Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пектины в процессах межклеточного узнавания при фитофторозе картофеля

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Пектины в процессах межклеточного узнавания при фитофторозе картофеля"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА

На правах рукописи

ЛЮБИМОВА Наталия Викторовна

УДК 577.352.333 :581.2

ЛЕКТИНЫ В ПРОЦЕССАХ МЕЖКЛЕТОЧНОГО УЗНАВАНИЯ ПРИ ФПТОФТОРОЗЕ КАРТОФЕЛЯ

03.00.04 — биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена б Институте биохимии пл. А. Н. Баха АН СССР.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор 3. Г. ЕВСТИГНЕЕВА

доктор биологических наук, профессор 10. Т. ДЬЯКОВ доктор биологических наук Н. Л. КЛЯЧКО

Ведущее учреждение: Главный ботанический сад АН СССР.

Защита состоится «/3......>> уЖШЮ.^Ъ.. 1992 года в .. ю... часов па заседании специализированного совета (Д002.96.01) но защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии ил. А. Н. Баха АН СССР (117071, Москва, Леипискнй проспект, 33, корп. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1).

Автореферат разослан «...3......» ^мйо.р.^.............. 199.2.года.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук Т. А. ВАЛУЕВА

- I -

Общая характеристика работа

• '.Актуальность проблемы. Несмотря на то, что проблема иммунитета растений интенсивно изучается, практические потеря с/х растений от инфекционных болезной еще очень велики. Поэтому поиски новых подходов к решению этой проблемы л расшифровка биохимических п молекулярных механизмов устойчивости растений к патогенным микроорганизмам не теряют своей злободневности и в настоящее время.

Очевидным является тот факт, что растения, находясь в постоянном окружении многочисленных патогенных организмов, все-таки выживают и, как правило, остаются устойчивыми к инфекционным заболеваниям. При этом устойчивость не абсолютна, она выступает как результат сложных, многоступенчатых процессов. Анализ литературных данных (ШтллцкпЯ, Оэерецковская, 1961; Дьяков, 1983; Wit, 1986; Larcb et al., IS87; Любимова, Салькова, IS88) позволил нам выявить несколько ключевых этапов, определяющих результат инфицирования растений патогенными микроорганизмами .•

Рассмотрим их в самом общем виде на примере широко изучаемой в миро потосистемы: клубни картофеля - возбудитель фитофтороза Phytophthora infestaM, при отсутствии данных будем привлекать сведения, полученные на других системах:

1. Межклеточный контакт и распознавание партнеров.

2. Образование сигнальных молекул (олигосахаринов), трансакция сигнала на геном растительной клетки.

3. Экспрессия растительного гбнома; синтез de novo нуклеиновых кислот и белков, активация ферментов.

4. Включение реакции сверхчувствительности: гибель инфицированных растительных клеток, накопление в них фитоалекскнов, гибель патогена.

5. Подавление рэакции сверхчувствительности судрессорами патогена.

Наиболее изученными являются последние стадии инфицирования растения, связанные с проявлением устойчивости хозяина к заболеванию в вице реакции сверхчувствительности (СВЧ). Реаютя СВЧ -это наиболее распространенная форма, фитоиммунитета; она заключается в быстрой гибели лервых инфицированных клеток растения, ка-копленип в них антибиотических веществ - фитоалекслнов (OA) л последующей гибели патогена.

Реакцию СВЧ в картофэле вызшзазт индуктор гриба - слохный липо-глико-протеиновый комплекс, обнаруженный у всех рас возбудителя фитофтороза, как поражающих картофель (совместимость), так и на поражающих (несовместимость) (Чалова, Озерецковская, 1984; Kuc, Ruch, 1985; costock et al., 1986). Ответственным за гибель растительных клеток и накопление ФА является ляппдный ког.шонент индуктора, а именно, Cgg-rowinenoBue кирные кислоты. Углеводный компонент сам на вызывал реакцию СВЧ, но в насколько раз усиливал эффект действия лнпидов. Структура и функции его но выяснены.

Специфичность взаимоотношений сортов картофеля и рас патогена определяется,по-видимому, на включением устойчивости, а. оо подавлением. Установлено, что возбудитель фитофтороза содержит су-прессор - цизкомолакулярный водорастворимый ß-1,3-1, б-глюка н, подавляйщий в совместимой комбинации раса-сорт реакцию СВЧ в картофеле (Озерецковская, Васюкова и др., 1982; Docke et ol.,I985).

Механизм действия индукторов и супрассоров гриба на растительную метку но выяснен. Однако есть основания полагать, что индуцирование устойчивости основано на экспрессии генома растительной клетки, следствием чего является синтез do novo нуклеиновых кислот п белков, активация ряда ферментов, образование белковых ингибиторов протеаз и окстролшбогатцх гликопротоинов, накопление атклека, лигнина, генерация суаероксадшх анионов и т.д. (Dixon, 1906; Halton et al., 1987i Teapleton, ЬашЪ, 1988;.

Передачу сигнала на геном, возможно, осуществляют олигосаха-рины, т.е. пизкомолекулярныа фрагменты ß-глюкаиов, хитина и хи-тозана, олигогалактуронидов (Albershoim ot al.,1937,Kyan, 1937).

Общепризнано, что все эти процессы инициируются на первом этапе инфицирования растения патогеном, прп межклеточной контакте и распознавании партнеров. Однако этот этап остается до настоящего времени наименее изученным. Предполагается из основании исследований под микроскопом и работ с протопластами из картофеля, что межклеточное узнавание и индуцирование устойчивости растения к заболеванию являются результатом взаимодействия физиологически активных клеточноповерхностншс метаболитов возбудителя фитофтороза п компонентов цптоплазматической мембраны (плазьала'^их) клеток картофеля (Kitasawa et al., 1973; Процешсо, 1978; Любимова, Озе-рещсоЕ-ская, 1984). Однако оставалось неизвестным, кате метаболиту патогена п компоненты растительной плазмалеммк участвуют в этом взаамодпйствлп.

Предполагается, что в процессах меулслаточного узнавания могут принимать участив лектшш lEtsier, 1931; Eolwcll, 1987; Pusztai, 1987). Лектшш - это белки пли гликопротошш, способные специфически связывать определенные углеводние структуру, но вызывая их химического превращения (Kocoureic, 1903). Лектшш называют такка агглютининами, поскольку они способна агглютинировать молекулы и клетки. Углеводы, специфически связывавшиеся с лектшшмя и подавляющие их гen агглютинирующую активность называют гаптенами.

Способность лектинов "распознавать" тонкие различия в структуре ух'леБодов послужила основанием для первого предполочсения об их участии в процессах "узнавания" молекул п клеток (Aiteraheim, 1975).

В системе in vitro водорастворимый лектин клубной картофеля (ЛКК) агглютинировал цистоспоры возбудителя фнтофтороза гак пора-кающей, так и непоражающей дашшй сорт картофеля расц патогена. Меченый флуоресцпзшом лектин связывался на поверхности гиф обоих рас гриба. Гаптен локтина (олнгомер lï-ацетил-Д-глюкозамина с длиной цепи 2-5 остатков, связанных по в-1,4 связям) пода шил специфически эти реакции (Furuichi et al., 1980).Более того, показано, что ЛКК связывался с индуктором гриба, при этом образовавшийся комплекс выпадал в осадок и терял ФА-индуцируюшую активность Юагаз, Kuc, IS8I). Из 30 соединений углеводной природа только гаптэп ЛКК подавлял образование ФА при инфицировании картофеля фитофторой (Kozue, 1980).

Изложенные данные дают основание полагать, что в процессах межклеточного узнавания при фитофторозе картофеля могут принимать участие мембранные рецепторы растительной клетки локгиновой природы. В этом случае становится понятным, почему растение способно "узнавать" широкий набор патогенных микроорганизмов (грибов, бактерий, вирусов), включая в ответ один и тот ке механизм зашиты -реакцию СВЧ. Очевидно, в силу своих свойств один и тот же лектин-рецептор растения способен специфически связывать определенную углеводную группу различных поверхностных глшюконыогатов многочисленных микроорганизмов, инициируя включение одного и того же защитного механизма.

Совокупность литературных данных позволила, нам предположить, .

что :

I. В узнавании растением-хозяином патогенных микроорганизмов

на клеточном уровне в ряде случаев могут участвовать фптолектиш.

2. Возможно, что межклеточное взаимодействие партнеров определяется специфическим взаимодействием рецепторов лектиновой природы цитоплазматической мембраны растительной клетки с углеводни-мн лигандами клеточной поверхности патогена.

3. Есть основания полагать, что лвктин-угловодноо взаимодействие но определяет специфичности сортов растения и рас патогена. Более вероятно, что оно необходимо для включения общего неспецифического механизма устойчивости растения к неблагоприятным внешним воздействиям.

4. По аналогии с системами животных клеток представляется вероятным, что роцептор-лягандное взаимодействие лццуцирует неспецифическую устойчивость хозяина посредством участия определенных мембранных процессов. Следует отметить, что никаких сведений об этих процессах в растительной клетке и их связи с механизмами фитоиммунлтета не имеется. Более того, не разработаны даке мото-дическис подходы к их изучению.

В настоящей работе предприняты попытки приблизиться к пониманию молекулярных процессов мекклеточного узнавания и индуцирования устойчивости растений-хозяев к патогенным микроорганизмам, что до последнего времени оставалось нэ ясным. Такое исследование является актуальным в плане решения как фундаментальных, так и практических задач.

Цель и задачи исследования. Цель состояла в изучении возмоа-пости участия лектин-углеводного взаимодействия в межклеточном узнавании при фитофторезе картофеля на уровне плазмалеадш растительной метки, а также исследовании мембранных эффектов, имеющих место в процессе индуцирования неспецифической устойчивости растеши к неблагоприятным факторам воздействия.

Б соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи исследования:

- разработать методы выделения п характеристики, а такае изучить свойства клеточноповерхностных структур и полимеров взаимодействующих партнеров патосистемы;

- исследовать характер и параметры их взаимодействия в устойчивой и восприимчивой комбинации раса гриба-сорт картофеля;

- выявить и охарактеризовать предполагаемые структурные и функцЕоналыгап изменения свойств плазмалеммы растительной клетки.

- изучить иммунные свойства лектина картофеля и их измоно-Ш!8 под влиянием специфического углеводного лиганда;

- определить возможные структурные и ¡информационные измепа-ния молекулы лектина под влиянием связивания угловодного лиганда.

Научная новизна работы. Установлены общие положения участия лектпн-углезоднэго взаимодействия в процессе межклеточного узнавания растошюм-хозяпном патогенных микроорганизмов, индуцпрова-ния определенных мзмбарикых аспектов, регулирующих посцецпфичсс-кую устойчивость растопил к инфекционным заболеваниям.

Убедительно показано, что лектин картофеля участвует в межклеточном узнавании возбудителя фитофтороза Р. 1г^е:Пап;; на уровне контакта шю ома леммы растительной клетки с моточной поверхностью внедряющегося патогена. При этом лектшш плазмзлемми картофеля специфически связываются с углеводными лагандами поверхностных глккоиептадов гриба. Сшзивание медиируется трштофанилями лектина и остатками и-ацетпд-Д-глюкозамина гликопептидов. Лектин-углсводное взаимодействие пмзет место как в устойчивой, таг: п в восприимчивой комбинации раса патогвна-сорт картофеля; при этом оно значительно интенсивнее в устойчивой комбинации. Впервые проводе по исследование мембранных эффектов, имеющихся при переходе растительной ¡метки пэ исходного "неактивного" состояния восприимчивости к патогену в "активное" состояние устойчивости, индуцированном патогеном или раневым стрессом. Установлено, что при этом имеет место повышение пропицаеьости мембран, активация синтеза плг.змалешшх белков, в том числе лектинов, повышение локти-новой активности и активности мембрапоспязашшх ферментов. Обна- • рукеио изменение структуры и свойств липидного матрикса плазма-леммы, увеличение его "текучести". Впервые установлено, что воздействие специфического углеводного лиганда на лектии вызывает локальные изменения мембранного рецептора и увеличение степени ого экспонирования. Обнарукенные мембранные эффекты усиливают лек-тин-углеводное взаимодействие при мааклоточном узнавании партнеров.!! способствуют повышенной реактивности хозяина в ответ на инфицирование патогеном. На основании полученных данных предложена гипотетическая схема, в которой впервые сделана попытка показать взаимосвязь поверхностных межклеточных взаимодействий при инфицировании растений патогенными микроорганизмами й индуцированных имя мембранных процессов с развитием защитных реакций хозяина п

п оявяением вторичных стрессовых метаболитов-фитоалекспнов.

Практическая значимость. Проведенные фундаматналыше исследования дают теоретическое обоснование для разработки новых подходов к практической защите культурных сельскохозяйственных растений от различного рода неблагоприятных внешних воздействий, в том числе и от инфекционных болезней. Научным обоснованием таких методов может служить факт повышения функциональной активности внутриклеточных процессов, активация неспецифической устойчивости растения, определяемые включением и действием предшествуюцих генетически запрограммированных механизмов клетки, направленных на ее выживание в неблагоприятных условиях. Источниками активного воздействия на растение могут слукить хитин и хптозан, содер-каащеся в значительных количествах в дешевых отходах гарских продуктов. £рагментн этих соединений, воздействую на специфический мембранный рецептор (лектпн) растительной клетки, по-видимому, приводят в действие неспецифпческие защитные механизмы растения. Следствием такого воздействия мохет быть но только индуцирование неспецифаческой устойчивости с/х культур к различного рода неблагоприятны:,! внешним факторам, но и повышение энергии прорастания, одновременность всходов и повышенна урожая. Предполагаемые биологические препараты будут обладать экологической чистотой.

Разработанные методы иммунофермонтного анализа лектиков-ре-цапторов патосистемы могут слушть основой для создания експресс-о про делений этих соединений в слокных биологических системах. -ею предположить, что их содержание в мембранах растительной кле~ ткя, активность синтеза п эффективность функционирования могут иметь пряьзуы коррелятивную зависимость со степенью устойчивости сортов растения к неблагоприятны:,! факторам воздействия.

/пробашкг работы,. Основные положения диссертации долог.енк на Международном Ботаническом конгрессе (Ленинград, 1975), Всесоюзных совеаениях по иммунитету растений к паразитарным грибам (Москва, 1581; 1988). УП Всесоюзном совещании по иммунитету -с/х растений к болезням и вреди у елям (Омск, 1£»31), Всесоюзном симпозиуме "Изменчивость фптопатогенных микроорганизмов в связи с селекцией с/х культур" (Рига, 1985), Всесоюзном симпозиуме по химии п. йу,07£1-л\ углеводов (Пул и но, 1982; Тбилиси, 1987), IX Международном симпозиуме "Гллкоконъягаты" (Лилль, 1987), Республиканской кокЗерешкв "Изучение п применение лектинов" (Таллин, 1Р38), Ре?~

100 мл

Рис. 4. Выделение и очистка водорастворимого лектина картофеля:

'а - аффинная хроматография препарата на хитине; 6 - гель-Фильтрация препарата на сефадексе 6-75: I - абсорбция при 280 нм; 2 - агглютинация (А) эритроцитов кролика пои соответствующей кратности разбавления фракции; 3 - рН элюа-та; в - диск-электрофорез в ПЛАТ в присутствии БЗ-Иа и в-пвркантоэтанола препаратов лектина. М-метчики: фосфорц-лаза В-94 кД, альбумин-68 кД, овальбумнн-43 кД, карбоан-гпдраза-30 кД, шшибитор трипсина-21 кД, лпзоцим-Г4,3 1сД

чешшй лектин равномерно связывался,на поверхности гифы гриба, Эго взаимодействие имело место' как в устойчивой, так и в восприимчивой комбинации раса-сорт. Обе реакции специфически подаалял гаитен лектина картофеля. Зти данные трактуются в пользу лаитяа-углеводного характера взаимодействия шшзмалегяли картофеля о вда-

- 14 -

точноповерхностными метаболитами гриба.

Изолированные клеточноповерхностиые глпкоюлгьюгати гриба, меченые фщуорохромтриазинвлом (ОеяеЫег, агаж^ь, 1973) связывались с плазмалеммой картофаля (рис. 5). Графики имели дао точки перегиба, что свидетельствует в пользу нескольких различных цен--тров связывания на плазмалаше. Это соотватствуат гетерогенности -использованных препаратов суммарных гликоконъюгатов, содержащих, по крайней мере, два различных соединения: в-глюканы и глпкопеп-тиды, очевидно, взаимодействующие с различными центрами на плаз-малемма. Взаимодействие имело место как в устойчивой, так и в восприимчивой комбинации раса-сорт, однако в устойчивой несколько сильнее.

%?0 495

60

40

20

Рис. 5. Взаимодействие мечоных

фиуорохромтрпазшшлом глп-конъюгатов ТГК) р. tanз с препаратом плазма-леммы картофеля (ППК): I -контроль (ГК); 2 - ГК несовместимой расы + ППК: 3 - ГК совместимой расы + ППК

10 50

100 мкг

Хорош известно, что связывание лектшюв со специфическими углеводным лигандами приводит к ингиблрованию их гемагглютиняру-щай активности (Линавич, 1979; Луцик, 1981).

Специфические для лектина картофеля гаптеш (олигомерц ИсКАс; при добавлении к ЛКК подавляли его гомлгглюгинврущую активность (табл. I). При этом с увеличением дайны цёпп олигома-ра требуется меньшее аго количество для полного подавления активности препарата. Мономер, хлорированные производные С1сКЛс п целый набор других моно- л олигосахаридов не влияли на гемагглюти-ияруюцув активность ЛИС.

Епервно нами установлено, что плазмалеммные ыперовезикули картофеля способны к гемагглютпнащш. Это прямо указывает на па-

личпа лектинов в этой субклеточной структура. Агглютинирующая активность плазмалашн специфически подавлялась гаптенами лектина картофеля, что указывает на сходство их углеводной специфичности. Ваяно отметить, что лектиновая активность раневой плазмалашн в 5 раз выше, чем нативной, и раневая плазмалемма связывала в 5 раз больше хитотбтраозы, чем нативная.

Таблица I. Подавление лектиновой активности препаратов

Лектиновый Лигянтт . мкг углевода

препарат вд на I мкг белка

(ПсЯАс О

Лектин (6ЮНАс)2 250

(МсНАс) ^ 30

(ИсНАо). 4

нативная 01сНАс 0 (а1сЛАо). 7 Плазмалемма----------*-----------------

раневая 01сШ° 0 _(СИНАс) 4_35

глюканы гриба О

совместимой расы 8

несовместимой расы 20

нативная гликопептада совместимой расы 8

Пяазм?леима ----------

глюканн гриба О

1 раневая глнкопмтида'^¿о^шсммой рам* ' ' '20 ' '

несовместимой расы 100

Изучено влияние метаболитов гриба на гемагглютинаругалую ак- ' тивность нативной и раневой плазмалемма картофеля, в-глюканы гриба, на имеющие в своем составе углеводных групп, специфических для лектина картофеля, не влияли на активность ни лектина, ни шгазмалэммн. Гликопептиды, имеющие в своем составе специфическую для лектина картофеля углеводную группу, подавляли агглютинирующую активность как лектина, так и плазм/злвмш. Важно отаетить, что шгазггалвшаа картофеля овязивала гликопептиды несовместимой расы в большем количества, чои совместимой. Болеа того, раневая плазмалемма связывала больше.углеводов, чем нативная, и бича более чувствительна в распознавании метаболитов порааающай а непо-рааакцей расы патогена.

Таким образом, очевидно, что взаимодействие плазмалвкмн картофеля с клеточноповерхностншги гликопвптидами патогена носит лек-

тин-углеводиый характер и медиируется остатками N-ацетилглюкоза-мина.

Ранее (A3hford et al., 1982) в модельных опытах было показано, что специфическое связывание гапгена с лектином не только подавляет его агглютирующую активность, но и тушит флуоресценцию его триптофаниловых остатков. Ладыженская и соавт. (1986) выявили, что микровезикулы плазмаламмы картофеля также обладают триптофа-ниловой флуоресценцией. Мы использовали это явление для дальнейшего исследования взаимодействия белков плазмалеммы картофеля с поверхностными гликоконъюгаташ патогена.

Как следует из данных, приведенных на рис. 6,а, мономер и тэ-трамвр N-вцвтилглюкозашша тушили флуоресценцию белков плазмалеммы картофеля с разной интенсивностью и с четким различием по характеру тушения. Мономер, не влияющий на лектиновую активность ЛКК, слабо тушил флуоресценцию плазмалемшшх белков, при этом графики тушения имели линейный характер или поломтельное отклонение в координатах Штерна-Фольмара, т.е. в данном случае имело место слабое взаимодействие балок-углевод, затрагивающее Есе триптофа-нилы белков,в одинаковой отепени доступные для этого лиганда. То-трамер, специфический гаптен ЛКК, интенсивно тупшл флуоресценцию белков плазмалеммы, графики тушения имели отрицательное отклонение в тех sä координатах. Это 'свидетельствует о том, что хятотот-раоза с высокой эффективностью взаимодействует только с некоторыми триптофанилами мембранных белков, доступными для этого лиганда и, очевидно, определяющими лектиновую активность плазмалеммы. Та-кпм образом, согласно тооратическим представлениям о механизмах тушения флуоресценции белков (Бурзтойн, 1976; Eftlnk.Ghlron, 1976; Лакович, 1986), связывание мономера п тотрамера и-ацетилглюкоза-млна с плазмалеммои картофеля затрагивает различные фяуорофоры плазмалеммных балков. При этом лектин-углеводное взаимодействие характеризуется отрицательным отклонением графиков тушения флуоресценции в координатах Штерна-Фольмера.

На рис. 6,6 представлены графики тушеная флуоресценции плазмалеммы картофеля гликотэньюгатами патогена. Графим тушения имели отрицательное отклонение, что характерно для лектин-угловодпо-го взаимодействия. С шгазмалеммой картофеля взаимодействовали глс-коконьюгаты как поракагз}ей,- так и копорагающей расы гриба. При этом, как и в предыдущих опытах, связывание было более интенсивным в устойчивой комбинация раса-сорт, чем в восприимчивой. Еаино

подчеркнуть, что раневая плазмалемма интенсивнее связывала углеводные лиганды как модельные, так и грибные, чем нативная. Более того, рановая плазмалемма была более чувствительна в распознавании метаболитов поракающей и непораиющей расы гриба, чем нативная..

Рис. 6. Тушение флуоресценции плазмаломмы картофеля: а - олигоме-рамп М-ацатилглюкозамина, I - раневая плазмалемма + (01сНЛо)4, 2 - нативная плазмалемма + (оХсИАс)^, 3,- раневая плазмалемма + 01сНЛо, 4 - нативная плазмалемма + МсИАс; б - гликоконъюгатами Р. 1пГезгапзД - раневая плазмалемма + гликскконъюгаты несовместимой расы, 2 - нативная плазмалемма + гликоконъюгаты несовместимой расы, 3 -раневая плазмалемма + гликоконъюгаты совместимой расы, 4 - нативная плазмалемма + гликоконъюгаты совместимой расы

Гликопептнды гриба обеих рас, которые, как показано ранее, подавляли лектиновую активность ЖК и плазмалеммы, тушили флуоресценцию белков такке по лектин-углеводному типу связывания: графи га тушения имели отрицательное отклонение, а-глюканы гриба, ко-, торые не влияли на лектиновую активность препаратов, слабев тушили их флуоресценции, графики имели линейный характер или положительное отклонение в координатах Штерна-Зольмера.

Таким образом, глякопоптиды меточной поверхности возбудителя фитофтороза имеют в своем составе специфическую для лектяна плазмалеммы картофеля углеводную группу, активно взаимодействуют ■с ЛКК и изолированной плазмалеммой, подавляют при этом их лектиновую активность, специфическую к этой углеводной группе, тушат траптофаииловую флуоресценцию препаратов определенным образом, характерным для лектин-углеводного связывания. Следовательно," ' / . глшсопептиды грпба связываются о плазмзлвммой картофеля росредот-' ' еом лектин-углеводного взаимодействия, которое медиируется трип-:тофанилами мембра[шого локтина и остатками п-ацэтилглюкозамипа 'гликопептидов. ,

В то ке врамя в-глюканы гриба, его предполагаемые иммуносуп-рассоры на содержат специфических для лактина картофеля доменов, не подавляют лектяновую активность ЛКК и плаз мал емш картофеля, слабев и иным образом тушат их флоуресценцию. По-видимому, глша-ны гриба токе взаимодействуют с плазмалеммой растения-хозяина, но очевидно, с рецепторами иной, не лектиновой природы.

Взаимодействие плазмалеммных лектинов картофеля с клеточно-поверхностними гликопвптидами патогена происходило как в устойчивой, так и в восприимчивой комбинации инфицирования раса-сорт, однако интенсивнее - в устойчивой.

Особенно ваяно отметить, что раневая плазмалемма, обладающая большой лектиновой активностью, эффективнее связывала специфические углеводные лиганды и била более чувствительна в распознавания метаболитов поражающей и непоражающей расы гриба, чем натпвная.

2.3, Изменение свойств плазмалеммы клеток картофеля/ под влиянием раневого стресса и иетаболитов возбудителя фптофтороза

Что se определяет большую реактивность раневой плазмалеммы клеток картофеля, характеризующихся повышенной метаболической я функциональной активностью, обладающих большей устойчивостью к патогену, чем нативная ткань?

Mu провали сравнительное изучение свойств плазмалеммн картофеля по проницаемости, активности синтеза плазмалеммных белкой л их составу, структуре и свойствам липидного магрпкса мембраны к активности транспортных А1Фаз, а тагске их изменение под влшпшеи раневого стресса шш метаболитов патогена.

Биосинтез шгазмалемнш: белков изучали по включении радиоактивного предшественника (14С-лейцина) in vivo в ткана сЕегенаре-занных дисков из клубной картофеля и шшубированшЕ (стареющих) после нарезания в тачание 16 ч. Затем из тканей вэдодяли различные субклеточные фракции, б том числа и препарат плаомглс^о;. Определяли поглощение матки тканями 'и еа включение в балки различных фракций. Кслэтеняе метки в белка плазмалеммы оказалось оптимальным при двухчасовой инкубации ткшш о маткой. Циклогексимзд к сштешо температуры до 4° в период инкубация паш с меткой полностью подавляли включение метки в белки, доглощшш матки при этом бшо подавлено на 40-50%. Лктиномициа 'Д'прзкгическ!; полностью подавлял шдаеше метки в белки све^енарвзашшх дисков л

только на 4С$ подавлял включение мотки в белки стареющих дисков. Поглощение метки при этом было подавлено на 40 и соответственно.

Из данных табл. 2 очевидно, что при активации тканой клубней картофеля раневым стрессом значительно усиливаются интенсивность поглощения ^-лейцина тканями и активность включения матки как в суммарные белки, так и в белки плазмалемми, что показано впервые. Обращает на себя- внимание большая удельная активность включения метки в плазмалешные белки по сравнению с суммарными водорастворимыми белками.

Таблица 2. Влияние раневого стресса на синтез балков клубней картофеля

Поглощение "^-лейцина, Включение ^С-лейцина, Состояние ткани имп/шн на I г ткани имп/мин на 1„мг белка

х Ю-3 х 10~3

суммарные плазмалеммные балки белки

Сваяенарезшшыс 1380 + 53 6+3,0 50 + 7,0

диска ■

Стареющие диски • 7740 + 68 256+29,0 790 + 36,0

Установлено, что в первые четыре часа после нарезания дисков активность синтеза плазмалеммных белков была- низкой (период выделения нативной, исходной плазмалеммы). Далее активность синтеза этих белков резко возрастала и стабилизировалась на протяжении 925 ч (период, выделения раневой плазыалешы).

Изложенные данные приводят к выводу, что в условиях раневого стресса в клубнях картофеля резко усиливается проницаемость меточных мембран и активируется синтез белков плазмалемми. Показана чувствительность синтеза белков к температуре, цпклогекоимиду, актиномлцину Д. Исследована кинетика и динамика процессов. Полученные результаты далл нам основание полагать, что индукция синтеза плазмалеммных белков регулируется на уровне транскрипции и проходит на 80 3 рибосомах; дяя встраивания вновь синтезированных белков в•плазмалемму требуется лаг-период, равный одному часу.

* Известно (Чэленко и др., -1980)| что по мере увеличения про-долнительности послеуборочного хранения картофеля в несколько' раз сниааатся его фитофтороустойчивость: проникновение патогена в ткани клубней возрастает в десятки раз) а скорость СВЧ-реакции,в от-

- 20 -

вет на инфицированные грибом замедляется в 4-5 раз.

Нами установлено, что падение устойчивости картофеля к инфекционным заболеваниям по мере увеличения продолжительности его хранения четко коррелирует с интенсивностью мембранного ответа растительных клеток на раневой стресс.

Оказалось, что поглощение метки тканями свекенарезанных дисков с увеличением длительности хранения картофеля возрастало, в то же время поглощение мотки стареющими дисками падало. Вследствие этого разница в скорости поглощения метки снижалась. Иными словами, интенсивность этой реакции на раневой стресс коррелировала с падением ого устойчивости к болезням при хранении картофеля (табл. 3).

Таблица 3. Изменение поглощения ^С-лейцина тканями в зависимости 'от продолжительности хранения картофеля (имп/мин на I г ткани х Ю-6)

Срок анализа Свекенарезанные диски Стареющие диски

Сентябрь 1.3 10,9

Декабрь 1.4 7,7

Апрель 1.9 8,2

Июнь 3,8 5,4

Интенсивность включения метки как в водорастворимые, так и в плазмаламмныэ белки в свекенаразанных дисках была низка в течение всего периода хранения картофеля (табл. 4).

Таблица^ 4. Изменение включения *ч!-лейцина в белки в зависимости от продолжительности хранения картофеля (имп/мин на I мг белка х Ю-3)

Срок анализа Свекенарезанные диски Старекре диски

суммарные белки шшзмалеммше балки суммарные бел1а! шшзмалеишше белки

Сентябрь 9 73 384 1330 '

Декабрь 4 зо • 257 818 .

Апрель ' 12 ' 34 - 200 . 165

Июнь 17 80 153 257 ■

В ответ на раневой стресс величина этого показателя резке возрастала как длл суммарных, так и для плазмалетъяшх белков. Однако интанс ганость этой раневой реакции тканей значительно сн1»я

лась при хранении картофеля. Интересно отметить, что если включение метки в суммарные белки стареющих дисков при этом снизалось в 2 раза, то включение матки в плазмалеммше белки за тот же период снижалось в 5 раз. Наиболее ярко эта реакция плазмалеммних белков на поранение проявлялась у клубней в начальный период хранения. Такие клубни обладали настолько высокой фптофтороустойчквостью, что их удавалось искусственно заразить только при условии высоких инфекционных нзгрузок. Число инфицированных и ЛВЧ-погибших клеток при этом было настолько мало, что область поранения можно было заметить только под микроскопом. В апреле-июне устойчивость хранящегося картофеля к инфекционным заболеваниям резко падала, при этом резко снижалась и интенсивность активации синтеза плазмалем-мных белков.

Таким образом, мы наблюдали четкую корреляцию в интенсивности реакций тканей клубней картофеля на инфицирование патогеном и на раневой стресс, тестируемый по активации биосинтеза плазмалем-мных белков.

Для изучения спектра плазмалеммных балков картофеля препараты нативной и раневой плазмалеммн били подвергнуты электрофорета-ческому п радиографическому исследованию.

Результаты электрофореза в ПААГ в присутствии С3-Иа и в-ыер-каптоэтанола препаратов плазмалемми картофеля представлены на рис. 7. При окрашивании фореграмм кумасси (¡-250 в препарате плаз-цалемиы было выявлено около 50 полос пептидов, равномерно распределяющихся по всему гелю в зоне мол. масс от 14 до 94 кД. Сравнительный анализ 'денсятограш (рис, 7,а) препаратов нативной и ра- -невой плазмалеммн показал, что в ответ на раневой стресс в плаз-малемме снижается содержание некоторых низкомолекулярных (18-25 кД) и увеличивается содержание несколишх высокомолекулярных белков (30—38, 56-68 и 94 кД). На гистограмме радиоактнвностей белковых зон гелей (рис. 7,6) представлена истинная радиоактивность зон фо-реграммн с учетом эффективности счета, определенной для каждой зоны методом внешнего стандарта. Радиоактивность образца, подвергаемого электрофорезу, равнялась сумма радиоактивностей зон, полученных после электрофоретического. разделения образца. Из представленных данных следует, что раневой сгоесо значительно активировал биосинтез всех белков плазмзлеммы.

Индуцировать в клубнях каргофзля состояние по2ксе;;ро?£ устой-

Рис. 7. Диск-элбктроЗороз в ПЛАТ в присутствии D3-iîa к с-мзскапто-этанола белков препаратов катпвноН (I) и раневой (II) плзз-малеммы картофеля : а - денситограмма геля; ó - гистограмма радиоактивности галл, в - деноитогража геля препаратов нативпоИ нлазмзлегмы из клубкай кгпюФсля, обработанная гоглогензтем зооспор V. infestara» 1 -"контроль, 2 - согкэ-сткмая раса, 3 - неооиасшня иаса

чивости к неблагоприятным факторам можно но только раневым стрессом, но и обработкой клубней микробиалышмн экстрактами (Чалова, Озерецковская, 1985; Deen, Кис, 1985). Весьма вероятно, что в обоих случаях растенио использует общие механизмы защити, основанные на активации генома, которые являются неспецифической реакцией хозяина па различного рода стрессы, обусловленные нарушением целостности ГЛОТОЧНЫХ СТеНОК (\7ara, 1906; ЬапЪ et al., 19В7). Мы полагаем, что белки плазмалеммы клеток клубней картофеля могут быть важнейшим элементом, инициирующим этот неспецифический механизм защиты по принципу: мааклеточноа узнавание - экспрессия генома - индуцирование защитных реакций. В связи с этим мы сопоставили влияние на биосинтез плазмалеммних белков картофеля раневого стресса и метаболитов возбудителя фитофтороза (рис. 7,в).

Оказалось, что обработка клубней картофеля гомогепатами зооспор гриба как поражающей, так и непоражающей расы, так se как и раневой стресс, заметно активировала синтез белков плазмалеммы картофеля. 11а денситограмме (рис. 7,г) четко заметно увеличение содержания плазмалеммных белков в препаратах, полученных из'клубней, обработанных грибными гомогенатамл, по сравнению с контролем (клубки, промыто водой). В устойчивой комбинации раса-сорт этот эффект вцрааен ярче, чем в восприимчивой. He исключено, что у поражающей расы гриба есть фактор, подавляющий индуцированный синтез белков картофеля. -

Таким образом, при индуцировании состояния устойчивости в 1иубнях картофеля раневым стрессом пли метаболитами гриба имеет мосто значительная активация биосинтеза плазмалеммных белков хо- • зяпна, регулируемая на уровне транскрипция. Интенсивность этого эффекта четко коррелирует с описанным ранее увеличением лектино-вой активности препарата плазмалеммы в аналогичных условиях. Это свидетельствует в пользу повышения содержания лектинов в плазма-леымз и (или) усиления аффинности лектинов к специфическим угле-еодннм лигадцзм. Образование дополнительных лектнновых рецепторов на плазмалемма, повышение их углеводсвяэывающай активности несомненно будет усиливать эффект лектин-углеводного взаимодействия при меаклеточном узнавании растением патогена. Это мезет бить одним из факторов, объясняющих механизм "сонспбилизацан" г;ст., повышения eg чувствительности в-распознавании метаболитов газогена и, в конечном счете, активации защитных реакций хозяина, ;

При индуцировании в растительной клетке состояния устойчиво-

сти раневш стрессом или метаболитами гриба наряду с изменениями в белковом компоненте плазмалеммы ми выявили четкие изменения п в ее липидном матриксе.

ШР-спектры спинового зовда 2,2,6,6-твтраматил-4-пальмнтопл-ампдошшаридин-1-оксила, встроенного в мембраны, представлены на рис. 8,а. Сравнение ЕГО? спектров плазмалеммы растительной клоткп с характерным спектром мембран мшфоорганизмов (Бшюков и др., 1987) свидетельствует об отсутствии в спектре растительных; мембран третьой компоненты, что предполагает более высокую микровязкость ее лнпидов. Под влиянием раневого стресса происходило изменение формы ЗПР-спектра зовда. Наиболее явное изменение наблюдалось в порвой компоненте спектра: появление плоча предполагает увеличение доли лнпидов с меньшой микровязкостью в липидном матриксе плазмалеммы, т.е. повышение ого "токучестн".

Рис. 8. Характеристика свойств ляплдного матрпкеа плазмалеммы картофеля: а - спектры 2ПР спинового зонда в препаоатах мембран: I - Bacillub brcvia, 2 - нативной плаз мало г.",ш картофеля, 3 - раневой.плазмалешы картофеля; б - томиератушко зависимости флуоресценции МБЛ в плазмалеммо кзотошоляП -нативная плазмалемма, 2 - раневая илаэмалемма," 3 - натпв-ная плазмалемма + гликоконъюгаты несовместимой расы, 4,-натпвная плазмалечлма + гликоконъюгаты совместимой расу

С целью подтверзденкя -згою вывода были всследэваш температурные зависимости флуоресцонцпк зовда мзтокепбензаптрош: (Ш\), широко применяемого кря изучении кокформашюшох т'глп-езт^рли;; не-

рвходов в I,¡¿дальних и природных мембранах (Владимиров, Доброцов, 1980).

Тошвратурние зависимости флуоресценции !.ШЛ, добавленного к про:¡аратам ллазмалешы картофеля, приведены на рис, 8,6. При нагревании образцоз в интервале температур 10-55° происходило з-об-разнэе снижение интенсивности флуоресценции. График в координатах Аррениуса имеет изломы, что -указывает на наличие структурных тем-пературно-индуцированных переходов в плазмале:.:.:е при соответствующих температурах. Полученные зависимости асимметричны: характерно существование плавного низкотемпературного лред-переходз около 20° и излома в области высоких температур (-10-50°), после чего происходит быстрое ойкание флуоресценции. ГраТ.пки изменения флуоресценции в случае использования раневой плазмалзммы имеют более широкую область основного парохода по сравнения с величинами аналогичных переходов в нативной шшзмзлеммо. Введение глпкоконъвгатов Р. 1п?езгапз в препарат ялазмалеммы ьызываало изменение температурных зависимостей Флуоресценции 1/.ЕА. Препараты гликоксньигатов,так ке как и раневой стресс, вызыезли уплрение области основного тгрштроинэго перехода. При этом более- значительное в устойчивой комбннаид'.и рзса-сорт, по сравнению с восприимчивой. Изменение областей переходов в обоих случаях происходили преимущественно за счет смащения их высокотемпературной границы. Увеличение интервалов термотроишх переходов под действием .раневого стресса или метаболитов гриба такаа трактуется в пользу увеличения "текучести" лдлпдного матрпкеа ллазмале^мк.

Анализ состава кирных кислот плазмзлем.гы подтверждает этот вывод (табл. 5). Как видно из таблицы, в составе плазмзлеммы клубней картофеля наиболее значительно содержание пальмитиновой, ли-калевэй я лгнолвновэй. Раневая плазмалзш/.а характеризуется более высоким относительным содержанием полннгнэгыщекнцх мирных кислот и более высоким индексом пензскщенности липпдов.

Интенсивность изменения структуры и гирнокислотного состава лнпадного матрикса плазизлемми, тазе нз как и ее белков, значительно снизалась при падении устойчивости з:.зртоТ>елл к инф^алнекнш болезням по игре увеличения его послеуборочного хранения.

Таким образом, в тканях клубней каргэуеля з ответ на рзнекй стресс ала контакт с метаболит?..».« патогена ьцякчею уззлгчешп "■ГЕкучести" липвдного катркксо пла5«'мем:гы. Ссг-лоско т&оуетпчес-

ким представлениям (Дкоуно, 1985), такое явление монет вызывать повышение степени экспозиции мембранных белковых рецепторов (лек-тинов) и усиление их латеральной подвикности. Это несомненно будет способствовать усилению рецептор-лигавдного (в данном случае -лектин-углеводного) взаимодействия при межклеточном узнавании растением патогенных микроорганизмов и, следовательно, активации, ответных защитных реакций. С другой стороны, это уг.е второй фактор (наряду с активацией плазмалеммных белков), объясняющий большую реактивность раневой плазмалеммы при взаимодействиях с метаболитами патогена, по сравнению с нативной. Эго подтверждает предположение об общности индуцированных защитных механизмов растительной глотки в отвот на раневой стресс и инфицирование патогешш-ми микроорганизмами.

Таблица 5. Состав Еирних кислот липвдов шшзмаломмы клубней картофеля

Содержание жирных 1шслот, шл.Я Елазмалемма -

CI6:0 CI8:0 ,С18:1 С18:2 С18:3 С20:0, ШР

Нативная 42,7 5,2 2,8 41,5 6,0 1,8 2,2 Раневая . 36,1 4,5 1,5 45,6 10,8 1,5 3,1

ШР - индекс насыщенности, рассчитанный по формуле:

[С18:1]+2[С18:2]+3[С18:31

521 =-:--±---L

[С16:0]+[С18:0]+[С20:0]

Обнаруженные зкачитмьныо структурные (белковые и липидныа) изменения d плазмалеммо растительной клетки при сенсибилизации тканей несомненно дол-шн сказываться и на ее фуш-адюнальнои активности .

В качество показателя фушсвдовэлыюй актяшооти 1уапз:.:злс.мм1.!, наряду с раизе описанной лектвновой активностью, исследовал;; активность транспортных катлон-стимулирузмых А№)3. ¡%2'-зависимая (К+-Г.Г;м- ) - агсгкззруекая АКаза является иэркершм фор,".ентом плазг.а-

глзгок ~лв?х;ш (Болдырев, Твэрдаслов, 1878). Лптерэтурппе «-шаг; о иадпчяк ^нелогичного фермента в гшазглуле;.::/- меток тво-т-.чи:!1 сока пс сгслл- одкозаачан (Jfc.3r.cio, Yanaki, 19745 НскЛгАЗаз, ÎS7C; Ечл'^-т.'М'лп п гр,, 1982), Us:r,i псслсдов';н;:я что

; спад? гЧ, АТФ-3.5 г;Ч) в щ»;сутст£яш

препарат^ плазмалеммы идет актшзнш гидролиз ATI'. Выявлены оптимальнее условия проведения реакции: время, температура, рН, концентрации катионов, синергпчески стимулирующих реакцию, субстратная специфичность, ¡лакспмалыюе количоотво неограничоского фосфата отделялось от АТФ при инкубации реакционной среди в тачзнио £0 мин при 37°. В препарате отсутствовали ферменты, катадпзирую-шие расщоплоние в-глицерофосфата и монофосФатов нуклеозидов. (2,5 м*.0 активировал расцепление ди- и трифосфатов нуклеозидов только при piï 6,0. Фосфогпдролазиую активность стимулировали мо-иовзлеитнио катионы К* а Иа+ в суммарной концентрации 100 iih, при соотношении концентраций ионов 1Ь+/К+, равном 1/4, и рН инкубационной среды 9,0. Максимальную активность расщепления и синергизм з стимуляции активности катионами llg2*" (2,5 мМ), К+ (80 мШ и îiah (20 íü) наблюдали только в присутствии АТФ (3,5 ыМ) и при рН 9,0.

Таким образом, данные зт-ой серии опытов указывают на то, что препарат плазшлоыш из паренхимы клубней картогзля обладал Ug2h-заЕ!!сишй, (К+-нТа+)-актпвлруемой АТФазноц активностью с оптимумом при рН 9,0.

Дэшмз табл. 6 свидетельствуют о том, что раневой сгросс значительно активирует обнаруженную ферментативную активность.

Таблица 6. Активность катион-зависимой АТФазы (мк1,1 Фн/мг белка в I ч)в ирэпаратах плазмолокмы из клубней картофеля

Среда инкубации

Препарат плазмэлекш!

нзтивнои раневой

Основная* 6,2+0,2 7,0+0,2

" + (К++Иа+) 6,8+0,3 9,1*0,2

" + Us2*- 8,8+0,3 32,1+1,2

" •!■ п/1" -г (К++1!а+) 10,0+0,5 38,5+1,5

основная среда инкубации: трлс-НС1 (40 мМ), AM (3,5 мМ), рН S,Q, Koi чентрация катионов: 1 ï£2+ (2,5 м!.0, К* (60 м!Л), (20 -.Г.).

Таким образом, ни приходим к очень важному выводу о том, что и раневой стресс и метаболиты гриба оказывали сходное влияние на структурные л функциональные свойства шшг&алег&з т-лубней картофеля: увеличивали проницаемость мембран, активировали синтоз бзл~ ков, повиаалп'яктишооть момбраносвязэнних Ферментов и лектаков, уиалш'«!лтг!! "текучесть" Л1ШИДН0Г0 кэгрякса мембраны. Згя мембран-

ныо эффекты были выявлены как в устойчивой, так и восприимчивой комбинации раса-сорт, хотя в устойчивой комбинации они были интенсивное .

Такая структурпо^функшюнальная перостройка растительной пла-змалзмми, с одной стороны, объясняет повышенную реактивность "ра-новой" плазма до» ми картофеля по сравнению с нативной, и, как следствие, болев активный иммунный ответ раневых тканей картофеля но инфицированные патогеном по сравнонию с исходными, нативпыми тканями. С другой стороны, исследование этих процессов в определенной степени раскрывает мембранный механизм индуцирования неспецп-фическон устойчивости картофоля к факторам внешнего воздействия, наблюдаемого как в условиях раневого стресса, так и лнФицировашш нопорапаюшей расой патогена. Интенсификация мембранных процессов при клот'очноиоверхностном узнавании растением патогена несомненно будет способствовать активации последующего этапа инфицирования -меточного распознавания, которое в первую очередь определяется экспрессной растительного генома и последующей серией биохимических и июточных событии, переводящих клетку в новое функциональное состояние повышенной устойчивости (Callow, 1984).

2.4. Пммунофсрмашшйанализ лектина и препарата ллазмаломмы клубной картофеля

Каков механизм "активации" плазмалеммы клеток картофеля, индуцированной локтпн-углеводним взаимодействио.*^ Что при этом происходит с мембранным лектшюм-рецопгором, как'изменяются ого свойства в процессе "узнавания" специфического углеводного лигпнда?

Среди известных подходов, применяемых дал решения этих вопросов, особое моего занимают иммунохимичсскно методы анализа, основанные на способности антител с продельной специфичностью "узнавать" определяемый антиген.К явным преимуществам метода относятся Tar.se высокая чувствительность, количественная оценка взаимодействий. Есе это позволяет получить существенную информацию о механизмах реакции "узнавания", о структуре активных центров вза-икодойстоукфвс молекул и их изменениях в процессе взаимодействия.

я исследования взаимодействия лектин-углеводпно лигандп пкдую.1 ер::зишй анализ (ИЬ\) применен впервые. Поэтому много внимания бнко уделано получеипэ и характеристике високоспецг:?ачесш;х антител, капрашеикой оптимизация нескольких схем анализ;! реакции еатигон-окхпгсло (Аг-Лт), изучению количественны:: гшговсгзрпэстеЗ

взаимодействия.

В качества антигена использовали выделяемый памп гомогенный водорастворимый локтин клубной'картоФоля. Игглуииэпци» кроликом проводили по широко примоняог.'ой ехпмо (Иммунология, 196У). А р! пи— ную очистку антитол проводили на колонки с локтипом, иммобилизованным на бром-цнан-софпрозо (Кестерешсо и др., 19139). В результате получали высокосппцифическую (¡рпкци» антител - ишуииоглойу-ЛШШ G( Ir;G ) .

Согласно рекомендациям литературы (Дзлптнол, Осипов, 1907) нанболво универсальным методом лвляотся твордофгг.шый iK'A, п котором один из компонентов иммунологической реакции связан с тннрцой фазой, в качестве которой широко используется плмшчеты из оптически прозрачного непористого полистирола. С целью регистрации процессов при крайне низких концентрациях компонентов использовали антигены и антитела, мочопио порсксидазой. ríoпьюгати получали ко-валентиим связыванием препарата с фор,ментом, кредпприталыю модифицированным период,тгом натрия (Дзантиев и да., 1979).

Для разработки и оптимизации систем 1К-'А необходимо было провести изучешш кинотнчоских и термодинамических закономерностей реакции антиген-антитело, лег.ащой в основе метода и опрпделея'/япй его основные харпктористшш.

Схома "Сэндвич-ИФА" была использована для определения содержания лсктшп в препаратах раневой и иативиоЛ плазмллоши карто-фоля. Она основана на последовательном взаимодействии вносимого определяемого антигена с иммобилизованными на ллшичптв антителами (первая ста;ц'я анализа) и с добавляемыми мечеными перокендлзой антителами (Ат'':) (вторая стадия анализа), при последующей детпюшп фзркзитотпвкоП активности образующегося па твердом носителе тройного комплекса:

+Аг +Лт,г Ь Лт--' " j- Лт-.Аг--íj- Ат-Лг-Лт"

Основными рабочими характеристиками "Сэндшрг-ИСА", который легко изменить, существенно влияя на чувствительность и пкспрес-сность анализа, является длительность двух ого стадий и концентрации пг.глукосеах'оатоп. При концотршак 5 гт.г/мл достигается

прзктапоскя полное нлок^онпе цоятроп сглзнкпися из тмрдоп носителе, что сбг.о:7"';;;взот оптимальные по чувствительности услоппя спита. При сяяз'.'игшпя о носителем псроксидазной м;тк;1 (ПХ) Д'~г jp?.-.?\-«vx ткцентрлекЛ коиьегяш Is'-—ПХ была наЯцзют оптг.пцръ-

пая концентрация конъюгата, ровная 1,2 мкг/мл по пероксидазе. Из кинетической кривой связывания антител с поверхностью лунок план-овта следует, что время полного заполнения поверхности при насыпающей концентрации Ат составляет 60 мин. Длительность второй стадии анализа оптимальна том при 60 мин.

Полученные результаты позволили выбрать оптимальные условия проведения анализа и построить калибровочный график. Нижний предел чувствительности анализа - I иг. Рабочий интервал определяемой концентрации лактина 1-8000 нг. Средняя ошибка в этом интервале концентраций лектина равна 3/». Чувствительность, достигнутая в оптимальных условиях проведения анализа, позволила провести определение содержания лектина в сложных биологических системах, таких как препарат илазыалеммы из клубней картофеля. Для этого в схему "Сзндвич-П-М" вместо антигена - водорастворимого лектина вносили препарат белков ллазмаломмы и по калибровочному графику определял!! содержание иммуьологпчес};и сходных с лектшюм веществ в ояазшлеаш. Оно составило порядка 3% в нативной плазмаявшо и & в раневой плазмалоше.

Тагам образом, доказано содержание лектина в плазшкеммо картофеля и увеличение ого содержания в условиях раневого стресса.

Выявление лектинов в сумма белков плазмалеммы провели методом иммуноблоттинга. С этой целью провели электрофорез препарата в пластинах полиакриламвдного геля (Т 10-20/', С 3/0 в присутствии 0,1% СЗ-Иа. Гель окрашивали купэсси й-250 (рис. 9,а). Здесь ' для сравнения приведена олектрофореграмма гомогенного водорастворимого лектина. Белки с геля переносили на нитроцалл/^озни'! бумагу методом электроблоттинга. При окраске репликп мечеными перок-едцазой антителами к лектину гомогенный водорастюраизй лектва щюявядагоя одной полосой, а в препарате плазмалеммы 3 белковые полосы обладали способностью связывать указанные антитела (рис. 9,6). Реплики были покрашены кумассн (тест на белки) и реактивном Шиффа (тест на сахара). Наиболее вероятно,- что первая полоса, содержащая белки и сахара (соответствующая метрику с мол. массой 100 кД), представляет собой днмзр лектина; вторая полоса, такав содержащая балки и углевода и соответствующая соециизиню с мол. массой £0 1сД, представляет собой мономер лекиша; не исключено, что траты полоса, содержащая только белки с мал, массой порядка 30 кД, то«е соответствует лектину, о именно, его белковой

у_^¡({¿леп дщ; ПЕП компоненте, поскольку деглпкози-

у у .лнрованний локтин такие обладает

^ ■ антигенными свойствами лектпна.

<=» . 1 . Для определения количест-

венных характеристик взаимодействия Аг-Ат использовали схемы прямого твпрдофазного 1МЛ с маркировкой ферментом как антител,

Рис. 9.аХарактеристика ЛКК и "так " антигена. Использование

препарата белков нлазмалемми этих двух вариантов определяется

(ЛЕИ) картофеля: а - электро- титоованиеч

фореграмма; б - пммуноэлектро- ы,л» Ч1и в охс-ыо 0 инртынин^л

олотгинг одного компонента реакции другим

возможно детектировать гетерогенность лишь одного титруемого компонента. Поскольку мы используем поливалентный антиген и поликло-палышо антитела, то следовало провести количественную характеристику центров связывания как одного, гак и другого класса молекул.

Кривая титрования активных центров иммобилизованного на пла-шнзто лектчна конъюгатом 1с&-ПХ продставлона на рис. 10.

Определенно равновесной константы связывания Аг-Ат в системе' координат В от г, где В - концентрация связавшихся антител, а г -концентрация свободных антител, приведено на рис. 10,о. Насыщение активных центров иммобилизованного антигена достигается при равновесной концентрации свободного комплекса ? ~ 9,2-Ю-® Концентрация активных центров иммобилизованного антигена С - . ~ 1!. В данной системе координат равновеенпя константа евл-

' зылашш Аг-Ат определяется как величина." обратная Т при Б0?-ком иа.еттаеипп актпшшх центров аитпгека. Такки образом, если т -- П, то К = 1,8-10^ 'Г^. Интерпретация кривой титрова-

ния активных центров лсктннг. в координатах Скзтчарда приведена на рис. 10,6. Его'позволяет качественно охарактеризовать антигоннчо детерминанты локтива. Нелинейная зависимость свидетельствует о неоднородности центров связывания лэктипа с Аг. Аппроксимируя крп-спгпзашш доугл прямыми, мэяко•'вчдолпть дао попуЛяцял актив-!чч: центров ч определи?* оТфектпЕЧне значения их концентрация и кзнст'ч'г сг.тотпяря. Дет лчптпип огв популяшгл характегпсугзгся

-гчпечпч-:: конот-пг: сгчпч:ч:п:л 2-10113 'Г1 п 8.7>кАг1 г :' 2,2-10~1Л (2ч ",С-Ю~10 '1 (77X0 соствзтг--

гг':г, чеччтчч'гч ц*•»лейрпзо =?1шпго А'.1 с

в-ш'Ч м

Рис, 10. Титра шита центров связывания сорбированного антигена

(лектт.нп) мичоными антителами (1сЗ-ПХ): а - зависимость концентрации связанного коньюгата 1пО-ПХ (В) от концентрации свободного коньюгата ХсуО-ИХ (Р); б - интерпретация данных тнтроьання центров связывания сорбированного антигена конъкгатом Хнв-ИХ в координатах Скэтчарда

С) т

конъмгатом раина 5,3«10" М .

Результаты титрования активных центров иммобилизованных антител конъмгатом антпгон-нероксчдпза (Агх) представлены на рис, II, По аналогии с предыдущим опитом рассчитаны соогввтствую-шии характеристики. Из рис. II,а следует, что насыщенно активных центров иммобилизованных пнгптол достигается при равновесной концентрации свободного комплекса Г = 2,8*10~*9 !.!. Концентрация ак-

в,%отС0 100%

Ю "

0,5

а

[50%

10

го г-ю? м

10,0

5,0

1,0

о

0У

0.0 1,2 в-109,Н

Рис. ¿1. Титрование активных центров сорбированных антител

копъйготом антигена лектпп-пороксидаза (ЛКК-ПХ): о - зависимость концентрации связанного конъюгата ЛКК-ПХ (В) от концентрации свободного конъюгата ЛКК-ПХ (3?); б - интерпретация данных титрования активных центров сорбированных антител конъкгатог.г ЛКК-ПХ в координатах Скэтчлрда

тпеных центров икотбнллзосашшх антител С = 1,7«Ю-9 М. Рявио-

весная кенеггнтр связывания Аг-Лт К = 1,7.Ю9 1.Г1. Анализ нели-

пзйпой зчр-сягястп б координатах Скятчпрда (рис. 11,6) свидетель-

ствуат о наличии двух популяций специфических активных центров у полученных полнклоналышх антител, которые характеризуются эффективными значениями констант связывания 2,3-10 М и 3,6-■ Ю8 1.Г1 и концентрациями' 0,7.10~Э 1,1 (29%) и 1,7-Ю"9 ¡.! (7150 соответственно. Эффективная константа связывания иммобилизованных 1сО с конъюгатом Аг" равна 6,9-Ю9 '.Г^. Таким образом, высокоаф-фишшо и низкоаффанные компоненты реакции Аг-Ат имели соответственно близкие количественные характеристики при «.«мобилизации на твердом носителе.

Полученные характеристики взаимодействия Аг-Ат относятся к системам, в которых один из компонентов маркирован ферментом. Значения этих характеристик могут отличаться от аналогичных данных в реакции между намеченными компонентами. Поэтому было прово-дено определение количественных характеристик взаимодействия немеченых компонентов по схеме конкурентного И ФА (Дзантрев и др., 1983):

-

Оптимизация условий реакции Аг-Ат по схеме конкурентного ИФА проведена аналогично ранее описанной схема "Сэндвич-ПФА". Принцип конкурентного анализа состоит в одновременном добавлении определяемого к меченого лиганда к иммобилизованному компоненту, дова-. дашш системы до равновесия и последующего измерения метки в комплексе с антителами или в несвязанном меченом антигене. Результаты анализа представлены в виде зависимости относительного уровня связывания конъюгата лектин-пероксидаза (Агл) от концентрации лек-тина (Аг) (рис. 12). Количество конъыгата Аг%, связавшегося с иммобилизованными антителами в отсутствие немеченых молекул лектина, принимали за 100$. Равновесная константа связывания немечено. а т

го лектина с иммобилизованными антителами составила 1,1-10 1.1 . Очевидно, что достоверное определение лектина о'наибольшей чувствительностью будет осуществляться в условиях, описываемых кривой 4. Конкурентный ИФА в данных оптимальных условиях характеризуется нижним пределом-чувствительности определения антигена - I нг. Рабочий интервал концентрации определяемого антигена составл I-500 нг. Средняя ошибка-определения в этом интервала 3%.

Лчизкие значения констант связывания Аг-Ат дая немеченых и меченых молекул лектина, рассчитанных в различных использованных

ig M

Рпс. 12. Взаимодействие Лг-Лт в спстсма копкурзтного ПОЛ: а - зависимость связывания моченого антигена jiiüC-ПХ с аитито-- ламп от концентрации опазделясмого антпгека ЛКК пса саз-лач1п:х начальднх концентрациях моченого антигэна;*б -завпспгость, Л, доли связанного с р.итптслаг.и «очоиого знткгеиа ЛКК-Пд. от копцонграцпл отделяемого антигена ¿Ka поп розлпчпих началып?х копщштргплтх глчшгаго питг-гепз; коншштрагдая ЛКК-НХ -.22,0, 5,6, 1,4, 0,4 н',1 для ' '[^ilHjyj,^-- соогветствоппо,-концентрация IçO при сорбции

схемах К5Д, указывает па то, что асрПэдсшшЯ сй.чтоз К0!гь::г2га леч'-тпи-перокспглза »2 "окззцЕао? влияния на хорагл-ерзепш ангвгшшш: сгзЕзтв лпг.типп'(табл. .7). Исходя из этего, ni всиользомлк г.:зтод г.зн-урентгпг'* длл спрадэлсик'« гпЕПоиесноН константы

Таблица 7. Эффективные значения констант связывания полнкло-аалышх антител с лектином картофеля

Схема 1№А

К, Ы'

Т"

Кс1 = (2,0±0,7).Ю1и (23$) ^ = (8,7±1,8).Ю8 (77$).

К^ = (5,3+1,9).Юу

к**

Ат*

Кс1 = (2,3+0,7).Ю10 (29$) КцЗ = (3,6+1,2).ю8 (713)

Кзф = (6,9+1,5)'10у

Аг"

-—Аг --Аг* (1,1+0,4) -Ю9 лектнн (4,2+0,7) -Ю9 плазиа-• ' лемма

4*Ат -«- |-АТ -а- Аг* Аг* + хитотриоза + гликопоптиды гриба II и >& .-е< (6,0+1,1)-Ю10 (7,5+1,3)-10го

плазмалеммного лектина картофеля с иммобилизованными антителами. Она составила 4,2'М9 М , что несколько превышает значение аналогичной константы', определенной для водорастворимого лектина. 'Эти данные свидетельствуют в пользу несколько большего сродства . плаэмалеммного лектина к антителам по сравнению с водорастворим его аналогом.

На основе проведенных исследований количественных закономерностей реакции Аг-Ат с использованием различных схем ИФА представилась возможность выявить вероятность влияния лектин-углеводного воздействия на иммунологические свойства лектина. С этой целью использовали схему прямого твердофазного ИФА с меченым антигеном:

н*

Аг

Как было показано ранее, перйодатный синтез конъигата лекгин-пероксидаза не оказывал достоверного влияния на антигенные свойства лектина. Следовательно, эк>т коиъюгат моает быть использован,в качестве аналога свободного, лектина в опытах по изучению иммунологических свойств отого соединения. По схема пряшго твердофазного ИОА к иммобилизованным на планшете антителам добавляли меченый антиген, предварительно проинкубированный б течение 20 шн с хито-

- 37 -

биозой или гликопептидами Р. Infestaña, непоракамцей расы (рис. 13). Константы связывания Аг-Ат в присутствии хлтобиозы п гликопэптидов гриба, рассчитанные в координатах ь/Р, составили соответственно 3,9-10 и 5,6-10^ Значения элективных констант связывания, определенных в координатах Скэтчарда, соответственно равны 6,0.10 0 п 7,5-Ю10 М , Из сравнения данных, приведенных в табл. 7, следует, что прп воздействии на лектин специфических углеводных лпгандов эффективная константа его взаимодействия с антителами увеличивается на порядок. Это свидетельствует об изменении иммунологических свойств лектина под влиянием лек-тин-углеводного связывания, что возможно объясняется изменением конформацип ого молекулы. Такое изменение молекулы мембранного лектин-рецептора несомненно способствует увеличению эффективности его функционирования в процессе-мекклеточного распознавания растением-хозяином патогенных микроорганизмов и, следовательно, интенсивности ответных защитных реакций.

2.5. Структурные изменения свободного и мембранно-связанного лектина под влиянием специфических углеводных легандов

Как показывает изучение клеток тшвотных, локальное комплек-сированпе эффектора (гормона) рецепторнкмй спстемэми приводит к Генерализованным конформационным изменениям рецептора и его окружения в плазматических мембранах, в результате чего при последую-ивй грансдукции сигнала клетка переходят в новое функциональное состояние (Конев, 1987). В последние годи получены данные, которые позволяют предположить справедливость этой гипотезы применительно к растениям в отношении, например, таких фитогормонов, как гиббереловая и абсцизовая кислота, а такжэ некоторых других биологически активных веаеств (Paula ot al., 1982; Ладыженская и др., 1986). Используя потенциал- п pll-чу ветви тельные зонды, Яоу п Ген-штейн (Ьоъ, Heinstein, 1986) обнаружили, что индукторы гриба Ver-ticiilirm dahiiae вызывают в культивируемых клетках растений кооперативные язмененая свойств плазмзлемма, связанные, вероятно, с дальнейшей трансдукцией сигнала.

Результаты нзатх исследований, изложенные, в разделе 3, свидетельствуют о тем, что клеточноповерхностнне углеводсог.эрЕа^яе мгтаболг.тч Р. iafestans, а тягле оллгомэрн 1Т-ацетилглюкоза'тна пгояпляпт сходную мембранную актпрность пои лх действии на плаз-

О 0,4

Рис. 13. Влияние. (МсНАс)

В-Ю9,Ы ■

0,8 1,2

Г11, ,0 Ш1ШШО (I)-и гликопептидов Р.1п£ез1апз несов-

местимой расы (2) на связывание адсорбированныхс конмгатом антигена ЙКК-ПХ (3):,а - зависимость' концентрации связанного коиь-югата ЛКК-ПХ (В) от концентрации свободного конъюгата ЛКК-11А б 1интерпрвтагад данных титрования активных центров сорбированных антител конъюгатом ЛКК-ПХ в координатах Скэтчарда

мзлемму клеток шубной картофеля, трактуемую как результат лектин-углаводного взаимодействия. При этом имело место подавление лек-тиновой активности, тушение трйптофаниловой белковой флуоресценции л изменение характеристик ляодцного матрикса мембраны из-за увеличения его текучести. Эти эффекты были наиболее ярко выражены в устойчивой комблнацпи раса-сорт в сравнении с восприимчивой, в проявлялась сильнее в случае "раневой" плазмалеммы, обладашей более высокой активностью иммунного ответа по сравнению с "натив-ной" плазмалеммой.

С целью более детального исследования процесса лектин-угле-водного взаимодействия и его последствий было исследовано специфическое связывание свободного и встроенного в модельные мембраны лектина картофеля с олигомерами п-ацетилглюкозамина методами флуоресцентной спектроскопии. Эти методы, обладая высокой чувствительностью к структурным и конформационным изменениям взаимодействующих молекул, обеспечивают регистрацию процессов в динамике, позволяют получить информацию о рецепторных взаимодействиях, а также о гонких изменениях функционального состояния мембраны при. ее повреждении пли развитии патологических процессов.

Для количественной оценки лектин-углеводного взаимодействия были рассчитаны константы связывания компонентов методом фдуоро-метряческого титрования (ЛпЪо о1; а1., 1976). Как видно из табл.8, константы связывания лектина с хитотриозой превышали константы связывания лектина с хптобиозой. При этом лектин, выделенный из раневых тканей клубной картофеля, обладал большим сродством к олпгосахаридам, чем лактпн, выделений из нативных тканей клубней.

Таблица 8. Константы связывания лектииа картофеля, полученного пз натавшх (3^) и раневых (Кр) тканей клубней с олигомерами и-ацотпл-Д-глюкозамлнз п хпто за пом

Углеводный лпгапдКд, М-1 ' М--4-

Хптобзоэа 1,3-Ю4 • 1,6-Ю4

Хптоттаоза 5,6-Ю4 2,0-105

Квтоззн - 8,7-Ю4 4,(МО5

Апаляз изменений спектров флуоресценции свободного ¡т гстро-ешгаго в моделыше мембраны лектпна под влиянием углекзглого ля-ганда, в присутствии нейтрального туплтеля - акряляулдэ к флуоресцентного зонда - ппреиз, лровадвя согласно согрспшзм теориям п

моделям, предложенным Бурштейном (Ви^е1п ег а1., 1972), Лакови-чем (1986), Эфтинком и Гироном (ЕЛ1пк, йыгоп, 1976), Добрецовым (1989).

Титрование лектина олигомерами Н-ацетилглюкозамина с длиной цепи 2-4 остатка вызвало тушение его флуоресценции и сдвиг максимума спектра испускания в коротковолновую область. Подобных спектральных эффектов не наблюдали при добавлении к лектину мономера Н-ацетилглюкозамина. Увеличение длины волны возбуждения флуоресценции приводило к возрастанию разрешения спектров, которое проявлялось в появлении плеча в области 330-335 нм и одновременном снижении обшей интенсивности флуоресценции с увеличением полуширины спектров.

Дифференциальные спектры флуоресценции лектина в присутствии олигосахаридов - хитобиозы и хитотриозы свидетельствуют о том, что лектин-углеводюе взаимодействие вызывает появление изоэмис-сивной точки в области 333-340 нм, максимума около 317-320 нм и минимума около 360-370 нм соответственно. Наибольшую степень тушения флуоресценции лектина (20-21$) наблюдали в области минимумов спектров. Известно (Бурштейн, 1976), что флуоресценция триптофана в водных растворах характеризуется максимумом при 348 нм, а его включение в молекулу белка приводит к сдвигу максимума в коротковолновую область спектра на несколько нанометров. Полученное в настоящей работе значение максимума спектры флуоресценции лектина (345 нм) указывает на гетерогенность положений триптофа-нилов в молекуле белка: очевидно, что некоторые остатки триптофана в молекуле лектина находятся в более гидрофобном окружении по сравнению с остатками, полностью экспонированными в водную фазу. Это подтверждается в опытах с акриламидом.

При титровании лектина акриламидом наблюдали интенсивное тушение флуоресценции с отчетливым отклонением графика от линейной зависимости, построенного в координатах Штерна~$ольмера (рис.14,а). Взаимодействие лектина с олигосахаридами вызывало снижение интенсивности тушения флуоресценции акриламидом с сохранением полоки-Тельного отклонения графику от линейной зависимости. Соответствуй ..; ющее изменение констант Штерна-Фольмера, измеренное по начальным ■ участкам графиков, составило 30$. На том же рисунке представлены, графики туше'ния акриламидом флуоресценции на длине волны 300 нм.'1" ■ В этом случае для свободного лектина график тушения флуоресценции,

регистрируемой при 360 им, имеет положительное отклонение от прямой, а в случае ее регистрации при 332 им - зависимость линейная Аналогичные графики для насыщенного олигосахаридом лектина представляют собой прямые в исследованном диапазоне концентраций ак-риламнда.

Рис. 14. Тушение (флуоресценции свободного лектина картофеля и комплекса лектин-углевод акрилзмидом: а - дчя системы лсктин: I -

= 281 нм, Л ем = 345 нм; 2 - Л е„ = 300 нм, А ем = 360 нм; 3" -Ч = 300 нм, = 332 нм; для системы лектин+хитотриозз: 4 ->*",= 281 им! х Ги = 345 нм; 5 = 300 нм, ^ е„ = 260 ш; 6 -

300 нм, А«ч = 332 нм. Концентрация лектина-1,2 ккМ, хито-трпозы-40 мкМ; б - дифференциальные спектры флуоресценции лектина картофеля (><.*= 300 нм-Лс« = 281-нм, нормированные при 345 нм); • I - лёктин; 2 - лектлн+хптотриоза; 3 - лектин+акриламид

Согласно теоретическим представлениям (Лакович, 1986), процесс динамического тушения флуоресценции в координатах Штерна-Фоль мера должен описываться прямой, угол наклона которой является константой тупения Штерна-Фольмера, п представляет собой произведение бимолекулярной константы скорости тушения и времени затуха-нпя флуоресценции в отсутствие тушителя. Отклонение графика Штер-на-Фольмерз от линейной зависимости мо^ег быть обусловлено рядом причин. По классификации ЭФтпнка и Гпрона (Вй1пк, вЫгоа, 1976) три различных типа графиков отражают распределение хромофоров следустим образом: I - верхний наклон графика указывает на приблизительное равенство в доступности триптофанплов дял тушения или преимучественнуп флуоресценции одного триптсфанила; И - линейная зависимость указывает из гетерогенную популяции хромофоров, нез-

_начительно отличающихся между собой по доступности для тушителя; Щ - отрицательное отклонение графиков наблюдается при значительном различии по признаку доступности. Анализ флуоресценции лектина показывает, что имеется два во типа: остатки триптофана, находящиеся во внутренних, неполярных областях молекулы и флуоресцирующие при 332 нм, имеют приблизительно равномерное распределение на поверхности молекулы; флуоресценция при 360 нм обусловлена преимущественно триптофанилом, имеющим высокую степень экспонирования в растворитель.

Особенно четко две популяции триптофанилов у лектина картофеля проявляются при анализе дифференциальных спектров, полученных вычитанием нормированных по максимуму флуоресценции (в облас.-ти 345 нм) спектров при возбуждении флуоресценции на длинах волн 300 и 281 нм (рис. 14,6). Образование комплекса лвктин-углаьид вызывает явное перераспределение интенсивностей полос^ этого спектра, что указывает на возрастание относительного количества экранированных от растворителя триптофанилов,за счет уменьшения триптофанилов, находящихся в контакте с растворителем. Как видно из рас. 14, образование комплекса лектин-углевод индуцирует примерно равное распределение триптофанилов относительно поверхности молекулы лектина, по-видимому, за счет как экранировки лигандом, так и вследствие локальных конформаций молекулы лектина, индуцированных этим взаимодействием.

Поскольку в межклеточном узнавании в системе растение-патоген участвуют мембранносвязанные лектины, следующая серия опытов была посвящена изучению воздействия олигоыеров Н-ацетилглшо-замина на лектин картофеля, встроенный в модельные мембраны, сформированные из дапальмитоилфосфатидилхолина. Встраивание лектина в липосомы сопровождалось изменениями спектра его собственной'флуоресценции, которые проявлялись преимущественно в ее тушении баз изменения положения максимума, а такке в уменьшении полуширины спектра и его асимметрии. Добавление к белок-липидному комплексу избытка хитотриозы приводило к сдвигу максимума спектра;испускания в коротковолновую область, аналогично тому, как это происходило в "случае-свободного лектина. .

Встраивание флуоресцентного зонда (пврена) в систему липосома-лектин вызывало сникенле интенсивности флуоресценции лектина в ее максимуме (345 нм). Одновременно наблюдали появление флуорес-

ценцпп в области излучения пирепа 370-480 нм я пшрокэй бесструктурной полосы в спектре возбуждения флуоресценции пирена в области 285-290 пм (рис. 15). Кроме' того, связывание пирена с липосо-мами вызывало сдвиг спектра возбуждения пирона в область длинных волн п сопровождалось интенсивной экспморизацией, что соответствует литературным данным о свойствах пирена (Birks, 1975)-

- 44 -

Эти спектральные изменения показывают, что в системе имеет место связывание лектина с липосомами, в результате чего происходит безизлучателышй перенос энергии с трпптофанилов на пирен. Такой перенос энергии мояет происходить только в случае "погружения" белка в липидний мзтрикс мембраны и невозможен при удалении белка от липида на расстояние более чег: 3 нм (Владимиров, Добрв-цов, 1580). Из представленных данных также следует, что встраивание пирена в систему липосома-лектин вызывало увеличение разреше-ши спектра флуоресценции лектина, появление полос в области 332 и 345-350 нм, снижение интенсивности флуоресценции в коротковолновой части спектра. Наблюдаемую картину перераспределения интенсивности флуоресценции, обусловленной различными фтуорофорами лектина," мозно объяснить тем, что пирен, по-видимому, преимущественно взаимодействует с популяцией трпптофанилов, находящихся в гидрофобном окружении м излучающих в области 332 нм. Во всяком случае, в присутствии пирена происходит снижение гомополярного переноса энергии мезду триптоишшлаш лектина.

Добавление к рассматриваемой системе олигомеров А-ацетил-глюкозамина в количестве, достаточном для насыщения специфических центров лектина, приводило к перераспределению Ееличин интенсив-ностей ({шуоресценции в полосах, излучаемых различно локализованными триптофанилаг.ш. Кроме того, при этом имело место снижение интенсивности полосы в области 285 нм спектра возбуждения флуоресценции пирена, характеризующей эффективность переноса энергии с трпптофанилов лектина на пирен.Изменение спектра возбуждения флуоресценции пирена в области 285-250 нм свидетельствует об изменении структуры аннулярных липпдов (Спирин, 1982). Количественная оценка изменения положения триптофанилов лектина, индуцированная лектин-углеводиым связыванием, проведена на основании графической зависимости снижения пареном триптофаннлыюй флуоресценции свободного и связанного с углеводным лигандом лектина по методу Спирина (1982) и Добрецова (1989). Долю флуоресценции триптофанилов (ь), доступных для тушителя (пирена), рассчитывали по формуле:*

Ъ = а[Ро/(Го,-?)] мин, где Го - флуоресценция свободного лектина в липосомах; г - 'флуоресценция лектина в присутствии добавок. При условии анроксимации

концентрационной' зависимости т /(Р -р) к бесконечно большой кон> 0 0

. ценгращш зонда и при распределении акцепторов в объеме а =0,75

(Литвинов, 1985), Расстояние манду статистическим центром трпптофанилов и пироном рассчитывали как X = I,2R0, где RQ - Ферстеро?-ский радиус переноса энергии от трпптофанилов на пирен, равный 3 пм; коэффициент Г,2 характеризует гетерогенность распределения доноров (Литвинов, 1935).

Результаты расчета свидетельствуют о том, что на долю тряп-тофадилов, расположенных па расстоянии X = 3,6 нм от пирена, приходится примерно 45% сГлоуресценцпи. Вследствие лектин-углеводного взаимодействия расстояние от статистического центра трпптофонплпв лектина до поверхности липосомы увеличивалось приблизительно на 60?. Т&ким об разом, для лектина характерно наличие-двух.популяшн"* трпптофанилов: одна, по-видимому, представлена триптофанилэми, преимуществешю экспонированными в раствор и флуоресцирующими прр У = 360 нм; другая - триптофаниламя, находящимися в гидрофобном окружения, недоступном для тушителя, флуоресцирующими при Д = в 332 нм. Лактип-углэводное взаимодействие приводит к выравниванию распределения трпптофанилов на поверхности молекулы как за счет экранирования углеводными лигандами, так а за счет локалышх азмзнонлй кояформацип молекулы лектина.

Специфическое взаимодействие олигосахаридов с мембранносвя-занвкм лектаном приводит к увеличению степени удаленности статистического центра трпптофанилов от-поверхности мембраны, т.е. увеличению степени экспонирования белковой молекулы в мембране, а тага я к язмепвшдо структурной организаций липядов мембраны. ГГо-влдимому, центры связывания лектина со специфическими углеводннга лигандами находятся вне липидной фазы мембраны. В обнаруяенкнх эффектах мокно ештвпть определенную аналогию с некоторыми регуля-торяымп механизмами распознавания и передачи сигнала, описанными для клеточных систем животных (Кульберг, 1987; Конев, 1987). Согласно существующим представлениям, межклеточное распознавание, обусловленное решптор-лягандннм взаимодействием, индуцирует кон-формациошшэ пзкеиеюш плазматических мембран, активацию дискретных рацвпторов, в результата чего при последующей тр'ансдукцпч сигнала клетка переходит в новое функциональное состояние.

3. ЗАКЛШШИЕ '

На основа проведанной работы в сопоставлении с анализом имеющихся данных представляется возмогшим выразить в виде схрмн со-

вокушюсть основных биохимических процессов, определяющих характер взаимоотношений растения-хозяина и гриба-патогена на примере модели картофель - Р. itlfeзt£шs (рис. 16). При инфицировании картофеля возбудителем фитофтороза ферменты гриба разрушают клеточную стенку растения и инфекционная гифа патогена прочно связывается с плазмалеммой растительной клетки, не нарушая ев целостности. Такой контакт является необходимым фактором развития процессов ыежклеточного распознавания партнеров.

Согласно проведенным исследованиям, молекулярное макклеточ-ное узнавание при фитофтороза картофеля обусловлено взаимодействием менбранносвязанного лектина растительной клетки со специфической к нему углеводной группой клеточно-повархностных гликопеп-тидов триба. Лектин-углеводноо взаимодействие имеет место как в устойчивой, так и в восприимчивой комбинации растение-патоген, однако эффективнее протекает в устойчивой комбинации. Лектин-ма-диируемоо взаимодействие рассматривается как первый необходимый этап, инициирующий многоступенчатый процесс общей, неспецифической устойчивости растения-хозяина к патогенным микроорганизмам. Однако, очевидно, этого еще недостаточно для проявления устойчивости растения к патогену в виде реакции СВЧ и накопления фитоа-лексшюв.

Первым следствием связывания лектинов плазмалекмы картофеля с углеводными лигандами поверхности патогена является изменение свойств плазмалеммы растительной клетки. При этом обнарукано несомненное сходство структурной и функциональной перестройки плаз-малемми картофеля, индуцированной метаболита!,« гриба и раневым стрессом растительной ткани. Такое сходство мембранных процессов, индуцированных раневым стрессом и метаболитами гриба поражающей и непорачсаьацей данный сорт картофеля рас, указывает на неспецифический характер индуцированной этими факторами общей устойчивости растений к неблагоприятным внешним воздействиям, разрушающим клеточную стенку растения. Такое представление о характере устойчивости совпадает о общеизвестным фактом, что растению безразлично, какой патоген его поражает^ оно отвечает на инфицирование во всех случаях одними и теми ке защитными реакциями, в частности реакцией СВЧ, накоплением одних и тех ка фитоолексинов. Более того, показано (Васйкова и др., 1985), что раса-специфические иммуносуп-рессоры возбудителя фитофтороза способны подавлять в картофеле ■

РАСТЕНИЕ картофель

фермент а^^

лектины

>

разрушение клеточной 'стенки растения

__!_

[сигнальные молекулы

ПАТОГЕН возбудитель фитофтороза

взаимодействие ^растительной Плазизлеюш с поверхностью гифы гриба

<

ферменты

И

<

гликококыогаты

перестройка плазмалешш

нуклеиновые

кислоты

белки

ферменты|

|зТИД6Н|

лигнин

супероксидныЯ анион

фитоалексины

трансмеибранный перенос сигнала

экспрессия генов защиты растения

АКТИВАЦИЯ РАСТИТЕЛЬНО!!

клетки

АКТИВИРОВАННАЯ {{ЛЕТКА

<

супрсссори

НЕАКШВИРОВАННАЯ .КЛЕТКА

N токсические уг вещества гриба

СВЧ-гнбель клетки (часы)

быстро® накопление фптоалексинов

гибель гриба (часы) локализация инфекции Л

v ! '

ыедленнал гибель клетки (дни)

медленное накопление фнтоалекстюв

замедленная гибель

гриба ( дни )•

распространение

инфекция

УСТОЙЧИВОСТЬ

ВОСПРИИМЧИВОСТЬ

Рис. ТВ Схема взаимоотношений рястенил и гмтсгрия

как реакции 'СВЧ, индуцированную патогеном, так и реакцию на поранение клубней,

Наспецифичвский характер индуцированной устойчивости растений к стрессовый факторам удачно сочетается с лектии-углеводнш механизмом ее инициирования как в условиях раневого стресса, так и при контакте с гдикоконъюгаташ поражавшей и непораасаюшей рао патогена. Как известно, лактин специфически связывает определенную углеводную группу, которая при этом может входить в состав различных гликоконъюгатов, локализованных на поверхности самых разных микроорганизмов, на клеточной стенке самого растения, входить в состав химических препаратов, которыми обрабатывают с/х растения на полях. Б любом из перечисленных случаев взаимодействие лакТина со специфическим углеводный лигандоы может включить неспецифическвй механизм активации метаболизма и функционирования клетки, который, очевидно, лежит в основе обшай устойчивости растений к различного рода стрессам. Имеются сведения об участии лек-тина картофеля в узнавании хозяина но только грибов (Furuichi et eil. Д980), НО и бактерий (Sequeira, 1985) И вирусов (Adam et al., 1987) и включение при этом одних а тех же защитных реакций хозяина.

Воздействие .специфического лиганда на мембранный лектлн проявляется в локальном изменении конформацип его .молекулы и увеличении степени ее экспонирования в мембране, что несомненно усиливает доступность углеводсвязываюших центров лектина. Обнарукенные мембранные эффекты очевидно повышают эффективность лектин-углвводного взаимодействия при меаклеточном узнавании партнеров и могут объяснить повышенную реактивность таких "перестроенных" активированных мембран к метаболитам гриба в условиях как инфицирования растения патогеном, так и раневого стресса.

По аналогии с системами животных клеток (Kohsb, 1987; Куль-берг, 1987) обнарукенные нами генерализованные изменения структуры и функций илазмалеммы в сочетании с локальными конформациошш-ыи изменениями и активацией дискретных рецепторов являются необходимым фактором последующей трансакции сигнала на геном растительной клетки, ,

В качестве сигнальных молекул в фитоиммунитета Зпберсхейм (Altersheim, Darvill, .1985) и Риан (Ryan, 1987) предлагает фрагменты ß-глюканов, хитина и хитозана, олигогалактурониды, состоящие из нескольких углеводных единиц со строгой пространственной

ориентацией, названные общим тормпном - олигосахарянн* Процосс активации олигосахариноми гонов растительной клетки не известен. Однако имеются сведения, что молекулы сходного строения проникают внутрь клетки, непосредственно взаимодействуют с ДНК и таким образом инициируют экспрессию гонов (Hadwiger ot al., 1986). Эксп-ресспя генов растительной клетки, индуцированная патогеном либо раневым стрессом, проявляется сходным образом. Отмечена активация синтеза de novo нуюлеиновых кислот и белков, среди которых особая роль отводится оксипролпнбогатым глпкопротеинам (лектпнам); возрастает активность ряда ферментов, в том числе й-глгаканаз, хит.ч-наз, поктолптпческих ферментов; активируется синтез" фптоэлехенноз, этилена; происходит лигнификация п суберенпзация ткани, образование пограничной перидермы и т.д. (Нетлицкий, Озпрецковскэя, 1981,• Дьяков, 1983; Kuc, Rush, 1985; Ryan, 1987; Любимова, Салысова, 1988). Настояцез исследование впервые показало, что важное место в реакции растительной клетки на стрессовые воздействия ишпцпро-взиием или поранением занимает и структурно-Функциональная ппрз-стройка ее плазмзлеммы.

В "активированной" таким образом клетке повышенная чугстви-тельность плазмалеммн к метаболитам патогена, с одной сторсгш, _ усиливает межклеточное взаимодействие партнеров, обусловленное лектпн-углеводным взаимодействием,' что несомненно повитает эффективность ответной реакции хозяина, а с другой стороны, является причиной быстрой сверхчувствительной гибейц растительной клетки под действием токсических для растения метаболитов гриба. В случае флтофтороза картофеля такт/л токсическими мзтаболлташ являются вероятно Cgg-Hio-nneiioBiio аирные кислота гриба (арахидоновая и зйкозопентаенопая), знзыващпе гибель- клеток хозяина (Presi-a Eue, 1985). В погпбеих растительных клетках через несколько часов накапливаются Фитоалексшш, что, как предполагается (Kuc,I972: Метлпцкгй, Сзорзцковская, 1931), гызывает гибель прокикизго в эти клптгеп патогена. За счет быстрой гибели ограниченного число перо-"OHUirx клеток хозяина вместе с прошнешм з них патогеном' инфекция локализуете.1!, а пзсюляв в целом остается здоровым. Таким пред-стазляотся г.:схпш1гн устойчивости картофеля г. Титофторозу.

13 Еоскрлг'гепзой копблнашя ссрт картосГ:сля-раса гриба такче пмезтея лектп!-\тлгодное вгапмодеПстгно нрп межклеточном контакте партнеров. Однако в этом олутяе гзк?« вгяпмодейстгяе пч пркро-

лит к "активации" клетки хозяина. Иммунносупрессоры пораз;аше!1 расы гриба, комплементарные данному сорту картофеля, подавляют процесс "активации" клетки возможно на уровне ингибирования инду-цпроЕанного синтеза белков. В этом'случае растительная клетка остается "веактивпроъашюй", она мало чувствительна к токсическим из габолитам гриба, медленно погибает под их действием, в ней медленно накапливается фитоалексшш, медленно погибает патоген. За это время гифы гриба успевают проникнуть в соседние метки и поразить их. Область инфицирования распространяется все дальше л дальше, в конце концов захватывая вое растение. Таков •■предполагаемый механизм восприимчивости растения к патогену.

В,предлагаемой схема взаимоотношений растения-хозяина и грн-ба-патогена впервые предпринята попытка показать взаимосвязь поверхностных мен1шоточних взаимодействий партнеров, мембранных процессов и фитолектинов, изучаемых в настоящей работе, с литературными данными, поскЕцеиьикя, в основном, исследованиям проявления устойчивости хозяина в виде реакции СВЧ и накопления фигоала-ксинов, и их подавлению супрессэрамн гриба. Предлагаемая концепция мог.ет рассматриваться ¡сак основа для дальнейшего изучения т.ю— лекулярно-генатических механизмов фитоиммупитета как а теоретическом, так и практическом аспектах. Одним из напрзаюшы дальнейших исследований представляется изучение влияния лзктйя-гглобод-ного ьзакшдеВствия на активность генома растительной клетки, процесса образования сигнальных молекул г. их прародн.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДИ

1. Установлено, что лзктшш растительной клегга пзеемншшо участвуют в ызгккетэчном контакте и распознавании паогцгров при флтофтороза картофеля на уровне взаимодействия плезмалеммн растительной клеисо с клеточной поверхностью гкфы гриб:--патогена.

2. Лектнны плазшлигз клеток картофеля спешфтскк взаимодействуй? с углеводными лигандами поверхностных глшкшбитацов гриба.- Бзашодейстхшс Мсцпирузгся .остатками триптофана моле;:улы. лектина и остатками И-аиетпл-Д-глшозампна глнкопаптидов.

3. Дектлн-углеводноа взаимодействие имеет место как з устойчивой, так и в восприимчивей комбгяадав растанпе-натоген. вместе с тем оно заметно интенсивнее в устойчивой комбинации.

4 4. Впервые■ обнаружено; что клеточно-поверхноепше гликокон-ь-ыгаты патогена и раневой стресс индуцируют в клубнях картофеля

сходную структурную п функциональную перестройку плазиалестл растительной клетки. Это проявляется в повышении проницаемости мембран, активации синтеза белков плазмялеммн, в том числа и лектя-нов, усилении активности мембранносгазанных ферментов и лектт'о-вон активности плазмалеммных мпкровезпкул; при этом имеет место Tairae увеличение "текучести" лппндного матрикса плазмалег-мч, повышение содержания в нем ненасыщенных яирных кислот.

5. Впервые проведенный иммунноферментный анализ лектиков картофеля позволил определить количественное содерг.анпо дсктипов в плазмалемме глоток картофеля (ЗХ) и ого увеличение в ответ на раневой стресс (8%). Выявлено три соединения в составе плазмплем-мы, пммунологичеекп сходных с водорастворимым лектпнем картофзля.

6. Определение эффективных констант связывания антиген-антитело выявило наличие у лектппа двух популяций антигенных детэрмп-нант с высокой п низкой константами связывания: I^j- - (2+0,7)-•I010 ЬГ1 (23%) л Кс2 = (8,7+1,8)-I03 М-1 (17%) соответственно. Установлено, что предварительное связывание лектппа со специфическими углеводными лпгандаг.га на порядок увеличивало эффективность-взаимодействия антиген-антитело.

7. Покапано, что лектип-угловодное взаимодействии приводит к локальному изменению копформзцин молекулу лектина п уЕзлпчеппп степени ого экспонирования, что обеспечивает большую отертлосгуп доступность угловодсвязнвакстх центров молекулы лептпиэ.

8. Обнаруженные мембранные эффекты усиливают лектан-углрвод-ное взаимодействие при межклеточном распознавании партнеров и объясняют повшззнную реактивность таких перестроечник [.'лмбрзн растя -тельной '-летга ¡сак в условиях инфицирования растения патогеном, так к в услопяях раневого стресса. Изучсшше процессы раскрнват, по крзГдеЗ мзро частично, мзибракнкП механизм индуцирования кее-поапФачос-сой устоНэдзостп растэшш к неблагоприятным воздействиям Енслнл;с «зктороз.

9. основании полученных данных впервые предложена гипотетическая схема взаимосвязи поверхностных ме-клэточннх 'взйимодей-стбпй п пндуцпрозатпя'Х ими момбранпих процессов с проявления?? ус -•го1''л::востп пли воспр.ч.чмчппзсги растения к патогену.

Спчеок сскоечюг статей, опубликованных по г'птерпзлам диосер-

I. .~о;п,"спс:спя 5.П., Любимова Н.В., Ппоиенко Горзблс-

м Я.П., !'~-д7гТчГ1 Л.Б. л^паг-тзрттгт-а тршптя пртсрлчзттч-к.'м.г.у

моибран из клубнай картофеля // ДАН СССР.1979.Т.244.№3.0.759-762.

2. Ладыженская Э.П., Любимова II.В., Процешга U.A., Корабле-ва Н.П., '.'етлицкш! Л.В. Выделенио цитоплазмэтичсских мембран из клубней каотофеля // Методы современной биохимии. 1,1.: Наука, IS80. С. 7-13. '

3. Кораблева Н.П., Ладыженская Э.П., Любимова Н.В., Процен-ко U.A., Кадиру.анова Д.К., Ыетлнцкий Л.В. Еыделение и характеристика Фракции, обогащенной плазмалеммой, из паоенхимы клуйней картофеля // Зимология растении.I980.T.27J£6.C.I249-I258.

4. Еагдасарян С.Г., Ладыяенская Э.П., Любимова II.В., Кораб-лова II.П., Штлпцкпй Л.В. Катион-стимулируемая АТФазная активность поопарата плазмалемми из паренхимы клубней каотосЬеля // Пршслад. биохим. микробиол., 1982. Т. 18. М. С. 554-551/

5. Любимова Н.В. О роли патотоксинов в опоеделении специфичности взаимоотношений растений-хозяев и их патогенов // Пршслад. 6i:OXiJM. микробиол., 1982.Т.18.К2.С. 147-153. (Обзор)

6. Любимова Н.В. Роль растительной плазмалеммы во взаимоотношениях пастения г, его патогена // Микология и фитопатология. I9S2. Т. 16. й I. С. 70-78. (Обзор)

7. Любимова Н.В., Озерецковская О.Л. Роль растительной плаз- . малешы в специфичности взаимоотношений растения-хозяина и его патогена // Биохимия иммунитета, покоя, старения растений. I,!.: Наука. 1334. С. 91-104. (Обзор)

8. Кораблева Н.П., Ладыженская Э.П., Процешсо H.A., Любимо-

. ва Н.В. Цитоплазматическая мембрана как объект для изучения механизма действия регуляторов роста растений //Там see. С. 166-180.

9. Любимова Н.В., Еерулидзе Г.Р. Включение ^С-лейцина в белки плазмалеммы клубней картофеля // Физиология растений. 1984.

Т. 31". Jp 4. С. 784-791. "

10. Любимова Н.В., Верулидэе Г.Р. Биосинтез белков плазмалем-мы паренхимпнх ¡слеток клубней картофеля // Биохимия. 1984. Т. 49. № 5. С. 781-786.

11. Любимова Н.В., Верулидзе Г.Р., Озерецковская О.Л., Ыет-лицкий Л.Е. Активация биосинтеза плазмалемшшх белков клубней као-тофеля в ответ на поранение // ДАН СССР. 1984. Т. 275..№2. С. 497-501."

12. Любимова Н.В., Верулидзе Г.Р. Изучение балков плазмалем-мы клубней картофеля и их роли в устойчивости к фптофторозу // Приклад, биохим. микробиол., 1986. T.22J£2. С.272-281.

13. bakhtln V.Ii., lyubimova U.V., Lectin-carbohydrate Interaction under potato Blight // Proceeding of the-9-th International Symposium on Glycoccn;Jugate3. Lille. 1987. G18.

14. Любимова Н.В., Верулидзе Г.P., Метлицкий Л.В. Влияние раневого стресса на состав и синтез белков плазмалеммы клубней картофеля .// Физиология растений. 1987. Т. 33. Ji I. С. 135-142.

15. Любимова Н.В., Лахтин Б.1,1., Шувалова Е.П., Бинюков В.И. Структурно-Функциональные изменения цитоплазматической мембраны растительной клетки под влиянием раневого стресса // Приклад, биохйм.микробиол., 1988. Т. 24. № I. С. II0-II8.

■16. Любимова Н.В., Лахтин В.М.,. Шувалова Е.П., Щербухин В.Д. С-Лектин-углеводное взаимодействие в системе картофель-возбудитель

фитофтороза на уровне растительной плазмплпммн // Гипнология растений. 1980. Т. 35. Jt 5. С. 8VCJ—Ь70.

17. Любимова If.В., Салькопп Е.Г. Локтин-углеводпое взаимодействия во взаимоотношениях рпстпнио-плтогои //Г1рш(лпя,.биохнм.мнк-робиол., I9BQ. Т. 24. № 5. С. -595-G07. (Обзор)

18. Любимова Н.В. Злоктрофирез 14С-мочених белков ци то пл.тематической мембраны тканой клубной клртоЫлл в присутствии доцо-цилсульфата // Ilouun методы практической биохимии. И.: Наука. 1988'. С. 226-232.

19. Lyublmova M.V., Sallrava E.G. Mechanlsn of plant-pathogen recognition and induction plant rosiotance to dlseas,-«3 // Proceeding of tho 14-tli International Сопдгезз of Biochemistry. Prague.' 1900. P. 607.

20. Lyubimova H.V. , Lakhtin V.U., 31iohorTiuJchin V.D. Lectln-earbohydrato Interaction nnd lt3 role in cell-cell гесо;;п!Чсп of potato Blight fundus // Proc. of 10-th Int. Lectin Conf..Prague, 190Q.H77.

21. Merzlyak И.Ц., Koahulln P.A., Lyublnova n.V. Розз1Ь1е rolo of lootin in interaction of potato plasma membrane and riiy-tophtliora infe3tan3 clycoconjugatos // Proceeding of ths 10-th International Lectin Conference, Prague, 1980, N03.

22. Любимова H.B., Салькова Е.Г. Межклеточное распознавание

п индуцирование устойчивости картофеля к возбудителю Фитофторе за// Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микрооргани-

змов с растениями, Пушино: Научный центр биологических исследований АН СССР. IS89. С. 158-163. (Обзор)

. Любимова Н.В., Шувалова Е.П., Лпхтин В.М., Дявлотшинл !.' стина во взаимодействии плазмллемми- клеток карте} еля'с ¡-поверхностными метаболитами возбудителя фитофгороза // »аписки Тартусского университета "Изучение и применение з". Тарту: Изд-во ТТУ. 1989. Вып. 870. С. 62-72,

23. Любимова Н.В., Шувалова Е.П., Лпхтип В.М., Дявлотшинл 1.1.Л. Роль лектина во взаимодействии плазмллемми- клеток картофеля'с клеточпо-пове " ' ' Учонне записк. лектинов"

24. Любимова Н.В., Салькова Е.Г. Фитолектинн во взаимоотношениях растений и патогенных микроорганизмов..Там же. С.З-9(обзор)

25. Lyublmova H.V., ShuvaLova Е.Р., Shcherbukhin Y.D., Seiko -va E.G. Potato lectins and their role in tho host resistance to Blight fun/jus // Proceedings of the 11-th International Lectin Conference, Tartu, 1909, N89.

26. Хзшулин П.А., Любимова H.B.. Шувалова Е.П., Дявлетмипа М.Л., Чивкунова О.Б., Решетникова И.В., Мерзляк И.Н. Структурные изменения в плазматических мембранах клртогеля иод влиянием гли-коконъкглтов возбудителя Фитофгороза //"Физиология растений. 1990. Т. 37. № I. С. I53-161.

27. Lyublnova N.V., itashulin Р.Л. , Lakhtin V.tl., Shcherbukhin V.D., Kerzlyak M.H. Lectln-carbotiydrnte interaction end its role in the cell-cell recognition in the system potato tuber.potato Blight fun/jus // Lectins» Biology, Biochemistry, Clinical Eioehi»c.l3trv, ed. Т,С.Ео/»-Напзеп. Eerlint Vblter de Gruyter. 1940. V. 7.

?G. LyuMrr.ova H.V. , Shcherbukhin V.D. Епгуг.е Irr-unoassay of of potato lectin // Proceeding's of the 12-th International Lectin Conference. California, D?vlsГ 1990. P. 67.

29. Любимова 1KB. Процессы ыекклаточного узнавания и индуцирование устойчивости картофеля к болезням // Биохимия хранения картофеля, овошей и плодов. М.: Наука, 1991. С. 61-67.

30. Л1Х5имовз Н.В., Щербухин В.Д. Мегжле точное распознавание и индуцирование устойчивости при фиТофлорозо картофеля // Приклад .биохим .¡.шкробиол. , 1991.Т.27Ы.С.3-16. (Обзор)

31. Любимова II.В., Шувалова Е.П., Агафонова Н.В., йеодев А.В., Щербухин В.Д. Ишунофчэрментний анализ лектипа картофеля // ХГрик-лад.биохим.иикробиол., 1991. Т. 27. )i\ 4. С. 145-155.

32. Кашулин II.А., Любимова Н.В,, Мерзляк Ы.Н., Щербухин В.Д. Структурные изменения свободного и мембраниосвязанного лектина картофеля под влиянием олнгомеров н-ацетил-Д-глюкозаминл // Приклад.биохим.мпкробиол.., 1991. т. 27. к 6.

33. byubimova it.V., Shchexbuhin V.D. Potato lectins and their role in the host resistance to Blightfunsus // lectinst Biology, biochemistry, Clinical Biochemistry, 13d. T.C. E/g-Han-sen. .Berlin» Valter de Gruyter. 1991. V.8.P.