Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспорт и активация шига токсина в эукариотических клетках

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Транспорт и активация шига токсина в эукариотических клетках"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

<\/ N

ПОЛЕССКАЯ Анна Николаевна

ТРАНСПОРТ И АКТИВАЦИЯ ШИГА ТОКСИНА

В ЭЖАРИ01Г11ЧЕСКИХ КЛЕТШ

03.00.03- Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор Ю. В. Козлов ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор А. Г. Тоневицкий кандидат биологических наук В. В. Гречко

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Защита состоится 1997 г. в /О часов на заседании Диссерта-

ционного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии РАН имени В. А. Энгельгардта.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии РАН имени В. А. Энгельгардта

Автореферат разослан

1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В природе существует множество бактериальных и растительных токсинов, отличающихся многообразием функций, структуры и механизмов действия. Обширную и очень интересную группу среди них составляют бактериальные и растительные токсины, специфически ингибирующие синтез белка в эукариотической клетке. К этой группе относятся растительные токсины абрин (из семян Abrispre-catorius), рицин (из семян Ricinuscommunis), модецин (из корней Ade-nia digitata), а также ряд токсинов бактериального происхождения: шига токсин (Shigella dysenteriae), псевдомонадный токсин А (Pseudomonas aeruginosa), дифтерийный токсин (Corynebacterium diphteriae). Данная группа токсинов представляетинтерес в силу своей высокой специфичности к рецепторам и внутриклеточным мишеням, что дает основание для их использования в терапии различного рода новообразований. Конъюгированные с антителами токсины (иммунотоксины)уже прошли ряд испытаний в лабораториях. Для подобного использования крайне важно знать особенности действия и транспортировки токсина в клетке.

Токсины этой группы используют для своей транспортировки в цитозоль мембранные структуры эукариотической клетки, и если часть из них ограничивается проникновением в эндосомы и оттуда в цитозоль (дифтерийныйтоксин);то для шига токсина была показана возможность ■ретроградноготранспорта по аппарату Гольджи и эндоплазматическому ретикулуму вплоть до периплазмы ядра. Таким образом, мы имеем дело с прекрасными моделями для изучения транспорта белка в эукариотической клетке, для понимания роли специальных сигнальных последовательностей, а также возможности взаимодействия транспортируемых белков с внутриклеточными белками-переносчиками. Важность изучения шига и шига-подобных токсинов не ограничивается чисто академическими соображениями. По-прежнему представляют значительную угрозу вызываемые ими заболевания, исключительная способность бактерий кадаптациии появление новых патогенов. В1996-1997 годах в Японии, Шотландии и США зарегистрированы три серьезные эпидемии желудочно-кишечных заболеваний, вызванные штаммом Е. coli 0157/Н7. Эти широко распространенные бактерии производят шига-подобный токсин и характеризуются очень высокой патогенностью. В таких условиях, знание структурно-функциональных свойств токсинов оказывается незаменимым оружием в борьбе с заболеваниями.

Научная новизна работы. Все токсины, подавляющие синтез белка в эукариотической клетке, проявляют специфическую ферментативную активность по отношению к своим мишеням. Механизм действия

большинства токсинов хорошо изучен, и следующим вопросом в этой области может стать возможность регулирования их активности. В предлагаемой здесь работе изложены результаты структурно-функционального исследования регулирования ферментативной активности шига токсина. Впервые продемонстрировано существование механизма самоингибирования 1Ч-гликозидазной активности токсина. Методами химической модификации и сайт-направленного мутагенеза показано, что образующийся при протеолитическом расщеплении А субъединицы шига токсина фрагмент А2 взаимодействует с активным центром токсина. Это взаимодействие обеспечивается нековалентными связями между аминокислотными остатками, входящими в состав активного центра и фрагмента А2. Устранение взаимодействия приводит к возрастанию М-гликозидазной активности шига токсина в бесклеточной системе в 50 раз.

Во второй части работы показано, что протеолитическое расщепление А субъединицы шига токсина в аппарате Гольджи клетки-мишени необходимо для проявления его полной энзиматической активности. Таким образом, продемонстрирована связь между транспортом и активацией шига токсина в мембранных структурах эукариотических клеток. Практическая ценность работы. Продемонстрировано существование механизма регуляции активности шига токсина, а также зависимость его цитотоксичности оттранспорта и протеолитического расщепления в эукариотической клетке-мишени. Эти данные могут использоваться при работах с химерными вариантами токсинов в биомедицинских исследованиях, направленных на терапию раковых заболеваний. Апробация работы. Результаты доложены на II съезде Биохимического Общества РАН (19-23 мая 1997 г., Москва); на 3-й международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (9-14 июня 1997, р. Волга); на студенческой сессии летней школы НАТО "Молекулярные механизмы липидного и белкового транспорта" (16-28 июня 1997, Каржиз, Франция); на 8-й Европейской конференции "Бактериальные белковые токсины" (29 июня-4 июля 1997, Штаффельстейн, Германия).

Основные положения диссертации обсуждены и представлены к защите на заседании коллоквиума лаборатории белковых ингибиторов клеточных процессов Института молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН 23 октября 1997 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 16 рисунков. Библиография включает 172 ссылки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В данной работе были использованы лабораторные штаммы Eco//JM109, НВ101, ВМН71-18 mut S. В качестве векторов использовали pUC19, pALTER ("Promega"), а также ранее полученную плазмиду pSHT23, несущую гены шига токсина. Для выращивания бактериальных штаммов использовали среды LB или 2XYT, с добавлением антибиотиков в случае необходимости. Трансформацию, выделение ллазмидной ДНК, гель-электрофорез, обработку ДНК рестриктазами и другими ферментами, извлечение фрагментов ДНК из агарозного геля проводили по Маниатису и др. [1984]. Клонирование фрагментов ДНК в составе вектора pALTER, выделение одно- и двухцепочечной ДНК, оликонуклеотид-направленный мутагенез клонированных генов шига токсина проводили согласно методике, описанной в руководстве фирмы "Promega". Секвенирование по методу Сэнгера проводили согласно методике, описанной в руководстве фирмы "Amersham". Обработку эукариотических клеток брефел-дином А и ингибитором калпаина, а также протеолитическое расщепление шига токсина трипсином и растворимым фурином проводили согласно [Garred et al., 1995]. Для олигонуклеотид-направленного мутагенеза использовали олигонуклеотиды, предоставленные Б. К. Черновым (ИМБ) и фирмой "Silex" (Москва).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Механизм действия шига токсина

Шига токсин, продуцируемый Shigella dysenteriae, это бактериальный токсин, обладающий N-гликозидазной активностью. Он специфически ингибирует синтез белка в эукариотических клетках, отщепляя остаток аденина в позиции 4234 28S рРНК и инактивируя таким образом рибосому [Endo Y. et al., 1988]. Энзиматически активная A субъединица шига токсина нековалентно ассоциирована с пентамером В-субъединиц, отвечающих за связывание с гликолипидными рецепторами, глоботриозилцерамидами (GB3) [Cohen A. et al., 1987]. После связывания, шига токсин подвергается эндоцитозу и транспортируется в транс-Гольджи сеть (ТГС) [Sandvig К. et al., 1991]. В чувствительных клетках, токсин переносится далее по ретроградному пути и оказывается в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) [Sandvig К. et al., 1992 ], где и может происходить его транслокация в цитозоль. А-субъединица шига токсина содержит два остатка цистеина (Cys-242, Cys-261), формирующие дисульфидную связь. В результате возникает петля, образованная восемнадцатью аминокислотными остатками, расположенными между цистеинами. Петля может быть расщеплена трипсином или эукариотической протеазой фурином, в результате чего

образуются энзиматически активный фрагмент А1 и фрагмент А2 [Garred О. et а!., 1995] (Рис.1). В эукариотической клетке функцию протеоли-тического расщепления токсина выполняет фурин, локализованный в ТГС [Garred О. et а/.. 1995].

Анализ кристаллической структуры шига токсина с разрешением 2,5 А [Fraser M. ef а/.,1994] позволил определить расположение аминокислот, входящих в активный центр, и позицию дисульфидной петли по отношению к ним. Показано, что петля может блокировать доступ субстрата к активному центру. Боковая цепь Туг-77, одной из аминокислот, формирующих активный центр, взаимодействует с Рго-258, находящимся вблизи С-конца дисульфидной петли. Показанотакже, что боковая цепь Met-260 входит в активный центр и частично его блокирует. Таким образом, отмечен ряд взаимодействий между ферментативным центром на А1 и дисульфидной петлей, сформированной А2 фрагментом.

С

At

Tyr..Tyr..Glu..Ala..Arg..Trp 77 114 167 16В 170 203

CysHistHisHisAlaPerAraValAlaArgMettMaSerAenGluPhePtoSerMetCvs 24Z ' 258 260261

I I

Ser Gly I Tip

L

J аминокислотные остатки, делегированные в мутанте шига токсина 2D Pío— Ser

258 замена пролина в положении 258 на серин в мутанте

шига токсина Pro — 258 — Ser Met—Gly/Trp

260 замена метионина в положении 260 на глицнн /триптофан Tyr..Tyr..Glu.. аминокислоты, формирующие активный центр 77 114 167 шига токсина

Рис. 1. Схематическое изображение структуры шига токсина и проведенных модификаций.

В данной работе исследовалась роль взаимодействия А1 и А2 фрагментов шига токсина в регуляции егоэнзиматической активности, а также значение протеолитического расщепления токсина в эукариотических клетках для его транспорта и активации. Показано наличие механизма активации шига токсина при частичном и полном

разделении фрагментов А1 и А2 и необходимость протеолитического расщепления шига токсина для проявления его полной цитотоксической активности.

2. Химическая модификация токсина.

Для разделения фрагментов А1 и А2 А субъединицы шига токсина мы производили протеолитическое расщепление токсина, а затем восстановление дисульфидной связи и карбоксиметилирование остатков цистеина. Энзиматическую активность шига токсина и его модифицированных производныханализировали по влиянию на синтез белка в бесклеточной системе. В опыте использовали три различных производных токсина и необработанный токсин в качестве контроля (Рис.2).

а

Н И

3 0 2

□ ТОКСИН ДИКОГО ТИПА О КАРБОКСИМ ЕТИЛИГО ВАННЫ Й ТОКСИН А РАСЩЕПЛЕННЫЙ ТОКСИН * КАРБОКСИМЕТИЛИРОВАННЫЙ, РАСЩЕПЛЕННЫЙ ТОКСИН

Н1 I I I ' I • 11Ч I I I I 1111]-1—Г I | 11|||-1—I I I I )И|

10^ 0.001 0.01 0.1 1

КОНЦЕНТРАЦИЯ ТОКСИНА, НГ/МЛ

Рис.2. Активность модифицированных производных шига токсина в бесклеточной системе синтеза белка по сравнению с необработанным токсином дикого типа. Токсин в возрастающей концентрации вносили в реакционную смесь и инкубировали 15 мин при 30°С. Ингибирующее влияние токсина оценивали по кинетике включения 35Б-метионина в суммарный белковый продукт.

В результате было показано, что активность расщепленного трипсином шига токсина слегка превышает активность необработанного токсина,

а активность токсина с карбоксиметилированными SH-группами сравнима с активностью последнего. В то же время, активность токсина с карбоксиметилированными SH-группами, расщепленного трипсином, превышала контрольную более чем в 10 раз.

Таким образом, мы пришли к заключению, что разделение фрагментов А1 и А2 шига токсина приводит к существенному повышению его энзиматической активности in vitro. Для проявления этого эффекта необходимо как расщепление А субъединицы токсина протеазами (в данном случае трипсином), так и блокирование SH-групп, участвующих в образовании дисульфидной связи.

3. Активность мутантного токсина с заменой Рго-258 на Ser.

Остаток Туг-77 активного центра А субъединицы шига токсина вступает в нековалентное взаимодействие с остатком Рго-258, находящимся на С-конце А2-фрагмента [Fraser M. et al., 1994]. Нами получен токсин, в котором Рго-258 заменили на Ser. Активность этого токсина анализировали в культуре клеток и в бесклеточной системе, с шига токсином дикого типа в качестве контроля. Результаты опытов представлены на рис. 3, 4. При тестировании в культуре клеток мутантный токсин проявил активность в 7-8 рзз большую, чем токсин дикого типа (Рис. 3).

Рис. 3. Цитотоксический эффект шига токсина дикого типа и мутантного токсина с заменой Рго-258 на Бег в культуре клеток НЕрП. Клетки инкубировали в присутствии возрастающих концентраций токсина в течение 50 мин, 2 ч и 14 ч, после чего оценивали кинетику включения 3Н-лейцинав суммарный белковый продукт.

Для сравнения, при анализе в бесклеточной системе активность токсина

дикого типа оказалась сравнимой с активностью мутантного токсина (Рис. 4).

П токсин ДИКОГО ТИПА

Рис. 4. Активность производных мутанта шига токсина Pro-258 - Ser в бесклеточной системе синтеза белка по сравнению с необработанным мутантным токсином Pro-258 - Ser. В качестве контроля использовали шига токсин дикого типа. Ингибирование синтеза белка оценивали по кинетике включения 355-метионина в суммарный продукт.

Это может указывать на то, что взаимодействие А1 и А2 фрагментов достаточно сильно и при нарушении взаимодействия Tyr-77 - Pro-258, и что в клетке существуют механизмы разворачивания комплекса А1-А2, которые отсутствуют в бесклеточной системе. Такое объяснение подтверждается и дальнейшими опытами в бесклеточной системе, в которых участвовал мутантный токсин с карбоксиметилированными SH-группами, расщепленный и не расщепленный трипсином (Рис. 4). В случае устранения дисульфидного моста, активность мутаитого токсина в бесклеточной системе возрастает в 10 раз по сравнению с контролем. В случае же устранения дисульфидного моста в сочетании с расщеплением А субъединицы на А1 и А2 фрагменты, активность токсина возрастает по сравнению с контролем приблизительно в 50 раз, и это значение является тем максимальным результатом увеличения

активности токсина, которого нам удалось добиться в наших экспериментах.

В опытах на клеточной культуре, активность мутантноготоксина по сравнению с контролем зависела от времени инкубации клеток с токсином. При времени инкубации 50 мин и 2 час разница в активности составляла 7-8 раз, но при инкубации в течение 14 часов активность токсина дикого типа возрастала до уровня активности мутанта. Эффект значительного изменения активности мутантных токсинов по сравнению с контролем при коротких и длительных сроках инкубации отмечали и в более ранних исследованиях [5апсМд К. 1993].

4. Влияние мутации Ме1-260 на активность шига токсина в культуре клеток и бесклеточной системе синтеза белка.

Предполагается, что боковая цепь Ме1>260 частично блокирует доступ к активному центру шига токсина. Для выяснения роли этой аминокислоты в регуляции активности токсина, мы произвели точечные замены метионина на аминокислоту с короткой боковой цепью (глицин) и с массивной боковой цепью, в которую входит ароматическое кольцо (триптофан).

Активность мутантов шига токсина с заменой Ме1>260 на б1у и Тгр определяли как в культуре клеток, так и в бесклеточной системе синтеза белка (рис. 5, 6).

Ме1>260 - Тгр в культуре клеток НЕрП.

Клетки инкубировали в присутствии возрастающих концентраций токсина в течении 50 мин, 2 ч и 14 ч, после чего оценивали ингибирование синтеза белка по кинетике включения 3Н-лейцина в суммарный белковый продукт.

а токсин дикого типа

О МУТАНТ N№-260 - Оу Л МУТАНТ МЫ-збо -Тф

0

О

■11-1—I < I И"Ч-1 ■ ' 1'Щ)-1 I ■ ЦЧЧ-- I I |1Ш|

104 0.001 0.01 0.1 1

КОНЦЕНТРАЦИЯ ТОКСИНА, НГ/МЛ

Рис. б. Активность мутантов шига токсина Рго-258 - С1у и Ме1>2б0 - Тгр в бесклеточной системе синтеза белка. Токсины в возрастающей концентрации вносили в реакционную смесь и инкубировали 15 мин при 30°С. Ингибирование сийтеза белка оценивали по кинетике включения 35Б-ме-тионина в суммарный белковый продукт.

Показано, что в обоих типах тестов активность мутанта шига токсина Ме1:-260 - С1у превышает активность токсина дикого типа в 5 раз. Токсин с заменой Ме^260 на Тгр на порядок активнее токсина дикого типа. Таким образом, при замене метионина, боковая цепь которого блокирует доступ к активному центру шига токсина, на аминокислоту с более короткой или более объемной боковой цепью, мы в обоих случаях наблюдаем повышение активности токсина. Можно констатировать, что взаимодействие боковой цепи Ме1-260 с активным центром шига токсина является составной частью ингибирующего влияния фрагмента А2 на 1М-гликозидазную активность токсина, поскольку при замене этой аминокислоты наблюдается существенная активация токсина. Таким образом, мы проанализировали роль взаимодействия А1 и А2 фрагментов А субъединицы шига токсина в регуляции его энзиматичес-кой активности. Показано постепенное увеличение активности токсина при удалении дисульфидной связи и при последующем расщеплении А субъединицы. Мы предполагаем, что три фактора - существование единой полипептидной цепи А субъединицы, присутствие дисульфидного моста и наличие взаимодействия между активным центром и А2 фрагментом - являются определяющими в ингибировании энзиматической активности шига токсина, осуществляемом А2 фрагментом А субъединицы. В процессе транспорта токсина эти факторы постепенно устраня-

ются, что приводит в конечном итоге к физическому разобщению активного центра на А1 и фрагмента А2 и к проявлению полной цитоток-сической активности шига токсина по достижении им своей мишени в цитозоле эукариотической клетки.

На сегодняшний момент, наиболее полно охарактеризованной стадией активации токсина в эукариотической клетке можно считать протеоли-тическое расщепление А субъединицы, происходящее в ТГС. Поэтому, вторая часть данной работы посвящена подробному исследованию влияния протеолитического расщепления шига токсина на его транспорт и цитотоксичность.

5. Активность мутантного токсина с делецией 10 аминокислотных остатков в составе фрагмента А2.

Для подробного выяснения роли фрагмента А2 в транспорте и активации шига токсина нами получен мутантный токсин, где были делетированы три аминокислотных остатка, предшествующих трипсин-чувствительному сайту в А2, и семь остатков, отделяющих этот сайт от Су$-2б1 (рис. 1). Таким образом, в полученном токсине (названном 20-мутантом), сохранился дисульфидный мост и участок разрезания протеазами, но большая часть петли, образованной А2 фрагментом, была удалена. В бесклеточной системе синтеза белка проверяли активность мутанта 20 как в исходной форме, так и карбоксиметилированного и расщепленного трипсином. В качестве контроля использовали токсин дикого типа, обработанный точно таким же образом.

п токсин дикого ТИПА

В РАСЩЕПЛЕННЫЙ, КАРБОКСИМЕТИЛИРОВАННЫЙ

Рис. 7. Активность модифицированных и протеолитически расщепленных производных мутанта шига токсина 20 и токсина дикого типа по

сравнению с необработанными токсинами в бесклеточной системе синтеза белка. Токсины в возрастающей концентрации вносили в реакционную смесь и инкубировали 15 мин при 30°С. Ингибирование синтеза белка оценивали по кинетике включения 355-метионина в суммарный белковый продукт.

Представленные на рис. 7 результаты свидетельствуют, прежде всего, о том, что активность мутантного токсина превышает контроль в 6-7 раз и что разница между активностью обработанного и необработанного токсина дикого типа составляет приблизительно 10 раз, как было показано ранее (рис. 2). Наиболее интересным же является наблюдение, что расщепление и карбоксиметилирование практически не изменяют активность мутантного токсина 2D. Эти результаты находятся в полном соответствии с гипотезой о том, что петля, образованная А2 фрагментом, оказывает ингибирующее действие на активный центр, находящийся на А1. При разделении А1 и А2 фрагментов токсина дикого типа наблюдается повышение активности токсина в 10 раз. Если же длина фрагмента А2 существенно уменьшена, как в случае мутанта 2D, то эффект активации не проявляется, потому что невозможно само ингибирование. Таким образом, исследование.активности мутанта с делециями в составе А2 фрагмента дает прямое доказательство участия дисульфидной петли в регуляции активности шига токсина.

6. Цитотоксический эффект и особенности внутриклеточного транспорта мутанта 2D шига токсина.

При исследовании цитотоксического эффекта мутанта 2D мы обнаружили, что его активность значительно ниже контроля, несмотря на то, что связывание с рецепторами находится на том же уровне, что и у токсина дикого типа. Известно, что цитотоксичность шига токсина зависит от его внутриклеточного транспорта и модификации, в частности, от расщепления в трипсин-чувствительном участке [Sandvig К. etal., 1994]. Чувствительность мутанта 2D к трипсину не отличается от чувствительности токсина дикого типа. Известно, однако, что функцию расщепления шига токсина в эукариотической клетке выполняетфурин, локализованный в ТГС . Как показали Garred и соавт., растворимый очищенный фурин способен расщеплять шига токсин in vitro. При тестировании чувствительности мутанта 2D к фурину in vitro мы обнаружили, что этот токсин не расщепляется фурином ни при одном из значений рН, оптимальных для расщепления токсина дикого типа (рис.8).

Токсин дикого типа мутант 2D

Фурин - + - + + + + + +

pH А AI 7.0 6.0 7.0 С1Ш 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5

дорожки 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рис. 8. Расщепление растворимым фурином in WiroLunra токсина дикого типа и его мутантного производного 2D. Токсин дикого типа и мутант 2D расщепляли фурином в течение 3 часов при 30°С, как описано в разделе «Материалы и методы». На дорожку 1 нанесен необработанный образец токсина дикого типа, на дорожку 3-необработанный мутант 2D.

Транспорт и активацию мутанта 2D в эукариотической клетке исследовали с помощью клеточной линии LoVo, не вырабатывающей действующего фурина [Komada М. etat., 1993]. Были использованы два линии LoVo: LoVo/fur, трансфицированная вектором, несущим ген фурина, и LoVo/neo, несущая контрольный вектор. Показано, что клетки LoVo/fur значительно менее чувствительны к мутантному токсину, чем к токсину дикого типа и, в то же время, клетки LoVo/neo проявляют одинаково низкую чувствительность к обоим токсинам (рис. 9). Если же подвергнуть токсин дикого типа и мутант 2D расщеплению трипсином перед их добавлением к клеткам LoVo, то можно видеть существенное возрастание активности мутанта 2D в клетках LoVo/fur и одновременное возрастание активности обоих токсинов в случае LoVo/neo. Полученные данные позволяют сделать несколько важных выводов: во-первых, делеция, произведенная при получении мутантного токсина 2D, не влияет на энзиматическую активность токсина, а только на его способность к протеолитическому расщеплению в эукариотической клетке. В самом деле, при трипсиновом расщеплении мутанта до его введения в клетки цитотоксическая активность полностью восстанавливается и достигает уровня токсина дикого типа (Рис. 9).

Рис.9. Цитотоксическийэффектпредварительнорасщепленныхтрипси-ном шига токсина дикого типа и мутантноготоксина 2D в культуре клеток LoVo/fur LoVo/neoпосравнениюснеобработаннымитоксинами. Время инкубации токсинов с клетками 3 ч. Ингибирование белкового синтеза в клетках оценивали по кинетике включения 3Н-лейцина в скуммарный белковый продукт.

Во-вторых, несмотря на полную сохранность участка чувствительности кфурину в мутанте 2D, этот токсин теряет способность к разрезанию фурином. Таким образом, образованная фрагментом А2 полипептидная петля играет роль и в осуществлении внутриклеточного расщепления шига токсина.

В предыдущих исследованиях не раз поднимали вопрос о важности расщепления А субъединицы шига токсина для проявления полного цитотоксическогоэффекта [Pelham H. R. В. eîal., 1992, Sandvig К. étal., 1993]. Поэтому, мы исследовали расщепление мутантного токсина 2D и токсина дикого типа клеточной линией НЕрИ, причем наряду с коротким и длительным временем инкубации использовали различные ингибиторы клеточных процессов: в первую очередь, брефелдин А (БФА), который разрушает аппарат Гольджи (АГ) в ряде клеточных линий и обладает способностью защищать клетки от цитотоксического эффекта шига токсина [Sandvig К. et al., 1991]. Кроме того, использовали ингибитор калпаина, цистеиновой протеазы, обнаруживаемой в цитозоле большинства животных клеток.

Токсин дикого типа мутант 20

добав. ничего БФА ИНГ. калп. ничего БФА инг. калп.

инк 0 1 5 1 5 1 5 0 1 5 1 5 1 5

цор 1 ы 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рис. 10. Расщепление шига токсина дикого типа и мутантного токсина 20 в культуре клеток НЕрП. Клетки преинкубировали в присутствии ингибитора калпаина (Инг. К) (100 мкг/мл) или брефелдина А (БФА) (2 мкг/мл) в течение 20 мин при 37°С. Затем добавляли меченый |] шига токсин (100нг/мл), и инкубацию продолжали в течение 1 или 5 часов. После инкубации, клетки отмывали, лизировали и исследовали в ПААГ. На дорожку 1 нанесен контрольный образец токсина дикого типа, на дорожку 8 — мутантный токсин 20, не инкубировавшиеся с клетками.

Как следует из рис. 10, расщепление токсина дикого типа в обычных клеточных линиях происходит в основном в ТГС, но не на более поздних стадиях транспорта и не в цитозоле. В самом деле, хорошо видно, что разрушение АГ, вызванное добавлением БФА, равно как и ингиби-рование цитозольной протеазы калпаина, не снижает уровень расщепления токсина дикого типа в эукариотической клетке. В то же время, мутантный токсин Ю расщепляется в клетках при длительных сроках инкубации лишь на 25-30%, и это расщепление эффективно подавляется разрушением АГ (путем добавления БФА) или ингибированием калпаина. Поскольку на данный момент убедительно показана возможность ретроградного транспорта шига токсина по мембранным структурам эукариотической клетки, то можно прийти к заключению о том, что не расщепленный фурином в транс-Гольджи сети мутант шига токсина 20 использует другие возможности для расщепления на более поздних стадиях транспорта и в цитозоле.

Таким образом, проведенное нами исследование активации и транспорта шига токсина в эукариотических клетках показало, что: во-первых, А2 фрагмент находится в контакте с расположенным на А1 фрагменте активным центром и ингибирует энзиматическую активность токсина. Разделение А1 и А2 путем протеолитического расщепления А субъединицы, восстановления дисульфидной связи между ними, а также устранения взаимодействия между Туг-77активного центра и Рго-258 А2фраг-мента приводит к возрастанию энзиматической активности фермента в бесклеточной системе в 50 раз. Возрастание цитотоксического эффекта

в 7-8 раз наблюдали в случае устранения связи Туг-77с Рго-258. Мутагенез метионина в позиции 260, боковая цепь которого частично блокирует доступ к активному центру шига токсина, приводит кактива-ции токсина в 5-10 раз как в культуре клеток, так и в бесклеточной системе синтеза белка (табл.).

Таблица. Концентрации различных мутантных и химически модифицированных производных токсина шигелл ы, подавляющих синтез белка в бесклеточной системе на 50%, по отношению к концентрации токсина дикого типа, оказывающей аналогичное ингибирование.

Токсин Отношение

концентраций, х 100%

Токсин дикого типа 100

Карбоксиметилированный токсин 100

дикого типа

Расщепленный токсин дикого типа 80

Карбоксиметилированный, 10

расщепленный токсин дикого типа

Мутант Рго-258 - Бег 100

Карбоксиметилированный мутант 10

Рго-258 - Бег

Карбоксиметилированный, расщепленный 2

мутант Рго-258 - Бег

Мутант Ме1>260 - &у 20

Мутант Ме1-260 - Тгр 10

Мутант Ю 50

Карбоксиметилированный, 30

расщепленный мутант2Р

Во-вторых, обнаружена потеря шига токсином чувствительности к внутриклеточной протеазе фурину в случае укорочения А2 фрагмента на 10 аминокислотных остатков, несмотря на полную сохранность участка расщепления. При невозможности расщепления токсина в ТГС эукариотической клетки, его цитотоксичность существенно снижается и может быть восстановлена либо путем альтернативного расщепления цитозольной протеазой калпаином, либо при условии обработки токсина трипсином до его введения в культуру клеток. Эти наблюдения позволяют заключить, что протеолитическое расщепление является важной стадией активации шига токсина в ходе его транспорта по мембранным структурам кпетки-мишени.

выводы

1. Установлено, что Ы-гликозидазная активность шига токсина частично ингибируется в результате взаимодействия энзиматического центра с С-концевым участком А субъединицы. Получены мутантные и химически модифицированные производные шига токсина, проявляющие повышенную активность в культуре клеток и бесклеточной системе синтеза белка.

2. Показано, что протеолитическое расщепление шига токсина эукарио-тической протеазой фурином, локализованным в транс-Гольджи сети, или альтернативное расщепление цитозольной протеазой калпаином, является важной стадией активации токсина в эукариотических клетках и необходимым условием для проявления его полной цитотоксической активности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

7. О. Garred, Е. Dubinins, A. Potesskaya, 5. Olsnes, J. Kozlov, К. Sandvig. Role of the Disulfide Bond in Shiga Toxin A-chain for Toxin Entry into Cells. -J. Biol. Chem., 1997, v. 272, No. 17, p. 11414-11419.

2. A. H. Полесская, О. Гарред, С. Олснес, Ю. В. Козлов. Самоингибиро-вание N-гликозидазной активности токсина шигеллы. - Молекулярная биология, 1997, т. 31, N 3, стр. 528-535.

3. Полесская А. Н., Козлов Ю. В. Самоингибирование N-гликозидазной активности шига токсина. - Материалы Второго съезда биохимического общества РАН, 19-23 мая 1997, Москва.

4. Kozlov J. V., PolesskayaA. N. Self-inhibition of N-glycosidase Activity of Shiga Toxin. - Eighth European Workshop Conference on Bacterial Protein Toxins, 29 June-4 July 1997, Staffelstein, Germany. Book of abstracts.