензилхлорида на активность некоторых литических ферментов печени живородки речной. // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Институт биологии Карельского НЦ РАН, - 2004, - Петрозаводск; - С.68,

8. Конин Д.Н., Гаверова Ю.Г., Гева О.Н„ Иванов В.Г., Коничев А.С. Воздействие экотоксикантов - хлорпроизводных метана на множественные формы некоторых гидролаз и дегидрогеназ живородки речной. // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Институт биологии Карельского НЦ РАН, -2004.-Петрозаводск:-С.54.

9. Конин Д.Н. Влияние бензина на протеолитическую активность в печени моллюсков Viviparus Vivíparas L, // Образование и наука для устойчивого развития. Сборник материалов Межвузовской научно-практическая конференции и научной школы для молодых ученых и студентов. - 2011. - М.: РХТУ. - С. 103-106.

Подписано в печать: 4.10.2011 г. Бумага офсетная. Гарнитура «Times New Roman». Печать офсетная. Формат бумаги 60/84 Ш6. Усл. п.л. 1,5.

_Тираж 130 экз. Заказ № 468.__

Изготовлено с готового оригинал-макета в Издательстве МГОУ. 105005, г. Москва, ул. Радио, д. 10-а.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Конин, Дмитрий Николаевич

Список используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ У МОЛЛЮСКОВ (обзор литературы).

I. I.

I. I. Общие понятия о протеолитических ферментах.

1. Протеолиз.

2.Функции протеолиза.

3. Классификация протеаз.

3.1. Аспартильные протеиназы.

3.2. Сериновые протеиназы.

3.3. Тиоловые протеиназы.

3.4. Металлосодержащие протеиназы.

3.4.1. Кальций-зависимые протеиназы.

3.4.2. Металлопротеиназы матрикса.

4. Локализация и активирование протеиназ.

4. АТФ зависимый протеолиз.

5. Ингибиторы протеолитических ферментов.:.

6. Протеолитические ферменты в регуляции биологических процессов.44 .7. Протеолитические ферменты у моллюсков.

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

II. 1. Материалы.

11.1.1. Особенности биологии подопытных животных.

II. 1.2. Сбор и содержание животных в лаборатории, постановка токсикологических экспериментов.

П.2. Методы.

П.2.1. Количественное определение активности ферментов.

П.2.2. Определение молекулярных масс субъединиц белков методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.

П.2.3. Выявление множественных форм ферментов методом энзимэлектрофореза.

П.2.4. Определение протеолитической активности ферментов при воздействии ингибиторов.

П.2.5. Определение протеолитической активности ферментов при воздействии ингибиторов с синтетическими субстратами.

П.2.6. Расчет и статистическая обработка данных.

Глава III. ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИЯ АКТИВНОСТИ КОМПЛЕКСА ПРОТЕАЗ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ РАЗЛИЧНЫХ ЭКОТОКСИКАНТОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ.

III. 1. Определение оптимальных параметров обнаружения активности протеаз.

Ш.2. Действие тяжелых металлов на активность протеаз живородки речной.

Ш.З. Действие хлорорганических соединений на активность протеаз живородки речной.

III.4. Действие хлорбензола, бромбензола и йодбензола на активность протеаз живородки речной.

Ш.5. Действие фенола и бензина на активность протеаз живородки речной.

Ш.6. Влияние ингибиторов на протеолитические ферменты печени моллюсков.

Ш.7.1. Динамика изменения количества белка в норме и при воздействии различных токсикантов.

III. 7.2. Определение молекулярных масс белков печени живородки речной.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение комплекса протеолитических ферментов при воздействии токсинов различной химической структуры в печени живородки речной"

Актуальность темы. В настоящее время уделяется значительное внимание биохимическому тестированию воздействия различных экотоксикантов на живые организмы [Антонов В.К., 1991; Бондарева JI.A., 2002; Егорова Т.А., 2004]. В свою очередь любые нарушения в жизнедеятельности организма начинаются с изменения присущих ему в норме биохимических процессов. Рост и развитие гидробионтов, и их ответные реакции на воздействие внешней среды опосредуется совокупностью метаболических процессов в их организме. Процессы метаболизма в свою очередь, как известно, контролируются ферментами [Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е., 1999; Reich Е., Rifldn D.B., Shaw Е., 1975].

Одним из наиболее перспективных приемов индикации загрязнения является изучение реакции на него протеолитических ферментов, как инструментов протеолиза - непременного фундаментального процесса обмена веществ в организме животных, обеспечивающего распад белков; пополняющего аминокислотный фонд клеток, участвующего в росте, делении и гибели клеток [Куцый Н.П., Кузнецова Е.А., Газиев А.И., 1999; Нейфах A.A., Тимофеева М.Я., 1977].

В последние годы был проведен ряд экспериментальных работ, в которых установлено, что моллюски представляют собой весьма перспективный тест-объект изучения воздействия различных групп токсикантов (галогенорганические соединения, фенольные соединения, ионы тяжелых металлов и пр.) на ферментные системы гидробионтов, что может быть использовано для оценки уровня загрязнений водной среды.

Соответствующие данные были получены в отношении нуклеаз, фосфатаз и дегидрогеназ [Попов А.П., 2002; Цветков И.Л., 2009]. В тоже время ферменты белкового обмена у гидробионтов мало изучены. Мы продолжили исследование в этом направлении, и основной целью данной работы стала характеристика изменения протеолитической активности ферментов б живородки речной Viviparus viviparous L. под воздействием токсикантов различной химической природы.

Исследование протеолитического комплекса ферментов в печени живородки речной представляет интерес не только для выяснения их роли в процессе токсикации организма загрязнителями антропогенной природы, но важно и в практическом отношении. Однако пептидогидролазы в экологическом аспекте в печени живородки речной практически не исследованы.

На основании вышеизложенного изучение комплекса протеиназ в печени живородки речной представляет принципиальный интерес.

Цели и задачи исследования. Целью работы является исследование протеолитических ферментов в процессе токсикации в печени живородки речной.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать эндогенный протеолитический комплекс в печени живородки речной и оценить степень его гетерогенности.

2. Изучить состав комплекса пептидогидролаз в печени живородки речной.

3. Проанализировать динамику активности протеолитического комплекса при различной продолжительности воздействия на них экотоксикантов различной химической природы и сопоставить ее с контрольными образцами, не подвергнутыми воздействию токсикантов.

4. Изучить структуру комплекса протеолитических ферментов, классовую принадлежность его компонентов.

5. Изучить структуру белкового спектра печени живородки речной в норме и при воздействии экотоксикантов различной химической природы.

Научная новизна работы. Отработаны методы исследования комплекса протеолитических ферментов, предназначенные для используемого тест — объекта живородки речной Viviparus viviparous L.

Охарактеризован комплекс протеолитических ферментов, участвующих во внутриклеточной деструкции белков в диапазоне рН от 2,2 до 9,6 в печени живородки речной Viviparus viviparous L.

Впервые исследована динамика активности протеолитического комплекса ферментов в норме и при различных концентрациях экотоксикантов основных групп загрязнителей, при различной продолжительности воздействия на них экотоксикантов различной химической природы и условий содержания тест — объекта.

Установлена структура комплекса протеолитических ферментов.

Практическое значение работы. Полученные данные о высокой активности и многокомпонентности протеолитических ферментов в печени живородки речной свидетельствуют о фундаментальной роли пептидогидролаз в обменных процессах белков при токсикации организма гидробионта.

Анализ полученных данных позволяет конкретизировать данные о биологических функциях исследованных пептидогидролаз в процессе токсикации живородки речной.

Установление взаимосвязи между уровнем активности протеиназ в печени моллюска в норме и при отравлении, что позволяет использовать их в качестве биохимического теста для фиксирования уровня загрязнения окружающей среды.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на научных сессиях по итогам научно-исследовательской работы МПГУ в 20042011 году, а так же на Международной научно-практической конференции

Актуальные проблемы биоэкологии» в 2008 году и VI Симпозиуме химии протеолитических ферментов в 2007 году.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 9 печатных работах из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, отражающего современные представления о протеолитических ферментах у моллюсков, описание материалов и методов исследования, результатов эксперимента и их обсуждения, заключения и выводов. Диссертационная работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 41 рисунок. Список цитируемой литературы включает в себя 125 названия, из которых 43 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Экология (по отраслям)", Конин, Дмитрий Николаевич

Выводы

1. Воздействие in vivo различных токсикантов (тяжелые металлы, фенол, бензин, галогенпроизводные бензола алифатических углеводородов) вызывает в различной степени выраженные изменения активности протеолитических ферментов в печени живородки речной. Эти изменения имеют фазный характер, совпадающий со стадиями адаптационного синдрома, и однотипны в отношении различных представителей одной группы загрязняющих веществ, что свидетельствует о развитии в организме моллюсков процессов неспецифической адаптации.

2. Под влиянием ионов тяжелых металлов (1ПДК) происходит уменьшение удельной активности протеиназ в печени моллюсков, а при высокой концентрации токсикантов (10 ПДК) — увеличение.

3. Под влиянием хлорорганических токсикантов наблюдается повышение удельной активности протеиназ в печени моллюсков (1 ПДК, 24ч экспозиции), но в дальнейшем (48ч экспозиции) наблюдалось уменьшение активности.

4. При низких концентрациях галогенароматических соединений (1 ПДК) активность протеиназ возрастала на 21-30% к 24ч и 27-40% к 48ч, что вероятно связано с процессом адаптации организмов к изменяющимся условиям окружающей среды. При более высоких концентрациях (10 ПДК) происходит снижение активности протеиназ через 24ч экспозиции на 14-17%. На более поздних этапах экспозиции активность продолжала снижаться на 94-98% по отношению к контролю.

5. Фенол и бензин оказывают наиболее существенное воздействие на активность комплекса протеолитических ферментов. Выявлено увеличение активности на отрезке от 1ч к 24ч экспозиции с последующим резким снижением активности к 48-72ч, при этом большинство (70%) моллюсков погибает после 72ч воздействия данных токсикантов.

6. Впервые методом электрофореза с ДДС-Ыа исследован белковый спектр печени моллюсков и определены молекулярные массы их полипептидных цепей, которые варьируют от 560Да до 533кДа. Под влиянием Сё (10 ПДК) на фоне увеличения протеолитической активности происходит распад полипептидов с молекулярными массами 375-512кДа и одновременно увеличивается число пептидов с массой около 960Да, что свидетельствует о распаде высокомолекулярных белков.

7. Разработан метод выявления протеолитической активности белков гепатопанкреаса после электрофореза в ПААГе. Высокая электрофоретическая подвижность белков, обладающих протеиназной активностью, свидетельствует об их небольшой молекулярной массе. В контроле выявлены 3 зоны активности, а под влиянием происходит исчезновение одной из зон, обладающей наименьшей электрофоретической подвижностью.

8. Впервые охарактеризованы степени ингибирования для различных подклассов протеиназ, что позволяет определить состав комплекса протеолитических ферментов в печени исследованного вида моллюсков: аспартильные протеиназы — 52%, металлопротеиназы — 32%, сериновые протеиназы - 12% и тиоловые протеиназы - 4%.

Заключение

Проведенные исследования и полученные нами данные позволяют судить о влиянии in vivo различных токсических веществ на активность протеаз печени живородки речной. Данная работа была посвящена количественному определению активности протеаз с целью сравнения чувствительности его к токсическому воздействию и анализу адаптивных изменений ферментативной активности при действии экотоксикантов различной химической природы (ионы тяжелых металлов, хлорорганических соединений, галогенопроизводные бензола, фенола и бензина).

Выбор печени в качестве органа, на котором проводились исследования, обусловлен несколькими причинами. Печень (гепатопанкреас) у данного вида моллюсков располагается в верхних завитках тела, обособленна от других тканей, что упрощает процедуру ее извлечения и идентификации. По простоте препарирования с печенью сопоставима только нога моллюсков. В то же время, наибольший уровень активности гидролитических ферментов у различных гидробионтов отмечен именно в печени, что связывают, прежде всего, с характером обмена в клетках соответствующих органов Субклеточные структуры зрелых мышц высокоспециализированы и практически не претерпевают изменений в ходе функционирования, а лизосомальный аппарат, в котором преимущественно представлен гидролитический комплекс ферментов, развит весьма слабо. Для кишечника, жабр и особенно печени, где происходят интенсивное деление, быстрый рост, дифференциация, а затем старение и отмирание клеток, характерна высокая степень репарации и автолиза, автофагии и гетерофагии, клеточной дефекации и секреции. В таких условиях лизосомы играют одну из ведущих ролей в функционировании, а затем и запрограммированной гибели субклеточных структур и клеток в целом, что, естественно, сопряжено с высокой активностью соответствующих ферментов.

Печень, как орган, где происходит детоксикация чужеродных веществ и некоторых собственных метаболитов, представляет наибольший интерес для эколого-биохимических исследований. В своей работе мы использовали современные методы биохимических исследований, которые нами были адаптированы под данный объект и установлены оптимальные условия и параметры их проведения.

Проведенные нами эксперименты показали высокую чувствительность комплекса протеолитических ферментов к воздействию токсикантов различной химической структуры. На более ранних этапах (24ч экспозиции) происходило увеличение активности протеаз сопряженное с неизменяющимся количеством белков печени, что, судя по всему, связано с попыткой организма адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды. Только в случае некоторых токсикантов (ионы ртути, фенол, хлорорганические соединения) происходило снижение количества белка. При более длительном воздействии (48ч экспозиции) происходила стабилизация активности протеолитических ферментов на уровень контрольных особей с последующим падением активности с разной степенью интенсивности и уменьшение количества белка (72ч экспозиции).

Исследовано воздействие специфических ингибиторов различных протеиназ (ФМСФ, ПХМБ, пепстатина и ЭДТА) на протеолитическую активность в печени моллюсков. Полученные данные указывают на различное представительство аспартильных, тиоловых, сериновых и металлопротеиназ в комплексе протеолитических ферментов изученного вида моллюсков, дают представление о структуре комплекса протеолитических ферментов, а так же способности подвергаться избирательному ингибированию за счет отдельных компонентов активных центов ферментов.

Проведенные анализы позволяют судить о составе белкового спектра печени живородки речной, определены молекулярные массы изучаемых белков и положение в этом спектре комплекса протеолитических ферментов.

Дальнейшие исследования представляют значительный интерес для сбора и систематизации данных о моллюсках, как перспективных тест - объектах в области индикации загрязнения окружающей среды; о комплексе протеолитических ферментов, как ведущем в процессе белкового обмена в организмах, а имеющиеся данные дают основу для постановки новых целей и задач в этом важном для окружающей среды вопросе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Конин, Дмитрий Николаевич, Москва

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Риф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. В 3-х т. — М.: Мир, 1994. Т. 2. С. 498.

2. Антонов В.К. Химия протеолиза. М.: Наука, 1991. С. 517.

3. Балабан Н.П., Маликова JI.A., Марданова A.M., Руденская Г.Н., Шарипова М.Р. Получение и характеристика субтилизиноподобных протеиназ, секретируемых в стационарную фазу роста Bacillus amyloliquefaciens Н2 // Биохимия. 2007. — Т. 72. Вып. 4. - С. 568-575.

4. Балкина A.C., Селищева A.A., Ларионова Н.И. Липосомальные формы белковых ингибиторов протеиназ. // тез. докладов к VI симпозиуму: Химия протеолитических ферментов. М., ИБХРАН. 2007. С. 163.

5. Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е. Протеолитические ферменты и их ингибиторы в семенах гречихи // Физиология растений. 1999. - Т. 46. №3.-С. 388-399.

6. Биохимия: учебник (Под редакцией Северина Е.С.) М. Гэотар-медиа, 2003. С. 768.

7. Бондарева Л.А. Ca -активируемые протеолитические ферменты у рыб и водных беспозвоночных // Вестник молодых ученых. Серия: Науки о жизни. -2002. Т. 4. №1. - С. 52-57.

8. Бондарева Л.А., Немова H.H., Кяйвяряйнен Е.И. Ca -зависимая протеолитическая система животных // Институт биологии КарНЦ РАН. М.: Наука. 2006. С. 294.

9. Ю.Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы Л.: Наука, 1987. - С. 232.

10. П.Бромлей H.B. Протеолитические ферменты в организме дубового и тутового шелкопряда // Ученые записки МГПИ им. В.И. Ленина. — 1938.-Т. 34. В. 5.-С. 65-84.

11. З.Валуева Т.А. Структура и свойства белковых ингибиторов сериновых протеиназ и биоспецифические сорбенты на их основе, автореф. дис. док. биол. наук. -М., 1990. С. 54.

12. Н.Валуева Т.А., Мосолов В.В. Белки-ингибиторы протеиназ в семенах // Физиология растений. 1999. - Т. 46. №3. - С. 347-387.

13. Веремеенко К.Н., Голобородько О.П., Кизим А.И. Протеолиз в норме и при патологии. Киев: Здоровье, 1988. — С. 688.

14. Волцит О.В., Черняховский М.Е. Природа России: жизнь животных. Беспозвоночные. -М.: ACT, 1999. С. 768.

15. Генгин М.Т. Особенности структурно-функциональной организации и физико-химические свойства нелизосомальных пептидгидролаз мозга животных, автореф. дис. канд. биол. наук. — Москва, 2002. С. 35.

16. Генгин М.Т., Вернигора А.Н., Никишиш H.H., Керимов В.Ю. Эффект эмоционального стресса на активность карбоксипептидазы N в отделах головного мозга крыс с различной к нему устойчивостью // Вопр. мед. химии. 1995. - Т. 41. №4. - С. 8-9.

17. Генгин М.Т., Вернигора А.Н., Никишин H.H., Щетинина Н.В. Активность карбоксипептидазы N и ангиотензин-превращающего фермента в сыворотке крови крыс в норме и при эмоциональном стрессе I! Укр. биохим. журн. 1994. - Т.66. №2. - С. 139-142.

18. Гзогян JI.A. Протеолитические ферменты и их ингибиторы в высших грибах, автореф. дис. канд. биол. наук. Краснодар, 2005. — С. 25.

19. Гомазков O.A. Физиологически активные пептиды. — М.: Наука, 1995. — С. 143.

20. Гомазков O.A. Функциональная биохимия регуляторных пептидов. — М.: Наука, 1993.-С. 159.

21. Грин Н., Стауд У., Тейлор Д. Биология: В 3-х т. М., Мир, 1990. Т. 1. -С. 368.

22. Громова Т.Ю., Гасанов Е.В., Демидюк И.В., Костров С.В. Процессинг предшественника протеализина // тез. докладов к VI симпозиуму: Химия протеолитических ферментов. М., ИБХ РАН. 2007. С. 106.

23. Грушко Я.М. Вредные органические соединения в промышленных сточных водах. Л.: Химия, 1982. - С. 216.

24. Дин Р. Процессы распада в клетке М. Мир, 1987. - С. 165.

25. Евтюгин Г.А., Будников Г.К., Никольская Е.Б. Биосенсоры для определения ингибиторов ферментов в окружающей среде // Успехи химии. 1999. - Т. 68. №12. - С. 1142-1167.

26. Егорова Т.А. Биохимические механизмы адаптация организмов к стрессовым воздействиям М.: Прометей, 2004. - С. 63.

27. Жужиков Д.П. Ингибитор сериновых протеиназ в кишечнике пепельно-серого таракана Nauphoeta cinerea II Эволюционная биохимия и физиология. 1997. - Т. 33. №6. - С. 592-598.

28. Клунова С.М., Ярыгин Д.В. Протеолиз и его регуляция у насекомых — М.: МПГУ, 2001.-С. 103.

29. Клунова С.М., Тарасенко Н.В., Киреева З.В. Изучениепротеолитического комплекса ферментов в гемолимфе ишелкоотделительной железе тутового шелкопряда на заключительном118этапе его личиночного развития // Биохимия насекомых. 1987. — М.: МГПИ. С. 112-120.

30. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия М.: Высш. шк., 2000. -С. 479.

31. Конин Д.Н. Влияние фенола на протеолитическую активность в печени моллюсков Viviparus viviparus L. И Актуальные проблемы биоэкологи. Сборник материалов Международной научно-практической конференции. 2008. - М.: МГОУ. - С. 61.

32. Конин Д.Н. Влияние ионов тяжелых металлов на протеолитическую активность в печени моллюсков Viviparus viviparus L. II тез. докладов к VI симпозиуму: Химия протеолитических ферментов. М., ИБХ РАН, 2007. С. 123.

33. Конин Д.Н. Влияние ингибиторов на протеолитические ферменты печени моллюсков Viviparus viviparus L. // Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». 2010. - М.: МГОУ - №1. - С. 33-35.

34. Конин Д.Н., Коничев A.C. Влияние ионов тяжелых металлов на протеолитическую активность в печени моллюсков Viviparus viviparus L. II Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». — 2007. М.: МГОУ -№1.-3-6.

35. Коничев A.C. Физико-химическая и функциональная характеристика множественных форм ферментов насекомых, автореф. дис. докт. биол. наук. — М., 1991. -С. 48.

36. Коничев A.C., Водолеев A.C., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Рибонуклеазная активность в грене родительских пород и гетерозисных гибридов тутового шелкопряда*// Биохимия насекомых. — 1979. М.: МГПИ. - В. 21. - С. 20-25.

37. Коничев A.C., Конин Д.Н., Селедкин А.Ю. Влияние хлорорганических соединений на протеолитическую активность в печени моллюсков Viviparus viviparus L. II Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». — 2007. М.: МГОУ - №2. - С. 3-7.

38. Короленко Т.А. Биохимические аспекты лизосомотропизма. — Новосибирск: Наука, 1983.— С. 152.

39. Котлова Е.К., Иванова Н.М., Юсупова М.П., Воюшина Т.Д., Иванушкина Н.Е., Честухина Г.Г. Сериновая тиолзависимая протеиназа Paecilomyces lilacinus: выделение и свойства. // Биохимия. 2007. - Т. 72. В. 1.-С. 137-144.

40. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии — М.: Высш. шк., 1980.-С. 352.

41. Куцый Н.П., Кузнецова Е.А., Газиев А.И. Участие протеаз в апоптозе // Биохимия. 1999. - Т. 64. №2. - С. 149-163.

42. Лизенко Е.И. Липидный состав и липолитические ферменты лизосом II Успехи современной биологии. 1982. - В. 1. - С. 94-110.

43. Лойда 3., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. -М.: Мир, 1982. С. 272.

44. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Растительные белковые ингибиторы протеолитических ферментов. М.: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 1993.-С. 208.

45. Мосолов В.В. Белковые ингибиторы как регуляторы процессов протеолиза. // 36-е Баховские чтения. 1983. — М.: Наука. - С. 40.

46. Мосолов В.В. Ингибиторы белковой природы протеолитических ферментов. // Биоорганическая химия. — 1994. — Т. 20. №2. С. 153-161.

47. Мосолов В.В. Новое о природных ингибиторах протеолитических ферментов. // Биоорганическая химия. 1998. - Т. 24. №5. - С. 332-340.

48. Мосолов В.В. Механизмы контроля протеолиза. // Успехи биол. Химии. 1988. - Т. 28. - С. 125-144.

49. Мухин В.А. Протеолитические ферменты в тканях некоторых морских беспозвоночных, автореф. дис. канд. биол. наук. — Мурманск. 1998. — С. 22.

50. Мухин В.А., Новиков В.Ю. Протеолиз и протеолитические ферменты в тканях морских беспозвоночных. Мурманск: ПИНРО, 2002. - С. 118.

51. Нейфах A.A., Тимофеева М.Я. Молекулярная биология процессов развития. -М.: Наука, 1977. С. 312.

52. Некрасов А.Н., Зинченко A.A. Информационная структура белков и функционирование протеолитических ферментов. // тез. докладов к VI симпозиуму: Химия протеолитических ферментов. М., ИБХ РАН. 2007. С. 55.

53. Немова H.H. Внутриклеточные протеолитические ферменты у рыб. — Петрозаводск: КНЦ РАН, 1996. С. 104.

54. Немова H.H., Бондарева JI.A. Протеолитические ферменты: учебное пособие. Петрозаводск: КНЦ РАН, 2005. - С. 92.

55. Орлова М.А. Радиационная инактивация протеолитических ферментов // Успехи химии. 1993. - Т. 62. №5. - С. 529-544.

56. Попов А.П. Множественные формы ферментов живородки речной как маркеры токсического загрязнения воды, автореф. дис. канд. биол. наук. М. 2002.-С. 18.

57. Попов А.П., Цветков И.Л., Коничев A.C. Биохимическое тестирование токсического загрязнения вод: планирование эксперимента и выбор тест-объекта. // Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». — 2006. — №4. С. 87-92.

58. Репин B.C. Критические факторы химической регуляции развития. — М.: Наука, 1980.-С. 235.

59. Ротанова Т.В., Абрамова Е.Б., Шарова Н.П. От парадокса — к Нобелевской премии. // Биологические мембраны. — 2005. — Т. 22. №2. -С. 151.

60. Сидоров B.C. Значение биохимического изучения нормы и патологии органелл для водной токсикологии. В кн.: Теоретические проблемы водной токсикологии. М.: Наука, 1983. С. 110-120.

61. Сыновец A.C., Левицкий А.П. Ингибиторы протеолитических ферментов в медицине. Киев: Здоровье, 1985. — С. 80.

62. Токин И.Б., Зензеров B.C. К проблеме изучения механизмов действия загрязнителей на клеточном и субклеточном уровнях. В кн.: Проблема изучения действия загрязнителей. — Апатиты: КФ АН СССР, 1977. С. 22.

63. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. Учебник для химических и биологических специальностей педагогических университетов и институтов. М.: Агар, 1999. - С. 519.

64. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. -М.: Просвещение, 1982. — С. 311.

65. Флеров Б.А. Экспериме^езп- j^-альные исследования фенольного отравления рыб. В кн.: Влияние фе-^г-ола на гидробионтов. Л.: Наука, 1973. - С. 195.

66. Хейсин Е.М. Краткий: определитель пресноводной фауны. М.: Учпедгиз РСФСР, 1962. - С. 148.

67. ХоретА. Молекулярные^^ основы патогенеза болезней. М.: Наука, 1982.-С. 182.

68. Цветков И. Л. Биохи^ч-^п^гческие параметры стресс-редуцирующей реакции гидробионтов т г~р>и интоксикации, автореф. дис. докт. биол. наук. М., 2009. - С. 4в

69. Цветков И.Л, Коничев —С. Экологическая биохимия гидробионтов. -М.: МГОУ, 2006. С. 1

70. Чарыков А.К. Матемо^пшчическая обработка результатов химического анализа. Л.: Химия, 1 — С. 168.

71. Чечеткин A.B., Голова -тт,кий И.Д., Калиман П.А., Воронянский В.И. Биохимия животных. — —: Высшая школа, 1982. С. 511.

72. Юровицкий Ю.Г., Сидсз>не=>ов B.C. Эколого-биохимический мониторинг и эколого-биохимическо^^ тестирование в районах экологического неблагополучия. // Изв Серия: Биология. 1993. - №1. - С. 74-82.

73. Яблоков A.B., OcTpoyz>w^ir<z»B C.A. Охрана живой природы: проблемы и перспективы. М.: промышленность, 1983. - С. 271.

74. Anson M.L. The estim.siriz5on of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with hemoglobin // J. Gen. Pfaiz^-siol. 1939. - V. 22. №1. - P.79-82.

75. Ashida M., Sasaki T. A target protease activity of serpins in insect hemolymph // Insect Biochem. Molec. Boil. 1994. - V. 24. lss. 10. - P. 1037-1041.

76. Bose S.G., Raikhel A.S. Mosquito vitellogenin subunits originate from a common precursor // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1988. V. 155. lss. l.-P. 436-442.

77. Bownes M. The regulation of the yolk protein genes, a family of sexdifferentiation genes in Drosophila melanogaster II Bioessays. 1994. — V. 16. lss. 10.-P. 745-752.

78. Chapman H.A., Riese R.I., Shi G.P. Emerging roles for cysteine proteases in human biology // Ann. Rev. Physiol. 1997. - V. 59. - P. 63-88.

79. Cong J.Y., Tompson V.F., Goll D.E. Immunoaffinity purification of the calpains // Prot. Express. Purif. 2002. - Vol. 25. - P. 283-290.

80. Croall D.E., McGrody K.S. Domain structure of calpains: mapping the binding site for calpastatin // Biochemistry. 1994. - Vol. 33. - P. 1322313230.

81. Davis J.R. Disc electrophoresis. Method and application to human serum proteins II Ann. N-Y. Acad. Sci. 1964. -V. 29. lss. 2. - P. 404-427.

82. De Martino G.N., Croall D.E. Purification and characterization of a protein inhibitor of calcium-dependent proteases from rat liver // Arch. Biochem. Biophys. 1984. - Vol. 232. - P. 713-720.

83. Eguchi M. Protein protease inhibitors in insects and comparison with mammalian inhibitors II Comp. Biochem. Physiol. — 1993. — V. 105B. lss. 3. p. 449-456.

84. Ferenz H. Yolk protein accumulation in Locust oocytes // Proc. 19 Int. Congr. Entomol. Beijing. 1992. - P. 69.

85. Giorgi F., Bradley J.T., Nordin J.H. Differential vitellin polypeptide processing in insect embryos // Micron. 1999. - V. 30. lss. 6. — P. 579-596.

86. Gonos E.S. Genetics of aging: lessons from centenarians // Exp. Gerontol. — 2000.-Vol. 406.-P. 15-21.

87. Guttman R.P., Johnson G.V.W. Calpain-mediated proteolysis of neuronal structural proteins // Calpain: Pharmacology and toxicology of calcium-dependent protesell II Ed. by K.K.W. Wang, P-W. Yuen. Philadephia (PA): Taylor and Francis. 1999. - P. 229-249.

88. Hagedorn H.H., Kunkel J.G. Vitellogenin and vitellin in insect // Ann. Rev. Entomol. 1979. -V. 24. - P. 475-505.

89. Hatzizisis D., Gaitanaki C., Beis I. Degradation of myofibrillar proteins by a calpain-like proteinase in the arm muscle of Octopus vulgaris II J. Comp. Physiol. B. 2000. - Vol. 23. - P. 3272-3276.

90. Hayashi M., Inomata M., Nakamura M. et. al. Hydrolysis of protamine by calcium-activated neutral protease (CANP) // J. Biochem. — 1985. Vol. 97.-P. 1363-1370.

91. Henrikson P.A., Clever U. Protease activity and sell death during metamorphosis in the salivary gland of Chironomus tentans II J. Insect Physiol.-1972.-V. 18. lss. 10.-P. 1981-2001.

92. Imaijoh S., Kawasaki H., Kisaragi M. et ol. A 107-kDa inhibitor for calcium-activated neutral protease (CANP): purification from the human liver//Biomed. Res. 1984. - Vol. 5. - P. 481-488.

93. Johnson G.V.W., Guttmann R.P. Calpains: intact and active? // Bioessays.-1997.-Vol. 19.-P. 1011-1018.

94. Johnson P., Hammer J.L. Effects of calpain on antioxidant enzyme activities // Free Radio Res. 1994. - Vol. 21, N 1. - P. 27-33.

95. Kageyama T., Takahahi S.V., Takahahi K. Occurrence of tiol proteinases in the eggs of the silkworm, Bombyx mori II J. Biochem. 1981. -V. 90. lss. 3.-P. 665-671.

96. Kambysellis M.P., Hatzopoulos P., Seo E.W., Craddock E.M. Noncoordinate synthesis of the vitellogenin proteins in tissues of Drosophila grimshawi II Dev. Genet. 1986. - V. 7. lss. 2. - P. 81-97.

97. Kolchinskaya L.I., Malysheva M.K. Activity of calpain in subcellular fractions of the rat brain // Neurophysiology. 2004. - Vol. 273. - P. 3053030536.

98. Kroemer G., Zamzami N., Susin S. Mitochondrial control of apoptosis // Immunol. Today. 1997. - 18. - P. 44-51.

99. Kurelec B., Pivcevic B. Distinct glutathione-dependant enzyme activities and a verapamil-sensitivy binding of xenobiotics in a fresh-water mussel Anodonta cygnea II Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1989. — 164.-P. 934-940.

100. Mellgren R.L., Murachi T. (Ed.). Intracellular calcium-dependent proteolysis. Boca Raton (FL): CRC, 1990. - P. 80-83.

101. Moriyasu Y., Tazawa M. Calcium-activated protease in the giant alga Chara Australia II Protoplazma. 1987. - Vol. 140. - P. 12-1 A.

102. Nicholson S. Cytological and physiological biomarker responses from green mussels, Perna viridis transplanted to contaminated sites in Hong Kong coastal waters I I Mar. Pollut. Bull. 1999. - 39. - P. 261-268.

103. Nicholson S. Cardiac and lysosomal responses to periodic copper inthe mussel Perna viridis // Mar. Pollut. Bull. 1999. - 38. - P. 1157-1162.

104. Pain S., Parrant M. Response of multixenobiotic defense mechanism in Dreissena polymorpha exposed to environmental stress I I Chemosphere. — 2003.-52.-P. 1105-1113.

105. Reich E., Rifldn D.B., Shaw E. Proteases and biological control // Cold Spring. Harbour. 1975. - P. 121-160.

106. Reddy J.K., Mannaerts G.P. Peroxisomal lipid, metabolism // Ann. Rev. Nurt. 1994. - 14. - P. 343-370.

107. Regoli F. Total oxyradical scavenging capacity (TOSC) in polluted and translocated mussels: a predictive biomarker of oxidative stress // Aquat. Toxicol. 2000. - 50. - P. 351-361.

108. Richard I. The genetic and molecular bases of monogenic disorders affecting proteolytic systems // J. Med. Genet. 2005. - Vol. 42. - P. 529539.

109. Sunila I., LaBanca J. Apoptosis in the pathogenesis of infectious diseases of the eastern oyster Crassostrea virginica II Dis. Aquat. Organ. — 2003.-56(2).-P. 163-170.

110. Suzuki K., Ohno S., Emori Y. Primary structure and evolution of calcium-activated neutral protease (CANP) // J. Protein. Chem. 1987. — Vol. 6. №1. - P. 7-15.

111. Weils W.W., Collins C.A., Kurtz J.W. Metabolic regulation of lysosome activity // In: Lysosomes in Biol. And Pathol. Amsterdam. North Holland. 3. 1975. - P. 200-238.

112. Wilson C.L., Safe S. Mechanisms of ligand-induced aryl hydrocarbon receptor-mediated biochemical and toxic responses // Toxicol. Pathol. — 1998.-26(5)-P. 657-671.

113. Zou H., Henzel W.J., Liu X., Lutschg A., Wang X., Apaf-1, a humanprotein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3 I I Cell. 1997. - 90 - P. 405-413.

114. Yuan J.U., Shaham S., Ledoux S., Ellis H.M., Horvitz H.R. The C. elegans cell death gene Ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-l-betaconverting enzyme. // Cell. — 1993. — 75. P. 641-652.