ДНК маркеры генов устойчивости к фитофторозу у картофеля и его дикорастущих сородичей

Соколова, Екатерина Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ДНК маркеры генов устойчивости к фитофторозу у картофеля и его дикорастущих сородичей
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "ДНК маркеры генов устойчивости к фитофторозу у картофеля и его дикорастущих сородичей"

005008217

На правах рукописи

СОКОЛОВА ЕКАТЕРИНА АНДРЕЕВНА

ДНК маркеры генов устойчивости к фитофторозу у картофеля и его дикорастущих сородичей

Специальность 03.01.06. - биотехнология (в том числе бионанотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 Я Н В 2012

Москва-2011

005008217

Работа выполнена в лаборатории ДНК маркеров растений Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии Российской академий сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИСБ РАСХН).

Научный руководитель: Эмиль Ефимович Хавкин

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Степан Димитриевич Киру

доктор биологических наук Александр Александрович Соловьев

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: Институт общей генетики

Имени Н.И. Вавилова РАН.

Защита диссертации состоится «_»_ 2012 г. в «_» _часов

на заседании диссертационного совета Д.006.027.01 Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская 42.

Тел. 8(499) 977-65-44, Факс 8(499) 977-09-47; e-mail: iab@iab.ac.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии. Автореферат размещен на Интернет-сайте www.vniisb.ru

Автореферат разослан « »_2012 г.

Ученый секретарь . . диссертационного совета, кандидат биологических наук

С.А. Меликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Картофель (Solatium tuberosum L.) является четвертой по значению продовольственной культурой в мире. Ежегодно значительная часть урожая картофеля теряется из-за фитофтороза, болезни, вызываемой оомицетом Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу (Fry, 2008; Gruenwald and Flier, 2005; Haverkort et al., 2009).

Начиная со второй трети XX века, для борьбы с фитофторозом использовали R гены устойчивости, перенесенные из дикорастущего вида Solarium demissum Lindl. Для идентификации R генов S. demissum в растениях картофеля применяются фитопатологические методы, основанные на наборе простых рас P. infestans. Этот метод позволяет идентифицировать R гены, однако не дает представления об их строении и полиморфизме, а также неудобен для массового скрининга растений.

Важную роль в исследовании расоспецифичных генов устойчивости к фитофторозу (за ними сохраняется название R генов) и создании устойчивых сортов картофеля сыграло использование молекулярных маркеров (marker-assisted selection). Вслед за картированием локусов устойчивости, соответствующих R генам, Gebhardt et al. (Ballvora et al., 2002; Gebhardt et al., 2004) охарактеризовали последовательность гена Rl, а затем создали на основе этой последовательности простой метод выявления данного гена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот и другие специфичные SCAR (sequence characterized amplified region) маркеры, созданные на основе нуклео-тидных последовательностей R генов, удобны в работе и дают один сигнал амплификации. Использование молекулярных маркеров позволяет быстро обследовать большие выборки растений, что дает существенные преимущества по сравнению с традиционными фитопатологическими методами определения R генов. С помощью SCAR маркеров R генов можно выявить потенциальные доноры генов устойчивости в генетических коллекциях, облегчить

отбор устойчивых растений в расщепляющихся популяциях и определить, сохранились ли гены устойчивости после многократных скрещиваний и в процессе многолетнего культивирования сортов картофеля. Использование этой технологии позволяет идентифицировать у культурных и дикорастущих форм Solanum секции Pelota не только уже охарактеризованные R гены устойчивости к фитофторозу, но и их структурные гомологи с еще неизвестными функциями.

Таким образом, изучение полиморфизма R генов и их гомологов у сортов картофеля и дикорастущих клубненосных видов Solanum и создание на основе данного полиморфизма ДНК маркеров устойчивости картофеля к фитофторозу является актуальной задачей, решение которой облегчит и ускорит создание новых сортов картофеля.

Цель и задачи исследования

Цель работы - создание ДНК-маркеров генов устойчивости к фитофторозу картофеля, анализ связи между присутствием R генов и фенотипической устойчивостью сортов и гибридов картофеля к фитофторозу и изучение распространения гомологов R генов S. demissum за пределами этого вида.

Для достижения поставленной цели в диссертационной работе решались следующие задачи:

1. Сравнительное изучение первичной структуры R генов устойчивости к фитофторозу и их структурных гомологов у картофеля и дикорастущих форм Solanum секции Pelota.

2. Создание высокоспецифичных SCAR маркеров генов устойчивости к фитофторозу на примере R1 и R3a генов и верификация этих маркеров.

3. Определение связи между присутствием R генов и фенотипической устойчивостью сортов картофеля к фитофторозу.

4. Изучение распространения структурных гомологов R генов за пределами S. demissum - вида, наиболее часто используемого в качестве источ-

ника признака устойчивости к фитофторозу, для поиска новых источников устойчивости.

5. Сравнительный структурный анализ R генов-прототипов и их гомологов из дикорастущих видов Solanum секции Petóla.

Научная новизна результатов

1. Создана новая серия специфичных SCAR маркеров, обеспечивающих распознавание генов R] и R3a.

2. Впервые установлена значимая связь между присутствием SCAR-маркеров R генов у отечественных и зарубежных сортов картофеля и их фенотипической устойчивостью к фитофторозу в полевых и лабораторных испытаниях.

3. Впервые обнаружены и идентифицированы на основании первичного строения гомологи генов R1 и Ría у дикорастущих видов Solanum секции Pelota за пределами вида S. demissum, в котором они были исходно описаны.

Практическая значимость работы

1. Создан эффективный инструмент для интрогрессивной селекции картофеля: высокоспецифичные SCAR-маркеры R генов устойчивости картофеля к фитофторозу - и проведена верификация этих маркеров,

2. На больших выборках сортов и гибридов картофеля показана возможность использования маркеров R генов для предварительного отбора устойчивых к фитофторозу растений, перспективных для дальнейшей оценки.

3. Расширен функциональный набор ДНК-маркеров, позволяющих вести поиск потенциальных генов устойчивости в коллекциях дикорастущих сородичей картофеля.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования и обсуждение» и «Заключение», выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 189 названий, 3 приложений. Работа изложена на 170 машинописных страницах, содержит 21 рисунок и 14 таблиц.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы девять работ, семь из которых соответствуют перечню ВАК Минобрнауки РФ, в том числе три - в журналах Доклады РАСХН и Plant Genetic Resources.

Результаты исследования были доложены на Пятом Съезде Вави-ловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), на Всероссийской конференции «Использование мировых генетических ресурсов ВИР в создании сортов картофеля нового поколения» (Санкт-Петербург, 2009), The Second International Symposium "Genomics of Plant Genetic Resources" (Bologna, Italy, 2010); The 18th Triennial Conference of the European Association for Potato Research (Oulu, Finland, 2011); The 12th and 13th EuroBlight workshops (Arras, France, 2010; Санкт-Петербург, Россия, 2011).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе было использовано более 400 генотипов Solanum, в том числе свыше 200 сортов и гибридов картофеля отечественной и зарубежной селекции и 213 форм дикорастущих сородичей картофеля, представляющих 23 вида Solamim секции Petota по классификации Хокса (Hawkes, 1990). Материалом для исследований служили клубни, семена и пробирочные растения из коллекций ВНИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха (ВНИИКХ, пос. Коренево, Моск. область); ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР, С.-Петербург), ВНИИ фитопатологии (ВНИИФ, Большие Вяземы; Моск. область) и НПЦ по картофелеводству и плодоовощеводству HAH Республики

Беларусь (пос. Самохваловичи, Минская область). Растения дикорастущих видов Solanum были выращены из семян, полученных из ВИР (VIR), Россия; The Centre for Genetic Resources (CGN), Нидерланды; The International Potato Center (CIP), Перу; IPK Genbank Aussensteile Nord (GLKS), Германия; The ARS Potato Introduction Project (PI), США. В работе использовалось два набора растений-дифференциаторов. Первый набор создан в CIP (Centro International de la Papa, Международный Центр картофеля, Лима, Перу), а вторая коллекция принадлежит the Scottish Agricultural Science Agency (SASA).

Результаты фитопатологического генотапирования с простыми и сложными расами P. infestons, включающими от 1 до 4 генов вирулентности (1; 3; 4; 10; 11; 1.2; 1.3;1.4; 2.4; 3.4; 1.2.4; 1.З.4.; 1.2.3.4), и оценки устойчивости сортов и гибридов картофеля, а также дикорастущих видов Solanum к фитоф-торозу в полевых и лабораторных испытаниях со сложной расой, включающей 11 генов вирулентности, получены сотрудниками ВНИИФ и ВИР в рамках совместного проекта МНТЦ 3714р.

Геномную ДНК выделяли из молодых листьев растений двумя способами: по протоколу, основанному на СТАВ-методе (Saghai-Maroof et al., 1984), и с помощью набора для выделения ДНК AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit (Axygen). Амплификацию ДНК проводили в термоциклерах Терцик (ДНК-технология), PTC-200/DNA Engine (MJ Research/BIO-RAD). Для амплификации ДНК и электрофореза фрагментов ДНК использовали стандартные методы (Sambrook and Russell, 2001). Для клонирования фрагментов ДНК использовали лабораторные штаммы Е. coli DH5a и JM109. ПЦР продукты очищали при помощи набора реагентов для быстрой очистки QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) по протоколу фирмы-производителя. Метод основан на использовании колонок (QIAquick spin column) для очистки ПЦР фрагмента. Лигирование по липким концам осуществляли в pTZ57R/T Vector, по тупым концам - в pJETl,2/blunt Vector по стандартному

протоколу с использованием наборов для клонирования InsTAclonelm PCR Cloning Kit и CloneJET'm PCR Cloning Kit (Fermentas/ Плазмиду выделяли из клеток по стандартному протоколу с помощью набора Wizard Plus SV Minipreps (Promega). Выделенные плазмиды секвенировали в лаборатории анализа генетически модифицированных организмов ВНЙИСБ.

Для подбора и оптимизации ПЦР-праймеров, идентификации и анализа клонированных последовательностей, поиска структурных гомологов в базах данных и множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали программы NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), Lasergene 7.0 (DNASTAR) и Oligonucleotide Properties Calculator (http://www.basic.northwestem.edu/biotools). Поиск гомологий осуществлялся по базам данным NCBI GenBank (CoreNucleotide, EST, GSS).

Для филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей использовали программу PHYLIP (Version 3.2) (Felsenstein, 1989). Статистический анализ связи между различными показателями проводили с помощью непараметрического U теста Манна-Уитни (Mann, Whitney, 1947) и коэффициента корреляции Спирмена с использованием пакета SPSS Statistics 17.0 (http://www.spss.com).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Создание SCAR маркеров R генов. В работе были созданы новые маркеры на гены R1 и R3a, поскольку известные из литературы маркеры R1-1400 и RT-R3a оказались неудобными для массового ПЦР анализа (табл. 1). Создание новых SCAR маркеров R1-1205 и R3-1380 было основано на множественном выравнивании этих генов с их функциональными и нефункциональными структурными гомологами из базы данных GenBank NCBI. Такое выравнивание позволило выявить участки, специфичные для функциональных R1 и R3a генов, и сконструировать праймеры, комплементарные этим участкам (Рис. 1).

Эти праймеры позволяют отличить R1 и R3a гены от их многочисленных гомологов с неизвестными функциями. С помощью программы Oligonucleotide Properties Calculator была установлена расчетная температура отжига праймеров, и они были проверены на отсутствие вторичных структур (шпилек) и самокомплементарности. Затем эмпирическим путем подбирали оптимальную температуру отжига праймеров, продолжительность стадий и число циклов ПЦР реакции.

R1F

R3F

R1 ген

R1R

R1-12051 маркер J

"1205 bp|

4101 bp

R3-1380 маркер

R3R

1380 bp R3 ген_

3849 bp

Рисунок 1. Строение генов R1 и R3a и положение маркеров R1-1205 и R3-1380.

Таблица 1. Маркеры R генов

Ген Маркер Праймеры 5'-3' последовательность праймеров Темп, отжига, °C

R1 Rl-1400 76-F 76-R* CACTCGTGACATATCCTCACTA CAACCCTGGCATGCCACG 55

Rl-1205 76-F 6300-R CACTCGTGACATATCCTCACTA GTAGTACCTATCTTATTTCTGCAAGAAT 61

R3a RT-R3a RT-R3a-F RT-R3a-R** ATCGTTGTCATGCTATGAGATTGTT CTTCAAGGTAGTGGGCAGTATGCTT 68-55

R3-1380 R3a-F R3a-R TCCGACATGTATTGATCTCCCTGAGCCA CTTCAGCTTCTTACAGTAGG 64

*Ballvora et al. 2002; **Huang et al., 2005.

Структурная верификация SCAR маркеров генов R1 и R3a. Фрагмент гена R1 длиной 1205 п.н. клонировали из сортов картофеля Ильинский и Скороплодный, несущих генетический материал S. demissum, и определяли нуклеотидную последовательность этих фрагментов. Сравнение нуклеотид-ного состава полученных клонов с геном-прототипом R1 из S. demissum (номер регистрации в ГенБанке AF447489) показало, что два клона из сорта Ильинский (JN609616) полностью идентичны соответствующему участку гена-прототипа, а в последовательности третьего клона (JN609615) присутствуют две синонимичные замены. Один клон из сорта Скороплодный (JN609618) полностью совпадал с геном R1, в другом (JN609617) найдена одна синонимическая замена, а в третьем (JN609619) - одна несинонимическая замена, соответствующая замене гистидин-аргинин.

Фрагмент гена R3a длиной 1380 п.н. клонировали из сортов Adretta, Никулинский и Архидея (JN609620, JN609621, JN609622). Последовательности этих фрагментов были полностью идентичны последовательности гена R3a (AY849382). Эти данные свидетельствуют о специфичности маркеров R1-1205 и R3-1380 по отношению к генам R1 и R3a.

Для верификации и определения распространения маркеров R генов в сортах картофеля и у его дикорастущих сородичей использовали большие выборки (сеянцы и клоновые растения) дикорастущих видов S. demissum и S. stoloniferum, сортов и гибридов картофеля, содержащих генетический материал S. demissum и S. stoloniferum, а также серию растений-дифференциаторов (специально подобранные сорта с генетическим материалом S. demissum, различающие расы Р. infestans\ Bradshaw, 2009). Образцы S. tuberosum ssp. tuberosum L., заведомо не содержащие генетического материала S. demissum и S■ stoloniferum, служили отрицательным контролем, так как с данными образцами маркеры генов R1 и R3a не давали сигнала амплификации.

При анализе растений-дифференциаторов маркеры гена RI R1-1400 и R1-1205 были найдены не только в дифференциаторе R1, но также в дифференциаторах R5, R6 и R9 (рис. 2а). Сходные результаты были получены Trognitz and Trognitz (2007) для маркера R1-1400. Недавно Kim et. al., (2011) показали с помощью фитопатологических и молекулярных методов, что дифференциатор R9 содержит несколько R генов (RI, R2, R3a, R3b, R4, R8, R9). Возможно, что дифференциаторы R5, R6 также несут ген RI. Секвени-рование фрагментов генома, соответствующих маркеру R1-1400, доказало их полную идентичность гену-прототипу.

Маркеры гена R3a были найдены у дифференциаторов R3 и R6-R9, при этом маркер R3-1380 был обнаружен у всех этих дифференциаторов, а маркер RT-R3a- только у дифференциаторов R3 и R6-R8 (рис. 26). В работе Kim et. al., (2011) показано, что дифференциаторы R8 и R9 несут гены R3a и R3b. Секвенирование нуклеотидных последовательностей маркера R3-1380 из дифференциаторов R7 и R9 показало, что эти фрагменты генома были практически полностью идентичны гену-прототипу R3a.

(а)

Рисунок 2. Маркеры Rl-1205 (a), R3-1380 (б) в растениях-дифференциаторах из набора SASA. К - отрицательный контроль, М - молекулярный маркер GeneRuler 1 kb DNA Ladder Plus.

Функциональная верификация SCAR маркеров генов R1 и R3a

Полное или практически полное сходство последовательностей маркеров генов R1 и ЯЗа с генами-прототипами само по себе не доказывает, что наши маркеры обнаруживают функциональные R гены. Поэтому мы сопоставили результаты маркерного анализа R генов с результатами фенотипическо-го анализа их активности - устойчивости к фитофторозу, которую определяли несколькими фитопатологическими методами другие участники проекта МНТЦ 3714р.

Согласие фитопатологического метода (с использованием простых рас P. infestans) и маркерного анализа составляло 74% для гена R1 и 70% для гена R3a. В случае гена R1 частота встречаемости гена была выше по фитопатоло-гическим данным, чем по результатам маркерного анализа. Это может быть связано с тем, что наши маркеры не амплифицируют активные копии гена с заменами в областях, комплементарных используемым праймерам. Напротив, ген R3a по фитопатологическим данным встречался реже, чем по молекулярным. Возможно, наш маркер гена R3a выявляет также аллельные формы R3a - гены R5-R11 (Hein et al., 2009). Несовпадение данных также может быть связано с тем, что исходные простые расы были отобраны на дифференциаторах, содержащих несколько R генов. Действительно, прямое исследование полиморфизма генов Avr3a и Avr4 в простых расах P. infestans, проведенное в рамках проекта МНТЦ 3714, обнаружило более широкий спектр Avr генов, чем это исходно предполагалось, и набор Avr генов не везде соответствовал исходным представлениям о простых расах (Pankin et al., in preparation).

Таким образом, в диссертационной работе были созданы SCAR маркеры, которые можно использовать для массового скрининга сортов и дикорастущих видов Solanum на наличие R1 и R3a генов и установления их связи с фенотипическим проявлением устойчивости.

Наследование маркеров генов R1 и R3a у сортов картофеля. Скрининг сортов и гибридов картофеля с помощью маркеров R1-1205 и R3-1380 позволил проследить наследование этих маркеров в поколениях. В качестве примера рассмотрим гибриды, полученные при скрещивании сортов Никулинский и Петербургский. Оба родителя несут маркеры R1-1205 и R3-1380. У 13 из 18 исследованных форм, полученных при клубневом отборе, одновременно присутствуют маркеры R1-1205 и R3-1380, у трех гибридов эти гены встречаются по отдельности и только у двух гибридов отсутствуют оба маркера. Сходная сегрегация маркеров генов R1 и R3a показана и в других гибридных комбинациях. Вместе с тем, ни в одном из рассмотренных скрещиваний маркеры R1-1205 и R3-1380 не появлялись у гибридов в тех случаях, когда они отсутствовали у родительских сортов.

Маркеры R генов как предикторы устойчивости. Используя маркеры генов R1 и Ria, мы исследовали 132 сорта и 71 гибрид картофеля. Присутствие маркеров генов R1 и R3a у 118 сортов картофеля сопоставляли с их родословными и теми сведениями об устойчивости к фитофторозу (полевая оценка), которые приведены в каталогах сортов (паспортные данные). Чтобы выявить вклад генов RJ и R3a в устойчивость, мы сравнили показатели устойчивости в четырех выборках генотипов картофеля, различающихся по результатам маркерного анализа, с тремя контрольными выборками. Четыре выборки состояли из сортов, несущих порознь и вместе маркеры R1-1205 и R3-1380 (табл. 2). Контроль 1 представлял собой все формы без маркеров R1 и R3a. Эту выборку разделили на две:

- контроль 2, содержавший только сорта, несущие генетический материал S. demissum и S. stoloniferum, но при этом без маркеров генов R1 и R3a\

- контроль 3, который содержал сорта, свободные от генетического материала S. demissum и S. stoloniferum (такие образцы S. tuberosum были представлены формами Chilotanum и по преимуществу раннеспелыми сортами

картофеля - потомками Early Rose и Daber, отобранным еще в 19 веке из форм Chilotanum).

Статистический анализ с помощью U-теста Манна-Уитни, проведенный в работе, показал значимую связь между присутствием маркера R1-1205 или одновременно маркеров R1-1205 и R3-1380 и устойчивостью ботвы и клубней картофеля к фитофторозу.

Таблица 2. Связь «паспортной» устойчивости картофеля к фитофторозу с присутствием маркеров Ш и ЯЗа генов

Сорта картофеля Средний балл устойчивости при полевой оценке (в скобках число исследованных сортообразцов) % сортов с высокой устойчивостью к фитофторозу (7-9 баллов)

Ботва Клубни Ботва Клубни

с маркером R1-1205 6.00 (26)ас 6.68 (26)ас 50.00 72.00

с маркером R3-1380 5.60 (20)с 6.06 (17)° 25.00 47.10

с маркерами R1 и ЯЗа генов 6.07 (13)ас 6.46 (13)с 38.46 53.85

все формы с маркерами R1 и R3a генов 5.86 (59)ас 6.44 (55f 37.29 60.00

контроль 1; все формы без маркеров R1 и R3a генов 4.98 (59)с 5.62 (53) 25.42 34.61

контроль 2: сорта с генетическим материалом S. demissum и S. stoloniferum без маркеров R1 и ЯЗа генов 5.40 (42)с 5.80 (42) 33.33 38.09

контроль 3: формы tuberosum, свободные от генетического материала S. demissum и S. stoloniferum без маркеров R1 и R3a генов 3.80 (17)аЬ 5.10(11) 5.88 18.18

а - Отличается от контроля 1 при 5% уровне значимости; Ь - Значимо отличается от контроля 2 при 5% уровне значимости; с - отличается от контроля 3 при 1% уровне значимости по и-критерию Манна-Уитни.

Распределение частот сортов, несущих только маркер Rl-1205, и сортов без обоих маркеров по шкале от 1 до 9 баллов устойчивости ботвы и клубней

к фитофторозу показало, что среди сортов с маркером Ш-1205 50% имели высокую устойчивость ботвы (7-9 баллов) и 72% - клубней.

Связь между высокой устойчивостью сортов и присутствием маркера 113-1380 показана только для устойчивости клубней. Так 47% сортов с маркером гена ЯЗа имели балл устойчивости 7-9 против 35% без обоих маркеров. При этом на долю сортов с баллом 7, как и в случае маркера гена Ш приходилось более 40% сортов, но был также высок процент сортов с баллом 5.

Для 78 сортов и 71 гибрида присутствие маркеров N генов было сопоставлено с оценками устойчивости к фитофторо\зу за два года полевых испытаний и за четыре года лабораторных испытаний, проведенных в лаборатории М.А. Кузнецовой во ВНИИФ. В полевых условиях определяется устойчивость растений к естественному фону заражения (смесь рас Р. т/виат). Устойчивость отделенных листьев и клубней определяли с помощью сложной расы 1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11. При заражении сложной расой Р. т/е№т происходит подавление всех генов расоспецифической устойчивости и, таким образом, мы можем оценить полигенную расонеспецифическую устойчивость. Поэтому в этом тесте гены Ш и ЯЗа не должны вносить вклад в устойчивость. Однако устойчивость сортов, несущих Ш и КЗ а гены, была существенно выше, чем у сортов без Я генов, что может объясняться сцеплением этих генов с другими генами устойчивости, которые не преодолевает раса 1-11 (табл.3).

С помощью коэффициента Спирмена была показана высокая корреляция (0,01% уровень значимости) лабораторной и полевой оценок устойчивости. Лабораторная оценка является более жесткой, чем полевая: средний балл лабораторной устойчивости был на балл ниже, чем полевой. Сорта, аттестованные при лабораторной оценке баллом 6, относятся к высокоустойчивым.

Показатели устойчивости сортов по данным ВНИИФ были в среднем на балл ниже паспортных данных полевой устойчивости сортов к фитофторозу, но по-прежнему сохранялась статистически значимая связь между присутст-

вием маркера гена Я1 или одновременно маркеров генов Я1 и ЯЗа и устойчивостью сортов к фитофторозу. Доля сортов, несущих маркеры генов Я1 и Я1+Я3а и обнаруживающих высокую устойчивость к фитофторозу при полевой оценке, составила более 50%.

Таблица 3. Связь устойчивости картофеля к фитофторозу по данным ВНИИФ с присутствием маркеров Я1 и ЯЗа генов* _

Сорта картофеля Устойчивость, средний балл % сортов с высокой устойчивостью

ЛТ* ПТ* ЛТ (6-9 баллов) ПТ. (7-9 баллов)

с маркером Ш-1205 4.58(18)" 6.00 (8)аЬс 27.70 62.50

с маркером 113-1380 4.79(14)" 5.27 (11)с 28.50 27,30

с маркерами Я1 и ЯЗа генов 4.97(12)" 6.03(10)"06 50.00 50.00

все формы с маркерами Я1 и ЯЗа генов 4.74(44)" 5.7 (29)с 34.10 41.40

контроль 1: все формы без маркеров Я1 и ЯЗа генов 4.13 (34)с 4.62(24)° 17.70 25.00

контроль 2: сорта с генетическим материалом 5. с^ет^.тт и .чЫот/егит без маркеров Я1 и ЯЗа генов 4.44 (27)с 5.08 (18)с 14.81 27.77

контроль 3: формы шЪегояит, свободные от генетического материала 5. ¿/еот/жуити и 8. зЫот/егит без маркеров Я1 и ЯЗа генов 3.2 (7)аЬ 3.41 (6)аь 0 0

*ЛТ - лабораторный тест; ПТ - полевой тест, а - отличается от контроля 1 при 5% уровне значимости по и- тесту Манна-Уитни; Ь - отличается от контроля 2 при 5% уровне значимости; с - отличается от контроля 3 при 1% уровне значимости.

Для гибридов картофеля нам не удалось показать связь между присутствием Я генов по молекулярным данным и устойчивостью к фитофторозу. Это, скорее всего, связано либо с высоким уровнем горизонтальной устойчивости у данных образцов, либо с тем, что по фитопатологическим данным гены Я1-Я4 присутствовали у 43 из 45 исследованных образцов.

Для 54 сортов и 45 гибридов во ВНИИФ было проведено фитопатологи-ческое генотипирование с простыми расами P. infestons по генам RI, R2, R3a и R4 (И.Н. Козловская, ВНИИФ, неопубл. данные). У большинства исследованных сортов и гибридов присутствовали R гены. При этом наиболее часто встречался ген R1 и сочетание генов RIR2, реже всего - ген R3a и другие комбинации R генов. Связь между присутствием R генов и устойчивостью при лабораторной оценке была показана для образцов, несущих ген R1 и гены R1R2. Связь между присутствием R генов и устойчивостью при полевой оценке показана для комбинаций генов RI, R1R2, R1R3, R3R4, R4.

Данные, полученные в тестах с простыми расами, свидетельствуют, что наиболее значимый вклад в устойчивость к фитофторозу делает ген R1 в сочетании с геном R2. Отдельно следует отметить, что в случае комбинации R1R2 процент сортов с высокой лабораторной устойчивостью к фитофторозу даже выше, чем в случае полевой, что может объясняться сцеплением гена R2 с другими генами устойчивости, которые не поражаются расой 1-11.

Таким образом, использование двух независимых подходов к обнаружению R генов доказало значимую связь между присутствием гена R1 и гена R2 (по фитопатологическим данным) и устойчивостью сортов и гибридов к фитофторозу.

Распространение R генов в секции Petota. Чтобы изучить распространение генов R] и R3a за пределами вида-источника S. demissum, мы исследовали 213 образцов 23 дикорастущих видов Solanum с помощью маркеров R1-1205 и R3-1380. Маркеры генов R1 и R3a обнаружены не только у S. demissum и S. stoloniferum, но и у других видов серий Demissa, Longipedicellata и диплоидных Tuberosa. Кроме того, маркер гена R3a был найден у более отдаленных видов: S. bulbocastanum, S. cardiophyllum и S. ehrenbergii. У S. brachycarpum были обнаружены оба маркера (табл. 4).

Полученные результаты подтверждают известные ранее фитопатологи-ческие данные о присутствии R генов за пределами серии Demissa (Букасов и

Камераз, 1972) и позволяют использовать наши маркеры для поиска новых гомологов Я генов устойчивости к фитофторозу в генетических коллекциях.

Таблица 4. Распространение маркеров R1-1205 и R3-1380 у дикорастущих видов Solanum._

Серии и виды Всего ис- Число образцов, не-

следовано сущих маркеры

образцов R1-1205 R3-1380

Bulbocastana S. bulbocastanum 23 0 t'Mkvft

S. demissum 39 16 f±i:;V 6:

S. hougasii 3

Demissa S. iopetalum 1 1 0

Longipedicellata S. fendleri 4 0 0

S. hjertingii 5 0 0

S. polytrichon 10 --kl" i 1

S. papita 4 0 ■1 1

S. stoloniferum 48 8

Pinnatisecta S. brachistotrichum 2 0 0

S. brachycarpum 2 ww'M^ ........-.1..

S. cardiophyllum 6 0 2 ,

S. ehrenbergii 13 0 2

S. jamesii 10 0 0

S. pinnatisectum 7 0 0

S. stenophyllidium 3 0 0

S. tarnii 3 0 0

S. trifldum 3 0 0

Polyadenia S. polyadenium 6 0 0

Диплоидные S. avilesii 2 0 0

Tuberosa S. berthaultii 6 1 0

S. microdontum 5 1 1

S. verrucosum 8 0 0

Верификация маркеров R генов за пределами серии Demissa. Маркер R1-1205 был клонирован и секвенирован из S. polytrichon и S. stoloniferum (сейчас, согласно ревизии секции Pelota (Spooner 2004), эти названия рассматривают как синонимы), а маркер R3-1380 - из S. bulbocastanum, S. cardiophyllum, S. hougasii, S. polytrichon и S. stoloniferum. Полученные последовательности на 98-100% гомологичны генам-прототипам (табл. 5).

Фрагмент гена Щ из S. ро1уМсИоп и 5. stoloniferum отличался от фрагмента гена ¡11 из (1епих<;ит однонуклеотидными заменами и делецией в б п.н. С этой последовательности может транслироваться белок, но он не полностью идентичен белку гена 111 из demissum. На участок с делецией у S. ро1у1псЬоп и Я. я1о1оп1/егит и этот же участок без делеции у 5. demissum были созданы праймеры, с помощью которых были проскринированы все образцы дикорастущих видов, у которых был ранее найден маркер Ш-1205. Скрининг показал, что делеция присутствует у всех образцов серии LongipediceПata и отсутствует у остальных видов с геном Ш.

Таблица 5. Сходство фрагментов RI и R3 генов из дикорастущих видов Solanum с генами-прототипами.__

Ген Виды Solanum Сходство с геном-прототипом, % гомологии

S. polytrichon (VIR 8815) НМ124852 99

R1 S. stoloniferum (PI 558477) гаплотип 1 HM124853 99

S. stoloniferum (PI 558477) гаплотип 2 HM124854 99

S. bulbocastanum (PI 275198) HM124855 98

S. bulbocastanum (PI 243508) HQ731036 91

S. stoloniferum (VIR 23652) 100

S. stoloniferum (GLKS 588) FJ175386 99

S. stoloniferum (PI 365401) HQ731037 98

R3a S. stoloniferum (PI 365401) HM 124856 98

S. stoloniferum клон 1 (CGN 18348) FJI75387 93

S. stoloniferum клон 4 (CGN 18348) FJ175388 95

S. cardiophyllum (VIR 24375) HM124857 99

X cardiophyllum (VIR 21301) 99

S. hougasii (VIR 8818) HM124858 99

S. polytrichon (VIR 24463) HM124859 98

Фрагменты гена КЗа из ЬиШоса.Мапит, S. саЫюр1\у11ит, S. кои^а.чИ, £ ро1уШс\юп и S. яЫот/егит также отличались от гена-лрототипа однонуклеотидными заменами и могли транслировать белок, который не полностью идентичен белку ИЗа из .У. ¿ет1язит. Фрагмент аминокислотной последова-

тельности из S. stoloniferum PI 365401 (HM 124856) был идентичен аминокислотной последовательности из S. bulbocastanum PI 275198 (НМ124855). Фрагменты из S. cardiophyllum VIR 24375 (НМ124857) и VIR 21301 оказались идентичны . Полноразмерные гомологи гена R3a из S. stoloniferum и S. bulbocastanum (HQ731036 и HQ731037) были на 98% и 91% сходны с геном-прототипом R3a из S. demissum (AY849382).

100

hou

•dms

sto 1

-|sto2l -Isto3l

bib 1

iph 1

-¡Sil -fitöTI

"tub 1

bib 2

•tub 2 "tub 3 "lye

Рисунок 3. Филогенетический анализ гомологов гена R3a (AY 849382) из дикорастущих видов Solanum (в рамке) с геном 12 (AF 118127) и R3-подобными не функциональными гомологами из NCBI Genbank (без рамки). Сокращения: S. bulbocastanum: bib 1, PI275198, НМ124855; bib 2, PI243508, HQ731036; S. cardiophyllum: cph 1, VIR 24375, HM124857; cph 2, VIR 21301; S. demissum. dms* ген R3a AY849382; S. hougasii: hou, VIR 8818, HM124858; S. lycopersicunr. lyc, 12, AFI 18127; S. polytrichon: pit, VIR24463, HM124859; S. stoloniferum: sto 1, VIR 23652; sto 2, GLKS 588, FJ175386; sto 3, PI 365401, HQ731037; sto 4, CGN 18348, FJ 175388; S. tuberosum: tub 1, I2GA-SH23-3, AY849384; tub 2,12GA-SH-23-1, AY849383; tub 3,12GA-SH194-2, AY849385. VIR, CIP, CGN, PI - сокращения названия банков откуда получены образцы (см. раздел «Материалы и методы»),

Сравнение фрагментов маркера R3-1380 из дикорастущих видов Solanum, секвенированных в нашей лаборатории, с геном R3a, геном 12 и Л5сг-подобными неактивными гомологами, последовательности которых были извлечены из Genbank NCBI, показало, что гомологи R3a гена из дикорастущих видов относятся к тому же кластеру, что и R3a ген из S. demhsum, и, следовательно, могут быть активными генами (рис. 3).

Полученные данные маркерного анализа и секвенирования еще не означают, что обнаружены перспективные гомологи генов R1 и R3a, однако они могут помочь в дальнейших исследованиях этих образцов дикорастущих видов, включая функциональный анализ гомологов R генов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В диссертационной работе были созданы и верифицированы ДНК маркеры RJ и R3a генов устойчивости к фитофторозу картофеля. Эти маркеры были использованы для скрининга 132 сортов и 71 гибрида картофеля, у которых параллельно определяли устойчивость к фитофторозу в полевых и лабораторных условиях и присутствие R генов фитопатологическими методами.

Показана связь между присутствием маркера гена R1 и одновременно маркеров генов RJ и R3a и фенотипической устойчивостью сортов картофеля к фитофторозу. Согласие данных о присутствии R генов, полученных с помощью маркерного анализа и фитопатологическим методом (с использованием простых рас Р. infestans), составило 74% для гена R1 и 70% для гена R3a. Ввиду сильного различия методов определения R генов, такое согласие данных маркерного анализа и фитопатологического можно считать высоким.

Полученные результаты открывают возможность использования вновь созданных маркеров для скрининга больших выборок сортов картофеля с целью предварительного отбора устойчивых к фитофторозу растений.

Для изучения распространения R генов, исходно охарактеризованных у S. demissum, за пределами этого вида маркеры генов R1 и R3a были использованы для скрининга 213 образцов 23 дикорастущих видов Solanum секции Petota. Маркеры генов R1 и R3a обнаружены у большинства видов серий Demissa, Longipedicellata и диплоидных Tuberosa, Маркер гена R3a был найден у более отдаленных видов: у S. bulbocastanum, S. cardiophyllum и S. ehrenbergii, y 5. brachycarpum были обнаружены оба маркера. Секвенирова-ние последовательностей генов R1 и R3a из этих дикорастущих видов показало, что гомология этих последовательностей с их генами-прототипами составляла 98 - 100%.

Полученные результаты подтверждают известные ранее фитопатологи-ческие данные о присутствии R генов за пределами серии Demissa и позволяют использовать созданные маркеры для поиска новых гомологов R генов устойчивости к фитофторозу у ранее не обследованных видов Solanum.

Работа проводилась в рамках проекта МНТЦ 3714р. Автор сердечно благодарит И. М. Яшину (ВНИИКХ), Л.И. Костину и Е. В. Рогозину (ВИР) и М.А. Кузнецову (ВНИИФ) за предоставленные образцы растений Solanum и данные об их происхождении и устойчивости к фитофторозу, а также лабораторию анализа генетически модифицированных организмов ВНИИСБ за секвенирование фрагментов ДНК и компанию «Синтол» за синтез олигонук-леотидов.

ВЫВОДЫ

1. Созданы и верифицированы специфичные SCAR маркеры генов R1 и R3a устойчивости картофеля к фитофторозу.

2. Показана связь между присутствием R генов, выявленных с помощью маркерного и фитопатологического анализа (с простыми расами Р. infestons), с фенотипической устойчивостью картофеля к фитофторозу в полевых и лабораторных испытаниях.

3. Помимо S. demissum и S. stoloniferum, маркеры генов 111 к R3a обнаружены у других видов серий Demissa, Longipedicellata и у диплоидных видов Tuberosa. Показано, что маркер гена R3a распространен значительно шире, чем маркер гена R1: он найден у таких отдаленных видов, как S. bulbocastanum, S. cardiophyllum, S. ehrenbergii и S. microdontum.

4. Выявлена высокая гомология (98-100%) последовательностей гомологов генов RI и R3a у исследованных дикорастущих видов Solatium секции Petota с генами-прототипами из S. demissum.

5. SCAR маркеры генов R1 и R3a могут стать полезным инструментом для решения ряда генетических и селекционных задач (поиски новых гомологов генов устойчивости картофеля к фитофторозу в генетических коллекциях, мониторинг сегрегантов в процессе интрогрессивной селекции и защита авторских прав селекционеров).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Соколова Е.А., Бекетова М.П., Хавкин Э.Е. (2010) ДНК маркеры генов RI и R3 как предикторы устойчивости к фитофторозу картофеля. Доклады РАСХН, №5,12-15.

2. Pankin A., Sokolova Е., Rogozina Е., Kuznetsova М., Khavkin Е. (2011) Allele mining in the gene pool of orphan Solatium species for homologues of late blight resistance gene RB/Rpi-blbl. Plant Genet. Resources, 9(2), pp. 305-308.

3. Sokolova E., Pankin A., Beketova M., Rogozina E., Kuznetsova M., Spiglazova S, Yashina I., Khavkin E. (2011) SCAR markers of the Д-genes and germplasm of wild Solatium species for breeding late blight-resistant potato culti-vars. Plant Genet. Resources, 9(2), pp. 309-312.

4. Beketova M.P., Drobyazina P.E., Sokolova E.A., Tsar'kova E.A., Vorobiev V.A., Yashina I.M., Khavkin E.E. (2007) DNA markers for potato intro-gression breeding, In: Potato production and innovative technologies (Haverkort A.J. and Anisimov B.V., eds.), Wageningen Acad. Publ., pp. 397-404.

5. Яшина И.М., Симаков Е.А., Склярова Н.П., Веселкин А.А., Мартынов В.В., Кузьмичева Н.В., Соколова Е.А., Хавкин Э.Е., Кузнецова М.А., Филиппов А.В., Спиглазова С.Ю., Сметанина Т.И., Козловская И.Н., Морозова Е.В., Рогожин А.Н., Стацюк Н.В. (2008) Молекулярные маркеры генома Solatium demissum как предикторы устойчивости картофеля к фитофторозу. В кн.: Картофелеводство: Результаты исследований, инновации, практический опыт. Москва, т. 1, с. 84-100.

6. Khavkin Е., Sokolova Е., Beketova М., Pankin A., Kuznetsova М., Kozlovskaya I., Spiglazova S., Statsyuk N., Yashina I. (2010) Potato resistance to late blight as related to the R1 and R3 genes introgressed from S. demissum. PPO-Special Report no. 14, H.T.A.M. Schepers (editor), Wageningen, DLO Foundation, pp. 231-238.

7. Pankin A., Sokolova E., Rogozina E., Kuznetsova M., Deahl K., Jones R., Khavkin E. (2010) Searching among wild Solatium species for homologues of RB/Rpi-blbl/Rpi-btl gene conferring durable late blight resistance. PPO-Special Report no. 14, H.T.A.M. Schepers (editor), Wageningen, DLO Foundation, pp. 277-284.

8. Соколова E.A., Рогозина E.B., Хавкин Э.Е. (2009) Маркеры R генов устойчивости к фитофторозу у дикорастущих сородичей картофеля. В кн.: Использование мировых генетических ресурсов ВИР в создании сортов картофеля нового поколения. СПб: ВИР, с. 255-259.

9. Дробязина П.Е., Соколова Е.А., Хавкин Э.Е. (2009) Полиморфизм гена R3 устойчивости картофеля к фитофторозу. В кн.: Использование Кировых генетических ресурсов ВИР в создании сортов картофеля нового поколения. СПб: ВИР, с. 250-255.

Подписано в печать: 10.01.12

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 7032 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Проспект Вернадского д.39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколова, Екатерина Андреевна, Москва

61 12-3/543

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии

На правах рукописи

Соколова Екатерина Андреевна

ДНК-маркеры генов устойчивости к фитофторозу у картофеля и его дикорастущих сородичей

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.01.06. - биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Э.Е. Хавкин

Москва - 20И г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений...................................................................4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ (ВВЕДЕНИЕ)...........................7

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................10

1.2. Иммунитет растений..........................................................11

1.3. Фитофтороз картофеля: происхождение, современная история, пути преодоления..................................................................................24

1.4. Молекулярно-генетические исследования устойчивости картофеля к фитофторозу.................................................................................34

1.4.1. R гены устойчивости к фитофторозу.....................................39

1.4.2. Виды ДНК-маркеров.........................................................45

1.4.3. Применение маркерного анализа к проблеме фитофтороза: картирование генов/признаков устойчивости и примеры селекционных приложений.............................................................................................53

1.4.4. Клонирование и характеристика R генов устойчивости к фитофторозу.............................................................................................55

1.5. Патенты на трансгенные растения, несущие R гены устойчивости к фитофторозу................................................................................57

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................61

2.1. Растительный материал.......................................................61

2.2. Родословные сортов и данные по устойчивости к фитофторозу......61

2.3. Фитопатологическое генотипирование и определение устойчивости сортов и гибридов картофеля и дикорастущих видов Solanum............................................................................................................62

2.4. Методы ДНК анализа.........................................................65

2.4.1. Выделение геномной ДНК из тканей растений........................65

2.4.2. Условия проведения ПЦР....................................................68

2.4.3. Выявление продуктов ПЦР .............................................71

2.4.4. Клонирование и секвенирование фрагментов ДНК...................73

2.5. Методы биоинформатики ...................................................76

2.5.1 Выравнивание ДНК последовательностей и создание ПЦР прайме-ров.....................................................................................................76

2.5.2. Регистрация последовательностей ДНК в базу данных NCBI......76

2.5.3. Филогенетический анализ, методы анализа корреляции.............77

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ............................................................................................78

3.1. Создание SCAR маркеров R генов..........................................78

3.2 Структурная верификация SCAR маркеров генов R1 и R3a............81

3.3 Функциональная верификация SCAR маркеров генов R1 и R3a......83

3.3.1 Наследование маркеров генов R1 и R3a у сортов картофеля.........85

3.3.2 Маркеры R генов как предикторы устойчивости.......................86

3.4. Распространение R генов в секции Petota..................................94

3.4.1. Верификация маркеров R генов за пределами серии Demissa......95

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................105

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ........................................106

ВЫВОДЫ...........................................................................107

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................108

ПРИЛОЖЕНИЕ 1...................................................................130

ПРИЛОЖЕНИЕ 2..................................................................145

ПРИЛОЖЕНИЕ 3..................................................................153

Список сокращений

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота.

ПЦР - полимеразная цепная реакция.

ETI (от effector-triggered immunity) - иммунитет, запускаемый эффекторами.

PTI (от PAMP-triggered immunity) - иммунитет, запускаемый патоген-или микроб-ассоциированными молекулярными структурами.

MAMPs и PAMPs (от pathogen- and microbial-associated molecular patterns) - патоген-или микроб-ассоциированные молекулярные структуры.

PRRs (от pattern recognition receptors) - трансмембранные паттерн-распознающие рецепторы, которые запускают РАМР-запускаемый иммунитет.

МАР-киназы (от mitogen-activated protein kinases) - митоген-активируемые протеинкиназы.

PR гены (от pathogen-responsive genes) - связанные с патогенезом гены.

ETS (от effector-triggered susceptibility) - чуствительность, запускаемая эффекторами.

TTSS (от type three secretory system) - секреторная система бактерий третьего типа.

Avr/avr-TOK (от avirulence gene) - ген чувствительности/вирулентности патогена.

R ген (от resistance gene) - ген устойчивости.

HR (от hypersensitive response) - гиперчувствительный ответ.

LRR (от leucine-rich repeat) - участок NB-LRR киназы богатый лейцино-выми повторами.

СС (от coiled-coil structure) - домен NB-LRR киназы, обладающий суперспиральной структурой.

LZ (от leucine zipper) - домен NB-LRR киназы «лейциновая молния».

NBS (от nucleotide-binding site) - нуклеотид-связывающий участок NB-LRR киназы.

TIR - (от Drosofila Toll/interleukin-1 resistance) -домен NB-LRR киназы.

TM (от transmembrane) - трансмембранный домен.

PK - рецепторные серин-треониновые киназы.

RLK (от receptor-like kinase) - рецептор-подобные киназы.

MAS (от marker-assisted selection) -селекция при помощи маркеров, маркер-опосредованная селекция..

RFLP (от restriction fragment length polymorphism) - полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов.

RAPD (от random amplified polymorphic DNA) - полиморфизм ДНК, ам-плифицированной случайным образом.

ISSR (от inter-simple sequence repeats) - последовательности между простыми повторяющимися последовательностями.

AFLP (от amplified fragment length polymorphisms) - полиморфизм по длине амплифицированных фрагментов.

CAPS (от cleaved amplified polymorphic sequence) - рестрикционный полиморфизм амплифицированных последовательностей.

SCAR (от sequence characterized amplified region) - охарактеризованная последовательность амплифицированного участка ДНК.

STMS (от sequence tagged microsattelite site), STR (от short tandem repeat), SSR (от simple sequence repeat) - микросателлиты, короткие тандемные повторы.

Список сокращенных названий генов

RB (син. Rpi-blbl), Rpi-blb2, Rpi-ЫЬЗ, Rpi-abpt и Rpi-btl - гены устойчивости к P. infestans из S. bulbocastanum.

R1-R11 — гены устойчивости к P. infestans из S. demissum.

12 - ген устойчивости томата к грибам F. oxysporum f. sp. lycopersici.

N- ген устойчивости табака к вирусу табачной мозаики.

Pto - ген устойчивости томатов к бактерии Pseudomonas syringae pv. tomato.

Prf - ген устойчивости к Pseudomonas syringae pv. tomato.

Bs4 - ген устойчивости томата к X campestris pv. vesicatoria

RPP1, RPP4, RPP5, RpplO, Rppl4 - ген устойчивости арабидопсиса к Ре-ronospora parasítica.

RPS2, RPMIvl RPS5 - гены устойчивости арабидопсиса к Pseudomonas syringae.

RPW8 - ген устойчивости арабидопсиса к грибам Erysiphe cichora-cearum, Е. crusiferarum, Е. orontii и Oidium lycopersici.

X, Rx2 и Nb - ген устойчивости картофеля к вирусу X.

Cf-2, Cf-4, Cf-5 и Cf-9 - гены устойчивости томатов к грибу Cladosporiumfulvum.

Xal, Ха5, Ха13 Ха21 и Ха27 - гены устойчивости риса к Xantamonas oryzae pv. oryzae.

Gpa и Gpa5 - гены устойчивости картофеля к Globodera pallida

Gprl - ген устойчивости картофеля к Globodera rostochiensis

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ (ВВЕДЕНИЕ) Актуальность проблемы. Картофель (Solanum tuberosum L.) является четвертой по значению продовольственной культурой в мире. Ежегодно значительная часть урожая картофеля теряется из-за фитофтороза, болезни, вызываемой оомицетом Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу (Fry, 2008; Gruenwald and Flier, 2005; Haverkort et al., 2009).

Начиная со второй трети XX века, для борьбы с фитофторозом использовали R гены устойчивости, перенесенные в из дикорастущего вида Solanum demis sum Lindl. Для идентификации R генов S. demis sum в растениях картофеля применяются фитопатологические методы, основанные на наборе простых рас P. infestans. Этот метод позволяет идентифицировать R гены, однако не дает представления об их строении и полиморфизме, а также неудобен для массового скрининга растений.

тидных последовательностей R генов, удобны в работе и дают один сигнал амплификации. Использование молекулярных маркеров позволяет быстро обследовать большие выборки растений, что дает существенные преимущества по сравнению с традиционными фитопатологическими методами определения R генов. С помощью SCAR маркеров R генов можно выявить потенциальные доноры генов устойчивости в генетических коллекциях, облегчить отбор устойчивых растений в расщепляющихся популяциях и определить, сохранились ли гены устойчивости после многократных скрещиваний и в

процессе многолетнего культивирования сортов картофеля. Использование этой технологии позволяет идентифицировать у культурных и дикорастущих форм Solanum секции Petota не только уже охарактеризованные R гены устойчивости к фитофторозу, но и их структурные гомологи с еще неизвестными функциями.

Цель и задачи исследования

Для достижения поставленной цели в диссертационной работе решались следующие задачи:

1. Сравнительное изучение первичного строения R генов устойчивости к фитофторозу и их структурных гомологов у картофеля и дикорастущих форм Solanum секции Petota.

4. Изучение распространения структурных гомологов R генов за пределами S. demissum - вида, наиболее часто используемого в качестве источника признака устойчивости к фитофторозу, для поиска новых источников устойчивости.

5. Сравнительный структурный анализ R генов-прототипов и их гомологов из дикорастущих видов Solanum секции Petota.

Научная новизна результатов

1. Создана новая серия специфичных SCAR маркеров, обеспечивающих распознавание генов R1 и R3a.

3. Впервые обнаружены и идентифицированы на основании первичного строения гомологи генов R1 и R3a у дикорастущих видов Solanum секции Petota за пределами вида S. demissum, в котором они были исходно описаны.

Практическая значимость работы

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В последнее время было клонировано свыше 20 функциональных генов устойчивости к фитофторозу, включая Rl, R2, R3a и R3b гены из Solanum demissum (Ballvora et al., 2002; Huang et al., 2005; Lokossou et al., 2009; Li et al., 2011), а также R гены из других дикорастущих видов: S. bulbocastanum (Song et al., 2003; van der Vossen et al., 2003, 2005), S. stoloniferum и S. papita, (Vleeshouwers et al., 2008), S. venturii и S. mochiquense (Pel et al., 2009; Foster et al. 2009).

Solanum demissum - это гексаплоидный, мексиканский дикорастущий вид рода Solanum. Он является важным источником расоспецифической устойчивости к фитофторозу картофеля. Гены Rl, R2, R3, R4 и RIO из Solanum demissum были перенесены в культурный картофель, но вскоре появились расы Р. infestans с новыми генами вирулентности, продукты которых не распознавались этими R генами (Wastie, 1991). Однако, "пирамидирование" в сорте нескольких R генов, включая не используемые ранее R гены из S. demissum и других дикорастущих видов Solanum, в том числе с помощью MAS является важным направлением в создании устойчивых сортов (Havenkort et al., 2009; Verzaux, 2010; Рогозина, 2011). Так, высокоустойчивый к фитофторозу сорт Sarpo Mira несет по меньшей мере пять R генов устойчивости (R3a, R3b, R4, Rpi-smiral и Rpi-smira2). (Rietman 2011). Между тем известно, что формы картофеля, содержащие R гены от S. demissum, сохраняют более высокую полевую устойчивостью, чем образцы без этих генов (Stewart et al., 2003; Gebhardt et al., 2004; Бекетова и др., 2006).

Говоря о преодалении R генов, следует помнить что, как и гены авиру-лентности (Avr гены) Р. infestans, гены устойчивости организованы в кластеры, возникающие благодаря дупликации и рекомбинации генов, а также при участии подвижных элементов генома. Помимо аллельных вариантов в одном кластере могут располагаться активные гены и псевдогены или же гены разной специфичности (Ballvora et al., 2007; Dodds et al, 2009; Gebhardt and Valkonen, 2001, Huang et al, 2005; Kuang et al., 2004; Kuang et al, 2005; Mi-

chelmore and Meyers, 1998). Между активными генами и псевдогенами возможна межаллельная рекомбинация, что, в совокупности с генной конверсией, приводит в ходе коэволюции растения и патогена к появлению и отбору новых аллелей генов устойчивости, которые могут распознавать новые эффекторы патогенов (Michelmore and Meyers, 1998).

Так как R гены преимущественно образуют кластеры, то в геноме картофеля имеется относительно небольшое число "горячих точек" устойчивости, и другие гены, находящиеся внутри этих кластеров могут также принимать участие в устойчивости к болезням (Gebhardt,Valkonen, 2001). Высокий уровень консервативности последовательностей генов в кластере, делает возможным использование ПЦР метода для амплификации гомологов известных генов устойчивости в других высокоустойчивых дикорастущих видах Solanum. Этот подход открывает новые возможности в изучении R генов и обнаружении генов с новыми функциями (Hein, 2009).

Таким образом, изучение R генов устойчивости к фитофторозу и их гомологов у дикорастущих видов Solanum остается важной задачей геномики и молекулярной селекции растений.

1.2. Иммунитет растений

Растения являются источниками питания для большинства таких гетеротрофных организмов, как растения-паразиты, травоядные и всеядные животные, а также вирусы, бактерии, грибы, нематоды.

В связи с большим числом различных патогенов, атакующих растительные организмы, для жизнедеятельности растений крайне важна их способность противостоять атаке патогенов. В отличие от позвоночных животных, растения не передвигаются, лишены антител и способности к фагоцитозу, не имеют кровеносной системы и гуморальных факторов иммунитета. Взамен этого каждая растительная клетка должна обладать врожденной и индуцируемой защитой (Walbot, 1985).

Орудия нападения патогенов на растения и способы защиты растений можно разделить на расоспецифичные и расонеспецифичные. В терминах Ван дер Планка, такая защита получила название вертикальной и горизонтальной устойчивости (Ван дер Планк, 1972). Расонеспецифичная устойчивость растений эффективна против всех генетических вариантов конкретного патогена/паразита, является более древней и надежной. За неспецифичной и качественной горизонтальной устойчивостью стоят, по Ван дер Планку, полигены (малые гены), которые теперь принято называть локусами количественной устойчивости (quantitative resistance loci, QRL).

Расонеспецифичная устойчивость связана с такими способами противостоять поражению, как опережающее развитие, развитие защитных покровов растения или синтез фитонцидов, фитоалексинов и фенольных соединений. К горизонтальной устойчивости можно отнести также идентификацию паттерн-распознающими рецепторами (pattern recognition receptors) специфических белковых и углеводных последовательностей патогенов; такое распознавание приводит к запуску ответа, неспецифичного по отношению к патогену (Дьяков, Озерецковская, 2001; Jones et al., 2006).

Анатомо-морфологические факторы устойчивости.

К анатомо - морфологическим факторам устойчивости относят такие признаки как; габитус растения, опушенность листьев, медленное наступление старения. Так, сорта картофеля с раскидистой ботвой менее поражаются фитофторозом, чем растения с плотными кустами. Различия объясняются тем, что капли воды, необходимые для заражения, высыхают на листьях раскидистых сортов быстрее, чем у сортов с плотными кустами. Сорта картофеля у которых замедлено наступление старения, также более устойчивы, так как фитофтороз поражает в основном стареющие ткани, в которых отток и распад углеводов преобладает над фотосинтезом (Дьяков, Озерецковская, 2001).

РАМР запускаемый иммунитет Современные представления о системе иммунитета растений уд

Информация о работе

Соколова, Екатерина Андреевна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

ДНК маркеры генов устойчивости к фитофторозу у картофеля и его дикорастущих сородичей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы