Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

СОЗДАНИЕ И ОЦЕНКА ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ ПО УСТОЙЧИВОСТИ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "СОЗДАНИЕ И ОЦЕНКА ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ ПО УСТОЙЧИВОСТИ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ"



На правах рукописи

КРУПЕНИН Роман Вячеславович

СОЗДАНИЕ И ОЦЕНКА ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ ПО УСТОЙЧИВОСТИ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ

Специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва - 2004

Работа выполнена в 2000-2003 гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте картофельного хозяйства ми, А.Г. Лорха

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Хромова Л.М,

л

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор Фирсов И. И. кандидат сельскохозяйственных наук Петухов СЛ.

Ведущая организация: Всероссийский НИИ

сельскохозяйственно! 1 биотехнологии

Защита диссертации состоится "_"_2004 г. в 13й1 час. х:

заседании диссертационного совета К,006.0}7.01 при Всероссийском научив исследовательском институте картофельного хозяйства 1м. А.Г. Лор.и РАСХН по адресу: 140052, Московская обл., Люберецкий р-н, пос Коренево, д. 23.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИКХ, Автореферат разослан "_"_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Н.П. Склярова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Создание растений, устойчивых к болезням является непростой задачей для генетиков и селекционеров из-за участия многих генов во взаимодействии растение-патоген. В настоящее время в селекционный процесс и той или иной степени вовлечены многие дикорастущие виды картофеля, служащие донорами генов устойчивости (Камераз и др., 1973). Однако, одним из главных недостатков традиционной селекции сортов на устойчивость является часто встречающееся при половой гибридизации сцепление с данным локусом резистентности нежелательных генов, снижающих хозяйственную ценность селекционного материала.

В настоящее время методы 1-енной инженерии становятся рабочими инструментами в селекции, поскольку они позволяют вводить определенный геи в растение конкретного генотипа, что значительно повышает качество и эффективность селекционной работы. Применительно к картофелю, который размножают вегетативно, и где обычная селекция подразумевает скрещивание между двумя гетерозиготными тетраплоидными формами, применение направленных, точных методов молекулярной селекции особенно актуально (Мскау, 1996).

Относительно недавно в семенах и вегетативных органах различных растений были обнаружены гены, способные экснрсссировать пептидные антибиотики - дефензины - коро ткие белки широкого фун пщидмого действия (ВгоекаеЛ е! а!., 1995). Одними из самых сильнодействующих являются дефензины из семян редьки (Парашина и др., 1999).

К настоящему времени получены трансгенные растения томата, табака, капусты, моркови и других культур, несущих ген защитного пептида редьки. Они отличаются повышенной устойчивостью к грибным заболеваниям. Поэтому использование гена растительного дефекзина для создания устойчивых к патогенам растений картофеля является новой, привлекательной областью приложения метода генной инженерии, имеющей как большое научное, так и практическое значение.

АТ.'* |

Цель и задачи исследований. В связи с вышеизложенным в настоящей работе была поставлена цель получить трансгенные растения картофеля на основе гена м дефензина из семян редькн (КарЬапих хап-ш-), оценить их ло устойчивости к грибным патогенам и выделить линии, превосходящие исходный сорт но резистентности к болезням.

Исходя из этого предстояло решить следующие задачи:

- оптимизировать методику трансформации для используемых в работе сортов картофеля;

- получить растения-регенеранты, несущие ген гл и доказать их транс ген н ость;

- провести раннее тестирование признаков резистентности к микозам в трансгепных растениях на основе т VI1 го-тестов и искусственных заражений клубней и взрослых растений;

- провести оценку урожайности трансгенных линий с повышенной устойчивостью к болезням в сравнении с исходным нетрансгенным сортом.

Наушая новизна. Оптимизирована базовая методика трансформации для сортов, использованных в работе. Получены траисгенныс линии картофеля, проявляющие повышенную устойчивость к фитофторозу, альтернарнозу, сухой фузариозной шили и парше обыкновенной.

Практическая ценность работы. Полученные в работе результаты и разработанные методики могут быть использованы при создании траисгешшх линий картофеля и их оценке на устойчивость к различным заболеваниям. По 6 перспективным сортам картофеля получено 10 трансгенных линий с комплексной устойчивостью к грибным патогенам. Трансгенные линии предложены авторам сортов как стартовый материал для всесторонней селекционной проработки в качестве улучшенной сортоформы.

Апробация работы. Материалы исследований были представлены па II молодежной научной конференции " Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 11 апреля 2002 г.), на 1

Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям (Санкт-Петербург, 2-5 июля 2002 г.), на второй научной конференции "Актуальные проблемы генетики", посвященной 315-лстшо со дня рождения Николая Ивановича Вавилова (Москва, 21-22 февраля 2003 г.), на конференции "Современное состояние проблем и достижений в области генетики и селекции", (Ал маты, 26-27 марта 2003 г.), на 7-й Пущи не кой школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 21-27 апреля 2003 г.).

Публикации. По материалам диссертация опубликовано 8 печатных

работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследовании, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 18 рисунков и 32 таблицы, библиография включает 206 наименований работ из них 102 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследований. В экспериментах были использованы перспективные copia картофеля селекции ВНИИКХ, имеющие низкую или среднюю устойчивость к некоторым грибным болезням: Лорх (неустойчив к раку и парше обыкновенной), Синецвет (неустойчив • к фитофторозу и альтериариозу), Жуковский ранний и Ильинский (неустойчивы к фитофторозу), Голуб] 13нз (среднеустойчив к фитофторозу), Раменский (неустойчив к сухой фузариозиой гнили). Растения выращивали in vitro на модифицированной среде Мурзснге и Скугз (Поддержание и хранение коллекционных образцов картофеля в условиях in vilro, 1987} при 16-часовом фотонерноде и освещенности 4000-6000 люкс.

Векторная конструкция и агробаюериальные штаммы, В работе использовали обезоруженные штаммы LBA4404 и LGV3S50 Agrobaciermm

lumefaciens и штамм A4 Agrobacterium rhuogmes. Эти штаммы несли векторную ¡шазмиду pK22rs с геном пептидного антибиотика (дефензина) редьки rs, и маркерным геном устойчивости к антибиотику канамицину nptlí (Шаденков и др., 1996). Использованная в работе генетическая конструкция защищена патентом на изобретение №2176669. Все агробактериалыше штаммы были предоставлены лабораторией генной инженерии растений ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии r рамках договора о сотрудничестве, Агробактерии культивировали на среде LB (Маниатис и др., 1984).

Штаммы фнтопатогенои. В качестве возбудителя фитофтороза использовали расы 1.2.3.4 и 1.2.3.4.5.6+0,7.8.10.1 t.xyz гриба l'bytophihora infesians, выделенные из состава местной популяции и отобранные с иомошью сортов-дифференциаторов. Для работы но оценке устойчивости к ризоктониозу использовали штаммы R-4, R-7 и R-9 Rhizoctonia sotaní, выделенные из склероциев и пораженных ростков. Для оценки материала на устойчивость к раку картофеля использовали Далемский патотнп (патотип I) гриба Syjtchytrium endohioücum. Коллекция вышеперечисленных патогенов хранится и поддерживается во ВНИНКХ, Для оценки материала на устойчивость к ранней сухой пятнистости картофеля (альтер нариозу) использовали штамм гриба Aiternana sotaní. В качестве возбудителя сухой фузариозной гнили использовали вид Fusarium Ытогипг. Эти культуры были получены из ВНТШСБ. Все патогены культивировались на картофельпо-сахарозном агаре, за исключением Phytophthora in fast ans - на овсяном агаре и Synchyirium cndobioticum - в виде инфекционного порошка, полученного из раковых наростов.

Получение трзнсгенных растений. Трансформировали растения по методике ВНИИКХ (Методические указания по получению трансформированных растений картофеля, 1995).

Молекул яр но-био логические анализы. Выделение ДНК из растений, устойчивых к канамицину, проводили по методике (Edwards et al., 1991). Включение в растительный геном целевого гена rs определяли методом 1DJP

(Современные метода биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии, 1998).

Опенка устойчивости растений к болезням. Оценку на устойчивость к фцтофгорозу по листьям с помощью искусственных заражений in vitro проводили, пользуясь экспресс-методом (Кукушкина, Юрьева, Кукушкин, 1994), Оценку на устойчивость к фнтофгорозу по листьям in vivo и по клубням с помощью искусственных заражений проводили по методикам ВН1ШКХ (Методические указания но оценке селекционного материала картофеля на устойчивость к фитофторозу, ризоктониозу, бактериальным болезням и механическим повреждениям, 1980). Устойчивость растений к альтернариозу in viiro оценивали но методике (Дмшриева, 1988). Для определения степени устойчивости селекционного материала к альтернариозу с применением искусственного заражения листьев взрослых растений использовали методику (Broggio, Kamicci 1990). Для оценки растений in vitro на устойчивость к ризоктониозу использовали методику (Захарова, 1979). Для оценки транс ген ных растений на ракоустойчивость использовали методику, разработанную Л.П, Салтыковой и В.П. Тарасовой (19S2). Оценку на устойчивость к сухой гнили проводили по методике H.A. Дорожки на и В.Т. Михальчика (1979). Оценку на устойчивость к парте обыкновенной проводили визуально на естественном фоне (Анисимов, 2000). Оценки проводили в лаборатории клеточной и генной инженерии и лаборатории иммунитета BEfJlIíKX. Все оценки проводили по 9-баллыюй шкале устойчивости СЭВ (низкая - 1-3 балла, средняя 4-6 балла, 7-9 баллов).

Вегетационный и полевой опыты В вегетационном опыте растения высаживали в теплице в пятикратной повтори ости в стеллажи заполненные торфом на глубину 30 см. Полевой опыт проводили на супесчаной дерново-подзолистой почве в пятикратной повториости на сертифицированном полигоне для xpai¡ereиных растений ВШШКХ в пос. Апариха Люберецкого р-на Московской области. В опытах очен и ват и урожайность, сравнивали

морфологические характеристики трансгенных линии с исходными сортами-стандартами.

Биохимическая идентификация генотипов картофеля. Для доказательства тождественности базисных генотипов трансгенных линий к сортов-стандартов проводили идентификацию образцов, показавших наиболее высокое проявление комплекса признаков (высокая устойчивость к болезням, м орфоти личность, продуктивность не ниже стандарта). Анализ белков проводили методом изоэлектрофокусировки в пол и акрид амид ном геле (Методы оценки оздоровленных сортов и меристемных линий в элитном семеноводстве картофеля, 1991), Анализы проводили в лаборатории молекулярной и гаметной селекции ВНИИКХ.

Статистическая обработка данных. Результаты исследований статистически обработаны по методике (Доспехов, 1979) и с помощью компьютерной программы Microsoft EXCEL.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оптимизация методики трансформации

Для проведения успешной селекции трансформированных растений на канам! щи новых средах необходимо было установить концентрацию этого антибиотика.. Для этого было взято по 10 стеблевых эксплантов каждого сорта и оценена их чувствительность на питательных средах для регенерации с различными концентрациями канамицина: 15 мг/л, 25 мг/л, 50 мг/л, 75 мг/^ffî и контроль без антибитотика.

При уровне канамицина 0-15 мг/л регенерация побегов происходила интенсивно. При высоком содержании антибиотика (50-75 мг/л), он не эффективен, поскольку такие концентрации приводят к некрозу эксплантов. При концентрации канамицина 25 мг/л регенерации не происходит, но эксплант остается жизнеспособным. В такой концентрации канамицин можно успешно использовать в качестве селективного фактора. При более высоком содержании

антибиотика, он также не эффективен. Видимо, это обусловлено либо толерантностью, либо та перч у вствнтел ьпостъю. приводящей к некрозу и нигев иди ости регенерантов.

При проведении пред инкубации на с кету наблюдали замедленную регенерацию эксплаитов в то время как иредынкуоашя в темноте дала лучший результат. Помимо это]-о, длительная ко культи ваши а!робактерин с эксплантами не давала положительного эффекта: ткани стеблевых фрагментов не кротизиро вались, среда зарастала агробактерией. Проведение предылкубации в темно!« способствовало усилению регенерации, что можно объяснить физиологическими процессами, идущими в темноте и способствующ!тми регенерации.

Существенному улучшению процесса регенерации эксплантов способствует стресс (Попадьин, 2002; Кучеренко, 1991), При стрессовой обработке пониженными температурами учитывали влияние различной экспозиции кокулътивации агробактерии с эксплантами картофеля исходных генотипов (табл. 1).

Ко культивировали в темноте при 25°С. Проведение предынкубации при 4°С было более эффективным. Объяснения между процессом регенерации и условиями проведения эта на предыякубашнт могут быть след у и {не; пониженные температуры синхронизируют клеточные циклы процессов деления и большее число клеточных мишеней для агробактерии оказываются одновременно в оптимальной стадии клеточного цикла.

Возможно, это также связано с физиолого-биохимнческими процессами, происходя щи ми по-разному в зависимости от температурного режима. Исходя из литературных данных, можно предположить, что наблюдаемый положительный эффект обусловлен торможением клеточного цикла под действием стресса посредством митоген-активируемых ккназ и запуском комплекса генов, детерминирующих комплексную дифференциацию.

Таблица 1. Влияние предыикубационной температуры и времени

кокультивации via эффективность регенерации эксплантов картофеля разных генотипов при трансформации различными штаммами Agrobciderium

tumefiiciens

. .. Сорт Штамм Условия температуры во время преды нкубации и экспозиция ко культивации, час

4...6СС 23.,.25°С

1 5 24 1 5 24

Синецвет LBA4404 34±1,4* 21 ±1,0 8±1,4 15±0,7 6±0,5 0

LGV3850 40±3,9 )9±2,1 10±1,9 8±0,5 6*0,7 0

Лорх LBA4404 26*2,3 18±1,6 0 7 ±0,7 0 0

LGV3850 36±S,0 2б±1,1 0 5±0,8 1*0,5 0

Жуковский ранний LBA4404 48±U 18±1,6 0 ]0±1,9 5±J,2 0

LGV3S50 44 ¿5,0 14±ЗД 0 13±1,2 3±0,9 0

Ильинский LBA4404 35±1,3 !9±2,1 ]±0,9 ] 8±2,0 0

LGV3850 42± 1,4 28±1,0 3+0,б 16±0,7 #¿0,3 0

Голубизна LBA4404 7В±8,0 54±5,0 6±2,0 48±1,1 14±2,7 0

LGV3850 82±5,0 55*8,0 10±3,3 24±1,8 12±2,4 2±0,5

Рзменский ¡LBA4404 10±0 2±5,0 0 2-+0,8 0 0

LGV3850 12±2,4 4*2,5 0 0 0 0

^указан выход регенератов, отложены ошибки средних, %

Также необходимо отметить, что выход регенерантов заметно отличается по генотипам. Сорта Голубизна, Жуковский ранний, Ильинский хорошо регенерировали, у них наблюдался наибольший выход регенерантов ш эксплантов. Такие генотипы, как Рамевский очень плохо поддаются трансформации, что обусловливается их слабой способностью к регенерации

С целью оптимизации методики трансформации с использованием АцгоЬаШшт гИ 1ю^епех были исследованы несколько составов питательных сред с различными сочетаниями фитогормонов и концентрацией К я) 25 мг/л.

Подобранные концентрации фитогормонов БАП (3,0 мг/л), (ИУК 0,1 мг/л) н (ГК !0 мг/л) оказались наиболее благоприятными для регенерации и обеспечили наибольший выход реге нерантов. В дальнейшем такие концентрации можно использовать при трансформации картофеля с помощью штамма Л4 А^гоЬас!егтт Нуюдетз.к.

Стеблевые эксплзнгы, взятые из междоузлий верхнего яруса регенерировали лучше по сравнению с зкеплангами среднего и нижнего ярусов (табл. 2).

Таблица 2. Зависимость регенерации от яруса междоузлия, взятого в качестве экспланта при трансформации штаммом А4 Agrohac1eriwn гИно^епа

Сорт Ярус\. Раменский Жуковский ранний Ильинский Голубизна

Верхний 24±0,9* 76±0,6 68±1,0 84±7,0

Средний 1б±0,7 41 ±1,3 32*1,5 . 58±3,0

Нижний 0 7±03 9±0,3 2Ы_0

*указап выход регенератов, отложены ошибки средних, % Следует сделать вывод, что целесообразнее использовать экенлангы из междоузлий верхнего и среднего яруса, поскольку клетки этих тканей, по-видимому, обладают большей реге нерацион ной способностью. С друга й стороны это может объясняться содержанием в верхушечной части эндогенных цигокининов, влияющих на реге нерационные процессы.

2. Оценка трансгенностн трансформированных ра стен ни картофеля

Укоренившиеся на среде с канамнцином (25 мг/л) реге неранты были размножены и проверены на содержание гена гх в растительном геноме методом ПЦР.

Методом 1ЩР наличие гена га было обнаружено в 80-ти реге неранта в 6-ти сортов и вычислена частота трзнсгеноэа по каждому генотипу (табл. 3).

Таблица 3. Эффективность трансформации картофеля сортов картофеля

в зависимости от штамма агробактерии

Сорт Штамм Кол-во эксплактов Регенеранты Кт-устой-чквые Трансгенные (ПЦР+), шт. Трансформация, (ПЩЧ) % жеппешты

шт. %

Лорх ЬВА4404 112 11 27,5 3 2,7

ЬО 73850 108 9 27,3 2 1,9

А4 - — - -

Синецвет ЬВА4404 128 20 28,2 9 7,0

1ЛЗУ3850 125 14 20,0 8 6,4

А4 - - - -

Жуковский ранний ЬВА4404 105 15 14,3 1 0,9

из 73850 100 15 15,0 1 1,0

А4 101 54 53,5 12 П,8

Ильинский ЬВА4404 48 12 25,0 1 2,1

ьвУ3850 56 12 21,4 2 3,6

А4 95 34 35,8 9 9,5

Голубизна ЬВА4404 98 14 14,3 9 9,2

ЫлУ3850 102 14 13,7 6 5,9

А4 90 40 44,4 14 15,6

Раменсюш ЬВА4404 50 4 8,0 0 Г 0

ЬСУ3850 50 6 12,0 0 0

А4 115 16 13,9 3 2,6

Траисгенных растений значительно меньше, нежели трансформантов,

устойчивых к канамииину. Предположительно это может объясняться следующим. Во-первых, регенерация побегов на экспланте может проходить из клеток каллуса, находящихся в разных точках. Поскольку канамицин в тканях распределяется по градиенту, то его концентрация может быть различной. Во-вторых, каллус представляет собой неорганизованную пролиферирующую ткань, состоящую из дедифферинцированных клеток (Ше вел ух а и др., 1998), что может привести к возникновению устойчивых к канамицину клеток к силу эпигеномной изменчивости и хромосомным абберациям, обусловливающих генетическое разнообразие каллусных клеток. В-третьих возможен разрыв

связи целевого гена гх и маркерного прШ, что могло обусловить встраивание генов независимо друг от друга.

3. Оценка устойчивости тра метенных линий к грибным болезням 80 трансгенных линий 6 сортов оценивали по устойчивости к грибным болезням в соответствии с задачами но коррекции каждого сорта, В табл. 4-7 приведены результаты оценок некоторых трансгенных линий картофеля, показавших полярные результаты по устойчивости в сравнении со стандартом. Приняты сокращения для линий: Ж -- Жуковский ранний, И - Ильинский, Г -Голубизна, Ра - Раменский, Л - Лорх н Сн - Си нецвет. Жирным шрифтом выделены линии, существенно превышающие стандарт но устойчивости. Таблица 4. Характеристика устойчивости трансгенных линий сорта Жуковский

ранний к фигофторозу

По ЛИСТЬЯМ По клубням

11! \'11го визу ал.

Линия 2002 2003 1Л ср. огкл. от оценка 2003 2002 откл. ОТ 51

Ж 51 4,2 3,6 3,7 3,8 - 1-3 4,2 -

Ж 139 7,0 7,2 6,0 6,7 2,9 7'4 3,2

Ж 101 5,5 5,7 6,1 5,8 2,0 5 5,4 1,2

Ж 25 6,8 6,5 6,5 6,6 2,8 3-5 5,8 ),6

Ж ш 4,5 4,5 4,0 4,3 0,5 3 6,5 2,3

Ж 107 4,3 4,2 4,8 4,4 0,6 3 5,0 0,8

НСР«в-1,6 1 !СР05=0,8

Таблица 5. Характеристика устойчивости трансгенных линий сорта Синецвет к

алътернариозу

J1 иния in vitro in vivo op. откл, O ï si визуал. оценка в поле, в год эпифиготии 2002

2001 2002 2001 2002

Си st 3,0 3.2 3,5 3,4 3,3 - 5

Си 57 6/; 7,1 6,8 6;6 6,9 3,6 9

Си 31 7,1 6,7 7,2 7,0 6,8 3,5 1

Си 59 7,3 6,7 7,0 7,1 7,0 3,7 7

Си 40 6,8 6,2 6,0 6,5 6,4 3,1 7

Си 33 8,3 7,6 S,2 8,0 8,0 4,7 9

Си 17 7,7 7,2 6,8 6,S 7,1 3,8 7

Си 19 7,0 7,0 6,8 7,3 7,0 3,7 9

Си 78 3,4 3,0 4,0 3.8 3/> 0,3 5

Си 14 з,з 3,2 4,0 3,8 3,6 0,3 5

HCPoHXS

Таблица 6. Характеристика Таблица 7. Характеристика

устойчивости трансгенных линий сорта устойчивости трансгеииых линий Раменский к сухой фузариозной гнили сорта Лорх к парше обыкновенной

(искусств. заражения) (визуальная оценка)

Линия ср. откл. от sí Линия 2002 2003 ср. ОТКЛ. от S!

Ра st 5,8 Л sí 2 6 4,0 -

Ра 101 5,6 -0,2 Л 9 3 5 4,0 0

Ра 103 5,4 -0,4 Л 8 5 7 6,0 2,0

Ра 105 8,0 2.2 J1 13 8 9 8,5 4.5

НСРц;-0,8 HCPfis-2,3

Нельзя однозначно утверждать о зависимости между фактам трапсгенности и повышением устойчивости 1рансгенных линий к болезням, поскольку не проведены прямые эксперименты по доказательству экспрессии встроенного гена методом Вестерн-блоттинга. К тому же, картофель является культурой, характеризующейся высокой сомаклональной вариабельностью по хозяйственно ценным признакам, в том числе и по резистентности к болезням, что могло быть причиной повышенной устойчивости к фитофторозу трансгенных линии. Имеются данные (Партийна, 1999; Сердобниский, 2002), что ген г.у успешно экспрессируется в растениях табака и томатов, принадлежащим как и картофель к семейству Пасленовые. На этом основании можно сделать предположение, что встроенный в геном картофеля ген дефензина также экспрессируется, чем и обусловливается повышенная устойчивость некоторых трансгенных линий к фитофторозу, альтернариозу и фузариозу.

Косвенным доказательством можно считать тог факт, что частота встречаемости в популяции трансгенных лилий с повышенной устойчивостью к фитофторозу листьев и клубней и к альтернариозу листьев выше, чем линий со сниженной и равной стандарту устойчивостью (табл. 8),

Таблица 8. Частоты встречаемости трансгенных линий с разной степенью устойчивостью к фитофторозу и альтернариозу

Частоты встречаемости трансгенов, %

Сорт и о £ ь £ о И- Я а* Б « я £ я « неустойчивости к фптофторозу по листьям по устойчивости к фитофторозу ПО клубням по устойчивости к альтернариозу

выше на ниже выше на ниже выше на ни

51 ■уровне 51 ,41 « уровне 51 й уропне 51 же 51

Лорк 5 80,0 0 20.0 20.0 40,0 40.0 100.0 0 0

Си нецвет 17 76,5 23,5 0 94,1 5,9 0 76,5 23,5 0

Жуковский ранний 14 35,7 64,3 0 100,0 0 0 35,8 57,] 7,1

11чышскш1 12 58,3 41,7 0 91,7 8,3 0 25,0 75,0 0

Голубизна 29 62,1 37,9 0 82,8 17,2 0 44,8 48,3 6,9

Раменский 3 33,3 66,7 0 33,3 66,7 0 66,7 33,3 0

Линий с устойчивостью существенно выше стандарта к фитофторозу по листьям, клубням и альтернарнозу в среднем было значительно больше, чем линий с устойчивостью на уровне и ниже стандарта.

5. Урожайность тра неге иных растений картофеля

У отобранных трансгенных линий с повышенной устойчивостью к патогенам оценивали урожайность в вегетационном и полевом опытах. В табл. 9 показана урожайность генетически модифицированных линий в сравнении со стандартом по НСР или критерию Фишера (Р^) в полевом опыте.

Таблица 9. Урожайность трансгенных линий картофеля, устойчивых к

комплексу болезней в полевом опыт« 2002-2003 гг., г/раст.

2002 (засушливый) 2003 (влажный)

Сорт Линия* урожайность откл. от Я, г/раст. ОТКЛ. ОТ % урожайность откл. ОТ г/раст. откл от м, %

! 2 3 4 5 6 7 1 8

Жуковский Ж 51 X X X 600 - -

ранний Г Ж25 X X X 950 350 53

Ж101 А х X 450 -150 -25

ЖП9 у к X 600 0 0

Г~Ж125 .4 х X НОО 800 133

Ж112 X X 750 !50 Г~ 25

Ж.! 2.6 X >: X 500 -100 -17

НСРоз 182

Ильинский И 51 У к V 500 - -

И104 У * * 440 -60 -12

г Ш15 X х к 700 200 40

И125 X X X 300 -200 -40

Н132 X X X 600 100 20

* НСР«; 176

Голубизна Г Л X X я 675 - -

гш У X X 500 -575 -26

поз X X X 720 45 7

ГЧ 34 >: * X 200 -475 -70

П2 X X X 1300 325 48

Г326 X Г- у 350 -325 -48

Ш X > * 600 -75 -11

ГП X X \ 700 25 4

ПЗ X * > 300 -375 -60

>; X /■ 400 -275 -41

НСР,,5 256

Рамснекий Ра X X к . 500 - -

Ра105 X X X 510 10 2

продолжение таблицы 9

1 2 1 J 4 5 6 7 8

Лорх Л к! 152 - 200 - -

Д2 148 -4 -3 240 40 20

Л8 180 2S IS 100 -300 -50

Л13 164 16 И 365 ¡65

Л14 50 -102 SO -120 -60

Hep«-1 42 HCPW 106

Синецвет Си si 102 - _. 375 - -

Си 19 10S 6 6 300 -75 -20

Cmj ) 100 -2 -2 400 25 7

Си59 76 -27 -26 120 -255 -65

См1.7 | 100 -г -2 300 -75 -20

С И 33 85 -17 -17 100 -75 -20

Си57 117 15 15 280 -95 -25

Си40 55 -47 -54 180 -195 -52

HCPrt5 26 HCPW 118

*жирным шрифтом обозначены линии с урожайностью выше стандарта; линии

с урожайностью на уровне стандарта - подчеркнуты.

По результатам полевого и вегетационного опытов и оценок устойчивости к грибным заболеваниям отобрали 2 линии copia Синецвет, 3 сорта Лорх, 3 сорта Голубизна, 1 линию сорта Жуковский ранний, 2 липни сорта Ильинский и 1 линию сорта Рамен ский. Все они имели комплексную устойчивость к грибным болезням, не отличались по морфологическим характеристикам от исходного сорта и, либо существенно не отклонялись по урожайности от стандарта, либо имели урожайность выше по сравнению с урожайностью нетрансгенной формой данного сорта.

4, M орфол отческие и физиологические особенности трапегеиных липни картофеля

Среди полученных регенерантов наблюдалось небольшое количество растений с нехарактерной морфологией (11%). Так у некоторых линии были замечены различия по форме листовой пластинки и частоте срастания листочков (у линий Л9, Ш24, Г39 и П19), Линии Си52, Си61, П40 отличались по форме клубня. У клубней трансгетгай линии 1Ш4 сорта Ильинский начиналось раньше прорастание на 3-5 недель по сравнению с исходной петрансгенной формой при одинаковых условиях хранения.

Возможно, это обусловлено гормональным дисбалансом, вызванным длительным пассированием in vitro и на стадии каллуса или сомаююнальнон вариабельностью, что характерно для культуры картофеля.

5. Комплексная оценка

Для выбора наиболее перспективных линий необходимо было учесть комплекс признаков, оцененных на протяжении исследований. С згой целью учитывали комплексную устойчивость к грибным болезням, урожайность и морфотиличность (табл. 10).

Таблица 10. Комплексная оценка трансгенных липни по устойчивости к

болезням и урожайности

Устойчивость к болезням (на основе оценок

методом искусственных заражений н визуальных наблюдений) Урожайность в

Сорт Лигам фитофторозу аль- ризокто- сух. парите вегета- ¡1 о ле-

ПО ЛИ- по тер на- ниоэт фуз. обык- цион- вом

СТЬЯМ клубням ркозу гнили новенной ном опыте опыте

I г 3 4 5 6 7 К 9 10

Дорх Л st С В Н У X И

Л2 в С В Ж К С 0 0

Л8 с С в X X с 0 0

Л13 it I) в X х в 0 +

ЛИ с с в X X с 0 -

Сине цвет Си st с С н с * X

Си19 в в в с X X +

Си 31 » в в с х X 0 0

СиЗЗ в в в с X X - -

Си 17 с в В с X X о 0

Си59 С л в с X X - -

Си 5 7 с с в с ж, X 0 0

| Си40 с в с с X 1 * 1 „

продолжение таблицы 10

1 г 3 4 5 6 7 8 9 10

Жуковский ранвий Ж si Ж25 ^ II с н с X X

С с в с X X - +

Ж101 С с в с X * - 0

Ж!39 Ж125 с в в с ж X 0

с с в с к X - -1

Ж112 с с с с X V - 0

Ж126 с с в с х - 0

Ильннский И si с с с У 'X X

HI 04 с с в X X X |> 0

И1!5 с в в X X X 0 +

И125 с в в X if X - -

1U32 с в в У X / с 0

Голубизна Г si с с н с к V

Г125 с в н с X X 0 0

Г109 с к Б с X X <> 0

Г134 с в с с У к - 0

Г!2 с в в с X X 0 0

Г126 с я в с X X -- 0

Г27 в в в с X к 0 0

пз в в в с X X 0 0

1-23 с в в с х X 0 -

04 с с в с X * 0 -

Гаме иски Г» Pa st "palOS с с с с И ( * d _ J

с в в с С i . | 0

1!о критериям высокой устойчивости к комплексу заболевании и урожайности не ниже стандарта в вегетационном и полевом опытах были отобраны самые перспективные трансгегшые линии картофеля, несущие ген rs редечного дефензинл: ЛЗЗ сорта Лорх, Си 19 и Си31 - Синецвет, Ж]39 сорта Жуковский ранний, Ш15 и И132 - Ильинский, П2, Г13 и Г27 - сорта Голубизна и Ра! 05 сорта Рамен скип.

6. Доказательство соответствия трансгениого и исходного генотипов с го мощью белковых маркеров

Для доказательства тождествен мости генотипов трансгенных линий и сортов-стандартов была проведена биохимическая идентификация образное, показавших наиболее высокое проявление комплекса признаков (устойчивость к болезням, мсрфотипичность, урожайность). ИЭФ-спсктры трунсгенных линий и исходных сортов-стандартов были идентичными.

Изменчивость, обусловленная сомаклопальным и, траисгенными или эпигенетическими эффектами и проявляющаяся фснотнпически в виде измененной устойчивости или продуктивности линий может не выявиться на ИЭФ-спектрах белков клубней в силу разрешающей способности метода. При интерпретации полученных результатов необходимо иметь в виду, с одной стороны, что в организме растений экспрессируется несколько тысяч генов и, следовательно, синтезируется столько же индивидуальных белков (Созинов, 1985), а самые совершенные методы разделения и обнаружения белков имеют разрешение по крайней мере на порядок ниже (0'Рапе1, 1975; Stegemarm, Ргапсквеп, Маско, 1973). С другой стороны, на анализ поступает обычно только часть белкового организма, например, легкорастворимые белки клубней, и поэтому можно судить о свойствах генотипа, сопряженных только с изучаемой группой белков (Мусип, !987). Поэтому тог факт, что встроенные гены не изменили общего белкового спектра запасных белков - ожидаемая ситуация. С другой стороны, тождественность спектров у линий со статистически достоверным различием в уровне устойчивости свидетельствует о том, что это клоповые варианты базового генотипа.

ВЫВОДЫ

1. Показана возможность трансгенного соргоулучшсния сортов картофеля по признакам устойчивости к фнтофторозу, альтернариозу, сухой фузариозиой гпилн, обыкновенной парше с помощью конструкции рК22 с

целевым геном дефеизина редьки м и маркерным пр/!1 посредством штаммов 1>ВА4404 и Ьв УЗ 8 50 Л^гоЬаМегшт Ште/аЫет и А4 А^гоЬааспит г/иго^епсз.

2. Получено 80 трансгенных лшгий: 17 сорта Синецвет, 5 сорта Лорх, 29 сорта Голубизна» 14 сорта Жуковский ранний, 12 сорта Ильинский и 3 трансгенные линии сорта Раменский. В соответствии с задачами по коррекции сортов все линии оценены на устойчивость к грибным болезням картофеля: фитофшрозу по листьям и по клубням, альтсрнариозу (линии всех сортов), ризоктониозу (линии сортов Синецвет, Жуковский ранний и Голубизна), к сухой фузарлозной гнили (линии сорта Раменский) и парше обыкновенной (линии сорта Лорх). Выявлены трансгенные линии со статистически достоверными положительными отклонениями по устойчивости от исходного сорта.

3. Оптимизирована методика трансформации: найдена оптимальная концентрация канамицнна дая селекции регенерантов, экспрессирующнх маркерный ген лрШ - 25 мг/л; установлено положительное влияние темноты на этапе преды нкубации экенлантов; подобрана оптиматыш экспозиция кокультивации эксплантов картофеля с агробактерией - 1 час; установлено, что воздействие на зкепланты низкой положительной температуры 4С'С существенно увеличивает выход регенератов до 82%; установлено влияние генотипа на интенсивность регенерации н выход регенерантов. Сорта Голубизна, Жуковский ранний, Ильинский обладают высоким ре генерационным потенциалом, сорт Раменский и Лорх - низким. Подобраны оптимальные концентрации регуляторов роста, обеспечивающие интенсивную регенерацию эксплантов картофеля при трансформации штаммом А4 А^гоЬааепит гЫт^епея - 0,1 мг/л ИУК, 3 мг/л БАГ1 и 10 мг/л ГК. Установлена зависимость между ярусами междоузлий, взятых в качестве эксплантов пробирочных растений и выходом регенерантов - экспланты верхних ярусов обладают наибольшей регенерационной способностью но сравнению с эксплантами среднего и нижнего ярусов междоузлий. Установлено влияние агробактериального штамма, несущего генетическую конструкцию с геном гя

на выход трансгенов. Наибольший выход трансгенов наблюдался при использовании штамма А4 Agrobacterium rhizogene.у - ]5,6 %. Эффективность трансформации при использовании оптимизированной методики составила 1,92,7% по сорту Лорх, 6,4-7,0% по сорту Синецвст, 0,9-П,В% по сорту Жуковский ранний, 2,1-9,5% по сорту Ильинский, 5,9- 15,6% по сорту Голубизна н 2,6 по сорту Раменский.

4. Выстроена система доказательств зрансгеннои природы регенерантов: селекция на канамицип-содержащих средах, 11ЦР па целевой rs-i ен, анализ частот встречаемости линий с различной степенью устойчивости к патогенам,

5. Оценены частоты встречаемости трансгенов с повышенной устойчивостью по всем исследуемым сортам для фитофтороза по листьям 3380%, фитофтороза но клубням 20-100%, альтер кариоза 25-100%. Максимальные отклонения по данным опенок искусственных заражений и визуальных наблюдений от исходного сорта но

- фитофторозу листьев у линии Л13 на 3,5 балла; Си19 и Си31 на 2,1 баллов, Ж139 на 2,9 балла, Ш32 на 2,2 балла; Г12 на 1,5 балла;

- фитофторозу клубней у линий Л13 на 1 балл; Си19 и СиЗЗ на 3 балла, Ж139 на 3,2 балла; И125 на 3,2 балла; П26 на 2,5 балла; Ра105 на 2,6 балла;

- альтернариозу у линий Л2 на 4,3 балла; СиЗЗ на 4,7 балла; Ж139 на 5,7 балла, И104 па 2,2 балла; ПЗ и Г23 на 4,4 балла; Ра 105 на 2,6 балла;

- сухой фузариозной гнили у линии Ра!05 на 2,2 балла - на основании результатов оценок с помощью искусственных заражений листьев и клубней;

- парше обыкновенной у линии Л13 на 4,5 балла но результатам визуальной оценке в поле,

6. Оненеиа урожайность трансгенных растений с повышенной устойчивостью к болезням в сравнении с исходным нетрансгениым сортом в вегетационном и полевых опытах. Отобраны линии с урожайностью на уровне или выше стандарта: Л13 (365 г/раст.), Си19 (300 г/раст,), СиЗ! (400 г/раст.),

Ж i 39 (600 г/раст.), И) 15 (700 г/раст.), И132 (600 г/раст.), Г12 (1300 г/раст.), ПЗ (700 г/раст.), Г27 (600 г/раст.) и Ра105 (510 г/раст.).

7. L1 результате анализа линий по комплексной устойчивости и урожайности выделено 10 трансгенных образцов для предложения авторам исходных сортов в качестве стартового материала на улучшенную сорюформу.

8. По фенотипичесиким характеристикам выявлено 11% отличных от стандартов трансгенных линий при сравнении трак с re иных линии с исходными нетрансгенными формами.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ

1. Для дальнейших испытаний как сортоулучшенные образцы рекомендуются трансгенные линии с повышенной комплексной устойчивостью к грибным заболеваниям и урожайностью не ниже стандарта: Л13 сорта Лорх, Си19 и Си31 сорта Сннецвег, Ж139 copra Жуковский ранний, 11115 и И132 сорта Ильинский, П2, Г13 и Г27 сорта Голубизна и Pal 05 сорта Раменский.

2. Для использования в скрещиваниях или в качестве родительской формы в селекционном процессе на целевую устойчивость к фитофторозу рекомендуются линии JI13, Си19, Си31, Си33,ж139, Ш25, И132, Г126 и Ра!05, на целевую устойчивость к альтеряариозу линии Л2, СиЗЗ, Ж139,1-1104, ГЗЗ, Г23 и Ра105; на целевую устойчивость к сухой фузариозной гнили линию Pal 05; на целевую устойчивость к обыкновенной парше картофеля линию Л13.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Крупенин Р,В. Использование селективных питательных сред и ЛЦР-метода на этапах получения трансгенных растений картофеля// Материалы 11 молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". - М., 2002. - С. 8-9.

2. Крупенин Р.В. Оценка трансгенных линий картофеля, несущих ген R.S-AFP2 на устойчивость к фитофторозу ботвы ia vivo// Материалы II

молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". - М.( 2002. - С. 4-5.

3. Круленин Р.В., Бирюкова В,А., Хромова Л.М. Создание трансгенных растений картофеля, устойчивых к фитофторозу, на основе гена фунгициднога пептида из семян редьки// Материалы Первой Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям. - Санкт-Петербург, 2002. - С. 159-160.

4. Крупеиии Р.В., Хромова Л.М. Испытания генно-модифицированных линий картофеля, устойчивых к фитопато генам// Материалы конференции "Актуальные проблемы генетики". - М.: МСХА, 2002, - Т. 2. - С. 152-153.

5. Круленин Р.В., Бирюкова В.А., Хромова Л.М Получение трансформ ированных растений картофеля с помощью штамма A4 Agrobacterium rlrizogeiies, несущего генетическую конструкцию фунгицидного пептида редьки (дефензинз)// Вопросы картофелеводства, - Науч. труды,- М: ВНИИКХ, Россельхозакадемия, 2002. - Вып. 64. -- С. 80-86.

6. Крупенин Р.В,, Бирюкова В А., Кукушкина Л.Н., Хромова Л.М, Использование гена антимикробного пептида редьки для повышения устойчивости картофеля к биотическим стрессам// Материалы 7-ой школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", - Пуши но, 2003, -C.I11.

7. Krupenin R.V., Kliromova L.M., Kukuslikina L,N. Studying of potato transgenic plants resistant to pathogens.'1/ Материалы международной научной конференции "Современное состояние проблем и достижений в области генетики и селекции". - Ал маты, Казахстан, 2003. - С, 103-104.

8. Крупенин Р.В., Бирюкова В.А., Кукушкина Л.Н., Хромова Л.М. Получение трансгенны.х растений картофеля, несущих ген антимикробного пептида редьки и их оценка на устойчивость к грибным болезням/ Материалы Международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 75-летию Института картофелеводства Нац. академии наук Беларуси, - Науч. труды. - Минск. 2003. - Ч. ]. - С. 293-299.

Лицензия ИД № 00808 от 20.01.2000 г.

Подписало в печать « 6 » р-'Срл^гЛ 200_^_г. Усл. пл.

Заказ № Тираж 100 экз.

Отпечатано на ризографе, ГНУ ВНИИКХ 140052 и. Коренбво ул. Лорха д. 23 Люберецкого района Московской области