Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гуморальный иммунный ответ на токсины из омелы белой (Viscum album)

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Солопова, Ольга Николаевна, Москва

i • «

' ' ! ' ~~ ч

n/ ,. t^ ^ ■ — ^ / * Л ¿>

(La / i \ л A

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ МЗ РФ

На правах рукописи

СОЛОПОВА ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА

ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУННЫИ ОТВЕТ НА ТОКСИНЫ ИЗ ОМЕЛЫ БЕЛОЙ

(VISCUM ALBUM).

03.00.03 .-Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук Агапов Игорь Иванович, доктор медицинских наук Комолов Игорь Сергеевич

Москва-1999

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

Список сокращений.................................................................................7

Введение...............................................................................................8

Глава 1. Обзор литературы. Иммунный ответ на белковые токсины различного происхождения.......................................................................................9

1.1.Введени е..........................................................................................9

1.2.Иммунный ответ на токсины бактерий....................................................10

1.2.1.Воздействие Шига-токсина на организм млекопитающих..........................10

1.2.1.1 .Строение и характеристика Шига-токсина...........................................10

1.2.1.2.Гуморальный иммунный ответ на Shigella dysenteriae.............................11

1.2.1.3.Клеточный иммунитет к Shigella dysenteriae..........................................12

1.2.2.Иммунологические характеристики коклюшного токсина и его искусственных

аналогов, полученных при производстве противококлюшных вакцин..................13

1.2.2.1 .Строение и действие коклюшного токсина...........................................13

1.2.2.2.Влияние коклюшного токсина на продукцию антител в организме............14

1.2.2.3.Клеточный иммунитет на коклюшный токсин.......................................15

1.2.3.Температуро-лабильный энтеротоксин Escherichia coli и холерный токсин: строение, биологическая активность и воздействие на иммунную систему............16

1.2.3.1.Сравнительные характеристики эндотоксина E.coli и холерного токсина.....16

1.2.3.2.Гуморальный иммунный ответ на эндотоксин E.coli..............................17

1.2.3.3.Гуморальный иммунный ответ на холерный токсин............................... 19

1.2.3.4.Клеточный иммунитет к эндотоксину E.coli и холерному токсину..............21

1.2.4.Ботулиновые нейротоксины, иммуногенные свойства...............................22

1.2.4.1.Происхождение, строение и биологическое действие ботулиновыхтоксинов22

1.2.4.2.Гуморальный иммунный ответ на ботулиновые токсины........................23

1.2.5.Общие черты воздействия бактериальных токсинов на иммунную систему

млекопитающих.....................................................................................23

1.3.Растительные токсины. Воздействие растительных токсинов на организм

млекопитающих.....................................................................................25

*

1.3.1.1.Рицин- белковый токсин из семян Ricinus communis. Строение и биологические свойства............................................................................26

1.3.1.2.Гуморальный иммунный ответ на рицин.............................................26

1.3.1.3.Клеточный иммунный ответ на рицин.................................................30

1.3.2.Влияние гелонина на клеточный иммунитет............................................30

1.3.3.Токсические белки из листьев и побегов омелы белой (Viscum Album L.)......31

1.3.3.1.Характеристики и биологическое действие..........................................31

1.3.3.2.Гуморальный иммунный ответ на белки водного экстракта омелы.............33

1.3.3.3.Воздействие антител против MLI на иммунокомпетентные клетки в экспериментах in vitro..............................................................................35

1.3.3.4.Анализ антигенных детерминант молекул ML.......................................36

1.3.3.5.Модуляция антителообразования компонентами экстракта омелы........... ..38

1.3.3.6.Воздействие токсинов омелы на клетки иммунной системы млекопитающих. Изменение уровня пролиферации мононуклеарных клеток периферической крови...................................................................................................39

1.3.3.7.Изменение секреции лимфокинов^под воздействием экстракта омелы.........43

1.3.3.8.Изменение концентрации и цитотоксической активности естественных киллеров под воздействием экстракта омелы.................................................45

1.3.3.9.Изменение количества макрофагов и их фагоцитирующей активности под воздействием экстракта омелы...................................................................47

1.3.3.10.Корреляция между гуморальным и клеточным иммунными ответами на

ML......................................................................................................48

1.3.4.0бщие черты взаимодействия растительных токсинов на иммунную систему

млекопитающих.....................................................................................50

1 АЗаключение.......................................................................................51

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................52

2.1. Культивирование клеточных линий........................................................52

2.2.Выделение токсинов и их субъединиц из растения Viscum alburn....................52

2.3.Иммунизация крыс и мышей нативным токсином MLIII или изолированными субъединицами токсина MLI.....................................................................54

2.4.1.Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела против вискумина............................................................................................55

2.4.2.Клонирование гибридом методом лимитирующих разведений...................56

2.4.3. Криоконсервирование клеток.............................................................57

2.5.Наработка и очистка антител.................................................................57

2.5.1.Очистка антител ионнообменной хроматографией....................................57

2.5.2.0чистка антител хроматографией на протеин А-сефарозе...........................57

2.6.Радиоактивное мечение белков..............................................................58

2.7.Иммуноферментный анализ..................................................................58

2.7.1.Иммуноферментный анализ с антигеном, сорбированным на планшете.........58

2.7.2.Иммунноферментный анализ с антигеном в растворе................................59

2.8. Изучение диссоциации и реассоциации тетрамерных токсинов и их

изолированных субъединиц.......................................................................60

2.9.Оценка галактозосвязывающей активности токсинов..................................60

2.10.По лучение иммунотоксинов................................................................61

2.11. Определение цитотоксической активности токсинов и иммунотоксинов.......62

2.12.Связывание токсинов с клетками.........................................................63

2.13.0чистка и ренатурация рекомбинантной А-субъединицы MLI.....................64

2.15 .Характеристики антител.....................................................................65

2.15.1.Определение констант ассоциации.....................................................65

2.15.2.0пределение класса и подкласса антител.............................................65

2.16. Определение гликозилированности токсинов..........................................66

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.................................................66

3.1.Изучение иммунного ответа на изоформы ML...........................................66

3.1.1 .Иммунизация крыс токсином MLIII......................................................67

3.1.2. Иммунизация мышей токсином MLIII...................................................70

3.1.3. Получение моноклональных антител мыши против MLIII.........................72

3.1.4.Получение моноклональных антител против MLII....................................74

ГЛАВА 4. ИММУННЫЙ ОТВЕТ НА ИЗОЛИРОВАННЫЕ СУБЪЕДИНИЦЫ MLI.78

4.1.Иммунизация животных А-субъединицей................................................78

4.1.1 .Образование антител к А-субъединице у крыс.........................................78

4.1.2.Иммунизация мышей А-субъединицей MLI............................................80

4.2.Иммунный ответ на В-субъединицу MLI..................................................83

4.2.1.Результаты иммунизации крыс MLB.....................................................83

4.2.2.Иммунизация мышей В-субъединицей токсина MLB................................85

4.2.3.Получение моноклональных антител против В-субъединицы MLI...............88

4.2.4. Взаимодействие полученных монАТ с целой молекулой токсина MLI..........89

4.2.5.Устойчивость гибридом, продуцирующих монАТ против MLB, к цитотоксическому действию MLI...............................................................91

4.3.Предсказание антигенных детерминант В-субъединицы MLI........................96

ГЛАВА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКТИНОВ В ПРЕПАРАТАХ ИЗ ОМЕЛЫ, АНАЛИЗ СЫВОРОТОК ПАЦИЕНТОВ......................................................................97

5.1.Разработка тест- систем для количественного определения МЬ в препаратах из омелы..................................................................................................97

5.2. Анализ сывороток больных, получавших инъекции экстракта омелы.............98

ВЫВОДЫ...........................................................................................101

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................102

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БСА - бычий сывороточный альбумин ДДС-Ыа - додецилсульфат натрия

ИТ -иммунотоксин

МонАТ - моноклональные антитела

НАФ - неполный адъювант Фрейнда

ПААГ - полиакриламидный гель

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

РИБ - рибосом-инактивирующие белки

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭР - эндоплазматический ретикулум

БТ - дифтерийный токсин

МЬ - токсины из омелы

МЫ - вискумин, токсин из омелы I

МП1 - токсин из омелы II

мил - токсин из омелы III

МЬА -А-субъединица вискумина

МЬВ - В-субъединица вискумина

ВВЕДЕНИЕ

Белковые токсины растительного и бактериального происхождения оказывают и угнетающее, и стимулирующее действие на иммунную систему млекопитающих. До сих пор нет полного понимания всех процессов, происходящих в организме при попадании токсинов. Известно, что они могут влиять на секрецию лимфокинов, на численность и активность макрофагов, естественных киллеров, лимфоцитов периферической крови.

Растительные токсины широко используются для производства фармакологических препаратов. Экстракт из листьев и побегов омелы (Viscum Album) с давних времен используется как дополнительное средство при лечении онкологических заболеваний, компоненты экстракта применяют для разработки иммунотоксинов- химерных белков, состоящих из токсина и антитела к определенному клеточному маркеру.

Основными активными компонентами экстракта являются токсические лектины, составляющие целое семейство гомологичных белков. Эти лектины представляют собой рибосом-инактивирующие белки 2 типа и состоят из двух субъединиц. А-субъединица токсина (29кДа) является высокоспецифической N-гликозидазой и избирательно выщепляет одну молекулу аденина в 28S рРНК рибосомы эукариотической клетки. В-субъединица (34кДа)- лектин, имеет два центра связывания с поверхностными рецепторами клетки и обеспечивает проникновение А-субъединицы в цитозоль.

Гуморальный иммунитет на компоненты экстракта омелы остается практически неизученным. Антитела, образующиеся в ответ на введение этих токсинов, имеют нейтрализующее действие и способны уменьшать цитотоксичность компонентов препарата, влияя на их стимулирующие свойства. Настоящая работа

посвящена изучению процесса образования антител против токсинов омелы, специфичности относительно их изоформ, направленности либо к А- либо к В-субъединицам токсина, а также изучению структуры основных антигенных эпитопов.

Целью данной работы является изучение гуморального иммунного ответа на токсические белки из омелы и их отдельные субъединицы. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1) испытать разные способы иммунизации лабораторных животных, в ходе иммунизации провести тестирование сывороток на содержание антител против токсина и его отдельных субъединиц; 2) получить и охарактеризовать моноклональные антитела против изоформ токсина и изолированной В-субъединицы; 3) изучить с помощью моноклональных антител механизм взаимодействия токсина с рецепторами внутри клетки; 4) разработать усовершенствованные тест системы для определения токсинов в фармакологических препаратах из омелы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 .Введение.

Многие прокариоты, растения и животные производят токсические вещества белковой природы, которые оказывают влияние, часто с летальным исходом, на другие организмы и дают преимущества в борьбе за существование. Действие токсинов на организм часто неоднозначно: помимо смертельного исхода токсины могут вызывать различные реакции организма. Иногда воздействие определенных доз токсина может иметь положительное значение для человека или животного, и это издревле позволяло применять яды в качестве лекарств. В связи с этим изучение влияния токсинов на живой организм представляет немалый интерес с практической точки зрения. В фундаментальных исследованиях токсины тоже нашли свое

применение, поскольку зачастую они становятся инструментом для изучения функций различных систем организма. Например, с помощью латротоксина- яда из слюнных желез скорпиона Latrodectus spider был обнаружен механизм передачи нервного импульса в отсутствие ионов кальция. (1).

Процессы, происходящие в организме при проникновении токсинов в ткани, реакции иммунной системы на введение токсина представляют немалый научный интерес и являются предметом настоящего обзора. В зависимости от происхождения токсины можно разделить на бактериальные, растительные и животные. Довольно часто молекула токсина состоит из двух видов субъединиц: А- субъединицы, проникающей в цитоплазму клетки и оказывающей цитотоксическое действие, и одной или нескольких В- субъединиц, обеспечивающих проникновение А-субъединицы внутрь клетки.

1.2.Иммунный ответ на токсины бактерий.

По всей видимости, с бактериальными токсинами человеку приходится сталкиваться наиболее часто. Возбудители многих инфекционных заболеваний, например, дизентерии, холеры, ботулизма, столбняка, коклюша, дифтерии, стафилококковых и кишечных инфекций при попадании в организм человека или животного производят токсические вещества, часто нескольких видов. Эти вещества, как правило, воздействуют на ту или иную системы организма, во многом определяя клиническую картину заболевания. Часто именно токсины, как наиболее иммуногенные белки бактериальной клетки, участвуют в выработке иммунного ответа на инфекционный агент, поэтому особенно важно исследовать, каким образом токсины взаимодействуют с иммунной системой организма.

1.2.1. Воздействие Шига-токсина на организм млекопитающих.

1.2.1.1. Строение и характеристика Шига-токсина.

Шига-токсин (известный еще как веротоксин) продуцируется бактериями Shigella dysenteriae серотип 1 (2) и Escherichia coli (3). Шига- токсин состоит из одной А-субъединицы (32 кДа) и пяти идентичных В-субъединиц (7.7кДа каждая). Цитотоксическое действие заключается в ингибировании белкового синтеза за счет N-гликозидазной активности А-субъединицы, расщепляющей один адениновый остаток в 28S рРНК 60S субъединицы рибосомы, что делает невозможным взаимодействие рибосомы с факторами элонгации eEf-1 и eEf-2. (4). Пентамер В-субъединиц способствует проникновению целого токсина в эукариотическую клетку путем рецептор- опосредованного эндоцитоза, соединяясь с клеточным рецептором Gb3 (глоботриасилцерамид).

Бактерии, продуцирующие шига- токсин, могут вызывать в организме дизентерию (S.dysenteriae), геморрагические колиты (E.coli), синдром гемолитической уремии (S.dysenteriae, E.coli). В этих случаях шига-токсин проникает в эпителиальные клетки кишечника инфицированных млекопитающих и, убивая их, уменьшает всасывающую способность кишечника.(5).

1.2.1.2. Гуморальный иммунный ответ на Schigella dysenteriae.

Для изучения иммуномодулирующуй активности шига- токсина мышам вводили внутрибрюшинно разные штаммы S.dysenteriae, как продуцирующие шига-токсин, так и непродуцирующие.(б). Затем оценивали продукцию антител по количеству антителообразующих клеток (АОК) селезенки, секретирующих антитела как к антигенам S.dysenteriae, так и к неспецифическим антигенам (эритроциты барана). Эти эксперименты показали, что уровень образования специфических антител против липополисахарида (ЛПС) S.dysenteriae был выше в случае заражения мышей штаммами, не продуцирующими шига-токсин, а в случае, когда измеряли антителообразование к эритроцитам барана (ЭБ), на ранних стадиях иммунизации

(на 4-7 сутки) наблюдалось снижение количества антителообразующих клеток, продуцирующих антитела к ЭБ. При этом подавление антителообразования к ЭБ было более выраженным в случае заражения животных штаммами S.dysenteriae, продуцирующими шига-токсин. По этой причине авторы делают вывод о иммуносупрессивном действии шига-токсина.

Похожий вывод делает в своей работе и Islam с сотр. (7), при изучении иммунного ответа в сыворотке и на слизистых больных дизентерией с разной степенью тяжести заболевания. У всех больных дизентерией наблюдалось снижение общего уровня сывороточных IgG и IgM, в зависимости от тяжести заболевания это снижение было более или менее выраженным. Вместе с тем количество секреторных антител (s-IgA) слизистых оболочек кишечника увеличивалось с увеличением тяжести заболевания. В этой связи авторы делают вывод, что при общей супрессии иммунной системы при дизентерии возрастает роль локального иммунитета слизистых оболочек.

При введении мышам очищенного шига-токсина также наблюдали дозозависимый иммунный ответ в виде продукции антител s-IgA против шига-токсина на слизистых оболочках кишечника. (8). Содержание сывороточных иммуноглобулинов IgG против шига-токсина через 5 недель после иммунизации тоже зависело от дозы, но в этом случае наблюдался оптимум дозы (Юмкг/мышь), при превышении этого количества токсина для иммунизации наблюдали резкое снижение уровня продукции антител против токсина. Авторы объясняют это толерантностью