Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологические основы расширения генетического разнообразия картофеля

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические основы расширения генетического разнообразия картофеля"

Г8 ОД

3 3 ФЕВ 1337

На правая рукописи

Аштасоз Валерий Арашвич

БштЕхюлзгкчЕсгаш основы расеиренш генетического разнообразия

КАРТОФЕЛЯ

е оз. оо. 23 - биотехнология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательско). институте сельскохозяйственной биотехнологии расхн.

Официальные оппоненты_- доктор биологическим наук,

профессор 3. Б.Шамина

- доктор биологических наук, профессор И. П. Ермаков

- доктор биологических наук З.В.мазин

Ведшая организация - московская сельскохозяйст-

венная академия им. к. А. Тимирязева

Зашита диссертации состоится " " Февраля 1897 г. в час. на заседании диссертационного совета Д. 020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г. Москва, ул. тимирязевская, д. 42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " " января 1937 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

С. А. Меликова

0ЕШ1АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, картофель - одна из важнейших продовольственных культур, для массового производства которой успешно используются методы биотехнологии СMorel, Martin, 1955; Бутенко, 1990; Хромова. 1987; Кучко и др., 1988; Мелик-Саркисов, 1995), что связано с тем, что практически любую биоинженерную Форму картофеля можно сохранить и размножить вегетативно. Дикие его виды были устойчивы ко многим патогенам. Окультуренный же в южной Аме рике картофель был первично отобран, вероятно, на отсутствие в клубнях горьких и токсичных соединений ~ гликоалкалоидов, что соответствовало пшевым потребностям человека, но снизило общую устойчивость картофеля к болезням, невозможность создания одновременно устойчивого ко всем патогенам сорта, разное использование картофеля в хозяйстве и различия в характере питания отдельных регионов обусловливают необходимость разнообразия его топов.

Картофель, однако, не обладает достаточной генетической изменчивостью для эффективного создания на ее основе новым клонов, в результате чего еще популярны сорта, выведенные много лет назад (Bajaj,l987). 13 районированных в России сортов картофеля выведены более 40 лет назад и все еше используется в производстве. Увеличение же генетического разнообразия с помощью межвидовой гибридизации сдерживается тем, что большинство дикорастущих видов картофеля уже вовлечено в селекционный процесс СКамераз, 1973).

Поэтому очень важным является создание биоинженерными методами широкого генетического разнообразия, как основы для конструирования более устойчивого к фитопатогенам картофеля, а также генетически маркированных генотипов, необходимых для фундаментальных исследований, без которых нельзя продуктивно решать и многие прикладные задачи. И хотя у картофеля уже получено больше число таких Форм (Кучко и др., 1981; Br-ight et al., 1984; сидоров и др., 1985; Хромова, 1987; Крашенинникова и др. 1991) все еше существует необходимость расширения их спектра из-за сложности и многообразия проблем, стоящих перед биотехнологией картофеля.

В то же время, актуальной является и разработка новых эффективных способов повышения устойчивоста картофеля к патогенам. Исходя иэ важной роли пектиназ микроорганизмов в патогенезе растений, а также из способно,ста гидролаз образовывать олигосахари-ды, индуцирующие в растениях защитные реакции iDarviii et al., 1992), мы решили использовать гидролазы микроорганизмов для повышения устойчивости растений картофеля к патогенам.

В связи с вышеизложенным были определены цели и задачи настоящего исследования.

иель и залачи исследования. Целью настоящего исследования было разработать биотехнологические основы увеличения генетического разнообразия картофеля, как базы для создания новый генотипов. необходимый для проведения теоретических й прикладных исследований в области биотехнологии, в первую очередь, для повышения устойчивости картофеля к патогенам.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать эффективную систему регенерации in vitro.

2. разработать методы изолирования и культивирования протопластов картофеля.

3. Оптимизировать систему получения трансгенных растений картофеля.

4. Использовать сушествушие методы m vitro для создания и скрининга устойчивых к патогенам Форм картофеля!

5. Разработать новую стратегию повышения устойчивости картофеля к патогенам на основе гидролаз микроорганизмов.

6. Создать коллекцию новых экспериментально полученных Форм с маркерными признаками, необходимую для проведения различных прикладных и Фундаментальных исследований в области биотехнологии картофеля.

7. Предложить эффективный способ сохранения уникальных реге-нерантов картофеля, получаемых в экспериментах по клеточной и генной биоинженерии.

Научная новизна и ппяктичрркяя принпрть

Показана важная роль генетического разнообразия картофеля, как основы для конструирования новых форм, необходимых для прикладных и Фундаментальных исследований в разных областях биологии картофеля, в том числе, для создания устойчивых к патогенам форм.

Разработана ранее практически не применяемая система регенерации на корневых зксплантах картофеля, позволяющая стабильно получать высокую частоту регенерантов и используемая также для размножения растений и получения побегов, если на каллусе идет лишь корневой органогенез.

Впервые разработана эффективная методика получения в большом количестве изолированных протопластов картофеля, способных к регенерации. Предложен комплексный показатель состояния популяции культивируемых протопластов, помогавший объективно оценить влияние различных Факторов на их развитие и подобрать оптимальные ус-

ловия т выращивания.

Усовершенствованы методы генетической трансформации картофеля с использованием векторов, созданный на основе Ti и Ri плазшд A. tumefaclens и A. rhizogenes, позволящие получать высокую эффективность трансформации. Получены и изучены трансгенные (nptll, gus и lpt) клеточные линии и регенеранты картофеля различных видов и сортов, которые можно использовать при соматической гибридизации с целью передачи генов устойчивости дикорастущий видов Solanura в сорта культурного картофеля, для исследования гормональной регуляции ростовых и генетических процессов, механизмов устойчивости к патогенам и т.д.

Создана и охарактеризована коллекция новым экспериментально полученных Форм картофеля с различными маркерннмн признаками, содержащая ю трансгенным клеточных линий, 24 трансгенных растения, 4 мутанта и 2 сомаклона. Созданная коллекция может быть использована в прикладных и Фундаментальных исследованиям на картофеле.

Показана недостаточная эффективность сомаклональной изменчивости и индуцированного мутагенеза и обоснована необходимость разработки новых in vitro методов для повышения устойчивости растений картофеля к патогенам.

Впервые предложены новью эффективные подходы к повышению устойчивости картофеля к болезням на основе использования пектоли-тических Ферментов микроорганизмов, в результате чего с высокой частотой получены Формы, устойчивые к различным патогенам, в том числе и с групповой устойчивостью к нескольким болезням.

Впервые продемонстрирована специфичность действия пектаназ и целлюлаз микроорганизмов на развитие растений картофеля in vitro и генотипическая зависимость устойчивости растений картофеля к этим ферментам.

разработан и запатентован высокотехнологичный способ получения митажлубней картофеля на зачатках регенерантов, находящихся на каллусе, который можно использовать для сохранения и размножения уникальных регенерантов картофеля, получаемых в экспериментах по клеточной и генной инженерии.

Аптбаиия работа, материалы диссертации докладывались на III, IV Всесоюзных и V Международной конференциях по культуре изолированных клеток растений САбовян, 1979; Кишинев, 1983; Новосибирск, 1988); Всесоюзной конференции "Состояние и перспективы развития сельскохозяйственной биотехнологии (Москва, 1986); V съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров сМосква. 1987); Все-

союзной научно-тенничеасой конференции "Применение биотехнологий в животноводстве, растениеводстве и ветеринарной медицине" (Ленинград, 1988): Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пдаино. 1988): Международной конференции "Проблемы и перспективы биотехнологии (Чехословакия.. Братислава, 1389); Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре С Звенигород, 1989); VII Международном конгрессе по культуре клеток и тканей растений (Нидерланды, Амстердам, 1990): 7 Международном конгрессе FESPP (Швеция. Умеа, 1990): 1 Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений (Пэдино, 1991); Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии - Агропромышленному комплексу (Черновцы, 1991): 8 Международном симпозиуме по протопластам (Швеция, Уппсала, 1991): международном Симпозиуме "Биотехнология растений и генетическая инженерия" (Киев, 1994): III Российском Симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" с Пувдно, 1995): Ежегодном симпозиуме СИР "Физико-химические основы Физиологии растений" (Пенза, 1996).

публикации- По материалам диссертации опубликованы 43 научные работы и получено 1 авторское свидетельство.

Обт^м и структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, материалов собственных исследований автора (главы, содержащей методическую часть работы и 5 глав экспериментального материала), обсуждения полученных результатов, заключения. выводов, списка использованной литературы и приложения.

материалы диссертации изложены на 250 страницах машинописного текста, включат1 57 рисунков и фотографий, 44 таблицы. В списке литературы приведены ссылки на 419 источников отечественной и зарубежной литературы. В приложении представлена коллекция экспериментально полученных в настоящей работе Форм картофеля.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Об'ьркты инрпрппдания в экспериментах использовали растения дикорастущих видов рода Solanum, устойчивых к различным заболеваниям: Solanum vemel Bitt. et Wittn., S. stoloniferum Bltt. и некоторые другие, а также растения 14 различных сортов S.tuberosum, выращиваемых в пробирочной культуре на среде Мурасиге-Скуга CMC).

Индукция каплуоюбразования и.морфогенеза. Методы индукции каллуса и морфогенеза в нем на листовых, стеблевых и кошевых эк-сплантах картофеля описаны в работах САветисов. Мелик-Саркисов,

1985; Шарова и др., 13953. Суспензионные культуры получали и пассировали на среде MC с 7 мг/л 2,4-Д.

Изолирование и кудьтиеистанш протопластов. Мезофильные и каплусные протопласты картофеля различным сортов изолировали и культивировали по разработанным нами методикам ( Бутенко и др., 1977; Аветисов и др., 1987).

Получение инпунигойянньш мугапий- Методы индукции мутаций описаны в работах (Давыдова, 1994; Шарова и др., 19966).

Изучение биологической активности гидролитических Ферментов. В работе использовали препараты пектиназ, продуцируемых Rhizopus sp., и целлшаз. продуцируемых Triehoderaa vi ride, которые вносили в соответствующих концентрациях в питательные среды.

ньй раствор пектиназы помещали на 1 час при 30й С листочки испытуемых образцов. Затем в них измеряли реакцию замедленной Флюоресценции хлорофилла на установке, работающей на базе фосфороскопа сматорин и др., 1985; Мелик-саркисов и др.. 1987).

деление в лаборатории иммунитета института биохимии им. А.Н.Баха РАН. По описанной методике с Давыдова. 1994) выделяли из растительной ткани препарат, содержащий белок клеточных стенок с ингибитор). Активность полигалактуроназы (ПГ) Vertid Шит dahllae определяли методом "cap-plate" на чашках Петри с пектансодержащей агари-зованной средой С Dingle et al., 1953). В лунки на чашках вносили стандартный Фермент ПГ с раствором испытуемого ингибитора. Об ин-гибирущей активности белковых препаратов судили по уменьшению диаметра (в мм) зоны разрушения пектина вокруг лунки после проявления рутениевым красным. Активность пектинлиазы С ГШ V. dahliae определяли спектроФотометрическим методом CPapavizas, Avers, 1966) в условных единицах оптической плотности.

Определений хитиназной активности. Активность хитиназы определяли методом, усовершенствованным Кривцовым Г. Г. СВНШСБ), который синтезировал по модифицированной им методике (Molano et al.. 1977) субстрат для хитиназы, представляющий собой меченый тритием реацетилированный хитин. Удельная радиоактивность этого препарата составляла 2x10е расп/мин- мг. Субстрат в Форме "капелек" геля вносили в растительный экстракт и сцинтиляционным счетчиком определяли его радиоактивность (число импульсов в минуту).

Ультраструктурнпе и ана-тммчрпспе_изучение дегенеюнтов^

Исследования были проведены в лаборатории электронной микроскопии

ВНШСБ по общепринятой методике (Электронномикроскошческие методы исследования биологических объектов, 1963).

Оненка устойчивости рргенр.рантдй к кппрзнзм Оценку проводили по методикам (Методические указания НИИКХ, 1980) в НШ картофельного хозяйства. Институте биохимии РАН и на Сахалинском опорном пункте Института Фитопатологии.

Бактроиапъныр пггаммы. в опытах использовали дикий штамм A4 Agrobacterium rhlzogenes и штамм A. rhlzogenes А4/рВИ01, а также штаммы A. timefaciens А281/рВ1121 и LBA4404/pBI121, обуславливавшие устойчивость к канамишну и бета-глисуронидазную активность трансформированных ими тканей (Jefferson et al., 1987). Использовали также штамм pGV2206, "shooty"- мутант A. tumefaclens, полученный на основе плазмиды PTIB6S3, в которой гены синтеза ауксинов Т—ДНК были замещены последовательностью плазмиды pGVlloe. со-держэцей бактериальный ген nptll (Leemans et al., 1981).

Трансформация картпДшя- Трансформацию проводили по описанным нами методикам (Гартель и др., 1990, 1991: Аветисов и др., 1991). Доказательством трансформации служили гибридизация по Сау-зарну С Southern. 1975), тестирование неомицинФосФотрансФеразы по Рейсу CReiss etal.. 1984) и Флюориметрическое количественное тестирование бета-глисуронидазной активности по ДжеФФереону С Jefferson et al.. 1987).

Определение..содержания эндогенных цитпкининсш. Определение проводили в лаборатории экспрессии генома растений Института Физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Цитокишны экстрагировали по методу Ondrey (Ondrey et al., 1989). Содержание зеатина определяли в тканях растений методом иммую-Ферментного анализа (Waller et al., 1976; Кудоярова и ДР.,1989).

Статистическая обработка данных. Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. Данные проведенных исследований обработай статистическими методами по Плохинскому (1967). В таблицах и на графиках приведены средние величины, полученные в 3-х экспериментах и отложены ошибки средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1, Некотоше особенности мойЕогенеэа в культуре ткани картофеля.

1.1. Грнптмпмческая характеристика регенеранионных пшпррсой в каллуснни .культурах .картофеля.. У большинства изученных генотипов картофеля каллус на листовых и стеблевых эксплантах легко об-

разовывался на средах, содержании только ауксины. Важное влияние оказывали на регенерашонные процессы генотипические особенности клеток и гормональный состав морфо генной среды. В то же время, показана большая роль, причем генотипически зависимая, которую играют в регенерационньш процессах гормональные Факторы среды для индукции первичного каллуса, в значительной степени определяющие, видимо, гормональный статус полученных клеток.

Для дальнейшей работы были отобраны сорта с высокой pgгенерационной активностью (Янтарный, Домодедовский. Изобилие. Гатчинский и др.). а также виды S. vernel и 5. stoloniferura. наоборот, не способные регенерировать в культуре, что делает их удобными партнерами в соматической гибридизации с целью передачи генов устойчивости в сорта культурного картофеля.

вое побегообразование на корнях картофеля представляет собой альтернативную и редко используемую в экспериментах систему регенерации ("Espinosa, Dodds, 13853- В наших опытах показано, что корневые экспланты на одной и той же среде, содержащей ГК, МУК и зе~ атин, образовывали каллус, в котором сразу же начинали Формироваться побеги, что значительно сокращало сроки регенерации по сравнению с использованием других типов эксплантов. Выявлено влияние генотипа на морфогенную активность корневых эксплантов.

Данная система регенерации побегов оказалась высоко эффективной. Например, из корневой системы одного растения сорта Янтарный можно было получить за 1.5 месяца до 140 регенерантов. Система характеризовалась высокой стабильностью, позволящей в любое время года получать в экспериментах высокую частоту регенерации.

Особое значение системе кошевых эксплантов картофеля придает развитие методов генетической трансформации. Регенерация побегов на "бородатых" корнях является единственным средством получения трансгенных растений картофеля в случае использования для трансформации A. rhizogenes. Изменения, затрагивающие растительный геном при генетической трансформации неизбежно влекут за собой изменения и в ответных реакциях на условия культивирования. С помощью штамма А4 A. rhizogenes были получены "бородатые коми" у нескольких сортов картофеля и проведено сравнительное изучение регенерационной активности нормальных и трансгенных корней. Было показано, что регенерационная активность различалась в зависимости от сорта, состава среды, а также у нормальных и трансгенных корней, причем у последних она была ниже.

В результате проведенных исследований была оптимизирован; система регенерации растений на корневых зксплантах картоФел! различных сортов, которую в дальнейшем успешно использовали ДЛ5 массового получения регенератов, в том числе, как альтернативны! способ регенерации -растений -из образующихся на каллусе корней._

1.3. Индукция ..клубняпбралования на дагенеоантак картофеля. Был разработан эффективный и технологичный метод, позволящий получать довольно крупные высокожизнеспособные микроклубни картофеля на зачаточных стадиях развития регенерантов, находящихся еще на каллусе (Авторское свидетельство N1376990. 1987г. Этот способ можно использовать для сохранения и размножения получаемы* при различных генетических манипуляциях с клетками и протопластами уникальных регенерантов. размножение которых черенкованием затруднено из-за их часто пониженной жизнеспособности, особенно на ранних стадиях развития.

2. Культую изолированных протопластов картофеля.

Изолированные протопласты картофеля в настоящее время широко используются с целью получения сомаоонов с различными свойствами (Кучко и др.. 1981: Thomas et. al.. 1982: Сидоров и др.. 1985а). Однако к моменту начала наших исследований, в средине 70-к годов, протопласты картофеля удалось успешно выделить только из клубней (Lorenzini, 1973). Поэтому перед нами в то время встала практически совершенно новая задача разработать, используя отечественные Ферментные препараты, условия изолирования протопластов различных сортов картофеля, способных к регенерации побегов.

Были подобраны оптимальные условия изолирования протопластов с помощью ферментного препарата Ксиланазы (Московский опытный Ферментный завод), которые позволяли получать из 1г листовой ткани до 7x10е жизнеспособных протопластов. В дальнейшем для изолирования мезофильных и каллусньи протопластов различных сортов картофеля были подобраны оптимальные концентрации импортных Ферментных препаратов, а также определены оптимальные сочетания и концентрации гормональный Факторов в питательной среде, позволяющие получать из протопластов каллусные колонии и регенеранты.

Большое значение для развитая протопластов в культуре имеет плотность их высева. Однако понятие "плотность высева" не учитывает различий между изолированными протопластами по их величине, которая может значительно варьировать, что влияет на общую массу культивируемых протопластов и создает различные кондиционируюаие

- и -

условия в среде при одной и той ж плотности высева. Поэтому мы предложили более объективный показатель, учитывающий не только число протопластов, высеянный в мл среды, но и их размер - суммарный объем, занятый изолированными протопластами в 1 мл суспензии и выраженный в мм3 (coro, который позволяет более правильно оценить влияние различных Факторов на поведение протопластов в культуре и подобрать оптимальные условия их культивирования. С помощью этого показателя были проанализированы эксперименты по выращиванию каллусных протопластов картофеля стабл. 1).

таблица 1.

Характеристика культивируемых протопластов картофеля.

1 1 1 1 Объем 1 Плотность вы- i СОП, 1 1 (Число делящихся!

1 протопласта,1 сева протоплас-1 мм3 1 клеток на 18-е 1

1 ммЗхЮ-5 |тов/мл среды I 1 сутки культиви-!

1 1 к 10^ 1 1 рования ! 1 1

1 Изобилие (протопласты из листового каллуса) 1

1 7,5+1.3 1 2 1 1,5чО,2 1 22,0+2,4 1

I 1 4 1 3.0+0,3 1 21,5+2,1 !

1 1 8 1 6,0+0,5 1 19.0+1,8 1

1 1 16 112,0+0,8 i 17.5+1,7 1

1 Домодедовский (протопласта из листового каллуса) !

1 3,1+0,8 ! 2,5 i 0,8+0,1 1 0 I

1 1 5 1 1,6+0,2 1 0 1

1 ! 10 1 3,1+0,3 i 8,1+1,2 !

1 1 20 1 6.2+0.5 1 24,0+1,9 !

1 Янтарный (протопласты из листового каллуса) 1

1 11,5+1,8 1 1 1 1,2+0,1 1 3,5+1,0 1

1 1 2,5 1 2,9+0,2 1 18,5+2,2 1

1 1 5 1 5» 8+0,4 1 20,0+2,0 1

1 1 10 111,5+0,7 1 17,0+1,7 1

1 1 20 123.0+1,9 I 13.0+1,5 1

1 Янтарный (протопласта из стеблевого каллуса) 1

1 2,4+Р,7 I 2,5 1 0.6+0,1 ! 0.3+0,3 !

1 1 5 1 1.2+0,1 1 4,0+1,0 i

1 1 ю 1 2.4+0,2 1 18,5+1,7 1

1 1 20 | | 1 4,84р,3 I 1 20,0+1.8 1 .......... ......

Изменение con у различных генотипов по разному сказалось на частоте делений. Так, протопласты с. Изобилие можно было эффективно культивировать при широком варьировании объемов высеваемой биомассы протопластов в мл среды, тогда как оптимальные условия

культивирования протопластов других сортов складывались лишь—при довольно высоких СОП. Анализ при помощи СОП позволяет вскрыть некоторые причины различного поведения протопластов в культуре.

Сравнение вариантов с одинаковыми низкими плотностями высева у протопластов с. Янтарный, изолированных из каллусов листового и стеблевого происхождения С2.5 и 5х104). указывает на более высокую способность к делениям каллусных протопластов листового происхождения. однако сравнение вариантов с примерно одинаковым СОП у этих протопластов показывет, что различия между ними по частоте делений связаны с различной биомассой высеянных протопластов, что создает разные кондиаионирукше условия в питательной среде, тогда как генетически'обусловленная способность к делениям у каллусных протопластов листового и стеблевого происхождения практически одинакова.

Используя разработанные методики изолирования и культивирования мэзофильных и каллусных протопластов картофеля мы получали регенеранты разных сортов картофеля, которые затем оценивали по устойчивости к различным заболеваниям.

таким образом, впервые были разработаны оптимальные режимы изолирования и культивирования способных к регенерации мезоФиль-ных и каллусных протопластов разных сортов картофеля.

з. расширение генетического разнообразия картофеля штодои генетаческой тоансфэдоации.

Среди различных методов генетаческой инженерии важное место занимает перенос генетической информации с помощью природных растительных патогенов A. tumefaclens и A.rhlzogenes, используемых в качестве векторов. С усовершенствованием методов выделения или синтеза полезных генов, введения их в растительный геном этот способ улучшения сельскохозяйственных растений станет, видимо, одним из основных. К сожалению, сейчас развитие методов генетаческой трансформации с целью создания генотипов с ценными свойствами лимитируется, в первую очередь, отсутствием широкого набора полезных генов и недоступностью их для широкого круга исследователей. Поэтому значительная часть работ в прикладной области генетической инженерии связана до сих пор с разработкой методичес-

ких аспектов получения трансгенных растений с разными маркерными генами и изучением полученных трансгенных растений.

3.1. Разработка эффективной системы трансформации на клубневых экгпдантак к-яртпдрпя. Клубневые экспланты из-за наличия большой раневой поверхности представляют для трансформации определенный интерес. Было изучено влияние различных факторов на эффективность заражения срезов клубней картофеля суспензией A.tumefaciens A28i/pBI12l и подобраны оптимальные условия их трансформации. Возможность избежать дополнительной операции по стерилизации делает полученные в культуре in vitro микроклубни удобным объектом для опытов по генетической трансформации картофеля. Поэтому в дальнейшем в экспериментах по трансформации, наряду с листовыми и стеблевыми экспланташ. мы использовали и срезы микроклубней.

aUîL^KmmâBJUL. С помощью штаммов А281/р8И21 и LBA4404/pBI12.1 A. tumefaciens впервые получены клеточные линии диких сородичей картофеля S. vernei и S. stoloniferum, способные расти на средах с 200 мкг/мл канашцина. Ш трансгенная природа была доказана различными методами (рис. 1). Каллусы обоих видов, полученные с использованием "необезоруженного" штамма А281, росли быстрее, чем полученные с использованием "обезоруженного" штамма LBA4404 (рис. 2). Линии не потеряли устойчивости к канамишну при пассировании в течение более 5 лет, что говорит о стабильной передаче маркерных генов в ряду клеточных поколений и о возможности использования этих линий в соматической гибридизации для передачи их генов устойчивости к Фитопатогенам сортам культурного картофеля.

3.3. Пппучрнир ттнггрнныу н-днамм! вдиугтпйчикьм_ШсенеШШШ

картофеля. В результате трансформации штаммом LBA4404/pBU21 A. tumefaciens были получены трансгенные растения сеянца N21 S.tuberosum, которые нормально укоренялись и развивались на среде, содержащей до 300 мкг/мя канажшна и были способны образовывать микроклубни in vitro и клубни в почве, причем урожай клубней был не ниже, чем в контроле. Это говорит о том, что используемые маркерные гены не влияют на урожайность трансгенных Форм.

При использовании штамма А4/рВ1101 A. rhizogenes трансформацию проводили на микроклубнях картофеля сорта Истринский. В результате были получены, так называемые, "бородатые корни", на которых затем индуцировали каллус и получали регенеранты, устойчивые к канамишну. Трансгенные растения имели мощную кошевую систему, ограниченный рост и очень короткие междоузлия. При выращи-

Рис.la. Гибридизация по методу Саузерна Фрагментов ДНК плаз-

миды рВ1121 и ДНК из трансформированного каллуса картофеля с [ «РЗ ДНК PBU21:

1 - ДНК рВ1121, расщепленная EcoRI-Hindi II; 2 - ДНК PBU21, расщепленная PsLl: 3- ДНК каллуса N2, расщепленная EcoRI. Слева - мол. массы Фрагментов ДНК рВ1121 в т.п.н. Мол. масса плазмиды рВ1121 - 13 т. п. н.: размер Т-ДНК в плазмиде рВИ21 около 5 т.п.н.

Рис.16. NFT активность в трансформированный каллусак картофеля; 1 - клубневой каллус;

2 - листовой каллус.

1

i-4% л*.

Ia

16

¡Ж! S.vernei

S.s to lorn ferum

Рис.2. Прирост трансгенныи каллусов 5. чете 1 и Б.зи»-1оп1Гегиш . на среде МС с 7 МКГ/МЛ 2.4-Д И 50 МКГ/МЛ канамишна (37 сутки культивирования). К-контрольные каллусы; А281 и 1£А4404-трансгенные каллусы, полученные при инфицировании эксплантов штаммами ЬВА4404/рВИ21 и А281/рВ1121 А. ШюеГас1епз.

а о

S

к

о о (я

¡М о сц

5я о

А

i

а

р

I

1 1

1 1 1

р 1

а281 lba ЧЧОЧ

к а281

lba ЧЧО'

5

4

вании на среде с 8% сахарозы наблюдали образование микроклубней из верхушечной части побега, что связано, по-видимому, с изменениями в чувствительности трансгенных тканей к Фитогормонам, или с изменением баланса между различными типами эндогенных фитогормо-нов в апикальной части побегов.

Полученные с помощью штаммов ША4404/рВ1121 А.1шпеГас1епз и А4/рВИ01 Л. гЫ2онеп85 трансгенные растения картофеля при выращивании на средах без канамицина в течение 5 лет не потеряли устойчивости к канамицину и бета-глюсуронидазную активность, что говорит о стабильной экспрессии введённых генов и возможности эффективного использования полученных Форм в экспериментах по клеточной инженерии картофеля.

Отработанные методики получения трансгенного картофеля могут быть использованы в дальнейшем в работах по введению в геном картофеля различных полезных генов. Полученные же генетически маркированные трансгенные Формы картофеля могут применяться в различных Фундаментальных и прикладных исследованиях.

и^пентенилтпансйррдзы. Появившаяся возможность вносить в растительный геном в результате генетической трансформации дополнительный ген ключевого Фермента биосинтеза цитокмнинов - изопенте-нилтрансФеразы, позволила искусственно изменять уровень эндогенных Фитогормонов в растениях, что открыло перед исследователями огромные перспективы в области изучения влияния Фитогормонов на процессы роста и развития растений и управления этими процессами (Муромцев и др., 198?; Кулаева, 1995;.

В работе была поставлена задача получить трансгенные Формы картофеля с различным содержанием эндогенных цитокининов и охарактеризовать их свойства. Для этого контрольные и инфицированные «граммом р6У2206 А. 1ишеГас1епз листовые экепланты Б. Шзегоэшя различных сортов и Б. уегае! помещали для получения каллуса на среды мс, содержащие 2 мг/л 2,4-Д или 2 мг/л 2,4-Д + о,5 мг/л БАП. Экепланты с образовавшимся каллусом для регенерации побегов перекосили на среду МС. не содержащую гормонов.

Присутствие БАП в среде для индукции каллуса ускоряло его образование, а таю® последущие процессы регенерации на безгормональной среде на контрольных и инфицированных агробактерией зк-сплантах (табл.2). инфицирование зкеплантов резко ускоряло последующую регенерацию побегов на безгормональной среде и в большей степени, чем БАП повышало частоту регенерации (табл.3). Регенера-

Таблица 2.

Влияние различных факторов на скорость регенерации побегов картофеля на безгоршнальной среде (время появления побегов, сутки).

__г-----------(-----,

I [Среды для индукции каллуса I Вид и сорт! и тип зкспланта I картофеля I-1-1-(-

1 1 > I la 16 2а 26

г 1 1Б. 1иЬегозига|

1 Янтарный | 37 27 47 35

1 Невский ! 40 25 50 29

1 Изобилие 1 43 22 50 -

уегпе! I 29

Примечание к табл.2 и 3. 1 - среда с 2 мг/л 2,4-Д + 0,5 мг/л ЕАП: 2 - среда с 2 мг/л 2,4-Д; а - неинициированные зкспланта; б - зкспланта, инфицированные штаммом рй\?2206 А. ШшГасхепз.

таблица з.

Влияние различных Факторов на частоту регенерации на безгормо-

иальнои среде.

1--1----1

I Вид I число зксплантов с побегами, % (числитель) I I и сорт I Число побегов на зксплант с знаменатель) I

¡картофеля I--1---1----1-!

I I 1а 1 16 I 2а I 26 )

jS.tuberos.¡. III I

I Янтарный 133,3+4,1/2,0170,0+6,8/9,2116,6+3,2/2,0157,1+5,9/10,01

! Невский ; 133,3±3,8/2,0170.0+6,4/5,3114,3+3.0/1,0! 50,0+4.9/3,5 I

I Изобилие 120,0+3,0/2,0166,6+7,0/4,5111,1+2,8/1,01 - I

¡S.varnei i О 123,0+3,5/5,41 I I i--1__i__i_i_i

ционная способность зксплантов зависела от генотипа. У Б. чете!, например, регенеранты удалось получить только в случае инфицирования зксплантов агробактерией и образования каллуса на среде с

Таблица 4.

Содержание зеатина в регенерантах картофеля, полученных в результате инфицирования листовых эксплантов штаммом рОТ220б

А. 1шжГас1ег15.

1 ........... 1 Содержание 1

1 Вид, NN Фенотип зеатина 1

\ сорт клонов ...... ............1

пмоль/г превыше- 1

сырого ние конт-1

веса роля, раз|

1 3. уег4- Контроль норм. 36+5 1,0 1

! ш! 2 норм. 130+10 3,6 1

3 зЬоо!у 265+25 7,3 I

5 зИос^у 243+23 6,8 !

6 гЬосЛу 179+14 5,0 !

7 205+19 5,7 I

У зЬоо1у 174+14 4,8 I

¡Б.1иЬе- Контроль норм. 64+8 1,0 |

| г05ш!1 11 бЬоо!у 704+42 11.0 1

1 с. Ян- 12 яЬоо1у 456+32 7,1 I

тарный 13 shooty 610+39 9,5 I

1. .......... 14 бИос^у 603+39 9,4 1 .............1

БАП. Причем, получить побеги в нормальных, не трансгенных каллусах Б.уегпе1. не удалось даже на специальных морфогенных средах с различными фитогормонами.

Полученные из инфицированных эксплантов регенераты можно было разделить на 2 группы - одни не отличались от контрольных, нормально укоренялись и развивались, другие не образовывали корней и имели значительные морфологические отклонения, характерные для, так называемого, Б1тоо1у-Фенотипа - нарушение апикального доминирования и кущение побегов, изменение листовой пластинки, сближенные междоузлия, карликовость, что может быть связано с влиянием цитокининового гена на ауксиновый обмен или на гормо-нально-ингибиторный статус растения в целом СКеФели и др., 1991). Блот-гибридизация по саузерну показала, что трансгенными являлись

лишь 5Ьоо1у-Формы. ни один из проверенный регенерантов с нормальной морфологией не содержал в своем геноме бактериальный ген прш. Эффективность трансформации зависела не только от сортовых особенностей, но и от Физиологического состояния объекта и условий инфицирования агробактерией, которые могли,_в_определенной

степени, изменяться в разный опытах.

Содержание эндогенных штокининов в растениях зависело от генотипа и у сорта Янтарный им количество было больше, чем у Б. уегпе!. В то же время, "5]-юо1у"-регенеранты характеризовались значительно более высоким уровнем цитокининов, чем нормальные растения (табл. 4). выделен также нетрансгенный, нормальный по морфологии регенерат- N2 5. уегпе! с повышенным содержанием цитокининов. что позволяет отнести эту Форда к сомаклональным вариантам. Обращает на себя внимание, что более, чем 4-х кратное превышение количества штокининов по сравнению с контролем приводит к значительным морфологическим и анатомическим изменениям у регенерантов. Имеющие высокое содержание эндогенных цитокининов зЬоо1у-регенеранты характеризовались также повышенной активностью растительной хитиназы (рис. 3), играшей определенную роль в защите растении от Фитопатогенных грибов.

8000

Рис.з. Влияние уровня эндогенных цитокининов и пектиназы в среде, для выращивания растений картофеля с. Янтарный на их хи-тиназную активность:

пектиназе (0,3 ед. активности/мл): 4 - нормальное растение на пектиназе.

1-5Ьас^у-регенерант N11:

2-нормапьное растение; 3-

;Ьоо1у-регенерант N 11 на

о

Л--I-1-1-1--Л-1-1-1.

9

Время инкубации, ч

ЗЬоо1у-Фенотип сохранялся у регенератов, образовавшихся на безгормональной среде из изолированных из зЬс^у-тканей протопластов, что говорит о сохранении экспрессии цитокининового гена при прохождении через стадию недифференцированного роста и о возможности использования полученных зЬоо1у-форм в экспериментах по клеточной инженерии картофеля.

Таким образом, была создана коллекция Форм картофеля, разли-чаицихся по содержанию эндогенных цитокининов, которую можно использовать для исследований гормональной регуляции ростовых и генетических процессов у картофеля, характерный Фенотип зЬоогу-ре-генерантов и способность эффективно регенерировать на безгормональной среде делает эти Форш хорошими маркерами, удобными для использования в экспериментах по клеточной инженерии.

4. Сошхлональная изшнчивость и индуцированный ыутагенез как ш-тояы расширения генетической изажнчшаста у кашсфэля.

ческая гетерогенность, свойственная большинству клеток растений 1п vit.ro и их способность регенерировать в целое растение давно используются исследователями наряду с индуцированным мутагенезом для выделения Форм растений с новыми свойствами СЗагорска, шами-на, 1970; Кучко и др., 1981: Ьагк1п, ЗсоусгоГг. 1981; Хромова и др., 1983а), в том числе и устойчивых к различным патогенам.

В проведенных исследованиях сопоставлены эти два способа получения растений с новыми свойствами и определены возможности их использования для повышения устойчивости растений картофеля к патогенам. Применяя оптимизированную нами систему культивирования изолированных протопластов, а также регенерацию на стеблевых и листовых каллусах мы получали сомаклоны и индуцированные мутанты у различных сортов картофеля и анализировали их устойчивость к одному из наиболее серьезных заболеваний картофеля - ФитоФторозу.

Полученные в экспериментах сомаклоны картофеля отличались большим разнообразием. В среднем, в зависимости от сорта, 15-25% регенератов имели разнообразные морфологические отклонения, многие характеризовались пониженной жизнеспособностью в полевьи условиях, задержкой в прохождении ФеноФаз. Все это осложняет вовлечение регенерантов картофеля в дальнейшую селекционную работу даже при наличии у них повышенной устойчивости к заболеваниям.

Полевая устойчивость к ФитоФторозу в условиях Московской области у значительного числа исследованных регенерантов была ниже.

чем в контроле Стабл; 5), а с повышенной устойчивостью не было найдено ни одного регенеранта с. Домодедовский и лишь небольшое их число превышало устойчивость контроля в случае с. Янтарный. Однако урожайность образцов с повышенной устойчивостью к фитофторозу часто была значительно ниже С50-150 г с одного куста), чем в контроле С700-750 г).

Таблица 5.

Уровень полевой устойчивости к фитофторозу сомаклонов картофеля.

I-1-1

Сорт

I Число регенерантов, %

1 - I К

I Янтарный 162,5±12.1125,0+10.3112,5+8,3 ¡Домодедовский ¡72,7+11,7123,1+11.?! о

I__I_(_1

Примечание. Устойчивость по отношению к исходному сорту: пониженная С ~), повышенная с+), на уровне исходного сорта СЮ.

Анализируя все полученные в экспериментах результаты по нескольким сотням сомаклональных вариантов различных сортов картофеля надо сказать, что на основе сомаклональноя изменчивости можно, видимо, эффективно отбирать в лабораторных условиях Формы с повышенной устойчивостью лишь к несложным расам №. 1пГез1апз. отбор сомаклональнык вариантов, устойчивых к высокоагрессивным расам патогена и природным его популяциям требует анализа гораздо большего материала. Для повышения эффективности метода сомаклональной вариабельности с целью отбора вариантов картофеля с повышенной устойчивость» к патогенам необходимо применять в работе различные селективные Факторы, причем в ранних пассажах, когда те высок морфогенный потенциал культуры и мала вероятность потери основных сортовых признаков.

Для получения клонов с повышенной устойчивостью к фитофторозу применяли также химический и радиационный мутагенез. В зависимости от сорта 20 - 40% полученных регенерантов характеризовались более высокой, чем в контроле устойчивостью стабл. 6). Однако в условиях естественного инфекционного Фона на сахалинском опорном пункте ВНИИ Фитопатологии устойчивость к фитофторозу многих отобранных регенерантов была на уровне исходного сорта или даже ниже.

Лишь некоторые клоны показали высокую устойчивость ботвы к ФитоФторозу на протяжении почта всего периода вегетации С рис. 43, однако и они при повторных испытаниях оказались пораженными фито-Фторозом. При этом, часто именно образцы, обладавшие определенной ФитоФгороустойчивостью (например. N 517.2.32, 518.2.32, 519.2.92) характеризовались пониженной урожайностью С табл. 7).

Таким образом, также как и в случае сомаклональных вариантов, среди индуцированных мутаций можно эффективно отбирать в лабораторных условиях Формы с повышенной устойчивостью к несложным

Таблица 6.

Лабораторная устойчивость к расе 1.2.3.4. РЬ. 1пГе£1апэ регенеран-тов картофеля, полученных в результате индуцированного мутагенеза.

Г 1 1 Сорт 1 1 Число регенерантов,%1

! г ! 1 - К + 1 1 1

! I (домодедовский! 50,0 12,5 37, 1 5 I

!Изобилие 1 45,5 17,0 37, 5 1

!Истринский 1 40,0 40,0 20. 0 I

1 Гибрид N474 1 1 1 42,8 35,0 . 22, 2 I 1

Рис. 4. Развитие ФитоФгороза у ре-генерантов картофеля в течение вегетации в условиях инфекционного фона на Сахалине.

1 512

* * 616 — 517

С°Р?.„, Олей

Изобилие

Дата наблюдения, число/месяц

расам фитофторы и гораздо сложнее получить Формы, устойчивые к ФитоФторозу в полевым условиям и не потерявшие к тому же основный сортовых качеств, в первую очередь, высокую урожайность, для чего необходимо работать с большим числом регенерантов.

Индуцированный мутагенез, часто вызывавший многочисленные изменения в геноме, что приводит к сцеплению отдельных полученных ценным признаков с рядом отрицательных характеристик и потере ос-

Таблица 7.

Урожайность экспериментально полученных клонов картофеля

1 1 Сорт, 1 ..... I Мутагенная 1 1 1 Средний урожай)

1 NN клонов 1 обработка 1 с куста, г | 1 1 .......1 1+1-1 1 1 !

1 Домодедовский 1 __ 1 1 1 (погиб 1680+25 |

1 510.2.92 1 НЭМ 0,02% 1400+161 1

1 513.2.92 1 зогр еосо 1 погиб 1310+15 1

1 514.2.92 1 НММ 0,02% 1156+7 | I

1 изобилие I ¡553+201750+30 1

1 512.2.92 1 ЗОГр еоСО 1368+161 1

1 516.2.92 1 НММ 0,02% 1280+131 1

! 517.2.92 1 50Гр еосо I 96+5 ¡190+15 I

1 Истринский 1 ¡364+161570+25 1

! 515.2.92 1 50Гр еосо ¡погиб ¡300+15 1

! 518.2.92 1 зогр 60со ¡150+8 ¡210+20 I

1 гибрмд 474 ! ¡606+281710+25 1

! 508.2.92 1 50ГР бОсо 1 67+6 ¡185+15 I

1 519.2.92 1 ЗОГр 60С0 1 I 82+6 1200+15 1 1........... 1.....1

Примечание: С-к) - на инфекционном Фоне; (-3 - без него. НЭМ - нитрозоэтилмочевина: НММ - нитрозометилмочевина.

новных сортовых признаков, предпочтительнее использовать для создания различных маркерных мутаций, применяемых в Фундаментальных исследованиях, когда сцеплением их с другими признаками и сохранением сортовых свойств можно пренебречь.

4.2. Получение члпргайоьнш мутантов. Хлорофильные мутации из-за простоты ик идентификации удобно использовать в качестве маркеров в клеточной инженерии картофеля (Зубко, 1387), в том числе и для получения устойчивых к патогенам форм. В наших экспериментах хлорофиллдефектные Формы были изолированы у сорта Янтарный при обработке НММ каллусов с небольшими зачатками регенеран-тов. Почти 50% полученных регенерантов составляли пестролистные и полностью лишённые хлорофилла Формы. Среди них были выделены две Формы со светло-желтой и одна с желтой окраской листьев, которые были изучены методами культуры ткани при выращивании на свету разной интенсивности и на средах разного состава, а также с помощью электронно-микроскопического исследования.

Высокая частота полученных у сорта Янтарный хлорофильных мутаций, которая обычно считается показателем общей мутабильности исследуемого образца, позволяет отнести этот сорт к высокомута-бильным, что необходимо учитывать при работе.

5. Гидролазы шкроорганизшв ках Фактора, повьшанаие устойчивость

растения к патогенам.

Гидролитические Ферменты патогенов, особенно пектиназы, являются одними из важнейших факторов патогенеза, способствущих проникновению и распространению патогенов в растениях (Mussell, Strand, 1976: Amadioha. 19933. С другой стороны, при действии пек-тиназ и целлюлаз патогенов из клеточных стенок растении высвобождаются олигосачариды, индуцирушие у растений защитные реакции (Bruce, West, 1982: Hahn et al.. 1989: Озерецковская и др., 1993: Павлова. 1995).

Поэтому стратегия использования гидролаз микроорганизмов в повышении устойчивости растений к патогенам может быть связана с двумя направлениями: с использованием гидролаз. как индукторов зацитных реакций и с повышением устойчивости тканей растений к действию пектиназ, что должно затруднить проникновение и распространение инфекции и повысить устойчивость растений к патогенам.

5.1.1. SjüíiHaa пекяиитъ и цеалтод на ruta&unuie- ааапяшнааш &ыпавдхвлаиыж гшлтениа «цтвфадл. Так как индукция защитных реакций гидролазами зависит от силы воздействия этих Ферментов на растения (Branca et al., 1988), была изучена чувствительность асептически выращиваемых растений картофеля к действию in vitro

Гаэт. Гатч. Гатч. Гам. a vemei-- 24Х —481 — a vwmi-- 24т--48х

Пекташаза, ед. активно ста/ил Целяюлаза, ед. ак?нвносвд/мл

Рис. 5. Влияние гидролаз на накопление биомассы растениями картофеля.

пектиназ и целлшаз микроорганизмов.

Исследования показали, что присутствие в питательной среде обеим гидролаз ингибировало рост побегов и корней и накопление растениями биомассы в зависимости от генотипа растения Срис. 5). причем целлюлазы сильнее подавляли рост побегов и накопление растениями биомассы, а пектиназы - рост корней. Более чувствительными к обоим Ферментам были, как правило, черенки S. vemel, а наиболее устойчивым - тетраплоид с. гатчинский, причем последний оказался более устойчивым, чем дигашюид этого сорта (например, td=4,ü: В>0,999 при действии пектиназ на рост побегов и td=2,3; В>0,95 по накоплению биомассы при концентрации пектиназ 15 ед. активности/мл). Низкие и средние концентрации пектиназ стимулировали прирост стеблевой биомассы у обоик форм сорта Гатчинский, чего никогда не наблкшали при действии целлюлазы. Из веек изученных генотипов наиболее чувствительными к этим ферментам оказались растения сорта Изобилие, а растения S. stoloniferum по своей реакции практически не отличались от S. ver-nei.

5.1.2. Устойчивость. к. пОтмяыал. гшотаниа кй|\шнР<ил, 6ыца-идошььх но. die^aa с гшшяиназош, и цбииимазшш» предполагалось, что растения картофеля, выращенные на средах, содержащих пектиназы или целлюлазы, могут обладать повышенной устойчивостью к патогенам в результате действия вылепляемых этими ферментами из клеточных стенок растения регуляторных молекул с элиситорной активностью. Для этого растения выращивали на небольших концентрациях пектиназ и целлюлаз, не угнетающих, как это было показано в пред-

Таблица 8.

Характеристика растений картофеля с. Янтарный, вырашеннын на средах, содержащих гидролитические Ферменты.

Кон-ция Фермента в среде, ед. актив. / мл

Устойч

ФитоФго-роз*

1вость, средний балл ¡Урожай

т-¡с куста

Черная I г

РизокЧКоль-тониоз|цевая I гниль

ножка«*I

+

О

пектиназа о, 03

о.з

целлюлаза 0,1 1,0

5,7

8,1

6,3

5,0 3,0

7 ! I

7 I 3 ! I

7 I 5 I

5

2 1575+25 I

2 ¡500+20 2 !410+10 I

2 1525+20 2 I470+15

Примечание. * - раса .1.2.3.4.5.6. + 0.8.9.10 хуг РЬ. 1пГез1агш: ** - балл поражения.

варительных экспериментах, рост растений картофеля 1п vit.ro.

Выраадвание растений на средах с даллшазами не привело к повышению их устойчивости к болезням, пектиназы же повывали устойчивость растений к ФитоФторозу по сравнению с контролем. Это тем более важно, что сами контрольные растения с. Янтарный были высокоустойчивы к ФитоФторозу (табл. 8). Примененные концентрации Ферментов вызывали сравнительно небольшое снижение урожайности растений, с повышением концентрации Ферментов устойчивость выращенных на них растений снижалась, т.е. наблюдалась определенная концентрационная зависимость эффекта ферментов, что согласуется с предполагаемым механизмом их действия через олигосахарины.

Обращает на себя внимание резкое снижение устойчивости к ри-зоктониозу растений картофеля, выращенных на среде, содержащей пектиназы в концентрации О,3 ед. активности/мл. Возможно, что одной из причин этого является значительное снижение хитиназной активности в таких растениях (рис. 3). Причем такое снижение наблюдали и у трансгенных $Ьоо1у-растений, что подтверждает неслучайный характер отмеченной закономерности.

Таким образом, взаимодействие m vitro пектиназ микроорганизмов с растением является сложным интегральным процессом, результат которого зависит от многих Факторов. С одной стороны, пектиназы могут играть роль индукторов устойчивости, а с другой -их действие может быть направлено^ основном,—на-подавление_защитных механизмов растения. Причем, оба эти процесса проходят, по-видимому, одновременно и в различных ситуациях, в зависимости от их соотношения, по-разному влияюгг на устойчивость растения.

Проведенные исследования показали возможность повышения устойчивости растений картофеля к одному из наиболее опасных заболеваний, ФитоФторозу, при выращивании растений на средах, содержащих пектиназы.

5.1.3. ДэМдоодетичаскив. прия^аасы. & кйиидеаде. кодоюфэд«,, бьцшщибвАмыас ко. crios&x а пмшшнлзами. Пектиназы были использованы также при регенерации побегов картофеля из каллусов, образующихся на корневых эксплантах. Пектиназы, даже в небольших концентрациях, использованных в этих опытах (0,03-0,3 ел. активности /мл) в течение всего процесса культивирования, ингибировши морфогенетические процессы на корневых эксплантах, причем, в определенной степени, сортоспецифично. Снижение продолжительности воздействия Ферментом при внесении пектиназы в культуральную среду лишь на одном из этапов культивирования привело, практически, к полному снятию ингибирушего воздействия, и во всех вариантах опыта было получено около 500 регенерантов.

5.1.4. Усдалйчи&астъ к гштдовкаш р&ганедшшюб ко]т»ф>вдя., поиичокнызс на ©ледах а гшкшшлциш. Полученные на средах с пектиназами регенераты с нормальной морфологией были испытаны на устойчивость к различным патогенам. Как показал анализ полученных результатов стабл.3), наблюдались резкие различия по устойчивости регенерантов к грибным и бактериальным заболеваниям. Ни один из полученных регенерантов по устойчивости к черной ножке и кольцевой гнили не превышал устойчивости исходных растении, а значительная их часть оказалась даже менее устойчивой к этим болезням.

Принципиально иную картину наблюдали по устойчивости регенерантов к таким грибнач заболеваниям, как ФитоФтороз и ризоктони-оз. Значительная часть регенерантов, полученных на средах с пектиназами, характеризовалась более высокой устойчивостью к этим заболеваниям, по сравнению с исходными растениями и регенеранта-ми, полученными на средах без Ферментов. Как и в случае с морфогенезом, отмечен определенный концентрационный и сортоспециФичес-

Таблица 3.

Влияние пектиназы на частоту изменения уровня устойчивости к патогенам у регенерантов картофеля С %).

Г.......... 1 Концентрация ФИТОфТОРОЗ i i |Ризоктониоз! черная 1................... ■■ 1 1 Кольцевая 1

! пектиназы, ¡ ножка 1 гниль 1

1 на которой i

i i i i 1 i i ¡......t i 1

1 образовались - I к 1 + 1 - 1 К 1 + 1 - ¡ к 1 + I - 1 К i + ¡

1регенеранты. 1 I ¡ I ! 1 1 ! i ! i

¡ед.актив./мл ! ! i 1 i 1 1 1 i i i ! t i i III! IIII

1 1 Янтарный I 1 i 1 i i i 1 I ! I ! ! i (11! ! 1 i i

1 0 - 167 ¡33 1 - ¡1001 - 133 167 ¡ - 1 33 i 67 1 - !

1 0,03 - 125 175 1 - 1 25175 150 150 1 - 1 50150 ! - !

1 0,3 - 150 150 117 1 831 - 167 133 1 - ¡1001 - ! - 1

1 Изобилие 1 1 i 1 I ¡ i III!

1 0 50150 1 - ¡25 1 501 25125 1 751 I 33¡67 ! 1

1 0,03 100! - 1 - | - 1 - ¡1001 - 11001 - ! 33167 1 - 1

1 0,3 1 50! -i ¡50 i i 1 - ¡1001 -i i i 1100! -t 1 1100! - ! - ! > I I 1

Примечание. Уровень устойчивости по отношению к контролю: пониженный (-), повышенный С+), на уровне немодного сорта С К).

кий эффект пектаназ в индукции устойчивости. Для сорта Изобилие, например, более эффективной оказалась пектиназа в концентрации 0,3, а для сорта янтарный - 0,03 ед. актавности/мл (табл. 9). причем урожайность полученный на пектиназах регенерантов составляла более 75%, а часто и 90% от урожая исходного сорта. Важно отметить также, что ряд клонов (например, 252 и 417 у сорта Янтарный и 39 у сорта Изобилие), полученных на средах с пектина-зами характеризовался более высокой устойчивостью одновременно к ФитоФторозу и ризоктониозу, что имеет большое прикладное значение.

5.2. Pn-irwwfp уртпйчмйьм к прктиназам регенерантов картофеля.

5.2.1. XteiUunBuc. гшшпина.Э' на »\м*>ти5и{1\*вА1Ш1 кашшш. и. и-з<ииг-fioSdRRbia ппвпгвлаасты. тципл&алл. Действие пектиназ на культивируемые in vitro клетки картофеля было изучено в опытах с суспензионными культурами S. stoloniferum и сорта Изобилие S.tuberosum, которые выращивали на средах, содержащих пектиназу в различных концентрациях. Клетки S. stolon!ferum оказались более устойчивыми

ЕЗ Изобилие И s.stoioni-ferum

0Д75

Концентрация пектиназы, ед. штвностд/ш

0.76

Рис.6 . Влияние пектиназы на жизнеспособность клеточных агрегатов S.stoloniferum и сорга Изобилие.

Рис.7. Влияние пектиназы на образование клеточных колонн мезофилышш протопластами с Гатчинский 24х.

к действию Фермента, чем клетки сорта изобилие с рис. 6). таким образом, различия в устойчивости к пектиназам на уровне целых растений сохранялись и на клеточном уровне, в то же время, пекти-назы в концентрации, которая значительно снижает жизнеспособность клеток, не действовали на изолированные протопласты и последние на среде с Ферментом образовывали клеточную стенку, делились и Формировали клеточные колонии, которые оказывались менее чувствительными к Ферменту, чем колонии, образующиеся на среде, не содержащей Фермента.

Проведенные на протопластах более детальные исследования показали, что пектиназы неколько снижали жизнеспособность изолированных протопластов лишь при концентрации 2 ед. активности/мл питательной среды. В небольших же концентрациях со,075 и 0,3 ед. активности/мл) пектиназы стимулировали деления протопластов и образование ими клеточных колоний с рис. 7), что можно объяснить, по-видимому. влиянием биологически активных олигогалактуронидов CBr-anca et al., 1988: Hahn et al., 1989), образующихся при действии пектиназ на Формирующуюся на изолированных протопластах клеточную стенку. При дальнейшем культивировании клеточных колоний, образовавшихся из изолированных протопластов на средах с пектина-эами. были получены микрокаллусы.

5.2,2. Зейстпйи» пшстшиц- на а^олцчв&йяныа юшш кй|и?шфвяя.

Для оценки влияния пектаназ на изолированные ткани картофеля критерием служила реакция каллусообразования на листовых зкеплантах. выращиваемых на средах с 7 мг/л 2.4-Д и пектиназой. Каллусогенез на зЕсплантах картофеля с. Гатчинский был сильно ингибирован уже при содержании в среде 1,8 ед. активности/мл Фермента, причем сильвее у дигаплоида, чем у тетраплоида. пассируемая каллуеная ткань оказалась еиё более чувствительной к аерменту, чем листовая.

таблица ю.

Влияние пектиназ на различном уровне организации биологического

материала.

Г < 1 !Пектиназа, .......................1

1 Объект 1ед. актив- ЭФФект 1

1 воздействия 1 1ности/мл

1 15.51о1оп1Гегигп

1 клетки 1 0,3 снижает число живых клеток в 2 раза!

1 протопласты 1 г* г* не снижает жизнеспособность 1

1 растения ] !> п не ингибирует развитие 1

} "---" I 3 ингибирует рост корней !

| /г >> 1 15 ингибирует все развитие растения 1

¡гатчинский 48х

! протопласта 10,075-0.75 не снижает жизнеспособность 1

| м »» 1 2,0 снижает жизнеспособность в 2,2 раза|

1каллуеная ткань 1 0.225 ингибирует рост каллуса в 2,5 раза 1

(листовая ткань 1 1,8 ингибирует каллусогенез в 2,5 раза 1

1 растения 1 1 30-60 1 ингибирует все развитие растения 1 |

Анализируя эффекты, вызываемые пектиназой при воздействии на разном уровне организации биологического материла Стабл. 10), можно, построить следующий ряд по устойчивости к пектиназе: растение > листовая ткань = протопласты > каллуеная ткань с клетки).

5.2.3. 5Ъ/шие{и1цш1 {млтаиий. кефлшфелл, ^сгавОлиь&ысс. к пектиг-иа-зам мшк1пс(1гаии.'&хя& и. иж оадпштхьпистикси Для получения устойчивых к пектиназам растений селективное давление осуществляли лишь на стадии, когда в каллусах имелись уж небольшие С1-2 мм высотой) зачатки регенерантов. Подавляшее большинство развиваю-

Контрольные регенеранты

Устойчивые к пектиназам

Устойчивые к пектн гт^т, получены с исп1 2ШЗ зованием

РГи г^ее1агк?

Рйг5о1ап(

Есаго1:оуога С^вресИоп'юит

Рис.

шик

8. Влияние пектиназ и Н№1 на частоту регенерантов, превышаю-устоичивость к патогенам исходник растения ( + регенеранты;.

адахся на средах с пектиназми регенерантов постепенно становились хлоротичными. Не потерявшие окраску регенеранты, т.е. устойчивые к пектиназам, возникали с низкой частотой.

Было получено несколько десятков регенерантов картофеля сортов Невский, Янтарный. Изобилие и Гатчинский, сохранявших зеленую окраску на средах с пектиназами, причем частота появления таких регенерантов увеличивалась при мутагенной обработке каллусов. Среди зеленых регенерантов различных сортов, полученных на средах с пектиназами, частота превышающих по устойчивости к болезням исходные растения оказалась, как правило, гораздо выше, чем среди регенерантов, полученных на средах без пектиназ С рис. 8). Причем наблюдали повышенную устойчивость и к Фитопатогенным грибам и к бактериальным патогенам. Обработка НИМ каллусов увеличивала обычно частоту регенерантов с повышенной устойчивостью к болезням.

Для экспресс-скрининга устойчивых к пектиназам регенерантов, популяция которых должна быть обогащена устойчивыми к болезням

Рис.3. Кривые замедленной Флуоресценции устойчивых и неустойчивых к пектиназам регенерантов с. Янтарный: необработанный пектиназои листе 13: обработанный пек-тиназой лист устойчивого СП) и неустойчивого СIII) регенерантов.

О 1 0 10 JО M M SO ?0 SO Jû 100 8ff ем л ¡рлугресаеяцца.с

Таблица 1.1.

Характеристика некоторых устойчивых к пектиназам регенеран

картофеля.

| Устойчивость К i " ■..... 1 Содержание i i ¡Активность 1

i NN Г-............... ......... .......... H зеатина, ¡ингибиторов!

i регенеран- расе * Кольце- Черной I пмоль/г | |

1 TOB 1.2.3-4- вой ножке ¡сырого веса!- i ■ I

ФИТОФТОРЫ гнили** 1 1 пг 1 1 Ш1 1 i i

! Растения 7 5,8 3,0 i 64+8 1 1 5,4 1 I 1 7,4 1

i с. Янтарный 1 ! 1 1

i N 6 11 7,5 1,5 i 120+15 ¡27,0 ¡25,9 1

i N 10 11 7,8 1,0 1 141+18 ¡16,2 1 0 I

1 N 54 7 6,8 1,5 ! 80+8 ¡18,5 ¡15,2. 1

1 N 75 i 10 7,2 2,5 1 75+6 i ¡23,7 i ¡10.3 1 i ... i

Примечание: * - число дней после инокуляции до спороношения: ** -балл устойчивости; *** - балл поражения: ****-снижение актавности пг и lin v.dahiiae при добавлении в стандартный раствор фермента белка клеточных стенок С ингибитора) соответствующих растений, в %.

Таблша 12.

Устойчивость к ФитоФторозу и урожайность клонов картофеля, полученных при использовании пектиназ микроорганизмов.

1 1 7...... 1 4--! Уг.тпйиирпгть 1 \

! Сорт, 1 к ФитоФторозу, Урожайность, 1

1регенерант! ( I баллы г с куста 1

< ( 1 1 ! лабор. ( - 1 полев. I 1

1 1 Янтарный 1 3.0 1 3,0 1 510+25 !

( 252" 1 5,0 ! 4,8 440+20 1

! 417* ! 5,0 1 4,7 500+25 !

! о** I 5, 7 1 5,3 470+25 1

1 ю** I 5,8 ( 5,6 450+20 !

! 54** I 5,5 1 5,2 470+25 1

!Изобилие I 5,7 1 5,5 450+20 1

1 39* 1 7,0 1 6.7 400+15 1

;Невский ! 5,0 1 4,8 480+25 !

! 27** I 6.9 ! 6,6 420+15 1

34** 1 !.............. 1. 7,0 1 6,8 « 430+15 1 ....... ......1

Примечание, лабораторная устойчивость определялась к расе РЬ. лп-{'взЬапз 1.2.3.4.5.6+0.8.3.10 хуг: * - регенеранты на низких концентрациях пектиназ; ** - устойчивые к пектиназам регенеранты.

Формами была использована реакция замедленной Флуоресценции хлорофилла, по времени полуингибирования выхода которой обычно судят об устойчивости растения к тому или иному Фактору Сматерин и др., 1985). С помошью этого метода отбирали устойчивые к пектиназам регенеранты С рис. 9).

в табл. 11 представлена характеристика некоторых устойчивых к пектиназам регенерантов, отобранных предложенным экспресс-методом. Активность ингибиторов пектиназ в них могла в 3-5 раз превышать их уровень в контрольных растениях. Следует отметить, что около 25% устойчивых к пектиназам регенерантов имели повышенное содержание штокмнинов. Среди изученных регенерантов были Формы с повышенной устойчивостью к ФитоФторозу, черной ножке, кольцевой гнили. При этом, до 10-15% устойчивых к болезням регенерантов характеризовалась устойчивостью более, чем к одному патогену.

- гз -

таким образом, реакция замедленной Флуоресценции хлорофилла может служить основой экспресс-метода для эффективного скрининга устойчивых к пектиназам и болезням регенерантов картофеля.

Полевые испытания регенерантов. полученных при различном использовании пектиназ. показали, что полевая устойчивость их к Фи-тофторозу была лишь немного ниже лабораторной, а урожайность мало отличалась от контроля Стабл. 12). В настоящее время 15 устойчивых к различным заболеваниям линий картофеля, полученных с использованием пектиназ, проходят полевые испытания в различных селекционных учреждениях.

Таким образом, в результате проведенных исследований была показана определенная связь между устойчивостью растении картофеля к пектиназам in vitro и устойчивостью к патогенам и принципиальная возможность использования пектолитических Ферментов микроорганизмов с целью создания устойчивых к патогенам растений.

6. Обсуждение полученных результатов.

Сельскохозяйственная биотехнология - это новая многообещающая область исследования. Если раньше новые, нетрадиционные методы селекции чаде всего противопоставлялись классическим, то сейчас почти все направления селекции картофеля используют, в той или иной степени, новые методы в качестве реальных этапов своего развития, что открыло совершенно иные перспективы в создании новых ценных Форм картофеля.

Потери урожая, причиняемые болезнями в картофелеводстве, составляют ежегодно до 22% и более (Росс, 1989), поэтому проблема создания устойчивого к заболеваниям картофеля стоит очень остро и для ее решения необходимо привлечение новых технологий. Распространение небольшого числа сортов на больших плошадях обычно приводит к тому, что растения становятся более уязвимыми для болезней и вредителей. Генетическое же разнообразие, являющееся основным орудием селекционера, в результате этого сужается.

Поэтому селекционная практика основывается на 2 принципиальных подходах - создании генетического разнообразия и селекции желательных генотипов. Картофель, однако, как это уже указывалось, не обладает достаточной генетической изменчивостью, что затрудняет' эффективное создание новых клонов этой культуры.

Клеточные технологии предлагают принципиально новые пути для создания генетического разнообразия и отбора Форм с искомыми признаками. Применение методов генетической и генной инженерии,

клеточной селекции и других биотехнологических приемов in vitro резко увеличивает генетическое разнообразие картофеля, в результате чего часто образуются формы, которые можно использовать для создания исходного селекционного материала с повышенной устойчивостью к патогенам ~С Brcttell, 1 ngraxru 1979: Мелик-Саркисов, Аве-тисов. 1984, 1987а: Хромова, 1984а: Кучко и др.. 1988), но которые нельзя получить пш половой гибридизации.

основные ограничения в применении этих методов связаны с часто недостаточной регенерашонной способностью культивируемых клеток и с отсутствием эффективных методов отбора in vitro устойчивых к заболеваниям регенератов, особенно с групповой устойчивостью к нескольким патогенам. Поэтому поиск методов, повышащих регенерационную активность в культуре in vitro, и разработка нетрадиционных селективных систем, позволяющих эффективно отбирать регенеранты картофеля, устойчивые к нескольким заболеваниям, являются актуальными на сегодняшний день проблемами.

Изучение морфогенеза in vitro у различных сортов картофеля выявило некоторые закономерности этого процесса, на основании которых были разработаны эффективные условия регенерации и отобран для дальнейшей работы материал с высоким и сохраняющимся при длительном культивировании морфогенетическим потенциалом.

Показанная в работе высокая стабильность и морфогенная способность редко применяемых в экспериментах кошевых зкеплантов картофеля позволяет широко использовать их в качестве альтернативной системы регенерации растений в различных биоинженерных экспериментах, в том числе при образовании корней на каллусе и трансгенных корней, полученным при использовании A. rhi2ogenes.

Мощным источником генетической изменчивости в условиях m vitro является культура изолированных протопластов, часто используемая для создания новых генотипов растений С Глеба и др.. 1975: Бутенко, Кучко, 1979в; Сидоров и др., 1984: Кучко, Летюх, 1989). Однако, к началу наших исследований у нас в стране и за рубежом не были разработаны методы изолирования и культивирования протопластов картофеля, что сдерживало работы по клеточной инженерии этой важной сельскохозяйственной культуры. Выполненные исследования позволили разработать эффективные методы изолирования и культивирования протопластов картофеля и получения из них в достаточном количестве протоклонов различных сортов картофеля.

В результате проведения всем вышеупомянутых работ была подготовлена база для достижения главной цели настоящего исследова-

ния - создания генетического разнообразия и селекции устойчивых к патогенам форм картофеля.

Расширение генетического разнообразия было достигнуто за счет получения трансгенных клеточных линий и регенерантов, а также индуцированных мутантов и сомаклонов картофеля. Созданные Формы найдут применение в различных фундаментальных исследованиях, без которых невозможно успешное развитое и многих прикладных аспектов биотехнологии картофеля. Кроме того, они могут использоваться в качестве маркеров при сбматической гибридизации с целью введения в геном картофеля различных генов.

В работе впервые были получены трансгенные СпрШ, еиэ) клеточные линии диких сородичей картофеля Б. уегпе! и 3.21о1оп1Гагиш, которые могут использоваться в соматической гибридизации с сортами культурного картофеля с целью передачи в последние генов устойчивости этих дикорастущих видов, используемые маркерные гены не снижали урожай, так как полученные трансгенные канамицинустой-чивые растения картофеля по урожайности не отличались от контрольных. Отработанные методы трансформации картофеля позволяют в дальнейшем рутинно вводить в его геном различные полезные гены, используя прШ и йи£ в качестве селективных маркеров.

Получение трансгенных растений с генетически обусловленным изменением Фитогормонального статуса, что может коренным образом менять экспрессию многих генов, в том числе и связанных с Функционированием защитных механизмов, представляет собой современный подход для выяснения путей гормональной регуляции не только роста и развития, но и защитных функций организма.

Способность трансгенных по цитокининовому гену тканей картофеля активно регенерировать побеги на безгормональной среде и их специфический зЫзс^у-Феиотип являются хорошими маркерными признаками, что делает эти Формы удобными при использовании в соматической гибридизации. С другой стороны, высокая регенерационная а!сгивность тканей с повышенным содержанием цитокининов показывает, что такой подход можно применять для повышения регенерацион-ной способности различных генотипов картофеля.

Другое направление работ было связано с непосредственны;.! получением устойчивых к патогенах! Форм. Результаты по более чем 300 сомаклональным вариантам и индуцированным мутациям показывают, что в обоих случаях в лабораторных условиях можно, видимо, эффективно отбирать Формы с повышенной устойчивостью лишь к несложным расам №. 1пГе51ап5, вызывающей наиболее опасное заболевание кар-

тофеля. Гораздо труднее получать Формы, устойчивые к фитофторозу в полевых условиях, и не потерявшие, к тому же. основных сортовых качеств, в первую очередь, высокую урожайность.

Индуцированный мутагенез, вызывающий значительные изменения в геноме, предпочтительнее использовать для создания маркерных мутаций, чаще всего применяемых в фундаментальных исследованиях, когда сцепление их с другими признаками и сохранение сортовых свойств не имеет большого значения. Для получения же исходного для селекции устойчивого к патогенам материала картофеля следует использовать, в первую очередь, сомаклональную изменчивость с применением различных селективных факторов.

Повышенная устойчивость растений к патогенам может быть обусловлена, в конечном итоге, двумя причинами - подавлением развития инфекции уже внутри ткани в результате различных механизмов, например, в результате защитных реакций, индуцируемых в растениях в ответ на внедрение инфекции и/или ограничением проникновения инфекции в растительную ткань.

Исходя из важной роли гидролаз микроорганизмов в патогенезе растений, в проникновении и распространении патогенов в тканях растений, а также из ик способности образовывать при контакте с растительной клеточной стенкой регуляторные молекулы, способные индуцировать защитные реакции CDarvill et al., 1992; Pavlova 9t. al., 1992; Озерецковская и др., 1993), мы впервые предложили применить гидролитические Ферменты микроорганизмов в качестве основных и единственных факторов повышения устойчивости растений к патогенам САветисов. Мелик-сарюисов. 1988).

Б работе впервые исследовано влияние пектиназ и целлюлаз микроорганизмов на растущие in vitro растения картофеля и показано, что их действие зависит от концентрации ферментов и генотипа растения. Полученные данные указывают на влияние уровня плоиднос-ти на устойчивость растений к этим ферментам и на то, что не всегда дикие сородичи культурного картофеля более устойчивы к различным стрессовым Факторам среды.

Выявлена специфичность действия изученных Ферментов на развитие in vitro растений картофеля, пектиназы обычно сильнее подавляли рост корней, а целлюлазы - стеблей. При этом, пектиназы, в отличие от целлюлаз, при довольно широком диапазоне концентраций стимулировали увеличение стеблевой биомассы, а при низких концентрациях могли стимулировать деления изолированных протопластов картофеля, что можно использовать для увеличения эффективности

высева протопластов в работая по клеточной инженерии, отмеченные эффекты пектиназ и целлюлаз могут, видимо, объясняться влиянием биологически активных олигосанаридов, образующихся при действии гидролаз на клеточные стенки растений (Оат-лП е! а1., 1992).

При выращивании растений картофеля на средах с пектиназами микроорганизмов были получены Формы, устойчивые к Фитопатогенным грибам, но не бактериям, что, возможно, как-то связано с действием особого белка клеточных стенок двудольных растений, инги-бирущего грибную, но не бактериальную полигапактуроназу (Сеглюпе е! а1., 1990). Можно предположить, что используемые в опытах пек-толитические Ферменты через посредство образуемых в результате их действия биологически активных олигогалактуронидов. активируют этот белок, что и приводит к повышению устойчивости растений к Фитопатогенным грибам, но не бактериям.

Эффективные концентрации пектиназ. индуцирушие устойчивость и влиявшие на морфогенетические процессы, различаются не только у разных сортов, но и в пределах одного сорта. Это дает основание предполагать, что в индукции устойчивости и в процессе регенерации могут, возможно, участвовать различные регуляторные молекулы, образующиеся при действии пектиназ. Причем, благодаря различной чувствительности разных сортов картофеля к пектиназам молекулы с элиситорной активностью и молекулы, контролируйте морФогенети-ческие процессы у растений разных сортов могут образовываться при действии пектиназ в различных концентрациях.

Другой подход к повышению устойчивости растений картофеля к патогенам был связан, в основном, с ограничением их проникновения в растения. Устойчивость против проникновения инфекции является наиболее важным в эволюционном отношении механизмом устойчивости, который свойствен многим мексиканским видам картофеля.

В наших исследованиях мы попытались создать барьер на пути проникновения и распространения инфекции, повысив устойчивость клеточной стенки, являкщейся местом первого контакта паразита и растения-хозяина, к гидролазам микроорганизмов. Учитывая, что пектиназы к тому же подготавливаягг растительный субстрат к действию целого комплекса остальных Ферментов патогена (Васильева и др., 1984) можно было предполагать, что устойчивые к пектиназам ткани растения будут менее доступны и для других Ферментов патогена, что должно повысить устойчивость к ним таких растений.

В отличие от экспериментов с низкими концентрациями пектиназ, на которых выращивали растения или получали регенеранты,

среди устойчивых к пектиназам регенерантов отмечали устойчивость как к бактериальным, так и грибным инфекциям.

Повышенная активность ингибитора полигалактуроназы в тканях этих регенерантов может ослаблять действие пектаназ Фитолатогенных грибов, что, с одной стороны, осложняет проникновение-последних в такие ткани, а с другой - снижая скорость, препятствует полной деградации полигалактуроновой кислоты клеточных стенок эн-дополигалактуроназой гриба, что может вести к изменению баланса между образующимися неактивными и элиситор-активными Фрагментами и накоплению последних CCervone et al., 1989, 1993). В то же время, устойчивость и к бактериальным и к грибным патогенам устойчивых к пектиназам регенерантов может быть связана и с повышенной активностью пектинлиазы в их тканях.

Можно предполагать, что у устойчивых к пектиназам регенерантов их устойчивость к болезням в основном связана с трудностями проникновения и распространения патогена в растении, а также с недостаточным функционированием других Ферментов патогена Защитные же реакции, индуцируемые олигогалактуронидами, образующимися при действии пектаназ патогенов и, возможно, играющие основную роль при использовании в экспериментах низких концентраций пекти-наз, в этом случае являются, по-видишму, вспомогательными.

Найденную определенную взаимосвязь между устойчивостью растений картофеля к патогенам и устойчивостью к пектиназам m vitro можно будет, по-видимому, использовать для экспресс-скрининга потенциально устойчивых к патогенам растений картофеля на основе реакции замедленной флуоресценции хлорофилла.

Очень важно, что при использовании пектиназ выявлены Формы с одновременной устойчивостью к нескольким патогенам. Это является преимуществом предложенных нами подходов перед существующими методами клеточной селекции, использующими обычно патотоксины определенного возбудителя, что резко ограничивает возможности этих методов. Возможно, что наши результаты объясняются неспециФическим характером воздействия примененных нами пектиназ. продуцируемых Rhizopus sp., а не определенным видом патогена.

Отдельно необходимо коснуться вопроса о возможной связи устойчивости растений картофеля к пектиназам in vitra и повышенным содержанием в них цитокининов, что наблюдается у определенной часта устойчивых к пектиназам регенерантов. Известно, что цитоки-нины способны усиливать лигниФикацию клеточный стенок СДерФлинг, 1985; Запрометов и др.. 1986), что делает растительную ткань ме-

нее доступной для гидролаз патогенов, в том числе и пектиназ. Отсюда можно предполагать, что повышенное содержание цитокининов в регенерантах, возможно, ведет к,некоторому механическому укреплению клеточных стенок, что делает их более устойчивыми к гидролазам патогенов. А это. в свою очередь, может обусловить более высокую устойчивость таких регенерантов и к самим патогенам. С другой стороны, регенеранты с повышенным содержанием цитокининов характеризовались и повышенным, по сравнению с обычными растениями, уровнем активности растительной хитиназы, игращей важную роль в защите растений от фитопатогенных грибов.

Таким образом, впервые представлены данные, свидетельствующие о связи между устойчивостью растений картофеля к пектиназам микроорганизмов in vitro и устойчивостью растений к патогенам, а также данные, позволяющие предполагать возможное участие эндогенных цитокининов в защитных механизмах против патогенов через повышение устойчивости растений к пектолитическим Ферментам патогенов и повышение активности растительных хитиназ.

Устойчивость к патогенам сомаклонов и индуцированных мутантов картофеля часто сопряжена, как это показано, с пониженной урожайностью. При использовании же пектиназ для получения устойчивых к заболеваниям клонов картофеля, урожайность была часто незначительно ниже контроля, что позволяет говорить еще об одном преимуществе предлагаемых нами приемов перед другими методами.

Таким образом, полученные в работе данные свидетельствует о перспективности использования пектиназ для создания устойчивых к болезням растений. В то же время, надо ясно представлять себе, что предложенные методы не обеспечивают 100%-ного получения более устойчивого материала, а, в первую очередь, способствуют отбору популяции растений, обогащенной потенциально устойчивыми Формами.

Наконец, проведенные на различных сортах и видах картофеля исследования по регенерации в культуре ткани, генетической трансформации. мутагенезу позволяют рекомендовать для работ по клеточной биоинженерии сорт картофеля Янтарный, который оказался наиболее отзывчивым ко всем примененным в работе манипуляциям.

заклочение

В результате проведенных на различных сортах и видах картофеля исследований разработаны: 1) эффективные системы регенерации побегов и размножения растений in vitro; 2) способ сохранения уникальных регенерантов, получаемых в экспериментах по клеточной

инженерии; 3) методы изолирования и культивирования протопластов; 4) эффективные методы трансформации с использованием агробактери-альных систем; 5) новые оригинальные подходы на основе пектиназ микроорганизмов к решению проблемы повышения устойчивости растений картофеля к патогенам; б) экспресс-метод для скрининга устойчивых к пектиназам и патогенам регенерантов картофеля.

Разработанные методы позволили получить большое число Форм картофеля с новыми свойствами, в том числе и устойчивых к патогенам и, таким образом, значительно расширить имеющееся генетическое разнообразие этой культуры. Отработанные приемы генетической трансформации дают возможность конструировать в дальнейшем новые Формы картофеля с различными полезными генами. Экспериментально созданные маркированные генотипы объединены в коллекцию, которая может использоваться в Фундаментальных исследованиях в различных областях биологии картофеля, а также в прикладных исследованиях с целью повышения устойчивости картофеля к патогенам и улучшения существующих сортов.

Полученные в работе результаты говорят о возможности использования пектиназ микроорганизмов для создания устойчивых к заболеваниям растений картофеля. Такая, не связанная с патотоксинами стратегия повышения устойчивости растений картофеля к патогенам обладает важным преимуществом, которое заключается также и в возможности получения растений с групповой устойчивостью к разным патогенам.

вывода

1. Повышение устойчивости картофеля к патогенам требует привлечения современных методов биоинженерии in vitro с целью создания широкой генетически разнообразной базы исходного материала для конструирования устойчивых Форм и проведения прикладных и Фундаментальных исследований в области биотехнологии картофеля.

2. Изучение морфогенетичеосих реакций m vitro разных типов эксплантов показало, что наибольшей регенерационной активностью обладают корневые экспланты. которые должны найти широкое применение для массового получения регенерантов, альтернативного получения регенерантов из корней, образующихся на каллусе, размножения материала, а также для получения Ri-трансгенного картофеля.

3. Разработаны оптимальные методы изолирования и культивирования протопластов, позволяющие получать протоклоны у различных

сортов картофеля. Предложен интегральный показатель, способствующий объективной оценке влияния различным факторов на развитие протопластов и подбору оптимальных условий их культивирования.

4. Оптимизированы методы получения трансгенных растений картофеля. Созданы трансгенные канамицинустойчивые растения картофеля, а также клеточные линии диких видов Solanum для использования в соматической гибридизации с целью передачи их генов устойчивости в слота культурного картофеля. Трансгенные растения с дополнительным геном изопентенилтрансФеразы Cshooty-регенерантьи могут быть использованы для исследования гормональной регуляции ростовых и генетических процессов у картофеля. Характерный shooty-фе-нотип и способность эффективно регенерировать на безгормональной среде делает эти Формы удобными маркерами для клеточной инженерии.

5. Методы сомаклональной изменчивости и индуцированного мутагенеза in vitro характеризуются недостаточной эффективностью в создании устойчивых к патогенам Форм картофеля.

6. Разработаны новые оригинальные системы повышения устойчивости картофеля к патогенам на основе пектолитических Ферментов Rhlzopus sp. С использованием этих систем получены регенеранты, устойчивые к Фитопатогенным грибам и бактериям, в том числе и с групповой устойчивостью к нескольким патогенам. Взаимодействие in vitro пектиназ Rhizopus sp. с растениями является комплексным процессом. Пектиназы могут, с одной стороны, индуцировать устойчивость, а с другой - подавлять защитные механизмы растения и в различных ситуациях, в зависимости от соотношения этих процессов, по-разному влиять на устойчивость растения.

7. Выявлена специфичность в действии пектиназ и целлюлаз на растения картофеля in vitro и генотипическая зависимость влияния этих Ферментов на растения. Предложен экспресс-метод оценки устойчивости растений картофеля к пектиназам по характеристике замедленной Флуоресценции хлорофилла, так как устойчивость растений картофеля к пектиназам микроорганизмов в какой-то степени связана с их устойчивостью к патогенам, это свойство можно использовать для скрининга потенциально устойчивых к патогенам Форм картофеля.

8. Среди различньи испытанных сортов картофеля выделяется сорт Янтарный, отличающийся высоким и длительным морфогенным потенциалом в каллусной культуре, высокой мутабильностью и эффективностью генетической трансформации, что позволяет рекомендовать его для широкого использования в биотехнологических исследованиях.

3. Разработан и запатентован способ сохранения и размноже-

ния уникальным регенерантов картофеля, заключающийся в индукции микроклубней на зачаткам регенерантов, находящихся в каллусе.

10. Создана и охарактеризована коллекция экспериментально полученных Форм картофеля с различными маркерными признаками, которая может быть использована в Фундаментальным и прикладным_исследованиях в различных областях биологии картофеля.

список

публикаций по теш диссертации

1. Бутенко р.Г.. Кучко A.A., Витенко В.А., Аветисов В.А. Получение и культивирование изолированным протопластов мезофилла листа Solanum tuberosum L. и Solarium chacoense Bitt. // Физиология растений. 197?. Вып. 24. N. 3. С. 660-665.

2. Аветисов В. А., Мелик-Саркисов 0. С., Петров А. Н. и др. Индуцированный морфогенез картофеля в культуре in vitro // Культура клеток растений и биотехнология. Кишинев. №шниа. 1983. с. но -ill.

3. Аветисов В.А., Мелик-Саркисов o.e. индуцированный in vitro морфогенез у сортов картофеля Янтарный, Львовянка и Повировец // Исследования по клеточной селекции картофеля. Научные труды ШМКХ. М. 1984. с. 89-94.

4. мелик-Саркисов O.e., Аветисов В.А. Использование клеточной биотехнологии в практической селекции и растениеводстве // Вестник с.-Х. науки. 1984. N. 7. С. 91-100.

5. Аветисов В.А., Мелик-Саркисов О.С. Генотипические особенности морфогенеза в каллусным культурах различным сортов картофеля // С.-М. биология. 1985. N. 3. С. 67-70.

6. Мелик-Саркисов O.e., Аветисов в.А. Перспективы клеточной био-темнологии в картофелеводстве // Состояние и перспективы развития сельскомозяйственной биотехнологии, л. 1986. С. 79-85.

7. Мелик-Саркисов O.e., Аветисов В.А. Клеточные биотехнологии в решении проблем картофелеводства // Вестник с.-х. науки. 1987. N. 1. С. 57-64.

8. мелик-Саркисов O.e., Аветисов В.А. Способ получения микроклубней картофеля // Авторское свид-во N 1376990, 1 ноября 1987г. Приоритет изобретения от 21 февраля 1986 г.

9. Аветисов В.А., Кривощапова Г.И.. Мелик-Саркисов О.С. Некоторые особенности культуры каллуснын протопластов картофеля // Физи-

ология растений. 1987. т. 34. Вып. 3. С. 595-603.

10. мелик-Саркисов o.e.. Аветисов В.А.. Кривоиапова Г.И. Индукция направленного органогенеза как новый метод интенсификации селекционного процесса в картофелеводстве //Тез. докл. V съезда ВОГИС им. Н. И. Вавилова. М. 1987. Т. 4. Ч. 4. С. 78.

11. Аветисов В.А., Мелик-Саргсисов O.e. Использование гидролитических Ферментов в селекции картофеля на устойчивость к грибным заболеваниям // Биология культивируемых клеток и биотехнология. Новосибирск. 1988. С. 172.

12. Мелик-Саркисов О. С.. Аветисов В. А., Гартель A.J1. Использование миниклубней картофеля для получения трансформированных клонов // Там же. С. 192-193.

13. Аветисов В. А., Мелик-Саркисов 0. С., Соболькова г. И. Индукция микроклубнеобразования на регенерантах из каллусов картофеля // С.-Х. биология. 1989. N. 5. С. 26-28.

14. Аветисов В.А.. Мелик-Саркисов О.С. Биологические приемы в повышении продуктивности растениеводства на современном этапе // Применение биотехнологий в животноводстве, растениеводстве и ветеринарной медицине. Л. 1988. с. 164-167.

15. Аветисов В. А., Соболькова Г. И.. Гартель А. Л. и др. Эффективная система трансформации картофеля при использовании срезов клубней//Новые направления биотехнологии. Пушино. 1988. С. 62.

16. Мелик-Саркисов O.e.. Аветисов В.А.. Соболькова Г.И. Новый интегральный показатель потенциального развития протопластов в культуре // Проблемы и перспективы биотехнологии. Братислава. Чехословакия. 1989. С. 58-59.

17. Гартель А. Л., Аветисов В. А., Соболькова Г. И. и др. Генетическая трансформация картофеля с использованием бинарного вектора в штамме Agrobacterium ttunefaciens // Тез. докл. Всес. конФ. по генетике соматических клеток в культуре. М. Звенигород. 1989. С. 89-90.

18. Аветисов В.А.. Мелик-Саркисов 0. С. Новый интегральный показатель потенциального развития протопластов картофеля в культуре in vitro // Регуляция роста и развития картофеля. М. Наука 1990. С. 118-122.

19. Дубровский И.Г.. Аветисов В.А.. Мелик-Саркисов О.С. Возможности использования адвентивного побегообразования на корнях в биотехнологии картофеля // Там же. С. 126-130.

20. Аветисов В. А.. Гартель А. Л.. Мелик-Саркисов О. С. и др. Система трансформации картофеля при использовании срезов клубней

// Биология культивируемых клеток и биотехнология растений, м. наука. 1991. С. 99-102.

21. Вито л И. С., мелик-саркисов О. С., Аветмсов В. А. и др. использование пероксидазы и глютаматдегидрогеназы в качестве биохимических маркеров в биотехнологических исследованиях на картофеле // Доклады ВАСХНШ1. 1989. N. 10. С. 14-15.

22. мелик-Саркисов G.C.. Аветисов В.А., Дубровский и.Г. и др. Множественные Форш некоторых оксидоредуктаз у различных ви-дбвТсашоФеля^// Физиология и биохимия культурных растений. 1990. Т. 22. N. 3. С. 297-300.

23. Гартель A.JL, Аветисов В.А., Соболькова Г.И. и др. Экспрессия гена бета-глюкуронидазы с сильного растительного промотора в каллусе трансгенного картофеля // Молекулярная биология. 1990. Т. 24. N. 3. С. 752-756.

24. Avetisov V.A., Mellk-Sarklsov 0.S. Some peculiarities in cultivating protoplasts isolated from potato callus culture // Abstracts Vilth Internat. Congress on plant tissue and cell culture. Amsterdam. 1990. P. 6.

25. Mellk-Sarklsov O.S., Avetisov V.A., Sobolkova G.I. et al. Genetic transformation of potato with binary vector in Agrobac-teriuifi rhizogeries // Ibid. P. 69.

26. Avetisov V.A., Melik-Sarkisov O.S., Avetisova L.V. Uncommon way of morphogenesis in transformed potato tissue // Phvsio-logia plantarum. 1990. V. 79. N. 2. Part 2. P. A5.

27. Дубровский И.Г., Витол И.е., Аветисов В.А. и др. Изоперокси-дазный анализ развития побегов на корнях картофеля // Доклады ВАСХНИЛ. 1990. N. 11. С. 18-21.

28. Гартель А.Л., Аветисов В.А.. Соболькова Г.И. и др. Изучение действия промотора 35S РНК в различных органах трансгенных растений картоФеля//Молекулярная биология. 1991. Т. 25. N. 5. С. 1372-1376.

29. Гартель А.Л.. Аветисов В.А., Соболькова Г.И. и др. Промотор экстенсина более эффективно действует в каллусе, чем в органах трансгенного картофеля // Там же. С. 1377-1381.

30. Аветисов В.А., Стефанович А.М., Давыдова Ю.В. и др. Использование shootv мутанта Afirobacterium tumefaciens для повышения регенерационной активности эксплантов картофеля в культуре m vitro // Биотехнология. 1991. N. 6. С. 19-22.

31. Давыдова ю.в., Аветисов В. А., мелик-Саркисов О.с. Создание трансгенных форм диких видов картофеля для использования в

соматической гибридизации // Тез. докл. Всес. КоиФ. "Достижения биотехнологии агропромышленному комплексу". 14-18 октября 1991. Черновцы. Т. 1. С. 51.

32. Avetisov V.A., Stefanovich A.M., Melik-Sarkisov О.S. Utilization of cvtokinln genes to create potato fortes with increased regenerative potential in the in vitro culture // First Symposium "Trends in Plant Biotechnology". USSR. Pushino. November 20-22. 1991. P. 120-121.

33. Melik-Sarkisov O.S., Davydova Yu.V., Avetisov V.A. Creation of partners marked by various signs for the somatic hybridization of potato // Ibid. P. 134-135.

34. Davydova Yu.V., Melik-Sarkisov O.S., Avetisov V.A. et al. Obtaining of potato clones with increased resistance to fungus infection // Ibid. P. 159-160.

35. Avetisov V.A., Davydova Yu-V., Melik-Sarkisov O.S. The production of marker forms for potato somatic hybridization and their protoplasts culture // Physiologia Plantar-urn. 1991. V. 82. N. 1. P. A9.

36. Аветисов В.А., Давыдова Ю.В., Мелик-Саркисов O.C. и др. Получение резистентных к гидролитическим Ферментам клеточных клонов и регенерантов картофеля с повышенной устойчивостью к Фи~ тофторозу // Биотехнология. 1992. N. 1. С. 18-22.

37. Аветисов В.А., Стефанович А.М., Мелик-Саркисов О.С. МорФогенетическая активность трансгенных и нормальных корней картофеля в культуре in vitro //Биотехнология. 1992. N. 2. С. 6-9.

38. Давыдова Ю.В., Мелик-Саркисов О.С.. Аветисов В.А. Создание маркерных устойчивых к каиамицину клеточных линий диких видов картофеля // Цитология и генетика. 1993. N. 2. С. 18-22.

39. Avetisov V.A., Davydova Yu.V., Sharova A.P. et al. The microorganism hydrolitic enzymes in potato plant cell selection // Int. Symposium "Plant Biotechnology and Genetic Engineering. October 3-6. 1994. Kiev. The Ukraine. P. 7.

40. Шарова А.П., Давыдова ю.В.. Мелик-Саркисов О.С., Аветисов В.А. Морфогенетическая активность различных типов зксплантов картофеля в культуре in vitro // Биотехнология. 1995. N. 12. С. 15-18.

41. Шарова А. П., Давыдова ю. В., Мелик-Саркисов 0. С., Аветисов В. А. Использование сомаклональной изменчивости и индуцированного мутагенеза в создании устойчивого к ФитоФторозу картофеля // Биотехнология. 1996. N. б. С. .14-20.

42. Шарова A.n., Давыдова Ю.В., Мелик-Саркисов o.e., Аветисов В.А. Новые подходы к конструированию устойчивого к инфекционному стрессу картофеля // Биотехнология. 1996. N. 7. С. 18-22.

43. Шарова A.n., Давыдова Ю.В., Мелик-Саркисов O.e., Аветисов В.А. Влияние гидролаз микроорганизмов на развитие растений картой

-de ля, выращиваемых in vitro // Онтогенез. 1996. Т. 27. N. 4.

С. 266-272.

44. Аветисов В.А., Давыдова Ю.В., Шарова А.П. и др. Создание и характеристика трансгенных растений картофеля с дополнительным геном биосинтеза цитокининов // Онтогенез. 1996. Т. 27. N. 6. С. 405-412.