Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция устойчивости картофеля к возбудителю фитофтороза Phytophthora infestans (Mont.) de Bary салициловой и жасмоновой кислотами

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция устойчивости картофеля к возбудителю фитофтороза Phytophthora infestans (Mont.) de Bary салициловой и жасмоновой кислотами"

На прявахрукописи

СОРОКАНЬ АНТОНИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

РЕГУЛЯЦИЯ УСТОЙЧИВОСТИ КАРТОФЕЛЯ К ВОЗБУДИТЕЛЮ ФИТОФТОРОЗА Phytophthora infestons (MONT.) DE BARY САЛИЦИЛОВОЙ И ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТАМИ

03.01.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

31 ОКТ 2013

Уфа-2013

005536312

Работа выполнена в лаборатории биохимии иммунитета растений Федерального государственного бюджетного.учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

Максимов Игорь Владимирович Доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Ибрагимов Ринат Исмагилович

Топунов Алексей Федорович

Ведущая организация:

Доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии и биотехнологии ФГБОУ ВПО Башкирский Государственный Университет Доктор биологических наук, заведующий лабораторией ФГБУН Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук

Защита диссертации состоится «?/» М/'^ЦМ 201 5 г. в « /¿>» часов на заседании диссертационного совета Д 0б2.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71; с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru

e-mail: rnolgen@anrb.ru.

Автореферат разослан «2/ » C^nui^vJi^Jfy 13 г. Ученый секретарь

диссертационного совета, к.б.н С.М. Бикбулатова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследований. .V Современные интенсивные технологии сельского хозяйства требуют эффективных способов защиты растений от повреждений патогенами. Химические средства защиты растений в основной массе являются одними из опаснейших поллютантов, кроме того, в популяциях патогенов идет отбор наиболее резистентных к ним форм, что приводит к потере их эффективности. Поэтому поиск альтернативных, экологически чистых путей решения проблемы защиты растений, направленных не на уничтожение биологического разнообразия агроценоза, а на биохимическую регуляцию иммунного потенциала растений и формирование целевой устойчивости к патогенам является актуальной задачей. В литературе широко обсуждается участие салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислот в механизмах системной устойчивости, однако многие данные крайне противоречивы [Pieterse, 2012; Robert-Senialitz, 2011; Denance et al., 2013]. Считается, что СК индуцирует в растениях биохимические процессы, приводящие к устойчивость против биотрофных патогенов, а ЖК - против фитофагов и некротрофов [Pieterse, 2012]. Неоднократно отмечалось, что эти соединения, индуцируя соответствующие сигнальные пути, способны подавлять защитноое действие друг друга, что выражается в подавлении устойчивости растений к патогенам, связанном с отсутствием патоген-специфической экспрессии всего спектра генов, кодирующих защитные белки, либо только СК- или ЖК- зависимых генов [Boatwright et al., 2013].

Возбудитель фитофтороза картофеля - Phytophthora infestans, являясь гемибиотрофным паразитом, сочетает в своем жизненном цикле биотрофную и некротрофную стратегии патогенеза. Следовательно, растения для своей защиты от этого патогена должны комбинировать защитные стратегии. Следует задаться вопросом, возможна ли в этих условиях одновременная активация СК- и ЖК-индуцируемых защитных реакций, в том числе - связанных с окислительным взрывом и активностью оксидоредуктаз?

Пероксидазы представляют собой обширное семейство белков, различающихся по спектру окисляемых субстратов и роли в онтогенезе, что связано с многообразием их молекулярных форм. Это требует от исследователей идентификации физиологических функций отдельных изоформ этого фермента [Cosío, Dunand, 2009;

Mathe et al., 2010]. Например, в отношении ряда изопероксидаз, в особенности анионных, выдвигаются предположения об их причастности к формированию устойчивости растений к патогенам [Dowd, Lagrimini, 2006; Maksimov et al., 2011; Van Loon, 2006].

Цель исследования: выявление сигнальной роли салициловой и жасмоновой кислот в регуляции защитного ответа растений картофеля в ответ на инфицирование возбудителем фитофтороза P. infestons, связанного с системой про-/анти-оксидантного статуса.

Задачи исследований:

1) Изучить вклад салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислот в формирование устойчивости растений картофеля к фитофторозу;

2) Оценить характер изменения содержания перекиси водорода и активности пероксидаз в растениях картофеля под влиянием СК, ЖК и инфицирования;

3) Провести анализ локализации лигнина, фенолышх соединений и активности пероксидаз в обработанных СК и ЖК растениях картофеля в ходе инфицирования;

4) Выявить в растениях картофеля изопероксидазы, взаимодействующие с хитином и полисахаридами клеточных стенок возбудителя фитофтороза;

5) Изучить транскрипционную активность генов картофеля, кодирующих пероксидазу М21334, белки PR-1 и PR-6 в качестве маркеров салицилат- и жасмонат-индуцируемых защитных реакций;

6) Для оценки роли изопероксидазы М21334 в защите растений картофеля от фитофтороза создать растения с подавленной экспрессией ее гена

Научная новизна. Выявлено, что одновременное совместное воздействие салициловой и жасмоновой кислот увеличивает устойчивость растений картофеля к фитофторозу, повышая активность пероксидаз, усиливая накопление активных форм кислорода и интенсифицируя отложение фенольных соединений и лигнина в тканях инфицированных растений. Тогда как при последовательном применении СК после ЖК, напротив, прослеживается значительное подавление транскрипции защитных белков - изопероксидазы М21334 и ингибитора протеиназ (PR-6), что ведет к восприимчивости растений к возбудителю фитофтороза. Впервые определены полисахарид-специфичные изопероксидазы картофеля с изоэлектрическими точками (рГ) ~ 3.5, ~ 3.7 и ~ 9.3, активирующиеся при инфицировании и под действием ЖК.

Для оценки роли изопероксидазы М21334 в защите растений картофеля от фитофтороза подобраны условия для агробактериальной трансформации и органогенеза пробирочных растений картофеля сорта Невский. На основе полученных с использованием генно-инженерной конструкции гена пероксидазы М21334 в антисмысловой ориентации растениях картофеля обнаружена подавленная активность изоформы р/ ~ 3.5, что приводило в последующем к снижению интенсивности лигнификации растительных клеточных стенок в зоне инфицирования и повышению восприимчивости к фитофторозу. Показана ведущая роль ЖК в защитном ответе картофеля против возбудителя фитофтороза, в котором задействованы полисахарид-специфичные изопероксидазы.

Практическая значимость работы. Совокупность полученных данных расширяет современные представления о биохимических и молекулярных механизмах регуляции устойчивости растений к патогенам с участием СК и ЖК. Предложенный способ культивирования безвирусных пробирочных растений картофеля на средах, содержащих защитные соединения, может способствовать получению посадочного материала с индуцированной устойчивостью к фитофторозу. Показана возможность регламентирования применения композиций сигнальных молекул СК и ЖК в качестве средств защиты растений природного происхождения для индуцирования в растениях картофеля выработанной за длительный период эволюционного взаимодействия между хозяином и патогеном системной приобретенной и системной индуцированной устойчивости. Изопероксидазы с р/ ~ 3.5, кодируемая геном М21334, и ~ 9.3 могут быть использованы в качестве биохимических маркеров при проведении скрининга современных средств защиты растений с иммуноиндуцирующим эффектом, а также при разработке новых сортов картофеля, устойчивых к возбудителю фитофтороза и чувствительных к подобным иммуномодулирующим соединениям.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на международных конференциях «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008), "Стратегия взаимодействия микроорганзмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2008), "Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего севера" (Апатиты, 2009), «Молодежь и наука XXI» (Ульяновск, 2010), «Растения и микроорганизмы» (Казань.

2011), «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам» (Пушкин, 2012); II (X) Ботанической конференции (Санкт-Петербург, 2012). На Всероссийских конференциях «Биостимуляторы в медицине и сельском хозяйстве» (Уфа, 2010), «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2011), VI съезде общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011), «Экология: традиции и инновации» (Екатеринбург, 2012), III съезде микологов России (Москва,

2012). Результаты так же были представлены на Всероссийских 2-й и 3-ей школах-конференциях по физико-химической биологии и биотехнологии «БИОМИКА -наука XXI века» (Уфа, 2011, 2012), на зарубежных конференциях "Symbiose" (Eskisehir, 2010) и «International symposium on secondary metabolites» (Denisli, 2011).

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Поволжье 10-04-97021, государственным контрактом Министерства образования и науки № П339 по ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. и АЦВП «Развитие научного потенциала высшей школы» № 2.1.1 ./5676.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 2 статьи в журналах «Перечня ВАК» и 3 статьи в тематических сборниках зарубежного издания.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего источников. Работа изложена на 153страницах машинописного текста, иллюстрирована 6 таблицами и 29 рисунками.

Благодарности. Автор благодарит сотрудников лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Сурину О.Б., к.б.н. Черепанову Е.А., к.б.н. Бурханову Г.Ф., к.б.н. Машкова О.И., а также с.н.с. лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Б.Р. Кулуева за помощь при выполнении и обсуждении работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В экспериментах использованы пробирочные стерильные растения картофеля,

полученные методом микроклонирования из верхушечной меристемы клубней [Винклер, Бутенко, 1970]. Для физиологических исследований использован восприимчивый к фитофторозу сорт Ранняя Роза, для создания растений с подавленным синтезом пероксидазы - сорт Невский, обладающий более высоким морфогенетическим потенциалом в каллусной культуре. Растения выращивали на модифицированной среде Мурасиге-Скуга при 20-22°С в климатокамере КС-200 СПУ (Россия) с 16-ти часовым светопериодом, освещенностью 12-16 тыс. люкс. Культура оомицета P. infestans (штамм 1.2) была любезно предоставлена проф. Ю.Т. Дьяковым (МГУ), а бактериальная культура Agrobacterium tiimefaciens штамма AGLO -сотрудником лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Кулуевым Б.Р.

В опытах растения после 30 сут культивирования на средах с СК, ЖК и их композициями заражали нанесением на каждый лист по 5 мкл суспензии зооспор патогена (105 спор/мл). В экспериментах с последовательным воздействием СК и ЖК растения выращивали 30 суток на СК либо ЖК, затем на листья наносили растворы ЖК либо СК, в зависимости от варианта опыта, и через 24 часа инфицировали.

Растительные экстракты, содержащие свободно-растворимую и связанную с клеточной стенкой пероксидазы, получали согласно [Bireska и Miller, 1974]. Активность пероксидазы измеряли микрометодом [Хайруллин и др., 2001]. Изоэлектрофокусирование (ИЭФ) белков проводили с использованием 7%-ного ПААГ и 2,5% амфолитов рН 3.0-10.0 ("BioRad", США). ПААГ проявляли на пероксидазную активность в растворе 0.01% 3.3 - диаминобензидина (ДАБ) и 0.016% Н202 в 0.1 М фосфатном буфере (ФБ). Концентрацию Н202 измеряли с использованием красителя ксиленоловый оранжевый [Bindschelder et al., 2001]. Оптическую плотность измеряли на приборе Bencmark Mikroplate Reader ("BioRad", США) при 490 нм. Активность изоформ анализировали при помощи компьютерной программы TotalLab (США). Для цитохимического выявления активности пероксидаз использовали раствор ДАБ, фенольных соединений - краситель толуидиновый синий [Mellersh et al., 2002]; лигнин определяли по автофлуоресценции [Высоцкая и др.,

2011]. Исследования проводили с использованием микроскопа Axio Imager Ml ("CarlZeiss", Германия).

Тотальную РНК выделяли с помощью препарата «Тризол» согласно протоколу фирмы-поставщика (Molecular Research Center, Inc, США). Синтез кДНК проводили с использованием праймеров и фермента M-MLV обратной транскриптазы по протоколу фирмы-поставщика (Fermentas, США). Одноцепочечную кДНК использовали в реакции амплификации с праймерами к генам пероксидазы картофеля М21334, PR-1 и PR-6.

Агробактериальную трансформацию растений картофеля проводили с использованием бактерий Agrobacterium tumefaciens [Newell et al., 1991], несущих плазмиду pCambia 1305.1. «Тупые» концы плазмиды были получены с помощьюТ4-ДНК-полимеразы. Вектор был модифицирован антисенс-конструкцией фрагмента гена М21334. Оптимальные условия для трансформации и органогенеза были подобраны экспериментально, для регенерации трансформантов использовали 1,5 мг/л транс-зеатина, 0,5 мг/л ИУК и 0.1 мг/л феруловой кислоты. Экспланты после трансформации помещали на среды, содержащие 100 мкг/л гигромицина и 700 мг/л препарата «Аугментин» (GlaxoSmithKline, UK). Было получено 26 морфологически полноценных регенерантов (25% эксплантов). Регенераты размножали методом микроклонирования по методу, предложенному акад. Р.Г. Бутенко с коллегами [1982].

В работе анализировали биоматериал каждого из трех повторов одного варианта опыта. Статистическая обработка проводилась компьютерной программой Statistica 6.0 (Stat Soft).

РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Подбор оптимальной индуцирующей устойчивость к P. infestons концентрации салициловой и жасмоповон кислот для обработки растений

картофеля

Известно, что воздействие гормонов на различные процессы в растениях зависит его соотношения с другими гормонами [Denancé et al., 2013]. Поиск комбинации СК и ЖК, обладающей иммуностимулирующим эффектом на растениях картофеля выявил формирование относительной устойчивости пробирочных растений картофеля под действием комбинации сигнальных молекул - 1 цМ СК с 0,01 цМ ЖК, а также 0,1 цМ СК с 0,01 цМ ЖК. Важно при этом заметить, что наибольшей

устойчивостью к фитофторозу характеризовались пробирочные растения картофеля, испытывающие воздействие смеси I цМ СК с 0.1 |iM ЖК R -»том варианте достаточно рано (на 1-2 сут после инфицирования) наблюдаюсь появление на листьях картофеля в местах контакта со спорами P. infestons множества мелких темных точек из погибших растительных клеток, окруженных светлым кольцом. Приведенные концентрации сигнальных молекул в отдельности и в композиции были использованы для проведения дальнейших исследований.

2. Влииние салициловой н жасчоновой кислот на содержание И.О. в растении* ь'арюфе.зи в норме и при инфицировании

Так как развитие защитного ответа растений сопровождается окислительным

взрывом [Fu, Dong, 2013), проведенный нами анализ содержания перекиси водорода в тканях растений показал, что СК и ЖК как но отдельности, так и в композиции значительно повышали се уровень (рис. 1). Иод воздействием СК уровень перекиси водорода повышался на 30% относительно контроля, а в обработанных ЖК растениях - более чем двукратно при инфицировании. Максимальное накопление перекиси водорода наблюдалось как в инфицированных, так и в незараженных растениях при совместном применении СК и ЖК. Таким образом, в растениях картофеля наиболее зффектнвным соединением, индуцирующим наиболее высокий уровень перекиси водорода, является жасмоновая кислота

Рис I. Концентрация Н>0; в растениях картофеля под воздействием СК и ЖК и через 48 часов после инфицирования.

1 - контроль; 2 - контроль+ P. infestons: 3 - СК; 4 - СК + P. infestons; 5 - ЖК; 6 - ЖК + P. infestons: 7 - СК/ЖК; 8 - СКОКК + P.infestans.

" v ' 12 3 4 S 6 7 I

Согласно исследованиям Mur с коллегами [2008], совместная обработка растений СК и ЖК в малых концентрациях так же приводила к увеличению содержания перекиси водорода, большему, чем в случае применения »тих соединений в отдельности. Исходя из полученных нами данных, можно предположить, что

I"

I 2,0

§1.5

§■1,0

¡0.5 ,<3 nJ_

именно присутствие ЖК как в отдельности, так и в комбинации с СК, способствовало более интенсивному накоплению перекиси водорода. Известно, что трансгснный картофель, в котором была увеличена продукция перекиси водорода, обладал большей устойчивостью к Р. т/езіапз, чем растения дикого тина [\*'и а а1., 1995), что согласуется с нашими данными о снижении площади поражений на листьях в вариантах, где концентрация перекиси водорода была высока даже в отсутствие инфицирования.

Рис. 2. Активность свободно-растворимых (а), ионно-связаниых (б) и ковалентно-связанных (в) с клеточной стенкой пероксилаз в растениях картофеля иод воздействием СК и ЖК и через 48 часов после инфицирования P. infestons.

1- контроль; 2 - контроль* P. infestons; 3 - СК; 4 - СК + Р infestons: 5 - ЖК: 6 - ЖК + P. infestons; 7 - СК/ЖК; 8 - СК/ЖК + Р infestons.

3. Влияние салициловой и жисчоновпй кислот на щоферчпмный спектр

каршфелн в норме и при инфицировании Р. infestans Перекись водорода используется пероксидазачи в реакциях, приводящих к синтезу лигнина [Almagro et al.. 2009]. Под воздействием СК и ЖК активность псроксидазы в свободно-растворимой фракции возрастала, а воздействие ЖК увеличивало ее так же в ионно- и ковалснтно-связанных с клеточными стенками растений фракциях (рис. 2). Псроксидазы растений характеризуются широким спектром изоформ [Passardi, 2005]. ряд из которых обладает способностью сяязывагься с полисахаридами без потери каталитической активности (Максимов и др.. 2005; Pchcnichnov ct al.. 2011]. Нами было выявлено, что с хитином связывались анионные изопсроксилазы картофеля с р/~ 3.5. — 3.7 и катионные с р/~ 8,8 и - 9.3. На препарате целлюлозо-глюканового комплекса клеточных стенок мицелия оомииета

Р. infestans сорбировалась иэоформа с р/ - 9.3 (рис. 3).

Рис. 3. Многообразие изопсроксилаз картофеля и их сродство к хитину (А) и клеточным сгснкам оомицета Р. tnfestans (Б):

1 - ис связавшиеся нзоформы;

2 - изоформы. элюнроваиные I М NaCI;

3 - грубый экстракт; М - маркер.

Анализ изменения нзоферментного с иск фа псроксилаз картофеля н свободно-растворимой фракции белков выявил, что инфицирование индуцировало активности обладающих сродством к полисахаридам клеточной стенки оомииста Р. іп/ехіап.ч и хитину изопсроксилаз с с р/ - 9.3 (рис. 4 а), а также конститутивно синтезирующихся изоформ с р/ - 3.5 и 3.7. (рис. 46). Важно заметить, что если в коїггрольньїх неинфикированных растениях изонсроксилаза с р/ ~ 9.3 не проявлялась, то инфицирование и добавление в среду культивирования ЖК способствовали ее активации. В то же время СК таким эффектом не обладала. Важно подчеркнуть, что цитологические исследования показати наличие пероксилазной активности на поверхности инфекционных гиф возбудителя фитофтороза (рис. 4 а). Мицелий Р іп/сзіапх. выросший на питательной среде, не обнаруживал соответствующей окраски, Аиатиз изоферментного состава пероксидаз показал, что наряду с катонными, в растениях на инфицирование и воздействие сигнальных молекул активно реагируют конститутивно синтезирующиеся связывающиеся с хитином анионные изоформы с р/ - 3.5 и р/ - 3.7. В инфицированных растениях картофеля, растущих на среде с добавлением смеси СК и ЖК. активності, анионных изоформ была выше, чем в вариантах с использованием СК и ЖК в отдельности (рис. 4 б). Причем, как видно, іти изопероксилазы были более чувствительны к воздействию ЖК. чем СК. Кроме тою, нами в этом эксперименте практически не обнаружено интерферирующего эффекта в изменении активности изопсроксилаз в условиях совместного использования СК и ЖК.

Рис. 4. Влияние СК и ЖК на активность катионной (а) и анионной (б) части изоферментного спектра пероксилаз картофеля в норме и через 48 часов после инфицирования и их концентрирование на поверхности гиф P. infestons. I- контроль; 2 - контролы- P. infestons-, 3 - СК; 4 - СК + P. infestons; 5 - ЖК; 6 - ЖК + Р, infestons; 7 - СК/ЖК; 8 - СК/ЖК + Р infestons. Отмечена полисахарил-спсиифичная псроксидаза с р/~ 9.3.

Полученные данные свидетельствуют в пользу, с олной стороны, определяющей роли ЖК в передаче сигнала при регуляции активности изонероксидаз картофеля с р/ - 3.5, ~ 3.7 и - 9.3., а с другой - о взаимном аддитивном эффекте изученных соединений на активность как анионных, так и катионных изопероксидаз.

4. Локализация пероксилаз, накопление фенольнмх соединений и лигнина в листьях инфицированных рас1сннй пол влиянием СК и ЖК

Согласно литературным данным, в развитии локального иммунитета важную

роль играют псроксилазы. Так, P. Bolwcll с коллегами [2001] показали, что пероксидазы выявляются в межклеточных пространствах вблизи инфекционного сайта, что коррелирует сокращением размера нскротизированных участков на листьях фасоли, инфнцнрованых Colletotrichum hndemuthianum.

Как видно из рис. 5, накопление фенольных соединений, лигнина и активация псроксилазы. происходящие в зоне замыкающих клеток устьиц, свидетельствуют об усилении защитных процессов именно в местах, где происходит преимущественное проникновение патогена P. infestons в ткани листа картофеля (Морозов, 1987, Kamoun et al.. 2000].

Рис. 5. Локализация лигнина вокруг некротизированного участка (а), лигнина (б), псроксилазной активности (в) и фенольных соединений (г) в зоне замыкающих клеток устьиц на листьях инфицированных растений (48 часов после инфицирования).

Как нами было показано ранее. ЖК траст ключевую роль в активации пероксидаз клеточных стенок, а СК - в накоплении фенольных соединений, в том числе - необходимых для синтеза лигнина [Сорокань и др., 201IJ. Таким образом, следует предположить, что для эффективной лигнификании пораженных тканей необходимо действие двух этих антистрессовых гормонов.

5. Изменение уровня мРНК заннпнмх генов картофеля пол влиянием салициловой и жаемоновой кислот

В работах Roberts с« al.. [I988J путем пептидного секвснировання была

I выявлена нуклеотидная последовательность гена, кодирующего чувствительную к поранению июпероксидазу картофеля М21334. Ранее нами были подобраны нраймеры к относительно вариабельной юне гена М.71334. близкой по структуре к фрагменту генов изопсроксидаз из других растений, кодирующих полисахарид-специфичный сайг [Максимов и лр.. 2010]. Анализ содержания гранскриптов гена WI334 в растениях картофеля, подвергнутых инфицированию и обработке СК и ЖК выявил, что при инфицировании P. infestans их уровень значительно возрастал (рис. 6).

В инфицированных растениях картофеля, обработанных СК или ЖК, интенсивность транскрипции гена M2I334 значительно превышала показатели в инфицированных контрольных растениях. При совместном применении СК и ЖК а также использование ЖК после СК значительно увеличивало содержание мРНК гена M2I334.

Рис. 6. Воздействие 1 цМ СК (3. 4) и 0.1 цМ ЖК (5. 6). их смеси (7. 8) и последовательною использования (9-12) на содержание мРНК генов, кодирующих нсроксидазу M2I334. белки PR-I и PR-6 в здоровых и инфицированных фитофторозом растениях каргофеля (48 часов после инфицирования):

1 - необработанный »«.-зараженный контроль; 2 - инфицирование Р infestons: 3 - обработка СК; 4 - обработка СК + P. infestons; 5 - обработка ЖК; 6 - обработка ЖК + Р infestons: 7 - обработка смесью СК и ЖК; 8 - обработка смесью СК и ЖК + P. infestons: 9 - «ЖК после СК»; 10 - «ЖК после СК» + P. infestonr, 11 - «СК после ЖК»; 12 -«СК после ЖК» + P. infestons. Цифрами указана нормализованная относительно активности гена актина транскрипционная активность генов в % от контроля.

Последовательное применение СК после ЖК снижало содержание транскрнптов гена М21334, что предполагает формирование интерференции между сигнальными путями запуска экспрессии гена в этом случае (рис. 6). Важно, что в вариантах с наибольшей активностью гена наблюдалось наименьшее развитие симптомов фитофтороза и, наоборот, в растениях, где активность гена была наименьшей, степень развития болезни была наибольшей.

Известно, что в растениях обработка СК и ЖК запускает стандартные и специфические пути формирования зашитого ответа, что впоследствии может определять их устойчивость к патогену [Pictcrsc. 2012]. В связи с этим была проведена серия экспериментов, где анализировали дополнительно содержание мРНК генов, колирующих защитные белки PR-1 и PR-6. проявляющих себя как соответствующие маркеры СК и ЖК индуцируемых сигнальных путей развития системной приобретенной или системной индуцированной устойчивости.

В контрольных растениях картофеля накопления транскрнптов гена, кодирующего белок PR-1, не происходило (рис. 6). Активация этого процесса наблюдалась при инфицировании растений, а так же пол воздействием СК.

Интересно, что в варианте с одновременным применением СК и ЖК содержание транскриптов гена /'Л-/ была выше, по сравнению с другими вариантами опыта, но только в инфицированных растениях. При использовании ЖК после СК транскриптов этого гена в анализированном после электрофореза геле практически не наблюдаюсь, как в нсинфицированных, так инфицированных растениях. П то же врем*, при применении СК после ЖК напротив, содержание транскриптов тгого гена было высоким в инфицированных растениях.

выявлено почти двукратное повышение содержания мРНК гена ГК-6 пол действием ЖК как в нсинфицированных. так и в инфицированных растениях. Присутствие в среде культивирования СК приводило к повышению содержания мРНК гена 1'К-6 только в зараженных спорами Р. /п/смап* растениях картофеля. Полненные данные предполагают, что развитие защитных реакций картофеля против этого патогена связано со способностью растений в условиях инфицирования синтезировать ЖК и через »таг механизм усиливать активность транскрипции гена РК-б. Интересно, что одновременное воздействие ЖК и СК вызывало более значительное накопление его транскриптов. чем ЖК в отдельности. Как и следовало ожилать. предварительная обработка растений СК не препятствовала высокому содержанию транскриптов гена РЯ-6 в растениях, впоследствии обработанных ЖК, чего не происходило при использовании СК лля обработки растений, длительно испытывающих воздействие ЖК. В варианте с обработкой СК после ЖК транскринты гена Рй-6 не проявлялись как в нсинфицированных. так и в инфицированных растениях, что предполагает негативный с&тииилатный контроль над жспрсссисй этого гена, точно также как и гена М21334.

ИЭФ псроксилат картофеля, проведенное на 2 сутки после инфицирования, продемонстрировало, что активность патоген-чувствительных итоформ с р/ - 3.5 и ~ 3.7 коррелировала с содержанием транскриптов гена М21334, и, как было показано ранее (рис. 4 б), была максимальна в случае длительного совместного воздействия СК и ЖК в инфицированных растениях. В растениях варианта «ЖК после СК» активность рассматриваемых изоформ была соизмерима с этим показателем в последнем случае (рис. 7). Обработка «СК после ЖК». напротив, препятствовала увеличению активности двух анионных пероксидаз - и в нсинфицированных. и в

инфицированных растениях этот показатель оставался на уровне неинфинированных и необработанных СК и ЖК контрольных растений. 400

-3.5 -3.7 -4.2

Рис. 7. Влияние последовательной обработки СК и ЖК на активность пероксидаз анионной часта спектра в норме и череп 48 часов после инфицирования: 1 - контроль; 2-Я ¡п/езшпг, 3 - «ЖК после СК»; 4 - «ЖК после СК» + Р. ¡п/е*1апг. 5 - «СК после ЖК»; 6 - «СК после ЖК» + Р. т/езшт.

Таким образом, следует предположить, что ведущую роль в регуляции активности анионной псроксидазы играет ЖК. При этом данный механизм зашиты представляется весьма важным, так как снижение се активности коррелировало со снижением устойчивости картофеля к фитофторозу. Чтобы подтвердить эт> гипотезу, мы провели работы по получению растений картофеля, несущих антисенс-конструкцию гена псроксидазы М21334.

6. Исследование морфою!о-физиоло!нчсской роли полисахарид-спспнфнчных пероксидаз картофеля при помощи антисенс-конструкний ф|>шмси1я | сна .421334

Наиболее эффективным методом идентификации продуктов определенных

генов может быть создание трансгснных растений, гнперсинтезируюших конкретные псроксидазы или, наоборот, содержащие нокаут-фрагменты [Hcgglc « а!.. 2005; ВтсксЬиИет с1 а!.. 2006].

Основываясь на имеющихся данных о возможности изучения роли того или иного гена в морфолого-физиологичсских процессах в растении с помощью антисмысловых РНК. мы получили генно-инженерную конструкцию гена Ш1334, содержащую последовательность, предположительно кодирующую полнеахарид-сязываюший домен одной из изопсроксидаз картофеля (рис. 8).

16

№01(1)

СвМУМБ промотор Стярт трмкляпии

СаМУЖ промотор с ■шхянссром

I шромиинн (И)

рСапЫа 1305.1 11824 Ьр

•VI (195) МШ4 «пПкшг

кояои трансляции Ро1уА сигнал

канампипн (И)"

200 пн.

Рис. 8. Клонирование фрагмент гена перокенлазм М21334 картофеля и "аитисмысловой" ориентации в векторе рСатЫа 1305.1. Кш - ген устойчивости к каначицину; 355 промотор - промотор вируса мозаики цветной капусты; промотор ВМГ - промотор вируса мозаики георгина; вша!. ВашН1. ХЬа1 - сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции. ро1уА - сайт полиаленилнрования.

После сокультивапии с агробактернями. несущими целевую антисснс-

конструкцию, нами было получено 26 регенерантов. жизнеспособных и не имеющих

морфологических отклонений. Растения были размножены метолом

микрочеренковання и в полученных клонах был проведен анализ транскрипции гена

пероксидазы М21334 и его антисснс-конструкции (рис. 8 б). Было показано.

количество транскршггов этого гена в трансформированных растениях сравнимо с

данным показателем в растениях дикого типа. Использование нраймеров.

подобранных к антисенс-послсдовательности гена М21334, внедренной в геном

растений, подтвердило, что в растениях дикого типа транскрипция этой

последовательности отсутствует. В трансформированных же растениях клона № 4

(4р) наблюдалась его максимальная транскрипционная активность. Данная линия

показала также наибольшее снижение активности анионной пероксидазы с />1~3.5

(рис. 9 а). Итак, при использовании антисенс-технодогин нами показано, что

17

индуиируюшаяс* при поранснснии изопероксидаза [Roberts et al.. 1988] является анионной изоформой. отвечающей на инфицирование возбудителем фитофтороза и облачающей высокой чувствительностью к воздействию ЖК.

литиссис-кписчл к ни«

а — 6 Z1JJ4 ■сна M2IJ34

✓ * _ wt 4р «1 'п

з ■ ШЩ ■■VI ■ V І

5 1 ШЯІ 1

I

М

Рис. 9. а: Изменение активности изоферментов псроксилаз в трансформированных растениях картофеля, - несущих антмсенс-коиструкцию участка гена

^ *** псроксидазы картофеля ШІ334. б: накопление транскриптов ієна А121334 и его антисенс- конструкции в растениях картофеля дикогх> типа (№0 и растсниях-рсгенераиіач после сокультивании с Л тте/асіею (4р). 1- контроль 2 - растения-регенераиты без целевой генно-инженерной конструкции; 3 - растения-регенеранты с аіггисенс генно-инженерной конструкцией , , ИР)-

В последующем мы проанализировали развитие симптомов фитофтороза на листьях растений клона 4р. На 10 сутки после инфицирования различия между двумя вариантами были наиболее заметны - так. максимальные повреждение контрольных растений составляло до 50% площади листовой пластинки, а листья трансформированных растений были практически полностью некротизированы (рис. 10).

По-видимому, столь заметное снижение устойчивости к фитофторозу растений картофеля, несущих аитисснс-конструкцию гена Ш1334. объясняется недостаточным накоплением псроксилаз в клеточных стенках в местах внедрения патогена Так. из рис. II видно, что окрашивание диаминобензидином (ДЛБ). выявляющее пероксилазную активность, наблюдается на участках, занимающих более 20 клеток эпидермиса вокруг устьиц, через которые происходит проникновение патогена в ткани. В то же время, на листьях трансформированных растений интенсивное ДЛБ -окрашивание отмечается в нескольких прилегающих к устьицам клетках, либо -довольно слабое только в замыкающих клетках устьиц.

vmviveM'IIM

Рис. 10. Развитие фитофтороза на листьях картофеля дикого типа (WT) и несущих антнсенс-конструкцию гена исроксидаэы M2I334 на 10 сутки после инфицирования.

Рис. II. Накопление псроксилазы в листьях контрольных (а) и трансформированных растений картофеля со сниженной активностью пероксилазы М21334 (б) через 48 часов посте инфицирования возбудителем фитофтороза.

Присутствие перокендаз необходимо для полимеризации монолнгнолов в молекулу лигнина [Blee et al„ 2003]. Цитохимические исследования показати. что в листьях инфицированных возбудителем фитофтороза трансформированных растений фенольные соединения, к которым относятся, в том числе, и мономеры лигнина, аккумулируются в той же степени, что и в инфицированных листьях картофеля дикого типа (рис. 12 а. б), так же определяясь в замыкающих устьичных клетках. Однако накопление лиг нина в клеточных стенках трансформированных растений при инфицировании происходит менее интенсивно (рис. 12 в, г), что. вероятно, объясняется отсутствием пероксилазы M2I334 с р/-3.5, катализирующей этот процесс, что позволяет считать се ключевой функцией участие в синтезе лигнина Так как недостаток активности изопсроксилазы М21334 с р/~3.5, как показано, в трансгенных растениях приводит к столь драматическому снижению устойчивости растений к фитофторозу, а в растениях картофеля дикого типа экспрессия этой

19

изоформы регулируете» ЖК. следует признать ведущую роль зтого соединении в устойчивости картофеля к фитофторозу.

т - ■ а

а я

Рис. 12. Накопление фенольных соединений (а. б) и синтез лигнина (в, г) в листьях картофеля через 48 часов после инфицирования контрольных (а. в) и трансформированных растений (б. г).

Таким образом, в нашей работе выявлена возможность применения

композиции ЖК и СК для индуцирования устойчивости растений. Путем внедрения в растения картофеля актисеис-конструкции гена А121334 было показано, что он кодирует анионную псроксидазу с р/~3.5. Сайлснсинг зтого гена вызывает существенное снижение устойчивости картофеля к фитофторозу из-за нарушения развития механического барьера на пути проникновения патогена.

ВЫВОДЫ

1. Показана эффективность применения салициловой и жасмоновой кислот в защите растений картофеля от фитофтороза при одновременном применении, однако салициловая кислота оказывает негативное действие на защитные реакции растений, длительно испытывающих воздействие жасмоновой кислоты.

2. Цитохимические исследования показали, что салициловая и жасмоновая кислоты увеличивают локальную активность пероксилаз. фенольных соединений и лигнина в месте инфицирования.

3. Выявлено, 'по псроксидазы картофеля с р/ - 3.5, - 3.7, ~ 8.8 и - 9.3 являются хитин-специфичными, изопсроксилаза с р/ - 9.3 способна связываться и с клеточными стенками мицелия Р. т/емапх.

4. Обнаружено, что жасмоиовая кислота как в отдельности, так и в комбинации с салициловой кислотой стимулирует накопление в инфицированных растениях перокенла

20

водорода и активирует изопероксидазу с р/ ~ 9.3, индуцирующуюся при инфицировании и проявляющую сродство к хитину и клеточным стенкам возбудителя фитофтороза.

5. Выявлено, что важный вклад в проявление протекторного действия ЖК на растениях картофеля вносит ее способность индуцировать экспрессию анионной хитин-специфичной пероксидазы с р/~ 3.5.

6. Показано подавление активности анионной изо пероксидазы с р/ ~ 3.5 по механизму РНК-сайленсинга.с использованием полученных в работе трансгенных растений картофеля, содержащих антисмысловую конструкцию гена М21334.

7. Обнаружено, что активное развитие возбудителя фитофтороза P. infestans на растениях картофеля с подавленной активностью анионной пероксидазы связано с недостаточной лигнификацией клеточных стенок в местах внедрения патогена, что указывает на ключевую роль этого фермента в защите картофеля от данного патогена

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Максимов, И.В. Влияние салициловой и жасмоновой кислот на компоненты про-/антиоксидантной системы картофеля при фитофторозе / И.В. Максимов, А.В. Сорокань, Е.А. Черепанова, О.Б. Сурина, Н.Б. Трошина, Л.Г. Яруллина // Физиология растений. 2011. Т. 57. № 2. С. 299 - 306.

2. Максимов, И.В. Структурно - функциональные особенности изопероксидаз растений / И.В. Максимов, Е.А. Черепанова, Г. Ф. Бурханова, А.В. Сорокань, О.И. Кузьмина// Биохимия. 2011. Т. 76, вып. 6. С. 749-763.

Статьи в коллективных монографиях

3. Sorokan', А. V. The interplay between salicylic and jasmonic acid during phytopathogenesis / A. V. Sorokan, G. F. Burkhanova, I. V. Maksimov // Salycilic acid: a plant hormone. Eds. S. Hayat. Springer-Verlag. Berlin. Heidelberg. 2013. P. 277-297.

4. Maksimov, I.V. Polysaccharide-specific isoperoxidases as an important component of the Plant Defence System / I.V. Maksimov, E.A. Cherepanova, A.V. Sorokan' // Products and applications ofbiopolymers. InTech. Rijeka. 2012. P. 201-220.

5. Sorokan' A.V., Maksimov I.V. Plant Peroxidases: Functions and Regulation during Pathogenesis / A.V. Sorokan', I.V. Maksimov // Peroxidases: Biochemical Characteristics, Functions and Potential Applications. Eds. Bogaert L„ Coppens N. Nova Publishers. 2013. ISBN: 978-1-62808-262-3. P. 55-74.

Публикации в других изданиях

6. Maksimov, I.V. Effects of salicylic and jasmonic acids on the phenolic compounds accumulation in potato plants infected with late blight / I.V. Maksimov, Sorokan A.V., Troshina N.B., Surina O.B. // Abstract book of Internet symp. on secondary metabolites.

Denisli, Turkey. 201 LP. 49.

7. Burchanova, G.F. Salicylic acid and jasmonic acid-depending signaling pathways regulation of potato plant resistance to Phytophthora infestans (Mont.) de Bary / G.F. Burchanova, A. V. Sorokan, I. V. Maksimov // Abstract book of conference "Symbiose".

Eskisehir. 2010. P. 20-22.

8. Сорокань, A.B. Полисахарид-специфичные пероксидазы в регуляции устойчивости картофеля к возбудителю фитофтороза / А.В. Сорокань, Г.Ф. Бурханова, Е.А. Черепанова, И.В. Максимов // Мат. XVII молодежной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии». Сыктывкар. 2011. С. 267-269.

9. Сорокань, А. В.Регуляция устойчивости картофеля к возбудителю фитофтороза Phytophthora infestans (Mont) de Вагу салициловой и жасмоновой кислотами / А. В. Сорокань, А. Ш. Валеев, Н. Б. Трошина, И. В. Максимов // Вестник уральской медицинской академической науки (тематический выпуск по микробиологии, иммунологии и биотехнологии). 2011. № 4/1 (38). С. 117-118.

10. Сорокань, А.В. Совместные культуры как модель для изучения взаимоотношений растение-патоген. Современные методы и подходы в биологии и экологии» / А.В. Сорокань, И.В. Максимов // Аграрная Россия, 2009. спец выпуск. С. 9.

11. Максимов, И.В. Регуляция системной устойчивости растений картофеля к возбудителю фитофтороза под влиянием эндофитной бактерии Bacillus subtilis 26Д и сигнальных молекул / И.В. Максимов, P.P. Абизгильдина, А.В. Сорокань, Г.Ф. Бурханова // Сборник трудов 1-ой Международной интернет - конф. «Растения и микроорганизмы». Казань. 2011. С. 82 - 87.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода; ДАВ - диаминобензидин; ЖК -жасмоновая кислота; ИЭФ - изоэлекто-фокусирование; ПААГ - полиакриламидный гель; СВЧ - сверхчувствительная реакция; СК - салициловая кислота; ФБ -фосфатный буфер; р/- изоэлектрическая точка.

Отпечатано с готовых диапозитивов на собственной полиграфической базе ИСЭИ УНЦ РАН 450054, РБ, г. Уфа, пр. Октября, 71 Тел: (8-347) 235-55-33, факс: (8-347) 235-55-44 Заказ № 15. Подписано в печать 17.10.2013 г. Формат 60x84,1/16. Бумага типа «Снегурочка» Гарнитура «Times». Усл. печ. л. 0,98 Уч.-изд. л. 01,44 Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сорокань, Антонина Вячеславовна, Уфа

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

СОРОКАНЬ АНТОНИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

РЕГУЛЯЦИЯ УСТОЙЧИВОСТИ КАРТОФЕЛЯ К ВОЗБУДИТЕЛЮ ФИТОФТОРОЗА Phytophthora infestons (MONT.) DE BARY САЛИЦИЛОВОЙ И ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТАМИ

03.01.04. - Биохимия

ю

"fr со СО т-

со s

СМ

О т

СМ £

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение 6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13

1.1. Сигнальная регуляция системной устойчивости растений к патогенам 13

1.1.1. Индукция салициловой кислотой системной приобретенной устойчивости 14

1.1.2. Участие жасмоновой кислоты в регуляции системной индуцированной устойчивости 19

1.2. Взаимодействие защитных путей, индуцируемых салициловой и жасмоновой кислотами 26

1.3. Пероксидазы в защитных реакциях растений 36

1.3.1. Особенности свойств и функций анионных пероксидаз 42

1.3.2. Хитин-специфичные пероксидазы 44 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Г ЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 48

2.1. Объекты исследований 48

2.2. Условия проведения опытов 51

2.3. Биохимические методы 52

2.3.1. Определение активности пероксидазы в растениях 54

2.3.2. Измерение концентрации П202 54

2.3.3. Колориметрический метод определения белка по Bradford 55

2.3.4. Изоэлектрическое фокусирование белков 55

2.3.5. Выделение изопероксидаз, специфичных к полисахаридам клеточных стенок грибов 56

2.4. Цитохимические исследования 57

2.5. Молекулярно-биологические методы 57 2.5.1. Выделение и очистка РНК из растений 57

2.5.2. Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе 58

2.5.3. Реакция обратной транскрипцонной ПЦР на основе матричной РНК и полуколичественный анализ экспрессии гена пероксидазы 60

2.5.4. Полимеразная цепная реакция ДНК 61

2.5.5. Электрофорез ДНК и РНК в агарозных и полиакриламидных гелях 61

2.5.6. Выделение гшазмидной ДНК щелочным методом 62

2.5.7. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 63

2.6. Получение трансгенных растений картофеля с подавленной экспрессией гена пероксидазы М21334 63

2.6.1. Трансформация бактерий Agrobacterium tumefaciens плазмидой, содержащей антисенс-конструкцига гена пероксидазы 63 М21334

2.6.2. Трансформации растений картофеля гено-можифицированными агробакгериями A. tumefaciens 64

2.7. Статистическая обработка результатов 66

2.8. Реактивы 66

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ 69

3.1. Подбор оптимальной индуцирующей устойчивость к Р. infestans концентрации СК и ЖК для обработки растений картофеля 69

3.2. Влияние СК и ЖК на компоненты про-/ангиоксидантной системы растений картофеля инфицированных возбудителем фитофтороза 77

3.2.1. Влияние СК и ЖК на концентрацию перекиси водорода в пробирочных растениях картофеля в норме и при инфицировании 77

3.2.2. Влияние СК и ЖК на активность пероксидаз в различных

фракциях белков картофеля 80

3.2.3. Влияние СК и ЖК на изоферментный спектр картофеля в норме и при инфицировании Р. 'т/ез1ат 84

3.3. Транскрипционая активность генов защитных белков под влиянием СК и ЖК в норме и при патогенезе 90

3.3.1. Анализ активности транскрипции гена М21334, кодирующего пероксидазу картофеля 90

3.3.2. Влияние СК и ЖК на транскрипционную активность генов, кодирующих белки РИЛ и РК-6 картофеля 93

3.4. Влияние последовательности обработки на взаимодействие растений СК- и ЖК- индуцируемых путей при развитии защитных реакций картофеля против возбудителя фитофтороза 96

3.5. Локализация пероксидаз, накопление фенольных соединений и лигнина в листьях инфицированных пробирочных растений под влиянием СК, ЖК и их композиции 102

3.6. Исследование морфолого-физиологической роли анионных пероксидаз картофеля при помощи антисенс-конструкций гена М21334 108

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 118

ВЫВОДЫ 122

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 124

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

ДАБ - диаминобензидин

ЖК - жасмоновая кислота

И ЭФ - изозлектофокусирование

МС - среда Мурасиге-Скуга

ПААГ - полиакриламидный гель

НЦР - полимеразная цепная реакция

СВЧ - сверхчувствительная реакция

СК - салициловая кислота

СПУ - системная приобетенпая устойчивость

ФБ - фосфатный буфер

рТ - изоэлектрическая точка

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследований. Современные интенсивные технологии сельского хозяйства требуют эффективных способов защиты растений от повреждений патогенами. Химические средства защиты растений в основной массе являются одними из опаснейших поллютантов, кроме того, в популяциях патогенов идет отбор наиболее резистентных к ним форм, что приводит к потере их эффективности. Поэтому поиск альтернативных, экологически чистых путей решения проблемы защиты растений, направленных не на уничтожение биологического разнообразия агроценоза, а на биохимическую регуляцию иммунного потенциала растений и формирование целевой устойчивости к патогенам является актуальной задачей. В литературе широко обсуждается участие салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислот в механизмах системной устойчивости, однако многие данные крайне противоречивы |Р1е1егзе, 2012; 11оЬег1-8еша1нг, 2011; Оепапсе е1 а!., 2013]. Считается, что СК индуцирует в растениях биохимические процессы, приводящие к устойчивость против биотрофных патогенов, а ЖК - против фитофагов и некротрофов [Р1е1ег.че, 2012]. Неоднократно отмечалось, что эги соединения, индуцируя соответствующие сигнальные пути, способны подавлять защитноое действие друг друга, что выражается в подавлении устойчивости растений к патогенам, связанном с отсутствием патоген-специфической экспрессии всего спектра генов,

кодирующих защитные белки, либо только CK- или ЖК- зависимых генов [Boatwright et al., 2013].

Возбудитель фитофтороза картофеля - Phytophthora infestons, являясь гемибиотрофным паразитом, сочетает в своем жизненном цикле биотрофную и некротрофную стратегии патогенеза. Следовательно, растения для своей защиты от этого патогена должны комбинировать защитные стратегии. Следует задаться вопросом, возможна ли в этих условиях одновременная активация CK- и ЖК- индуцируемых защитных реакций, в том числе -связанных с окислительным взрывом и активностью оксидоредуктаз?

Пероксидазы представляют собой обширное семейство белков, различающихся по спектру окисляемых субстратов и роли в онтогенезе, что связано с многообразием их молекулярных форм. Это требует от исследователей идентификации физиологических функций отдельных изоформ этого фермента [Cosio, Dunand, 2009; Mathe et al., 2010]. Например, в отношении ряда изопероксидаз, в особенности анионных, выдвигаются предположения об их причастности к формированию устойчивости растений к патогенам [Dowd, Lagrimini, 2006; Maksimov et al., 2011 ; Van Loon, 2006].

Цель исследования: выявление сигнальной роли салициловой и жасмоновой кислот в регуляции защитного ответа растений картофеля в ответ на инфицирование возбудителем фитофтороза P. infestans, связанного с системой про-/анти-оксидантного статуса.

Задачи исследований:

1) Изучить вклад салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислот в формирование устойчивости растений картофеля к фитофторозу;

2) Оценить характер изменения содержания перекиси водорода и активности пероксидаз в растениях картофеля под влиянием СК, ЖК и инфицирования;

3) Провести анализ локализации лигнина, фенольных соединений и активности пероксидаз в обработанных СК и ЖК растениях картофеля в ходе инфицирования;

4) Выявить в растениях картофеля изопсроксидазы, взаимодействующие с хитином и полисахаридами клеточных стенок возбудителя фигофтороза;

5) Изучить транскрипционную активность генов картофеля, кодирующих пероксидазу М21334, белки РК-1 и РЯ-6 в качестве маркеров салицилат- и жасмонат- индуцируемых защитных реакций;

6) Для оценки роли изоиероксидазы М21334 в защите растений картофеля о г фитофтороза создать растения с подавленной экспрессией ее гена.

Научная новизна. Выявлено, что одновременное совместное воздействие салициловой и жасмоновой кислот увеличивает устойчивость растений картофеля к фитофторозу, повышая активность пероксидаз, усиливая накопление активных форм кислорода и интенсифицируя отложение фенольных соединений и лигнина в тканях инфицированных

растений. Тогда как при последовательном применении СК после ЖК, напротив, прослеживается значительное подавление транскрипции защитных белков - изоиероксидазы М21334 и ингибитора протеиназ (РЯ-6), что ведет к восприимчивости растений к возбудителю фитофтороза. Впервые определены полисахарид-специфичные изоиероксидазы картофеля с изоэлектрическими точками (р/) ~ 3.5, - 3.7 и ~ 9.3, активирующиеся при инфицировании и под действием ЖК. Для оценки роли изоиероксидазы М21334 в защите растений картофеля от фитофтороза подобраны условия для агробактериальной трансформации и органогенеза пробирочных растений картофеля сорта Невский. На основе полученных с использованием генно-инженерной конструкции гена пероксидазы М21334 в антисмысловой ориентации растениях картофеля обнаружена подавленная активность изоформы р/ ~ 3.5, что приводило в последующем к снижению интенсивности лигнификации растительных клеточных стенок в зоне инфицирования и повышению восприимчивости к фитофторозу. Показана ведущая роль ЖК в защитном ответе картофеля против возбудителя фитофтороза, в котором задействованы полисахарид-специфичные изоиероксидазы.

Практическая значимость работы. Совокупность полученных данных расширяет современные представления о биохимических и молекулярных механизмах регуляции устойчивости растений к патогенам с участием СК и ЖК. Предложенный способ культивирования безвирусных

пробирочных растений картофеля на средах, содержащих защитные соединения, может способствовать получению посадочного материала с индуцированной устойчивостью к фитофторозу. Показана возможность регламентирования применения композиций сигнальных молекул СК и ЖК в качестве средств защиты растений природного происхождения для индуцирования в растениях картофеля выработанной за длительный период эволюционного взаимодействия между хозяином и патогеном системной приобретенной и системной индуцированной устойчивости. Изопероксидазы с р/ ~ 3.5, кодируемая геном М2/334, и ~ 9.3 могут быть использованы в качестве биохимических маркеров при проведении скрининга современных средств защиты растений с иммуноиндуцирующим эффектом, а также при разработке новых сортов картофеля, устойчивых к возбудителю фитофтороза и чувствительных к подобным иммуномодулирующим соединениям.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на международных конференциях «Биология - наука XXI века» (Пущипо, 2008), "Стратегия взаимодействия микроорганзмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2008), "Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего севера" (Апатиты, 2009), «Молодежь и наука XXI» (Ульяновск, 2010), «Растения и микроорганизмы» (Казань. 2011), «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам» (Пушкин, 2012); II (X) Ботанической конференции (Санкт-Петербург, 2012). На Всероссийских конференциях

«Биостимуляторы в медицине и сельском хозяйстве» (Уфа, 2010), «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2011), VI съезде общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011), «Экология: традиции и инновации» (Екатеринбург, 2012), III съезде микологов России (Москва, 2012). Результаты так же были представлены на Всероссийских 2-й и 3-ей школах-конференциях по физико-химической биологии и биотехнологии «БИОМИКА - наука XXI века» (Уфа, 2011, 2012), на зарубежных конференциях ''Symbiose" (Eskiçehir, 2010) и «International symposium on secondary metabolites» (Denisli, 201 1).

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Поволжье 10-04-97021, государственным контрактом Министерства образования и науки № Г1339 но ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. и ЛЦВП «Развитие научного потенциала высшей школы» № 2.1.1 ./5676.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 2 статьи в журналах «Перечня ВАК» и 3 статьи в тематических сборниках зарубежного издания.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего источников. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, иллюстрирована 6 таблицами и 28 рисунками.

Благодарности. Автор благодарит сотрудников лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Сурину О.Б., к.б.н. Черепанову Г.А., к.б.н. Бурханову Г.Ф., к.б.н. Машкова О.И., а также с.н.с. лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Б.Р. Кулуева за помощь при выполнении и обсуждении работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Сигнальная регуляция системной устойчивости растений к

патогенам

Устойчивость растения к патогену определяется его конститутивными признаками, а так же способностью распознать и своевременно включить механизм защиты. Активные механизмы этой устойчивости чаще всего связаны с изменениями в спектре экспрессируемых генов, кодирующих белки, обеспечивающие защиту от патогенов [1£1 I ladrami, 2012J.

В растениях может происходить индукция устойчивости к патогенам, различающимся по происхождению, причем как в месте проникновения инфекции (локальный ответ), так и в местах, удаленных от него (системная устойчивость). Формирование системной усюйчивости связано с продукцией в месте поражения сигнальных молекул, которые способны транспортироваться по тканям и стимулировать в них иммунитет. Впервые термин системная приобретенная устойчивость (CI1У или SAR - systemic aquired resistans), также как термин локальной приобретенной устойчивости (localized acquired resistance - LAR) был введен немецким ученым Россом в 1961 году на основании исследования табака, инфицированного ВТМ [Ross, 1961 J. Так, СПУ развивалась в органах растения, удаленных от мест инфицирования, тогда как локальная - непосредственно в месте инфицирования [Дьяков, 2001]. Интересно, что такого рода устойчивость

может иметь различную длительность, от достаточно краткого периода времени до всего жизненного цикла растения, а так же проявляться в потомстве [Fu, Dong, 2013|. С молекулярной точки зрения СПУ характеризуется увеличением экспрессии большого количества PR-генов как в очаге инфекции, так и в тканях, не контактирующих напрямую с патогеном [Liu et al., 2012; Luna et al., 2012].

1.1.1. Индукция салициловой кислотой системной приобретенной устойчивости

В начале 80-х годов прошлого века впервые внимание было уделено участию СК в развитии устойчивости растений к патогенам. Antoniw и White продемонстрировали, что обработка листьев табака аспирином увеличивает их устойчивость к вирусу табачной мозаики |цит. по Kawano, 20071. В последующем при помощи СК и ее аналогов, таких как бензотиадиазол, 2,6-дихлороизоникотиновая кислота, аспирин и др., в различных исследованиях удавалось индуцировать устойчивость растений к различным биотическим факторам, в том числе многим грибным патогенам [ Boatwright, Pajerowska-Muchtar, 2013], бактериям и вирусам [Chaturvcdi, Shan, 2007], патогенным нематодам [Akbar et al., 2012] а так же абиотическим стрессорам [Масленникова и др., 2013; Mabibi, 2012]. Эффективная антииатогеиная защита аналогами СК послужила одним из аргументов к внедрению фирмой "Novartis" (Ciba, Швейцария) в растениеводство препарата «Бион»

(действующее вещество бензотиадиазол (benzo-(l ,2,3)-thiadiazolc-7-carbotionic acid S-methyl ester)). Показана его эффективность против патогенов, вызывающих болезни тыквенных, пасленовых, злаковых [Hukkanen et al., 2007]. Описана индукция CK и бензотиадиазолом в устойчивости клевера к паразитическому растению Orobanche minor [Kusumoto et al., 2007].

Механизм действия CK связывают с сигнальной регуляцией защитного механизма растений, называемого системной приобретенной устойчивостью, активирующейся в различных растениях при контакте с широким спектром патогенных организмов - вирусами, бактериями, грибами и оомицегами [Fu, Dong, 2013]. Р1аиболее убедительные доказательства участия салицилата в передаче сигнала СГТУ получены из опытов с трансгенным табаком, в геном которого встроен ген nahG из бактерии Pseudomonas putida, кодирующий синтез салицилат-гидроксилазы. Этот фермент катализирует превращение CK в катехол, который не является индуктором СГ1У. Растения, экспрессирующие ген nahG, не накапливают CK в ответ па инфекцию патогенами и не способны индуцировать СПУ в ответ на вирусные, бактериальные или грибные инфекции [Durrant, Dong, 2004]. Показано, что растения пшеницы, экспрессирующие геи NPR1 арабидопсиса, который участвует в траисдукции СК-сигнала, а так же растения, обработанные CK, проявляли большую устойчивость к Fusarium graminearum [Macandar et al., 2012].

Недавние исследования показали, что воздействие СК приводит к гипометилироваиию генов и изменению структуры хроматина, которые характерны для СПУ, индуцированной воздействием PstDC3000 [Luna et al., 2012]. Увеличение концентрации СК наблюдается в месте проникновения патогена совместно с �