Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активация сигнальных процессов в клетках под действием лектинов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Активация сигнальных процессов в клетках под действием лектинов"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ

УДК 577.35.05

I

ТИМОШЕНКО Александр Викентьевич

АКТИВАЦИЯ СИГНАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В КЛЕТКАХ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЛЕКТИНОВ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой стслгни доктора биологических наук

Минск-1998

Работа выполнена в Белорусском государственном университете

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Черенкевич С.Н.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик НАНБ, профессор Конев C.B. доктор биологических наук, профессор Зинченко В.П. доктор химических наук Киселев П.А.

Оппонирующая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита состоится 27 марта 1998 года в часов на заседании совета по защите диссертаций (Д 01.37.01) в Институте фотобиологии HAH Беларуси по адресу: 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии HAH Беларуси.

<ß У»(

Автореферат разослан чР t » февраля 1998 года.

Ученый секретарь

совета по защите диссертаций

кандидат биологических наук /^^З&с*^ Л.Ф. Кабашникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. К настоящему времени стало ясно, что кроме общеизвестной функции обеспечения клетки энергией углеводы участвуют в процессах обмена и переноса биологической информации [Laine, 1997]. Углеводные структуры различной степени сложности экспрессированы на поверхности клеток и являются составной частью клеточных рецепторных систем, участвующих в процессах молекулярного узнавания и трансмембранной сигнализации [Gabius, 1991; Rosales, Juliano, 1995; Wahl et a!., 1996; Villalobo et al., 1997]. Декодирование биологической информации, содержащейся в структуре углеводных цепей, осуществляется с участием углеводсвязывающих белков (УСБ), обеспечивающих реализацию адекватного биологического ответа. Различают несколько групп УСБ, которые могут быть иммуноглобулинами (антитела против углеводных детерминант) [Feizi, Childs, 1987], ферментами (гликозилтрансферазы и гликозидазы) [Ichikawa et al., 1992] и пектинами [Луцик и др., 1981]. К лектинам относят белки неиммунной природы, обладающие свойством обратимо и избирательно связывать углеводы и углеводные компоненты различных типов гликоконьюгатов без изменения их химической структуры. Пектины получили широкое применение в биологии и медицине в качестве, прежде всего, гистохимических маркеров для изучения экспрессии гликолигандов на поверхности клеток и в биологических жидкостях [Луцик и др., 1989; Лахтин, 1995], митогенов [Borrebaeck, Carlsson, 1989], а также аффинных сорбентов для выделения гликопротеинов [Луцик и др., 1981] и клеточных субпопуляций [Koren, Agrov, 1985].

Исследования биологической активности пектинов, которые ранее традиционно относили к белкам растительного происхождения, существенно интенсифицировались в последние годы в связи с двумя основными достижениями в области лектинологии. Во-первых, выявлена фармакологическая значимость пектинов в качестве активных компонентов лекарственных экстрактов растений в применении к проблеме лечения рака, что относится, прежде всего, к галактозидспецифичному пектину омелы белой (Viscum album L. agglutinin, VAA) [Gabius et al., 1994]. Во-вторых, выявлены многочисленные типы УСБ в тканях, биологических жидкостях и на поверхности клеток человека и животных [Drickamer, Taylor, 1993; Barondes et al., 1994; Powell, Varki, 1995], содержание которых в организме изменяется при патологии [Gearing, Newman, 1993]. Основные научные проблемы, которые возникли в связи с этими открытиями и до сих пор не решены, состоят в установлении мембранных механизмов действия пектинов на клетки, определении физиологических функций пектинов в организме и сопоставлении биологической активности эндогенных и лекарственных пектинов.

В последние годы появились свидетельства того, что пектины обладают свойствами модификаторов биологического ответа (biological response modifiers), подобных иммуно-тропным веществам и цитокинам [Winner, 1991; Gabius et al., 1992]. В сложной цепи сигнальных реакций, которые запускаются в клетках стимулирующими факторами, можно выделить отдельные звенья, связанные с образованием и/или высвобождением таких низко-

молекулярных вторичных мессенджеров как ионы Ca2*, супероксидный анион-радикал, Н2О2, монооксид азота, метаболиты арахидоновой кислоты (АК) и др. Однако данные аспекты процессов сигнализации в клетках, обусловленные действием эндогенных лектинов человека и животных, а также лектинов лекарственных препаратов растительного происхождения, остаются практически не исследованными. В то же время физиологическая значимость лектинов подтверждается данными об участии этих веществ в процессах активации комплемента [Holmskov et ai, 1994], адгезии и миграции лейкоцитов [Mackay, Imhof, 1993], лекгинофагоцигоза [Sharon, 1987], метастазирования [Raz, Lotan, 1987], апоптоза [Savill et а!., 1993]. Несмотря на это, целенаправленное применение лектинов, кроме митогенных агглютининов Canavalia ensiformis (Con А) и Phaseolus vulgaris (РНА), в качестве стимуляторов специфических функций и реакций клеток остается офаниченным.

Таким образом, актуальность темы диссертации обусловлена необходимостью определения роли и места лекарственных и эндогенных пектинов в качестве селективных стимуляторов клеточного ответа и процессов сигнализации в клетках.

Связь работы с крупными научными программами и темами. Работа выполнялась в рамках научно-исследовательских проектов, которые финансировались Министерством образования Республики Беларусь и международными фондами: "Взаимодействия лекгин-гликолиганд как новый вид молекулярного узнавания в регуляции клеточных функций" (№ г/р 19943145), "Исследование свойств и биологической активности новых классов синтетических и природных соединений в клеточных системах: эндогенные углевод-связывающие белки и неогликоконьюгаты" (№ г/р 19963652), "Выделение и клеточно-биологическая характеристика лектинов для биомедицинского применения" (Volkswagen-Stiftung, I/68 661, ФРГ), "Неогликоконьюгаты как прогностические маркеры опухолей - синтез, гистопатопогиче-ское применение и клеточно-биологические эффекты" (INTAS-94-0289, ЕС).

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в определении биологической активности и физиологической роли растительных, эндогенных (животных и человека) и бактериальных лектинов на основе анализа механизмов ранних стадий процессов трансмембранной сигнализации в клетках иммунной системы. Основные задачи настоящей работы, решение которых было необходимо для достижения поставленной цели, состояли в следующем:

1. Исследовать молекулярно-мембранные механизмы активирующего действия га-лактозидспецифического пектина омепы белой и его субъединиц на клетки крови человека и тимоциты крыс.

2. Разработать критерии отбора растительных лектинов для биомедицинского применения на основе изучения ранних клеточных ответов (агрегация клеток, генерация активных форм кислорода, дегрануляция, модификация потоков ионов Са2+ и Н*).

3. Изучить влияние высокоселективных ингибиторов биосигнальных путей на устойчивость межклеточных контактов, образованных под действием лектинов.

4. Исследовать эффекторные свойства набора высокоочищенных эндогенных УСБ животных и человека, включавших три галактозидспецифичных белка (галектина) из ткани сердца быка (BL-14, 14 кДа), кишечника цыплят (CL-14, 14 кДа), печени цыплят (CL-16, 16 кДа), две субфракции IgG, различающиеся сродством к a-gal (a-gal-lgG) и ß-gal (ß-gal-IgG) и два пентраксина (С-реактивный белок - CRP и сывороточный амилоидный Р компонент - SAP).

5. Изучить лектинзависимую реактивность различных субпопуляций клеток экспонированных к контролируемым физико-химическим воздействиям (тепловой шок, УФ-облучение, ингибиторы протеолиза, сульфгидрильные реагенты), которые избирательно модифицируют рецепторный аппарат и инактивируют медиаторные системы клеток.

6. Определить роль пектин-гликолигандного узнавания в механизмах взаимодействия бактерий Escherichia coli (E.coli) с нейтрофилами человека и тимоцитами крыс.

7. Экспериментально обосновать возможность использования пектинов в качестве стимуляторов клеточного ответа в биомедицинских исследованиях и разработать лектино-вые тесты для выявления нарушений функциональной активности лейкоцитов при раковых заболеваниях различной этиологии.

Научная новизна полученных результатов заключается в обосновании и разработке концепции об универсальной регуляторной роли углеводспецифических взаимодействий в процессах клеточной сигнализации.

Доказано, что механизм ранних стадий активирующего действия на различные типы клеток крови человека (нейтрофилы, лимфоциты, тромбоциты) и тимоцитов крыс галакто-зидспецифического пектина омелы обусловлен наличием в его составе нетоксической уг-леводсвязывающей В-субъединицы.

Впервые проведено изучение лактозоиндуцированной дезагрегации тимоцитов крыс и нейтрофилов человека и показано, что специфические ингибиторы отдельных сигнальных реакций в клетках подавляют образование лактозорезистентных межклеточных контактов при действии VAA.

Обнаружено свойство растительных лектинов активировать менадионзависимуга генерацию Н202 внутриклеточными редокс-системами тимоцитов.

Показано, что агрегационная активность растительных лектинов Сол A, Sambucus nigra (SNA), Solanum Tuberosum (STA), PHA, Pisum sativum (PSA), Triticum vulgaris (wheat germ agglutinin, WGA) и Urtica dioica (UDA) с различной углеводной специфичностью не является достаточным условием для запуска процессов сигнализации как в нейтрофипах человека, так и в тимоцитах крыс. Методической основой и критерием отбора лектинов лекарственных растений для биомедицинского применения является наличие у них стимулирующего действия на сигнальные реакции в клетках, связанные с такими вторичными мес-сенджерами клеточного ответа как Н202, ионы Са2+ и Н+.

Выявлен эндогенный галектин животного происхождения (CL-16), который in vitro был стимулятором НАДФН-оксидазной активности и дегрануляции нейтрофилов человека,

а также вызывал увеличение внутриклеточной концентрации ионов Ca2' ([Ca2'],) и продукцию ионов Н+ в тимоцитах крыс, т.е. обладал спектром функциональной активности VAA.

Обнаружен общий момент в механизмах агрегации клеток под действием пектинов и сульфатированных полисахаридов (ПСХ), который состоит в том, что эти процессы находятся под контролем протеолитических систем клеток и высокочувствительны к действию сульфгидрильных реагентов.

Установлено, что в условиях теплового шока (45°С) инициируется процесс шеддинга мембранных компонентов клеток, приводящий к сложной динамике изменения агрегацион-ных свойств клеток в ответ на действие агрегантов различной природы.

Показано, что генерация Н2Ог нейтрофилами человека под действием лектинов с различной углеводной специфичностью (VAA, РНА и WGA) полностью блокируется в условиях краткосрочного воздействия теплового шока (46°С) или УФ-облучения (254 нм); молекулярный механизм данных эффектов состоит в инактивации термолабильного цитоплаз-матического компонента НАДФН-оксидазы - p67-phox.

Уточнены механизмы процесса межклеточной агрегации клеток-мишеней (тимоциты крыс, нейтрофилы человека) и бактерий Е. coli в смешанной суспензии и показано, что маннозоспецифичные контакты обеспечивают взаимоузнавание этими клетками друг друга. Найдено, что изменение температуры выступает в качестве триггера реакции межклеточной агрегации с участием бактерий и обнаружено, что образование маннозорезистентных контактов блокируется под действием ингибиторов окислительного метаболизма фагоцитов.

На разнообразном клиническом материале показана применимость лектиновых тестов (агрегация клеток, генерация супероксида и Н2О2, дегрануляция) для изучения нарушений функциональной активности нейтрофилов при раке легкого, гортани, прямой кишки, а также при хронических бактериальных инфекциях дыхательных путей.

Установлено, что повышенная концентрация [N02"+N031 в плевральных экссудатах (ПЭ) является индикатором рака легкого и выявлена взаимосвязь между этим параметром и экспрессией рецепторов для glcNAc и ганглиозида GM) на поверхности клеток ПЭ.

Практическая значимость полученных результатов. Основными отраслями практического применения полученных результатов является биотехнология, фармакология, здравоохранение и народное образование. Результаты исследований создают научную и теоретическую базу для целенаправленного использования пектинов, включая пектины лекарственных растений и эндогенные пектины животных и человека, в биомедицинских исследованиях в качестве стимуляторов функциональной активности клеток. Лектины перспективны для применения в цитоэкологических исследованиях в качестве индикаторов действия на клетки патогенных факторов внешней среды. Разработанные пектиновые тесты могут бьгть использованы в качестве новых методов для дифференциальной диагностики рака и бактериальных инфекций. Результаты работы создают основу для развития современных технологий получения лекарственных препаратов и диагностических средств нового типа, действие которых основано на лектинспецифических взаимодействиях.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Активирующее действие галактозидспецифичного пектина омелы белой VAA на клетки иммунной системы определяется его углеводсвязывающей В-субъединицей, обеспечивающей запуск процессов трансмембранной сигнализации в клетках. Отдельные аспекты сигнальной активности VAA присущи ряду эндогенных пектинов животных и человека, которые совместно с другими гликобиологическими факторами (аи-кислый гликопротеин и его гликоформы, углеводслецифичные иммуноглобулины) образуют лектинзависимую систему регуляции клеточных функций в организме.

2. Применение пектинов и сульфатированных полисахаридов позволяет выявить нарушения механизмов функционирования клеток, связанных с процессами клеточной агрегации, шеддинга мембранных рецепторов и изменением НАДФН-оксидазной активности нейтрофилов при действии факторов внешней среды (тепловой шок, УФ-облучение и сульфгидрильные реагенты).

3. Взаимодействия бактериальных клеток Е. coli с клетками-мишенями (тимоциты крыс, нейтрофилы человека), основанные на маннозоспецифических контактах, имеют обратимый характер и зависят от метаболической активности клеток и температуры.

4. Пектиновые тесты, основанные на анализе ранних стадий функционального ответа нейтрофилов, могут использоваться в качестве дополнительных диагностических средств в биомедицинских исследованиях.

Личный вклад соискателя. Выбор и обоснование научной тематики исследований, постановка экспериментов, анализ полученных результатов и их интерпретация были сделаны автором самостоятельно. Все основные научные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором.

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на заседаниях научного семинара кафедры биофизики Белгосуниверситета (1989-1997 гг.), Всесоюзной конференции "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов" (Минск, 1988), Всесоюзном совещании "Актуальные вопросы клеточной биологии" (Ленинград, 1989), конференции молодых ученых "Биохимия и биофизика клеточных процессов" (Минск, 1990), 1 Иммунологическом съезде Белоруссии "Экологические проблемы иммунологии и аллергологии" (Минск, 1990), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки" (Минск, 1990), 9 Международном симпозиуме по аффинной хроматографии и биологическому узнаванию (Иокогама, 1991), 15 Международной конференции по пектинам (Сегед, 1993), 1 и 2 съездах Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1994, 1996), 8 Симпозиуме по экспериментальным исследованиям рака Немецкого Ракового Общества (Хайдельберг, 1995), 8 съезде оториноларингологов Украины (Киев, 1995), 2 Международной конференции по лазерной физике и спектроскопии (Гродно, 1995), 4 съезде оториноларингологов Республики Беларусь (Витебск, 1996), Международном симпозиуме "Кислород и свободные радикалы" (Гродно, 1996), 1 Международной конференции UICC по исследованию рака

(Вена, 1997), научной конференции "Современное состояние и перспективы развития фундаментальных направлений медико-биологических наук в Беларуси" (Минск, 1997).

Опубликованность результатов. По теме диссертации опубликовано 53 научные работы, включая 2 раздела в книгах издательств Springer и Humana Press, 31 публикацию в журналах (из них 5 научных обзоров) и 1 авторское свидетельство на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, методической главы, 5 экспериментальных глав с собственными результатами и их обсуждением, заключения, выводов, списка использованной литературы (494 источника) и приложения (обзоры по теме диссертации). Она изложена на 295 страницах и содержит 98 рисунков и 25 таблиц.

МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выделение клеток. Нейтрофилы и лимфоциты выделяли из крови методом центрифугирования в градиентах фиколл-пака, лимфопрепа или гистопака с плотностью 1,077 г/мл [B0yum, 1968]. Тимоциты крыс выделяли из тимуса белых беспородных крыс методом центрифугирования [Тимошенко, 1987]. Обогащенную тромбоцитами плазму и отмытые тромбоциты получали методом дифференциального центрифугирования [Самаль и др., 1990]. Культуральные клетки линий HeLa, 1_-41и Vero покупали в Институте микробиологии и эпидемиологии МЗ Беларуси. Бактериальные клетки Е. coli, штамм К12 АВ1157, выращивали в полноценной питательной среде на основе аминопептида [Гриц, 1976]. Для проведения исследований клетки суспендировали в сбалансированных солевых растворах, pH 7,3, забуференных 10 мМ Na2HP04-'KH2P04, HEPES или MOPS.

Лектины. VAA и его субъединицы выделяли из водного экстракта сухих листьев омелы белой методом аффинной хроматографии на сефарозе 4В с иммобилизованной лактозой [Gabius, 1990] и контролировали их чистоту методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Лектины STA, SNA, РИА, PSA и WGA были производства НПО Лектинотест (Львов, Украина), a Con А - фирм Roth (ФРГ) или Vector (США). Пектин UDA, все эндогенные лектины (CL-14, CL-16, BL-14, HL-14, SAP, CRP), а также а- и ß-галактозидспецифичные субфракции IgG были получены из Мюнхенского университета (проф. H.-J. Gabius).

Препараты ai-кислого гликопротеина (AGP) были получены по известным методам [Новикова, 1990; Шиян и др., 1991] в Институте биоорганической химии РАН (Москва) и предоставлены для исследований Н.В. Бовиным (лаборатория химии углеводов).

Клинический материал. Образцы крови больных и их клинические данные получали из 4-й городской клинической больницы (Минск), НИИ онкологии и медицинской радиологии WI3 Беларуси, Клиники Марбургского университета (ФРГ). Клиники торакальных заболеваний г. Хайдельберга (ФРГ). Плевральные экссудаты получали на кафедре патологии Клиники торакальных заболеваний г. Хайдельберга (ФРГ).

Основные методики. Экспериментальные исследования с клеточными суспензиями проводили при 37°С в условиях постоянного перемешивания в процессе измерений, если иное специально не было предусмотрено условиями опыта.

Измерения агрегации и дезагрегации клеток проводили оптическим методом по изменению величины светопропускания клеточных суспензий при 590 нм с помощью колориметра КФК-2 или при 632,8 нм с помощью лазерного нефелометра [Самаль и др., 1990], а также с применением компьютеризированного агрегометра АР2110 СОЛАР (Беларусь).

Лектин-индуцированную продукцию нейтрофилами человека супероксида определяли спекгрофотометрическим методом по восстановлению цитохрома С [Markert et al., 1984].

Генерацию Н202 клетками определяли флуоресцентным методом с использованием скополетина [Corbett, 1989].

Концентрацию ионов Са5' в цитоплазме тимоцитов крыс измеряли с использованием флуоресцентного Са2+-индикатора квина-2 согласно описанному методу [Tsien et al., 1982].

Измерения внутриклеточного рН (рНО проводили с помощью рН-чувствительного флуоресцентного зонда 2',7'-бискарбоксиэтил-5(6')-карбоксифлуоресцеина (BCECF) согласно описанной методике [Gelfand et al., 1988] в модификации [Sjaastadt et al., 1992].

Дегрануляцию нейтрофилов измеряли по выходу из клеток трех гранулярных ферментов: лизоцима, миелопероксидазы и эластазы. Активность лизоцима определяли по скорости лизиса бактерий Micrococus lysodeikticus [Yoshimura et al., 1987]. Активность миелопероксидазы и эластазы определяли спектрофотометрическим методом с применением в качестве субстратов соответственно о-дианизидина [Henson et al., 1978] и метоксисукци-нил-ала-ала-ала-про-вал-р-нитроанилида [Nakajima et al., 1979].

Липосомы готовили инъекционным методом [Kremer et al, 1977] из клеточных пипидов, которые экстрагировали из тромбоцитарного концентрата по методу [Rendi et al., 1976].

Эстеразную активность определяли флуоресцентным методом по скорости гидролиза флуоресцеиндиацетата (ФДА) [Rotman, Papermaster, 1966].

Связывание биотинилированных пектинов и гликолигандов с клетками определяли методом флуоресцентной микроскопии с помощью авидин-биотиновой техники [Kayser et al., 1994], используя меченый техасским красным стрептавидин.

Общую концентрацию нитритов/нитратов [NO2+NO3"] в жидкости ПЭ определяли спектрофотометрическим методом с использованием реактива Грисса [Hevel, Marietta, 1994].

Флуоресцентные и спектрофотометрические измерения проводили с использованием следующих приборов: компьютеризированного флуориметра LSF 1211А СОЛАР (Беларусь), спектрофотометров Hitachi U-1100 (Япония), Uvikon 810 фирмы Kontron (ФРГ) и EAR 340 AT фирмы SLT Labinstruments (Австрия).

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы NCSS 5.03, а также графических редакторов GraphPad PRISM 1.03 и Harward Graphics 1.02. Достоверность различий средних рассчитывали с применением t-критерия Стъюдента, принимая различия достоверными при уровне значимости Р<0,05.

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЛЕКТИНА ОМЕЛЫ БЕЛОЙ И ЕГО СУБЪЕДИНИЦ

Влияние VAA на реактивность нейтрофипов человека и тимоиитов крыс. Лектин омелы относится к семейству растительных токсинов и является гетеродимером, состоящим из двух субъединиц, соединенных дисульфидной связью: В-субъединицы с молекулярной массой 34 кДа (VAA-B) и А-субъединицы (VAA-A), представленной двумя близкими изоформами (А,: 28,5 кДа и А2: 29,5 кДа) (рис. 1). В-субъединица обладает собственно лек-тиновой активностью и связывает a/ß-галактозидсодержащие гпиколиганды [Gabius et al., 1992], тогда как А-субъединица, является токсином, ингибирующим белковый синтез [Endo et al., 1988]. В растворе происходит ассоциация гетеродимерных молекул пектина с образованием тетрамера с молекулярной массой около 126 кДа. Нерешенной проблемой является предотвращение или снижение токсических свойств препаратов на основе VAA. Для разработки научно-обоснованной стратегии использования VAA в биомедицинских целях были изучены механизмы ранних стадий действия целого леетина и его субъединиц на клетки крови и иммунной системы, позволяющие определить ключевые лектинзависимые пути

Рис.1. Электрофорез галактозидспецифич-ного лектина омелы в ПААГ (10 % разделяющий гель) в присутствии 0,1 % додецил-сульфата натрия и р-меркаптозтанола. 1,2 -различные концентрации \/АА; 3 - маркерные белки (сверху вниз): бычий сывороточный альбумин (66 кДа), яичный альбумин (45 кДа), р-лактоглобулин (18,4 кДа) и а-лактоглобулин (14,2 кДа).

Нами показано, что \/АА эффективно связывался с клетками крови и в диапазоне концентраций 1-5 мкг/мл вызывал дозозависимую агрегацию тимоцитов крыс, а также нейтро-филов, лимфоцитов, тромбоцитов и, в меньшей степени, эритроцитов человека. На примерах тимоцитов крыс, тромбоцитов и нейтрофилов человека установлено, что агрегационная активность УАА определяется его углеводсвязывающей В-субъединицей. Так, при добавлении к отмытым тромбоцитам, реакцию агрегации вызывали только \/АА и В-субъединица, тогда как А-субъединица была неактивной. Необходимо отметить, что как целый лектин, так и его В-субъединица в концентрациях соответственно 100 и 400 мкг/мл не вызывали агрегации липосом из общих липидов тромбоцитов. Родственный в структурном и углеводспе-

трансмембранной сигнализации в клетках. 1 2 3

А-» - —

66

18,4 14,2

цифическом отношении лектин клещевины (100 мкг/мл), а также лектин сои (400 мкг/мл), были в этом аспекте эффективными агрегантами, действие которых блокировалось лактозой. Следовательно, рецепторами \/АА в клетках являются гликопротеины.

С применением в качестве модельной системы тимоцитов крыс было установлено, что УАА обладал не только агрегирующей активностью, но и индуцировал такие внутриклеточные сигнальные реакции как увеличение [Са2^ и усиление менадион-зависимой генерации Н202. Перечисленные клеточные ответы развивались в течение нескольких минут после добавления к суспензии тимоцитов как целого лектина, так и его В-субъединицы (рис. 2). Хроматографически чистая А-субъединица в концентрации до 12,5 мкг/мл не вызывала агрегации клеток и изменения [Са2+],. Более того, она ингибировала генерацию Н202 тимо-цитами на 18+9 % (п=5).

Время, мт

Время, мин

0 2 4 6~ 8

Время, мин

Рис.2. Кинетические кривые функциональных ответов тимоцитов крыс на УАА и его субъединицы: а - агрегация клеток; б - изменение интенсивности внутриклеточной флуоресценции Са2*-индикатора квина-2 (Х.ех=339 нм, А.ет=495 нм); в - менадион-зависимое окисление скополетина (генерация Н202) (Аех=350 нм, Хет=460 нм). Концентрации: УАА (1) и УАА-В (2) - 1,25 мкг/мл, \/АА-А (3) - 12,5 мкг/мл, 4 - контроль или \/АА + лактоза (25 мМ).

Аналогичный характер имело действие лектина и его субъединиц на агрегацию ней-трофилов человека и генерацию этими клетками супероксида и Н202. В частности, \/АА и его В-субъединица в концентрации 50-100 мкг/мл обеспечивали генерацию супероксида на уровне 8-10 нмоль/15 мин/2х106 кл. Во всех случаях наблюдаемые эффекты были дозоза-висимыми и блокировались в присутствии лактозы в концентрации 25-50 мМ, что подтверждает лекти.човую природу УАА-индуцирсванных реакций.

По данным литературы сходное действие in vitro VAA и VAA-B оказывали также на секрецию а-фактора некроза опухолей, интерлейкинов 1 и 6 мононуклеарными клетками [Hajto et al., 1990] и на рост [CaJ*]¡ в лимфоцитах человека [Büssig et al., 1996]. Существенно, что in vivo внутривенные инъекции кроликам оптимальных доз (0,25-1,0 нг/кг веса) VAA или VAA-B, повышали такие иммунологические параметры как цитотоксическая активность NK-клеток и количество больших гранулярных лимфоцитов [Hajto et al., 1989].

Эти данные показывают, что углеводсвязывающая В-субъединица VAA обладает широким спектром активности целого лектина, соответствующему его иммуномодулирующему действию на клетки. Данный вывод принципиален для биомедицинского применения VAA, поскольку позволяет разработать стратегию по использованию нетоксической В-субъединицы взамен целого лектина. Отметим, что А-субъединица VAA имеет другую, "нелектиновую" область своего применения в качестве действующего компонента иммунотоксинов [Гоневицкий и др., 1995].

Тот факт, что сигнальная активность VAA определяется его В-субъединицей, подводит нас к проблеме поиска лектинов с подобными характеристиками для биомедицинского применения. С целью разработки критерия отбора лектинов с потенциальными иммуномо-дулирующими свойствами было проведено тестирование других растительных агглютининов (STA, SNA, WGA, PHA, PSA, Con А и UDA). Лектины в концентрации 25 мкг/мл добавляли к суспензии нейтрофилов (1х106 кл/мл) в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и измеряли в одинаковых условиях агрегацию клеток и генерацию Н202. Оказалось, что изученные агглютинины можно разделить, по крайней мере, на две группы в зависимости от их способности вызывать активацию дыхательного метаболизма клеток, а именно на "метаболически активные" (VAA, WGA, РНА и Con А) и "метаболически неактивные" (STA, SNA, SBA и UDA) лектины. Агрегационная активность пектинов в обоих группах изменяется в значительных пределах, в частности, слабый агрегант Con А был более мощным стимулятором генерации Н202 нейтрофилами, чем лектины с высокой агрегационной активностью (SNA, STA).

Отсутствие прямой корреляции между эффективностью связывания растительных агглютининов с клетками и пострецепторными сигнальными реакциями наблюдалось также и для тимоцитов крыс. В этой серии опытов лектины использовали в следующих концентрациях: VAA - 2,5 мкг/мл; РНА, UDA, WGA - 25 мкг/мл; Con A, PSA, SNA, STA - 50 мкг/мл. Было установлено, что все лектины, за исключением UDA и WGA, вызывали в течение 5-10 мин эффективную агрегацию клеток. Этот процесс сопровождался ростом более чем в три раза величины базального уровня [Ca2*], при действии VAA, SNA, Con А, РНА и PSA, увеличением рН| под действием VAA и РНА, а также снижением величины pH¡ под действием амилорида (ингибитора Ма7Н+-обменника) в присутствии VAA и SNA. Кроме того, из 5 изученных лектинов VAA, Con А, РНА-Е и WGA дозозависимым образом стимулировали мена-дион-индуцированную продукцию Н202 тимоцитами крыс, тогда как SNA был неактивен.

Таким образом, агрегационная активность растительных лектинов не является достаточным условием для запуска процессов сигнализации как в нейтрофилах человека, так и тимоцитах крыс. Высокий уровень экспрессии углеводных детерминант на поверхности кле-

ток является лишь предпосылкой для формирования адекватного клеточного ответа. Реальное участие в передаче пектинового сигнала принимает ограниченное число функционально активных мембранных рецепторов. При этом одинаковые лектины могут по разному влиять на различные субпопуляции клеток иммунной системы. Достаточно общее активирующее действие на сигнальные ответы клеток (изменения [Ca21], и рН(, генерация Н202) оказывали только VAA, РНА и Con А. Именно эти пектины, как предполагается, перспективны для использования в качестве иммуномодуляторов в онкологии [Wimer, 1991; Gabius et al., 1992]. Измерение агглютинации эритроцитов при действии белковых экстрактов лекарственных растений [Гопынская и др., 1989] нельзя, таким образом, считать достаточным основанием для характеристики лектинов как фармакологически активных компонентов фитопрепаратов. Наиболее приемлемой методической основой и критерием скрининга новых лектинов для биомедицинского применения является наличие стимулирующего действия на ранний ответ клеток, развивающийся в течение первых минут после связывания лектина с мембранными гликолигандами.

Лактозоиндуциоованная дезагрегация клеток. Процесс агрегации клеток под действием лектинов сопряжен с активацией ряда пострецепторных сигнальных реакций, включающих фосфорилирование внутриклеточных белков и липидов [Gabius et al., 1992; Ohta et al., 1992], изменение концентрации неорганических ионов в цитоплазме [Гуковская, 1984], метаболизм AK [Parker, 1981; Tsunawaki, Nathan, 1986]. Особенностью действия VAA является то, что соответствующие клеточные ответы подавляются лактозой. Однако до последнего времени оставался невыясненным вопрос о влиянии лактозы на агрегированные клетки, то есть на клетки, которые активированы VAA. Научная идея данного подхода состоит в том, что в случае образования межклеточных "сшивок" только посредством молекул VAA клеточные агрегаты должны разрушаться в присутствии высоких концентраций лактозы, блокирующей места связывания лектина с мембранными галактозидами. Если же в процессе VAA-индуцированной активации клеток образуются дополнительные межклеточные контакты вследствие запуска внутриклеточных сигнальных реакций, то ожидаемое дезафегирующее действие лактозы может значительно сниматься или даже отсутствовать.

Для проверки этого предположения было проведено скрининговое исследование влияния 26 высокоселективных ингибиторов известных сигнальных путей на процессы формирования клеточных агрегатов под действием VAA. В отсутствие ингибиторов добавление лактозы (55 мМ) приводило к остановке реакции VAA-индуцированной агрегации клеток (нейтрофилов или тимоцитов) и небольшой дезагрегации. Однако некоторые ингибиторы вызывали значительное усиление процесса дезагрегации, так что клеточные агрегаты легко разрушались под действием лактозы (рис. 3). Дезагрегирующий эффект лактозы имел дозозависимый характер и достигал максимальных значений при концентрации углевода 50-100 мМ.

В табл.1 представлены данные об ингибиторах, которые оказывали существенное потенцирующее действие на лактозоиндуцированную дезагрегацию тимоцитов крыс, акти-

%

8Q 7Q 60. 50 40 30. 20. 10j О.

Рис. 3. Кинетики агрегации тимоцитов крыс (5x106 кл/мл) под действием УАА (3 мкг/мл) и последующей дезагрегации клеток под действием лактозы (55 мМ) в присутствии и отсутствие ШвА (30 мМ). Измерения проводили при 37°С в ФСБ. Стрелкой показан момент добавления лактозы к агрегированным клеткам: 1 -контрольный препарат клеток; 2 - клетки, преинкубированные в течение 3 мин с ШвА; 3 - лактоза и ингибитор добавлены одновременно. По оси ординат - све-топропускание, %; по оси абсцисс - время, мин.

Таблица 1

Влияние ингибиторов сигнальных реакций (10 мкМ) на образование 1.ас'-контактов в

Название соединения Мишень действия К-во Lac"-контактов, %*

Дисренипенсиодониум (DPI > |МО синтлйа. шансгорт К' и Са*' 82,545,2 (4)

НАДН-убихино! юксиоеду стаза 11И11111

фгавопротеинь IlillSSISSIS

Ингибитор II диацилглицеринкиназы Диацилгпицеринкиназа 81,2±8,5 (4)

(ингибитор ДАГ-киназы)

К Г6720 Пр01 еинкиназсд А 71 Bt0,4 {3,

КТ5926 СаМ киназа; миозинкиназа; про- 82,2±3,5 (3)

теинкиназа С

Нордигидрогваяротссзя киспгл а Липогспгеназ? 81,5±3,1'{3) ■

_(NDGA)r . / ШШШШШШШШШШ•

Трифторперазин (TFP) Антагонист кальмодулина; про- 90,6±3,8 (3)

теинкиназа С

Трициклодекач 9-ил^сангсгенаг Фосфатидил^олин-специфичная 73.0114 8 (3)

„(D809). >"„,„.„"„ фссфол* паза С ЩшШШВШШЩ

1-(р-Хлорбензил)-5-(изопропил)-3-1- 5-Липоксигеназа 73,5±8,6 (3)

диметилпропановая кислота (МК-866)

Эмоции РЬО * ТИрОЗИ |>ИНсН«| e2,2iii,3 ;&:

N-этилмалеимид (NEM) Сульфгидрильный реагент 86,5±4,6 (3)

Примечание: 'Цифра в скобках - количество независимых экспериментов.

вированных VAA. Полученные результаты дают основание объяснить VAA-индуцированную агрегацию тимоцитов крыс образованием двух типов межклеточных контактов, а именно: лакгозочувствительных (Lac+) и лактозорезистентных (Lac") в зависимости от их устойчивости к дезагрегирующему действию лактозы. В соответствии с зтим признаком перечисленные выше вещества образуют новую группу соединений - ингибиторов межклеточных Lac-контактов. В механизмах образования Lac-контактов принимают участие, скорее всего, такие известные адгезионные молекулы как интегрины и селектины, повышенная экспрессия которых на поверхности клеток под действием стимулирующих агентов происходит в течение нескольких минут [Shattil et а!., 1994; Mackay, Imhof, 1993; Bevilacqua, Nelson, 1993].

Если предположить, что формирование Lac'-контактов при действии VAA связано с процессами пострецепторной сигнализации, то обоснованным является вопрос о влиянии ингибиторов на внутриклеточные уровни таких вторичных мессенджеров клеточного ответа как Н202 и ионы Са2+, которые, как известно, способствуют формированию межклеточных и адгезионных контактов [Тимошенко и др., 1986; Самаль и др., 1988; Skoglund et al., 1988]. Как оказалось, действие ингибиторов Lac'-контактов на изменение [Саг*} в тимоцитах было неоднозначным: из 10 названных ранее соединений, только половина, а именно DPI, NEM, NDGA, TFP и КТ5926 в микромолярном диапазоне концентраций подавляли рост [Са2+]и вызванный VAA. Более того, в отношении реакции менадион-индуцированной генерации Н202 тимоцитами крыс среди ингибиторов Lac-контактов были стимуляторы (NEM, D609), ингибиторы (NDGA, эмодин, DPI, TFP) и малоактивные вещества (МК-866, ингибитор ДАГ-киназы, КТ5720 и КТ5926). Отметим, что ускорение менадион-зависимой генерации Н202 тимоцитами в присутствии SH-реагента NEM было характерной чертой этой реакции. Влияние ингибиторов Lac-контактов на VAA-индуцированную генерацию H202 нейтрофилами человека было другим. Так, NDGA, DPI, TFP, КТ5926 и NEM в использованных дозах полностью блокировали генерацию Н202 нейтрофилами человека. Ингибировал данный ответ клеток эмодин, незначительные изменения вызывали КТ5720, ингибитор ДАГ-киназы и D6D9. МК-866 сам активировал нейтрофилы и вызывал генерацию Н202 в отсутствие лектина. Примечательно, что разница в действии ингибиторов на генерацию Н202 тимоцитами и нейтрофилами свидетельствует о различной регуляторной роли редокс-систем, локализованных внутри клеток (восстановление менадиона) и в плазматической мембране (НАДФН-оксидаза фагоцитов).

Таким образом, ни ионы Саг\ ни Н202 нельзя рассматривать в качестве единственных посредников в образовании Lac'-контактов при действии VAA. Поэтому мы предполагаем, что Lac'-контакгы характеризуются гетерогенным составом и в их образовании участвуют различные сигнальные пути, выявляемые с помощью ингибиторов. Прежде всего, это хорошо известная Са2*-мобилизирующая полифосфоинозитидная мессенджерная система, сопряженная с метаболизмом ДАГ и активацией Са27кальмодулин-зависимой протеинкина-зы [Радченко, 1991]. Ключевые звенья этой Са2+-зависимой сигнальной цепи блокируют TFP, КТ5926, КТ5720, DPI, NEN и ингибитор ДАГ-киназы. В дополнение к сигнальным процессам, связанным с гидролизом фосфатидилинозита, следует учитывать роль других

фосфолипидов, так как ингибитор фосфатидилхолин-специфической фосфолилазы С D609 подавлял образование Lac'-контактов. Общим вторичным посредником в обоих случаях является ДАГ, обеспечивающий дальнейшую трансдукцию активирующего сигнала в клетках по механизмам с участием протеиншназы С и метаболитов АК [Радченко, 1991]. Выраженное потенцирующее действие NDGA и МК-886 позволяет говорить о самостоятельном значении в формировании 1_ас"-контактов арахидонат-зависимого (липоксигеназного) пути. Этот вывод подтверждается данными литературы об агрегации клеток иммунной системы при действии свободной АК и лейкотриена В4 [Villa et а/., 1984; Dahl, 1985; Beckman et af., 1985]. Возможный участник процессов образования Lac-контактов - тирозинкиназа p56/sk (iymphocyte-specific protein-tyrosine kinase), активность которой подавляется эмодином. Этот фермент относится к Src-семейству нерецепторныхтирозинкиназ, вовлеченных в процессы ранней сигнализации в Т-клетках [Bolen et at., 1992]. Соответствующий каскад сигнальных реакций, приводящих к образованию части Lac-контактов, по-видимому, не зависит критическим образом от [Са2+];, так как эмодин не влиял на Са2+-ответ тимоцитов. Однако в этом случае роль Н502 как медиатора межклеточных взаимодействий может быть существенной, поскольку эмодин (10 мкМ) ингибировал генерацию Н202 на 40 % нейтрофи-лами при действии VAA и на 74 % тимоцитами в присутствии менадиона.

Таким образом, в качестве ключевых компонентов каскада взаимокоординированных сигнальных путей, обеспечивающих формирование 1_ас"-контактов в тимоцитах, можно рассматривать Са2*-зависимый путь, арахидонат-зависимый путь и p56'sk тирозинкиназу. Плейотропный характер механизмов межклеточной адгезии, чувствительных к действию ингибиторов Lac' контактов, обеспечивает сбалансированность и адекватность агрегацион-ного ответа клеток.

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭНДОГЕННЫХ ПЕКТИНОВ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА

Поскольку VAA и пектины других лекарственных растений являются экзогенными белками для животных и человека, то представляет интерес идентификация тех эндогенных пектинов, которые могли бы участвовать в регуляции соответствующих клеточных функций в организме. Были исследованы эффекторные свойства набора высокоочищенных эндогенных гапак-тозидсвязывающих белков, включающих три галектина (BL-14, CL-14 и CL-16) и две gal-специфические субфракции IgG, а также, для сравнения, два пентраксина (CRP и SAP).

Реактивность нейтоофилов. Основываясь на данных о медиаторной роли активных форм кислорода (АФК) в процессах сигнализации в клетках [Ramasarma, 1990; Chanock et al„ 1994], было исследовано влияние эндогенных пектинов животных и человека на генерацию Нг02 нейтрофилами. Оказалось, что среди исследованных галектинов и пентраксинов только димерный галектин CL-16 из печени цыплят стимулировал генерацию Н202 нейтрофилами (табл. 2). Этот эффект CL-16 был углеводспецифическим и ингибировапся лактозой в концентрации 50 мМ. Несмотря на то, что галекгины CL-14 и BL-14 обладали одинаковой с CL-16 но-

Таблица 2

Влияние эндогенных УСБ животных и человека и УАА на генерацию Н202 нейтрофи-лами человека, уровень [Са3,]| и изменение рН в тимоцитах крыс (Х+ЭЕ)

Вещество, Генерация Н202 ней- Концентрация ионов Снижение рН| в тимоци-

концентрация, трофилами, усл.ед. С а2* в цитоплазме тах при действии 1 мМ

мкг/мл тимоцитов, нМ амилорида, усл. ед.

t; Контроль - 21.1*4.2 <7> . 88±6 (14) 0.054+0,008 (9)

2. VAA, 2,5 284,1 ±24,7*" (8) 314±36* (11) 0,199+0,014*** (8)

Л СЫо 2' ' 114,0^:34,6* (4) - ?59 70* О1 0 11«'0 00Г-"-(~,,

4.CL-14, 25 38.5-14.0 (5) '/) 0 .5, 0,10010,013* (3)

5. 81-14,25 ЗЭ 7* 10," (3) 95+8 (7) 0,071 «3,009 (3)

6. ra-gal-IgG, 25 51,9114,3* (5) 97±17(6) 0,064+0,007 (3)

7 .i-gs'-IgG Г Г 53,7 1?5*(ft; 01 Пф) 0 077 0 ОСЙ (2)

8. CRP, 50 35,5+8,7 (4) 103+17(4) 0,075+0,004 (3)

0 S-Ф ЬО 24,8+5,3 (4) 104i:7 (5) 0,061+0,005(3)'

Примечания: *Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001. В скобках указано число экспериментов.

минальной углеводной специфичностью, так как были выделены на идентичных хроматографи-ческих колонках с иммобилизованной лактозой, они были неактивны. Аналогично, очень низкой стимулирующей активностью обладал также галекгин-1 (мол. масса 14 кДа) из плаценты человека. Следует отметить, что в дополнение к CL-16 достоверное увеличение уровня генерации Н2Ог нейтрофилами вызывали а- и р-галакгозидспецифичные субфракции IgG (см. табл. 2).

Мы установили, что активация нейтрофилов пектинами сопровождается не только синтезом Н202, но и высвобождением из клеток гранулярных ферментов - лизоцима, эла-стазы и миелопероксидазы. В предварительных экспериментах с VAA было показано, что эффективная дегрануляция нейтрофилов (высвобождение из клеток от 15 до 40 % анализируемых ферментов) происходит только в присутствии цитохалазина В (5 мкг/мл), блокирующего полимеризацию актина и рост микрофиламентов. В отсутствие цитохалазина В лектин-индуцированный выход ферментов наблюдался только в случае лизоцима, маркера и специфических и азурофильных гранул, тогда как эластаза и миелопероксидаза, как известно [Boxer, Smolen, 1988], содержатся только в последних. Таким образом, состояние системы микрофиламентов контролирует высвобождение ферментов из различных типов внутриклеточных гранул под действием пектинов. Среди тестированных эндогенных УСБ человека, взятых в концентрации 100 мкг/мл, статистически достоверное (Р<0,01) увеличение выхода лизоцима и эластазы из нейтрофилов, обработанных цитохалазином В, наблюдалось, соответственно, в ответ на HL-14 (эндогенный галектин из плаценты человека аналогичный BL-14) и p-gal-IgG, тогда как a-gal-IgG и SAP были неактивны. CL-16 стимулировал высвобождение лизоцима, эластазы и миелопероксидазы, a CL-14 в идентичных условиях был

был неактивен. Поскольку номинальная углеводная специфичность галекгинов одинакова, то эти различия можно объяснить взаимодействием HL-14, CL-14 и CL-16 с различными типами галактозидсодержащих олигосахаридов на поверхности клеток.

Различия в сигнальной активности гапакгозидсвязывающих УСБ обнаружены нами и при изучении реакции агрегации нейтрофилов под действием АК (48 мкМ). Было установлено, что в неагрегирующих дозах VAA, CL-16, HL-14 и p-gal-IgG обладали потенцирующими свойствами и ускоряли арахидонат-индуцированную агрегацию нейтрофилов (2x10s кл/мл в ФСБ с глюкозой) на 10-50 % по отношению к контролю. Данный набор активных УСБ был полностью аналогичен таковым при анализе дегрануляции нейтрофилов. Не оказывали существенного влияния на АК-зависимый ответ нейтрофилов CL-14, SAP, CRP и ct-gal-lgG. С учетом данных об ингибиро-вании образования !_ас"-агрегатов под действием ингибиторов липоксигеназ (NDGA и МК-866) можно однозначно заключить, что VAA и отдельные галактозидсвязывающие белки непосредственно влияют на арахидонат-зависимый путь в активации клеток.

Изменение концентрации ионов Са2* иН'в цитоплазме тимоцитов крыс. Ионы Са2' являются ключевыми медиаторами различных сигнальных реакций в клетках, что позволяет рассматривать увеличение [Ca2*]j как фактор, относящийся к запуску эффекторных механизмов в клетках [Авдонин, Ткачук, 1994]. Из 7 изученных эндогенных УСБ только галек-тин CL-16 вызывал однозначный рост [Са2*], в тимоцитах (см. табл. 2). Как и в случае с генерацией Н202, эффект галектина был углеводспецифическим и ингибировался лактозой в концентрации 50 мМ. Два других галектина (CL-14 и BL-14), а также пентраксины не изменяли базапьный уровень [Са2*], при инкубировании с клетками в течении 5-10 мин.

В аналогичных условиях все исследованные эндогенные УСБ не влияли на величину рН| в тимоцитах крыс, нагруженных BCECF. Однако при добавлении 1 мМ амилорида, блокирующего функционирование Ыа*/Н'-обменника плазматической мембраны, наблюдалось существенное снижение флуоресценции рН-зонда BCECF в клетках, инкубированных с CL-14 и CL-16 (см. табл. 2). Эти данные позволяют заключить, что галектины тканей цыплят активируют внутриклеточные процессы, связанные с избыточным образованием метаболитов, закисляющих среду (например лактата) и/или изменением мембранной проводимости для ионов Н+ (активный и пассивный транспорт).

Основной результат этой серии исследований состоит в том, что впервые выявлен эндогенный гапекгин животного происхоледения (CL-16), который in vitro был эффективным стимулятором НАДФН-оксидазной активности, дегрануляции (выход из клеток лизоцима, эластазы и миелопероксидазы) и арахидонат-индуцированной агрегации нейтрофилов человека, а также индуктором увеличения [Са24], и изменения рН, в тимоцитах крыс. Другие галактозидспецифич-ные эндогенные лектины и субфракции IgG обладали избирательной активностью или были неактивными в использованных экспериментальных условиях. Эти данные позволяют по-новому взглянуть на проблему определения физиологических функций эндогенных пектинов, поскольку становится ясным, что решающее значение имеет не номинальная углеводная специфичность белка, а особенности сродства к сложным олигосахаридным структурам в составе функцио-

напьно значимых мембранных рецепторов. Поэтому, использование подходящих олигосахари-дов, а не простых Сахаров в качестве аффинных сорбентов определяет стратегическую линию для получения субфракций эндогенных пектинов с заданной биологической активностью.

В целом, полученные данные позволяют сделать вывод о том, что функциональная роль галактозидспецифичных эндогенных пектинов животных и человека определяется их прямым активирующим действием на клетки иммунной системы. Кроме того, результаты исследований указывают на некоторую аналогию в сигнальных механизмах действия лекарственного пектина VAA и галактозидспецифичных эндогенных пектинов на клетки крови. Попытки использования очищенных препаратов VAA в онкологии имеют, таким образом, рациональное обоснование, хотя и требуют более глубоких и детальных исследований в будущем с помощью подходящих тест-систем из-за амбивалентного действия лектинов на состояние иммунной системы [Gabius, Gabius, 1994].

Влияние оп-кислого гликопротеина на генерацию H?Q? нейтрофилами. Важными участниками углеводспецифических взаимодействий в организме являются циркулирующие гликопротеины, содержащие в своем составе сложные олигосахаридные структуры - потенциальные лиганды лектинов. Особое место среди эндогенных гликопротеинов занимает AGP, относящийся к белкам острой фазы воспалительного ответа, уровень которых в крови резко возрастает при патологии [Van Dijk et al., 1995]. На основе анализа генерации Н202 нейтрофилами человека под действием стимуляторов различной природы (VAA, дигитони-на и N-формил-метил-лейцин-фенилаланина - FMLP) нами обнаружено модифицирующее действие AGP и его гликоформ на изученные клетки.

На рис. 4 представлены соответствующие результаты, полученные для нефракцио-нирсванного AGP, которые свидетельствуют о существенном дозозависимом подавлении генерации Н202 под действием дигитонина, потенцировании эффекта VAA в области низких доз и относительно небольшом снижении ответа на FMLP. Наличие сиаловой кислоты в терминальной позиции углеводных антенн AGP было не критично для проявления ингиби-рующего действия на дыхательный взрыв нейтрофилов: в присутствии 250 мкг/мл асиало-AGP величина ответа клеток на дигитонин, VAA и FMLP составляла, соответственно, 12,2+0,6 %, 66,4+10,1 % и 58,6+12,9 % от контроля (п=3). Субфракции AGP с низким (AGP-А) и высоким (AGP-B) сродством к лектину Con А обладали подобным с AGP ингибирую-щим действием на дигитонин-индуцированный ответ нейтрофилов. Однако в отличие от AGP, AGP-A в области низких концентраций тормозил, а области высоких - ускорял генерацию Н202 вызванную FMLP. Особенностью AGP-B в сравнении с AGP было отсутствие потенцирующего действия на VAA-зависимую реактивность клеток.

Таким образом установлено, что наряду с эндогенными пектинами, AGP и его глико-формы обладают свойством модификаторов функционального ответа нейтрофилов, а именно генерации этими клетками Н202 при действии стимуляторов различной природы. Поскольку при воспалении и других патологических состояниях изменение активности нейтрофилов происходит на фоне значительных изменений в крови уровня различных эндогенных фак-

Рис. 4. Влияние AGP на генерацию Н202 нейтрофилами человека под действием различных стимуляторов. Клетки (2x106 кл/мл) суспендировали в ФСБ, рН 7,3 при 37°С; концентрация стимуляторов: VAA и дигитонин - 2,5 мкг/мл, FMLP - 40 нМ. Скорость генерации Н202 выражена в % относительно контрольного препарата клеток, не содержащего добавок AGP.

торов гликобиологической природы (гликопротеинов, лектинов, углеводспецифичных иммуноглобулинов), то можно сделать заключение о существовании в организме специфической лектинзависимой системы регуляции клеточных функций. Характерным свойством данной системы является возможность достаточного гибкого управления внутриклеточными процессами за счет прямых и конкурентных углеводспецифических взаимодействий модификаторов с мембранными рецепторами, а также образования активных и неактивных лектин-гликолигандных комплексов.

ЛЕКТИНЫ - ИНДИКАТОРЫ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА КЛЕТКИ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ

Высокая биологическая активность лектинов и их сродство к определенным гликоли-гандным структурам плазматической мембраны создают основу для использования этих веществ в качестве подходящих инструментов для анализа изменений функциональной активности клеток при действии экзогенных факторов различной природы. В настоящем разделе представлены результаты исследований лектинзависимой реактивности клеток (агрегации и генерации Н202) экспонированных к контролируемым физико-химическим воздействиям (тепловой шок, УФ-облучение, оксиданты и др.), модифицирующих рецепторный аппарат клеток и избирательно инактивирующих медиаторные системы клеток.

Нами установлено, что инкубирование суспензий тимоцитов и спленоцитов крыс, клеток HeLa, L-41 и Vero в течении 1 часа при температурах 0°С (тающий лед), 20°С, 37°С и 45°С в ФСБ сопровождается схождением (шеддингом) мембранных компонентов в среду и соответствующим термозависимым снижением количества гликопротеинов в клетках. Так, инкубирование клеток при 0°С и 20°С приводит к относительно незначительным изменениям содержания гликопротеинов в клетках, а максимальные изменения (40-50 % от контроля) наблюдаются при 45°С. Мембранные компоненты клеток, сошедшие в среду, обладают также эстеразной активностью, поскольку 1) в процессе инкубирования клеток HeLa в течение 20-120 мин при 45°С наблюдается увеличение скорости гидролиза ФДА в инкубацион-

Дигитонин VAA FMLP

1000

AGP, мкг/мл

ной среде и снижение таковой собственно клетками; 2) профили элюции на акрилексе Р-200 сулернатантов клеток L-41, тимоцитов и спленоцитов крыс с эстеразной активностью соответствуют фрагментам плазматической мембраны тимоцитов, содержащих лектиновые рецепторы [Безвершенко, Сидоренко, 1981]. Эти данные свидетельствуют в пользу термо-индуцированного шеддинга мембранных рецепторов, которые могут выполнять функции мембранносвязанных эстераз [Vega-Saenz de Miera, Rubalcava, 1988].

С учетом данных литературы о разрушающем действии теплового шока на рецепторы адгезии [Cress et al., 1990] можно было ожидать существенной модификации агрегаци-онных свойств клеток, подвергшихся термообработке. Действительно, мы наблюдали, что скорость агрегации тимоцитов и спленоцитов крыс, преинкубированных в течение 1 часа при разных температурах, под действием Сол А и WGA снижалась в сравнении с контролем (клетки при 0°С) и коррелировала с изменением содержания гликопротеинов в клетках. Следовательно, уменьшение агглютинабельности термообработанных клеток можно считать следствием сброса пектиновых рецепторов с клеточной поверхности.

Состав углеводных детерминант, выступающих в качестве лигандов для лектинов, на поверхности клеток характеризуется высокой степенью гетерогенности [Kobata, 1992]. В связи с этим возникает вопрос о взаимосвязи между содержанием основных и минорных гликопротеинов в клетках и их агрегационными свойствами. С целью получения ответа на него были детально изучены изменения в условиях гипертермии (45°С, 0-180 мин) агрегации тимоцитов крыс, клеток L-41 и HeLa под действием эквимолярных доз (2x10"7 М) трех лектинов с различной углеводной специфичностью и агрегационной активностью: PHA, SNA и Con А. Была обнаружена сложная динамика изменения скорости агрегации клеток в зависимости от лекгина (рис. 5). Кроме того, при сравнении между собой разных клеток наблюдались существенные различия в амплитуде и направленности агрегационных эффектов. Это свидетельствует о том, что вызванные гипертермией изменения лектин-индуцированной агрегации специфичны по отношению к нормальным и трансформированным клеткам и обусловлены различной скоростью схождения с клеточной поверхности специфических гликолигандных структур.

о.оч

О 20 40 60 80 100 120 Время, im

Рис. 5. Зависимость скорости агрегации культуральных клеток HeLa (106 кл/мл, ФСБ, рН 7,3, 37°С), индуцированной растительными лектинами РИА, SNA и Con А (0,2 мкМ) от времени пре-инкубирования при 45°С. V и Vo - величины скоростей агрегации клеток в опыте и контроле (клетки хранились на тающем льду).

.6

Наряду с растительными пектинами сульфатированные ПСХ (гепарин и декстран-сульфат-500) в концентрации 25-100 мкг/мл также вызывали агрегацию тимоцитов и слле-ноцитов крыс, которая имела необратимый характер и была чувствительна к действию факторов внешней среды и метаболических ингибиторов. В качестве рецепторов ПСХ, в частности гепарина, могут выступать эндогенные пектины, включая фибронектин, гепарин-связывающий белок плаценты человека, фактор роста фибробластов и др. [Бычков, 1983; Parish, Snowden, 1985; Kohnke-Godt, Gabius, 1989]. Структурная лабильность клеточных мембран играет ключевую роль в процессах ПСХ-индуцированной агрегации тимоцитов крыс, поскольку белок-сшивающий реагент глутаровый альдегид (0,12 %) практически полностью ингибировал эту реакцию. Обнаружен общий момент в механизмах агрегации лимфоцитов при действии сульфатированных ПСХ и растительных пектинов, состоящий в том, что эти процессы находятся под контролем протеолитических систем, так как трипсин ускорял, а соответствующие ингибиторы (соевый ингибитор трипсина и контрикал) тормозили агрегацию клеток.

Другим важным общим свойством лектинзависимой агрегации клеток была чувствительность к действию SH-реагентов (флуоресцеинмеркуриацетат, а-иодацетамид) и свободных тиолов (гпутатион, дитиотреитол), которые ингибировали эту реакцию. Следовательно, для обеспечения процессов лектинзависимой агрегации клеток необходим определенный уровень восстановленное™ SH-rpynn на поверхности клеток. Участие SH-групп в лектиновых реакциях клеток подтверждается также нашими данными об антиагрегацион-ном действии на лимфоидные клетки нетоксичесшх доз (<10 мкМ) сильного оксиданта КМп04, о снижении под действием VAA уровня свободных SH-групп в тимоцитах крыс и о подавлении образования межклеточных Lac'-контактов в присутствии NEM.

Рассмотренные результаты позволяют заключить, что агрегация клеток, опосредованная растительными и эндогенными пектинами, претерпевает кардинальные изменения в зависимости от степени и характера воздействия на клетки факторов внешней среды и может быть успешно использована при проведении соответствующих цитоэкологических исследований.

Лектинзависимая реактивность нейтррфилов в условиях теплового шока и УФ-облучения. Нейтрофилы содержат уникальную тетракомпонентную НАДФН-оксидазную систему, функция которой состоит в генерации АФК при активации клеток различными по природе стимулами, включая пектины. Для реконструкции полноценной дыхательной цепи необходимы мембраносвязанный флавопротеин цитохром Ь.245 (состоящий из двух субъединиц p22-phox и gp91-phox) и цитоплазматические белки с молекулярной массой 67 кДа (p67-phox), 47 кДа (p47-phox) и 22 кДа (ГТФ-связывающий белок) [Rotrosen et al., 1992; Koshkin et al., 1996]. Критическое значение для обеспечения функционирования НАДФН-оксидазы имеет интактность термолабильного белка p67-phox. Мы предположили, что использование пектинов в качестве стимуляторов дыхательного взрыва нейтрофилов позволит выявить нарушения метаболической активности клеток, связанные с данным компонентом.

Действительно, было обнаружено, что как тепловой шок (46°С), так и УФ-облучение (254 нм) полностью ингибировали в течение нескольких минут генерацию Н202 нейтрофилами чело-

века при действии \/АА (рис. 6), равно как и пектинов РНА и У\ЛЗА. При этом инакгивированные нейтрофилы сохраняли свои агрегационные свойства (см. рис. 6, заштрихованная область): скорость агрегации снижалась не более чем на 60 % после 30-минутной обработки клеток, а агрегационный ответ на РНА в течение первых минут действия повреждающих факторов даже возрастал. Следовательно, представляется маловероятным процессом инактивация генерации Н202 за счет шеддинга мембраносвязанного компонента НАДФН-оксидазы - гликопротеина др91-рЬох, который может выступать в качестве гликолиганда для лектинов. Однако, 5-минутного профевания нейтрофилов при 46°С достаточно для того, чтобы повредить цито-плазматический белок р67-рЬох [Епскзоп е1 а1., 1992]. Именно термоинактивация этого белка, а не предполагаемое антиоксидантное действие белков теплового шока [Мапс!оппеаи-Рапп1 е\ а!., 1988], является причиной ингибирования продукции супероксида нейтрофилами человека в ответ на форболовый эфир [ЕпскБоп е! а1., 1992]. Наши данные подтверждают, что аналогичное нарушение функции нейтрофилов при нагревании выявляется и с помощью лектинов. Поскольку функциональный ответ нейтрофилов изменялся подобным образом и при УФ-облучении, то можно заключить, что и в этом случае механизм инактивации клеток связан с повреждением р67-рИох.

Рис. 6. Влияние теплового шока (46°С) и УФ-облучения на скорость агрегации нейтрофилов человека (а) и генерацию Н202 (о) под действием \/АА (5 мкг/мл). Измерения проводили при 37°С в ФСБ; концентрация клеток была 106 кл/мп. По оси абсцисс - время воздействия на клетки повреждающего фактора; по оси ординат - скорость процесса, отн. ед.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что молекулярной мишенью действия как теплового шока, так и коротковолнового УФ-облучения в нейтрофи-лах является цитоплазматический белок р67-рЬох и что повреждающее действие данных факторов на клетки можно надежно определять с использованием лектинов в качестве стимуляторов НАДФН-оксидазной системы фагоцитов.

В целом, рассмотренные данные убедительно свидетельствуют о том, что лектин-зависимая реактивность нейтрофилов и лимфоцитов может быть положена в основу разработки высокочувствительных тестов для определения механизмов воздействия на клетки факторов внешней среды.

МЕМБРАННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОУЗНАВАНИЯ БАКТЕРИЙ И КЛЕТОК-МИШЕНЕЙ

Бактериальные лектины обеспечивают опсониннезависимое прикрепление бактерий к углевод содержащим структурам на поверхности клеток эукариотов [Sharon, 1987]. Несмотря на многочисленные исследования оставался неясным вопрос о роли структурного и метаболического факторов в этих реакциях.

Для того, чтобы определить место лектинов бактерий в вероятных каскадах клеточных ответов в организме, нами была разработана экспериментальная модель для изучения межклеточных взаимодействий бактерий E.coli и клеток иммунной системы в суспензиях. Оказалось, что при добавлении клеток E.coli к перемешиваемой суспензии нейтрофилов человека или тимоцитов крыс (1-10х106 кл/мл), находящейся при комнатной температуре, наблюдался рост величины светолропускания образцов при 590 нм вследствие образования в течение нескольких минут крупных, легко различимых визуально и под микроскопом, клеточных агрегатов. В основе данного явления - межклеточной агрегации - лежит лектин-зависимое прикрепление бактерий к клеткам-мишеням посредством известного бактериального лектина [Sharon, 1987], поскольку D-манноза в концентрации 2-50 мМ предотвращала процесс агрегации. Жизнеспособность E.coli имела существенное значение для проявления агрегационной активности, так как обработка суспензии бактерий такими бактерицидными воздействиями как нагревание (80°С) или УФ-облучение (254 нм) приводила к ин-гибированию реакции межклеточной агрегации.

Характерным признаком реакции маннозоспецифической агрегации тимоцитов крыс и бактерий было то, что ее скорость снижалась с ростом температуры в отличие от агрегации тимоцитов, вызванной маннозоспецифическим пектином Con А, скорость которой возрастала. Учитывая возможность термоиндуцированных изменений углеводсвязывающей активности лектинов [Curatolo, 1982], логично предположить, что соответствующие обратимые структурные изменения лектинов бактерий лежат в основе разрушения межклеточных контактов при высокой температуре. Для проверки этого предположения были проведены специальные эксперименты, при которых температуру образцов скачкообразно изменяли в ходе процесса агрегации. Оказалось, что межклеточная агрегация тимоцитов крыс и E.coli, протекающая при 16°С, была обратимой при повышении температуры до 50°С, так что процесс агрегации клеток сменялся клеточной дезагрегацией (рис. 7). Более того, реакция дезагрегации также была обратимой и сменялась агрегацией при повторном снижении температуры образца до 16°С. В тоже время, Con А-индуцированная агрегация тимоцитов, протекающая при 37°С, могла бьггь остановлена при снижении температуры, однако дезагрегация клеток при этом не происходила. Полученные результаты впервые демонстрируют, что изменения температуры могут влиять противоположным образом на формирование маннозоспецифических контактов тимоцитов крыс в зависимости от природы участвующих в этом процессе лектинов и выступают в качестве триггера реакции межклеточной агрегации, поскольку позволяют как "включить", так и "выключить" данный процесс.

Рис. 7. Агрегация и дезагрегация тимо-цитов крыс и Е.соН при скачкообразном изменении температуры. Бактерии (1,3x10° кл/мл) были добавлены к суспензии тимоцитов (5x106 кл/мл) в ФСБ при 16°С. В моменты времени, обозначенные стрелками, температуру образца скачкообразно изменяли не прерывая записи кинетических кривых

Агрегация Е.соН и тимоцитов крыс, представляющих собой нефагоцитирующие клетки, является в известной мере модельной системой. Более интересным и функционально значимым является взаимодействие в организме бактерий с фагоцитами. В этом случае первичное взаимоузнавание комплементарных структур на поверхности клеток завершается опсониннеза-висимым фагоцитозом и инактивацией бактерий [Маянский и др., 1986]. С учетом того, что фагоцитарная функция нарушается при ряде заболеваний [Дуглас, Куи, 1983], представляет интерес анализ взаимодействия бактерий и нейтрофилов, функциональная активность которых изменена под действием физико-химических факторов. С этой целью нами были изучены процессы агрегации/дезагрегации нейтрофилов человека и Е.соН в присутствии ингибиторов (азид и фторид натрия, амилорид, колхицин, ЫРвА, ЫЕМ, ТРР) и при низкой температуре (10°С), а также проведен анализ возможной роли Н2С>2 в процессах гликобиологического узнавания.

Было установлено, что й-манноза, добавленная в ходе развития процесса межклеточной агрегации нейтрофилов человека и Е.соН, вызывала дезагрегацию клеток, степень которой существенно зависела от температуры: при 37°С дезагрегация была небольшой, а при 10°С -быстрой и эффективной. Различия в величинах параметра дезагрегации клеток при 37°С (0,714±0,058) и 10°С (0,145±0,090) были достоверны (Р<0,001). Аналогично поведению охлажденных клеток, в присутствии метаболических ингибиторов (1,25 и 2,5 мМ ЫЕМ, 25 мМ ЫаЯ, 100 мкМ МОбА, 250 мкМ колхицина и 50 мкМ ТРР) агрегаты нейтрофилов и бактерий относительно легко разрушались при 37°С Р-маннозой. Рассмотренные эффекты по влиянию Э-маннозы на устойчивость агрегатов нейтрофилов и бактерий были полностью подобны дезагрегации тимоцитов и нейтрофилов, активированных УАА, под действием лактозы. Следовательно, ранее сформулированное положение об активации дополнительных адгезионных контактов между клетками при действии пектинов подтверждается в независимой модели межклеточных взаимодействий, основанной на другом типе углеводных контактов.

При добавлении Е.соН к суспензии нейтрофилов наряду с агрегацией клеток наблюдается генерация Н202, которая блокировалась в присутствии N00А и ЫЕМ. Углеводная специфичность этой реакции, также как и агрегации клеток, определялась маннозозависи-мыми межклеточными контактами, поскольку в присутствии 50 мМ Б-маннозы генерация Н202 не происходила. Следовательно, пектины бактерий следует рассматривать не только

5 10 15 Время, мин

в качестве пассивных участников процессов межклеточных взаимодействий, но и в качестве активаторов сигнальных процессов в клетках, а также потенциальных иммуномодулирую-щих факторов. В этом отношении лектинзависимое связывание бактерий с клетками-мишенями приводит не только к генерации АФК, но и росту [Ca2*], и дегрануляции клеток [Goetz, Silverblatt, 1987; Sandberg et al„ 1988; Mangan et al., 1989]. Более отдаленные реакции, развивающиеся при действии лектинов бактерий, включают стимулирование синтеза ряда цитокинов лимфоцитами [Schain et al., 1992].

Таким образом, как и в случае с эндогенными и растительными пектинами, образование межклеточных контактов с участием лектинов бактерий обеспечивает запуск адекватного каскада внутриклеточных сигнальных реакций. В целом, рассмотренный материал подтверждает положение об универсальном характере лектинзависимых взаимодействий, определяющих механизмы молекулярного узнавания поверхностных структур клеток и последующей клеточной сигнализации.

БИОМЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ЛЕКТИНОВ В КАЧЕСТВЕ СТИМУЛЯТОРОВ КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА

Совокупность полученных результатов в модельных системах логично подвела нас к проблеме использования лектинов в качестве стимуляторов клеточного ответа в клинических исследованиях. С учетом роли нейтрофилов как эффекторных клеток в неспецифических иммунных реакциях основное внимание было акцентировано на анализе лектинзави-симой реактивности этих клеток, включая такие клеточные ответы как агрегация, генерация АФК и дегрануляция клеток. Всего было обследовано 332 пациента с различными типами рака, склеромой и здоровых доноров. Минимальная обследованная группа пациентов составляла 10 человек, а количество использованных лектинов в каждой серии было от 3 до 5 типов. Основные результаты, свидетельствующие об информативности пектиновых тестов в качестве дополнительных диагностических средств, состоят в следующем:

• При анализе генерации супвроксида нейтрофилами установлена зависимость скорости этой реакции от гистологического типа опухоли. Селективное подавление функциональной активности клеток выявляется в ответ на Соп А у пациентов с немелкоклеточ-ной формой рака легкого, а также в ответ на Соп А и VAA у пациентов с раком легкого и ко-лоректальной карциномой в условиях химиотерапии, а также на галекгин-1 у пациентов с раком легкого. Ответ клеток на WGA, который специфичен к N-ацетилглюкозамину и сиа-ловым кислотам, не изменялся в изученных группах больных. У пациентов с раком молочной железы ответ нейтрофилов на все 4 изученных пектина не отличался от контроля.

• Генерация Н202 была подавлена у пациентов с раком гортани в ответ на VAA, тогда как этот параметр не изменялся у пациентов со склеромой. Применение WGA и STA не выявило отличий в генерации Н202 при раке и склероме. У пациентов с раком гортани наблюдалась более высокая агглютинабельность нейтрофилов, чем лимфоцитов. Дегрануля-

ция нейтрофилов (высвобождение лизоцима) в ответ на РНА, SNA, PSA и Сол А была снижена у пациентов со склеромой в сравнении с контролем, тогда как ответ на WGA не изменялся.

• Нейтрофилы пациентов с мелкоклеточным раком легкого характеризовались более высоким уровнем высвобождения эластазы под действием Con А, чем клетки в контроле. Степень Con А-индуцированного выхода из клеток лизоцима у больных с мелкоклеточным раком легкого была выше, чем у больных с немелкоклеточным раком. Ответ клеток на VAA не различался меиеду обследованными группами пациентов с раком легкого.

• Во всех изученных группах пациентов даже в контроле наблюдался значительный межиндивидуальный разброс измеряемых параметров. Этот факт, по-видимому, имеет важное значение при разработке схем клинического применения пектинов с иммуномоду-лирующими свойствами, поскольку индивидуальная восприимчивость различных пациентов должна учитываться для назначения данного типа терапии.

Таким образом, рассмотренные данные позволяют заключить, что в зависимости от типа рака происходит нарушение отдельных звеньев трансмембранной сигнализации в нейтрофилах, связанных с лектинзависимыми биохимическими путями в активации клеток, и что пектиновые тесты, основанные на определении функционального ответа клеток, могут быть положены в основу разработки комплекса новых методов диагностики и изучения механизмов патогенеза рака и бактериальных заболеваний.

Лектинзависимые реакции в известной степени моделируют функциональный ответ фагоцитов в организме опухоленосителя при связывании с опухолевыми клетками, экс-прессирующими на своей поверхности различные эндогенные пектины [Gabius et al., 1995]. В результате соответствующих межклеточных контактов трансформированных клеток с клетками крови и сосудистой стенкой продуцируются не только короткоживущие кислородные радикалы, но и, так называемые, активные формы азота, предшественником которых является новая сигнальная молекула - радикал монооксида азота (NO) [Moneada et al., 1991]. В результате химических превращений N0 в присутствии кислорода, в том числе с участием кислородных радикалов, образуются стабильные конечные продукты (N02" и NO3"), содержание которых в биологических жидкостях отражает степень активации NO-синтаз в организме. В связи со сказанным представляется обоснованным в применении к клиническим исследованиям нахождение корреляций между экспрессией эндогенных лектинов на поверхности клеток и уровнем N02Vi N03" в биологических жидкостях.

Общепринятым объектом патофизиологических исследований в применении к дифференциальной диагностике легочных заболеваний является жидкость и клетки плевральных экссудатов (ПЭ). Основываясь на гипотезе о том, что при раке легкого происходит активация процессов локальной продукции воспалительных медиаторов, способствующих неопластической трансформации клеток, был проведен комбинированный анализ лигандс-вязывающих свойств опухолевых клеток при раке легкого (п=103) и лейкоцитов в ПЭ больных с плевритами (п=17) и содержания [N02"+N03T в ПЭ с легочными заболеваниями (п=52). В ходе исследований было впервые обнаружено, что независимо от результатов ци-

тологического анализа ПЭ (наличие или отсутствие опухолевых клеток) суммарная концентрация [МОг'+ГЮз! У пациентов с различными гистологическими типами рака легкого была существенно выше, чем у больных с плевритами неонкологической природы (табл. 3).

Таблица 3

Содержание нитритов/нитратов в жидкости ПЭ больных с различными легочными

заболеваниями

Заболевание Количество [ИОг'+МОзг [ЫОг'+ЫОз"],

больных мкМ мкМ/мг белка

1 Плевриты неонкопоглче-гой природы 12 . ~ 12,6±10 7 0 303±0 247

2. Плоскоклеточный рак 37,4±12 9* 1,075±0,385*

2 1 ПЭ не содорда- опухолевые кг.етки 6 ?6 2*17."" 1 051±0417-

2.2. ПЭ содержат опухолевые клетки 1 44 5 1 215

3 Адонскаршномэ 20 35,6+13 0* 1,034±0,376*

3.1. ПЭ не содержат опухолевые клетки 4 £1 2±14 7"* 0 839±0 254"

3 2 ПЭ содержат опучогевыс клзттм 16 ЗС\0±12 3- 1 083^.0 332"

4. Мелкоклеточный рак (ПЭ содержат опухо- 1 27,9 1,504

левые клетки)

5, Крупноклеточный рек . з. 4 02 7г12.5" 0,711+0,090—

5.1. ПЭ не содержат опухолевые клетки 2 25 5±1 6 0,711±0,127***

5,2 03 одержат опухолевые тетки , . Я1ЙИ1 4/, 1 . . 13,711

6. Мезотелиома 6 41,3±25,5" 1,212±0,601*

У Лимфома 2 31,5x19,5 1,51640,589

7.1. ПЭ не содержат опухолевые клетки 1 45,3 1,933

7 ПЭ содержат опухолевый ^ге^ки 1 - 17.7 .. .....МАО.. .

8. Саркома (ПЭ не содержат опухолевые клетки) 1 90,1 1 865

Все пациенты с рагом легкого 40 37,6+17 0* 1,100±0,437*

Примечание: *Р<0,001, **Р<0,01, ***Р<0,05 в сравнении с величиной для плевритов.

Кроме того, оказалось, что между экспрессией рецепторов для дкЫАс и ганглиозида вМ-! на поверхности клеток ПЭ и содержанием [ЬЮ2"+М03"] в ПЭ имеется корреляционная связь. Так, у больных с плевритами уровень [1М02'+М0з"] в ПЭ для д1сМАс"-подгруппы был 17,3±1,0 мкМ (п=8), что существенно (Р=0,023) превышало таковой для д1сЫАс*-подгруппы (3,3±2,8 мкМ, п=4). В противоположность этим результатам при раке легкого (аденокарцинома) уровень [МОг'+Шз"] в ПЭ для д^Ас-подгруппы (30,8±11,5 мкМ, п=12) был существенно ниже (Р=0,032), чем таковой для д1сЫАс*-лодгруппы (43,2±12,1 мкМ, п=8). В отношении связывания с клетками вМ, достоверные различия были установлены только для больных с раком легкого. В СМГ-подгруппе больных с аденокарциномой суммарный уровень [М02" +N031 в ПЭ (30,3±10,6, п=11) был существенно ниже (Р=0,032), чем в СМ,+-подгруппе (42,5±13,0, п=9). Хотя молекулярные механизмы избирательного повышения уровня [1М02"

+Ы0з1 з ПЭ раковых больных остаются неизвестными, можно выделить наиболее вероятные причины этого эффекта: стимуляция ЫО-синтазной активности эндотелиоцитов или лейкоцитов под действием опухолевых клеток [ЛетЬа!а е( а1., 1994] и избыточная продукция N0 опухолевыми клетками, которые могут содержать в своем составе ЫО-синтазы [ТИотзеп е( а!., 1994; СоЬЬэ е1 а1., 1995]. Наши результаты позволяют конкретизировать возможный молекулярный механизм регуляции активности ЬЮ-синтаз в нормальных и опухолевых клетках, который состоит в нарушении процессов гликобиологического узнавания в соответствующих клеточных системах. Полученные данные однозначно свидетельствуют о повышение ЫО-синтазной активности у пациентов с раком легкого, которое зависит от экспрессии на поверхности клеток ПЭ рецепторов пектиновой природы, связывающих д!сЫАс и вМ,.

ВЫВОДЫ

1. Разработана научная концепция об универсальной регуляторной роли угпевод-специфических взаимодействий в процессах клеточной сигнализации, протекающих с участием различных растительных, эндогенных (животных и человека) и бактериальных пектинов. В рамках этих представлений охарактеризованы молекулярно-мембранные механизмы таких процессов как активация клеток иммунной системы под действием эндогенных галак-тозидспецифичных лектинов человека и животных; углевод-индуцированная дезагрегация клеток, активированных пектинами; термоиндуцированный шеддинг мембранных гликопро-теинов; межклеточная агрегация в смешанных суспензиях клеток иммунной системы и бактерий; активация ЫО-синтаз при раке легкого.

2. Показано, что сигнальная активность галактозидспецифичного лекгина омелы белой, который используется в качестве антиопухолэвого и иммуномодулирующего препарата, определяется его нетоксической углеводсвязывающей В-субъединицей. В отличие от токсической А-субъединицы нативный лектин омелы и его В-субъединица вызывали агрегацию различных типов клеток крови человека (нейтрофилы, лимфоциты, тромбоциты) и тимоцитов крыс и активировали ряд сигнальных клеточных ответов, включающих генерацию супероксидного анион-радикала и Н2О2, увеличение концентрации ионов С а2* в цитоплазме, изменение внутриклеточного рН и дегрануляцию клеток. Использование В-субъединицы пектина омелы в биомедицинских целях можно рассматривать в качестве способа снижения токсичности этого вещества.

Установлено, что критерием адекватного отбора растительных лектинов для биомедицинского применения является наличие у них стимулирующего действия на начальных стадиях процессов сигнализации в клетках, опосредованных низкомопекупярными вторичными мессенджерами клеточного ответа, а не степень агрегационной активности этих веществ.

3. Обнаружено явление усиления биосигнальными ингибиторами углевод-индуцированной дезагрегации клеток, активированных пектинами. Выявлен ряд соответствующих веществ (дифенилениодониум, ингибитор диацилглицеринкиназы, нордигидрог-ваяретовая кислота, трифторперазин, эмодин, Ы-зтипмапеимид, 0609, КТ5720, КТ5926 и

МК-866), которые потенцировали дезагрегирующее действие лактозы в отношении VAA-агрегированых нейтрофилов человека и тимоцитов крыс и на этой основе предложена схема каскада взаимокоординированных пострецепторных сигнальных реакций, ведущих к формированию лактозорезистентных межклеточных контактов.

4. Показано, что функциональная роль галактозид специфичных эндогенных пектинов животных и человека заключается в их активирующем действии на клетки иммунной системы. Обнаружено, что эндогенный галектин животного происхождения (CL-16) in vitro является полипотентным стимулятором реактивности нейтрофилов человека и тимоцитов крыс, подобным по сигнальной активности лекарственному лектину омелы белой. Установлено, что наряду с эндогенными пектинами, модулятором функционального ответа нейтрофилов, а именно генерации этими клетками Н202, является at-кислый гликопротеин сыворотки крови, маркерный белок острой фазы воспалительного ответа, и его гликоформы. Таким образом, эндогенные факторы гликобиологической природы образуют специфическую систему лектинзависимой регуляции клеточных функций в организме.

5. Лектинзависимая реактивность клеток (генерация Н202, агрегация) претерпевает кардинальные изменения в зависимости от степени и характера воздействия на клетки внешних факторов, избирательно модифицирующих рецепторные и функциональные компоненты клеточных сигнальных систем, таких как тепловой шок, УФ-облучение, оксиданты, протеолитические ингибиторы, сульфгидрильные и белок-сшивающие реагенты, что позволяет рассматривать лектины в качестве высокочувствительных индикаторов нарушений функциональной активности клеток.

6. Установлено, что в основе мембранных механизмов процессов межклеточной агрегации клеток-мишеней (нейтрофилы человека, тимоциты крыс) и бактерий Escherichia coli лежат маннозоспецифичные контакты, образование которых блокируется под действием бактерицидных факторов и селективных ингибиторов клеточного метаболизма. На примере тимоцитов крыс показано, что формирование маннозоспецифических межклеточных контактов в различных температурных диапазонах зависит от природы лектина и обнаружено свойство обратимости процесса межклеточной агрегации в смешанной суспензии бактерий и тимоцитов при повторяющихся увеличении и уменьшении температуры.

7. Показано, что применение разработанных пектиновых тестов в клинических исследованиях позволяет выявить существенные изменения эффекторных свойств нейтрофилов, сопряженных с продукцией клетками медиаторов воспалительных процессов, при раке легкого, гортани, прямой кишки, а также при хронических бактериальных инфекциях дыхательных путей. Обнаружено, что новым признаком рака легкого является повышенная суммарная концентрация [N02'+N03"] в жидкости плевральных экссудатов, причем величина этого параметра зависит от экспрессии углеводсвязывающих рецепторов для gicNAc и ганглиозида GMt на поверхности клеток плевральных экссудатов. Полученные данные свидетельствуют о диагностической ценности анализа нарушений гликобиологических механизмов функционирования клеток при различных типах патологии.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тимошенко А.В., Черенкевич С.Н., Камано С.С., Горудко И.В. Шеддинг гликопро-теинов и агрегация клеток // Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов: Тез. докл. Всесоюзн. конф.- Минск, 1988,-С. 133.

2. Тимошенко А.В., Камано С.С., Черенкевич С.Н. Факторы регуляции агрегации лимфоцитов, вызванной сульфатированными полисахаридами // Биохимия (Сборник статей).- Мн.: Университетское, 1989,- С. 103-108.

3. Тимошенко А.В., Черенкевич С.Н. Векторное перемещение рецепторов плазматической мембраны // Цитология,- 1989.- Т. 31, N3 9,- С. 1131.

4. Тимошенко А.В., Черенкевич С.Н. Агглютинация тимоцитов крыс, вызванная агрегированным конканавалином А // Биополимеры и клетка - 1989.- Т. 5, № 6,- С. 78-82.

5. Тимошенко А.В., Горудко И.В., Камано С.С., Черенкевич С.Н. Термоиндуцирован-ный шеддинг мембранных гликопротеинов // Вестн. Белорус, ун-та. Сер.2, хим., биол., географ,- 1990, № 1,- С. 34-36.

6. Тимошенко А.В. Анализ лектин-индуцированной агрегации клеток // Биохимия и биофизика клеточных процессов: Тез. докл. конф. мол. уч.- Минск, 1990,- С. 28.

7. Тимошенко А.В., Черенкевич С.Н. Влияние гипертермии на некоторые свойства мембран клеток Heia // Эксперим. онкология,- 1990,- Т. 12, № 3,- С. 63-65.

8. Тимошенко А.В., Черенкевич С.Н. Кластеры мембранных рецепторов и их движение в клетках /I Успехи совр. биол - 1990,- Т. 109, Вып. 2.- С. 206-218.

9. Тимошенко А.В., Черенкевич С.Н. Изучение мембранных гликопротеинов опухолевых клеток с применением лектин-индуцированной агрегации // Биохимия опухолевой клетки: Тез. докл. Всесоюзн. симпоз,- Минск, 1990 - С. 102-103.

10. Тимошенко А.В., Черенкевич С.Н. Рецепторные механизмы ранних стадий активации клеток // Экологические проблемы иммунологии и аллергологии: Тез. докл. 1 имму-нол. съезда Белоруссии.- Минск, 1990 - С. 22.

11. Тимошенко А.В., Герасимова Л.К., Колупаева Л.И., Черенкевич С.Н. Агрегация клеток как метод биомониторинга // Новые направления биотехнологии: Тез. докл. Всесоюзн. конф,- Пущино, 1990,- С. 91-92.

12. Тимошенко А.В., Герасимова Л.К., Колупаева Л.И., Черенкевич С.Н. Межклеточная агрегация тимоцитов и бактериальных клеток Escherichia coli // Биополимеры и клетка,-1991,- Т. 7, № 3 - С. 98-102.

13. Тимошенко А.В., Герасимова Л.К., Колупаева Л.И., Черенкевич С.Н. Воздействие факторов внешней среды на агрегационные свойства бактериальных клеток // Методы исследования и использования гидросистем: Тез. докл. научн.-метод. экол. конф,- Рига, 1991-С. 39-40.

14. Тимошенко А.В., Черенкевич С.Н. Индуцированная агрегация клеток // Укр. био-хим. ж -1991,- Т. 63, № 6,- С. 3-14.

15. Тимошенко А.В., Герасимова Л.К., Черенкевич С.Н. Способ определения агглютинации лимфоцитов // Авторское свидетельство СССР № 1677634. Заявлено 03.04.89; Опубл. 15.09.91, Бюл. № 34.- 2 с.

16. Ц1машзнка А.В., Камано С.С., Чаранкев1ч С.М. Механ1змы узаемадзеяння перман-ганату калю з л1мфощным1 клеткам! // Весц1 АН Беларуси Сер. Ь\т. навук,- 1994, № 2,- С. 72-75.

17. Тимошенко А.В., Фомичев А.Ю., Черенкевич С.Н. Влияние метаболических ингибиторов на устойчивость маннозоспецифических контактов Escherichia со//' К12 и нейтро-филов человека // Молек. генетика.- 1994, № 5,- С. 9-13.

18. Тимошенко А.В., Черенкевич С.Н. Гликобиологические аспекты активации дыхательной цепи фагоцитов // Биополимеры и клетка -1994,- Т. 10, № 1- С. 58-66.

19. Тимошенко А.В. Взаимодействие галактозоспецифичного пектина из омелы белой (Viscum album) с клетками крови и тимоцитами // Тез. докл. I съезда Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (22-23 ноября 1994 г.).- Минск, 19S4 - С. 172.

20. Тимошенко А.В., Черенкевич С.Н. Влияние гипертермии (45°С) на агрегацию лимфоидных клеток// Биофизика- 1995- Т. 40, Вып. 1.- С. 115-116.

21. Тимошенко А.В., Тимошенко А.П., Шляга И.Д., Тимошенко П.А., Черенкевич С.Н. Влияние пектинов на агрегацию клеток и генерацию Н202 нейтрофилами у пациентов с раком гортани и склеромой // Тез. докл. 8 съезда оториноларингологов Украины (5-10 июня

1995 г.).- Киев, 1995 - С. 382-383.

22. Тимошенко А.В., Согрина Е.Н. Флуоресцентный метод анализа влияния пектинов на менадион-зависимую генерацию перекиси водорода тимоцитами // Тез. докл. 2 Международной конф. по лазерной физике и спектроскопии.- Гродно, 1995,- С. 196.

23- Тимошенко А.В., Черенкевич С.Н. Генерация Н202 и агрегация нейтрофилов человека под действием пектинов II Гематол. трансфузиол.- 1995.- Т. 40, № 4,- С. 32-35.

24. Тимошенко А.В., Тимошенко А.П., Шляга И.Д., Тимошенко П.А., Черенкевич С.Н. Агрегация клеток и генерация перекиси водорода нейтрофилами при раке гортани и склероме // Здравоохранение (Минск).- 1996, № 2,- С. 10-12.

25. Тимошенко А.В., Горудко И.В., Черенкевич С.Н. Феномен углевод-индуцированной дезагрегации клеток, активированных пектинами // Тез. докл. II съезда Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (25-27 июня 1996 г.).- Минск, 1996,- С. 133.

26.Тимошенко А.В. Гликобиология и биомедицинское применение пектинов // Тез. докл. II съезда Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (25-27 июня 1996 г.).-Минск, 1996 -С. 31.

27. Тимошенко А.В. Влияние пектинов на активность NO-синтазы в культуре клеток J774 // Тез. докл. II съезда Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (25-27 июня

1996 г.).- Минск, 1996 - С. 132.

28. Тимошенко А. В. Гликобиопогические методы анализа в изучении патологии ЛОР-органов // Тез. докл. 4 съезда оториноларингологов Республики Беларусь (19-20 сентября 1996 г., Витебск).- Минск, 1996,- С. 123-124.

29. Тимошенко А.В., Горудко И.В., Тимошенко А.П. Использование пектинов в диагностике ЛОР-заболеваний // Тез. докл. 4 съезда оториноларингологов Республики Беларусь (19-20 сентября 1996 г., Витебск).- Минск, 1996,- С. 124-124

30. Тимошенко А.В. Гликобиология процессов генерации активных форм кислорода клетками // Кислород и свободные радикалы: Материалы международного симпозиума (под ред. М.В. Борисгока).- Гродно, 1996 - С. 118-119.

31. Тимошенко А.В. Применение эндогенных пектинов в клинической диагностике // Мед. новости (Минск).- 1997, № 4,- С. 16-20.

32. Тимошенко А.В. Гликобиология и биомедицинское применение пектинов // Вестн. Белорус, ун-та. Сер.2, хим., биол., географ,- 1997, № 2,- С. 38-47.

33. Timoshenko A.V., Gerasimova L.K., Kolupaeva L.I., Cherenkevich S.N. Protoin-carbohydrate interactions in intercellular aggregation // Abstracts of the 9th International symposium on affinity chromatography and biological recognition (Japan, September 24-28).-Yokohama, 1991.-P72.

34. Timoshenko A.V., Gabius H.-J. Efficient induction of superoxide release from human neutrophils by the galactoside-specific lectin from Viscum album // Biol. Chem. Hoppe-Seyler.-1993,- Vol. 374, No 4,- P. 237-243.

35. Timoshenko A.V., Cherenkevich S.N. Factors affecting the ability of cells to form aggregates via lectins II Abstracts of the 15th International lectin meeting (Hungary, August 2228).- Szeged, 1993,- P21.

36. Timoshenko A.V., Gabius H.-J. Measurement of lectin-induced superoxide release from human neutrophils// Lectins and Glycobiology (H.-J. Gabius, S. Gabius, Eds.).- Heidelberg: Springer Verlag, 1993,- P. 365-368.

37. Timoshenko A.V., Kayser K„ Drings P., Kolb G., Havemann K., Gabius H.-J. Modulation of lectin-triggered superoxide release from neutrophils of tumor patients with and without chemotherapy//Anticancer Res.- 1993,-Vol. 13, No5C.- P. 1789-1792.

38. Timoshenko A.V., Fomicfiev A.Yu., Cherenkevich S.N. Intercellular contacts of Escherichia coli with phagocytic and nonphagocytic cells // J. Mol. Recogn. -1993 - Vol. 6, No 1.- P. 17.

39. Timoshenko A.V., Gerasimova L.K., Kolupaeva L.I., Cherenkevich S.N. Mannose-specific intercellular aggregation of rat thymocytes and Escherichia coli triggered by temperature // Биополимеры и клетка -1994,- Т. 10, № 2,- С. 28-31.

40. Timoshenko A.V., Kayser К., Drings P., Gabius H.-J. Lectin-mediated pathways in activation of neutrophils from patients with lung cancer // J. Cancer Res. Clin. Oncol.- 1995,- Vol. 121, Suppl.2.-P. A46.

41. Timoshenko A.V., Kayser K., Drings P., Andre S., Dong X., Kaltner H., Schneller M„ Gabius H.-J. Carbohydrate-binding proteins (plant/human lectins and autoantibodies from human

serum) as mediators of release of lysozyme, elastase, and myeloperoxidase from human neutrophils // Res. Exp Med.- 1995,- Vol. 195, No 3,- P. 153-162.

42. Timoshenko A V., Gabius H.-J. Influence of the galactose-specific lectin from Viscum album and its subunits on cell aggregation and selected intracellular parameters of rat thymocytes // Planta Med.- 1995,- Vol. 61, No 2,- P. 130-133.

43. Timoshenko A.V., Cherenkevich S.N., Gabius H.-J. Viscum album agglutinin-induced aggregation of blood cells and the lectin effects on neutrophil function // Biomed. & Pharmacother.- 1995,- Vol. 49, No 3,- P. 153-158.

44. Samal А.В., Gabius H.-J., Timoshenko A.V. Galactose-specific lectin from Viscum album as a mediator of aggregation and priming of human platelets H Anticancer Res- 1995,-Vol. 15, No 2,- P. 361-368.

45. Timoshenko A.V., Kayser K., Kaltner H., André S., Gabius H.-J. Binding capacities of two immunomodulatory lectins, carrier-immobilized glycoligands and steroid hormones in lung cancer and the concentration of nitrite/nitrate in pleural efusions // Lung Cancer.-1996.- Vol. 14, No 1.- P. 75-84.

46. Timoshenko A.V., André S., Kaltner H., Dong X., Gabius H.-J. A galactose-specific endogenous lectin and sugar-specific antibodies induce the release of H202 from human neutrophils// Br. J. Haematol.-1996,- Vol. 93, Suppl. 2,- P. 99.

47. Timoshenko A.V., Loiko E.N., Cherenkevich S.N., Gabius H.-J. Effects of metabolic inhibitors and lectins on the menadione-dependent generation of H202 by rat thymocytes // Biochem. Mol. Biol. Int.-1996,- Vol. 40, No 6,- P. 1149-1158.

48. Timoshenko A.V., André S., Kaltner H., Dong X., Gabius H.-J. Generation of H202 by human neutrophils and changes of cytosolic Саг+ and pH of rat thymocytes in response to galactoside-binding proteins (lectins or immunoglobulins) // Biosci. Rep.-1997- Vol. 17, No 2 - P. 219-230.

49. Timoshenko A.V. Lectins as elicitors of cellular responses in cancer research // Abstracts of the First International Meeting in the Knowledge of Cancer Management (Austria, June 28 to July 1).- Vienna, 1997,- P. 67.

50. Gorudko I.V., Timoshenko A.V., Timoshenko A.P., Vacker A.V., Timoshenko P.A., Cherenkevich S.N. Lectin-induced degranulation of neutrophils from patients with ENT-diseases // Central East Eur. J, Otorhinolaryngology Head Neck Surg.-1997 - Vol. 2, No 1/2 (5/6).- P. 22-27.

51. Timoshenko A.V., Gorudko I.V., Kaltner H., Cherenkevich S.N., Gabius H.-J. Metabolic inhibitors as tools to delineate participation of distinct intracellular pathways in enhancement of lactose-induced dissociation of neutrophil and thymocyte aggregates formed by a plant lectin // Biochem. Mol. Biol. Int.-1997 - Vol. 43, No 3,- P. 477-487.

52. Timoshenko A.V., Timoshenko A.P., Gorudko I.V. Application of lectin tests to study the larynx carcinoma // Oncology in Otolaryngology: Abstracts of the 7lh International Symposium (Poland, June 27-29).- Poznan, 1997,- P. 182.

53. Timoshenko A.V., Kayser K., Gabius H.-J. Lectin-triggered superoxide/H202 and granule enzyme release from cells // Lectin Methods and Protocols (J.M. Rhodes, J.D. Milton, Eds.)/ Meth. Mol. Med.- Totowa: Humana Press, 1997.- Vol. 9.- P. 441-451

РЭЗЮМЭ Ц1МАШЭНКА Аляксандр Вженцьев1ч Актывацыя Ыгнальных лрацэсау у клетках пад уздзеяннем лекцЫау

Кпючавыя словы: лекцЫы, трансмембранная агнал1зацыя, нейтрафты, лмфацыты, актыуныя формы кгслароду, унутрыклетачны кальцый, дэгрануляцыя, 1тнкаб1ялопя, Viscum album L.

Аб'екгам1 даследавання 6bini лекцЫы (бялю, яюя звязваюць вугляводы) рознай пры-роды i клетю ¡муннай астэмы (нейтрафты i л'|мфацыты чалавека, тымацыты пацукоу).

Мэта дадзенай работы заключалася у вызначэнш бшлапчнай актыунасц1 i фЫялапчнай poni раслшных, эндагенных i бактэрыяльных лекцЫау на аснове анал1зу мехажзмау paHHix стадый лрацэсау трансмембраннай с'|гнал1зацы'| у клетках.

Асноуным1 метадам1 даследаванняу был1 слектрафатаметрыя, флуарэсцэнтны анал1з, вымярэнне святлорассеяння, центрыфугаванне, аф!нная храматаграфш.

У рабоце раслрацавана навуковая канцэпцыя аб ун'версальнай рэгулятарнай рол'| вугляводслецыфнных узаемадзеянняу у мехажзмах клетачнай агналйацьн. Вызначана, што актывацыя у клетках лрацэсау утварэння i/альбо выслабанення другасных мессенджа-рау (юны Са2+ i Н+, суперакадны ангён радыкал, Н202 i ¡нш.) зяуляецца агульнай прыкметай б1ялапчна актыуных лекцшау. Паказана, што ф1з1ялалчная значнасць лекавага лекцта аме-лы белай i яго В-суб'адзшю, якая звязвае галактазщы, а таксама эндагенных галакта-31дспецыфнных лекцшау жывел i чалавека вызначаецца ix актыв'|руючым дзеяннем на ад-лаведныя агнальныя працэсы у клетках ¡муннай астэмы. Знойдзена, што лекцш-¡ндуцыраванае фарм1раванне мЬкклетачных кантактау, устойл1вых да гаптэнавых вугляво-дау, падауляецца селектыуным> ¡Hri6iTapaMi ферментау унутрыклетачнага каскада а'гнальных рэакцый. Даказана абгрунтаванасць i лравамернасць выкарыстання лекцЫау у якасц| стымулятарау клетачнага адказу для даследавання малекулярных мехажзмау дзе-яння фактарау знешняга асяроддзя (цеплавы шок, УФ-апрамяненне i акаданты) на клети i парушэнняу функцыянальнай актыунасц1 нейтрафшау пры раку i бактэрыяльных захворван-нях.

BbiHiKi работы могуць быць выкарыстаны у б^ялогн, б'|ятэхнапоги, фармакапоги, ахове здороуя i народнай адукацыК

РЕЗЮМЕ

ТИМОШЕНКО Александр Викентьевич Активация сигнальных процессов в клетках под действием пектинов

Ключевые слова: лектины, трансмембранная сигнализация, нейтрофипы, лимфоциты, агрегация, активные формы кислорода, внутриклеточный кальций, дегрануляция, гли-кобиология, Viscum album L.

Объектами исследования были лектины (углеводсвязывающие белки) различной природы и клетки иммунной системы (нейтрофилы и лимфоциты человека, тимоциты крыс).

Цель настоящей работы заключалась в определении биологической активности и физиологической роли лекарственных, эндогенных и бактериальных пектинов на основе анализа механизмов ранних стадий процессов трансмембранной сигнализации в клетках.

Основными методами исследований были спектрофотометрия, флуоресцентный анализ, измерение светорассеяния, центрифугирование, аффинная хроматография.

В работе разработана научная концепция об универсальной регуляторной роли уг-леводспецифических взаимодействий в механизмах клеточной сигнализации. Установлено, что активация в клетках процессов образования и/или высвобождения вторичных мессенд-жеров (ионы Ca2t и Н\ супероксидный анион радикал, Н202 и др.) является общим признаком биологически активных лектинов. Показано, что физиологическая значимость лекарственного лектина омелы белой и его галакгозидсвязывающей В-субъединицы, а также га-лактозидспецифичных эндогенных лектинов животных и человека определяется их активирующим действием на соответствующие сигнальные процессы в клетках иммунной системы. Обнаружено, что лектин-иццуцированное формирование межклеточных контактов, устойчивых к гаптенным углеводам, подавляется селективными ингибиторами ферментов внутриклеточного каскада сигнальных реакций. Доказана обоснованность и правомерность использования пектинов в качестве стимуляторов клеточного ответа для изучения молекулярных механизмов действия на клетки факторов внешней среды (тепловой шок, УФ-облучение и оксиданты) и нарушений функциональной активности нейтрофилов при раке и бактериальных заболеваниях.

Результаты работы могут быть использованы в биологии, биотехнологии, фармакологии, здравоохранении и народном образовании.

SUMMARY

TIMOSHENKO Alexander Vikentjevich

Lectin-induced activation of signaling processes in cells

Key words: lectins, transmembrane signaling, neutrophils, lymphocytes, aggregation, reactive oxygen species, intracellular calcium, degranulation, glycobiology, Viscum album L.

The studied objects were lectins or carbohydrate-binding proteins of different origin and such immune cells as human neutrophils, lymphocytes, and rat thymocytes.

This study was aimed to disclose the biological activity and physiological role of herbal, endogenous and bacterial lectins on the basis of the analysis of early stage mechanisms of transmembrane signaling processes in cells.

The main methods of the study were spectrophotometry, fluorescent analysis, light transmission measurements, centrifugation, and affinity chromatography.

The scientific concept on the universal regulatory role of carbohydrate-specific interactions in cell signaling mechanisms was developed in the work. It was found that the activation of such cellular processes as synthesis and/or release of secondary messengers (Ca2* and H+ ions, superoxide anion radical, H202, etc.) was a common feature of biologically active lectins. The physiological significance of medicinal mistletoe lectin and its galactoside-binding B-subunit as well as of galactoside-specific animal and human endogenous lectins was shown to be determined by their impact on the respective signaling processes in immune cells. It was found that the lectin-induced formation of intercellular contacts, which were resistant to haptenic sugar, was suppressed by selective enzyme inhibitors of intracellular signaling pathways. The validity and expediency of application of lectins as cell response elicitors was proved with respect to study of molecular mechanisms of environment factors (heat shock, UV-radiation, and oxidants) action on cells and of disturbances of neutrophil functional activity at cancer and bacterial diseases.

The results of the work can be used in biology, biotechnology, pharmacology, medicine 3nd national education.

Подписано к печати 12. 02. 98. Формат 60*84/16. Бумага тип. N 1. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ N 320. Белгосуниверситет, 220050, пр.Ф.Скорины, 4. Отпечатано на ризографе ЦИТ Белгосуниверситета.