Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности внутриклеточного транспорта растительных токсинов, используемых в составе иммунотоксинов

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности внутриклеточного транспорта растительных токсинов, используемых в составе иммунотоксинов"

московский государственный университет

им. м.в. Ломоносова г „ _

' ■ ^ I/ А

Биологический факультет 2 Я '{[ОН ?ППП

На правах рукописи

Машоченко Наталия Валериевна

УДК 57.083.3

ОСОБЕННОСТИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА РАСТИТЕЛЬНЫХ ТОКСИНОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В СОСТАВЕ ИММУНОТОКСИНОВ

03.00.25- клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2000

Работа выполнена на кафедре клеточной физиологии и иммунологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: Доктор биологических наук

профессор М.В. Гусев

Кандидат биологических наук, С.Г. Егорова

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук

профессор В.Г. Галактионов

Кандидат биологических наук С.П. Домогатский Ведущая организация: НИИ трансплантологии и

искусственных органов МЗ РФ

Защита состоится «__»_2000 г. в_ч_мин на

заседании специализированного совета Д.053.05.95 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, ауд._.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан «__»_2000 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат

биологических наук ^ /^¿х^Н-В. Воробьева

1 1

Актуальность темы. Высокая цитотоксическая активность белковых токсинов растительного происхождения привлекает к ним особое внимание. Каталитические части токсинов широко применяют для создания химерных соединений - иммунотоксинов (ИТ), способных элиминировать определенные клеточные популяции. Подобные препараты направленного действия используют при терапии опухолевых и аутоиммунных заболеваний, при трансплантации органов. Однако низкая эффективность действия ИТ ограничивает их применение в клинической практике. Одна из причин низкой активности - несовершенство внутриклеточного транспорта искусственных конъюгатов по сравнению с нативными токсинами. Поэтому изучение внутриклеточного транспорта (ВТ) токсинов и их производных является актуальной задачей не только теоретической, но и практической молекулярной биологии.

Сами токсины представляют собой удобный объект для изучения внутриклеточного транспорта белков. Белки из семейства РИБП задействованы в самых разных процессах транспорта: связывание с клеточными рецепторами, рецептор-опосредованном эндоцитозе, прохождение через эндосомальные компартменты, транспорте белков внутри аппарата Гольджи, ретроградном переносе из аппарата Голъджи в эндоплазматический ретикулум и, наконец, в процессе трансмембранного переноса. В ходе своего внутриклеточного транспорта токсины связываются со многими клеточными структурами, обеспечивающими механизм внутриклеточного движения белков и поэтому могут служить зондами для доставки белков и пептидов в определенный клеточный компартмент [^ептагк е1 а!., 1991]. Например, возможна доставка малых пептидов к молекулам МНС I класса для антигенной презентации на поверхности.

Изучаемый в работе вискумин из омелы белой, является одним из наименее изученных среди известных токсинов семейства РИБП. Однако, дальнейшее изучение данного белка представляется перспективным благодаря ряду свойств вискумина. Было показано, что ИТ на основе каталитической субъединицы вискумина более активны, чем ИТ на основе А-субъединицы рицина [ТопсуЦзку ег а1., 1996]. Кроме того, экстракты омелы белой обладают иммуномодуляторной, апоптотической и антимутагенной активностью, благодаря чему широко используются в течение ряда лет в

качестве противоопухолевых препаратов в странах Европы [Bussing et al., 1997а].

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было исследование отдельных этапов внутриклеточного транспорта вискумина с помощью модельных систем - гибридом. Кроме того, целью работы изучение влияния векторной и цитотоксической части на эффективность иммунотоксинов, направленных к меланомо-ассоциированному антигену - HMW-MAA.

Для достижения цели были поставлены конкретные задачи:

1. Получение гибридом, продуцирующих монАт против нативной и денатурированной формы А-субъединицы вискумина. Изучение специфичности, аффинности полученных монАт.

2. Изучение устойчивости данных гибридом к цитотоксическому действию вискумина и рицина.

3. Получение иммунотоксинов, на основе антител 225.28 и 763.74 и каталитических субъединиц рицина и вискумина. Изучение свойств полученных ИТ.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получена панель монАт, распознающих различные детерминанты каталитической субъединицы вискумина. Получение высокоаффинных моноклональных антител MNA способствовало созданию чувствительной и селективной тест-системы по определению содержания токсических лектинов из омелы белой.

Получены свидетельства, что вискумин претерпевает различные модификации в ходе внутриклеточного транспорта токсина, а именно, происходит диссоциация субъединиц и разворачивание каталитической субъединицы вискумина до момента транслокации белка в цитозоль.

В целях получения высокоэффективных препаратов направленного действия к меланоме были созданы и охарактеризованы ИТ на основе разных монАт к меланомо-ассоциированному антигену HMW-MAA и разных каталитических субъединиц токсинов. Впервые проводили сравнение связывающей и цитотоксической активности данных конъюгатов на шести меланомных линиях.

Полученные свидетельства о модификациях каталитической субъединицы MLA могут быть использованы для дальнейшего изучения транспорта РИБП и их производных.

Наиболее эффективные in vitro конъюгаты к меланоме могут быть использованы для создания рекомбинантных аналогов иммунотоксинов. Апробация результатов и публикации. Результаты работы были доложены на международной конференции COST98 (Германия, 1996), на П съезде биохимического общества РАН (Россия, 1997), на международной конференции для молодых ученых «Экзоцитоз» (Франция, 1998), на III конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 99» (Россия, 1999). Апробация диссертации проведена на заседании кафедры клеточной физиологии и иммунологии МГУ им. М.В. Ломоносова. По материалам диссертации было опубликовано 13 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 151 страницах, иллюстрирована 28 рисунками и 8 таблицами. Список литературы содержит 210 источников.

Материалы и методы

Клетки и антитела. В работе были использованы клеточные линии: миеломные клетки sp2/0 (Институт Канцерогенеза, Москва), клетки меланомы кожи человека: Melur, Colo38, Fol, S-5 (Нью-йоркский медицинский колледж, США), FM3D (Дания), HL60 (Институт Канцерогенеза, Москва), лимфомы L14 (Нью-йоркский медицинский колледж, США), а также полученные в ходе работы гибридомы. Клетки культивировали в 5-6% С02, 37°С, RPMI 1640 10% FBS). Гибридомы -HAT/RPMI1640. За исключением полученных в нашей лаборатории, в работе использовались моноклональные антитела: ТА5 («Госниигенетика», дбн Агапов И.И.), 763.74 (IgGl) и 225.28 (IgG2a) (Нью-йоркский медицинский колледж, США, проф. Солдано Ферроне).

Выделение и очистка токсинов Рицин и агглютинин рицина экстрагировали из семян клещевины Ricinus communis по методике [Nicolson et al., 1972]. Выделение вискумина проводили из листьев растения Viscum album по модифицированной методике [Pfuller et al., 1994]. Разделение субъединиц токсинов проводили с помощью аффинной, ионообменной хроматографии. Чистоту препаратов контролировали электрофорезом в 8% ПААГ в денатурирующих условиях [Laemmli et al., 1970], а также с помощью ТИФА. Получение гибридом, очистка монАт. Для получения гибридом, продуцирующих антитела к нативной форме А-субъединицы вискумина (MLA), мышей линии Balb/C (пит. Столбовая) иммунизировали по схеме: 1,2 инъекции - 20мкг ML А/мышь с ПАФ, 3,4,5,6 инъекции - Юмкг ML А. Гибридомы к денатурированной форме получали иммунизацией мышей с ПАФ. Эффективность иммунизации, а также в последующем скрининг гибридом проводили ТИФА. Слияние иммунных селезеночных лимфоцитов и миеломы Sp2/0 проводили на третий день после последней иммунизации в ПЭГ (Mr 4000) [Davidson et al., 1977]. МонАт выделяли из асцитной жидкости мышей методом аффинной хроматографии на протеин А - сефарозе [Еу et al., 1978]. Чистоту препаратов контролировали с помощью электрофореза в 12%ПААГ в денатурирующих условиях по [Laemmli et al., 1970]. ТИФА и иммуноблотинг. Изучение взаимодействия антител с антигеном проводили в различных системах ТИФА: 1 - антиген на плате, 2 - антиген в растворе, 3 - сэндвич-ТИФА. Антиген (растительные токсины) модифицировали с помощью тепловой денатурации, изменением pH, добавлением восстанавливающих агентов. Для оценки эпитопной направленности монАт использовали конкурентный ТИФА. С помощью ТИФА также определяли константу аффинности полученных монАт. Количественную оценку взаимодействия антител и их производных - ИТ с клетками проводили клеточным ТИФА. Взаимодействие оценивали либо с помощью вторых антител против иммуноглобулинов мыши (1:10000), меченных пероксидазой (IMTEK, Россия), либо в системе биотинилированный антиген +стрептавидин-пероксидаза. В качестве хромогенного маркера пероксидазной реакции использовали о-фенилендиамин (Sigma, USA). Калориметрические измерения проводили на мультискане фирмы Labsystems (Финляндия) при 492 нм.

По взаимодействшо антител с фрагментами вискумина, представленными в виде пептидов, фиксированных на носителе, проводили картирование эпитопов антител. В качестве хромогенного маркера 1ероксидазной реакции использовали 2,2'-азино-ди(3-этил)-эензоазолинсульфоновую кислоту (АБТС, Sigma, USA). Реакцию измеряли при 405 нм.

Иммуноблотинг проводили согласно методике, описанной ранее [Towbin et al., 1982]. После ЭФ в 12% ПААГ токсины переносили на иитроцеллюлозную мембрану полусухим методом в течение 1 часа при 150 мА, 20 V. В качестве хромогенного маркера пероксидазной реакции использовали хлор-нафтол (Sigma, USA).

Предсказание и сиптез пептидов. Пептидпый ТИФА. Расчет проводился по третичной структуре вискумина с использованием программы DSSP для расчета степени экспонированности аминокислотных остатков [Kabsch et al., 1983], а также с учетом значений температурных В-факторов, вторичной структуры и вариабельности аминокислотных последовательностей в ряду гомологичных белков [Jameson et al., 1988]. Были предсказаны наиболее иммуногенные области А-субъединицы вискумина. На основании предсказания были синтезирйваны 80 пептидов, длиной в восемь аминокислотных остатков. Синтез пептидов на полиэтиленовых иглах проводился с использованием F-moc производных аминокислот в присутствии эквимолярного количества 1-гидрокси-бензотриазола, согласно инструкции фирмы-производителя Cambridge Research Biochemical Со, UK [Worthington et al., 1994].

Получение и очистка иммунотоксинов. ИТ получали по описанной ранее методике с использованием гетеробифункционального агента N-сукцинимидил-3(2-пиридилтио-) пропионат (СПДП) [Carlsson et al., 1978]. Количество введенных ПДП-групп оценивали спектрофотометрически (343 нм и 280 нм). Очистку полученных коньюгатов от свободных антител и А-субъединицы токсина проводили с помощью гель-фильтрации на колонке TSK-3000SW (26 ммхбО см) в системе HPLC. Степень очистки оценивали 8% ПААГ и ТИФА с помощью поликлональной сыворотки, направленной как против MLA, так и против RTA. Для дальнейшей работы ИТ стерилизовали через мембранные фильтры Millipore. Концентрацию стерильных агентов

определяли с помощью ТИФА по содержанию иммуноглобулинов и содержанию каталитических субъединиц токсинов.

Связывающая я цитотоксическая активность ИТ. Связывающую активность полученных ИТ оценивали качественно с помощью иммунофлюоресцентного метода (ИФ) и количественно с помощью клеточного ИФА на антиген-позитивных и антиген-негативных клетках. В качестве вторых антител для ИФ использовали AT против иммуноглобулинов мыши, меченные ФИТЦ (ин-т Гамалея, Москва). Реакцию оценивали при помощи флуоресцентного микроскопа (Leitz, Германия), при 250х или 400х увеличении.

Цитотоксическое действие токсинов определяли по выживаемости клеток в присутствии токсинов с помощью раствора МТТ (2-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразолиум бромид, "Sigma") [Mossman et al., 1983]. Измерения оптической плотности проводили на мультискане фирмы Labsystems при 595 нм. Согласно методике величина оптической плотности прямо пропорциональна числу живых клеток [Mossman et al., 1983]. Для сравнения активности токсинов на разных гибридомах, использовали величину ЛД50, или доза токсина, вызывающая гибель 50% клеток. За контроль (100%) принимали интенсивность окрашивания клеток, которых культивировали в отсутствии цитотоксических агентов. Приготовление аффинной колонки с moiiAt MF11-30. Приготовление аффинной колонки и очистка белков на ней проводили согласно рекомендациям фирмы-производителя аффинного сорбента HiTrap (Pharmacia Biotech, USA). Эффективность связывания монАт MF11-30 и содержание белков в собранных фракциях после элюции с колонки проверяли спектрофотометрически (280 нм).

Результаты и обсуждение

1. Гибридомы к нативной форме А-субъедииицы внскумина

В качестве модели изучения транспорта токсинов использовали гибридомы, продуцирующие антитела к токсинам [Youle et al., 1987]. Исследуя явление устойчивости гибридом, авторы пришли к выводу, что

устойчивость гибридом к цитотоксическому действию белка определена внутриклеточным взаимодействием токсинов и антител. В ходе слияния и скрининга были получены моноклопы (МИА), продуцирующие антитела к нативной форме А-субъединицы вискумина. Свойства антител серии МЫА изучали в различных модификациях ТИФА. Для изучения внутриклеточного транспорта была отобрана группа гибридом, продуцирующих антитела с разными свойствами. Гибридомы обладали сходным уровнем устойчивости к рицину. Это являлось показателем неспецифической устойчивости гибридом, определяющейся, в частности, нарушением внутриклеточного пути белков.

При изучении свойств монАт серии ММА было показано, что, за исключением М№А5 подобных антител, монАт взаимодействовали как с нативным вискумином, так и с немодифицированной каталитической частью белка. В условиях, при которых осуществляется денатурационый переход МЬА [Бушуева, 1992] реакция ММЛ антител заметно уменьшалась, следовательно эпитопы антител - конформационные.

Изученные антитела направлены к трем участкам молекулы МЬА. Большинство антител перекрещиваются между собой в отношении двух участков (таблица 1).

Таблица 1. Результаты конкурентного анализа монАт

Название антител

Участок 1 \1NA2, МЫ АЗ, МЫА4, МЫА7

Участок 2 ШШ, МЫАб, МИА8, МЫА9, МИАЮ

Участок 3

Для антител МЫА4 ММА8, МИА9 были определены константы взаимодействия с помощью ТИФА (таблица 2).

Таблица 2. Константы связывания монАт.

К асс. МЫ в растворе К асс. МЫ на плате

МЫА4 0. 91+/- 0.064х 10-8 М 0.527+/- 0.075х 10-8 М

МКА8 0.96 +/-0.075х 10-8 М 1.179+/-0.177х 10-8 М

МИА9 1.49+/-0.089х 10-8 М 1.189+/-0.025х 10-8 М

Для экспериментов по устойчивости отобрали гибридомы МЫА4, МЫА5, МНА8, МЫА9. Оценивали устойчивость гибридом МИА4, МЫА8, МЫА9 по отношению к вискумину, его природной нзоформе-МЫН и рицину (изучение гибридомы МЫ А 5 представлено далее). Результаты устойчивости полученных гибридом представлены на рис.1 А.

- 1.Е-09

ш 1

0

1

0

* 1.Е-10

н к

ГО 1.Е-11

а н

1

ш

х 1.Е-12

О

*

ми мин

|1 I Оз

1*60 I 4

Рисунок 1. А. Устойчивость гибридом к действию МЫ, М1ЛИ, 1160. Б- степень взаимодействия антител с МЫ, МЫШ, Я60 при концентрации антител 100 нг/мл. Обозначения: 1-МЫА4, 2- М^А8, 3-МКА9,4- Бр2/0.

Цитотоксические тесты показали, что ЛД50 гибридом МЫА9, МЫА8 превышало ЛД50 контрольной линии Бр2/0, непродуцирующей антитела к МЫ, в 600 раз, а МЫА4 - в 60 раз (рис 1А). Сравнение аффиности антител

представлено на рис. 1Б. Наиболее аффинными антителами являются МЫЛ9, однако гибридома МЫА8 имеет сходный с МЫА9 уровень устойчивости при менее аффи1Шом связывании с эпитопом. Аффинность МИЛ8 и МЫА4 практически не различается, при этом МЫА8 в 10 раз устойчивее \1NA4 по отношению к действию МЫ.

Та же закономерность наблюдалась по отношению к цитотоксическому действию МЫП на клетки гибридом. Гибридомы МЫЛ обладали повышенной в 50 раз устойчивостью к МЫП по сравнению с контролем Бр2/0. Несмотря на то, что МЫА8 в большей степени связывает МЫП, чем МЫА4 и МИА9, устойчивость гибридом пй отношеншо к МЫП находится практически на одном уровне (рис 1), разница в аффинности не влияла на устойчивость гибридом к МЫП.

- Таким образом, в; данных экспериментах наблюдали феномен устойчивости гибридом [Уои1е е1 а1., 1987, Топеу^ку е1 а1., 1995]. Гипотезу о том, что устойчивость гибридом определяется взаимодействием внутриклеточных антител и токсина, подтверждает обнаруженная зависимость от свойств антител. В нашей системе разница в степени связывания полученных антител с вискумином не определяла устойчивость гибридом. Больший эффект на выживаемость гибридомных клеток оказывала наиравлетюсть антител. По-видимому, эпитоп МИ А 8 и МЫ А 9 функционально более значим для осуществления цитотоксического действия данных белков, чем МЫА4. Возможно, фрагменты токсина, которые распознаются антителами МЫА8 и МЫА9, участвуют во взаимодействии с мембранными структурами во время процесса транслокации, что подтверждают эксперименты, проведенные на модельных липосомных системах [Агапов е1 а1., 1997]. Было показано, что изолированная А-субъединица вискумина вызывает агрегацию липосом.. В присутствии антител против МЬА эффект отменялся в различной степени: наиболее выраженным блокирующим действием обладали монАт МЫ А 8 и МЫА9, в меньшей степени - МЫА4.

Работа по изучению свойств монАт MNA5 осуществлялась совместно с к.б.н. Гусаровой В.Ю., д.б.н. Агаповым И.И. (Государственный научный центр «ГосНИИГЕНЕТИКА», Москва). С помощью ТИФА, в которых

применялась модификация вискумина и его каталитической субъединицы, различными способами было показано, что монАт МЫА5 распознают конформационный эпитоп, находящийся на каталитической субъединице вискумина в зоне контакта с В-субъедшшцей. Данный эпитоп экранирован в цельной молекуле В-субъединицей и появляется при расхождении субъединиц (рис2Б).

Концентрация вискумина, М

Рисунок 2 А. Цитотоксическое действие вискумина на клетки гибридомы МЫА5 и контрольную линию Бр2/0. 1-МЫА5, 2- Бр2/0. Б- Взаимодействие монАт МЫА5 с 1-МЬА, 2-М1Л, 3-МЫ+100°С, 4-МП+рН5,5 5- МЫ +5мМ ДТТ

ЛД50 гибридомы МИА5 бьша в 70 раз выше ЛД50 контрольной линии эр2/0 (рис. 2А). Согласно гипотезе, объясняющей устойчивость гибридом, антитела связываются с токсином до выхода его в цитозоль во внутриклеточном компартменте. Но для того, чтобы антитела МЫА5 обеспечивали протективный эффект, необходимо расхождение субъединиц вискумина. Повышенная устойчивость гибридомы МЫ А 5 является

свидетельством того, что в клетке происходит диссоциация А и В-субъединиц вискумина до момента транслокации.

Это согласуется с рядом свидетельств о том, что дисульфидная связь должна быть восстановлена до трансмембранного переноса токсина в цитозоль [Lord, 1996, Barbieri et al., 1993]. И хотя полости ЭР имеют окислительную среду, способствующую формированию дисульфидной связи, восстановительное отделение субъединиц токсина может осуществляться в результате обмена дисульфидпыми группами между белком и ферментом ЭР дисульфидной изомеразы [Hwang, 1992].

2. Использование мопАТ серии MNA в создании тест-системы

Работа проводилась совместно с группой иммунохимии лаб. Агапова И.И. (Государственный научный центр «ГосНИИГЕНЕТИКА», Москва ). Экстракты омелы белой, получившие широкое распространение в терапии опухолевых заболеваний, зачастую являются недостаточно охарактеризованными по содержанию в них токсических лектинов Mistletoe. Идеальная тест-система на основе сандвич ТИФА должна состоять из трех пар антител, позволяющих определить MLI, MLII, MLIII по-отдельности. Получение антител серии MNA, распознающих нативные формы вискумина и его изоформ и имеющих высокую аффинность связывания, позволило использовать их при создании таких сэндвич-ТИФА. В результате анализа различных комбинаций антител в сэндвичах были найдены оптимальные варианты, исходя из чувствительности и селективности. Для определения содержания MLI в смеси ML-токсинов использовали сэндвич MNA4-MNA9. Такая система позволяет специфически определять MLI и имеет предел чувствительности около 0,08 нг/мл. Кроме того, антитела MNA4 использовали для определения MLII в сэндвич системе MTC12-MNA4. Работа полученных тест-систем проверяли на двух;, коммерческих экстрактах омелы белой - "Eurixor" и "Helixor". В результате было показано, что чувствительность разработанных систем значительно возросла. Например, в экстрактах "Helixor" MLI не определялся. С помощью сэндвича MNA4-MNA9 в экстракте "Helixor" было выявлено около 47 нг/мл MLI [Темяков, 1997].

3. Гибридомы к денатурированной форме А-субъединицы вискумина

Для изучения вопроса, происходит ли разворачивание каталитической субъединицы вискумина в ходе внутриклеточного транспорта, были использованы гибридомы, продуцирующие антитела к денатурированной форме MLA. С помощью разработанной системы иммунизации, применения гибридомной технологии, системы скрининга, клонирования и реклонирования были созданы стабильные клоны, названные ТА7-подобными гибридомами (ТА7П).

С помощью ТИФА было показано, что при тепловой денатурации сродство полученных антител повышается (данные не представлены). По результатам конкурентного анализа ТА7П антитела узнают 5 различных эпитопов: 1) ТА72, ТА73, 2) ТА74,3) ТА71, ТА75, ТА77,4) ТА76,5) ТА7.

Основываясь на данных о взаимодействии полученных антител ТА7-серии с денатурированной формой вискумина, мы предположили, что эпитопы, распознаваемые ТА7-подобными антителами, являются полностью или частично линейными.

1 13 31 а 72 № 112 И 196 206 210 ¡29 2« 255

ТА71

ТА72 ■ Ш

5 13

ТА73 ТА75 ТА76 ТА7

П 90 91 «3

95 ИЗ

93 га

III I

75 0 (7 Н 99 Ш 196 2М

сыворотка в И И И В I

5 12 45 52 И S 93 КЗ 11S 123 211 21!

Рис.3. Картирование линейных эпитопов вискумина.

Используя различные алгоритмы предсказания эпитопов, на основании как первичной, так и третичной структуры.А-субъединицы вискумипа, были выбраны наиболее иммуногенные области вискумина и синтезированы соответствующие пептиды (рис.. 3).

Согласно результатам пептидного ТИФА антитела ТА72 и ТА73 узнают участок MLA 93-103 кроме того наблюдалось слабое взаимодействие данных антител с 81-90. Низкое аффинное связывание было отмечено для антител ТА71 с участком 95-103, ТА75 - 95-103 и ТА76 - 93-103. Антитела ТА7 связывались с фрагментом 98-108, слабо с 75-83, 196-204. Участок вискумина 93-108, который представляет собой частично экспонированную на поверхность белковую петлю, образованную Р-изгибом, представляет собой высокоиммуногенную область вискумина и входит в состав различных комбинаций эпитопов. ~

Изучение устойчивости полученных гибридом ТА7 серии к цитотоксическому действию вискумина показало, что ЛД50 одной из гибридом-ТА7 была а 10 раз выше ЛД50 контрольной линии sp2/0 (рис.4). Интересно, что ни одно из антител ТА71, ТА75, ТА77, взаимодействующих с RTA и рицином в сорбированной форме, не определяло устойчивость соответствующих гибридомных клеток.

Мы наблюдали устойчивость гибридомы ТА7 к цитотоксическому действию вискумина. Согласно гипотезе об устойчивости пнбридом, антитела ТА7 взаимодействуют с токсином внутри клетки и обусловливают протективный эффект. Так как антитела ТА7 взаимодействуют с ненативными состояниями вискумина, то для взаимодействия с антителами ТА7 необходимо разворачивание белка. В сравнении с устойчивостью гибридом, продуцирующих антитела к нативной форме вискумина (MNA8, MNA9), к цитотоксическому действию вискумина, наблюдался низкий уровень устойчивости ТА7 гибридомы. Возможно, отсутствие сильного протективного эффекта ТА7 антител вызвано недолговременным существованием промежуточных коиформационных состояний вискумина, в которых эпитоп для ТА7 становится доступен. Это может происходить в том случае, когда антитела и токсины разделены расстоянием внутри везикулы и токсин, разворачиваясь для трансмембранного перехода, успевает уйти из области взаимодействия с антителами, например, в результате погружения в

липидный бислой или при связывании с шаперонами. Полученное в ходе работы свидетельство о разворачивании вискумина до выхода в цитозоль согласуется с тем, что при введении ковалентной дисульфидной связи в А-субъединицу рицина, то есть при жесткой фиксации конформации белка, способность токсина транслоцироваться резко понижается [Веаитс11е et а1., 1997]. '

1.Е-10 3

Бр2/0 ТА71 ТА72 ТА7 ТА75 ТА73 ТА77 ТА74

Рисунок 4. Устойчивость гибридом к цитотоксическому действию вискумина и рицина . 1-вискумин, 2-рицин

Суммируя эксперментальные данные по устойчивости гибридом МКА и ТА7-серии в свете существующих представлений о внутриклеточном транспорте белков можно представить следующую гипотетическую картину транслокации токсинов родственных вискумину. Растительные РИБН не имеют собственной машины транслокации в отличие от дифтерийного токсина и, предположительно, используют клеточные механизмы для выхода

в цитозоль. В настоящее время существует гипотеза о возможности использования токсинами системы ретротранслокации для выхода из ЭР [Hazes et al., 1997]. Ретротранслокационная система, функционирующая во всех нормальпых клетках, экпортирует из цистерн ЭР молекулы белков с неправильной укладкой полипептидных цепей. В результате работы ретротранслокационной системы неправильно свернутые белки экспортируются в цитозоль, подвергаются модификации убиквитином и расщепляются в протесомах . Токсшш могут претерпевать конформационные изменения, как показали эксперименты с гибридомами MNA5 и ТА7, и таким образом мимикрировать под «плохие» белки. Диссоциация субъединиц вискумина может бьггь один из способов мимикрии под неправильно уложенный белок, так как в результате подобной диссоциации экпонируются гидрофобные области, скрытые в зоне контакта. За счет экспонирования гидрофобных участков осуществляется взаимодействие с шаперонами, которые способствуют попаданию токсинов, как белков неправильной укладки в ретротраслокон и траслокации через него в цитозоль.

4. Иммунотоксппы, направленные к HMW-MAA

Используя монАт 763.74 и 225.28, направленные к меланомо-ассоциированному антигену HMW-MAA, а также растительные токсины -рицин и вискумин, были созданы следующие иммунотоксины (ИТ): 225.28-RTA, 225.28-MLA, 763.74-RTA, 763.74-MLA. Для дальнейшей работы выбирали фракции ИТ, содержащие одну или две молекулы RTA или MLA на молекулу антитела. Иммунофлюоресценцией было показано, что все полученные ИТ избирательно действовали на клетки-мишени. Количественную оценку связывающей активности полученных ИТ проводили клеточным ИФА. Из рисунка 5 видно, что при конъюгации сродство ИТ к клеткам Melur, в особенности с антителами 225.28, уменьшается. Причинами могут быть: 1) стерические затруднения, возникающие в результате введения в молекулу ИГ 30kDa А-субъединиц токсинов и экспонирования части антиген-связывающего центра, 2) частичная денатурация антител в ходе химического конъюгирования. В меньшей степени понижалось сродство к клеткам коныогатов с антителами 763.74 по сравнению со свободными Ат (рис 5).

О 0,01 0,1 1 10 Концентрация агентов, мкг/мл

О 0,01 0,1 1 10 Концентрация агентов, мкг/мл

Рисунок 5. Связывающая активность конъюгированных и неконъюгированных антител против НМ\*/-МАА по отношению к клеткам Ме1иг: 1-неконъюгированные, антитела, 2-конъюгат с МЬА, 3-конъюгат с ЯТА

Возможно, это связано с тем, что антитела 763.74 обладают бивалентным связыванием (задействованы оба антиген-связывающих центра АСЦ) в отличие от моновалентного связывания антител 225.28 [Тетрош е1 а1., 1992]. Поэтому в случае «порчи» АСЦ антител 225.28 эффект проявляется сильнее, чем у 763.74. Исследовалась связывающая активность антител и конъюгатов на меланомных клеточных линиях, отличающихся экспрессией НМ\У-МАА. По степени связывания как свободные, так и конъюгированные антитела располагаются следующим образом: Ме1иг>Со1о38>Р-01>8-5.

Цитотоксическая активность полученных ИТ оценивали на меланомных линиях человека РМЗБ, Ме1иг, Со1о38, Р-01, Б-5 и контрольных

линиях НЬбО, Ь14. Кроме того, для оценки цитотоксичности использовали линии А431 и МЕ)СК, данные по которым не показаны. В качестве контроля на неспецифическую цитотоксичность использовали агенты: свободные антитела, свободные А-субъедипицы, смесь антител и А-субъедшпщ в концентрациях и соотношениях, полученных в результате конъюгации антител. Например, если ИТ состоял молекулы антитела и двух молекул А-субъединицы, то такое соотношение использовали при приготовлении смеси. Данные по цитотоксичности конъюгатов приведены в табл.3

ИТ 225.28-R.TA обнаруживают низкую цитотоксическую активность на клетках-мишенях и сравнительно высокую на контрольных клетках. Разница между активностью конъюгата 225.28^ТА и смеси антител 225.28 и RTA (225.28+RTA) незначительна, что говорит не в пользу химического конъюгирования данных агентов. Явление усиления цитотоксичности смеси по сравнению с цитотоксичностью отдельных компонентов, вероятно, можно объяснить тем, что 225.28 способствуют проникновению изолированных субъединиц в клетку. Возможно, при связывании антител с НШ¥-МАА на поверхности клетки и последующем формировании эндоцитозного пузырька во впутретший объем последнего могут попадать молекулы, находящиеся в жидкости, окружающей клетку, в том числе и свободные RTA.

225.28-МЬА действует на клетки Р-01, РМЗБ на порядок эффективнее, чем 225.28-Е1ТА, при этом на клетки Ме1иг и Со1о38 действие данных ИТ сравнимо. На контрольных линиях 225.28-МЬА показывал невысокую цитотоксичность. При анализе действия смеси 225.28+МЬА наблюдали цитотоксичность, сравнимую с действием конъюгата 225.28-МЬА.

763.74-ЯТА действует на порядок эффективнее ИТ на основе 225.28 антител. Причем неспецифическая активность по отношению к клеткам-мишеням невысока (более 10"8М). Одним из недостатков данного ИТ -одинаковое действие конъюгата 763.74-ЯТА и смеси 763.74+КТА.

763.74-МЬА по своим параметрам выглядит наиболее эффективным и специфичным ИТ: во-первых, цитотоксическая активность данного конъюгата составляет от 10'" до 10"|ОМ, во-вторых, неспецифическая активность ИТ превышает 10"8М, в-третьих, активность смеси 763.74+МЬА незначительна (10"8М). Таким образом, наиболее удачным вариантом конъюгирования оказался 763.74 и МЬА.

Таблица 3 ЛД^

Клетки-мишени Контрольные клетки

РМЗБ Мс1иг Со1о38 Р-01 Б-бх 1Л4 НЬ6 0

225.28-1*ТА 225.28+ИТА >10" 10у >10"® 1,8x10* 7x10'10 ю-8 9х10"" 2x10"10 9x10^ 9x10"9 >10"8

225.28-МЬА 225.28+МЬА 2x10^ 10* 7x10"9 6x10'а 3x10'10 1.5Х10* 10,и 2x10"10 >10"8 >10"8 8x10"

763.74.RTA 763.74+НТА 9х10"'и Зх10'ш 5x10"10 6x10-'° ЗхЮ10 10" 9x10-" 2x10'10 >10'8 >10"® >10'7

763.74-МЬА 763.74+МЬА 3x10-" 9x10'" >10'8 10"'и >10'8 10-и 9x10'" Ю10 >10'8 >10"" >10'7

225.28 >10"8 >10'8 >10'8 >10'8 6х10'1и >10"8

763.74 >10'8 >10-" >10"8 >10'8 9,5x10'у >10"8

М1А 5,5x10"" >10"" >10"8 9,5x10-11 1,5х10"1и >10'8

ЯТА г.ЗхЮ-" 8x10-* >10"* >10" 6x10"* >10^

Примечания. Видно, что цитотскскическая активность ИТ по отношению к меланомной лиши 8-5, не экспрессирующей Ю^-МАА, необычно высока. Поэтому, в дальнейшем, при обсуждении резульатов 8-5 не использовалась как контрольная линия. Высокая цитотоксичность, по-видимому вызвана, неслецифическим цитотоксичным действием отдельных компонентов (свободных антител и А-субъедштц).

В ходе работы использовались различные агенты, способствующие усилению цитотоксической активности ИТ. Так, хорошо известно, что лизосомотропные агенты, такие как МНЦСЛ, моненсин и др. усиливают активность ИТ [\¥и, 1997]. Использование N11(0 одновременно с 225.28-МЬА, 763.74-R.TA, 763.74-МЬА усиливало цитотоксичность данных ИТ на порядок. Интересно, что использование ЫНЦО вместе со свободными антителами 225.28 усиливало цитотоксичность последних.

Известно, что использование вторых антител, .направленных к антителам против поверхностных рецепторов клетки, может способствовать формированию комплексов на мембране клетки, которые легче и быстрее

эндоцитируются внутрь клетки. В наших исследованиях использование зторых антител не приводило к усилению цитотоксического действия ИТ. Антитела, направленные к разным эпитопам, могут определять различную эффективность интернализации ИТ на их основе. Была проведена комбинированная обработка клеток ИТ на основе антител 225.28 и 763.74. Эднако, синергичного эффекта не наблюдали, цитотоксичность такой смеси ¡¡оставляла среднюю от цитотоксичностей отдельных компонентов.

После химической конъюгации с А-субъединицами токсинов антитела 225.28 в метшей степени связывались с клетками-мишенями. Анализ цитотоксической активности ИТ на основе монАт 225.28 показал, что они эбладали низкой специфичной активностью. Возможно, в ходе химического конъюгирования А-субъединиц токсинов с антителами часть ИТ могли эказаться с испорченными АСЦ, за счет введения А-субъединицы в него или в соседний участок и экспонирования. Моновалентное связывание антител 225.28 усиливает эффект «порчи» АСЦ 225,28, который выражен сильнее, чем у 763.74 [Тешрош, 1992]. Полученные в лаборатории анти-вдиотипические монАт МР11-30, направленные против АСЦ антител 225.28, имитирующих антиген НМ\У-МАА использовались для приготовления аффинной колонки. Антитела МР11-30 были проверены в клеточном ИФА на гтспень ингибирования связывания антител 225.28 с клетками-мишенями [данные не приведены). Начиная с 5-ти молярного избытка МР11-30 полностью ингабировали связывание 225.28 с различными меланомными клетками. Очистка конъюгатов на подобной колонке, предполагалось, позволит отделить ИТ с активными АСЦ от ИТ, у которых АСЦ испорчен, гак как первые должны сильнее связываться с носителем. Проводили :равнение связывающей и цитотоксической активности фракции элюатов с колонки, содержащие обогащенные активными АСЦ ИТ и ИТ до очистки на колонке. Результаты сравнения действия конъюгата 225.28-R.TA представлены на рис 6. Видно, что после очистки на колонке ни связывающая активность, ни цитотоксическая не изменилась. Аналогичные результаты эыли получены при очистке на колонке конъюгата 225.28-МЪА (данные не показаны).

2-, 1.1 1,6 ^ 1.4

см

со 1,2

- 1 с:

° 0,8 0,6 0,4 0,2 0

А

А 1 2

I МИНИ

I II I пщ

100

1000

10000

Концентрация агентов, нг/мл

Концентрация агентов, М

4

Рисунок 6.А: Связывающая активность ИТ 225.28-R.TA до и после очистки на аффинной колонке МР11-30. 1-до очистки, 2-фракция 1 элюата, 3-фракция 2 элюата, 4- 225.28 антитела.

Б: Цитотоксическая активность ИТ 225.28-R.TA до и после очистки на аффинной колонке МБП-ЗО: 1-до очистки, 2-фракция 1 элюата, 3-фракция 2 элюата.

Возможно, отсутствие эффекта усиления активности конъюгатов объясняется тем, что наше исходное предположение о связи низкой активности ИТ на основе 225.28 антител с «порчей» АСЦ неверна. Вероятные причины низкой эффективности могут быть заложены в свойствах самих антител. Известно, что не все монАт способны создавать активные ИТ, только 10-20% антител удовлетворяют нужным критериям [вЬейе, 1994].

Л 1

-й. А.

Выводы

1. Получены и охарактеризованы монАТ к различным эпитопам нативной и денатурированной формы каталитической субъединицы вискумина

2. Было показано, что гибридомы, продуцирующие антитела к нативной форме MLA, устойчивы к действию вискумина. Уровень устойчивости определяется направленностью антител.

3. Устойчивость гибридомы MNA5 является свидетельством о восстановлении субъединиц вискумина, происходящем до момента транслокации токсина в цитозоль

4. Устойчивость гибридомы ТА7 свидетельствует о разворачивании А-субъедшгацы вискумина в ходе его внутриклеточного транспорта.

5. Созданы ИТ на основе разных векторных и цитоксических частей и направленных против меланомо-ассоциировашюго антигена HMW-MAA. Изучена связывающая и цитотоксическая активность полученных копьюгатов. Показано, что наиболее эффективным конъюгатом являлся 763-MLA, ЛД 50 которого составляла 10-11М.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Moisenovich MM., Egorova S.G.,. Maluchenco N.V.,. Tonevitskii A.G..// Immunotoxins based on antimelanoma monoclonal antibodies B3F7 and ricin A-chain or ricinus agglutinin A-chain."// International conference "Human antibodies and Hybridomas", 14-16 October, 1996, Jerusalem, Israel

2. Маточенко H.B., Бухлала С.// Эффективность цитотоксического действия иммунотоксинов,созданных на основе А-субъединицы рицина и агглютинина рицина.// Международная конференция студентов и аспирантов " Ломоносов-96"

3. Д.Е. Темяков, И.И. Агапов, М.М. Мойсенович, С.А. Прокофьев, Н.В. Малюченко, С.Г. Егорова, У. Пфюллер, X. Зинке, А.Г. Тоневицкий // Изучение гетерогенности каталических субъединиц лектинов омелы белой с помощью моноклональных антител// Молекулярная биология, V. 31.Р. 536541.1997

4. Н.В.Малюченко, М.М. Мойсенович, С.Г.Егорова, В.Ю. Гусарова, И.И. Агапов, У. Пфюллер, Р. Айфлер, А.Г.Тоневицкий // Получение моноклональных антител к различным детерминантам А-субъединицы Mistletoe lectin I // Биотехнология, н. 7-8, стр. 8-18,1997

5. С.Г.Егорова Н.В.Малюченко, М.М. Мойсенович, , В.Ю. Гусарова, И.И. Агапов, К. Пфюллер, У. Пфюллер, Р. Айфлер, А.Г.Тоневицкий // Устойчивость гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к конформационным детерминантам А-субъединицы MLI// Биотехнология, н. 9-10, стр. 3-11, 1997

6. И.И. Агапов, А.Г. Тоневитский, М.М. Мойсенович, Малюченко Н.В., В.Ю. Гусарова и др. // Диссоциация каталитической и связывающей субъединиц вискумина при транслокации токсина через мембрану// Доклады академии наук, V. 363(6), PP. 823-826,1998

7. Agapov I.I., Temjakov D.E., Gusarova V.Ju., Maluchenko N.V., Moisenovich M.M., Pfuller U., Tonevitsky A.G.// Cytotoxic activity of immnunotoxins containing A-chain of Mistletoe lectin I and ricin : the role of protein-mambrane interaction// in "Mistletoe Lectin" ed by Bardocz S., SpringerVerlag, Cost 98, V.5, pp. 107-112

8. H.B. Малюченко, В.Ю. Гусарова, M.M. Мойсенович, С.Г. Егорова, И.И. Агапов., И.С. Комолов, А.Г. Тоневитский, М.П. Кирпичников// Устойчивость гибридом, продуцирующих антитела к растительному токсину-вискумину не зависит от аффиности антител // Доклады академии наук, V. 367(1), PP. 1-4,1999

9. М.М.Мойсенович, В.Ю. Гусарова, Е.Р. Полосухина, С.Г. Егорова, Н.В. Малюченко, А.Ю. Барышников, Пфюллер У., А.Г. Тоневитский// Действие иммунотоксинов, содержащих нативную и рекомбинантную каталитические субъединицы // Биотехнология, т. 2, стр. 3-8,1999

10. Мойсенович М.М., Челнокова О.В., Солопова О., Малюченко Н.В., Егорова С.Г., Агапов И.И., Зайцев И.З., Колесанова Е.Ф., Тоневицкий А.Г.// Анализ свойств эпитопа общего для А-субъединиц рицина и вискумина// Биотехнология, т. 2, стр 5-10, 1999,

11. К.Н. Новиков, Н.В. Малюченко, М.М.Мойсенович, С.Г.Егорова, И.И.Агапов, О.С. Солопова, И.3.3айцев, А.Г.Тоневицкий// Анализ основных

антигенных детерминант Mistletoe Lectin I //Биотехнология, т. 3. Стр 14-18,

12. Новиков К.Н., Малюченко Н.В., Мойсенович М.М., Егорова С.Г.// Моноклональные антитела против высокомолекулярного меланомо-ассоциированного антигена как вектор для синтеза иммунотоксинов// Медицинская иммунология, Т.1 (3-4). Стр.103, 1999 по материалам III конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 99», проходящей в С-П 18-10 мая 1999 года

13. Малюченко Н.В., Мойсенович М.М., Егорова С.Г. Агапов И.И. Колесанова Е.Ф., Тоневицкий А.Г. // Разворачивание А-субединицы вискумина в ходе внутриклеточного транспорта токсина// Молекулярная биология, т 34(1), 2000

1999

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Малюченко, Наталия Валериевна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Токсины растения Viscum album.

1.1.1. Строение токсинов из растения Viscum album.

1.1.2. Ферментативная субъединица.

1.1.3. Связывающая субъединица.

1.1.4. Зона контакта субъединиц.

1.2. Внутриклеточный транспорт токсинов.

1.2.1. Интернализация токсинов.

1.2.2. Прохождение токсинов через эндосомальный компартмент.

1.2.3. Формирование и слияние везикул

1.2.4. Транспорт в аппарате Гольджи.

1.2.5. Ретроградный транспорт в эндоплазматический ретикулум.

1.2.6. Транслокация токсинов.

1.2.7. Альтернативные пути транспорта.

1.3. Иммунотоксины в терапии меланомы 1.3.1. Белки меланомы.

1.3.2. Высокомолекулярный меланомо-ассоциированный антиген

1.3.3. Иммунодиагностика и иммунотерапия меланомы.

1.3.4. Иммунотоксины к меланоме.

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Клетки и антитела.

2.2. Выделение токсинов и их субъединиц из растения Ricinus communis.

2.3. Выделение токсинов и их субъединиц из растения Viscum album.

2.4. Получение гибридом, продуцирующие моноклональные антитела к нативной форме А-субъединицы вискумина.

2.5. Получение гибридом, продуцирующие моноклональные антитела к денатурированной форме А-субъединицы вискумина.

2.6. Получение и очистка антител.

2.7. Изучение взаимодействия антител с антигеном на плате с помощью ТИФА.

2.8. Изучение взаимодействия антител с нативной и денатурированной формой антигена с помощью ТИФА.

2.9. Конкурентный ТИФА.

2.10. Сэндвич-ТИФА на основе монАт MNA-серии.

2.11. Определение констант взаимодействия монАт с антигеном в растворе.

2.12. Определение взаимодействия монАт с антигеном, сорбированного на плату.

2.13. Иммуноблоттинг.

2.14. Предсказание и синтез пептидов.

2.15. Пептидный ТИФА.

2.16. Получение и очистка иммунотоксинов.

2.17. Иммунофлюоресценция.

2.18. Клеточный ТИФА.

2.19. Оценка цитотоксической активности токсинов и иммунотоксинов.

2.20. Приготовление аффинной колонки с монАт MF 11-30.

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Гибридомы, продуцирующие антитела к нативной форме MLA.

3.1.1. Получение гибридом.

3.1.2. Свойства монАТ серии МЧА.

3.1.3. Устойчивость гибридом к цитотоксическому действию вискумина.

3.1.4. Устойчивость гибридомы МИА5.

3.1.5. Использование монАТ серии МКА в создании тест-системы.

3.2. Гибридомы, продуцирующие антитела к денатурированной форме МЬА.

3.2.1. Получение гибридом.

3.2.2. Свойства антител.

3.2.3. Картирование эпитопов.

3.2.4. Устойчивость гибридом.

3.3. Иммунотоксины, направленные к НМ\У-МАА.

3.3.1. Получение ИТ.

3.3.2. Специфичность связывания ИТ.

3.3.3. Связывающая активность ИТ.

3.3.4. Оценка цитотоксической активности ИТ.

3.3.5. Использование различных агентов, усиливающих цитотоксичность ИТ.

3.3.6. Очистка ИТ на анти-идиотипической колонке.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности внутриклеточного транспорта растительных токсинов, используемых в составе иммунотоксинов"

Особенное внимание к рибосом-инактивирующим белкам II класса (РИБП) связано с высокой цитотоксической активностью данных белков по отношению к эукариотическим клеткам и возможностью их использования для элиминации определенных клеточных популяций, например опухолевых. По своему строению РИБП представляют димерные А-В токсины, где А-субъединица является каталитической, а В-субъединица - связывающей. В-субъединица токсинов связывается с поверхностью любой клетки. Замена В-субъединицы на другую молекулу, способную избирательно реагировать с определенными типами клеток, в ряде случаев позволяет получить высокоэффективный цитотоксический препарат направленного действия -иммунотоксин (ИТ). Однако эффективность таких конъюгатов снижена по сравнению с нативными токсинами. Это объясняется тем, что В-субъединица участвует не только в процессе связывания токсина с клеточным рецептором, но и играет роль во внутриклеточном транспорте токсина и, возможно, в процессе выхода токсина в цитозоль клетки. В иммунотоксинах В-цепь заменяется векторной молекулой, которая, как правило, не способна направлять ИТ по наиболее эффективному внутриклеточному пути и обеспечить максимально эффективную транслокацию. Низкая активность ИТ ограничивает их применение в качестве клинических препаратов. Поэтому для создания высокоэффективных ИТ актуальной задачей является изучение механизмов действия и особенностей внутриклеточного транспорта нативных токсинов. Например, ощутимый прогресс в усилении терапевтического потенциала ИТ наблюдался с открытием сигнальных мотивов в белке-пептидных последовательностей, определяющих локализацию белка в тот или иной компартмент клетки. Рекомбинантные ИТ с последовательностью 8

REDKL, направляющая белки в ЭР, отличалась большей цитотоксичностью по сравнению с ИТ без данной последовательности [Brinkman et al., 1994]. Сами токсины представляют собой удобный объект для изучения внутриклеточного транспорта белков. Белки из семейства РИБП задействованы в самых разных процессах транспорта: связывание с клеточными рецепторами, рецептор-опосредованном эндоцитозе, прохождение через эндосомальные компартменты, транспорте белков внутри аппарата Гольджи, в ретроградном переносе из аппарата Гольджи в эндоплазматический ретикулум и, наконец, в процессе трансмембранного переноса. В ходе своего внутриклеточного транспорта токсины связываются со многими клеточными структурами, обеспечивающие механизм внутриклеточного движения белков и поэтому могут служить зондами для доставки белков и пептидов в определенный клеточный компартмент [Stenmark et al., 1991]. Например, возможна доставка малых пептидов к молекулам МНС I класса для антигенной презентации на поверхности.

Изучаемый в работе вискумин из омелы белой, является одним из наименее изученных среди известных токсинов семейства РИБП. Однако, дальнейшее изучение данного белка представляется перспективным благодаря ряду свойств вискумина. Например, было показано, что ИТ на основе каталитической субъединицы вискумина более активны, чем ИТ на основе А-субъединицы рицина [Tonevitsky et al., 1996]. Кроме того, экстракты омелы белой обладают иммуномодуляторной, апоптотической и антимутагенной активностью, благодаря чему широко используются в течение ряда лет в качестве противоопухолевых препаратов в странах Европы [Bussing et al., 1997а]. Целью данной работы было исследование отдельных этапов внутриклеточного транспорта вискумина с помощью модельных систем - гибридом. Кроме того, целью работы изучение влияния векторной и цитотоксической части на 9 эффективность действия иммунотоксинов, направленных к меланомоассоциированному антигену - НМ\У-МАА,

Для достижения цели были поставлены конкретные задачи:

1. Получение гибридом, продуцирующих монАт против нативной и денатурированной формы А-субъединицы вискумина. Изучение специфичности, аффинности полученных монАт.

2. Изучение устойчивости данных гибридом к цитотоксическому действию вискумина и рицина.

3. Получение иммунотоксинов, на основе антител 225.28 и 763.74 и каталитических субъединиц рицина и вискумина. Изучение свойств полученных ИТ.

10

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Малюченко, Наталия Валериевна

ВЫВОДЫ

1. Получены и охарактеризованы монАт к различным эпитопам нативной и денатурированной формы каталитической субъединицы вискумина

2. Было показано, что гибридомы, продуцирующие антитела к нативной форме МЬА устойчивы к действию вискумина. Уровень устойчивости определяется направленностью антител.

3. Устойчивость гибридомы МЫА5 является свидетельством о восстановление субъединиц вискумина, происходящее до момента транслокации токсина в цитозоль

4. Устойчивость гибридомы ТА7 свидетельствует о разворачивании А-субъединицы вискумина в ходе его внутриклеточного транспорта.

5. Созданы ИТ на основе разных векторных и цитоксических частей и направленных против меланомо-ассоциированного антигена НМ\¥-МАА. Изучена связывающая и цитотоксическая активность полученных конъюгатов. Показано, что наиболее эффективным конъюгатом являлся 763-МЬА, ЛД 50 которого составляло 10-11М.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе работы были получены специфичные монАт, распознающие с высокой степенью аффинности нативную форму каталитической субъедицы вискумина. В основном, при используемой схеме иммунизации антитела вырабатывались к двум участкам МЬА, третий узнавался небольшим количеством гибридом (14%). Все эпитопы, распознаваемые данными антителами были конформационными и частично разрушались при воздействии температуры на А-субъединицу вискумина. Нам не удалось получить моноспецифичные антитела, направленные только к МЫ и не взаимодействующие с другими изоформами вискумина-МЫ1, МЫП. Видимо, это объясняется высокой степенью сходства как в первичной, так и в третичной последовательности данных белков. Однако, отдельные антитела среди полученных обладали отчетливой разницей в связывании МЫ и МЫП, что способствовало созданию тест-систем по количественному определению изоформ вискумина в экстрактах омелы белой.

Мы использовали гибридомы, продуцирующие антитела к вискумину в качестве модели для изучения внутриклеточного транспорта. Была изучена устойчивость различных гибридом, продуцирующих монАт с различными свойствами к действию различных цитотоксических агентов. Было показано, что гибридомы серии М№А отличались устойчивостью по отношению к МЫ: ММА4, \4NA8, М1ЧА9 в 60, 600, 600 раз соответственно. Обнаруженное в ходе работы явление устойчивости гибридом согласуется с работами других авторов [Уои1е ег а1., 1987, Топеуквку е! а1., 1995]. Более того, в ходе данной работы наблюдали зависимость уровня устойчивости гибридом от направленности антител. Аффинность антител в изученной области не влияла на уровень устойчивости. Возможно, это объясняется тем, что связывание антител с тем или иным участком токсина имеет неравноценные последствия для выживания клетки. В результате такого связывания могут затрагиваться функционально значимые участки токсина: каталитический центр, участок, ответственный за процесс транслокации белка, и др. В связи с этим планируется дальнейшее изучение функциональной нагрузки различных эпитопов вискумина. Во время внутриклеточного транспорта токсина, с ним могут происходить разного рода модификации. Наличие антител, распознающих уникальные конфигурации белка могут способствовать детекции таких состояний. В ходе работы использовали гибридому МЫА5, продуцирующие антитела исключительно к нативной форме МЬА и не распознающие цельный вискумин. Устойчивость МЫА5 гибридомы (в 70 раз) является свидетельством, что восстановление А и В-субъединиц молекулы МЫ происходит до процесса транслокации его в цитозоль. Одним из малоизученных аспектов внутриклеточного транспорта токсинов является конформационное состояние молекулы токсина в процессе трансмембранного переноса в цитозоль. В связи с этим создана панель гибридом, продуцирующих монАт к денатурированным формам молекулы МЬА (ТА7-серия). Свойства ТА7-подобных антител были изучены, часть эпитопов удалось картировать с помощью пептидной библиотеки А-субъединицы вискумина. Одна из гибридом - ТА7 отличалась устойчивостью к действию вискумина в 10 раз. Несмотря на низкую степень устойчивости, данный факт является свидетельством разворачивания А-субъединицы вискумина в ходе внутриклеточного транспорта. Это согласуется с исследованиями рицина, введение в структуру которого жесткой связи снижает способность рицина к транслокации [ВеаитеПе Й а1., 1997].

Суммируя экспериментальные данные по устойчивости гибридом ТУША и ТА7-серии в свете существующих представлений о внутриклеточном транспорте белков можно представить следующую гипотетическую картину транслокации токсинов родственных вискумину. Растительные РИБП не имеют собственной машины транслокации как дифтерийный токсин и, предполагают, используют клеточные механизмы для выхода в цитозоль. Наиболее привлекательным местом и транслокации токсинов является ЭР, так как в нем сосредоточены различные белковые системы, занимающиеся трансмембранным переносом белков. В настоящее время существует гипотеза о возможности использования токсинами системы ретротранслокации для выхода из ЭР. Ретротранслокационная система, функционирующая во всех нормальных клетках, экпортирует из цистерн ЭР молекулы белков с неправильной укладкой полипептидных цепей. В результате работы ретротранслокационной системы неправильно свернутые белки экспортируются в цитозоль, подвергаются модификации убиквитином и расщепляются в протесомах. Токсины могут претерпевать конформационные изменения, как показали эксперменты с гибридомами М№А5 и ТА7, и таким образом мимикрировать под плохие белки. Диссоциация субъединиц вискумина может быть один из способов мимикрии под неправильно уложенный белок, так как в результате диссоциации экпонируются гидрофобные области, скрытых в зоне контакта. За счет экспонирования гидрофобных областей осуществляется взаимодействие с шаперонами, которые способствуют попаданию токсинов, как белков неправильной укладки в ретротраслокон и траслокации через него в цитозоль.

Заключительная часть работы является прикладной и посвящена созданию и изучению ИТ, направленных к меланомо-ассоциированному антигену НМ\¥-МАА. Исходя из фактов о том, что векторная и токсическая часть ИТ определяет эффективность их действия, были созданы возможные комбинации ИТ на основе двух разных антител и двух каталитических субъединиц токсинов: 225.28-КГА, 225.28-МЬА, 763.74-R.TA, 763.74-МЬА. Изучение цитотоксического действия данных конъюгатов на клетки-мишени показало, что иммунотоксины на основе А-субъединицы висумина были активнее, конъюгатов на основе А-субъединицы рицина. Но наиболее специфичные конъюгаты получались на основе антител 763.74. Ранее обсуждалось, что действительно, только небольшой процент (10-20%) антител может дать эффективные ИТ. Эксперименты по цитотоксичности показали, что наиболее активным конъюгатом был 763.74-МЬА, ЛД50 которого варьировала на разных клеточных линиях-мишенях от Ю~10 до 10"ИМ, при этом уровень неспецифической активности составлял >10"8М. Такая активность позволяет рассчитывать на использование данного ИТ в предклинических и клинических исследованиях. Возможно, высокая активность данного препарата обусловлена несколькими факторами: 1) антитела 763.74 эффективнее как вектор для доставки цитотоксической части внутрь клетки благодаря бивалентному и более аффинному связыванию с НМ\У-МАА, 2) каталическая субъединица вискумина более активна в составе ИТ, чем каталическая субъединица рицина, как показано ранее [ТопеуИяку е1 а1., 1995]. Причины, вызывающие высокую активность препаратов на основе 763.74 антител и каталитической субъединицы вискумина, видимо, связаны с более эффективным транспортом таких препаратов внутри клетки. Интересно, что

125

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малюченко, Наталия Валериевна, Москва

1. Анисимова В.А., Копылов П.Х., Шемыкин И.Г. //Белки направленного действия как потенциальные лекарственные препараты // Vestn Ross Akad Med N auk, Т. 6, стр 52-59. 1997

2. Вернослова Е.А., Конарева Н.В., Михайлов А.М., и др. // Рентгеноструктурное исследование молекулы MLI Viscum album (Mistletoe) в нативном состоянии при разрешении 3,5 А// Кристаллография, 1999, в печати

3. Граф JL, Ферроне С.// Антигены человека, ассоциированные с меланомой//стр. 175-212 в изд. Иммуногенетика человека в 2-х томах, ред Литвин С., «Мир» М., 1994

4. Дерффель К. //Статистика в аналитической химии.М.: Мир, Москва. 1994

5. Малюченко Н.В., Мойсенович М.М., Егорова С.Г., и др. // Получение моноклональных антител к различным детерминантам А-субъединицы MISTLETOE LECTIN I // Биотехнология, н. 7-8, стр. 8-18, 1997

6. Темяков Д.Е., Агапов И.И., Мойсенович М.М., и др. // Изучение гетерогенности каталических субъединиц лектинов омелы белой спомощью моноклональных антител//Молекулярная биология, V. 31.Р. 536541. 1997

7. Argent R.H., Roberts L.M., Wales R., et al // Introduction of a disulfide bond inti ricin A-chain decreases the cytotoxicity of the ricin holotoxin // J. Biol. Chem., V. 269, PP. 26705-26710, 1994

8. Bastiaens PI, Majoul IV, Verveer PJ, Soling HD, Jovin TM// Imaging the intracellular trafficking and state of the AB5 quaternary structure of cholera toxin//EMBO J, v. 15(16), pp. 4246-53, 1996

9. Barton B.E.// The biological effects of interleukin 6//Med.Res.Rev. V. 16, PP 87, 199615. . Barbieri L., Battelli M.G., Stirpe F. Ribosome-inactivating proteins from plants//Biochim. Biophys. Acta., v. 1154, pp. 237-282. 1993

10. Beaumelle B , Alami M., Hopkins C.R.// ATP-dependent translocation of ricin across the membrane of purified endosomes // J. Biol. Chem., V. 268, PP 2366123669, 1993

11. Benjamin D.C., Berzofsky J. A., East I.J. // The antigenic structure of proteins: a reappraisal// Ann. Rev. Immunol., V. 2, PP. 67-101, 1984

12. Beuth J., Stoffel B., Ko H.L., Jeljaszewicz J. et al // Immunomodulating Ability of Galactoside-specific Lectin standardized and depleted Mistletoe Extract// Arzneim.-Forsch./Drug Researsch, V. 45, PP. 1240-1242, 1995

13. Beuth, J. Clinical relevance of immunoactive mistletoe lectin-I. // ANTI.CANCER DRUGS, V. 8 Suppl. 1, PP. S53-S55. 4-1997.

14. Bilge A., Howell-Clark J., Ramakrishman S., et al// Degradation of ricin A-chain by endosomal and lysosomal enzymes: the protective role of ricin B-chain// Ther. Immunol., V. 1, PP. 197-204, 1994

15. Bilge A., Warner C., Press O. //Translocation of ricin A-chain into proteoliposomes reconstituted from Goli and endoplasmic reticulum// J. Biol. Chem., V.270, PP 23720-23725, 1995

16. Bliek V.D., Redelmeier T.E., Damke H. et al// Mutations in human dynamin block an intermediate stage in coated vesicle formation// J.Cell Biol., V. 122, PP 553-565, 1993

17. Bolognesi, A., Tazzari, P. L., Olivieri, F., Polito, L., Falini, B., and Stirpe, F. Induction of apoptosis by ribosome-inactivating proteins and related immunotoxins. // Inter.J.Cancer, V. 68(3), PP. 349-355. 11-4-1996.

18. Brodsky J.L., McCracken A.A.//Er-associated and proteasome-mediated protein degradation: how two topologically restricted events came together.//Trends Cell Biol., V. 7, PP 151-156, 1997

19. Bussing, A., Jungmann, H., Suzart, K.,et al// Suppression of sister chromatid exchange-inducing DNA lesions in cultured peripheral blood mononuclear cells by Viscum album L. // J.Exp. Clin.Cancer Res., V.15, PP. 107-114,. 1996(a).

20. Bussing, A., Suzart, K., Bergmann, J., Pfuller, U., and Schietzel, M. Induction of apoptosis in human lymphocytes treated with Viscum album L Is mediated by the mistletoe lectins // Cancer Lett., V. 99(1), PP. 59-72. l-19-1996(b).

21. Bussing, A.// Mistletoe: A story with an open end.// Anti-Cancer Drugs, V.8 Suppl. 1S1-S 2 (a) 1997 (a)

22. Bussing, A., Suzart, K., and Schweizer, K. Differences in the apoptosis-inducing properties of Viscum album L extracts. // ANTI.CANCER DRUGS, V. 8 Suppl. 1,PP. S9-S14. 4-1997 (b)

23. Byers V S., Pawluczyk I.Z., Hooi D.S., et al //Endocytosis of immunotoxin-791T/36-RTA by tumor cells in relation tpits cytotoxic action// Cancer Res., V. 51, PP. 1990-1995, 1991

24. Carayon P., Bord A., Gaillard J.P//Ricin A-chain cytotoxicity depends on its presentation to the cell membrane //Bioconjgate Chem., V. 4., PP. 146-152, 1993

25. Collawn J.F., Stangel M., Kuhn L.A., et al. // Trasferrin Receptor internalizaion sequence YXRF implicates a tight turh at the structrural recognition motif for endocytosis// Cell, V. 63., PP 1061-1072, 1990

26. Conrad P.A., Smart E.A., Ying Y.S.// Caveolin cycles between plasma membrane caveolae and the Golgi complex by microtubule-dependent and microtubule-independent steps// J. Cell Biol., V. 131, PP. 1421-1433, 1995

27. Cosson P., Letourneur F.// Coatomer interaction with di-lysine endoplasmic reticulum retention motifs// Science, V. 263, PP 1629-1631, 1994

28. Davidson R.L, Gerald P.S.// Induction of mammalian somatic cell hybridization by polyethylene glycol// Methods Cell Biol., V. 15, P.325,1977

29. Debray H., Wieruszeski J.M., Strecker G., Franz H.// Structural analysis of the carbogidrate chains isolated from mistletoe (Viscum album) lectin I. // Carbohidrate Research, V. 236, PP.135-143, 1992.

30. Deen D.F., Morgan W.F., Tofilon P.J., Barcellos-HofFM.H.// Measuremant of sister chromatid exchanges and their relationships to DNA damage, repair and cell killing// Pharmacol. Ther., V 42., pp 349-360, 1989

31. Deurs B.V., Tonnessen T.I., Petersen O.W.et al // Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex// J.Cell Biol., V. 102, PP 37-47, 1986

32. Donaldson J.G., Finazzi D., Klausner R.D. et all // Brefeldin A inhibits Golgi membrany-catalysed exchange of guanine nucleotide onto ARF protein// Nature, V. 360, PP. 350-352, 1992

33. Eiklid K., Olsnes S., Phil A.//Entry of lethal doses of abrin, ricin and modeccin into the cytosol ofHeLa cells//Exp. Cell Res., V. 126, PP. 321-326, 1980

34. Endo Y., Mitsui K., Motizuki M., et al // The mechanism of action of ricin and related toxic lectins on eukaryotic ribosomes. // J. Biol. Chem., V. 262, PP. 59085912, 1987

35. Endo Y., Tsurugi K., Franz H. // The site of action of the A-chain of mistletoe lectin I on eukaryotiic ribosomes. The RNA N-glycosidase activity of the protein. // FEBS Letters., V.231, PP. 378-380. 1988

36. Ensslin A.S., Formby B.// Comparison of cytolytic and proliferating activities of human yS and a(3 T cells from peripheral blood against carious human tumor cell lines // J. Natl. Cancer Inst. V. 83. PP. 1564-1569, 1991

37. Eschenburg S., Krauspenhaar R., Mihailov A., et al //Primary structure and molecular modelling of mistletoe lectin I from Viscum album //Biochem. Biophys. Res. Comm., V. 247, PP367-372, 1998

38. Ey P.L., Prowse S .J., Jenkin C.R. //Isolation of pure IgGl, IgG2a and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using protein A-sepharose // Immunochemistry, V. 15, PP. 429-436, 1978

39. Falnes P.O., Choe S., Madshus I.H.// Inhibition of membrane translocation of diphtheria toxin A-fragment by internal disulfide bridges.// J. Biol. Chem., V. 270, PP. 20787-20793, 1995

40. Fischer S., Scheffler A., Kabelitz D.// Stimulation of the specific immune system by mistletoe extracts. // Anti-cancer drugs, V. 8 Suppl. 1, PP. S33-S37, 1997.

41. Franz H. // Mistletoe lectins and their A and B chains. // Oncology, V. 43, PP.2334, 1986.

42. Franz H. // Viscaceae lectins. // In: Franz H.(ed.). Advances in lectin research., Berlin, VEB, Verlag volk und Gesundheit, V.2, PP.28-59. 1989

43. Garred O., Dubinina E., Holm P.K., et al //Role of processing and intracellular transport for optimal toxicity of Shiga toxin and toxin mutants //Exp. Cell. Res., V. 218, PP. 39-49, 1995a

44. Garred O., Deurs B.V., Sandvig K.//Furin-induced cleavage and activation of Shiga toxin//J.Biol.Chem., V.270,PP. 10817-10821, 1995b

45. Garrigues H. J., Lark M.W., Lara S., et al// The melanoma proteoglycan: restricted expression on microspikes, a specific microdomain of the cell surface. //J.Cell Biol., V 103, PP. 1699-1710, 1986

46. Garrison M., Nathanson L. // Prognosis and staging in melanoma // Semonars in oncology, V. 23, PP. 725-33, 1996

47. Ghetie V., Vitetta E. //Immunotoxins in the theraphy of cancer: from bench to clinic //Pharmac. Ther., V. 63, PP. 209-234, 1994

48. Gluck A., Endo Y., Wool I. The ribosomal RNA identity elements for ricin and for alpha-sarcin: mutations in the putative CG pair that close a GAGA tetraloop. //Nucleic Acids Res., v. 22, pp. 321-324. 1994

49. Goldstein J.L., Brown M.S., Anderson G.W. et al. //Receptor-mediated endocytosis: concepts emerging from the LDL receptor systems// Ann.Rev.Cell.Biol., V.l, PP. 1-39, 1985

50. Gorelick E., Wiltrou R.H., Okumua K. // Role of NK cells in the control of metastastatic and growth of tumor cells in mice // Int. J. Cancer, V. 30, PP. 27832789, 1982

51. Gorlich D., Hartmann E., Prehn S., et al // A protein of endoplasmic reticulum involved early in polypeptide translocation //Nature, V. 357, PP. 47-52, 1992

52. Green S.A., Setiadi H., McEver R.P. // The cytoplasmic domain ofP-selectin contains a sorting determinant that madiates rapid degradation in lysosomes// J/ Cell Biol., V. 124, PP. 435-448, 1994

53. Griffiths, G. D., Leek, M. D., Gee, D. J.// The toxic plant proteins ricin and abrin induce apoptotic changes in mammalian lymphoid tissues and intestine // J.Pathol, V. 151, PP. 221-229, 1987.

54. Goldstein JL,Brown MS, Anderson RG, et al, //Receptor-mediated endocytosis: concepts emerging from the LDL receptor system.// Annu Rev Cell Biol. V. 1. PP. 1-39, 1985

55. Gorelick E., Wiltrout R.H., Okumua K., Habu., Herberman R.B.// Role of NEC cells in the control of metastastic spread and growth of tumor cells in mice// Int. J. Cancer, V. 30, PP. 107-112, 1982

56. Haft C. R., Klausner R.D., Tayolor S.I. // Involvement of dileucine motifs in the internalization and degradation of the insulin receptor// J.Biol. Chem., V. 269, PP. 26286-26294, 1994

57. Hajto, T., Hostanska, K., and Gabius, H. J. Modulatory potency of the beta-galactoside-specific lectin from mistletoe extract (Iscador) on the host defense system in vivo in rabbits and patients. // Cancer Res, V. 49(17), PP. 4803-4808. 9-1-1989.

58. Hajto T., Hostanska K., Fischer J., et al // Immunomodulatory effects of Yiscum album agglutinin-I on natural immunity. // Anti-cancer drugs, V. 8 Suppl. 1, PP. S43-S46. 4-1997.

59. Hamprecht, K., Handgretinger, R., Voetsch, W., et al// Mediation of human NK-activity by components in extracts of Viscum Album.// Int. J. Immunopharm., V. 9, PP. 199-209, 1987

60. Hansen S.H., Sandvig K., Deurs B.V. // Molecules internalized by clathrin-independent endocytosis are delivered to endosomes containing transferrin receptors//J.Cell Biol., V. 123, PP 89-97, 1993

61. Hauri H.P. Schweizer A.//The endoplasmic reticulum-Golgi intermediated compartment// Curr.Opin.Biol, V. 4, PP. 600-608, 1992

62. Hazes B.// The (QxW)3 domain: a flexible lectin scaffold// Protein Science, V. 5, PP.1490-1501, 1996

63. Hazes B., Read R.J. //Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter target cells//Biochem., V. 36, PP 11051-11054, 1997

64. Henderson R.A., Finn O.J.// Human tumor antigen are ready to fly// Advances in immunol., V. 62, PP. 217-256, 1996

65. Herlyn M. in ed. Molecular and cellular biology of melanoma, CRC Press, 102 p., 1993

66. Hincha D.K., Pfuller U., Schmitt J.M. // The concentration of cryoprotective lectins in mistletoe (Viscum album L.) leaves is correlated with leaf frost hadriness//Planta, V. 203, PP. 140144, 1997

67. Hinkle G.H.// An Overview of advances in radioimmunodetection of melanoma // http://justdotta.dccs.upenn.edu/medonc/overraidmm.html

68. Hudson Т.Н., Grillo F.G.// Brefeldin A enchancer ricin A-chain immunotoxins and blockade of intact ricin, modecin and abrin// J.Biol. Chem., V. 266, PP. 18586-18592, 1991

69. Humphrey J.S., Peters P.J., Yuan L.C et al //Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine containing sequence// J. Cell Biol., V. 120, PP. 1123-1135, 1993

70. Hwang C., Sinskey A.J. and Lodish H.F. Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum. // Science, v. 257, pp. 1496-1502. 1992.

71. Inward C.D., Williams J.M., Chant I.D., et al // Verocytotoxin 1 unduces apoptosis in vero cells// J.Infect., V.30, PP. 213-218, 1995

72. Jameson B.A., Wolf H.// The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants// Comput. Appl. Biosci., V.4. PP. 181-186, 1988

73. Janssen, O., Scheffler, A., Kabelitz, D.// In vitro effects of mistletoe extracts and mistletoe lectins. Cytotoxicity towards tumor cells due to the induction of programmed cell death (apoptosis). // Arzneimittelforschung, V. 43, PP. 12211227,. 1993

74. Janssen O., Fischer S., Scheffler A., Fiebig H.H., Kabelitz D.// Cytotoxicy towards tumor cells due to induction of programmed cell death (apoptosis) // коференция в Виттене или COST98

75. Jenrette J.M.// Malignant melanoma: the role of radiationtheraphy revisited// Seminars in Oncology. V. 23, PP. 759-762, 1996

76. Johannes L., Tenza D., Antony C. // Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga-toxin// J.Biol.Chem., V. 272, PP 19554-10561, 1997

77. Johannes L., Goud B. // Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum// Trends in Cell Biology, V.8, PP 158-162, 1998

78. Joller P.W., Menrad J.M., Schwarz T., Pfuller et al//Stimulation of cytokine production via a special standardized Mistletoe preparation in an in vitro human skin bioassay// Arzneim.-Forsch./Drug Researsch, V.46, PP.649-653, 1996

79. Juntti-Berggren L., Larsson o., Rosman P.//Increased activity of L-type Ca2+ channels exposed to serum from patients with type I diabetes// Science, V.61., PP.130-133, 1993

80. Jurin M., Zarkovic N., Hrzenjak M// Antitumorous and immunomodulatory effects of Viscum album preparation Isorel// Oncology, V. 50, PP. 393-398, 1993

81. Jurin, M., Zarkovic, N., Borovic, S., et alII Viscum album L preparation Isorel modifies the immune response in normal and in tumour-bearing mice. // Anticancer drugs, V. 8 Suppl.l, PP. S27-S31.-1997

82. Kabsch W., Sander C//Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features// Biopolymers, V.22. P.2577-2637, 1983

83. Khan, T., Waring, P.// Macrophage adherence prevents apoptosis induced by ricin. // Eur.J.Cell Biol., V. 62, PP. 406-414, 1993.

84. Kovacs E., Hajto T., Hostanka K. //Improvement od DNA repair in lymphocytes of breast cancer patients treated with Viscum album extract (Iscador)// Eur. J. Cancer. V27,PP. 1672-1676, 1991

85. Kuttan, G. and Kuttan, R. Immunological mechanism of action of the tumor reducing peptide from mistletoe extract (NSC 635089) cellular proliferation. // Cancer Lett, V. 66, PP. 123-130, 1992

86. Kuttan G., Kuttan R.// Reduction of leukopenia in mice by Viscum Album administration during radiation and chemotherapy// Tumori, V.79, PP. 74-76, 1993

87. Kuttan, G., Menon, L. G., Antony, S., and Kuttan, R. Anticarcinogenic and antimetastatic activity of Iscador. // Anti-cancer drugs, V. 8 Suppl., PP. S15-S16, 1997

88. Laemmli U.K.// Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4// Nature, V.227, PP. 680-685, 1970

89. Lee R.T., Gabius H.J., Lee Y.C. // Ligand binding characteristics of the major mistletoe lectin // J. Biol. Chem., V. 267, PP. 23722-23727, 1992

90. Letourneur F., Gaynor E.C., Hennecke S. // Coatomer is essential for retrieval of dilysine-tagged proteins to the endoplasmic reticulum // Cell, V. 79, PP. 11991207, 1994

91. Lewis M.J., Pelham H.R.// Ligand-induced redistribution of human KDEL receptor from Golgi complex to the endoplasmic reticulum// Cell, V. 68, PP. 353364, 1992

92. Llorente A., Rapak A., Schmid S., et al // Expression of mutant dynamin inhibits toxicity and transport of endocytosed ricin to the Golgi apparatus// J.Cell Biol., V. 140, PP. 553-563, 1998

93. London E. //How bactreial protein toxins enter cells: the role of partial infolding in membrane translocation//Mol. Microbiol., V.6, PP. 3277-3282, 1992

94. Lord J.M., Hartley MR. and Roberts L.M.// Ribosome-inactivating proteins of plants. // Sem. Cell. Biol., V. 2, PP. 15-22, 1991

95. Lord J.M., Roberts L.M. // The intracellular transport of ricin: why mammalian cells are killed and how Ricinus cells servive.// Plant Physiol Biochem., V. 34 (2), PP. 253-261. 1996.

96. Lord J.M., Roberts L.M. //Retrograde transport: going against the flow// Curr. Biol., V. 8, PP R56-R58, 1998

97. Majoul I. V., Bastianes P.I., Soiling H.D.// Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells.// J.Cell Biol., V. 133, PP. 777789, 1996

98. Majoul I. V., Ferrari D., Soiling H.D. //Reduction of protein disulfide bonds in an oxidizing enviroment. The disulfide bridge of cholera toxin A subunit is reduced in the endoplasmic reticulum // FEBS Lett., V. 401, PP. 104-108, 1997

99. Manske, J. M., Buchsbaum, D. J., Hanna, D. E., and Vallera, D. A. Cytotoxic effects of anti-CD5 radioimmunotoxins on human tumors in vitro and in a nude mouse model. // Cancer Res, V. 48(24 Pt 1), PP. 7107-7114. 12-151988.

100. Mastrangelo M.J., MaguireH.C., Sato T. //Active specific immunization in the treat of patients with melanoma// Seminars in Oncology, V. 23, PP 773-781, 1996

101. Mellman I. //Endocytosis and molecular sorting// Ann. Rev.Cell.Dev.Biol., V. 12, PP. 575-625, 1996

102. Miesenböck G., Rothman J.E. // The capacity to retrieve escaped ER proteins extends to the trans-most cisternae of the Golgi stack // J. Cell Biol., V. 129, PP. 309-319, 1995

103. Miettinen H.M., Matter W., hunziker J.K. et al// Fc receptor endocytosis is controlled by a cytoplasmic domain determinant that actively prevents coated pit localization // J. Cell. Biol., V. 116, PP. 875-888, 1992

104. Montesano R., Roth J., Robert A. et al // Non-coated membrane invaginations are involved in binding and internalization of cholera and tetanus toxin// Nature, V. 296, PP. 548-559, 1982

105. Montfort W., Villifranca J.E., Monzingo A.F., Ernst S., Katzin B., Rutenber E., Xuong N.H., Hamlin R., Robertus J.D. The three-dimensional structure of ricin at 2,8 A. //J. Biol. Chem., v.262, pp.5398-5403. 1987.

106. Morris R.E., Gerstein A.S., Bonventure P.F., et al // Recptor-mediated entry of diphtheria toxin into monkey kidney (Vero) cells: electron microscopical evaluation//Infect. Immun., V. 50, PP 721-727, 1985

107. Mossman T.//Rabid colometric assay for cellular growth and survave: application to proliferation cytotoxity assayes//J.Immunol.Methods, V.65, PP. 55-63, 1983

108. Moya M., Dautry-Varsat A., Goud B. // Inhibition of coated pit formation in Hep2 cells blocks the cytotoxicity of diphtheria toxin but not that of ricin toxin// J.Cell Biol., V.101, PP. 548-559, 1985

109. Mueller E.A., Andrer F.// A Viscum album oligosaccharide activating human natural cytotoxicity is an interferon gamma inducer //Cancer Imm. Imm. V. 32, PP. 221, 1990a

110. Mukherjee S., Ghosh R.N., Maxfield F. // Endocytosis // Physiol. Reviews, V. 77, PP 759-803, 1997

111. Murzin A., Lesk A., Chothia C. // Beta-trefoil fold. // J.Mol.Biol., v.223, pp.531-543. 1992.

112. Ngai P.K.,Ackermann F.,Wendt H.,Savoca R.,Bosshard HR.// Protein A antibody-capture ELISA (PACE): an ELISA format to avoid denaturation of surface-adsorbed antigens//J Immunol Methods.,V. 158(2), PP.267-76, 1993

113. Newton D.L., Wales R., Richardson P.T., et al // Cell surface and intracellular functions for ricin galactose binding // J.Biol. Chem., V. 267, PP 11917-11922, 1992

114. Nicolson G.L., Blaunstein J. // The interaction of Ricinus communis agglutinin with normal and tumor cell surfaces. // Biochem. Biophys. Acta., V.266, PP. 543-547, 1972

115. Nilsson T., Hoe M.H., Shsarewicz P. et al // Kin regognition betwenn medial Golgi enzymes in Hela cells// EMBO J., V. 13, PP. 562-574, 1994

116. Noronha E.J., Wang X., Desai S.A., et al//. Limited diversity of human scFv fragments isolated by paaning a synthetic phage-display scFv library with cultured human melanoma cells. // J.Immunol., V. 161, PP. 2968-2976, 1998

117. Ohno H., Stewart J., Fournier M.C. et al. //Interaction of tyro sine-based sorting signals with clathrin-associated proteins// Science, V.269, PP. 1872-1875, 1995

118. Olsnes S., Stirpe F., Sandvig K., and Phil A. Isolation and characterizaion of viscumin, a toxoc lectin from Viscum Album L. (misletoe) // J. Biol. Chem., v.257, pp. 13263-13270. 1982.

119. Opresko L.K., Chang C.P., Will B.H. et al// Endocytosis and lysosomal targeting of epidermal growth factor receptors are mediated by distinct sequence independent of the tyrosine kinase domain// J. Biol. Chem., V. 270, PP. 43254333, 1995

120. Oshimi Y., Miyazaki S.// Fas antigen-mediated DNA fragmentation and apoptotic morfologic changes are regulated by elevated cytosoloic Ca2+ level// J. Immunol., V. 154, PP 599-609, 1995

121. Palade G.E. //Intracellular aspects of process of protein transport //Science. V. 189, PP347-358, 1975

122. Parmiter A.H., Nowell P.C.// The cytogenetics of human malignant melanoma and premalignant lesions in Nathanson L., ed Malignant melanoma, Biology, diagnosis, and therapy, Boston: Kluwer Academic Publishers, PP 47-61, 1988

123. Pelham H.R. // Control of protein exit from the endoplasmic reticulum // Annu. Rev. Cell Biol., V. 5, PP 1, 1989

124. Pelham H.R., Roberts L.M., Lord J.M. // Toxin entry: how reversible is the secretory pathway? // Trends Cell Biol., V. 2, PP. 183-185, 1992

125. Pelham H.R., Munro S.// Sorting of membrane proteins in the secretory pathway // Cell, V. 75. PP. 603-605, 1993

126. PfefFer S.P., Rothman J.E. // Biosynthetic protein transport and sorting by the endoplasmic reticulum and Golgi // Ann.Rev.Biochem, V. 56, PP. 829-852, 1987

127. Pietersz G.A., Rowland A., Smyth M.J., et al// Chemoimmunoconjugates for treatment of cancer// Advances in Immun., V. 56, PP. 301-387, 1994

128. Ponnambalam S., Rabouille C.,Luzio J.P. et all // TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the TGN// J. Cell Biol., V. 125, PP253-268, 1994

129. Press O.W., Martin P., Thorpe P.E., et al // Ricin A-chain containing IT directed against different epitopes on the CD2 molecule differ in their ability to kill normal and malignant T-cells// J. Immunol., V. 141, PP 4410-4417, 1988

130. Rapak A., Falnes P., Olsnes S. //Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol./ZProc.Natl.Acad.Sci.USA, V. 94, PP. 3783-3788, 1997

131. Ribereau, Gayon G., Jung, M. L., et alII Effects of mistletoe (Viscum album L.) extracts on cultured tumor cells. // Experientia, V. 42, PP. 594-599, 1986

132. Ribereau-Gayon G., Dumont S., Muller C., et al// Mistletoe lectins I, II and III induce the production of cytokines by cultured human monocytes// Cancer Lett., V. 109, PP. 33-38, 1996

133. Ribereau-Gayon, G., Jung, M. L., et al// Modulation of cytotoxicity and enhancement of cytokine release induced by Viscum album L. extracts or mistletoe lectins. II Anticancer Drugs, V. 8 Suppl 1, PP. S3-8XX, 1997

134. Riechman L., Clark M., Waldmann H. //Reshaping human antibodies for therapy//Nature, V. 332, PP. 323-327, 1988

135. Riederer M. A. Soldati T, Shapiro AD, Lin J, Pfeffer SR // Lysosome biogenesis requires Rab9 function and receptor recycling from endosomes to the trans-Golgi network//J. Cell Biol., V. 125, PP 573-582, 1994

136. Riezman H. // The ins and out of protein translocation// Science, v. 278, PP. 1728-1729, 1997

137. Roberts L.M. and Lord J.M. //Cytotoxic proteins. // Current Opin. Biotech., v.3, pp.422-429. 1991.

138. Robinson M.S. et al // Cloning and expression of y-adaptin, a component of clatrin-coated vesicles associated with Golgi apparatus// J.Cell.Biol, V. Ill, PP. 2319-2326, 1990

139. Rohrer J., Schweizer A., Johnson K.F. et all// A determinant in the cytoplasmic tail of cation-dependent mannose -6-phosphate receptors prevents trafficking to lysosomes// J. Cell Biol., V.130, PP 1297-1306, 1995

140. Rosenberg S.A., Lotze M.T., Muul L.M. et al //Observations on the systemic administration of autologous lumphokine activated killer cells and recombinant IL-2 to patients with metastatic cancer// New.Engl. J.Med., V.313, PP1485, 1985

141. Rothman J.E., Schmid S.L. // Enzymatic recycling of clathrin from coated vesicles// Cell, V. 46, PP. 5-9, 1986

142. Rothman J.E. // Mechanisms of intracellular transport// Nature, V. 372, PP. 55-63, 1992

143. Rothman J.E. // Mechanisms of intracellular protein transport// Nature, V. 372, PP. 55-63, 1994

144. Rutenber E., Ready M., Robertus J.D. // Structure and evolution of Ricin B-chain. //Nature, V.326, PP.624-626, 1987

145. Rutenber E., Robertas ID.II Structure of Ricin B-chain at 2.5 A Resolution. // Proteins, V.10, PP.260-269. 1991

146. Salzer, G. //Pleura carcinosis. Cytomorphological findings with the mistletoe preparation iscador and other pharmaceuticals. // Oncology, V. 43 Suppl 1, PP. 66-70. 1986

147. Sandvig K., Olsnes S., Petersen O.W. et al// Endocytosis from coated pits of Shiga toxin: a glycolipid-binding protein from Shigella dysentereriae// J. Cell Biol., V. 108, PP. 1331-1343, 1989

148. Sandvig K., Dubinina E., Garred O., et al// Endocytosis and intracellular transport of protein toxins//Biochem. Soc. Trans., V. 21, PP. 707-710, 1993

149. Sandvig K.,.Ryd M., Garred O., et al.//Retrograde transport from the Golgi complex to the ER of both Shiga toxin and nontoxic shiga B-fragment is regulated by butyric acid and cAMP// J. Cell Biol., V. 126, PP. 53-64, 1994

150. Sandvig K., Bo van Deurs // Endocytosis, intracellular transport and cytotoxic action of shiga toxin and ricin// Phys. Reviews, V. 76, PP. 949-966, 1996

151. Schekman R. // Genetic and biochemical analysis of vesicular traffic in yeast //Curr.Opin. Cell. Biol. V. 4, PP 587-592, 1992

152. Schink, M.// Mistletoe therapy for human cancer: The role of the natural killer cells. // Anti-cancer drugs, V. 8 Suppl. 1, PP. S47-S51, 1997

153. Schmid S.L., Carter L.L. // ATP is required for receptor-mediated endocytosis in intact cells// J. Cell Biol, V. Ill, PP. 2307-2318, 1990

154. Schultze, J.L., Stettin, A. and Berg, P. A.// Demonstration of specifically sensitized lymphocytes in patients treated with an aqueous mistletoe.// Klinische Wochenschrift., 69, pp.397-403, 1991

155. Schutze M.P., Peterson P. A., Jackson M.R. // An N-terminal double-arginine motif maintains type II membrane proteins in the endoplasmic reticulum // EMBO J., V. 13, PP. 1696-1705, 1994

156. Seetharam S., Chaudhary VK, FitzGerald D, Pastan I // Increased cytotoxic activity of Pseudomonas exotoxin and two chimeric toxins ending in KDEL //J. Biol. Chem., V. 266, PP 17376-17381, 1991

157. Sharon N. // Lectin-carbohydrate complexes of plants and animals: an atomic view. // TIBS, V. 18, PP. 221-226, 1993.

158. Simpson J.C., Dascher C., Roberts L.M., et al //Ricin cytotoxicity is sensitive to recycling between the endoplasmic reticulum and the Golgi complex// J. Biol. Chem., V. 270, PP 20078-20083, 1995a

159. Simpson J.C., Lord J.M., Roberts L.M. // Point mutation in the hydrophobic C-terminal region of ricin A chain indicate that Pro250 plays key role in the membrane translocation//Eur. J. Biochem., V. 232, PP 458-463, 1995b

160. Simpson J.C., Roberts L.M., Lord J.M. //Free ricin A-chain reaches an early compartment of the secretory pathway before it enters the cytosol// Exp. Cell Res., V. 229, PP. 447-451, 1996

161. Soler M.H., Stoeva S., Schwamborn C., et al // Complete amino acid sequence of the A chain of mistletoe lectin I. //FEBS Lett., V.399, PP. 153-157, 1997.

162. Soler M.H., Stoeva S, Voelter W // Complete amino acid sequence of the B chain of mistletoe lectin I // Biochem Biophys Res Commun V. 246(3), PP. 596601, 1998

163. Stamnes M. A., Rothman J.E. // The binding of AP-1 clathrin adaptor particles to Golgi membrane requires ADP-ribosylation factor, a small GTP-binding protein// Cell, V.73, PP. 999-1005, 1993

164. Stamnes M.A., Craighead M.W., Hoe M.H et al //An integral membrane component of coatomer-coated transport vesicles defines a family of proteins involved in budding// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 92, PP. 8011-8015, 1995

165. Stein, G. M. and Berg, P. A.//Mistletoe extract-induced effects on immunocompetent cells: In vitro studies.// Anti-cancer drugs, V.8 Suppl. S3 9-S42, 1997

166. Stein, G.M. and Berg, P. // Modulation of cellular and humoral immune response during exposure of healthy individuals to an aqueous mistletoe extract.// Eur. J. Med. Res., V. 3, PP. 307-314, 1998

167. Stenmark H., Moskaug J.O., Madshus I.H et al// Peptides fused to the amino-terminal end of diphtheria toxin are translocated to the cytosol// J. Cell Biol., V. 113, PP. 1025-1032, 1991

168. Stumpf, C. and Bussing, A.// Stimulation of antitumour immunity by intrapleural instillation of a Viscum album L extract. // Anti-cancer drugs, V. 8 Suppl. 1, PP. S23-S26, 1997

169. Sweeney E.C., Palmer R.A., Pfuller, U// Crystallization of the ribosome-inactivating protein MLI from Viscum album (Mistletoe) complexed with 0-D-galactose //J.Mol.Biol., V. 234, PP.1279-1281, 1993

170. Sweeney E.C., Rex A.P., Pfuller U., et al // Dimerisation of mistletoe lectin I occurs by non-covalent association of two molecules// COST 98, V. 5, PP. 69-75, 1998

171. Tagge E., Chandler J, Tang BL, Hong W, Willingham MC, Frankel A // Cytotoxicity of KDEL-terminated ricin toxins correlates with distribution of the KDEL receptor in the Golgi //J. Histochem. Cytochem., V. 44, PP. 159-165, 1996

172. Teasdalae R.D., Jackson M.R.//Signal-mediated sorting of membrane proteins between the endoplasmic reticulum and the the Golgi apparatus// Ann.Rev.Cell Dev.Biol., V.12, PP. 27-54, 1996

173. Timoshenko, A. V., Kayser, K., Drings, P., Kolb, G., Havemann, K., and Gabius, H. J. Modulation of lectin-triggered superoxide release from neutrophils of tumor patients with and without chemotherapy. // Anticancer Res, V. 13, PP. 1789-1792. 1993

174. Tonevitsky A.G., Agapov I.I., Ershova G.V., et al //Cytotoxic Effect of Ricin A-Chain Conjugates Containing Monoclonal Antibodies Against Human Erythroid Cells. //Int. J. Immunopharmacology, V.15, PP. 229-235, 1993

175. Tonevitsky A., Shamshiev A., Prokoph'ev S., et al //Hybridoma cell producing antibodies against A-chain of mistletoe lectin I are resistant to this toxin//J.Immun.Lett., V.46, PP. 5-8, 1995.

176. Trush GR., Lark LR., Clinchy B.C. //Immunotoxins: an update// Ann.Rev.Immunol., V.14, PP 49-71, 1996

177. Van Deurs B, Tonnessen TI, Petersen OW, et al// Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex// J.Cell Biol V. 102, PP. 37-47, 1986

178. Van Deurs B., Sandvig K., Petersen O.W. et all // Estimation the amount of internalizated ricin that reaches the trans-Golgi network// J.Cell Biol., V.106, PP. 253-267, 1988

179. Van Deurs B., Sandvig K., Petersen O.W. et all //The ways of endocytosis // Int. Rev. Cytol, V. 117, PP. 131-177, 1989

180. Villafranca J.E., Roberts J.D. // Ricin B chain is a product of gene duplication //J.Biol. Chem., V. 256, PP. 554-556, 1981

181. Voorhees P., Deignan E., van Donselaar et alII An acidic sequence within the cytoplasmic domain of furin functions as a determinant of trans-Golgi network localization and internalization from cell surface //EMBO J., V. 14, PP. 49614975, 1995

182. Wales R, Richardson P.T., Roberts L.M., et al// Mutational analysis of the galactose binding ability of recombinant ricin B chain // J. Biol. Chem., V. 266, PP. 19172-19179, 1991

183. Waring, P. // DNA fragmentation induced in macrophages by gliotoxin does not require protein synthesis and is preceded by raised inositol triphosphate levels. //J.Biol.Chem, V. 265, PP. 14476-14480, 1990

184. Worthington, J., Morgan, K.// Peptide Antigens./ Eds Wisdom G.B.Oxford: Univ. Press, PP. 181-217, 1994

185. Wiedlocha A., Sandvig K., Wazel H., et al //Internalization and action of immunotoxins containing mistletoe A-chain// Cancer Res., V. 51, PP. 916-920, 1991

186. Williams J.M., Lea N., Lord J.M., et al.// Comparison of ribosome-inactivating proteins in the induction of apoptosis// Toxicology Lett., V. 91, PP 121-127, 1997

187. Wolff E. A., Hellstram I., Chace D.F. et al//Antitumor activity of melanoma-specific immunotoxin// Ther.Immunol., Y.2, PP. 137-145, 1995

188. Wu M.// Enhancement of immunotoxin activity using chemical and biological reagents//Br.J.Cancer, V.75, PP.1347-1355, 1997

189. Youle R.J.,Colombatti M.// Hybridoma cells containing intracellular antiricin antibodies show ricin meets secretory antibody before entering the cytosol //J.Biol.Chem., V.262. P.4676-4682, 1987

190. Zarkovic, N., Zarkovic, K., Grainca, S., et al// The Viscum album preparation Isorel inhibits the growth of melanoma B16F10 by influencing the tumour-host relationship// Anti-cancer Drugs, V. 8 Suppl., PP. S17-S22, 1997

191. Zeme M., Rybak S.M., Dibel S. et al //Cloning and cytotoxicity of human pancreatic Rnase immunofiision// Immunotechnology, V.2, PP 127-13 6, 1997

192. Zhan J., Stayton P., Press O. //Modificatication of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences150enhances its cytotoxicity and traslocation // Cancer Immunol., Immunother., V. 46, PP 55-60, 1998

193. Zimmerman R., Pfuller U.// Glycosylation pattern of mistletoe lectins // COST98, V5, PP. 55-62, 19981. БЛАГОДАРНОСТИ