Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Иммунологические основы паразитизма и болезнеустойчивости растений

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Иммунологические основы паразитизма и болезнеустойчивости растений"

российская академия сельскохозяйственных наук

всесоюзный ордена трудового красного знамени научно-исследовательский институт защиты растений

На правах рукописи

ГРОМОВА Буия Бера-Ошеровна

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПАРАЗИТИЗМА И БОЛЕЗНЕУСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ

Специальность: 06.01.11 — Защита растений от вредителей и болезней

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

санкт-петербург 1992

Работа выполнена во Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте защиты растений в период 1970—

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук О. Л. Озерецковская; профессор, доктор биологических наук 10. И. Власов; доктор биологических наук, профессор И. П. Гаврилюк.

Ведущее учреждение: Институт Экспериментальной ботаники им. В. Ф. Купревича.

на заседании Специализированного совета Д.020.01.01 во Всесоюзном НИИ защиты растений по адресу: 189620, Санкт-Петербург—Пушкин-6, шоссе Подбельского, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ защиты растении.

Автореферат разослан « » 1992 г.

1990 гг.

Защита состоится

1992 г. в

часов

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Г. А. Наседкина

1 0ЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Работы' по созданию устойчивых сортов тре-/ют иммунологически обоснованного подхода к выбору источников и до-эров устойчивости. В связи с от™ наиболее важным в теоретическом и рикладном отношении является вскрытие закономерностей паразитирова-йя возбудителей болезней на растениях и познание факторов, влиянцюс а исход взаимоотношений патоген - растение-хозяин. Решение этой роблемы требует многогранного освещения вопросов, находящихся на тыке таких дисциплин, как фитопатология, иммунология, иммунохимия, изиология, биохимия, цитология.

Большинство исследований этого, направления посвящено атакующей истеме патогенов, а свойство устойчивости одних сортов растений и осприимчивости других связывается с уровнем детоксикации, инактива-ии гормонов и выработкой фитоалексинов.

Значительная'часть исследований освещает изменения в метаболизме астений, возникающие при внедрении патогена и включающие синтез как ысокоспецифических, так и неспоцифических веществ. Характер ответ-ых реакций растений', как известно, предопределяется свойственным . ля них обменом веществ', закодированным в генетической структуре. В той связи не меньший интерес представляет сравнительное изучение пецифических особенностей устойчивых и восприимчивых к заболеванию ортов.

При всей многогранности проявления обмена веществ у любого орга-изма центральным звеном является синтез белка - ключевого элемента ■иологических, транспортных и энергетических систем. Среди методов зучения качественных особенностей белков перспективны методы иммуно-:имки, с непревзойденной специфичностью и высокой разрешающей способ-;остью.

Иммунохишческие методы основаны на использовании сывороток жи-¡отных - биологического теста, позволяющего безошибочно оп- делить ;тепень сходства и хиг.отческую индивидуальность белков, полисахаридов 1 нуклеопротеидов, а исходя из этого - иммунохимическое сходство и эазличио между близки»,® и эволюционно отдаленными видами живых орга-шзмов и, в частности, подойти к пониманию проявления паразитизма у ¡атогенов растений.

Наши исследования, связанные с изучением механизма взаимодействия патогена и растения на молекулярном и клеточном, уровнях, с опре-1елением природы устойчивости последнего, проводимые на ряде систем эастение-патоген /кормовые-злаковые, пасленовые; технические-мальво-зые в отношении биотрофов и некротрофов/, основывались на изучении

биохимической характеристики структур, обеспечивающих это взаимодей ствие. Поэтому особое значение приобретают исследования, посвящении роли сходных антигенов патогена и растения, участвующих в перекроет них реакциях, а также не обнаруживающих этого свойства, установлени юс природы, локализации, функции.

Полагаем, что такие исследования моленулярно-биологических оснс паразитизма позволяет определить роль биополимеров различной природ и их комплекса не только в постинфекционный, но и в преинфекционны} период. Это очень важно, поскольку позволит определить генотипичес-кие свойства растения по признаку устойчивости к тем или иным фито-цатогенам независимо от развития инфекции в природе, так как не вс( да и не в каждой, эоне испытания сорта есть условия, благоприятству! щие развитию отдельных pao возбудителя, так необходимые для характ! ристини сортов на болезнеустойчивость.

Цель и задачи исследований. Цель работы - изучить взаимоотноше ния между возбудителями заболеваний и растениями-хозяевами на моле кулярном и субклеточном уровнях на основании выявления иммунохимич кюс и биохимических свойств их биополимеров с целью разработки над ных методов,определения свойства устойчивости растений.

Подходя к изучению природы устойчивости с позиций того, что па зитизм фитопатогенов обусловлен сходством белков патогена и растен нами были получены новые данные о том, что сходство обусловлено не только белками, как считалось ранее, что и выдвинуло для изучения вые вопросы. Таким образом, задачи исследования механизма паразит1! вдния заключались в следующем: установить природу иммунохимически сходных, или перекрестно реагирующих,' антигенов и природу рецепто] "распознаида" биополимеры патогена и растения; выявить структура подобие белков патогена и растения-хозяина, перекрестно реагируют в иммунохимичес-ких реакциях; выявить локализацию перекрестно pean рующих антигенов .пат.огена и растения; выяснить, на-какие системы ' внутриклеточного метаболизма действуют сходные и несходные с раст ем антигены патогена и в чем состоит это действие; определить, ка физиологическую реакцию клеток растения обуславливает взаимодейст "партнерой"; установить роль структурных и функциональноактивных" ков ^ а также гликопротеидов и лектинов в проявлении свойства усто воет?./восприимчивости растений; определить качественное разнообра белков в проявлении паразитизма у .фитопатогенов в пределах вида.

Вое лересичленные вопросы в разной степени решались на разнш системах патоген-хозяин во взаимосвязи, поскольку они являются до сторонами одного процесса в бинарной системе, и в соответствии с-

кожностъю количественного получения того пли иного биополимера для исследования.

Научная новизна -работы. Впервые в фитопатологической практике детально исследованы с позиций иммунохимического сходства антигенов патогена и растения вопроси,паразитизма и природы устойчивости растений. Впервые получены данные, доказыващио, что контроль за синтезом иютунохкчически сходных полипептидннх цепей фитопатогена и растения осуществляется сходными генами - на примере возбудителя фитофтороза и картофеля. Впервые установлено также на этой патосистеме, что им-мунохимически сходные, или перекрестно реагирующие антигены патогена и растения, т.е. те, которыми обуславливается паразитизм, локализовали в мембранных"структурах клетки: тонопластз, плазмалемме, наружных мембранах хлоропластств, а также в цитозоле клетки листа, а у патогена - в оболочке мицелия и зооспор.

Получены новые данные о том, что антигены патогена и конгениального растения, наравне с белнами, представлены гликопротеидами и уг-леводсвязывающими белками. Биополимеры такой природы выявлены не только в цитозоле клетки, но и в мембранных структурах, что ранее отмечалось только для животных тканей. Впервые среди антигенов листьев картофеля, иммунохимически сходных с таковыми патогена, были обнаружены антигены-фитогемагглютинины /лектинц/. Кроме того, обнаружены лектины растения, которые не проявляют иммунохимического сходства с биополимерами патогена и характеризуются ингибиторной активностью. Впервые обе группы лектинов выделены из листьев картофеля и из лек-тинов трипсинподобные ингибиторы. Впервые показано наличие гемагглю-тнниругощей /лектинподобной/ активности для ингибиторов трипсинподоб-ннх л химотрипсинподобных ферментов листьев картофеля. . •

Новые данные свидетельствуют о наличии лектинов-зритроагглюттш-нов среди антигенов фитопатогена - возбудителя фитофтороза. Обнаружено также на примере возбудителя фитофтороза картофеля и растения-хозяина, что антиген растения, иммунохимическая детерминанта которого построена по типу аминосахара №-ацетил-Д-глюкозамина, является рецептором для биополимеров фитопатогена и локализован в мембранных структурах клетки. Установлено на двух системах патоген-хозяин /картофель-розбудителъ фитофтороза, кукуруза--возбудители головневых/, что имму-юхимически сходные, или перекрестно реагирующие антигены "партнеров" збладгшт множественной ферментативной активностью. Установлено на па-госистемах картофель-возбудитель фитофтороза', хлопчатник-возбудитель зертициллеза, что полипептидные цепи белков патогена, сходные с тако-знми растения, являются индукторатли экспрессии генов последних.

Разработан оригинальный метод определения свойства устойчивости растений различных сельскохозяйственных культур к фитопатогенным микроорганизмам на основании учета таксономии иммунохимически сходных • биополимеров. Разработан новый метод .определения неспецифической устойчивости картофеля к возбудителю, фитофтора по количественному учету лектинов /зритроагглготининов/ листьев.

Положения, выносимые на защиту. Согласно полученным данным, было сформулировано положение, касающееся познания отдельных сторон механизма паразитирования и устойчивости растений к фитопатогенам.

Паразитизм фитопатогенов возможен при наличии перекрестно реагирующих, или сходных, структур разной природы: гликопротеидов, угле-водсвязивающих белков, лектинов /фитоагглютининов/, структурных и ферментативноактивных белков, локализованных в мембранных структура) клетки растения и патогена.

Формирование связей в фитопатосисТеме осуществляется благодаря подобию протеинов, синтез которых контролируется сходными генами, гликопротеидов и лектинОв'с антигенными детерминантами углеводной природы и, в частности, имеющим структурное подобие, аналогичное ам носахару Л-ацетил-Д-глюкозамину/для системы возбудитель фитофтороза картофель-листья/, которыми осуществляется взаимное "распознавание"

Благодаря белкам, обеспечивающим имйунохимическое взаимрдействи и проявлявшим ферментативную активность, с одной стороны, naioren вмешивается в метаболизм растения-хо'зяина, с другой - растение обус лавливает проявление защитной ответной реакции, соотпетстаушаи cBot ству устойчивости, связанному "с функцией белков, лектинов, ферментов и их ингибиторов. ...

Всеми перечисленными биополимерами, участвующими в перекрестно: реакции, обуславливается как специфическое, так и неспецифическое взаимодействие в фитопатосистеме. В зависимости от специфики сходс реализуется свойство устойчивости или восприимчивости. Изменение м таболизма растения и его влияние на возбудителя болезни - все это вторичные проявления, которые так или иначе зависят от того, наскс ко' сходны перекрестно реагирующие структуры, ""стимулирующие-, эксгц .сию генов во взаимодействующей системе..

'Обосновывается способ определения .свойства устойчивости расте! в связи со знанием таксономического уровня отдельных лолипептиднш цепей белков или их комплекса, проявляющих и не обнаруживающих им нохимического сходства с патогеном.

Обосновывается также способ-определения свойства неспецифйчес: устойчивости растоний картофеля к возбудителю фитофтороза на ochó

пии использования такого критерия, как титр гемагглютинируицей способности клеточного сока листьев растения.

Совокупность сформулированных нами научных положений можно квалифицировать как перспективное направление в области фитоиммунитета - ■ иммунобиологические основы паразитизма фитопатогенов и устойчивости растений, позволяющее в кратчайшие сроки решать вопросы практической селекции.

Практическое значения и использование результатов работы. Результаты исследований позволили вскрыть новые закономерности паразитизма, расширить представление о природе и роли перекрестно реагирующих биополимеров . фитопатогена и растения, углубить знания в вопросах специализации фитопатогенов.

Решение части поставленных задач по изучению молекулярных меха, низмов взаимодействия фитопатогенных микроорганизмов и растения-хозяина позволило нам решить вопросы практической значимости.

■ Определить свойство устойчивости таких сельскохозяйственных растений, как картофель, пшеница, кукуруза, к различным по выраженности паразитизма фитопатогенним микроорганизмам /отдельным расам/ на основании учета таксономии их иммунохимически сходных антигенов /с использованием сыворотки к белкам патогена/.

Определить свойство неспецифической устойчивости растений картофеля к возбудителю фитофтороза на основании гемагглютинируицей активности биополимеров листьев.

Для целей селекции на устойчивость и фитопатогенам определить успешность подбора исходных родительских форм картофеля, кукурузы в результате выявления приуроченности патогена, выражающейся в наличии иммунохимическо'го сходства его белков с протеинами гибридов, характеризующих крупные таксоны растений. Определить характер экспрессии генов родительских форм в гибридах картофеля, пшеницы, кукурузы по признаку устойчивости к фитопатогенам и по-фенотипу, определяемых по им-мунохимическим свойствам белков. Осуществить поиск источников устойчивости к фитопатогенам, произвести отбор устойчивых линий, сортооб-.разцов, сортов на основании анализа и учета белков растения, как про-, являющих иммунохимическое сходство с патогеном, так и не. обнаруживающих его и, кроме того, характеризующихся определенной ферментативной активностью.

Разработанный метод микроиммунофоретического анализа белков растений и фитопатогенов используется в ряде НИУ страны.

Внесено усовершенствование в методы выделения лектинов, в частности, 'предложено сочетать методы ионообменной, а также аффинной хро-

йатографии с методом электрофореза и шлмунохишческого тестирования.

Внедрены в практику научно-исследовательских институтов методические указания по определению свойства устойчивости растений к фитопато-генам на основании использования различных биохимических критериев /1975, 1980, 1902, 1990 гг./1

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 2-м съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова /Ленинград, 1972/, Конференции Европейских и Средиземноморских стран о ржавчине хлебных злаков /Прага, 1972/, У1, УП , УШ Всесоюзных: совещаниях по иммунитету с/х растений к болезням и вредителям /Одесса, 1975; Омск, 1981; Рига, 1986/, УШ Международном конгрессе по защите растений /Москва, 1975/, ХП Г.!ождународном конгрессе по ботанике /Лв-' нинград, 1975/, Ш съезде Украинского общества генетиков и селекционеров /Киев, 1976/, Ш Международном съезде по ржавчишшм грибам /Шиой-. царш!, 1976/, Всесоюзном совещашга по биохимии иммунитета растений к паразитным грибам /Москва, 1977/, Советско-Шведском симпозиуме "Физио-лого-бпохимические и генетические основы иммунитета с/х растений к болезням" /Киев, 1978/, Всесоюзном семинара "Иммунохимпчиские методы в целях определения иммунных свойств растений" /Дотнува, 1981/, Всесоюзной конференции "Проблемы и пути повышения устойчивости растений к болезням и экстремальным условиям среды в связи с задачами селекции" /Ленинград, 1981/, Всесоюзной конференции по научно-методическим ос- ' новаы селекции интенсивных сортов -зерновых культур, устойчивых к не. благоприятным факторам климата /Нодино, 1981/, Всесоюзном совещании "Изменчивость фитопатогенних микроорганизмов" /Рига, 1983/, ХП конференции по споровым растениям Ср.Азии, и Казахстана /Алма-Ата, 1983/, П Всесоюзной йоиференцик "Экологическая генетика растений и животных" /Кишинев, 1984/, Всесоюзном совещании "Зизиолого-оиохимические основы иммунитета к грибным болезням растении" /Уфа, 1933/, Республиканской конференции "Изучение и применение лектиноь" /Тарту-Таллинн, 1983/, XI Международном симпозиуме "Йнтерлек" /Таллинн, 1939/.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 65 научных работ, . _

Объем и структура щбот'п. Диссертация состоит из введения, пяти . глав, заключения, выводов,изложенных: на 46G стр машинописного текста, включай» 24 таблицы /26 стр./; приложение - 35 стр., список литературы - 125 стр.- содержит 1276 наименований,- в том числе 048 - на иностранных языках, документы о внедрении результатов исследования - 7стр., 178 рисунков оформлены самостоятельным томом.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

. Исследования по теме диссертации выполнены в лаборатории иммунитета растений к вредным организмам ВИЗР в соответствии с планом ра-5от по проблеме иммунитета, сельскохозяйственных культур к болезням.

Объектами изучения являлись различные виды, сорта, гибриды и лиши таких важнейших сельскохозяйственных культур, как картофель, пше-лща, кукуруза, хлопчатник и различные по выраженности паразитических звойств фитопатогены, паразитирующие на указанных культурах, соответ-зтвенно, возбудители фитофтороза и рака, бурой ржавчины, пыльной и 1узнрчатоЙ головни, возбудитель вертициллезного увядания. Проблема 1зучения взаимоотношения растения-хозяина и паразита является одной 13 основных в селекции растений на устойчивость к различным болезням. Эта проблема осложняется тем, что возбудитель генетически не однороден и состоит из ряда биотипов, рас, клонов, отличающихся по вирулентности, что учитывалось в нашей работе.

Теоретические разработки осуществлялись в основном на системах картофель-возбудитель фитофтороза и хлопчатник-возбудитель вертицил-иеза. Определение преинфекционной устойчивости у злаковых проводили ю белкам зерновок, ответной реакции - по белкам листьев. У растений слопчатника использовали для исследований семена и зеленые растения. Зопросы взаимоотношения растений картофеля и возбудителя фитофтороза »эучались на биополимерах зеленых листьев и лишь в некоторых случаях ираллельно на протеинах клубней, поскольку в иммунологической и фи-гопатологической практике определение генотипа картофеля по признаку устойчивости к названному патогену решается по ответной реакции листь-эв на заражение.

О методах, использованных при проведении исследований, дают представление • последующие главы автореферата.

.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. РОЛЬ ПЕРЕКРЕСТНО РЕАГИРУЩИХ /ПР/ АНТИГЕНОВ ФИТОПАТОГЕ-НОВ И РАСТЕНИЙ-ХОЗЯЕВ

В настоящее время считается общепризнанным установленное в живот-зой иммунологии явление о том, что в процессе внеклеточного и внутриклеточного паразитизма микроорганизмов приобретаются признаки, сло-зобствуицие их длительному существованию и вниггеаниго в организме хозяина. К ним относится появление у микроорганизмов антигенов сходных гли идентичных антигенам тканей хозяина /Нуков-Вережников, 1947;-Мек-лер, 1965; Лямперт и др., 1975; Фонтамин, Певнивдий, 1978/. Эти ис-.

следования, получившие статус открытия-/Чепулис, Жданов, 1968, 1969/, подтвердили гипотезу Федотовой, выдвинутую в области иммунологии растений, о возможности паразитизма фитопатогенных организмов лишь при-наличии у них белков серологически сходных с таковыми хозяина/1935г./ В .чем же заключается механизм действия иммунохимически сходных и несходных с протеинами растения-хозяина отдельных полипептидных цепей антигенов патогена на метаболизм растения. Предстояло выяснить, дифференцированы ли мобилизационные возможности растения в отношении указанных полипептидов. Для этого на двух системах паразит-хозяин: картофель /сорт Сако ^/-возбудитель фитофтороза /раса 4/, хлопчатник /сорт Ташкент 1/-возбудитель вертициллезного вилта, были проведены модельные исследования по введению белков патогена в растение /Громова, Гусева, Лантас, 1975/.

Были выявлены и выделены белки, возбудителей фитофтороза картофеля и вертициллеза хлопчатника, иммунохимически сходные с.протеинами хозяина и не проявляющие такового. Эти белки патогена вводили, соответственно, в черешок отделенного листа картофеля й стебель растения хлопчатника. ...

Впервые для системы растение-патоген было'установлено дифференцированное влияние' перекрестно реагирующих полипептидных цепей патогена на метаболизм растения.

Наибольшие изменения в протеинах листьев картофеля были Выявлены при введении сходной полипептидной цепи белка патогена. Резко увеличивается содержание белка ео всех фракциях протеинограммы, а также отмечено появление новых компонентов с катодной и анодной подвижностью /рис. 1/. Установлено также, что введение как сходных, так и не. сходных белков патогена вызывало усиление активности, а также появление новых, изоферментов эстеразы и кислой фосфатазы. Отличными'от эти; ферментов оказывались изменения., происходящие со щелочной фосфатазой Введение сходной и несходной фракции белка патогена, по сравнению с контролем, вызывает исчезновение ряда изоферментов щелочной фосфатазы в сильное ослаблешш активности в ряде изоферментов растения-хозя ина. ' ,

. Кроме перечисленных ферментов изучались ферменты, обладающие де-гидрогеназной активностью. Опыт с введением несходных полипептидных цепей белков мицелия патогена в растение не отличался от контроля при изучении малатдегидрогеиазы и выявлял незначительное усиление ак тивности в изофермонтах лактатдегидрогеназы.. Введение же сходных бел ков патогена вызывало значительное уменьшение активности в избфермен тах как ВДГ, так и ЛДГ растений. Эти данные свидетельствуют о том,

-1= .11

.1

1'ло г;:,1; З-Л: длт

3

4

м-»

1

з

1

. I. Схеаа тстекно- (Л) и зиэ-ютготи &ст8.шз:1 (Б) нэлахле-.югетгн (и): 1-:-<:олтроль, 2-в5едсс:п /¿:сй1лл::рол;;лоЛ води, тмунойосходяол и ч—сходло" иолалелглдисЛ цопл ант.и'онц возбу-зла 1'ц5о:чороз^, раса 'к

что уровень активности глиоксалатного пути превращения органической кислоты значительно снижается под действием сходных компонентов патогена; что ведет к уменьшению количества веществ /пирувата/, с которых запускается цик'л Кребса. Интересно отметить, что снижение де-гкдрогеназной активности происходит на фоне увеличения белка в одноименных компонентах.

Анализ материалов по влиянию белков .патогена на метаболизм растений хлопчатника также свидетельствует о значительных изменениях, . происходшдих в составе белков и ферментов растений хлопчатника, что выражается в появлении новых компонентов и в то же время в деградации отдельных фракций. Наибольшие-'изменения наблюдаются в синтезе пероксидазноактиБних белков при введении в растение полипептидных цепей белков мицелия патогена, сходных с протеинам хозяина. Число изофярментов у "инфицированных", растений с 9 уменьшается до 7 по сравнению с контрольным! растениями и теми, и которые были введены носходпче белки патогена. Эти данные вскрывают дифференцированный

-"»

■ 3

характер действия отдельных полипептидных цепей белков мицелия патогена, свидетельствуя о том, что иммунохимически сходные полипептиды препятствуют синтезу веществ у растений хлопчатника, осуществляющих защитную функцию, поскольку, снижение активности пероксидазы растения в результате исчезновения 2-х ее изоферментов может повлечь за собой уменьшение количества соединений фенольной природы, играющих роль химического барьера для внедрившегося патогена /Галлегли, Нидерхаузен, 1962/. В этом наиболеэ четко проявляется паразитическая сущность ПР-антигенов патогена, характеризующихся свойством антигенной мимикрии.

Реакция иммунитета у растений - это активная реакция организма хозяина на внедрение паразита. В ней, кроме высокомолекулярных, участ вуют и низкомолекулярные вещества, входящие в состав клеток растения, как, например, соединения фенольной и сесквитерпеновой /фитоалексины/ природы. При этом обнаруживается та же закономерность в изменениях, что и в высокомолекулярных соединениях. В инфицированных растениях картофеля по сравнению с контролем отмечаем синтез шерти фенольных соединений, а в растениях хлопчатника -'четырех в ответ на сходные . фракции патогена. Введение несходных полипептидных цепей вызывает образование двух неидентифицированннх соединений у растений обоих видов. Изменения, индуцируемые у растений картофеля, иммунохимически сходными антигенами патогена, обнаруживались V в интактных тканях в увеличении зоны флуоресценции.

Особо следует отметить, что на 3 сутки после инфицирования раз те-•' ний картофеля сходной фракцией белка патогена выявлен синтез "<1е ро-уо" кофейной кислоты, которая играет значительную роль в защитных ре> акциях растений. ■ '

Изменения, обнаруженные в синтезе ферментов и фенолов, свидетельствуют о том, что в инфицированном растении продукты окислительного ' превращения фенолов - хиноны оказывают ннгибирующее влияние на дегид

• рогенавы. В результате происходит некоторое подавление дыхания клето . растения и интенсификация пентозофосфатного цикла. В результате пода ■ ления дыхания, связанного с циклом Кребса, буде* наблюдаться подавле

ние образования и углекислого газа, поставщиком которого он является и в связи с этим торможение роста грибницы, так как, по данным иссле

• доварий Ака1, РикиЮи1 /1967/, СО2 используется патогеном для синтеза липойдных соединений. Переключение анаэробного превращения субстрата на более ускоренное протекание апотомических реакций сПособст вует, вероятно, быстрой мобилизации защитных'сил организма.

Изменения в фитоалексинах-осйбой группе антибиотических веществ, связаны с тем, что, достигнув фунгитоксических концентраций, они пр<

пятствуют развитию патогена. В результате исследований была выявлена' тенденция н увеличению фитоалексинов в "инфицированных" антигенами патогена клубнях. При этом отмечается сохранение закономерности изменений, выявляемых в других веществах при введении иммуноидентичных, сходных и несходных полипептидных цепей антигена патогена.

Интересен' тот факт, что одни и те же.полипептидные цепи патогена, иммуносходные с протеинами растений, являются индукторами одновременного проявления специфических, выражающихся в изменении белков и ферментов , и неспецифических реакций растения - синтез фитоалексинов и фенолов.

Аналогичные явления отмечались, нами и при изучении характера изменений в белках и ферментах у различавдихся по признаку устойчивости сортов таких сельскохозяйственных культур каш пшеница; кукуруза, хлопчатник, картофель. Они демонстрируют нарушения в сложной отрегулированной системе обмена веществ, происходящие под воздействием возбудителей, различающихся по степени выраженности у них паразитизма: обли-гатные - возбудитель бурой ржавчины, пузырчатой головни, рака картофеля, вирусы, факультативные - возбудитель фитофтороза картофеля и вертициллезного увядания хлопчатника.'

Специфический характер этих изменений обнаруживается у всех сортов в динамике развития заболевания: инкубационный период и проявление заболевания, равно как и в различных органах - листья, клубни, семена, а также в зависимости от растворимости в растворителях и,кроме того, обусловлен специфичностью .патогена. Вместе о тем,наблюдается и проявление неспецифических изменений. Например, среди белков листьев разных сортов картофеля была выявлена полипептидная цепь, в которой отмечалось новообразование белка при заражении растений' на только расами возбудителя фитофтороза, но и различными вирусами /X, s/. Наблюдаемые изменения у растений происходят не только в зараженных фитопатогенными грибами органах, но и в незараженных, на основании. чего можно сделать вывод о том, что растение выступает как целостная система дане в случае локального поражения.

Изменения в полипептидах свидетельствуют об инициировании экспрессии генома растения в результате вмешательства конкретных биополимеров патогена в определенные звенья метаболизма растения, активации одних и кнгибировании других процессов. Это мояет рассматриваться как интеграция факторов защиты и согласуется с представлением / callo», 1984/ о том, что изменения биохимических'процессов в клетке приводят ее в состояние повышенной устойчивости. . .

Данными исследованиями осуществлен подход к раскрытию отдельных

звеньев механизма действия патогена на растение на молекулярном уровне, поскольку в модельном опыте растение реагирует на введение отдельных полипептидных цепей белков фитопатогена, хотя и без проявления внешних симптомов, так же, как если бы на него действовал интактный патоген. . •

Углубление знаний о роли перекрестно реагирующих антигенов фитопатогена и растения-хозяина связано с конкретизацией представления о их топографии, В связи с этим определение связи изучаемого антигена-о цитологическими структурами органа является необходимым элементом иммунологического анализа.

2.2. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПЕРЕКРЕСТНО' РЕАГИРУЩИХ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИ- ■ ТЕЛЯ ФИТ0ФТ0Р03А И РАСТЕНИЯ-ХОЗЯИНА, ВЫЯВЛЕННЫХ МЕТОДОМ ИММУНО ЛШИНЕСЦЕНТНОГО И ИММУНОХИШЧВСКОГО АНАЛИЗА /

Были осуществлены исследования по обнаружению локализации иммуно-химически сходных, или перекрестно реагирующих, антигенов фитопатоген НОГО гриба Phytophthora infestana Hont de 1)нгу И растения-хозяина С использованием непрямой реакции по Кунсу / Ооопе , 1942/. Знания о локализации перекрестно реагирупцих антигенов в клеточных структурах имеют немаловажное 'значение для познания природы, механизма паразити-рования фитопатогенов и разработки мер борьбы с ними.

Исследования проводили С растениями ДИКОГО вида Solanum dfiiuissum; liji r4; R2; йт з i , с возбудителем фитофтороза - paca 4; сыворотки: к водорастворимым белкам листьев с.Столовый 19 /s.tuberosum ь4 / к-белкам мицелия четырех рас патогена,- 1; 4; 1.4; 1.З.4.; а также к полипептидным цепям мицелия возбудителя расы 4 - восемь моноспецифических сывороток. Наблюдение препаратов в свете их иммунолюминесцен-ции проводилось в люминесцентном микроскопе МЛ-2.

Цвет аутофлуоресценции изучаемых структур обусловил выбор иммуноглобулинов, конъюгированных с ФИТЦ - наиболее сильно люминесцирукхцеп ив применяемых люминофоров, полученных из Йн-та микробиологии и виру. оологии им. Гамалеи. Локализация антигенов обнаруживается по зеленом; свечению тех или иных структур клетки в случае их .сходства, с антител: М.и к исследуемым гомологичным или гетерологичнцм антигенам.

Установлено, что как те, так и другие локализуются в различных • структурах клетки. У патогена это клеточная оболочка и, очевидно,под лежащая под ней плазмалемма, а также наружная и внутренняя оболочка зооспор и аооспорангиев. У растения это первичная оболочка клетки и также цитоплазматическая мембрана, или плазмалемма /рис. 2/. Диффере цировать свечение клеточной оболочки и плазмаломмы на срезах не пред ставляется воэможнш. Тесное прилегание плазмалеммы к оболочке отме-

r- ..-.-i

3- 120х

4- 276х

Р::с. ?.. Логол^ззча«: ан?1Г.й!0? г ; i с т е i i : i : i, пзрзкросгяо рсагзруюцлх • 'о iuKojir::i гогоу.т.т'злл •..ято-.торозз, риса 'f. Оюзы ллсга каргстзля . soimiura d«Bit"íiin (к ) ' I-¡:ó:!?oo.ib - оорчботка почу.альнол кроличьей j.aii'jciapy.Q.cn:■ «шлкраЕачь û скзорогкоЗ, г^лз^месценцнп пер-.wp.ie г:'м xíúTÓit столСч'ато!! и 5-губчатоИ парен-!íí :ci0')0!i.î'iCT0S пол обработке сыворот-

:ппосц:туюдзй аатакоолачье:!.

L.riiio.' o'')0..0'i:;.i,

? <::. .J ¡мрУ- ■ ко.! п;1то1 слу л

чалось многими исследователями /схиЬааа , 1969; соп, ?ли , 1970/. Обращает на себя внимание то, что антигены в клеточной оболочке и в прилегающей к ней плазкалемме, перекрестно реагирующие с антигенами . патогена, локализованы не равномерно, а сосредоточены в виде глыбок. По-видимому, перекрестно реагирующие антигены имеют мозаичную локализацию в клеточной стенке и плазмалемме растения, тем более, что для цитоплазматической мембраны о помощью электронной микроскопии удалось установить регулярность в расположении частичек различной величины /но1)е1 чаоп , 1966/, а в первичной клеточной оболочке белок-Л -целлю-лвза ДоХапа , 1973/ и гликопротеин-зкстепсин /ьдсироп , 1975/ также распределены между фибриллами полисахаридов.

Наряду с названными структурами' отмечается и внутриклеточная локализация антигенов, связанная с мембранами органелл, а именно хлоро-пластов. Кроме того,, при отсутствии хлоропластов выявляется светящееся веленым светом содержимое цитоплазмы с выделяющимися глыбкообраз-ными структурами. Интерпретировать эти образования и идентифицировать с цитоплазматическими структурами трудно.

В связи с тем, что антигены растения, перекрестно реагирующие с сывороткой к антигенам патогена, локализованы только в определенных участках мембраны, представлялось целесообразным выявить, существует' ли специфика во взаимодействии этих антигенов растения с отдельными полипептидными цепями водорастворимых белков-мицелия патогена.

Топография локализации таких антигенов в клеточной оболочке и мембранах во всех случаях оказатцсь одинаковой и представляется на срезах в виде чередования лшинесцирувдих и. узких нелюминесцирукщих участков. Специфичность же выражалась в интенсивности люминесценции, что может быть связано с различным содержанием в структурах растения антигенов, перекрестно реагирующих с сыворотками к той или иной полипептидной цепи белка мицелия патогена. Наибольшей интенсивностью им-мунолюминесценции характеризуются антигены растения, обнаруживаемые сывороткой к антигенам патогена А-8-10 расы 4 в совместимой комбинации /срезы Б.летвБиш ь4 /. Полипептидная цепь А-8-10 обнаруживает иммунохимическую идентичность с рядом полипептидных цепей суммарных водорастворимых белков листьев растений картофеля сорта Столовый'19. /и4 '/.'Сыворотка к полипептидной цепи антигена мицелия К 18 обнаруживает слабую люминесценцию клеточных структур в совместимой сочетании и не выявляет её в несовместимой комбинации патоген-хозяин. В иммуно-электрофоретической реакции этот компонент либо вообще не обнаруживает сходства, либо только на уровне белков, характерных для рода растений.

Для конкретизации локализации гомологичных-и перекрестно реагиру

лцих антигенов растения и фитопатогена било осуществлено дифференци-отанное выделение клеточных органелл и мембран с дальнейшим виделе-шем из них белков. Трудности выделения белков мембран связаны с тем, гто на всех цитоплазматических мембранах клетки прочно закреплены ри— !осорлы, которые не позволяют выделить чистую фракцию белков плазма-темны, тонопласта, а также мембран органелл /Тахая, 1979/. В литературе не встречается сведений, которые свидетельствовали бы о связи рибосом с мембранной оболочкой хлоропластов.

В результате использования опыта выделения белков хлоропластов 'Курсанов и др., 1970; Осипова, 1971; ШсНагНзпп т а1. , 1963 и др./ Зыли получены три различные фракции белков листьев: белки цитоплазмы, зключакхцие белки митохондрий и рибосом, легко растворимые белки хлоропластов и белки меябран хлоропластов' /Громова и соавт., 1975/. Несмотря на выявленные различия в электрофоретической подвижности; все исследуемые белки клетки обнаруживают иммунохимическое сходство между зобой и выявляют сходные в суммарных аммонийосажденных водорастворимых Зелках. Кроме того, в суммарной аммонийосажденной водорастворимой фракции белков листьев нам представилось возможным в иммунофоретичес-ком анализе с использованием сыворотки к "Фр1Р" из листьев ячменя идентифицировать полипептидные цепи с рибулозодиФосфаткарбоксилазной /ВДФК/ активностью - ключевым ферментом, обеспечивающим фиксацию СО2.

Иммунохимическое сходство между различными белками листьев и идентификация отдельных электрофоретических компонентов о ними позволили осуществить анализ и конкретизировать полипептидные цепи белков растения, иммунохимкчески сходные, или перекрестно реагирующие, с протеинами возбудителя фитофтороза, его различных рас.

. Локализацию полипептидных цепей в биополимерах листа, перекрестно реагирущих с антигенами фитопатогена, можно рассмотреть на примере сорта Столовый 19. В иммунных сыворотках к возбудителю фитофтороза картофеля обнаружен;/ антитела, реагирующие с антигенами мембраносвя-занных и стромальннх белков хлоропластов, а также с фракциями суммарных водорастворимых и цитоплазматических белков клетки листа картофеля. При этом показано /рис. 3/, что эти антитела выявляют довольно богатнй и специфический, в связи с генотипическиш особенностями, спектр перекрестно реагирущих или серологически родственных патогену, антпгеноактивных биополимеров, локализованных в перечисленных структурах. Наряду со специфичностью в спектрах исследуемых белков растения, обнаруживающих иммунохимическое- родство с протеинами патогена, отмечается определенная общность. Она обнаруживается в том, что во всех белках листьев разных сортов и видов картофеля в перекрестных реакциях как с мо'носпегофтчрскими сыворотками, так и к суммарным водорасТ-

fi 7 1J 1 BÄJlö

Рис. 3. Перекрестно реагирую щие в иммунохимической реак--о ции белки клеточных структур

листа картофеля /с.Столовый "J'J 19/ и возбудителя фитофторо-за, раса 4: А-йелок мембран -»•»•< хлоропластов, Б-легкораство-, ркмые /стромальные/ белки хлоропластов, В-цитоплазмати ческие, содержащие рибосомал ные и митохондриалыше белки Г-водорастворимые белки лис! , - ев, 70 % аммония от насыщени

Сыворотки к водорастворимым белкам мицелия возбудителя фитофтороза; расы 0, расы 1, расы 4, расы 1.4., расы 1.3.4., 5 - к водорастворимым белкам листьев сорта Столовый 19, 70 % аммония от насыщения.

воримым белкам различных рас возбудителя фитофтороза выявляются две полипептидные цепи, идентифицированные с белками, характерными для рода и вида растения /условное обозначение Н/. Наряду с этим в суммарных водорастворимых белках и "цитоплазматической" фракции листы растений вида ь.tuberosum 'со всеми исследуемыми ра'сами патогена ] совместиуой комбинации обнаруживают сходство полипептидные цепи.ида тифицированные с рибулозодифосфаткарбоксилазой-/условное обозначен] Щ/. Антигены растения, локализованные б мембранных структурах лист; .обеспечивают большую специфичность в перекрестных реакциях с антиг нами патогена. Это проявляется в том, что но'липептидпыо цепи, объе диненные полосой преципитации Ш, по'взаимодействуют с сыворотками белкам несовместимых рас патогена.

Таким образом, антигены, входящие во фракцию суммарных водорас воримых бе.лков и перекрестно реагирующие с патогеном, иммунохимиче ни идентифицированы как антигены,•локализованные в мембране и.стро хлоропластов, а также в цитоплазме клетки листа.

Наряду с тем, что патоген имеет антигены,, родственные белкам р тения, локализованным в'клеточных структурах, листа, он имеет также антигены, сходные с белками, локализованными в тканях клубней, т.е патоген характеризуется органоспецифическими антигенами, перекрест реагируидими с антигенами растения.

Сыворотки к антигенам растения, локализованным в мембранах хлс ропластов и цитоплазме клеток листа, выявляют родственные антиген! у возбудителя фитофтороза картофеля, полученные в результате обработки тритоном Х-100 деградированных механическим путем клеточных структур грибницы после экстракции из последних цитоплазматически белков /рис. 4/. Это антигены разрушенных, маннано- или глюна'нопр< теидных комплексов, различных слоев клеточной оболочки, включающее и чисто белковый слой, и гликопротеиновый, погруженный в белок, а

Рис. 4. Перекрестно реагирующие г« тритонрастворимые /А/ и водорастворимые /Б/ белки мицелия воз-5 будителя фитофтороза и растения-з хозяина. Сыворотки: 2-к цитоплаз-матическим белкам листьев с.Столовый 19 /н/, 3-к белкам мембран хлоропластов листьев с.Столовый 19, 5-к белкам мембран хлоропластов листьев Б .(1еп1 зэиш-П^ .

также цитоплазматической мембраны. В водорастворимых белках мицелия также обнаруживаются полипептидные цепи, перекрестно реагирущив с антигенами растения. Причем, в сыворотках, полученных к различным белкам растения, обнаруживаются антитела, реагирующие с одними и темя же полипептидаш. Однако, наблюдается и специфика в спектре имму-нохимического сходства, обусловленная расоспецифичностью патогена.

■ Таким образом, впервые были получены убедительные результаты, свидетельствующие о том, что антигены растения, перекрестно реагирующие с таковыми патогена, локализованы в таких мембранных структурах клетки как первичная кл&точная оболочка, плазмаломма, наружная мембрана хлоропластов и цитозоле клетки. В своп очередь, антигены патогена, локализованные к клеточной оболочке и цитозоле мицелия, перекрестно реагируют, или ишуносходны,с антигенами растения-хозяина.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что сопоставление фактов, полученных прп изучении растворимых антигенов и изолированных структур с результатами изучения локализации антигенов интактпых клеток могут дать истинное представление об антигенных свойствах клеточных структур. В сеязи с изложенным, т.е. знанием о локализации Г1Р антигенов, возникает вопрос о природе антигенов, об антигенных различиях тех клеточных структур, в которых локализованы перекрестно реагирующие антигены, а тапке не содержащие таковых. Являются ли эти отлиЧия качественными или количественными.

2.3. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕРЕКРЕСТНО ГЕАГИРГЩИХ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ФИТ05Т0Р03А КАРТОФЕЛЯ И РАСТЕНИЯ-ХОЗЯИНА •;• ,

Ферментативная активность иммуносходных антигенов растения и фитопатогена и антнпротеазная активность гаялупонесходных антигенов. '

Изучение белков растений-хозяев и патогенов показало, что все они обладают множественной ферментативной активностью. При этом наи-

больший интерес представляют полипептидные цепи антигенов растений и патогена, проявлящйе к тому же лммунохвмическое сходство, поскольку именно ими обусловлена восприимчивость со стороны хозяина и вирулентность патогена с другой стороны. •

Целесообразным представлялось провести анализ ряда ферментов класса оксиредуктаз /каталаза, пероксидаза, некоторые дегидрогенаэы/ и гидролаз /эсгераза, кислая и щелочная фосфатазы, амилаза, протеазы/, гак как моделыше опыты по механизму действия белков патогена, сходных и несходных с протеинами растения-хозяина, выявили изменения именно в этих ферментных системах растения.

На примере шести гиоридов картофеля и их родительских форм, а также разных рас возбудителя фитофтороза, было показано, что в одних и • тех же перекрестно реагирующих полипептидных цепях антигенов определяется активность перечисленных ферментов в различном сочетании. В соответствии с полученными данными и представлением о. формировании обратимых стехнометрических белок-белок комплексов, в которых один осуществляет конкурирующее цитирование их каталитических функций /Фридрих, 5-986/, было необходимо определить, свойственна ли ПР антиге нам ингибиторная функция. Для этого использовали- полипептидные цепи белков листьев растений картофеля сорта Столовый 19 Д4 / и Гатчинский /кт /, иммуноразллчние и сходные с Протеинами расы 4, совместимые по генотипу с одним сортом и несовместимой с другим.

Воспользовавшись методами определения активности трипсина по рас. щеплению казеина /Шагинян и др;, 1980/ и протеолитической активности в белках /апиоп , 1938/, оценили ингибиторную активность в препаратам по подавлению активности трипсина. Установили наличие протеолитиче'с-ких ферментов'в полипептидных цепях, иммуносходных й несходных с пате геном, а в.полипептидных цепях растения, несходных с таковыми патогена, выявили наличие их ингибитора.

Кммунонесходные с патогеном полипептидные цепи растения, которые характеризуются наличием ингибитора протеолитйческих ферментов, по. видимому, выполняют двойную функцию: препятствуют процессу разрушени антигенов до момента "распознавания" иммуносходных детерминант, а та же тормозят процесс протеолиза. биополимеров растения, индуцируемый ф • топатоге'ном. Этим и можно объяснить тезис о том, что несходные с пат геном белки растения обуславливают свойство устойчивости к фитопато-гену.

Гликопротеиды и белки перекрестно реагирующих антигенов возбудителя фитофтора картофеля и растения-хозяина и их роль во взаимоотношениях

Данные, полученные нами при изучении локализации перекрестно ре-«прупцих антигенов патогена и растения, свидетельствуют о том, что >ни приурочены к первичным оболочкам клеток и кх мембранным структурам.

Установлено,/А1Ьегзо11е1т, 1972, 1975/, что структура первичной иеточной оболочки для всех двудольных и'однодольных растений'универ-:альна и что поперечные связи мевду цепями полисахаридов в первичной 1екто-целлталозной оболочке образует гликопротеин экстенсин / Ьятрогл, 1970/. Что же касается мембран, то известно /Мусил, 1984/, что мембраны растений представляют собой белково-липидный комплекс. Кроме го-го, имеются сведения о присутствии в различных слоях клеточных мемб-. ран углеводсодержащих биополимеров, в частности, гликолипидов, выделенных из хлоропластов {астений. В этой связи представлялось необходимым установить природу антигенов, выделяемых из растений й. фитопато-?енов.

. Участие гликопротеидов растения и фитопатогена в имтлунохимической реакции было обнаружено по специфическому окрашиванию полос преципитации /Громова и соавторы, 1981/. Надо сказать, что гликопротеиды об-' шруживаются в тех же комплексах антиген-антитело, которые образуют-зя и белками. Однако, иммунохимический спектр гликопротеидов в гомологичной и гетерологичной комбинации всегда беднее аналогичного им-лунохимического спектра белков, т.е. не во всех комплексах обнаруживаются гликопротеиды. При этом установлено, что спектр иммунохимичес-<ого сходства гликопротеидов фракции "цитоплазматических" белкой листьев картофеля и патогена, его различных рас /рис. 5/, не отлича-этся разнообразием и расположен в катодной части иммунофореграммы. Более специфичен спектр перекрестно реагирующих гликопротеидов, обнаруженных во фракции белков мембран хлоропластов листьев картофеля, с антителами к биополимерам патогена /рис. 5/, он сосредоточен в анодной части иммунофореграммы.

В результате поиска гликопротеидов патогена,.участвующих в гомологичной и гетерологичной иммунохимической реакции, было показано, что они содержатся во фракции труднодоступных тритонрастворимых белков оболочки и мембран мицелия возбудителя фитофтороза картофеля /рис. 6/ и что'спектр сходства довольно'однообразен.

Сведения о том, что в составе антигенов растения, перекрестц.0 реагирующих с.таковыми патогена, кроме структур гликопротеидной природы

Рис. 5. Сравнительные спектры

, образованные белковыми /к/ и

_ < --гликопротеиднша /Б/ антигена

_im цитоплазматических I белко

I' и мембран хлоропластов П лис-

-« —:—=--г тьев картофеля с.Столовый 19

_ 0 _«г^ в перекрестной цммунохимичес-

--кой реакции. Сыворотки к водо

^ -V растворимым белкам иицелия

-JUI|L---- рас 0,1,^,1.4, и к "Фр1Р"-ри-

— * ——--; булозодифосфаткарбоксилазе

11 ' *__" /к-концентрированная, и-исхой

. о ная/.

г " Рис. 6. Сравнительные спектры

образованные'белковыми /А/ и «ш «ряо глик0Пр01еидныии /Б/ антигена

—Ф*—=-2 ми тритонраство^имых белков

, -.......-а мицелия возбудителя фитофторе

: -—а»— ' ^— за /расы 0,4,1,1Л/ в перекре —^—- 1,4.—;— 5ной иммунохимической реакции ^_____ » о антителами к антигенам: 2_ —3 водорастворимых белков листь-

« аз «ев /в/р/ о.Столовый 19, 3-з/1

-__ —^-« белков листьев с.Берлихинген

—-—. «——-т /г/, 5-"цитоплааматическах"

-д--- , ■ белков листьев о.Столовый 19,

• 6-белков мембран хлоропласта /НЩ листьев с.Столовый 19,

7-Б11Х в.иеииьзиы-К, .

* '

имеются иб^лки, были получены не (только специфическим окрашивание) амадошварцви,, но. и при деструкции, биополимеров трипсином, процазой и оаркоэидои. Это. контролировалось измененной характеристикой злеш рофоретических свойств и отсутствием или угнетением образования пр! ципитатов между, шшатаии полипептвдыых цепей, обработанных фермент; ми, и антителами к антигенам патогена.

Детерминанты перекрестно реагирущих айтигенов фитопатогена и растения^-хозшша.

• . ., Для оценки биологической функций биополимера необхрдимо связат его свойства с химической структурой; Структуры, принимающие участие в специфической реакции о антителами, складываютоя из различно го числа детерминантных групп. По присутствию антигенных детермина оцениваются вещества иммулохимическими методами Дунданов и др., 1973/. Среди антигенов листьев и клубней, а также возбудителя фито Фгороэа в реакции гаптенного ингибирования иммуноэлектрофоретическ

1"о анализа были определены детерминанты со сродством к двум аминоса-хараи: Кьацетил-Д-глпкозамину и Н»-ацетил-Д-галактозамину, а также модифицированному сахару-отрептомицину. При этом установлено, что у разных рас полипептидные цепи белков с одинаковой электрофоретичес- • кой подвижностью имеют антигенные детерминанты, построенные по типу различных аминосахаров и что детерминантами, определяющими родство антигенов различных рас внутри вида, являются также оба аминооахара. Взаимосвязь между перекрестно реагирующими антигенами растения /из ткани листа/ и фитопатогена осуществляется антигенными детерминантами, построенными по типу Ке-ацетил-Д-глюкоэамина.

На основании использования гаптенного блокирования антигенов было установлено, что взаимодействие патогена и раотения на молекулярном уровне обеспечивается углеводсвязывающими белками /рис. 7/.

Оывороткп А . антигены

,- 2и -

____' ____1н/и '

_ ""' 1л

Рис. 7. Гаптенное ингибирование иммунохимической реакции между антигенами водорастворимых (в/р) белков листьев з.ает1азит-в1 (I) и антителами к в/р белкам мицелия возбудителя фитофтороза, раса I (2); А-окраска на белок* Б-окраска на гликопротеиды, н/и-препарат не ингибирован, и-препарат ингибирован №-ацетил-Д-глю-козамином.

. В соответствии с представлением о роли углеводных молекул в-распознавании "своих и чужеродных" структур, мы считаем, что гликопротеи-дами и углеводсвязывающими белками растения картофеля, антигенные детерминанты которых построены по типу амйносахара №-ацетил-Д-глюкозами-на, осуществляется распознавание растением фитопатогена.

Проведенные исследования могут служить обоснованием для разработки фунгицида на основе Иьацетил-Д-глюкозаиина .или других гаптенов, блокирующих биополимеры растения, а также обоснованием механизма действия антибиотиков, используемых в защите растений.

Экзополимеры возбудителя фитофтороза картофеля, их природа и роль во взаимодействии с растением-хозяином

Исследования, направленные на раскрытие природы паразитизма в системе патоген-хозяин, связаны с задачей изучения взаимоотношения растения с патогеном на уровне его экзогенных продуктов. Нам представляет-

•ся, что' ее решению будут способствовать данные об иымунохииических и ферментативных свойствах экзобиололииеров.

В иимунохииических свойствах белково-фериентного коиплекса зкзо-продуктов патогена были выявлены различия, характеризующие специфичность метаболизма разных рае патогена. Было обнаружено, что спектр иццунохшшческого сходства экаопродуктов патогена и биополимеров растения довольно специфичен в связи с генотипическими особенностями и патогена, и'растения /рис. 8/. Надо отметить, что специфичность об наруживается лишь при работе с белками листьев.

».«г. Рис. 8. Перекрестно реагирующие анти-—______ гены растения-хозяина и экаопродуктов

" возбудителя фитофтороза картофеля. Сыворотка к экзопродуктаи расы 0,4,1.4. Антигены: водорастворимые белки листьев картофеля с.Столовый 19 /Ст.19/, гибридов 62,63 /Аг-антигены, Ат-антц-тела/. ' ...

В результате исследований было установлено'также, что в состав ¡экзогенных продуктов возбудителя фитофтороза картофеля входят' и ферменты разных классов. При атом изозимные спектры одних экзофермен-тов не отличаются специфичностью, другие обнаруживают ее. Кроне того, установлено, что одни изозииы зкзоферментов патогена обнаружива . от сходство с эндоизозимами растения, другие нет. Очевидно, одним из доказательств природы несовместимости мояет являться факт недостаточной сходности изозишшх спектров зкзоферментов патогена-и эн-доферментов клеточных структур растения. Следует оказать, что/.спект сходства зкзоизозимов патогена и эндоферментов растения, отличается от такового эндоферцентов в патосистеме. ■

Эти данные свидетельствуют о необходимости дифференцированного подхода к изучению механизмов взаимодействия на уровне зкзо- и зндс продуктов патогеца и растения.

Лектины и их р'оль.во взаимоотношении фитопатоген - • . . ., .. растение-хозяин . Лектины - обширная группа естественно встречающихся белков и гликопротеидов-неиммуиного происхождения, которые обладают способностью избирательно связывать углеводы и углеводные детерминанты биополимеров, не вызывая их химического превращения.

Серией исследований было показано, что лектины растений ингиби руст прорастание спор фитопатогенных грибов. Наряду о этим приводя

ся сведения о том, что экстракты патогена агглютинируют клетки растений. Каковы же функции лектинов в систеие микро-макроорганизм на молекулярной уровне и, в частности, в системе картофель-возбудитель фито'фторрза.

С использованием бараньих и кроличьих эритроцитов были идентифицированы фитогемагглютинины в клеточном соке листьев и клубней картофеля, в водорастворимых белках и белках мембран хдоропластов, а также в белках мицелия возбудителя фитофтороэа. Для выделения пектинов из листьев и клубней картофеля.были использованы принципы метода ионообменной /Allen, Neuierger , 1973/ и аффинной /Луцик,198^/ хроматографии.

Лектины выделяли из листьев, что было сделано впервые, и клубней 2-х сортов: Столовый 19 /к4 / и Гатчинский /нт /. Характер распределения агглютинирующих и'неагглютинирующих элюатов после хроматографии у сортов был приблизительно одинаков. Установлено, что лектины листьев, полученные последовательной хроматографией на ДЕАЕ- и КМ-целлюлозах /ЛЛЦ/ и аффинновыделенные /ЛО/, представлены четырьмя полипептидными цепями с катоднцй подвижностью /рис. 9/. Однако, ЛО соответствовали полипептидам из водорастворимых белков, расположенным на протеинограмиах дальше всех'от старта, ЛЛЦ-соответствовали полипептидам из тех а£е белков, локализованным ближе к старту и характеризующих крупные таксоны - род, вид растения.

\JM>7i

Рис. 9. Электрофоретическая характеристика лектина листьев -• ЛЛЦ /I/, полученного последовательной хроматографией на целлюлозах, лектина листьев-ЛО' /2/, полученного аффинной хроматогра-фиой.'на овогеле, ингибитора трипсинподобнцх фермзнтов-ИТ /3/, полученного аффинной хроматографией на трипсин-агарозе из лектина ЛО, протеинограмма листьев /4/ о.Столовый 19 /от 50 % осаждения аьшонием/, из которых выделен ЛЛЦ, ЛО.

Эти данные позволили /Громова, 1988/ сделать заключение, чтс во многих электрофоретических .компонентах белков листьев, по крайней мере о катодной подвижностью, содержатся как неагглытинируюдца комлонен-

тн, так и агглютинирующие. Иммунохимический анализ по идентификации агглютинирующих полипептидных цепей в суммарных белках листьев, а также клубней подтвердил это положение.

О наличии лектинов в электрофоретических компонентах свидетельствуют и результаты, полученные в реакции прямой эритроагглятинации элюатами отдельных полипептидных цепей белков клубней, листьев картофеля, "а также элюатами из электрофоретических фракций белков грибницы возбудителя фитофтороза картофеля. Было,установлено, что методы, используемые для выделения лектинов, необходимо сочетать Ь электрофо-ретнческим разделением й йммуноэлёктрофоретическиы тестированием /Громова, 1990/. Последними в лектинах листьев, наравне с основными полипептидами, были обнаружены незначительно представленные' сопутствующие компоненты. Например, для|аффинновыделенных лектинов это группа ЛО—2. На примере растений картофеля выявлена органная специфика лектинов, ввделенных из листьев и клубней, что обнаруживается разли-.чнями в электрофоретических и иммунохимических свойствах, хотя отмечаются и иммунохимически сходные структуры.

Для изучения морфологии углеводной части лектина была использована реакция угнетения агглютинации в присутствии Сахаров. Установлено, что гаптеном лектинов листьев является мономер JS-ацетил-Д-глюкозамин, которой ингибировал реакцию гемагглютинации в концентрации от 0,05 до 0,005 молей в 1 мл реакционной смеси.

Немаловажной характеристикой дл^ познания свойств лектина является его функциональная активнрсть. Методом энаимофореза в основных компонентах лектинов лиотьев-ЛДЦ была выявлена пероксидазная активность, а в основных компонентах ЛО из шести определяемых ферментов установлено наличие активности двух: эстеразы и пероксидазы /Громова, 1986/. Успех в выяснении .функций лектинов может быть получен также из анализа их изменений при действии на растение биогенных факторов - фитопа-тогена. Исследования свидетельствуют об изменении уровня гемагглюти-нирувдей активности в отделенных листьях картофеля /с.Столовый 19/ нз на 5-й и 7-ой день после заражения разными расами /рис. 10/. ДиффереН цированные изменения наблюдаются в пределах 5-и суток, затем они не связаны с вирулентностью патогепа и однотипны в зависимости от локалу аации лектинов. Эти данные позволяют сделать' заключение о том, что ■ грибная инфекция вызывает экспрессию генов, кодирующих синтез лектинов. Это представлйет большой интерес, поскольку от изменения содержания вецгств, участвующих в узнавании фитопатогенов, хотя и неспецифическом, зависит исход взаимоотношения в системе паразит-хозяин.

1 Рис. 10. Динамика уровня лек-■ типов в листьях картофеля при | заражении возбудителем фито-j фтороза /по реакции гемагглю-тинации/

Лектиноподобные свойства ингибиторов трипсина и химотрипсина листьев картофеля В 1905 г. Бардом /и а га , 1905/ было сделано предположение, что в растениях имеются вещества, способные ингибироиать рост грибов. Сообщение об ингибиторе, обнаруженном в клубнях картофеля, появилось в печати в 1963 г. /в.чПя, jiyan , 1963/. Нашими исследованиями /Громова, 1986/.было впервые установлено, что лектины листьев содержат вещества с антиферментной активностью. Это - ингибиторы трипсшшодоб-вых ферментов /ИТ/. Они были выделены по методу Ахen /1967/ на трип-син-агароэе из лектина листьев. Ингибитор химотрипсинподобного фор-■ мента /ИХ/ был выделен аффинной хроматографией на хкмотрипсин-агарозе из водорастворимых белков листьев. Установлено, что оба препарата -ИТ и ИХ проявляют свойства, Присущие лектинактивным веществам - агглютинируют эритроциты крови животных при титре 1:256 и концентрации балка, в указанном разведении равном 0,65-0,75 f/ил. Аналогичными свойствами характеризуется ИТ пшеницы /Мелентьев, Ямалеев и др., 1986/.

. ИТ и ИХ прж электрофоретическом исследовании /рис. 9/ в геле агар-агара в веронал-ацетатном буфере, рН 8,6 Ji 0,25 представлены двумя полипептидными цепями,, которые по подвижности соответствуют двум из четырех компойентов лектина с овогеля и друг другу. Оба компонента лектинактивны. ИТ выделяли также и' из суммарной фракции водорастворимых белков листьев. Полученный пренара» соответствовал по свойствам ИТ, выделенному из лектина. Ингибиторы трипсина и химотрипсина обладают сродством к углеводам, о чем свидетельствует их способность агглютинировать эритроциты,'что обусловлено углеводными компонентами последних, и то, что эта "способность подавляется Й-ацатил-Д-глюкоза-

■мином в той же концентрации, что и у лектинов.

При изучении иммунохимических свойств ИТ и ИХ установлено, что в составе этих биополимеров, кроме основных компонентов, еще присутствуют аналогичные по подвижности группе ®-2, их обозначали ИТ-2 и ИХ-2. г .! ■ •..■•'.

Иммунохкмическое сходство лектинов и гемагглютинируицих ингибиторов протеиназ. из листьев картофеля с биополимерами патогена '

Установлено, что ЛЛЦ, обнаруживая сходство с антителами к антигенам патогена /рис. 11/,. не выявляют специфики при взаимодействии с сыворотками к разным расам возбудителя фитофтороза /расы 0,1,4,1.4, 1.3.4., 1.2.3'.4/. Кроме того, ЛЩ нымунохимически сходны и-с экзо« ~ цсллгалярныги продуктами обмена ^итопатогена. Спектры их сходства как с эндо-, так и с экзоцеллюлярными биополимерами патогена оказались похожими -.все полипептидные цепи ЛЛЦ участвовали в перекрестной реакции. Лектины клубней картофеля /Ж-в 100/.также обнаруживали имму-нохимическое сходство с белками фитопатогена /рис. 11/.

■ ' " ""суадти«" Рис. II. Лектины листь'ев-ЛЛЦ

(I) и клубне П-ЛК-оЮО (И) картофеля (с.Столовый 19),перекрестно реагирующие с антителами к шщелиальнша и экзо-целлйлярнии белкам рас (0,1,

МЛ.,1.341.2.3.4.) возбудителя фятоутороза.

О ._„ О

о а

о О

О о

: о__ о _1234

Иммуноэлектрофорётическими исследованиями было установлено, что основные компоненты лектинов с овогеля /Л0/, в противоположность лек-тинам' листьев с целлюлоз /ЛЩ/, не выявляют.иммунохимического сходства с протеинами возбудителя фитофтороза. Аналогичная картина наблюдалась и с ингибитором трипсинподобных и химотрипсинподобных ферментов.

Подтверждением нашего предположения о том, что некоторые лектины не обеспечивают специфичности во взаимоотношениях с патогеном, является наличие одинакового спектра иммунохимического сходства в реакции полипэптидов всех взятых в исследование рас фитолатогена с анти-

"телами к лектинам растения /рис. 12/. Эти же полипептидные цепи белков патогена с анодной подвижностью перекрестно реагируют в ии-мунохииической реакции не только с лектинами, но и, как указывалось ранее', с суммарными водорастворииыыи белками листьев различных видов картофеля.

Рис. 12. Мицолиальные: водорастворимые /А/, тритонрастворимые /Б/ и экзоцеллюлярние антигены рас /0,1,2,4,1.4. Л.3.4., 1.2.3.4./ возбудителя фитофторо-за, перекрестно реагирующие о антителами к лектинам листьев с целлюлоз-ЛЛЦ и иммобилизованным такае к

на эритроцитах-ЛЭ, а такае лектинам клубней-ЛК-С 100.

Таким образом, стало возможным идентифицировать в суммарных водорастворимых белках листьев полипептидные цепи, сходные с.видоспе-цифаческими белками возбудителя фитофтороза - это лектины тех полипептидных цепей листьев растений, которые характерны ^ля'его рода и вида. Эти же компоненты растения обусловливают сходство о Ъкзоцал-" люлярньши антигенами патогена, его разных рас.

Нам представляется, что лектины, которые в неочищенной состоянии связаны о белками, характеризующими принадлежность к-виду и рот ду, очевидно, и выполняют функцию .неспецифического взаимодействия "-распознавании" патогена на молекулярном уровне. Остальные лектины, рассредоточеннив по другим полипептидным цепям, -очевидно, могут участвовать либо в специфическом взаимодействии, либо как лектины с овогеля,_ которые- не проявляют иммунохимического сходства с патогеном, осуществлять защитные или -какие-либо другие функций. -Таким образоц, лектины, как и белки, могут выполнять различные функции.

Неспецифическое взаимодействие на уровне обнаруженных агглюти-нинов-ЛЛЦ возмонно не только в отношении возбудителя фитофтороза, но и других микроорганизмов, поскольку они входят в состав .таких полипептидных цепей, которые сходны не только с различными расами такого полусапрофитного патогена как возбудитель фитофтороза, но и •с протеинами облигатного патогена - возбудителя рака.

Лектины листьев - показатели иеспецифической устойчивости картофеля к возбудителю фитофтороза Данные об изменении уровня активности геиагглютинируодих биополимеров в растениях, зараженных фитонатогенамп, свидетельствуют о

юм, что лектины связаны с механизмами защиты растении.

В связи с этим возникла задача определить, является ли содержание лектина генетически обусловленным критерием.

Исследованиями, основанными на учете титра гемагглютинацин соком из ластьсв картофеля, било установлено, что сорта различаются содержанием лектина, причем этот признак генетически детерминирован.

Характеристика свойства-устойчивости соргообразцов к возбудители фитофюрога по содержанию -эритроагглютининов в биополимерах листьев и клуби?,;, впервые осуществленная нами, совпадает с фитопатологичес-кой характеристикой. При этом установлена отрицательная корреляция между свойством устойчивости и содержанием лектина, т.е. чем выше устойчивость, тем ниже содержание лектина', и наоборот. Так, при характеристике сорта по лектина!.! ¡гшетьев устойчивость определяется титром от 1:4 до 1:256, при этой титры до 1:64 свидетельствуют о высокой несп-ецифичёской устойчивости картофеля к возбудителю фитофто-роза. Сорта картофеля, восприимчивые к возбудителю, характеризуются высоким содержанием-лектина, определяемым титром 1:1024 и выше.

При характеристике сорта по лектинам клубней граница титров смещаются. Так, к устойчивым относятся такие сортосбразцы, у которых титр эритроагглютинации 1:512 и пике, к восприимчивым относятся сорта или сортообразцы с титром эритроагглютинации лектинами клубней от 1:2048 и вше. Эти данные были получены на основании анализа 132 гибридных образцов и сортов. После линеаризации зависимых методом симметризации, разработанном Сергеевым /Васильев, Поляков, Сергеев, 1973/, в объединенной выборке /устойчивые и восприимчивые сорта/ обнаруживается высокая корреляционная связь свойства устойчивости растении картофеля, выражающегося в процентах поражения возбудителем фиг'офтороза с титром агглютинации эритроцитов соком листьев /лекти-иов/. Связь эта положительная - определяется коэффициентом корреляции г =0,834 и выражается графически моделью зависимости между этими величинами /рис. 13/. На основании данных этой модели можно су- • дить о проценте поражения растений. Кроме того, по алгоритму и программе, предложенной Сергеевым /1939/ для выполнения расчета графически, была построена номограмма. _

Пользуясь показателем титра, указанным 'в номограмме, можно онре-' делить свойство неспецифической устойчивости или восприимчивости растений картофеля к' возбудителю фит о фтор о за. . •

Рис. 13. Модель зависимости фитопатологицеской характеристики сорта картофеля по признаку устойчивости к возбудителю ёитофтороза от титра гемагглютинации /после линеаризации зависимых методом симметпизации/

Ингибитор гр:шсана как возможный критерий при селекции картофеля ¡¡а устойчивость к возбудителю фптофтороуа Результаты цсследовашй. по определенна ¡¡ТА, расщепляющего суб-С1рз?, представлении;: И1 -бонз соя- М -аргинин- п -нлтроанндлдо:;, /Га/ман,' Байсблау,1975/,свидетельствует о том, что тр!:пс:ш:!нг::с:'ру^-щдя активность в лиегьх картофеля - ато -чрезвычайно в&рзасодыий лока-•затель, что очевидно, обусловлено гекотллямаскака признаке« сорта.

После скжетркзуядах преобразований параметров/ПТА и % поражения растений/ проявляется слабое Елг.яние активности ингибитора на свопст-■ во устойчивости растении к возбудителю фитофтороза. При этом оно от-рщательное при низкой активности и положительное при высокой. Однако, низкий коээфиш:ент нелинейной корреляции /^ =0,11/ в данном случае не дозволяет сделать каких-Л3160 достсреркнх выводов о влиянии пн~ •гибиторов на свойство устойчивости.

Полученные результаты говорят о тем, что такой фактор клк общая активность ингибитора трипсина, не является существенным, или оиреде-.Ляюшим,. свойство устойчивости растений к фнтофторозу, хотя и прослеживается некоторая тенденция. Эти результаты не противоречат данным относительно функции ингибиторов, определяемых в отдельных полниептид-.ных цепях белков листьев.

Проведенные исследования выявляют коррелятивные связи ИТА и титра агглютинации. Для выборки, объединявшей восприимчивый и устойчивые сорта, зависимость демонстрирует явно двускатный характер /рис. 14/. Хотя коээфицнент нелинейной корреляции оказырается невысоким /^"=0,3/, бимодальный характер' распределения титра агглютинации статистически достоверен. Установлено, что коррелятивные связи обнаруживались толь-

Рис. 14. Коррелятивные , связи между ингибиторами • тшпеиновой активности ! /ЙТА/ и титром агглютинации эритроцитов клеточным соком зеленых листьев кар: тофеля ' ■

I

* Тигр

ко для ИТА и титра агглютинации, определяемых в зеленых листьях. ' ' Между количеством лектина в листьях картофеля и активностью ингибитора трипсина /ИТА/ существует связь определенного причинно-следственного направления. Она свидетельствует о том, что активность'ингибитора трипсина находится под контролем фитогемагглютининов, обратной связи нет.

Графические данные свидетельствуют, что низкому значению титра агглютинации соответствует высокая активность ингибитора. Среднему значению - .соответствует минимальное' значение активности ингкбирова-ния, которая опять.уйеличивается с ростом тйтра агглютинации эритроцитов соком листьев.

Существенный интерес представляет то, что положительная корреляция между титром' агглютинации и активностью ингибитора трипсина наблюдается у восприимчивых сортов, а отрицательная корреляция, между этими параметрами - у устойчивых сортов. 'Такие данные позволяют предположить, что механизм взаимодействия агглютининов и ингибиторов про-теиназ .у устойчивых сортов картофеля отличается от их взаимодействия у восприимчивых сортов, что"может отразиться и на процессах взаимодействия патогена и растения. •.

2.4 СХОДСТВО БЗЛКОЗ ПАТОГЕНА Ы РАСТЕНЛг-ХОЗЯИНА-ПЖПТСЕСКй ДЕГШДИНИРОВАННОЕ ЯВЛЕНИЕ.

¡г.кунохимическое сходство фитопатогенов и растений обусловливаёт-ся конкретными полипёптидными цепями патогена и растения-хозяина. При этом обнаружено, что приуроченность различных рас патогена к определенному сорту связзна с наличием комплекса иммунохишчески сходных полипептидов растения разного таксономического уровня /характерных

•для рода, вида, сорта/, также, как и у патогена, специфических для рода, вида, расы/. С использованием моноспецифических сывороток, то есть полученных к отдельным полипептидным цепям /электрофоретическим фракциям белков/, выявлены и конкретизированы такие полипептиды, которые определяют кммунохимическое сходство с каждой стороны во взаимодейству щей "системе". Эти полипептиды, как у патогена, так и у растения, представляются сложными в структурном отношении. Об этом свидетельствует избирательный характер взаимодействия их белков в кы-мунохимическом анализе. Это, в свою очередь, свидетельствует о том, что у полилептидной цепи может быть несколько детерминант, обуслов-ливапцих сходство /табл. 1/. Среди иммуносходных полипептидннх цепей растения можно выделить определенные группы, которые имеют одинаковый набор антигенных детерминант, обусловливающих сходство с определенными полипептидными цепями патогена.

Таблица 1. Характеристика электрофоретрческих фракций белков листьев картофеля сорта Столовый 19 по наличию антигенных детерминант, обусловливаниях перекрестную' реакцию с белками возбудителя фитофто-роза /раса 4/

1 и_♦ *_'_■_' ' '

.И П-» . ♦« * ♦ . » 1

Антигенный анализ с использованием моноспецифических сывороток и элюатов'белков отдельных фракций в качестве антигенов показал, что у-патогена наряду с полипептидными цепями, обладающими широким спектром иммунохимической сходности с белками растения-хозяина, тлеются и. такие, которые сходны только с 1-2-мя полипептидными цепями антигена. Антигенный; анализ позволил выявить степень иммунохимического сходства отдельных полипептидных цепей патогена и растения, их идентичность. 8 белках листьев сорта Столовый 19-'выявляется три полипептидных цепи тшунохимически идентичных протеину АП /А8-10/ патогена. Полагаем, что сиитез таких•белков детерминирован сходными-генами и что приуроченность патогена возможна лишь на основе общих /близких/- элементов генетических систем двух'организмов - патогена и хозяина, наличие ко-

•оммншчамвим оюмогая ■ и« «Р*»ВМ би«М КМДИ УККГ-

|Ц 1» 111 Ш 11 II я 9 5 , в 9 X Я м я X д 3 1 и I

к ♦ ♦ ♦ 4 и « • « » К »-11 * . »

11 « ♦ 1 с-} ♦ ♦ е • К ? ♦ » I и « *

4 • 4 »1 ; ! -

1 15-1« • • . 2

I

I *-*

торых обуславливает и проявление общности в синтезе икмунохимически сходных белков.

Судить о структуре генетических систем представляется возможным на основании изучения биохимических свойств белка. Так, о величине гена можно получить представление по размерам того белка,, который образуется под его контролем. Теория генетического 'кода предполагает, что аминокислоты в белке располагаются в той же последовательности, в какой кодонн расположены В гене.

В связи с новыми данньвш о сравнительном строении обычного гемоглобина *и его мутационной.формы /Дубинин, 1984/,считают, что один ген может кодировать одну полипоптидпую цепь, а.не весь специфический белок, состоящий из комплекса полипептидов. В 1957 г. Ингрем Впервые показал, что сложные пептидные смеси, ферментные гидролизаты можно анализировать двухмерным разделением с помощью хроматограф™ и электрофореза. Метод получил название "метод пептидных карт".

. Для исследования были использованы триптические гидролизаты шести пар иммуноразличных и сходных полипептидных цепей белков листьев двух сортов - Столовый 19 /1?^/ и Гатчинский /Е]/ и мицелия возбудителя фитофтороза, раса 4, которая совместима с одним и не совместима с. другим сортом. При этом установлено, что иммуносходные полипеп^ид-ные цепи растения и патогена /в совместимой и несовместимой комбина-ции/-характеризуются одинаковы?,® пептидными 'картами /рис. 15/, свидетельствующими о сходстве их первичных структур.

О ■ о

0 о

«. оыдтл и 1 Н

О '

О

Рис. 15. Пептидные карты иимунохи-мически сходных /К У1 и Щ/ и различных /КУ1 и К24, К26/ элюатов электрофоретических фракций белков мицелия возбудителя фитофтороза /раса 4/ и листьев растений картофеля сорта Столовый 19.

оо О о о 'О о о:

.I)

Нчличие в белках патогена и 'растения г.олипептидштх цепей, обнзру г.иващих им;.гунохкмическое сходство и имеющих одинаковые пептидные карты, является доказательством структурного подобия генов, контро-® рувдих синтез перекрестно реагирующих антигенов как.у патогена, так к у растенгя, т.е. далеко отстоящих друг от друга в эволюционном .

и

I ж

Плане видов. Пептидниэ карты иммунонесходных иолипептидних цепей отличаются друг от друга расположением фрагментов трнпгических пептидов. . \ Характеристика аминокислотного состава полипептидной цепи белна в виде брутто-формулы при наличии информации о перекрестно реагирущих компонентах белков патогена и растения и о их пептидных картах может либо подтвердить, либо опровергнуть выводы, сделанные о сходном строении первичных структур иммуносходных компонентов и о'том, что синтез последних контролируется генетическими структурами также со сходным строением. Поэтому изучение количественного состава связанных аминокислот представлялось чрезвычайно целесообразно. Количественное определение аминокислот в гидролизате проводили с помощью аминокислотного анализатора /марка ЗАТ-ЗЗЭ, Чехословакия/, весь процесс автоматизирован. Анализ сведений об аминокислотном составе и их количестве свидетельствует о том, что фракции белков патогена обладают близкими характеристиками с белками растения-хозяина, проявляющими иммунохимическое сходство, в отличие от белков,, не проявляющих такового. Эти данные при наличии ранее полученной информации являются подтверждением гипотезы о сходном строении генетических структур, контролирующих синтез перекрестно реагирующих полипептидных цепей растения 1; патогена.

Анализ количественного содержания аминокислот в отдельных сходных и несходных с патогеном полипептидных цепях растения представляет определенный интерес еще в связи с тем,'что исследованиями установлено терапевтическое действие аминокислот в отношении ряда фитопатогенов. Установлено, что в несходных с патюгеном полипептидных цепях растения /с катодной подвижностью/ двух аминокислот - гистидина и метионина, в 2,5 и 3 раза, соответственно, больше, чем у патогена /табл. 2/. В им-мунохимически сходных цепях растения и'патогена танже о катодной подвижностью,. обе аминокислоты находятся в равных или почти равных количествах; Остальные аминокислоты, которые, по данным публикаций, относятся к ингибиторам, в белках растения как сходных, так и несходных с патогеном, и с различной подвижностью в электрическом поле, содержатся либо в равных количествах с аминокислотами соответствующих полипептидных цепей патогена, либо в меньших. Защитная роль может быть, очевидно, связана с отдельными полипеитидными цепями, характеризующимися катодной Подвижностью.

В результате теоретических разработок по изучению экспрессии генов ■растений по признаку устойчивости наметился практический выход, который был использован нами при определении этого свойства у линий, гиб-рнцов к сортов пшеницы'в отношении возбудителя бурой ржавчины, при определении экспрессии гонов родительских форм .у гибридов картофеля в отно'лрш'и г-ог.^удг'те.пя фитофгороза, у 'линий, гибридов и сортов кукуру-

кмшиоп алвкт'эо*.СЕ»т*'иеч|в коцлоичвги Рмм« пятопма гостде! емтвмя Таблица 2. Аминокислотный

втощш» иеоюллш. состав иммунохимически

1п «1«-К) К 1 (К *-<) I 26 сходных и несходных белков

и» •ч щ. • А". II,! ' 11.5 1.9 28,7 15,5 1.7 . 2Б.0 27,5 15,0 возбудителя фитофтороза /раса 4/ и листьев картофеля сорта Столовый 19, проявляющие катодную подвиж- ; НОСТЬ

Г.г юл 15,7 «Л

г),) г»,в 10.' . . (

<■ 1. 15,2 17.7* «. в

гг* а.« - 7,0 ».5

. 22,7 22,2 26.2

«I. ' В.» 18,7

15,5 . ».0 6,1

1М1 м 2.1 11,1 •

II.» 12,1 11,5 4.3 •

1л» 17,5 »,« ' 1 7.8

1>Г 10,4 10,8 . 1 7.9

ГЬ. 1,5 5.» ' 6.9

зы,относительно возбудителей пыльной и пузырчатой головни. Прежде ■ ■ Всего, это было использование наших рекомендаций по определению свой ства устойчивости к фйтопат.огенам,. заключающихся в учете -таксономии

• белков растения и патогена, обуславливающих перекрестную иммунохими-ческу» реакцию. При этом важно установить, что белки родительских форм, перекрестно реагирующие с протеинами патогена, за исключением полипептидных цепей, характерных для крупных таксонов, не.передают этого свойства гибридным растениям. Кроме того, ватао обращать внимание на экспрессию в гибридах тех- генов, контроль которых за синтезом полипептидов у родительских форм обеспечивает отсутствие ишуно-химгческого сходства с протеинами патогена.

Наряду с этим проводились исследования по выявлению закономерное тей .наследования свойства устойчивости растениями кукурузы к головш бым и картофеля к возбудителю фитофгороза-, на основании изучения каталитически активных и иммунохимкчески сходных белков /Громова, .Сан-тас, Нитлова, 1976, 1981/.

Сравнительное изучение спектров исследованных ферментов позволи ло определить характер наследования их гибридами. Так, на призере гибридов картофеля и кукурузы установлено, что спектры амилазы и ка талазы. наследуются от восприимчивого родителя; пероксидаза, эстераз кислая и щелочная фосфатазы- от устойчивого; малатдегидрогеназа -от обо>.х родителей. Таким образом, наследование гидролитических фер ментов гибридом связано, в основном^с экспрессией генов устойчивог родителя. Преимущество в наследовании принадлежит материнской форме Но основной интерес представляли отдельные полипептидные цепи, ' проявляющие иммунохимическое сходство с протеинами патогена, с точ! зрения ферментативной активности. Полученные.данные позволил! выде-

:лить пояипептидныо цепи с ферментативной активностью, характерной для ' той или другой исходной формы, и проследить' их наследование гибридами Та!<, для устойчивых родителей характерно наличие более широкого спектра каталитически активных белков, особенно гидролитических, по сравнению с восприимчивым. Очевидно, гидролитическая активность в компонентах белкового спектра, проявляющих иммунохимическое сходство с белками патогена, у устойчивого вида, в отличив от восприимчивого, препятствует развитию патогена в тканях хозяина.

Проведенные исследования позволили предположить, что 1&личие активности пероксидазы в ряде полипептцдных цепей белков листьев картофеля, обладающих наибольшей и наименьшей подвижностью в гелэ агар-агара, и фосфатаз в отдельных компонентах, коррелирует с устойчивостью к возбудителю фитофтороза у изучаемого вида. Наличие же малат-актта-ности в полипептидных цепях, характерных для рода Зо1атш , коррелирует с восприимчивостью в первую очередь к расе 4 и, возможно, к расе 1. Другой компонент, с анодной подвижностью и такяе характерный для рода Бо1апии , свидетельствует о способности поражаться патогенами, так как проявляет татунохкмическсе сходство с изучаемыми расами у обоих родителей и у гибрида. Таким образом, для более 'точной характеристики наследования следует ориентироваться тленно на перекрестно реагирующие полипептидные цепи, а не только на сходство спектров белков и изоферментов родительских форм и гибридов, даже если протеиновый спектр у гибридов больше связан с экспрессией генов устойчивого родителя.

. ' Данные, полученные по детерминации синтеза сходных белков патогена и растения сходными генами, дополненные практическими разработка- , ми по.определению устойчивости-последнего, исходя из учета кммуно-сходных и 'различных структур, позволят вести обоснованную, работу по созданию-устойчивых сортов различных сельскохозяйственных культур традиционными методами, направленными на разрыв приуроченности патогена к своему хозяину, а также методами генной инженерии, исключая эмпирический подбор необходимых для трансформации в растение участков генетических структур, обеспечивающих его устойчивость.

- . 2.5" ЗМШЭЧЕШЕ

На примере рчда сельскохозяйственных культур и различных по проявлению паразитических свойств фитопатогенных грибов была вскшта ■природа их взаимодействия. Более подробно она изучена для системы возбудитель фитофтороза - картофель.

Взаимоотношения в системе патоген-растение-хозяин на молекулярном уровне обуславливаются комплексом высокомолекулярных соединений: гликопротеидов, лектинов, углеводсвязывающих, каталитически активных

■и структурных белков, синтез которых контролируется сходными генами. О сходстве структурной организации генов, кодирующих синтез сходных полипептидных цепей, свидетельствует.икмунохимиЧеское родство этих полипеитидов и их одинаковое строение. Доказательством этому является расположение фрагментов триптических пептидов на "пептидных картах" и одинаковые качественные и количественные характеристики аминокислот кг.-муносходных полипептидных цепей.

Сходными у патогена и растения являются такие биополимеры, у которых дсхоржпанты, обуславливающие "распознавание" друг, друга, по-, строены по типу №-ацетил-Д-глюкозамина. Эти детерминанты определяются среди гликопротеидов, углеводсвязыващих- и структурных белков, а также у лектинов. Ферментативноактивнне бедки патогена осуществляют "вмешательство" в метаболизм и гидролиз биополимеров /полисахаридов и белков/ в составе клеточных структур раст'ения. .Нарушения выявляются и средат.высокомолекулярных соединений растения /структурные- и ферментативноактивные белки, лектины/ и у низкомолекулярных /фенолы, фитоалоксины, аминокислоты/. Изменения и накопление перечисленных веществ свидетельствует о их защитном характере. В уровне этих изменений и их скорости реализуется свойство устойчивости /восприимчивое ти'. Особо следует отметить возможный защитный характер для полипептидных цепей растения, несходных с таковыми патогена, характеризующихся протеолитической активностью. Эти структуры и лектшш, также несходные с полипептидами патогена,. содержат в своем составе ингибиторы протеаз - ингибитор трипсина и химотрипсина. Известно, что иш биторы характеризуются высокой специфичностью взаимодействия с субстратом. Если ке учесть сведения об ингибируидем действии лектинов растений на прорастание фитопатогенных спор грибов, то их можно отнести к ингибиторам протеаз. В полипептидных цепях растения, несходных с таковыми патогена, содержится, крона того,.в 2,5-3 раза больш акилокислот /гистидин и метионин/, обладающих терапевтическим дейст виеМ л отношении многих фитопатогенов. Бее перечисленные группы веществ, участвующие в.образовании патосистемы, обуславливают неспеци фическое и специфическое взаимодействие в системе патоген-растение.

Так, группа полипептидных цепей белков, характеризующая крупные таксоны растения: род, вид, сходна не только с полипептидами разных ■ рас одного вида, но и с таковыми разных видов патогена. В этой груг пе белков, например у картофеля, происходят однотипные изменения в' ответ как на грибную, так и вирусную инфекцию, обуславливая проявда ние неспецгуической реакции. К зтой группе.приурочены еще к лактиш которые сходны с полипептиднытж цепями разных ряс возбудителя фгто-¡¡тороза. Они характеризуют крупные таксоны систематики патогена -

его вид.

• Взаимоотношения фитопатогепа и растения, обусловленные глза;опро-теидами цитоплазмы, так же, как и названные выше лектшш, вскршают урЬвень неспецифических отношений в системе.

Кроме перечисленных биополимеров, неспецифический характер взаимоотношении обуславливают поллпептидние цепи растения, идентифицированные с рибулозодифосфаткарбоксилазой. Одновременно осуществляется специфическое взаимодействие, связанное с комплексом биополимеров, сочетающих- ферыентативцсактиыше-, углеводсвязивагадпе-, структурные белки и лектшш. Последние отличаются от лектинов, участвующих в осу-ществлешш неспецифических связей в системе патоген-растение, тем что не проявляют сходства с протеинами патогена и содержат ингибитор протеаз. Лектшш по-разному осуществляют контроль за активностью ингибитора трипсина у устойчивых и восприимчивых сортов.

В полипептидних цепях растения, несходных с таковыми патогена, содержащих лектины и ингибиторы протеаз, наблюдается более дифференцированная ответная реакция на грибную и вирусную инфекцию. Сходство на уровне гликопротеидов мембранных структур растения /хлоропластов/ обусловливает большую специфичность при взаимодействии с патогенен, чем на уровне цнтозольных глпкопротеидов. Сходство подопептидных цепей белков патогена и растения отражает специфику их приуроченности, связанную с генотипом.. Можно воспроизвести своеобразную топографию биополимеров растения на электрофореграмме, обусловливающих специфические и неспецифические отношения в системе патоген-растение /схема/|

структурно- , шзшодсвдзывасще-, фжднтатжшо аиибше

ЕЕЛШ-спецполка

МЕМБРАННЫЕ .ШШРОТШН

специфика

БЕЛК'НИШЕйТОРЫ-специ^ка

Л0,ИТА,ИХА-

.специфика'

ЖБУЗЮЗОЖ ФОСФАТКАР-ЕОКОЩЗА-"ФрЦаГ

неспецифика

старт

ЦИТОЗОЛЬЛЫЕ ГЛИКОПРОТЕИДЫ-

неспецифика неспецифика

сопутствующие Л0-2-

белм, ллц-

неспецифяка

[сопутствующие НТА-2-| неспецифика)

сопутствующие ЛДЦ-неспецифика

Все сходные полипептвдные цепи патогена и растения, обуславливающие перекрестную реакцию, локализованы в первичной клеточной оболочке - тонопласте, прилегающей к ней пла.змолеше, мембранах хлороплас-тов и цитозоле клетки листа. У патогена перекрестно реагирупцие цепи локализованы в цитоплазматической оболочке. Таким образом, сходные полипептидные цепи, осуществляющие со стороны патогена мимикрию, а у растения "распознавание" этих.мимикрийных антигенов, локализованы в структурах клетки листа, • первыми вступающих в контакт и осуществляющих последующее взаимодействие. - .

В соответствии с существующими специфическими и неспецифическими уровнями взаимодействия патогена и растения-хозяина были разработаны методы определения специфической и неспецифической устойчивости растений к фитопатогенам. К специфическим относятся: методы, учитывающие таксономию сходных полипептидных депей, позволяющие также определить экспрессию генов родительских форм по признаку устойчивости к фитопа-тоге'ну в гибридных поколениях; метод учета специфической ферментативной активности в иммуносходных полипептидных цепях белков и ферментов растения, его мобилизационных возможностей. К неспецифическим методам характеристики свойства устойчивости/восприимчивости растений относится метод определения неспецифической устойчивости растений картофеля . к возбудителю фитофтороза по титру фитогемагглютининов - лектинов в листьях.

Результаты исследований могут быть использованы для дальнейшего развития фундаментальных работ по фитоиммунитету и как методологическое обоснование подбора действующего начала фунгицидов. '

ВЫВОДЫ

1. .Синтез перекрестно реагирующих, или иммуносходных белков патогена и растения-хозяина, обуславливающих паразитизм, контролируется . . сходными-генными структурами. Это-доказано на примере системы карто-фельтвозбудитель фитофтороза и обнаруживается в наличии одинаковых пептидных карт и одинаковом количественном и качественном составе аминокислот у иммуносходных полипептидных цепей.

• 2. Антигены растения, перекрестно реагирующие с таковыми патогена, локализованы в мембранных структурах клетки: -плазмалеше,• мембранах эндоплазматического ретикулума, мембранах хлоропластов /наружных/, а также в. клеточной оболочке. Антигены фитопатогена, перекрестно реаги-рупдие с антигенами растения, локализованы в клеточной 'оболочке гиф мицелия я зооспор. ' '

3. Среди антигенов листьев картофеля обнаружены лектины двух типов. (.Одни - Л-ГЦ проявляют имл/нохгмичсское сходство с антигенами разных

'рас патогена, в чем проявляется неснецкфичность взаимодействия растения и возбудителя болезни на молекулярном уровне, другие - JiO не обнаруживают пм.гунохпмпческого сходства с протеинами возбудителя £кто-фтороза и но элчитроиодтишоств отличашся or ад.

-1. Лг-ктшш с obori-i.CT содержат в своем составе кнгиоитори трипсин-подойных ферментов, ксторие выделены из него методом аффинной хрсма-тографпи.

5. АМитювидолштпе из листьев картофеля ингибиторы проф&инаэ: ингибиторы трипсиннодобпих и химотрипсинподобнцх ферментов гетерогонии /по две полипептндние цепи/, проявляют гемагглытинирувдую, или лектин-ную, активность, характеризуются аффинитетом к углеводам и не проявляют кммунохимичрского сходства с антигенами патогена.

6. Наличие в листьях картофеля биополимеров имлунонесходных с протеинам] патогена, проявляющих геиагглвтиниру ицио, а также ингибирув-щие свойства, и, кроме того, содержщио в большом количестве аминокислоты, характеризующиеся терапевтическими свойствами относительно фито-патогенов, позволяат говорить о ряде полипептидных ценой белков листьев с катодной подвижностью как о веществах, выполняющих р растении защитную функцию.

7. Между jiGKTKH'ir.j листьев и БАПА-зн зависимыми ингибиторами трипсина установлена причинно-следственна!! связь, свидетельствующая о том, что фнтогемагглйтинины контролируют активность ингибитора трипсина. Обратной связи нет. При этом у устойчивых сортов картофеля наблюдается отрицательная корреляция между количеством лектипа и ¡ITA,

у восприимчиглос - положительная.

В. Х'пктилы листьев, полученные методом последовательной хроматографии на целлюлозах /ЛИЦ/, а также аффинной хроматографией на овогело ЛЮ/, характеризуются й-адетил-Д-^глюкозагашной специфичностью так же, как пзтер'/ипантп перекрестно реагирующих белков и' гликопротэидоз па-гогг-.a.j и растения. С детерминантами, построенными по типу названного if'i'b'nc'-.xapa, у лектинов также связываются процессы "распознавания". ■ 3. Устпн./ншю, что некоторые перекрестно реагирующие /ПГ/ антнге-в; растения и Знтспатогена представлены гликощютендами. Спектр IIP iHTurehOB растения и патогена, представленных гхлкоиротг-идами, пролв-ыот различную специфичность. в зависимости от локализации антигенов ! клеточных структурах. Специфичность во взаимодействии патоген-растение на молекулярном уровне обеспечивается гликопротаидами клеточных кмбран растения, шзспецифическоо - обусловлено, глг.конротоидага, со-(ер'кащимися в цитозольной франции клеток листа.

10. Антигены растенияперекрестно.реагируксио в И№унохт№Ч-зской >еакцги с биополимерами патогена, параду с гликогротевадами, представ-

лены углеводсвязывавдши белками.

11. В качестве гаптена при перекрестных иммунохимических реакциях между белками, а также гликопротеидами .патогена и растения-хозяина выступает й-ацетил-Д-глшозамин, который выполняет функции рецептора при распознавании фитопатогена. ■ . ■ .

12. Г&зработаны метод и модель' определения неспецифической устойчивости картофеля к возбудителю фитофтороза•по лектинам листьев.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

♦

На основании исследований,, проведенных на ряде систем фитопатоген-хозяия: картофель - возбудитель фитофтороза, рака;-пшеница - возбудитель бурой ржавчины; кукуруза - возбудители рыльной и пузырчатой головни; хлопчатник - возбудитель вертициллезного увядания, автором рекомендовано: 1. проводить определение Свойства устойчивости сельскохозяйственных растений к различным по выраженности паразитизма фитопатогенным '■ микроорганизмам /их расам/ на основании учета таксономии иммунохимичес-ки сходных антигенов /с использованием сыворотки к белкам патогена/; 2. определять свойство неспецифической устойчивости растений картофеля к возбудителю фитофтороза, используя в качестве критерия титр гемагглю-тинируицей способности клеточного сока листьев растения; 3. выявлять на самых ранних этапах селекции свойство экспрессии признака устойчивости родительских пар, производить отбор устойчивых линий, гибридов, сортов /образцов/ на основании знания характера передачи родительскими формами качертвенной специфики белкой - иммунохимических фенотипов -гибридам, в том числе иммуносЗ:одных и'несходных с патогеном; 4. ислоль-аовать характеристику ферментативной активности в ПР полипептидных цепях патогена и растения в качестве критерия для выявления характера наследования гибридами признаков родительских форм, а также для ялреде ления свойства их устойчивости к фитопатогейам; 5. использовать данные о гликопротеидах, лектинах, белков,' ферментов и их ингибиторов для соз даниямоделей сортов различных сельскохозяйственных культур, устойчи-. вых к фитопатогенам; 6..выделение лектинов методом аффинной, а также последовательной хроматографии на целлюлозах дополнять элеткрофорети-ческим разделением, чистоту их выделения проверять иммуноэлектрофореи • ческим тестированием; 7. использовать для разработки фунгицидов, применяемых против фитопатогенов, содержащих в оболочке хитин или хитин' подобные вещества, в качестве действующего начала К-ацетил-Д-глюкоза-мян.

Список основных статей, опубликованных-по материалам диссертации.

1, Громова Б.Б.-О., Шопина В.В., Патрикеева М.В. Характеристика ответных реакций растений на заражение различными патогенами.//Труды У Всесоюзного совещания по иммунитету растений.-Киев.19G9.С. 20-22.

2. 5едотопа Т.П., Шопина В.В., Громова Б.Б.-О., Повышение эффективности работ по селекции пшеницы на устойчивость к видам ржавчины.//

В кн.: Сборник докладов Европейской и Средиземноморской коЯферешц'.и о ржавчине хлебных злаков. Прага.-1972, С. 99-107."

.3. Громова Б.Б.-О., Шопина В.В. Мобилизационные возможности и специфичность ответных реакций на заражение бурой расавчиной.// Микология и фитопатология. 1972. Т.6. В.6. С.528-529.

, 4. Голик И.В., Громова Б.Б.-О., Федотова Т.И. Об иммунохимичесной сходности белков Synehytrium endobioticum (ScUilb.) Pers И раствНИЯ-хозяина.//Труды ВИЗР. 1973. JÎ36. С.107-112.

5. Громова Б.Б.-О. Специализация Ehytophthora infestans м. d.B.

и кммунохимическая и электрофоретическая характеристика белков возбудителя. //Научно-технический бюллетень ВИЗР: 1974.-К27.Ч). 45-49.

6. Федотова Т.И., Громова Б.Б.-О. Паразитизм фитопатогенных организмов. //ВШШТЭИСХ, МСХ CCCP.-U: 1974.-57 с.

7. Feiiotova T.I., Gromova B.B.-O. Tlie'Law of Parasitism.

// XÏÏ Международный конгресс по ботанике. Л. 1975. . • •

8. Громова Б.Б.-О., Гусева H.H., Лантас Е.С. Реакция растения на иммунохимически сходный'и несходные белки патогена //Микология и фи' топатология. 1975.-Т.9.-В6.-С. 494-500.

,9. Громова Б.Б.-О., Лантас Е.С. Выявление иммунохимически сходных компонентов белков- возбудителя фитофтороза картофеля и его растения-хозяина с использованием моноспецифических сывороток // Иммунитет сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям. Труды ВАСХШШ. М.:Колос,'1975.-С. 39-46.

■10. Громова Б.Б.-О., Гусева H.H., Лантас Е.С., Тимчук К.С. Биохимические методы изучения иммунитета сельскохозяйственных растений к болезням.// В кн.: Методы исследований патологических изменений. М. 1976.-C. 3732'.- - ;

11. Громова Б.Б.-О., Лантас B.C.', Китлова H.A. Наследование свойства устойчивости к фитофторозу гибридами картофеля// Ш съезд Украинского общества генетиков и селешцюнеров.-Киев:1976.

12. fiiiseva N.N; , Groiuovft B4li.-0. Г.гояя heactlne Antigenes of mown bust Clausal Anient ana Uheat Planta in Immun > log loa 1 Testa-// Fourth bui opean and Xlert ite i rum;an Cureal liusts Conference. Intorlakon

/swiL zei JixiMl//.Pio<:f odi(i{;s.-Zuíii:h-Jiocli.eiili'jlí :1976.- S, 13-14.

13. Гусева H.H., Громова Б.Б.-0., Левитин U.M. Разработка физиоло-го-биохпмических и генетических подходов в селекции растений на устойчивость к болезням // В кн.: Проблема защиты растении от вредителей болезней и сорняков. Научные труды ВАСХНИЛ. М:Колос. 1979, С.123-128.

14. - (Juseva N.N., G rom.i va Ii-b-^JJ. , Lantaa 1Î.C. Сruas-rene tlu.-i anti-íi'iis or [Minsens arid tlioir host planta // Acta I'lij top.i t!i. Aoaii. Soi. Ilung. £4 7,4. V.rl, N 3/4. - P. 449-452. .

15. Громова Б.Б.-О. Определение устойчивости сельскохозяйственных растений к фитопатогенним организмам по иммунохимическому сходству белков // Зкспресс-методы диагностики устойчивости растений к болезням. Методические указания. ВАСХНИЛ.-М. :1980.-С. 23-25.

16. Громова Б.Б.-О. КммунохимИческие исследования для разработки принципов селекции растений на устойчивость к болезням // В кн.: Устойчивые к болезням сорта с.-х. растений в условиях концентрации и специализации производства. Л.,1981. С. 70-77.

17. Громова Б.Б.-О., Лантас Е.С., Еитлова H.A. Наследование свойст) исходных форм растений по изоферментным спектрам // В кн.:" Устойчивы! к болезням сорта с.-х. растений в условиях концентрации и специализации производства. Л., 1981. С. 78-85.

18." Громова Б.Б.-О. Иммунохимические свойства белков в связи с селекцией растений на устойчивость // Всесоюзная конференция "Проблемы и пути повышения устойчивости раст&ний к болезням и экстремальным условиям среды в связи с задачами селекции". Тезисы докладов.-Л. ,1981.• Ч.З. С. 5G-57.

19. Громова Б.Б.-О., Лантас Е.С., Житлова H.A. Использование метод анзимфореза для диагностики устойчивости растений //Всесоюзная конференция "Проблемы и пути повышения устойчивости растении к болезням и экстремальным условиям среды в связи с задачами селекции". Тезисы до: ладев. Л., 1981.-Ч.4." С. 70. .

20. Громова Б.Б.-О., Роль перекрёстно реагирующих антигенов в фито-иммунитете // УП Всесоюзное совещание по иммунитету.сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям. Тезисы донладов.-Омск, Ново сибирск: 1981. - С. 11-12. • -,

21. Громова Б.Б.-О., Лантас Е.С. Гликопротеиды в проявлении ппраэи тизма'фитопатогенов // Там же. С. 13. • .

22. ГусеЕа H.H., Громова Б.Б.-О., Лантас Е.С. Общие антигены фито-патогенов и растений // Научно-методические основы селекции сортов рерновых культур, устойчивых к неблагоприятным факторам климата. -Яодипо: 1981.-С. 51-53. • -

'• 23. Громова Б.Б.-О., 1^сева H.H., Лант&о Е.С. Лдаунохимическиа и биохимические методы в иммунологии растений. Методические указания. ВИЗР. Л: 1982. 30. с.

24.-Громова Б.Б.-О. Иммунохпмические подходы к изучению свойства паразитизма фитопатогенов // В кн.: Изменчивость фитопатогенных микроорганизмов. М., 1983. С. 21-31.

25. Громова Б.Б.-О: Роль лектинов при взаимодействии фитопатогена и растения-хозяина // УШ Всесоюзное совещание по иммунитету растений к болезням. Тезисы докладов.-Рига: 1986.-С. 9.

25. Громова Б.-Б.-О., Лантас Е.С. Ускорение оценки растительного материала на устойчивость к болезням при использовании иммунохимических методов // Сводный координационный отчет за 1986 г. ВИЗР.-Л.: 1987. С. 149-153.

26. Громова Б.Б.-О., Лантас Е.С. Воль изофврментных систем во взаимоотношениях растений и фитопатогенов // Теоретические основы иммунитета растений к. болезням: Л.: 1988.-» С. 54-58.

27. Громова Б.Б.-О. Кммунолюминбсцентная микроскопия в познании взаимоотношения паразит-хозяин // Там же. С. 26-39.

28. Громова Б.Б.-О. Лектины картофеля, иммунохимичес;<и'сходные с биополимерами возбудителя фитофтороза // Физиолого-биохимические основы иммунитета к грибным болезням растений. Сб. тезисов.-Уфа: 1988. С. 18.

29. Громова Б.Б.-О., Ямалеев A.M., Мелентьев А.И.', Исаев Р. Лектины и ингибиторы некоторых протеаз'из листьев картофеля // Там же.

С. 19.

30. Громова Б.Б.-О. Взаимоотношения в системе'возбудитель фитофто-.роза-картофель на уровне лектинов // Изучение и применение лектинов. ученые записки Тартуского университета.-Тарту: Изд-во ТГУ. 1989. Вып. 870.-Т.2,.С. 76-81. ' ' • •''•'•

31. Qromova H.H.-О. Potato Leaf Lectins arid their Hole In Plant Keaiatenee to Phytophthora inffjstana (Hont) de Вагу.//Proceedings at tlie IT-th Internntimil Lectin Conference.-Tartyj 1999. P. 23.

' 32. Громова Б.Б.-О., Патрикеева M.B., Зуева О.И.,' ЛСитлова H.A., Осипова Е.И. Определение неспецифической устойчивости картофеля к возбудителю фитофтороза по лектинам листьев. Методические указания. 'ВИЗР. Л. :19Э0. 12 с. ' ' . • '

.', 33. Громова Б.Б.-О.,'Ямалеев A.М1. .Мелентьев А.И. Выделение фитогем-агглютининов из листьев картофеля. Методические указания. ВАСХНШ. ВИЗР:-Л. ,1990 - 32 с.