Создание и оценка трансгенных растений картофеля устойчивых к грибным болезням

Крупенин, Роман Вячеславович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Создание и оценка трансгенных растений картофеля устойчивых к грибным болезням
ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Создание и оценка трансгенных растений картофеля устойчивых к грибным болезням"

На правах рукописи

КРУПЕНИН Роман Вячеславович

СОЗДАНИЕ И ОЦЕНКА ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ ПО УСТОЙЧИВОСТИ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ

Специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук -

Москва-2004

Работа выполнена в 2000-2003 гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте картофельного хозяйства им. А. Г. Лорха

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Хромова Л.М.

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Фирсов И. П. кандидат сельскохозяйственных наук Петухов С.Н.

Ведущая организация:

Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии

Зашита диссертации состоится и_"_2004 г. в 1300 час. на

заседании диссертационного совета К.006.017.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте картофельного хозяйства им. A.Г. Лорха РАСХН по адресу: 140052, Московская обл., Люберецкий р-н, пос. Коренево, д. 23.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИКХ. Автореферат разослан "_"_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Создание растений, устойчивых к болезням является непростой задачей для генетиков и селекционеров из-за участия многих генов во взаимодействии растение-патоген. В настоящее время в селекционный процесс в той или иной степени вовлечены многие дикорастущие виды картофеля, служащие донорами генов устойчивости (Камераз и др., 1973). Однако, одним из главных недостатков традиционной селекции сортов на устойчивость является часто встречающееся при половой гибридизации сцепление с данным локусом резистентности нежелательных генов, снижающих хозяйственную ценность селекционного материала.

В настоящее время методы генной инженерии становятся рабочими инструментами в селекции, поскольку они позволяют вводить определенный ген в растение конкретного генотипа, что значительно повышает качество и эффективность селекционной работы. Применительно к картофелю, который размножают вегетативно, и где обычная селекция подразумевает скрещивание между двумя гетерозиготными тетраплоидными формами, применение направленных, точных методов молекулярной селекции особенно актуально (Mckay, 1996).

Относительно недавно в семенах и вегетативных органах различных растений были обнаружены гены, способные экспрессировать пептидные антибиотики - дефензины - короткие белки широкого фунгицидного действия (Broekaert et а1., 1995). Одними из самых сильнодействующих являются дефензины из семян редьки (Парашина и др., 1999).

К настоящему времени получены трансгенные растения томата, табака, капусты, моркови и других культур, несущих ген защитного пептида редьки. Они отличаются повышенной устойчивостью к грибным заболеваниям. Поэтому использование гена растительного дефензина для создания устойчивых к патогенам растений картофеля является новой, привлекательной областью приложения метода генной инженерии, имеющей как большое

научное, так и пракгическое значение. ГТЗТНАЦИ^Н^

| у"'

Цель и задачи исследований. В связи с вышеизложенным в настоящей работе была поставлена цель получить трансгенные растения картофеля на основе гена гх дефензина из семян редьки (Варкапт шНут), оценить их по устойчивости к грибным патогенам и выделить линии, превосходящие исходный сорт по резистентности к болезням.

Исходя из этого предстояло решить следующие задачи:

- оптимизировать методику трансформации для используемых в работе сортов картофеля;

- получить растения-регенеранты, несущие ген гх и доказать их трансгенность;

- провести раннее тестирование признаков резистентности к микозам в трансгенных растениях на основе т ^го-тестов и искусственных заражений клубней и взрослых растений;

- провести оценку урожайности трансгенных линий с повышенной устойчивостью к болезням в сравнении с исходным нетрансгенным сортом.

Научная новизна Оптимизирована базовая методика трансформации для сортов, использованных в работе. Получены трансгенные линии картофеля, проявляющие повышенную устойчивость к фитофторозу, альтернариозу, сухой фузариозной гнили и парше обыкновенной

Практическая ценность работы Полученные в работе результаты и разработанные методики могут быть использованы при создании трансгенных линий картофеля и их оценке на устойчивость к различным заболеваниям. По 6 перспективным сортам картофеля получено 10 трансгенных линий с комплексной устойчивостью к грибным патогенам. Трансгенные линии предложены авторам сортов как стартовый материал для всесторонней селекционной проработки в качестве улучшенной сортоформы.

Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям (Санкт-Петербург, 2-5 июля 2002 г.), на второй научной конференции "Актуальные проблемы генетики", посвященной 115-летию со дня рождения Николая Ивановича Вавилова (Москва, 21-22 февраля 2003 г.), на конференции "Современное состояние проблем и достижений в области генетики и селекции", (Алматы, 26-27 марта 2003 г.), на 7-й Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 21-27 апреля 2003 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных

работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 18 рисунков и 32 таблицы, библиография включает 206 наименований работ из них 102 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследований. В экспериментах были использованы перспективные сорта картофеля селекции ВНИИКХ, имеющие низкую или среднюю устойчивость к некоторым грибным болезням: Лорх (неустойчив к раку и парше обыкновенной), Синецвет (неустойчив к фитофторозу и альтернариозу), Жуковский ранний и Ильинский (неустойчивы к фитофторозу), Голубизна (среднеустойчив к фитофторозу), Раменский (неустойчив к сухой фузариозной гнили). Растения выращивали in vitro на модифицированной среде Мурасиге и Скуга (Поддержание и хранение коллекционных образцов картофеля в условиях in vitro, 1987) при 16-часовом фотопериоде и освещенности 4000-6000 люкс.

Векторная конструкция и агробактериальные штаммы. В работе использовали обезоруженные штаммы LBA4404 и LGV3850 Agrobacienum

tumefaciens и штамм A4 Agrobacterium rhizogenes. Эти штаммы несли векторную плазмиду pK22rs с геном пептидного антибиотика (дефензина) редьки rs, и маркерным геном устойчивости к антибиотику канамицину nptll (Шаденков и др., 1996). Использованная в работе генетическая конструкция защищена патентом на изобретение №2176669. Все агробактериальные штаммы были предоставлены лабораторией генной инженерии растений ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии в рамках договора о сотрудничестве. Агробактерии культивировали на среде LB (Маниатис и др., 1984).

Штаммы фитопатогенов. В качестве возбудителя фитофтороза использовали расы 1.2.3.4 и 1.2.3.4.5.6+0.7.8.10. ll.xyz гриба Phytophthora infestans, выделенные из состава местной популяции и отобранные с помощью сортов-дифференциаторов. Для работы по оценке устойчивости к ризоктониозу использовали штаммы R-4, R-7 и R-9 Rhizoclonia solani, выделенные из склероциев и пораженных ростков. Для оценки материала на устойчивость к раку картофеля использовали Далемский патотип (патотип I) гриба Synchytnum endobioticum. Коллекция вышеперечисленных патогенов хранится и поддерживается во ВНИИКХ. Для оценки материала на устойчивость к ранней сухой пятнистости картофеля (альтернариозу) использовали штамм гриба Allernaria solani. В качестве возбудителя сухой фузариозной гнили использовали вид Fusarium culmorum. Эти культуры были получены из ВНИИСБ. Все патогены культивировались на картофельно-сахарозном агаре, за исключением Phytophthora infestans — на овсяном агаре и Synchytnum endobioticum - в виде инфекционного порошка, полученного из раковых наростов.

Получение трансгенных растений. Трансформировали растения по методике ВНИИКХ (Методические указания по получению трансформированных растений картофеля, 1995).

Молекулярно-биологические анализы. Выделение ДНК из растений, устойчивых к канамицину, проводили по методике (Edwards et al., 1991). Включение в растительный геном целевого гена rs определяли методом ПЦР

(Современные метода биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии, 1998).

Оценка устойчивости растений к болезням. Оценку на устойчивость к фитофторозу по листьям с помощью искусственных заражений m vitro проводили, пользуясь экспресс-методом (Кукушкина, Юрьева, Кукушкин, 1994). Оценку на устойчивость к фитофторозу по листьям in vivo и по клубням с помощью искусственных заражений проводили по методикам ВНИИКХ (Методические указания по оценке селекционного материала картофеля на устойчивость к фитофторозу, ризоктониозу, бактериальным болезням и механическим повреждениям, 1980). Устойчивость растений к альтернариозу in vitro оценивали по методике (Дмитриева, 1988). Для определения степени устойчивости селекционного материала к альтернариозу с применением искусственного заражения листьев взрослых растений использовали методику (Broggio, Ranucci 1990). Для оценки растений in vitro на устойчивость к ризоктониозу использовали методику (Захарова, 1979). Для оценки трансгенных растений на ракоустойчивость использовали методику, разработанную Л.П. Салтыковой и В.П. Тарасовой (1982). Оценку на устойчивость к сухой гнили проводили по методике Н.А. Дорожкина и В.Т. Михальчика (1979). Оценку на устойчивость к парше обыкновенной проводили визуально на естественном фоне (Анисимов, 2000). Оценки проводили в лаборатории клеточной и генной инженерии и лаборатории иммунитета ВНИИКХ. Все оценки проводили по 9-балльной шкале устойчивости СЭВ (низкая - 1-3 балла, средняя 4-6 балла, 7-9 баллов).

Вегетационный и полевой опыты. В вегетационном опыте растения высаживали в теплице в пятикратной повторности в стеллажи заполненные торфом на глубину 30 см. Полевой опыт проводили на супесчаной дерново-подзолистой почве в пятикратной повторности на сертифицированном полигоне для трансгенных растений ВНИИКХ в пос. Алариха Люберецкого р-на Московской области. В опытах оценивали урожайность, сравнивали

морфологические характеристики трансгенных линий с исходными сортами-стандартами.

Биохимическая идентификация генотипов картофеля. Для доказательства тождественности базисных генотипов трансгенных линий и сортов-стандартов проводили идентификацию образцов, показавших наиболее высокое проявление комплекса признаков (высокая устойчивость к болезням, морфотипичность, продуктивность не ниже стандарта). Анализ белков проводили методом изоэлектрофокусировки в полиакриламидном геле (Методы оценки оздоровленных сортов и меристемных линий в элитном семеноводстве картофеля, 1991). Анализы проводили в лаборатории молекулярной и гаметной селекции ВНИИКХ.

Статистическая обработка данных. Результаты исследований статистически обработаны- по методике (Доспехов, 1979) и с помощью компьютерной программы Microsoft EXCEL.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оптимизация методики трансформации

Для проведения успешной селекции трансформированных растений .на канамициновых средах необходимо было установить концентрацию этого антибиотика.. Для этого было взято по 10 стеблевых эксплантов каждого сорта и оценена их чувствительность на питательных средах для регенерации с различными концентрациями канамицина: 15 мг/л, 25 мг/л, 50 мг/л, 75 мг/мл и контроль без антибитотика.

При уровне канамицина 0-15 мг/л регенерация побегов происходила интенсивно. При высоком содержании антибиотика (50-75 мг/л), он не эффективен, поскольку такие концентрации приводят к некрозу эксплантов. При концентрации канамицина 25 мг/л регенерации не происходит, но эксплант остается жизнеспособным, В такой концентрации канамицин можно успешно использовать в качестве селективного фактора. При более высоком содержании

антибиотика, он также не эффективен. Видимо, это обусловлено либо толерантностью, либо гиперчувствительностью, приводящей к некрозу и нитевидности регенерантов.

При проведении предынкубации на свету наблюдали замедленную регенерацию эксплантов в то время как предынкубация в темноте дала лучший результат. Помимо этого, длительная кокультивация агробактерии с эксплантами не давала положительного эффекта: ткани стеблевых фрагментов некротизировались, среда зарастала агробактерией. Проведение предынкубации в темноте способствовало усилению регенерации, что можно объяснить физиологическими процессами, идущими в темноте и способствующими регенерации.

Существенному улучшению процесса регенерации эксплантов способствует стресс (Попадьин, 2002; Кучеренко, 1991). При стрессовой обработке пониженными температурами учитывали влияние различной экспозиции кокультивации агробактерии с эксплантами картофеля исходных генотипов (табл. 1).

Кокультивировали в темноте при 25 °С. Проведение предынкубации при 4°С было более эффективным. Объяснения между процессом регенерации и условиями проведения этапа предынкубации могут быть следущие: пониженные температуры синхронизируют клеточные циклы процессов деления и большее число клеточных мишеней для агробактерии оказываются одновременно в оптимальной стадии клеточного цикла.

Возможно, это также связано с физиолого-биохимическими процессами, происходящими по-разному в зависимости от температурного режима. Исходя из литературных данных, можно предположить, что наблюдаемый положительный эффект обусловлен торможением клеточного цикла под действием стресса посредством митоген-активируемых киназ и запуском комплекса генов, детерминирующих комплексную дифференциацию.

Таблица 1. Влияние предынкубационной температуры и времени

кокультивации на эффективность регенерации эксплантов картофеля разных генотипов при трансформации различными штаммами Agrobacterium

Ште/аает

Условия температуры во время предынкубации и

Сорт Штамм экспозиция кокультивации, час

4...6°С 23...25°С

1 5 24 ] 5 24

Синецвст 1>ВА4404 34±1,4* 21±1,0 8±1,4 15±0,7 6±0,5 0

1ЛлУ3850 40±3,9 19±2,1 10±1,9 8±0,5 6±0,7 0

Лорх ЬВА4404 26±2,3 18±1,6 0 7±0,7 0 0

1Х5У3850 36±8,0 26±1,1 0 5±0,8 1±0,5 0

Жуковский ЬВА4404 48±1,2 18±1,6 0 10±1,9 5±1,2 0

ранний 1Х}У3850 44±5,0 14±3,2 0 13±1,2 3±0,9 0

Ильинский ЦВА4404 35±1,3 19±2Д 1±0,9 18±2,0 8±6 0

ЬСУ3850 42±1,4 28±1,0 3±0,6 16±0,7 8±0,3 0

Голубизна ЬВА4404 78±8,0 54±5,0 6±2,0 48±1,1 14±2,7 0

ЬСУ3850 82±5,0 55+8,0 10±3,3 24±1,8 12±2,4 2±0,5

Раменский ЬВА4404 10±0 2±5,0 0 2±0,8 0 0

1Х}У3850 12*2,4 4±2,5 0 0 0 0

♦указан выход регенерантов, отложены ошибки средних, %

Также необходимо отметить, что выход регенерантов заметно отличается по генотипам. Сорта Голубизна, Жуковский ранний, Ильинский хорошо регенерировали, у них наблюдался наибольший выход регенерантов из эксплантов. Такие генотипы, как Раменский очень плохо поддаются трансформации, что обусловливается их слабой способностью к регенерации

С целью оптимизации методики трансформации с использованием Agrobaclerium rhiz,ogenes были исследованы несколько составов питательных сред с различными сочетаниями фитогормонов и концентрацией Кт 25 мг/л.

Подобранные концентрации фитогормонов БАЛ (3,0 мг/л), (ИУК ОД мг/л) и (ПС 10 мг/л) оказались наиболее благоприятными для регенерации и обеспечили наибольший выход регенерантов. В дальнейшем такие концентрации можно использовать при трансформации картофеля с помощью штамма А4 Agrob aclerium rhizogenes.

Стеблевые экспланты, взятые из междоузлий верхнего яруса регенерировали лучше по сравнению с эксплантами среднего и нижнего ярусов (табл. 2).

Таблица 2. Зависимость регенерации от яруса междоузлия, взятого в качестве экспланта при трансформации штаммом A4 Agrobacterium rhizogenes

Сорт Ярус Раменский Жуковский ранний Ильинский Голубизна

Верхний 24±0,9* 76±0,6 68±1,0 84±7,0

Средний 16±0,7 41±1,3 32±1,5 ., 58±3,0

Нижний 0 7±0,3 9±0,3 2Ш,0

♦указан выход регенерантов, отложены ошибки средних, %

Следует сделать вывод, что целесообразнее использовать экспланты из междоузлий верхнего и среднего яруса, поскольку клетки этих тканей, по-видимому, обладают большей регенерационной способностью. С другой стороны это может объясняться содержанием в верхушечной части эндогенных цитокининов, влияющих на регенерационные процессы.

2. Оценка трансгенности трансформированных растений картофеля

Укоренившиеся на среде с канамицином (25 мг/л) регенеранты были размножены и проверены на содержание гена к в растительном геноме методом ПЦР.

Методом ПЦР наличие гена к было обнаружено в 80-ти регенерантов 6-ти сортов и вычислена частота трансгеноза по каждому генотипу (табл. 3).

Таблица 3. Эффективность трансформации картофеля сортов картофеля

в зависимости от штамма агробактерии

Сорт Штамм Кол-во эксллан-тов Регенераты Кт-устой-чивые Трансгенные (ПЦР+), шт. Трансформация, (ПЦР+) % тра„сгеиыхХШй жспланты

шт. %

Лорх LBA4404 112 11 27,5 3 2,7

LGV3850 108 9 27,3 2 1,9

A4 - — — — -

Синецвет LBA4404 128 20 28,2 9 7,0

LGV3850 125 14 20,0 8 6,4

A4 - — - -

Жуковский ранний LBA4404 105 15 14,3 1 0,9

LGV3850 100 15 15,0 1 1,0

A4 101 54 53,5 12 11,8

Ильинский LBA4404 48 12 25,0 1 2,1

LGV3850 56 12 21,4 2 3,6

A4 95 34 35,8 9 9,5

Голубизна LBA4404 98 14 14,3 9 9,2

LGV3850 102 14 13,7 6 5,9

A4 90 40 44,4 14 15,6

Раменский LBA4404 50 4 8,0 0 0

LGV3850 50 6 12,0 0 0

A4 115 16 13,9 3 2,6

Трансгенных растений значительно меньше, нежели трансформантов,

устойчивых к канамицину. Предположительно это может объясняться следующим. Во-первых, регенерация побегов на экспланте может проходить из клеток каллуса, находящихся в разных точках. Поскольку канамицин в тканях распределяется по градиенту, то его концентрация может быть различной. Во-вторых, каллус представляет собой неорганизованную пролиферирующую ткань, состоящую из дедифферинцированных клеток (Шевелуха и др., 1998), что может привести к возникновению устойчивых к канамицину клеток в силу эпигеномной изменчивости и хромосомным абберациям, обусловливающих генетическое разнообразие каллусных клеток. В-третьих возможен разрыв

связи целевого гена ге и маркерного прШ, что могло обусловить встраивание генов независимо друг от друга.

3. Оценка устойчивости трансгенных линий к грибным болезням

80 трансгенных линий 6 сортов оценивали по устойчивости к грибным болезням в соответствии с задачами по коррекции каждого сорта. В табл. 4—7 приведены результаты оценок некоторых трансгенных линий картофеля, показавших полярные результаты по устойчивости в сравнении со стандартом. Приняты сокращения для линий: Ж - Жуковский ранний, И - Ильинский, Г -Голубизна, Ра - Раменский, Л - Лорх и Си - Синецвет. Жирным шрифтом выделены линии, существенно превышающие стандарт по устойчивости. Таблица 4. Характеристика устойчивости трансгенных линий сорта Жуковский

ранний к фитофторозу

По листьям По клубням

Ш У11ГО визуал.

Линия 2002 2003 1П VIУО ср. откл. отй оценка 2003 2002 откл. от б!

Жй 4,2 3,6 3,7 3,8 - 1-3 4,2 -

Ж 139 7,0 7,2 6,0 6,7 2,9 5-7 7,4 3,2

Ж 101 5,5 5,7 6,1 5,8 2,0 5 5,4 1,2

Ж 25 6,8 6,5 6,5 6,6 2,8 3-5 5,8 1,6

Ж111 4,5 4,5 4,0 4,3 0,5 3 6,5 2,3

Ж 107 4,3 4,2 4,8 4,4 0,6 3 5,0 0,8

НСР05=1,6 НСРо5=0,8

Таблица 5. Характеристика устойчивости трансгенных линий сорта Синецвет к

альтернариозу

Линия ¡п у|4го in vivo ср. откл. OTSt визуал. оценка в поле, в год эпифитотии 2002

2001 2002 2001 2002

Си st 3,0 3,2 3,5 3,4 3,3 - 5

Си 57 6,9 7,1 6,8 6,6 6,9 3,6 9

Си 31 7,1 6,7 7,2 7,0 6,8 3,5 7

Си 59 7,3 6,7 7,0 7,1 7,0 3,7 7

Си 40 6,8 6,2 6,0 6,5 6,4 ЗД 7

Си 33 8,3 7,6 8,2 8,0 8,0 4,7 9

Си 17 7,7 7,2 6,8 6,8 7,1 3,8 7

Си 19 7,0 7,0 6,8 7,3 7,0 3,7 9

Си 78 3,4 3,0 4,0 3,8 3,6 0,3 5

Си 14 з,з 3,2 4,0 3,8 3,6 0,3 5

НСРо5=0,8

Таблица 6. Характеристика устойчивости трансгенных линий сорта Раменский к сухой фузариозной гнили (искусств, заражения)

Таблица 7. Характеристика устойчивости трансгенных линий сорта Лорх к парше обыкновенной (визуальная оценка)

Линия ср. откл. от st

Past 5,8 -

Ра 101 5,6 -0,2

Ра 103 5,4 -0,4

Ра 105 8,0 2,2

НСР05=0,8

Линия 2002 2003 ср. откл. от st

Л st 2 6 4?0 -

Л 9 3 5 4,0 0

Л 8 5 7 6,0 2,0

Л 13 8 9 8,5 4,5

НСРо5=2,3

Нельзя однозначно утверждать о зависимости между фактом трансгенности и повышением устойчивости трансгенных линий к болезням, поскольку не проведены прямые эксперименты по доказательству экспрессии встроенного гена методом Вестерн-блоттинга К тому же, картофель является культурой, характеризующейся высокой сомаклональной вариабельностью по хозяйственно ценным признакам, в том числе и по резистентности к болезням, что могло быть причиной повышенной устойчивости к фитофторозу трансгенных линий. Имеются данные (Парашина, 1999, Сердобинский, 2002), что ген гъ успешно экспрессируется в растениях табака и томатов, принадлежащим как и картофель к семейству Пасленовые. На этом основании можно сделать предположение, что встроенный в геном картофеля ген дефензина также экспрессируется, чем и обусловливается повышенная устойчивость некоторых трансгенных линий к фитофторозу, альтернариозу и фузариозу.

Косвенным доказательством можно считать тот факт, что частота встречаемости в популяции трансгенных линий с повышенной устойчивостью к фитофторозу листьев и клубней и к альтернариозу листьев выше, чем линий со сниженной и равной стандарту устойчивостью (табл. 8).

Таблица 8. Частоты встречаемости трансгенных линий с разной степенью устойчивостью к фитофторозу и альтернариозу

Частоты встречаемости трансгенов, %

Сорт £ В £ о £ о X ю в'? по устойчивости к фитофторозу по листьям по устойчивости к фитофторозу по клубням по устойчивости к алкгернариозу

11 выше на ниже выше на ниже выше на ни

у уровне й уровне 81 & й уровне же

Лорх 5 80,0 0 20.0 20.0 40,0 40,0 100,0 0 0

Синецвет 17 76,5 23,5 0 94,1 5,9 0 76,5 23,5 0

Жуковский ранний 14 35,7 64,3 0 100,0 0 0 35,8 57,1 7,1

Ильинский 12 58,3 41,7 0 91,7 8,3 0 25,0 75,0 0

Голубизна 29 62,1 37,9 0 82,8 17,2 0 44,8 48,3 6,9

Раменский 3 33,3 66,7 0 33,3 66,7 0 66,7 33,3 0

Линий с устойчивостью существенно выше стандарта к фитофторозу по листьям, клубням и альтернариозу в среднем было значительно больше, чем линий с устойчивостью на уровне и ниже стандарта.

5. Урожайность трансгенных растений картофеля У отобранных трансгенных линий с повышенной устойчивостью к патогенам оценивали урожайность в вегетационном и полевом опытах. В табл. 9 показана урожайность генетически модифицированных линий в сравнении со стандартом по НСР или критерию Фишера (Б05) в полевом опыте.

Таблица 9. Урожайность трансгенных линий картофеля, устойчивых к

комплексу болезней в полевом опыте 2002-2003 гг., г/раст.

Сорт Линия* 2002 (засушливый) 2003 (влажный)

урожайность откл. от вг, г/раст. откл. отв^ % урожайность откл. от г/раст. откл. от

1 2 3 4 5 6 7 8

Жуковский ранний ЖБ1 X X X 600 - -

Ж25 X X X 950 350 58

Ж101 X X X 450 -150 -25

Ж139 X X X 600 0 0

Ж125 X X X 1400 800 133

Ж112 X X X 750 150 25

Ж126 X X X 500 -100 -17

НСР03 182

Ильинский Ий X X X 500 - -

И104 X X X 440 -60 -12

И115 X X X 700 200 40

И125 X X X 300 -200 -40

И132 X X X 600 100 20

* НСРщ 176

Голубизна Гй X X X 675 - -

Г125 X X X 500 -175 -26

Г109 X X X 720 45 7

Г134 X X X 200 -475 -70

Г12 X X X 1300 325 48

Г] 26 X X X 350 -325 -48

Г27 X X X 600 -75 -11

ПЗ X X X 700 25 4

Г23 X X X 300 -375 -60

Г24 X X X 400 -275 -41

НСР05 256

Раменский Ра X X X . 500 - -

Ра105 X X X 510 10 2

Р05=0,1 Ртабл =5,3 ГС5< Рта6л

продолжение таблицы 9

1 2 3 4 5 6 7 8

Лорх 152 - - 200 - -

Л2 148 -4 -3 240 40 20

Л8 180 28 18 100 -100 -50

Ш 164 16 И 365 165 83

Л]4 50 -102 80 -120 -60

НСР05 42 НСР05 106

Синецвет Сив! 102 - - 375 - -

Си19 108 6 6 300 -75 -20

СиЗ]. 100 -2 -2 400 25 7

Си59 76 -27 -26 120 -255 -68

Си17 100 -2 -2 300 -75 -20

СиЗЗ 85 -17 -17 300 -75 -20

Си57 117 15 15 280 -95 -25

Си40 55 -47 -54 180 -195 -52

НСРоз 26 НСР05 118

♦жирным шрифтом обозначены линии с урожайностью выше стандарта; линии

с урожайностью на уровне стандарта - подчеркнуты.

По результатам полевого и вегетационного опытов и оценок устойчивости к грибным заболеваниям отобрали 2 линии сорта Синецвет, 3 сорта Лорх, 3 сорта Голубизна, 1 линию сорта Жуковский ранний, 2 линии сорта Ильинский и 1 линию сорта Раменский. Все они имели комплексную устойчивость к грибным болезням, не отличались по морфологическим характеристикам от исходного сорта и, либо существенно не отклонялись по урожайности от стандарта, либо имели урожайность выше по сравнению с урожайностью нетрансгенной формой данного сорта.

4. Морфологические и физиологические особенности трансгенных линий картофеля

Среди полученных регенерантов наблюдалось небольшое количество растений с нехарактерной морфологией (11%). Так у некоторых линий были замечены различия по форме листовой пластинки и частоте срастания листочков (у линий Л9, И124, Г39 и Г119). Линии Си52, Си61, Г140 отличались по форме клубня. У клубней трансгенной линии И124 сорта Ильинский начиналось раньше прорастание на 3-5 недель по сравнению с исходной нетрансгенной формой при одинаковых условиях хранения.

Возможно, это обусловлено гормональным дисбалансом, вызванным длительным пассированием in vitro и на стадии каллуса или сомаклональной вариабельностью, что характерно для культуры картофеля.

5. Комплексная оценка

Для выбора наиболее перспективных линий необходимо было учесть комплекс признаков, оцененных на протяжении исследований. С этой целью учитывали комплексную устойчивость к грибным болезням, урожайность и морфотипичность (табл. 10).

Таблица 10. Комплексная оценка трансгенных линий по устойчивости к

болезням и урожайности

Сорт Линия Устойчивость к болезням (на основе оценок методом искусственных заражений и визуальных наблюдений) Урожайность в

фитофторозу аль-терна-риозу ризокто-ниозу сух. фуз. гнили парше обыкновенной вегетационном опыте полевом опыте

по листьям по клубням

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Лорх Л st С В Н X X Н

Л2 В с В X X С 0 0

Л8 с с в X X С 0 0

Л13 в в в X X в 0 +

Л14 с с в X X с 0 -

Синецвет Си st с с н с X X

Си19 в в в с X X + 0

Си31 в в в с X X 0 0

СиЗЗ в в в с X X - -

Си17 с в в с X X 0 0

Си59 с в в с X X - -

Си57 с с в с X X 0 0

Си40 с в с с X X - -

продолжение таблицы 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Жуковский JfCst II с н с X X

ранний Ж25 С с в с X X - +

Ж101 С с в с X X - 0

Ж139 с в в с X X 0 0

Ж125 с с в с X X - +

Ж112 с с с с X X - 0

Ж] 26 с с в с X X - 0

Ильинский И st с с с X X X

И104 с с в X X X 0 0

И115 с в в X X X 0 +

И125 с в в X X А - -

И132 с в в X X X 0 0

Голубизна Г st с с н с X X

Г125 с в н с X X 0 0

Г109 с в н с X X 0 0

Г1 34 с в с с X X - 0

Г12 с в в с X X 0 0

Г126 с в в с X X - 0

Г27 в в в с X X 0 0

Г13 в в в с X X 0 0

Г23 с в в с X X 0 -

Г24 с с в с X X 0 -

Раменский Past с с с с н X

Pal 05 с в в с с X 0 0

По критериям высокой устойчивости к комплексу заболеваний и урожайности не ниже стандарта в вегетационном и полевом опытах были отобраны самые перспективные трансгенные линии картофеля, несущие ген rs редечного дефензина: Л13 сорта Лорх, Си19 и Си31 - Синецвет, Ж139 сорта Жуковский ранний, И115 и И132 - Ильинский, Г12, Г13 и Г27 - сорта Голубизна и Pal 05 сорта Раменский.

6. Доказательство соответствия трансгенного и исходного генотипов с помощью белковых маркеров

Для доказательства тождественности генотипов трансгенных линий и сортов-стандартов была проведена биохимическая идентификация образцов, показавших наиболее высокое проявление комплекса признаков (устойчивость к болезням, морфотипичность, урожайность). ИЭФ-спектры трансгенных линий и исходных сортов-стандартов были идентичными.

Изменчивость, обусловленная сомаклональными, трансгенными или эпигенетическими эффектами и проявляющаяся фенотипически в виде измененной устойчивости или продуктивности линий может не выявиться на ИЭФ-спектрах белков клубней в силу разрешающей способности метода. При интерпретации полученных результатов необходимо иметь в виду, с одной стороны, что в организме растений экспрессируется несколько тысяч генов и, следовательно, синтезируется столько же индивидуальных белков (Созинов, 1985), а самые совершенные методы разделения и обнаружения белков имеют разрешение по крайней мере на порядок ниже (ОТагге1, 1975; Stegemann, Ргапскзеп, Маско, 1973). С другой стороны, на анализ поступает обычно только часть белкового организма, например, легкорастворимые белки клубней, и поэтому можно судить о свойствах генотипа, сопряженных только с изучаемой группой белков (Мусин, 1987). Поэтому тот факт, что встроенные гены не изменили общего белкового спектра запасных белков - ожидаемая ситуация. С другой стороны, тождественность спектров у линий со статистически достоверным различием в уровне устойчивости свидетельствует о том, что это клоновые варианты базового генотипа.

ВЫВОДЫ

целевым геном дефензина редьки га и маркерным прШ посредством штаммов LBA4404 и LGV3850А§гоЪас1вг1ыт Шшв/аавт и А4 А£гоЪа&егшт rhizogenes.

2. Получено 80 трансгенных линий: 17 сорта Синецвет, 5 сорта Лорх, 29 сорта Голубизна, 14 сорта Жуковский ранний, 12 сорта Ильинский и 3 трансгенные линии сорта Раменский. В соответствии с задачами по коррекции сортов все линии оценены на устойчивость к грибным болезням картофеля: фитофторозу по листьям и по клубням, альтернариозу (линии всех сортов), ризоктониозу (линии сортов Синецвет, Жуковский ранний и Голубизна), к сухой фузариозной гнили (линии сорта Раменский) и парше обыкновенной (линии сорта Лорх). Выявлены трансгенные линии со статистически достоверными полоясительными отклонениями по устойчивости от исходного сорта.

3. Оптимизирована методика трансформации: найдена оптимальная концентрация канамицина для селекции регенератов, экспрессирующих маркерный ген - 25 мг/л; установлено положительное влияние темноты на этапе предынкубации эксплантов; подобрана оптимальная экспозиция кокультивации эксплантов картофеля с агробактерией - 1 час; установлено, что воздействие на экспланты низкой положительной температуры 4°С существенно увеличивает выход регенерантов до 82%; установлено влияние генотипа на итенсивность регенерации и выход регенерантов. Сорта Голубизна, Жуковский ранний, Ильинский обладают высоким регенерационным потенциалом, сорт Раменский и Лорх — низким. Подобраны оптимальные концентрации регуляторов роста, обеспечивающие интенсивную регенерацию эксплантов картофеля при трансформации штаммом А4 AgroЪacterium rhizogenes - 0,1 мг/л ИУК, 3 мг/л БАП и 10 мг/л ГК. Установлена зависимость между ярусами междоузлий, взятых в качестве эксплантов пробирочных растений и выходом регенерантов - экспланты верхних ярусов обладают наибольшей регенерационной способностью по сравнению с эксплантами среднего и нижнего ярусов междоузлий. Установлено влияние агробактериального штамма, несущего генетическую конструкцию с геном га

на выход трансгенов. Наибольший выход трансгенов наблюдался при использовании штамма А4 Agrobactermm rhizogenes - 15,6 %. Эффективность трансформации при использовании оптимизированной методики составила 1,92,7% по сорту Лорх, 6,4-7,0% по сорту Синецвет, 0,9-11,8% по сорту Жуковский ранний, 2,1-9,5% по сорту Ильинский, 5,9-15,6% по сорту Голубизна и 2,6 по сорту Раменский.

4. Выстроена система доказательств трансгенной природы регенерантов: селекция на каиамицин-содержащих средах, ПЦР на целевой rs-ген, анализ частот встречаемости линий с различной степенью устойчивости к патогенам.

5. Оценены частоты встречаемости трансгенов с повышенной устойчивостью по всем исследуемым сортам для фитофтороза по листьям 3380%, фитофтороза по клубням 20-100%, альтернариоза 25-100%. Максимальные отклонения по данным оценок искусственных заражений и визуальных наблюдений от исходного сорта по

- фитофторозу листьев у линий Л13 на 3,5 балла; Си19 и Си31 на 2,1 баллов; Ж139 на 2,9 балла; И132 на 2,2 балла; Г12 на 1,5 балла;

- фитофторозу клубней у линий Л13 на 1 балл; Си 19 и СиЗЗ на 3 балла; Ж139 на 3,2 балла; И125 на 3,2 балла; Г126 па 2,5 балла; Pal 05 на 2,6 балла;

- альтернариозу у линий Л2 на 4,3 балла; СиЗЗ на 4,7 балла; Ж139 на 5,7 балла; И104 на 2,2 балла; ПЗ и Г23 на 4,4 балла; Pal05 на 2,6 балла;

- сухой фузариозной гнили у линии Pal 05 на 2,2 балла - на основании результатов оценок с помощью искусственных заражений листьев и клубней;

- парше обыкновенной у линии Л13 на 4,5 балла - по результатам визуальной оценке в поле.

6. Оценена урожайность трансгенных растений с повышенной устойчивостью к болезням в сравнении с исходным нетрансгенным сортом в вегетационном и полевых опытах. Отобраны линии с урожайностью на уровне или выше стандарта: Л13 (365 г/раст.), Си19 (300 г/раст.), Си31 (400 г/раст.),

Ж139 (600 г/раст.), И115 (700 г/раст.), И132 (600 г/раст.), Г12 (1300 г/раст.), ПЗ (700 г/раст.), Г27 (600 г/раст.) и Pal 05 (510 г/раст.).

7. В результате анализа линий по комплексной устойчивости и урожайности выделено 10 трансгенных образцов для предложения авторам исходных сортов в качестве стартового материала на улучшенную сортоформу.

8. По фенотипичесиким характеристикам выявлено 11% отличных от стандартов трансгенных линий при сравнении трансгенных линий с исходными нетрансгенными формами.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ

1. Для дальнейших испытаний как сортоулучшенные образцы рекомендуются трансгенные линии с повышенной комплексной устойчивостью к грибным заболеваниям и урожайностью не ниже стандарта: Л13 сорта Лорх, Си19 и Си31 сорта Синецвет, Ж139 сорта Жуковский ранний, И115 и И132 сорта Ильинский, Г12, ПЗ и Г27 сорта Голубизна и РаЮ5 сорта Раменский.

2. Для использования в скрещиваниях или в качестве родительской формы в селекционном процессе на целевую устойчивость к фитофторозу рекомендуются линии Л13, Си19, Си31, СиЗЗ, Ж139, И125, И132, Г126 и РаЮ5; на целевую устойчивость к альтернариозу линии Л2, СиЗЗ, Ж139, И104, ПЗ, Г23 и Pal05; на целевую устойчивость к сухой фузариозной гнили линию Pal05; на целевую устойчивость к обыкновенной парше картофеля линию Л13.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Крупенин Р.В. Использование селективных питательных сред и ПЦР-метода на этапах получения трансгенных растений картофеля// Материалы II молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". - М., 2002. - С. 8-9.

2. Крупенин Р.В. Оценка трансгенных линий картофеля, несущих ген Rs-AFP2 на устойчивость к фитофторозу ботвы in vivo// Материалы II

молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". -М., 2002. - С. 4-5.

3. Крупенин Р.В., Бирюкова В.А., Хромова Л.М. Создание трансгенных растений картофеля, устойчивых к фитофторозу, на основе гена фунгицидного пептида из семян редьки// Материалы Первой Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям. - Санкт-Петербург, 2002. - С. 159-160.

4. Крупенин Р.В., Хромова Л.М. Испытания генно-модифицированных линий картофеля, устойчивых к фитопатогенам// Материалы конференции "Актуальные проблемы генетики". - М.: МСХА, 2002. - Т. 2. - С. 152-153.

5. Крупенин Р.В., Бирюкова В.А., Хромова Л.М. Получение трансформированных растений картофеля с помощью штамма А4 Agrobacteriura rhizogenes, несущего генетическую конструкцию фунгицидного пептида редьки (дефензина)// Вопросы картофелеводства. - Науч. труды.- М.: ВНИИКХ, Россельхозакадемия, 2002. - Выл. 64. - С. 80-86.

6. Крупенин Р.В., Бирюкова В.А., Кукушкина Л.Н., Хромова Л.М. Использование гена антимикробного пептида редьки для повышения устойчивости картофеля к биотическим стрессам// Материалы 7-ой школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". - Пущино, 2003. -С.Ш.

7. Krupenin R.V., KhromovaL.M., Kukushkina L.N. Studying of potato transgenic plants resistant to pathogens// Материалы международной научной конференции "Современное состояние проблем и достижений в области генетики и селекции". - Алматы, Казахстан, 2003. - С. 103-104.

8. Крупенин Р.В., Бирюкова В.А., Кукушкина Л.Н., Хромова Л.М. Получение трансгенных растений картофеля, несущих ген антимикробного пептида редьки и их оценка на устойчивость к грибным болезням/ Материалы Международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 75-летию Института картофелеводства Нац. академии наук Беларуси. - Науч. труды. - Минск, 2003. - Ч. 1. - С. 293-299.

Лицензия ИД № 00808 от 20.01.2000 г.

Подписано в печать « » 2001/ г.

Усл. пл.

Заказ № Тираж 100 экз.

Отпечатано на ризографе, ГНУ ВНИИКХ 140052 п. Коренёво ул. Лорха д. 23 Люберецкого района Московской области

» - 2605

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Крупенин, Роман Вячеславович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. БОЛЕЗНИ КАРТОФЕЛЯ И ДОСТИЖЕНИЯ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ В БОРЬБЕ С НИМИ.

2.1. Фитофтороз.

2.2. Апьтернариоз.

2.3. Ризоктониоз.

2.4. Рак картофеля.

2.5. Сухая фузариозная гниль.

2.6. Обыкновенная парша.

3. РОЛЬ АНТИМИКРОБНЫХ БЕЛКОВ ДЕФЕНЗИНОВ В ЗАЩИТЕ РАСТЕНИЙ ОТ ФИТОПАТОГЕНОВ.

3.1. Общее строение дефензинов.

3.2. Экспрессия дефензинов в органах растений.

3.3. Антимикробная активность дефензинов.

3.4. Получение трансгенных растений с генами дефензинов и их устойчивость к болезням.

4. ПЕРЕНОС ГЕНОВ В РАСТИТЕЛЬНЫЙ ГЕНОМ С ПОМОЩЬЮ АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ.•.

5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

5.1. Объекты исследований.

5.1.1. Растительный материал.

5.1.2. Векторная конструкция и агробактериальные штаммы.

5.1.3. Штаммы фитопатогенов.

5.2. Место проведения и схема полевого и вегетационного опытов.

5.3. Метеорологические условия 2002-2003 гг.

5.4. Микроклональное размножение картофеля в условиях in vitro.

5.5. Методика выделения ДНК из растительных тканей картофеля и ПЦР-анализа.

5.6. Методы оценки трансгенных растений на устойчивость к болезням

5.7. Биохимическая идентификация исходных и трансгенных растений с помощью белковых маркеров.

5.8. Статистическая обработка данных.

6. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

6.1. Оптимизация методики трансформации картофеля.

6.1.1. Анализ чувствительности трансформантов к канамицину.

6.1.2. Получение трансформированных растений картофеля с помощью штаммов LBA4404 и LGV3850 Agrobacterium tumefaciens.

6.1.3. Получение трансформированных растений картофеля с помощью штамма А4 Agrobacterium rhizogenes.

6.2. Оценка трансгенности трансформированных растений картофеля.

6.3. Характеристика устойчивости трансгенных линий картофеля к грибным инфекциям.

6.3.1. Характеристика устойчивости трансгенных линий картофеля к фитофторозу.

6.3.2. Характеристика устойчивости трансгенных линий картофеля к альтернариозу.

6.3.3. Характеристика устойчивости трансгенных линий картофеля к ризоктониозу in vitro.

6.3.4. Лабораторная оценка устойчивости к раку картофеля.

6.3.5. Лабораторная оценка устойчивости к сухой фузариозной гнили.

6.3.6. Визуальная оценка устойчивости к парше обыкновенной.

6.4. Определение урожайности трансгенных растений картофеля.

6.5. Морфологические и физиологические особенности трансгенных линий картофеля.

6.6. Комплексная оценка трансгенных линий картофеля.

6.7. Доказательство соответствия трансгенного и исходного генотипов с помощью белковых маркеров.

7. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВЫРАЩИВАНИЯ ТРАНСГЕННОГО КАРТОФЕЛЯ, УСТОЙЧИВОГО К ГРИБНЫМ

БОЛЕЗНЯМ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Создание и оценка трансгенных растений картофеля устойчивых к грибным болезням"

Актуальность проблемы. Россия, занимая лидирующее положение по абсолютному количеству производимого картофеля, вместе с тем остается на одном из последних мест по урожайности. Низкое качество семенного материала, в сильной степени зараженного вредоносными патогенами, - один из главных факторов, определяющих хронически низкий уровень урожайности картофеля (Анисимов, 2000). Значительная часть сортов, картофеля остается уязвимой для поражения различными грибными заболеваниями, среди которых весьма ощутимый урон наносят фитофтороз, ризоктониоз, фузариозная сухая гниль и др. (Попкова, Воловик, Шнейдер, 1986). Многочисленные заболевания в значительной степени снижают урожайность картофеля и качество клубней (Постников А.Н., Постников Д.А., 1994; Шуманн, 1999 ). Применение дорогостоящих фунгицидов требует больших материальных затрат.

Создание растений, устойчивых к болезням является непростой задачей для генетиков и селекционеров из-за участия многих генов во взаимодействии растение-патоген. В настоящее время в селекционный процесс в той или иной степени вовлечены многие дикорастущие виды картофеля, служащие донорами генов устойчивости (Камераз и др., 1973). Однако, одним из главных недостатков традиционной, селекции сортов на устойчивость является часто встречающееся при половой гибридизации сцепление с данным локусом резистентности нежелательных генов, снижающих хозяйственную ценность селекционного материала.

Методы генной инженерии позволяют вводить конкретный ген в растение конкретного генотипа, что значительно повышает качество и эффективность селекционной работы. Применительно к картофелю, который размножают вегетативно, и где обычная селекция подразумевает скрещивание между двумя гетерозиготными тетраплоидными формами, применение направленных, точных методов молекулярной селекции особенно актуально (Mackay, 1996).

Относительно недавно в семенах и вегетативных органах различных растений были обнаружены гены, способные экспрессировать пептидные антибиотики - дефензины - короткие белки широкого фунгицидного действия (Broekaert et al., 1995). Одними из самых сильнодействующих являются дефензины из семян редьки (Terras et al., 1995; Парашина и др., 1999).

Цель и задачи исследований. В связи с вышеизложенным в настоящей работе была поставлена цель получить трансгенные растения картофеля на основе гена rs дефензина из семян редьки (Raphanus sativus), оценить их по устойчивости к грибным патогенам и выделить линии, превосходящие исходный сорт по резистентности к болезням.

Исходя из этого предстояло решить следующие задачи:

- оптимизировать методику трансформации для используемых в работе сортов картофеля;

- оценить эффективность различных элементов трансгенных технологий (штаммы Agrobacterium, этапы трансформации, типы эксплантов и др.) для оптимизации встройки и функционирования целевого гена;

- получить растения-регенеранты, несущие ген rs;

- провести тестирование встройки гетерологичной ДНК;

- провести раннее тестирование признаков резистентности к микозам в трансгенных растениях на основе in vitro-тестов и искусственных заражений клубней и взрослых растений;

- провести оценку хозяйственной урожайности трансгенных растений с повышенной устойчивостью к болезням в сравнении с исходным нетрансгенным сортом;

- сравнить трансгенные линии, проявляющие повышенную устойчивость с исходными нетрансгенными формами по морфологическим характеристикам;

- доказать принадлежность трансгенных линий с повышенной устойчивостью к базисному генотипу исходного сорта с помощью биохимического анализа.

Научная новизна. Показана возможность коррекции недостающих признаков устойчивости сортов картофеля с помощью трансформации их конструкциями, несущими гены rs и nptll. Предложены уточняющие параметры методики трансформации линий картофеля. Получены трансгенные линии с комбинированной повышенной устойчивостью к нескольким грибным патогенам. Показана независимость изменения устойчивости к разным грибным патогенам в результате встраивания чужеродных генов.

Практическая ценность работы. Полученные в работе результаты и разработанные методики могут быть использованы при создании трансгенных линий картофеля и их оценке на устойчивость к различным заболеваниям. По 6 перспективным сортам картофеля получено 10 трансгенных линий с комплексной устойчивостью к грибным патогенам.

Трансгенные линии предложены авторам сортов как стартовый материал для всесторонней селекционной проработки в качестве улучшенной сортоформы.

Апробация работы. Материалы исследований были представлены на II молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 11 апреля 2002 г.), на I Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям (Санкт-Петербург, 2-5 июля 2002 г.), на Второй научной конференции "Актуальные проблемы генетики", посвященной 115-летию со дня рождения Николая Ивановича Вавилова (Москва, 21-22 февраля 2003 г.), на конференции "Современное состояние проблем и достижений в области генетики и селекции", (Алматы, 26-27 марта 2003 г.), на 7-й Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 21-27 апреля 2003 г.).

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Крупенин, Роман Вячеславович

из выводы

1. Показана возможность трансгенного сортоулучшения сортов картофеля по признакам устойчивости к фитофторозу, альтернариозу, сухой фузариозной гнили, обыкновенной парше с помощью конструкции рК22 с целевым геном дефензина редьки rs и маркерным nptll посредством штаммов LBA4404 и LGV3850 Agrobacterium tumefaciens и А4 Agrobacterium rhizogenes.

2. Получено 80 трансгенных линий: 17 сорта Синецвет, 5 сорта Лорх, 29 сорта Голубизна, 14 сорта Жуковский ранний, 12 сорта Ильинский и 3 трансгенные линии сорта Раменский. В соответствии с задачами по коррекции сортов все линии оценены на устойчивость к грибным болезням картофеля: фитофторозу по листьям и по клубням, альтернариозу (линии всех сортов), ризоктониозу (линии сортов Синецвет, Жуковский ранний и Голубизна), к сухой фузариозной гнили (линии сорта Раменский) и парше обыкновенной (линии сорта Лорх). Выявлены трансгенные линии со статистически достоверными положительными отклонениями по устойчивости от исходного сорта.

3. Оптимизирована методика трансформации: найдена оптимальная концентрация канамицина для селекции регенерантов, экспрессирующих маркерный ген nptll — 25 мг/л; установлено положительное влияние темноты на этапе предынкубации эксплантов; подобрана оптимальная экспозиция кокультивации эксплантов картофеля с агробактерией - 1 час; установлено, что воздействие на экспланты низкой положительной температуры 4°С существенно увеличивает выход регенерантов до 82%; установлено влияние генотипа на интенсивность регенерации и выход регенерантов. Сорта Голубизна, Жуковский ранний, Ильинский обладают высоким регенерационным потенциалом, сорт Раменский и Лорх - низким. Подобраны оптимальные концентрации регуляторов роста, обеспечивающие интенсивную регенерацию эксплантов картофеля при трансформации штаммом А4 Agrobacterium rhizogenes - 0,1 мг/л ИУК, 3 мг/л БАП и 10 мг/л

ГК. Установлена зависимость между ярусами .междоузлий, взятых в качестве эксплантов пробирочных растений и выходом регенерантов - экспланты верхних ярусов обладают наибольшей регенерационной способностью по сравнению с эксплантами среднего и нижнего ярусов междоузлий. Установлено влияние агробактериального штамма, несущего генетическую конструкцию с геном rs на выход трансгенов. Наибольший выход трансгенов наблюдался при использовании штамма АЛ Agrobacterium rhizogenes - 15,6 %. Эффективность трансформации при использовании оптимизированной методики составила 1,9-2,7% по сорту JIopx, 6,4-7,0% по сорту Синецвет, 0,9-11,8% по сорту Жуковский ранний, 2,1-9,5% по сорту Ильинский, 5,915,6% по сорту Голубизна и 2,6 по сорту Раменский.

4. Выстроена система доказательств трансгенной природы регенерантов: селекция на канамицин-содержащих средах, ПЦР на целевой rs-ген, анализ частот встречаемости линий с различной степенью устойчивости к патогенам.

5. Оценены частоты встречаемости трансгенов с повышенной устойчивостью по всем исследуемым сортам для фитофтороза по листьям 33-80%, фитофтороза по клубням 20-100%, альтернариоза 25-100%. Максимальные отклонения по данным оценок искусственных заражений и визуальных наблюдений от исходного сорта по

- фитофторозу листьев у линий Л13 на 3,5 балла; Си19 и Си31 на 2,1 баллов; Ж139 на 2,9 балла; И132 на 2,2 балла; Г12 на 1,5 балла;

- фитофторозу клубней у линий Л13 на 1 балл; Си19 и СиЗЗ на 3 балла; Ж139 на 3,2 балла; И125 на 3,2 балла; Г126 на 2,5 балла; Ра105 на 2,6 балла;

- альтернариозу у линий Л2 на 4,3 балла; СиЗЗ на 4,7 балла; Ж139 на 5,7 балла; И104 на 2,2 балла; Г13 и Г23 на 4,4 балла; Pal 05 на 2,6 балла;

- сухой фузариозной гнили у линии Pal05 на 2,2 балла - на основании результатов оценок с помощью искусственных заражений листьев и клубней;

- парше обыкновенной у линии JI13 на 4,5 балла - по результатам визуальной оценке в поле.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ

1. Для дальнейших испытаний как сортоулучшенные образцы рекомендуются трансгенные линии с повышенной комплексной устойчивостью к грибным заболеваниям и урожайностью не ниже стандарта: Л13 сорта Лорх, Си19 и Си31 сорта Синецвет, Ж139 сорта Жуковский ранний, И115 и И132 сорта Ильинский, Г12, Г13 и Г27 сорта Голубизна и Ра 105 сорта Раменский.

2. Для использования в скрещиваниях или в качестве родительской формы в селекционном процессе на целевую устойчивость к фитофторозу рекомендуются линии Л13, Си19, Си31, СиЗЗ, Ж139, И125, И132, Г126 и Ра105; на целевую устойчивость к альтернариозу линии Л2, СиЗЗ, Ж139, И104, Г13, Г23 и Ра 105; на целевую устойчивость к сухой фузариозной гнили линию Pal05; на целевую устойчивость к обыкновенной парше картофеля линию Л13.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Крупенин, Роман Вячеславович, Москва

1. Анисимов Б.В. Сорта картофеля, возделываемые в Российской Федерации. Каталог. М.: Информагротех, 1999. - 113 с.

2. Анисимов Б.В. Сортовые ресурсы и передовой опыт семеноводства картофеля. М.: ФГНУ Росинформагротех, 2000. - 152 с.

3. Аш О.А., Коваленко Е.О., Коломиец Т.М., Майсурян А.Н., Мазин

4. B.В. Агробактериальная трансформация томата геном дефензина// Материалы Международной науч.-практ. конф. "Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке". М., 2000. - Т. 1. - С. 113-114.

5. Батинг Г., Контор Ч., Коллинз Ф. и др. Анализ генома. Методы: Пер. с англ. М.: Мир, 1990. - С. 176-190.

6. Бебре Г.Т. Видовой и штаммовый состав возбудителя сухой гнили рода Fusarium в Прибалтике// Защита картофеля от болезней и вредителей. М., 1984. - С. 90-93.

7. Березовский М.И. Особенности проявления сухой фузариозной гнили на клубнях картофеля в Беларуси// Вопросы картофелеводства. — М., 1999.-С. 13-16.

8. Бордукова М.В. Ризоктониоз и белая ножка на картофеле// Картофель и овощи. 1970. - №4. - С. 42-44.

9. Будин К.З. Генетические основы селекции картофеля. Л.: Агропромиздат, 1986. - 192 с.

10. Бурьянов Я.И. Успехи и перспективы генно-инженерной биотехнологии растений// Физиол. растений. 1999. - Т. 46. - №5. —1. C. 930-944.

11. Бусько И.И., Козлова Л.И. Некоторые биологические особенности возбудителя сухой фузариозной гнили картофеля F. sambucinum// Актуал. пробл. соврем, картофелеводства. Минск, 1997. - С. 68-69.

12. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. - 272 с.

13. Воловик А.С. с соавторами. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков (справочник).- М.: Агропромиздат, 1989. -285 с.

14. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство: Пер. с англ./ Под ред. Дж. Дрейпера, Р. Скотта, Ф. Армитиджа, Р. Уолдена. М.: Мир, 1991.-408 с.

15. Горковенко М.Н. Сорта, устойчивые к вирусным и грибным болезням (в условиях Северо-Кавказского региона). Пущино, 1996. - Вып. 2. - С. 92-95.

16. Гостимский С.А. Генетическая изменчивость клеток растений при культивировании// Успехи современной генетики. М.: Наука, 1987.-Вып. 14,-С. 48-63.

17. Гросс O.K. Ризоктониоз картофеля// Защита растений. 1985. - Т. 2. -С. 56.

18. Данченко М.И. Биологические особенности обычной расы возбудителя рака картофеля различного географического происхождения// Защита растений. 1989. - Т. 14. - С. 32-35.

19. Дмитриева Е.П. Разработка методов устойчивости картофеля к альтернариозу и характеристика картофеля по этому признаку: Автореф. на соиск. степ. канд. с.-х. наук. М., 1988. - 21 с.

20. Долягин А.Б., Писаренко Э.К., Капустина В.М. Характеристика Synchytrium endobioticum (Schilb.) при инактивации// Актуал. проблемы картофелеводства. М., 1993. - С. 62-71.

21. Дорожкин Н.А., Вельская С.И. Болезни картофеля. Минск: Наука и техника, 1979. - 314 с.

22. Дорожкин Н.А., Вельская С.И., Алексеева Т.П., Новикова Л.М. Гнили картофеля при хранении// Картофель и овощи. 1982. - №10. - С. 1314.

23. Дорожкин Н.А., Куневич Р.В. Вирулентность и паразитическая специализация штаммов гриба Rhizoctonia solani Kiihn// Микология и фитопатология. 1968. - Т.2. - № 5. - С. 408-413.

24. Дорожкин Н.А., Михальчик В.Т. Методы оценки устойчивости к фузариозной гнили. Селекция и семеноводство, 1979. - №3. - С. 18— 20.

25. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). 5-е изд., доп. и перераб. - М.: Агропромиздат, 1985.-351 с.

26. Дьяков Ю.Т., Филиппович А. Относительная роль генов и полигенов в устойчивости клубней картофеля к фитофторозу// Картофель и овощи. 1967. - №2. - С. 32-36.

27. Ерохина С.А., Данилова Е.А. Методы определения патогенности штаммов парши {Actinomyces) для их использования в лабораторной оценке на устойчивость// Селекция и сортовая агротехника картофеля. Вып. 28. - М., 1977. - С. 75-82.

28. Ефремова Н.Н., Крашенинникова Л.В. Получение трансгенных растений картофеля, экспрессирующих человеческий альфа-интерферон и двунитевую РНК// Вопросы картофелеводства. -Научные труды ВНИИКХ. М., 1994. - С. 74-78.

29. Захарова Л.Н. Оценка сеянцев картофеля на устойчивость к ризоктонии// Науч. труды ВНИИКХ. М., 1979. - Вып. 33. - С. 7982.

30. Захарова JI.H., Михеева Л.П. Поражаемость ростков картофеля ризоктонией при искусственном заражении// Научн. труды Сев.-Зап. НИИ с.-х. М„ 1975. - Вып. 34. - С. 99-101.

31. Иванова Н.Г. Разработка селективного фактора для проведения клеточной селекции на устойчивость к Corynebacterium sepedonicum!7 Использование клеточных технологий в селекции картофеля. Науч. труды. - М., 1987. - С. 26-28.

32. Иванюк В.Г. Взаимодействие рас гриба Alternaria solani (Ell. et Mart.) Jones et Grout, с сортами картофеля// Защита растений. 1991. - Т. 16. -С. 58-66.

33. Иванюк В.Г. Особенности проявления альтернариоза картофеля// Актуал. пробл. адаптив. интенсификации земледелия на рубеже столетий. Минск, 2000. - С. 315-318.

34. Иванюк В.Г., Бусько И.И. Видовой состав возбудителей парши обыкновенной картофеля и меры борьбы с болезней в условиях Белорусской ССР// Защита растений. Минск: Ураджай, 1990. - С. 58-63.

35. Иванюк В.Г., Палилова А.Н. Структура популяции Alternaria solani (Ell. et Mart.) Jones et Grout. возбудителя альтернариоза картофеля и ее динамика в условиях Белоруссии// Микология и фитопатология. -1996. - Т. 30. - Вып. 3. - С. 66-74.

36. Камераз А .Я., Яшина И.М., Склярова Н.П. Генетика устойчивости картофеля к патогенам// Генетика картофеля.- М.: Наука, 1973. С. 175-233.

37. Капустина В.М. Распространенность и развитие ризоктониоза на картофеле в зависимости от сортовых особенностей и климатических условий. Вопросы картофелеводства. - М., 1994. - С. 161-167.

38. Картель Н.А. Биоинженерия: методы и возможности. Минск: Ураджай, 1989.- 143 с.

39. Каталог сортов картофеля селекции ВНИИКХ. М.: ВНИИКХ, 1993. - 109 с.

40. Кваснюк Н.Я., Козловский Б.Е. Альтернариоз картофеля// Защита растений. 1985. - Т. 11. - С. 27-28.

41. Кирай 3., Клемент 3., Ф. Шоймоши, Й. Вереш. Методы фитопатологии: Пер. с англ. М.: Колос, 1974. - 343 с.

42. Комплексная система защиты картофеля от болезней, вредителей и сорняков (практическое руководство). М.: ЦНТИПР, 1995. — 69 с.

43. Константинович А.А., Иванюк В.Г. Особенности проявления фитофтороза картофеля в Белоруссии и некоторые приемы снижения его вредности// Защита растений. Минск: Ураджай, 1991. - С. 7383.

44. Коршунов А.В. Современные технологии возделывания картофеля// Агро XXI, приложение. Эффективные технологии производства картофеля. М., 1999. - С. 9-10.

45. Кузнецова Т.Н. Рак картофеля// Наука практики. 1999. - №3. - С. 6.

46. Кукушкина JI.H., Юрьева Н.О., Кукушкин Н.И. Экспресс-метод диагностики устойчивости к фитофторе сомаклонов картофеля in vitro// Научные труды ВНИИКХ. Вопросы картофелеводства. -1994.-С. 62-66.

47. Куневич Р.В. К вопросу об устойчивости сортов картофеля к ризоктонии// Экспериментальная ботаника. Минск: Высшая школа, 1966. - С.123-128.

48. Курочкина С.Д. Получение трансгенных растений картофеля: Автореф. дисс. на соиск. уч. степ. канд. биолог, наук. Минск, 1995. -21 с.

49. Кучук Н.В. Генетическая инженерия высших растений. Киев: Наукова думка, 1997. - 152 с.

50. Кучук Н.В., Каневский И.Ф. Методы генетической трансформации растений// Физиология растений. 1987. - №3. - С. 30-31.

51. Левенко Б.А. Трансгенные растения. Современное состояние, проблемы, перспективы. Киев: Дошкольник, 2000. - 305 с.

52. Лихтенштейн К., Дрейпер Дж. Клонирование ДНК // Генетическая инженерия растений. Методы. М.: Мир, 1988. - С. 315-380.

53. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М.: Мир, 1984.-480 с.

54. Методика исследований по защите картофеля от болезней, вредителей, сорняков и иммунитету. М.: ВНИИКХ, 1995. - 106 с.

55. Методические указания по оценке селекционного материала картофеля на устойчивость к фитофторозу, ризоктониозу, бактериальным болезням и механическим повреждениям. М., 1980. -53 с.

56. Методические указания по получению вариантных клеточных линий и растений у разных сортов картофеля. М.: ВАСХНИЛ, 1984. -28 с.

57. Методические указания по получению трансформированных растений картофеля. М.: ВНИИКХ, 1995. - 14 с.

58. Методы оценки картофеля на устойчивость к клубневым гнилям (рекомендации)/ Под. ред. Н.А. Дорожкина. Минск: Наука и техника, 1985. - 17 с.

59. Мусин С.М. Полиморфизм белков картофеля и возможности его использования в селекции и семеноводстве// Использование клеточных технологий в селекции картофеля. Науч. труды. - М., 1987.-С. 77-88.

60. Остерман J1.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983. - 304 с.

61. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот// Электрофорез и ультрацентрифугирование. Практическое пособие. -М.: Наука, 1981.-283 с.

62. Парашина Е.В. Создание и характеристика форм томатов (Lycopersicon esculentum М.), экспрессирующих ген дефензина редьки R.S-AFP2: Автореф. на соиск. степ. канд. биол. наук. М., 1999. - 20 с.

63. Парашина Е.В., Лаврова Н.В., Аветисов В.А. Использование гена защитного пептида (дефензина) из семян редьки для повышения устойчивости томата к фитопатогенным грибам// Материалы IV съезда Об-ва физиологов России. М., 1999. - С. 661-662.

64. Парашина Е.В., Сердобинский Л.А., Калле Е.Г., Лаврова Н.В., Аветисов В.А., Лунин В.Г., Народицкий Б.С. Получение трансгенных растений рапса и томата, экспрессирующих ген дефензина редьки// Физиология растений. 2000. - Т. 47. - № 3. — С.471-478.

65. Парашина Е.В., Шаденков А.А., Лаврова Н.В., Аветисов В.А. Использование гена защитного пептида из семян редьки для повышения устойчивости томата к заболеваниям, вызываемым грибами.// Биотехнология. 1999. - № 6. - С. 35-41.

66. Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология. — 4-е изд., перераб. и доп. М.: Агропромиздат, 1989. - 480 с.

67. Подгаецкий А.А., Коваль Н.Д. Поиск источников устойчивости к сухой фузариозной гнили// Селекция и биотехнология картофеля. -Научные труды ВНИИКХ. М., 1990. - С.38-43.

68. Поддержание и хранение коллекционных образцов картофеля в условиях in vitro. Методические указания. Л.: ВНИИ растениеводства им. Вавилова (ВИР). - 40 с.

69. Попадьин П.В. Применение агробактериальной трансформации в селекции белокочанной капусты на устойчивость к болезням: Автореф. на соиск. степ. канд. биол. наук. М., 2002. - 20 с.

70. Попкова К.В., Векогон В.Г. Ризоктониоз картофеля// Картофель и овощи. 1967. - №3. - С. 33-34.

71. Попкова К.В., Воловик А.С., Шнейдер Н. Защита картофеля в индустриальной технологии. М.: Россельхозиздат, 1986. -150 с.

72. Попкова К.В., Шнейдер Ю.И., Воловик А.С., Шмыгля В.А. Болезни картофеля. М.: Колос, 1986. - 304 с.

73. Постников А.Д., Постников Д.А. Картофель. Сорта, болезни, вредители, сорняки и меры борьбы с ними. М.: ТОО РУПОР, 1994. -48 с.

74. Рассадина Г.В. Возможности клеточного уровня организации генотипа для повышения устойчивости растений картофеля к патогенам и стрессам// Использование клеточных технологий в селекции картофеля. Науч. труды. - М., 1987. - С. 19-25.

75. Салтыкова Л.П., Тарасова В.П. Методические указания по испытанию картофеля на ракоустойчивость. Л.: ВАСХНИЛ, 1982. -49 с.

76. Самерсов В.Ф., Иванюк В.Г. Фитофтороз картофеля// Защита растений. 1992. - №5. - С.21-22.

77. Селекция картофеля и интенсивная технология его выращивания/ П.И. Альсмик и др. Минск, 1986. - 48 с.

78. Сельскохозяйственная биотехнология/ B.C. Шевелуха, Е.А. Калашникова, С.В. Дегтярев и др.: Под ред. B.C. Шевелухи. -М.: Высш. школа, 1998. 416 с.

79. Сердобинский Л.А. Создание векторных конструкций, содержащих гены фунгицидно-бактерицидных пептидов, и анализ полученных с их помощью растений: Автореф. на соиск. степ. канд. биол. наук. — М., 2002. 20 с.

80. Сердобинский Л.А., Шаденков А.А., Ковалева М.В., Лунин В.Г. Создание генетических конструкций, содержащих гены дефензинов и анализ трансформированных с помощью них растений табака// Материалы IV Об-ва физиологов России. М., 1999.-С. 693.

81. Созинов А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. М.: Наука, 1985. - 272 с.

82. Сорта картофеля селекции ВНИИКХ. М.: Колос, 2000. - 36 с.

83. Справочник картофелевода/ Под. ред. А.И. Замотаева. М.: Агропромиздат, 1987.-351 с.

84. Стратегия и тактика защиты картофеля от фитофтороза. Метод, рекомендации. - М.: ВАСХНИЛ, 1990. - 41 с.

85. Суркова Т.А. Диагностика фузариозных гнилей// Защита растений. -1982.-№11.-С. 36-41.

86. Толкачев Б.С. Устойчивость селекционного материала картофеля к раку// Актуал. проблемы фитовирусологии и защиты растений. -Минск, 1997.-С. 88.

87. Уткин М.С. Иммунитет сортов картофеля к Phytophthora infestans и Rhizoctonia solani и обоснование иммунитета// Труды Всероссийского энтомолого-фитопат. 2-го съезда. Петроград, 1921. - С. 136-152.

88. Хромова Л.М. Перспективы использования клеточно-инженерных работ для создания исходных форм и сортов картофеля// Использование клеточных технологий в селекции картофеля. -Научные труды. М., 1987. -С. 113-124.

89. Ху Чжун, Го Гуаньцинь, Чжао Дунли, Ли Лихуа, Чжэн Гочан. Регенерация побегов из листовых эксплантов Lycium barbarum и агробактериальная трансформация// Физиология растений. — 2000. -Т. 48.-№4.-С. 529-535.

90. Шаденков А.А., Лунин В.Г., Лаврова Н.В. и др. Создание трансгенных растений табака и картофеля, несущих ген пептидного антибиотика Amarantus caudatusll Материалы VIII конференции "Новые направления биотехнологии". М., 1998. - С. 33.

91. Шаденков А.А., Ковалева М.В. и др.// Молекулярная биология. -1996. Т. 30. - №2. - С.454-460.

92. Шпаар Д., Иванюк В., Шуманн П., Постников А. и др. Картофель/ Под ред. Д. Шпаара. Минск: ФУАинформ, 1999. - 272 с.

93. Шуманн П. С поля в хранилище: без окольных путей// Новое сельское хозяйство. 1999. - № 2. - С. 38-39.

94. Шушукова Т.В., Тюкавин Г.Б., Долгов С.В. Генетическая трансформация моркови (Daucus carota) геном суперсладкого белка и геном дефензина редиса// Материалы III Пущинской конференции молодых ученых. Пущино, 1998.- С. 104-105.

95. Яковлева В.А. Рак картофеля// Защита растений. 1989. - Т. 4. - С. 52-53.

96. Albright L.M., Yanofsky M.F., Leroux В., Ma D., Nester E.W. Propcessing of the T-DNA of Agrobacterium tumefaciens generates bordernicks and linear, single stranded T-DNA// J. Bact. 1987. -Vol.169.-P. 1046-1055.

97. Altenbach S.B., Pearson K.W., Leung F.W., Sun S.S.M. Cloning and sequence analysis of a cDNA encoding a Brazil nut protein exceptionally rich in methionine/ Plant Mol. Biol. 1987. - Vol. 8. - P. 239-250.

98. Ampe C., Van Damme J., de Castro L.A.B. et al. The amino-acid sequence of the 2S sulphur-rich proteins from seeds of Brazil nut (Bertholletia excelsa H.B.K.)// Eur. J. Biochem. 1986. - Vol. 159. - P. 597-604.

99. Benhamou N., Broglie K., Broglie R., Chet I. Antifungal effect of bean endochitinase on Rhizoctonia solani, ultrastructural changes and cytochemical aspects of chitin breakdown// Canad. Journal of Microbiol. -1993.-Vol. 39.-P. 318-328.

100. Bevan M.W. Binary Agrobacterium vectors for plant transformation// Nucleic Acids Res. 1984. - Vol. 12. - P. 8711-8721.

101. Bevan M.W., Flavell R.B., Chilton M.D. A chimaeric antibiotic resistance gene as selectable marker for plant cell transformation// Nature. 1983.-Vol. 303.-P. 184-187.

102. Bloch C., Richardson M. A new family of small (5 kDa) protein inhibitors of insect a-amylases from seeds of sorghum {Sorghum bicolor (L)

103. Moench) have sequence homologies with wheat y-purothionins. FEBS Lett. 1991. - Vol. 279. - P. 101-104.

104. Bohlmann H. The role of thionins in plant protection Crit. Rev. Plant Sci. -1994.-Vol. 13.-P. 1-16.

105. Bol J.F., Linthorst H.J.M., Cornellissen B.J.C. Plant pathogenesis-related proteins induced by virus infection// Annu. Rev. Phytopathol. -1990. -Vol.28.-P.l 13-138.

106. Boman H.G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity// Annu. Rev. Immunol. 1995. -Vol.13. - P. 61-92.

107. Bounois G. Principles of Gene Cloning and Analysis: A Laboratory Guide. Blackwell Scientific Publication, Oxford, 1987.

108. Brian P.W., Elson G.W., Hemming J.M., Wright J:M. The phutotoxic properties of alternaric acid in relation to the etiology of plant diseases caused by Alternaria solaniII Ann. Appl. Biol. 1962. - Vol. 39. - № 3. -P. 308-321.

109. Broekaert W.F. et al. Antimicrobial peptides from plants// Plant Sci. -1998.-Vol. 16.-P. 297-323.

110. Broekaert W.F. et al. Biocidal proteins// WO 92/21699, 1992.

111. Broekaert W.F. et al. Biocidal proteins// WO 93/05153, 1993.

112. Broekaert W.F., Terras F.R.G., Cammue B.P.A. and Osborn R.W. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defence system// Plant Physiol. 1995. - Vol. 108. - P. 1353-1358.

113. Broggio M. Ranucci A. Screening potato genotypes for resistance to Alternaria solani through in vitro infection of regenerant calli and micropropagated plantlets// Riv. Agr. subtrop. trop. 1990. - An.84. -№3. — P. 534-537.

114. Bruix et al. Solution structure of gamma 1-H and gamma 1-P. thionins from barley and wheet endosperm determined by 'H-NMR: a structural motif common to toxic arthopod protheins// Biochemistry. 1993. - Vol. 132.-P. 715-724.

115. Butenko P.G. et al. New forms of potato created by cell and protoplast culture methods. Tissue Culture and RES. (Eds: P.Rohlich and E. Bacsy), 1984.-P. 515-527.

116. Callis J., Fromm M., Walbot V. Introns increase gene expression in cultured maize cells// Genes and Development. 1987. -Vol.1. - P. 1183— 1200.

117. Caplan A., Herrera-Estrella L., Inze D., Van Haute D., Van Montagu M., Schell J., Zambryski P. Introduction of genetic material into plant cells// Science. 1983. - Vol. 222. - P. 815-822.

118. Carrer H., Hockenberry T.N., Svab Z., Maliga P. Kanamycin resistance as a selective plastid marker// Mol. and Gen. Genet. 1993. - Vol. 241. - P. 49-56.

119. Chaband M., Passiatore J.E. Parameters affecting kanamycin resistant alfalfa obtained by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation// Plant Cell Report 7. 1988. - Vol. 7. - P. 512-516.

120. Chang M.M., Chiang C.C., Martin M.W., Hadwiger L.A. Expression of a pea disease resistance response gene in the potato cultivar Shepody// Americ. Potato Journal. 1993. - Vol. 70. - P. 635-647.

121. Chiang C.C., Hadwiger L.A. The Fusarium solani-inducQd expression of a pea gene family encoding high cysteine content proteins// Mol. Plant Microbe Interact. 1991. - Vol. 4. - P. 324-331.

122. Collila F.J., Rocher A., Mendez E. Gamma purothionins: amino acid sequence of two polypeptides of a new family of thionins from wheat endosperm// FEBS Lett. 1990. - Vol. 270. - P. 191-194.

123. Constable C.P., Bertrand C., Brisson N. Transgenic potato plants overexpressing the pathogenesis-related Sth-2 gene show unaltered susceptibility to Phytophthora infestans and potato virus XI/ Plant Mol. Biol. 1993. - Vol. 22. - P. 775-782.

124. Constable C.P., Brisson N. The defense related Sth2 gene product of potato shows race - specific accumulation after inoculation with low concentrations of Phytophthora infestans zoospores// Planta. - 1992. -Vol. 188. - №3. - P. 289-295.

125. Epple P., Apel K. and Bohlmann H. An Arabidopsis thaliana thionin gene is inducible via a signal transduction pathway different from that for pathogenesis-related proteins// Plant Physiol. 1995. - Vol. 109. - P. 813— 820.

126. Ganz Т., Lehrer R.I. Defensins// Curr Opin Immunol. 1994. - Vol.6. - P. 584-589.

127. Edwards K., Johnstone C. and Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for Plant Cell Repts. analysis// Nucl. Acids Res. 1991. - Vol. 19. - №6. - P. 1349.

128. Fraley R., Rogers S., Horsch R. et al. Expression of bacterial genes in plant cells// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - Vol. 80. - P. 4803-4807.

129. Gao A.-G. et al. Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide. Nat. Biotechnol. 2000. - Vol. 18. - P. 13071310.

130. Golds J.S., Marrey L., Maegheim G.J., Jefferson N., Fraley R.T., Waldo M., Lindelmann T. Transformation of Onobrychis sativa using disarmed binary vector in Agrobacterium rhizogenesll Theor. Appl. Genet. 1991. -Vol. 82. - №3. - P. 264-271.

131. Gomi K., Yamamato H., Akimitsu K. Epoxide hydrolase: a mRNA induced by the fungal pathogen alternaria on rough lemon (Citrus jambhiri Lush)// Plant Mol. Biol. 2003. - Vol. 53 - №1. - P. 189-199.

132. Gotz E. Pathothypendefenition fei Ph. infestans (Mont) de Bary mittels in vitro-testortiment// Arch. Phythopathol. Pflanzenschutz. 1985. - Bd 21. -№4. - S. 265-271.

133. Gu Q., Kamata E.E., Morse M.J., Wu H.M., Cheung A.Y. A flower-specific cDNA encoding a novel thionin in tobacco// Mol. Gen. Genet. -1992.-Vol. 234.-P. 89-96.

134. Herrera-Estrella et al. Chimeric genes as selectable markers for plant cell transformation// EMBO J. 1983. - Vol. 24. - P. 987-995.

135. Hoffmann J.A., Hetru C. Insect defensins: inducible antibacterial peptides// Immunol. Today. 1992. - Vol.13. -P. 411-415.

136. Intrieri M.C., Vendramin G., Buiatti M. Horizontal flux of DNA, the case Nicotiana Agrobacterium rhizogenesll Assoc. Genet. Ital. 42 Conv. sci. Riccione, 2-5 ott. 1996. Atti. Assoc. Genet. Ital. - 1996. - Vol. 42. - P. 121-122.

137. Ishibashi N.,Yamauchi D., Minamikawa t. Stored mRNA in cotyledons of Vigna unguiculata seeds: nucleotide sequence of cloned cDNA for a stored mRNA and induction of its synthesis by precocious germination. Plant Mol. Biol. 1990. - Vol. 15. - P. 59-64.

138. Jensen J.S., Marcker K.A., Otten L., Schell J. Nodule-specific expression of a chimaeric soybean leghaemoglobin gene in transgenic Lotus corniculatisll Nature. 1986. - Vol. 321. - P. 669-674.

139. Karunanandaa В., Singh A., Kao T.-H. Characterization of a predominantly pistil expressed gene encoding a y-thionin-like protein of Petunia injlatall Plant Mol. Biol. 1994. - Vol. 26. - P. 459-464.

140. Keinonen-Mettala K., Weissenberg K. von. Improved method for Agrobacterium-mediated gene transfer in silver birch {B etui a pendula)// Abstracts of IX Intern. Congr. Plant Tissue Cell Culture, Jerusalem, June 14-19, 1998.- 1998.-P. 156.

141. Klee H.J., Gordon M.P., Nester E.W. Complementation analysis of Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid mutation affecting oncogenicity// J. Bacterid. 1982. - Vol. 150. - №2. - P. 327-331.

142. Klee H.J., Yanofsky M.F., Nester E.W. Vectors for transformation of higher plants// Biotechnol. 1985. - Vol. 3. - P. 637-642.

143. Lehrer R.I., Lichtenstein A.K., Ganz T. Defensins- antimicrobial and cytotoxic peptides of mammilian cells// Ann. Rev. Immunol. 1993. -Vol. 11.-P. 105-128.

144. Linthorst H.J.M. 1991. Pathogenesis-related proteins of plants// Crit. Rev. Plant Sci.-1991.-Vol. 10.-P. 123-150.

145. Liu D., Raghothama K.G., Hasegawa P.M., Bressan R.A. Diseases responses to fungal infection in transgenic tobacco and potato plants that overexpress the osmotin gene// Plant Physiol. 1993. - Vol. 102. - P. 165.

146. Mackay G.R. An agenda for future potato research// Potato Research. -1996.-Vol. 39.-P. 387-394.

147. Martini N., Egen M., Runtz I., Strittmatter G. Promoter sequences of a potato pathogenesis-related gene mediate transcriptional activation selectively upon fungal infection// Mol. and General Genet. 1993. - Vol. 236.-P. 179-186.

148. Mascarenhas D., Mettler I.J., Pierce D. Lowe H. Intron-mediated enchancement of geterologous gene expression in maize// Plant Mol. Biol. 1990. - Vol. 15. - P. 913-920.

149. Matern U., Strobel G., Shepard J. Reaction to phytoxins in a potato population derived from mesophyll protoplasts// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. - Vol. 75. - №10. - P. 4935-4939.

150. Melchers L.S., Regensburg-Tuink A.J.G.,Schilperoort R.A., Hooykaas P.J.J. Specifity of signal molecules in the activation of Agrobacterium virulence gene expression// Mol. Microbiol. 1989. - Vol. 3. - №7. - P. 969-977.

151. Mendez E. et al. Primary structure and inhibition of protein synthesis in eucaryotic cell-free system of a novel thionin, gamma-hordothionin, from barley endosperm// Eur. J. Biochem. 1990. - Vol. 194. - P. 533-539.

152. Moreno M., Segura A., Garcia-Olmedo F. Pseudothionin, a potato peptide active against potato pathogens// Eur. J. Biochem. 1994. - Vol. 223. - P. 135-139.

153. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture// Physiol. Plant. 1962. - Vol. 15. - P. 473497.

154. O'Farrel P.H. High resolution two dimensional electrophoresis of proteins// J. Biol. Chem. 1975. - Vol. 250. - P. 4007-4021.

155. Ollson К. Impact damage, gangrene and dry rot in potato. Important biochemical factors in screening for resistance and quality in breeding material. Svalov, 1989. - 129 p.

156. Ooms G., Hooykaas P.J.J., Moolenaar G., Schilperoort R.A. Crown gall plant tumors of abnormal morphology, induced by Agrobacterium tumefaciens carrying mutated octopone Ti-plasmids: analysis T-DNA functions// Gene. 1981. - Vol. 14. - P. 33-50.

157. Osborn R.W. et al. Isolation and characterization of plant defensins from seeds of Asteraceae, Fabaceae, Hippocastanaceae and Saxifragaceae// FEBS Lett. 1995. - Vol. 368. - P. 257-262.

158. Penninckx I.A.M:A., Eggermont K., Terras F.R.G. et al. Pathogen-induced systemic activation of a plant defensin gene in Arabidopsis follows a salicylic acid-independent pathway// Plant Cell. 1996. - Vol.8. - P. 2309-2323.

159. Perl A., Coutos-Tevenot P., Boulay M. Proteases for the improvement of the plant transformation// Abstracts of IX Intern. Congr. Plant Tissue Cell Culture, Jerusalem, June 14—19, 1998. 1998. - P. 46.

160. Ponstein A.S., Bres-Vloemans S.A., Sela-Buurlage M.B. et al. A novel pathogen- and wound-inducible tobacco (Nicotiana tabacum) protein with antifungal activity// Plant Physiol. 1994. - Vol. 104. - P. 109-118.

161. Shaw C.H., Watson M.D., Carter G.H. et al. The right hand copy of the nopaline Ti-plasmids 25 bp repeat is required for tumor formation// Nucl. Acid Res. 1984. -№12. - P. 6031-6041.

162. Shepard J., Bidney D., Shanin E. Potato protoplast in crop improvement// Science. 1980. - Vol. 208. -№17. - P. 39-44.

163. Spano S., Gordon M.P., Nester E.W., Gottwald F., Teela A., Cordell A.W. Genetic modification of alfalfa (Medicago sativus) development using Ri-plasmid// Biotechnol. 1987. - Vol. 5. - P. 267-274.

164. Stegemann H., Francksen H., Macko V. Potato proteins; genetic and physiological changes, evaluated by one- and two-dimensional PAA-gel-techniques// Z. Natur. 1973. - Vol. 28. - P. 722-732.

165. Stiekema W.I. et al. Molecular cloning and analysis of four potato tuber mRNAs. Plant Mol. Biol. 1988. - Vol. 11. - P. 255-269.

166. Sukhapinda K., Spivey R., Shanin E.A. Ri-plasmid as a helper for introducing vector DNA into alfalfa plants// Plant Mol. Biol. 1987. -Vol. 8.-P. 209-216.

167. Tempe J., Goldman A. Occurrence and biosynthesis of opines// Molecular Biology Plant Tumours. New York, Acad. Press, 1982. - P. 575-584.

168. Tepfer D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes. Sexual transmission of the transformed genotype and phenotype// Cell. 1984. - Vol. 37. - P. 959-967.

169. Terras et al. A new family of basic cysteine-rich plant antifungal proteins from Brassicaceae species// FEBS Lett. 1993. - Vol. 316. - P. 233-240.

170. Terras et al. Analysis of two novel classes antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.) seeds// J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267. - P. 15301-15309.

171. Terras et al. Small cysteine-rich antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.). Their role in host defense// Plant Cell. 1995. - Vol. 7. - P. 573-588.

172. Terras F. R. G., Penninckx I.A.M.A., Goderis I.J., Broekaert W.F. Evidence that the role of plant defensins in radish defense responses is independent of salicylic acid// Planta. 1998. - Vol.206. - P. 117-124.

173. Thevissen K., Ghazi A., De Samblanx G.W., Brownlee C., Osborn R.W. and Broekaert W.F. Fungal membrane responses induced by plant defensins and thionins// J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. - P. 1501815025.

174. Tinland B. The integration of T-DNA into plant genomes// Trends Plant Sci.- 1996.-Vol. l.-P. 178-184.

175. Tu H.M., Godfrey L.W., Sun S.S.M., Expression of the Brazil nut methionine-rich protein and mutants with increased methionine in transgenic potato// Plant Mol. Biol. 1998. - Vol. 37. - P. 829-838.

176. Van den Elzen P.J.M., Jongedijk E., Melchers L.S., Cornelissen B.J.C. Virus and fungal resistance from laboratory to field// Philosoph. Transactions of the Royal Society of London Series B-Biological Sciences.- 1993. Vol. 342. - P. 271-278.

177. Van Loon L.C., Gerrittsen Y.A.M., Ritter C.E. Identification, purification and characterization of pathogenesis-related proteins from virus-infected Samsun NN tobacco leaves// Plant Mol.Biol. 1987. - Vol.9. - P. 593609.

178. Van Loon L.C., Pierpoint W.S., Boiler Т., Conejero V. Recommendations for naming plant pathogenesis-related proteins// Plant Mol. Biol. Reporter.- 1994. Vol.12. - P. 245-264.

179. Van Loon L.C., Van Strien. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins// Physiol, and Mol. Plant Pathol. 1999. - Vol. 55. - P. 85-97.

180. Wu G., Shortt B. J., Lawrence E. B. et al. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H202-generating glucose oxidase in transgenic potato plants// The Plant Cell. 1995. - Vol. 7. - P. 1357.

181. Yip W.K., Moore Т., Yang S.F. Differential accumulation of transcripts for four tomato 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase homologs under various conditions// Proc. Nat-1 Acad. Sci. USA. 1992. - Vol. 89. - P. 2475-2479.

182. Yu D., Xie Z., Chen C., Fan B. and Chen Z. Expression of tobacco class II catalase gene activates the endogenous homologous gene and is associated with disease resistance in transgenic potato plants// Plant Mol. Biol.1999. Vol. 39. - P. 477-488.

183. Yun D.-J., Bressan R.A. and Hasegawa P.M. Plant antifungal proteins. In: J. Janick (Ed.) Plant Breeding Reviews. John Wiley, New York, 1997. -Vol. 14. - P. 39-88.

184. Zhen W., Chen X., Liang H., Hu Y., Gao Y., Lin Z. Enhanced late blight resistance of transgenic potato expressing glucose oxidase under the control of pathogen-inducible promoter// Chinese Science Bulletin.2000. Vol. 45. - №21. - P. 1982-1987.

185. Zoubenko O.V., Allison L.A., Svab Z., Maliga P. Efficient targeting of foreign genes into the tobacco plastid genome// Nucl. Acid. Res. 1994. -Vol. 22. - P.3819-3824.1. УТВЕРЖДАЮ- t О «01 i- /■> "->v . „„- ^^^-^мсрр^РАСХН

Информация о работе

Крупенин, Роман Вячеславович
кандидата сельскохозяйственных наук
Москва, 2004
ВАК 06.01.05

Диссертация

Создание и оценка трансгенных растений картофеля устойчивых к грибным болезням - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы