Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мутагенез А субъединицы шига токсина

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Мутагенез А субъединицы шига токсина"

РГ6 од

" i; '¡''у, '¡ российская академия наук

институт молекулярной биологии имени В.А.энгельгардта

На правах рукописи УДК 577.21.6

ДУБИНИНА Елена Николаевна

МУТАГЕНЕЗ А СУБЬЕЛИНИЦЫ ШИТА ТОКСИНА 03.00.03 - Молокуляная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

Работа выполнена в Институте молекулярной .биологии имени В.А.Энгельгардта РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕ»:

доктор биологических наук, профессор Ю.В.Козлов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук М.Я.Тимофеева доктор биологически* наук А.Г.Тоневицкия

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - Институт биологии гена РАН

Защита состоится "^^^и^сЬ^^! -1593г. Е-10часоз на заседании специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии РАН им.В.А.Энгельгардта по адресу: 117964, Москва, ул.Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии РАК имени В.А.Энгельгардта.

сбшая характеристика работы

Актуальносхь_темы. Существует целый ряд белковых токсинов бактериального и растительного происхождения избирательно поражавших эукариотические клетки. Мишгнью для токсинов может служить клеточная мзмбрана, какой-либо из оелков, определявших метаболическую активность клетки. либо клеточный белоксинтезируюшия аппарат. К токсинам, действующим на белоксинтезируюший аппарат относятся такие представители семейства растительных токсинов как абрин (из семян Abrus precatorlus). рииин (из семян Ricinus comnunis). а также ряд токсинов бактериального происхождения - иига токсин 1 Shigella dyser.terlae), псевдоионадныя токсин А IPseudomonas aeruginosa), дифтериинып токсин ICorynebacterlm dlphteriae).

Проникновение токсина в клетку приводит к полному подавлению синтеза белка, которое в случае ряда растительных токсинов и шига токсина происходит в результате инактивации 60S субьединицы рибосом, а в случае дифтерийного токсина и псевдомонадного токсина А - инактивации фактора элонгации 2 IEF-2).

При проникновении в эукариотическую клетку токсины, как правило используют пути и механизмы, которые характерны для многих регуляторных белко5 (факторы роста, гормоны). Поэтому проникновение токсинов в клетку иожзт слуаить моделью для изучения механизмов транспорта регуляторных белков.

Обшим в дсяствии токсинов является таххе их способность вызывать лизис и гибель ряда зукариотических клеток. Поэтому исследования проникновения и механизма действия токсинов могут иметь и прикладное значение, поскольку открывает возможности создания . целенаправленно измененных токсинов (иммунотоксинов). которые могут быть использованы для унмчтожэния определенных групп клеток, например, раковых.

Бактериальные токсины играют важнув роль в патогенезе ряда инфекционных заболевания (столбняк. дизентерия). Поэтому исследование молекупярных механизмов действия токсинов на клетки эукариот представляет большой научный интерес ' и имеет важное значение для изучения основ

иитерес и имеет важное значение для изучения основ патогенеза.

Нахчная_новизна_рабохи^ В результате проведенной работы было показано, что шига токсин in vivo обладает специфической активностью и инактмвирует эукариотичесие рибосомы. Эта специфическая активность токсина мигеллы проявляется в удалении одного основания аденина в положении 4324 с 3'-конца в 285 р-РНК. Метод удлиняющейся затравки, котсрып был использовав для юкализации места модификации в 28S р-РНК является высокочувствительным методом определения активности токсинов, которые функционируют как N-гликозидазы.

Изучение эффекта полученных мутации s экзиматичаски активной А субьеданное, в участке иежду Cys 241 и Cys 260, позволило подтвердить значение протеолитического разрезания А субьедикацы токсина для проявления его биологической активности внутри клетей. Проведенные эксперименты показали, что мутант токсина, лишенный участка чувствительного к расщеплении трипсином (delta mut), так жз как и другой мутантный вариант токсина ,в котором два аргинина заменены на гисткдины 1Г".47,2504) обладают меньшей, по сравнению с диким вариантом, цитотоксичностьо для различных линия эукариотическшс клеток. Vero, НЕр-2, T47D7. Протеолитическое растепление А субьедоницы шига токсина является важным условием для проявления его иктотоксичности.

Полученные экспериментальные данные позволили . также заключить, что протеолитическое растепление шига токсина может происходить в аппарате Гольдам, либо в другом клеточном компартменте в ходе транспорта токсина к соответствушвя мишени.

Практическая ценность работы. Полученные экспериментальные данные имеют важное значение для изучения некоторых аспектов патогенеза инфекционных заболевании, вызываемых пшгеллами. Исследование особенностей внутриклеточного транспорта шига токсина открывает перспективы использования химерных вариантов токсинов в биомедицинских исследованиях. Апрдбация_1)аботы. Результаты доложены на 4-ом Европейской симпозиуме "Bacterial protein toxins" i Италия, Урбино. 1969г. 1; на 6-ом Европейском симпозиуме "Bacterial protein

toxins" НИотландия. Сткрлинг, 1993г.). Основные положения диссертации обсуждены и представлены к заште на заседании коллоквиума отдела генетическом инженерии Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта FAH 13 октября 1993г.

Обьем_и_ствуктува_диссертаиии. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы.

Работа изложена на 95 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы и 15 рисунков. Библиография включает 126 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В данной работе были использованы лабораторные штаммы E.coll JM103, НВ101, BMH71-1S. В качестве векторов использовали pUC19 (Ap'.lacZ), pUC10 (Ар1 ,lacZ). фаг M13mp8 (lacZ) и ранее полученную плаэмиду pSKT23 С Ар1 ), несущую гены аига токсина. Для выращивания бактериальных штаммов использовали среды LB или 2XYT. В случае необходимости в среды добавляли антибиотики. Трансформацию, выделение плазмиднои ДНК, гель-электрофорез, обработку ДНК рестриктазами и другими ферментами, извлечение фрагментов ДНК из агарозного геля проводили по Манлатксу и др. [1984 1. Клонирование фрагментов ДНК в составе фага ИЗврв, выделение одно- и двухиепочечкся фаговой ДНК, а также секненирование по методу Сэнгера проводили согласно методике описанной в руководстве фирмы Assrsham. Секвенироваяие фрагментов ДНК осупествляли химическим методом (Махаш A., Gilbert W. ,1981 1. Олигонуклеотид-направленныи мутагенез проводили как описано в статье tZoller М., Smith М., 1084]. р-РНХ из клеток Vero выделяли по IChoracsynsky P., Sacchl N.. 19871. Обработку клеток А431 масляной кислотой, мечение шита токсина i2sl, субклеточное Фракционирование проводили согласно ¡Santívig et.al., ¡351 j. Обработку эукариотичесюк клеток брефельдинои А осуществляли как это описано (van Deurs 3. et.ftl., 1986). В качестве затравки в реакции синтеза к-ДНК с помощью

обратной транскриптазы и для олигонуклеотид-направленного мутагенеза использовали олигонуклеотиды любезно предоставленное Б.К.Черновым 1ИМ5).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Механизм действия токсина ¡шгеллы

1.Специфическая активность токсина пигеллы in vitro и т vivo

Целый ряд токсинов растительного происхождения, таких как рииик. абрик, вискумин, модеиин, являясь специфическими N-гликозидазами, инактивируют In vitro эукариотическ::е рибосомы. Обнаруженные структурные сходства шига токсина и рицина IKoslov J.7. et.al., 19871 обладавшего N-гликозидазноа активностью [Endo Y. et.al., 1967J позволили предположить и функциональное сходство этих двух токсинов. Для того чтобы проворить это предположение экспериментально, рибосомы из ретикулоиитов кролика обрабатывали шига токсином. Для выявления модификации в РНК использовали обработку РНК анилином, который вносит разрыв фосфодиэфирной связи в месте модификации. После удаления анилина РНК анализировали электрофорезом в 1,7" агарозном геле. Результаты эксперимента представлены на рис.1. Как видно на рисунке, обработка рибосом шига токсином и последующая обработка анилином приводит к разрезанию 2SS р-РНК на два субфрагмента: большой субфрагмент ( ¿ 28S), имеющий электрофоретическую подвижность несколько большую,чем 28S р-РНК и малая субфрагмент 1f-фрагмент I. Не обработанная токсином РНК после обработки анилином остается интактнои. Таким образом, было получено экспериментальное подтверждение сходства механизма действия рицина и токсина шигеллы in vitro.

Экспериментальные данные полученные In vitro не всегда адекватно отражают ситуацию in vivo. Взаимодействие шига токсина с чувствительной эукариотической клеткой, которое в конечном итоге приводит к ее гибели, является комплексным

процессом. Vero клетки чузствительные к действию вига токсина использовали для изучения биологической активности токсина In vivo. Была проведена серия экспериментов в которых анализировали рибосомнув РЖ выделенинуо из клеток линии Vero, обработанных шга токсином. Через определенные промежутки времени выделенную РНК, тахже как и в экспериментах In vitro, обрабатывали анилином и анализировали электрофорезом в агарозном геле. Было обнаружено, что шига токсин In vivo также вызывает модификацию 2SS р-РНК, 18S р-РНК остается интактноя Iрис.1 >. Короткий субфргтмент 285 р-РНК, f-фрагмечт, появляется vacs через 4ÛMMH после добавления токсина к клеткам (5-ая дорожка). Модификация токсином РНК, видимо, не ведет к существенной деградации рибосом в клетке, так как картина распределения РНК практически не меняется в течение последуэших е-ми часов инкубации клеток с токсином (дорожки 7 и в ). В параллельном опыте была изучена кинетика подавления синтеза белка в клетках Vero после добавления токсина. Результаты эксперимента представлены на рис.2. Через 40мин после добавления токсина к клеткам каблюдаетя почти полное подавление включения иС-меченных аминокислот в новосинтезированные белки, в контроле включение метки линейно растет с течением времени. Таюш образом, In vivo обнаруживается временная корреляция пэяглеяия Г-фрагмечта с кинетикой включения «етки (рис.1.2). По-видимому, определенная промежуток времени, о:соло 40кки.- это то время, которое необходимо для связывания токскна с рецепторами клеточной поверхности, проникновения в клггтку я проявления энзиматического действия. Полученные результаты дают возможность заключить, что in vivo, так хг как и In vitro плга токсин инахтив;;руьт рибосомы эукарвотических клеток кодифицируя 2SS р-РНК. Сходство иехгкжзха действия шига токсина и ркцика In vitro эксперимеатапьпо было подтверждено и другими авторами [Endo Y. et.al., 1987].

Элемрофоретическсе разделение Flu:, выделенной из рибосом. • Сработанных и Kt обработанных шига токсином in vitro ;л), In »/Ivo !Б>

12 3 4

1-ГНК из не обработанных токсином рибосом;

2--ГИК из не обработанных токсином рибосом, но обработанная анилином, З-ГНК обработанных рмцнкнм рибосом и обработанная анилином;

•1 - ГПК. ил обработанных шига токсином рибосом и обработанная анилином.

В

288—».

13s

Л2В8

1qg

12 3 4 5 6 7 8

1-РНК из обработанных токсином клеток; ,2-ШК из не обработанных токсином клеток: З-ШК. выделенная через 20ммн после обработки клеток токсином и обработанная ани лином; 4-то >;а без анилина: 5-П1К, внлелец ная через ЧОмин после обработки клеток токсином и обработанная анилином; б-то же без анилина; 7-РНК.. выделенная через 6ч после обработки клетох токсином и обработанная гни-

В?£М9(П1'.Н

Рис.2 Кинетика вютчения иС-мечекых агэшЕкшслот клетками Vero обработанными I—) и не обработанная кита токсином (—).

2.Определение.места модификации шига токсином в 26S р-РНК

Для локализации места модификации в 28S р-РНК шига токсином in vivo использовали метод удлиняшеяс.^ затравки. Как предполагалось, результатом такси модификации яз.-яэтся терминация синтеза к-ДКК на матрице 28S р-РНК в участке модификации з реакции обратной транскрипции. Б качестве специфическое затравка в реакции синтеза к-ДНК использовали агР-меченый огигснуклеотид комплементарный 3*-концу 28S р-РНК и находядаися на расстоянии около 50-ти нуклестидов от возможного места кодификации. Синтезирозаннув к-ДНК анализировали электрофорезом з секвенируошем геле. К-ДНК синтезированную на инактной р-РНК использовали в качестве контроля. Синтез к-ДНК на р-РНК матрице обработанной шкга токсином осуиествяяется обратной транскриптазои лишь до места модификации, что приводит к появление дополнительной полосы, по сравнению с. контролем, соответствующей длине к-ДНК от 5'-коныа праимера до места модификации. В кентрольном эксперимента синтезируется полнеразмерная копия к-ДНК (пк-ЛЖ1. Игл более детальной локализации места модификации, волноразиеркуо копии ДНК секвенировали методом Максама и Гилберта. На соседнюю дорожку в качестве контроля наносили k-ÍHK. синтезированную на обработанной шига токсином 28S р-РНК. Модификация в 28S р-РНК осуществляется по А*з2*.Определенное положение места модификации совпадает с данными работ других авторов (Endo Y. et.al., 1988], которые локализовала саят модификации In vitro. Метод удлиняющейся затравки может быть использован как высокочувствительная метод определения специфической активности токсиноз in vivo, которые обладают сходным с шкга токсином механизмом действия.

II.Мутагенез А субьединицы шига токсина LUito токсичность целого ряда белковых токсинов.

определяется несколькими факторами: 1 ¡экзиматическои активностью : 2 Эффективностью транспорта токсина внутрь клетки и к соответствующей мишени внутри клетки: 3 Эффективностью связывания токсина с клеточными рецепторами.

В предыдущей главе было показано, что А субъединица шига токсина обладает специфической энзиматическоя активностью ведущая к инактивации эукариотических рибосом а подавлению синтеза оелка в клетке-мишени. Лальнепшим этапом наших исследований било изучение роли протеолитического расщепления энзиматически активноя А субьединицы шига токсина зля проявления его биологической активности , а также некоторых особенностей внутриклеточного транспорта токсина.

Пнтотоксичность некоторых бактериальных токсинов усиливается при протеолитическом растеплении энзииатически активной субьединицы токснна. К таким токсина* относятся, например, дифтерипный токсин IMosltaug J.O. et.al.. 1983!, псесломонадныл tokc.ih а iPastan i. et.al.. 13631. холерный тэксчн lOlsnes S.. Sandvlg К., 19381. Про^еолитическое р?-шеплекие токсина иожт происходить на разла-пшх стадиях проникновения токсина е клетку. Установлено, например, что в протео;;;:тичссксм расщеплении дифтерийного токсина участзувт клеточные поотеазы подобные тгипсину, г.стсзме разрезапт токси;; на этапе тсанслокации из эндосом в шетозоль клетки lífcskaug J.O., 1983 1.

Предпогагг.энгя участок произсс;-:нга в последовательности Д суСьедини 'У тчига токсина расположен кехду Суь 241 и Cys 250. Эти д^а ^истеин'- образуют дисуль'Ъидньт "мостик" 2 А субьедлкние токсина. Мягкая соразотка трипсином и последующее восстановление дясульеадгазя сзязи

С-уеркап'-оэтанолом приводит к осразованио дзух полипоптилов Al и А2. Именно Al йрагиэнт является э::зииат:г«ески актиенын

специфической актискосты? прер.осг.одтпег активность интактноя А суСьелинипы ь оесклеточно™ скстечж ÍRelsblg R.. et.al.. 1.

Су^эстпусиие данные позволили предпэ.'й^.ить. что протр-глити'-:сскоэ расцепление ui;r а tokz-ау:. гг.утри клетки MorvT осугэст/лято клеточниз прзт^ази подобные трипсину.

-î fr-

Для изучения влияния протеолитического растепления А субьединииы на энзиыатическус активность токсина, транспорт внутри клетки и в конечном итоге на цитотоксичность были сконструированы три различных мутантных варианта шига токсина (рис.31. Мутации были введены в область предполагаемого разрезания А субьединииы. Между Cys 241 и 260, образуммыя дксульфидныя "мостик" в А субьединице, расположена аминокислотная последовательность, которая узнается трипсином -Arg-X-X-Arg-. Поэтому в пределах участка, расположенного между Cys 241 и Cys 260, в одном из мутантов, два аргининовых аминокислотных остатка - Arg 247 и Arg 250 были заменены на два гистидиновых (R247.250H mut). Второй мутант содержал замену лишь одного аргинина Arg 247 на His 247 (Н247Н Mit). Третий мутант содержал делешш шести аминокислот (delta sut), включая Arg 247 и Arg 250.

SHIGA TOXIN

S—S 293 1 69;

A1

A2

В

Cy*HisHl*HUAlaSerArgVaMlaArgMetAla8arAapQluPhePraSarMetCya

241 ■ 260?*

SerArgValAlaArgMet (deleted) delta mut His 247 R 247 H mut. i _ HiS247 His 2501 R24r\S50H mut.j

Рис.3 Ыутаатные варианты шига токсина

Чтобы исключить влияние полученных мутаций непосредственно на экзиматическую активность токсина, мутантные белки анализировали in vitro, в ретикулоиитном лизате. В данных экспериментах in vitro активность токсина

определяли по включение 355-иеченого метконина в суммарный белковый продукт после добавления токсина в различных концентрациях. Анализируемые мутантные токсины были способны ингибировать синтез белка в бесклеточной системе в топ же степени что и дикий вариант шига токсина (рис.4). Полученные результаты- позволили заключить, что данные мутации не оказывают прямого влияния на знзиматическую активность шига токсина. Оказалось также, что введенные мутации не оказывают влияния на эффективность связывания токсина с клеточными рецепторами.

100 1000

КОНЦЕНТРАЦИЯ ТОКСИНА (НКГ/ЫЛ) Рис.4 Кинетика включения эзЭ-метионина в суммарный белковый продукт в бесклеточноя системе, лизате ретикулоцитов кролика. д -R247.250H; »-delta mut: »-контроль без токсина: о-дикий вариант шига токсина.

Для исследования влияния мутация в области предполагаемого процессинга А субьешгашш токсина на цитотоксичность ln vivo использовал* различные линии эукариотических клеток Vero, T47D, КЕр-2, чувствительные к действию шига токсина. Результаты данных экспериментов представлены на рис.5.

§ »

а з 8

5» •»•

г »

? Ч Ё

в § 5

л Н

X

с м к

о! я

.. ю

(»

Т ■§

о. р> л) x ь- Н

-I

в с

о а: с: т х ч ►о

Е=

Ш

Н о ?! П X

X >

ВКЛЮЧЕНИЕ 3Н - Л Е И Ц И Н А (ХОТ КОНТРОЛЯ)

Было обнаружено, что замена лишь одного аргинина на гистилин IH247H mut! в исследуемом участке А субьединицы токсина приводит лишь к очень незначительному снижение цитотоксичности. В то же время замена двух аргининов на гистидины (R247.250H mut) приводит к снижению активности токсина в 5-10 раз, а делеция б-ти аминокислот (delta nut) в области предполагаемого проиессинга А субьединицы - к 100-кратному снижению активности токсина по сравнению с диким типом.Интересно что, цитотоксичность мутантных вариантов токсина может варьировать в зависимости от используемых клеточных линия. Снижение активности всех мутантных Еариантов токсина наблюдается в случае короткой, по времени, инкубации клёток с токсином (1-Зчасов).

Полученные налги мутантные зарианты токсина содержат замены аминокислот в участке узнавания трипсина и ¡ложно было предполагать, что эти замены поблияют на чувствительность токсина к обработке трипсином. В наших экспериментах мутактные варианты mira токсина после обработки трипсином In vitre, анализировали электрофорезом з 15S полиакриламияном геле (рис.6).

A mut. 2Я-2Н VV.L

Trypsin Cwi'ml) 00-215 00.21 S 00.2 1 5

чбкО ЗОкО 21.5 кО 14.3 kD

Lara 1 2 3 4 5 6 78 910 1112 Î314

Рис.б Чувствительность дикого и мутантных вариантов шга токсина к обработке трипсином.

Токсины Имг/мл) обрабатывали трипсином в различных

концентрациях в течение 2мин при ÎS'C. Реакции останавливали добавлением PMSF до 5мМ и образцы наносили на 155 полиакриламидныи гель. i-4-delta mut: 5-8-R247.250H: 9-12-дикий вариант токсина: 14-маркеры молекулярного веса.

Действительно.как это видно на рисунке, токсин содержащий лелецив, так же как мутантныи вариант, в котором два аргинина заменены на гистидины, не чувствительны к обработке трипсином. В то время как А субьединица дикого варианта токсина при обработке трипсином расщепляется на два полипептида А1 (27кД) и А2 (4,5кД). Таким образом, наблюдаемое снижение цитотоксичности мутантных вариантов шига токсина (R247.250H mut) коррелирует с устойчивостью токсинов к обработке трипсином.

Полученные результаты позволяют заключить, что проиессинг А субьединицы шига токсина на А1 и А2 полипептиды, в участке между Cys 241 и Cys 260 является важным условием для проявления цитотоксичности.

Изучение транспорта целого ряда других токсинов методами электронной микроскопии, радиоактивным и иммунологическим мечением показало, что небольшая часть молекул токсинов после стадии эндоцитоза транспортируется в аппарат Гольджи эукариотическоя клетки [Olsnes S. et. al., 1983, van Deurs В. et.al., 1988, van Deurs B. et. al. 1990 1. До сих пор, однако, остается неизвестным, транслоцируется ли энзиматически активный компонент токсина в цитозоль непосредственно из аппарата Гольджи или же транслокации предшествует транспорт в другой клеточный компартмент. Недавно было показано. что шига токсин может транспортироваться ретроградным путем из аппарата Гольджи в эндоплазматическии ретикулум, откуда также возможна транслокация энзиматически активной субьединицы токсина в цитозоль ISandvlg К. et.al., 1992 1.

В наших экспериментах для изучения внутриклеточного транспорта шига токсина использовали клетки А431, которые исходно не являются чувствительными к шига токсину, но приобретают способность активно связывать и транспортировать токсин внутрь клетки после предварительной обработки масляной кислотой. Масляная кислота индуцирует в клетке

синтез нейтральных гликолипидов, которые являются рецепторами для лига токсина 15аш1У1г К. ег.а1., 19Э1 !. Клетки (А431 ) инкубировали в течение часа с ¡251-меченьш токсином. затем гомогенизировали и подвергали Фракционированию. Зона I I рис.7) соответствует по своему положению фракции содержащей компоненты аппарата Гольджи, зона XI - фракции компонентов плазматической мембраны, зона III - эндосомнои и лизосомной фракциям. В контрольных клетках А431, не обработанных масляной кислотой лишь очень незначительное количество токсина транспортируется в аппарат Гольджи I рис.7 а и Ы. в то время как во фракции соответствующей компонентам аппарата Гольджи обработанных А431 клеток обнаруживается значительно большее количество шига токсина (рис.7 с и (1). Таким образом, проведенное фракционирование клеток А431 после инкубации с 1251-меченым шига токсином при 37* С показало, что обработка клеток масляной кислотой приводит к резкому увеличению содержания шига токсина в аппарате Гольджи (рис.7).

Тер Friction по. Bottera Top Fraction no. Bottom

f. _

Рис.7 Влияние масляной кислоты на распределение íes I-меченого шга токсина в клетках А431. Клетки инкубировали с 1»ВА) и без 2мМ масляной кислоты в течение Чбчасов. После добавления шига токсина и маркеров клетки инкубировали при 37* С еще в течение . часа. А.Е-распределение шига токсина и маркеров в клетках, не обработанных масляной кислотой; C,D-to же в клетках обработанных 2мМ масляной кислоты.

Экспериментальные данные получеиние In vivo подтверждают важность протеолитического растепления А субьединицы шига токсина для увеличения его цитотоксичности. Эти данные в совокупности с результатами свидетельствующими о необходимости транспортировки то:;сина в аппарат Гольдм:, позволили предположить, что процессинг А субьединицы шига токсина можзт осуществляться протеазами подобными трипсину в ходе внутриклеточного транспорта токсина. Лля проверки данного предположения использовали линию клеток T47D исходьо чувствительную к действия шига токсина и линию A431 сенсибилизированную к деястЕИ» гоксина обработка« масляной кислотой. Клетки псдЕергали предварительной обработке Срефельдлноц А. Известно, что е результат обработки клеток срефелъдикоы А аппарат Гольджи подвергается дезинтеграции ÍLlppincott-Sctíwart;: J. et.al., 193S). Следовательно, если А субьеднпица иига токсина, содержащая делению также транспортируется в аппарат Гольд:ки, предварительная обработка клеток брефельдиноы А лолжка заседать клетки от действия шуга токсина. Результаты такого эксперимента прелстаслены на рис.Ь. К клеткам T47D, после предварительной инкубации с брефель^.-.ном А добавляли дикий и иутантнык вариант токсина ¡delta ¡wat) в различных концентрациях. ¿ качестве контроля служили клетки не обработанные брефельдинзм А. После трех часовой инкубации клеток с токсином эффективность доГстеия токсина определял!« пс включению метки - зН-леицина в суммарный белковая продукт. Как это показано на ркс.Е С>сфьл'.аик А за^иает клетки T47D от интоксикации как диким, так и ¡/у ггнтны.:

вариантом токсина. Полученные результаты позволяют заключить, что делеиионныя вариант токсина в клетках Т47Э транспортируется в аппарат Гольдлм.

■< х

я _

tc а;

ы с?

■=: о

I IX.

s 1-

1

ы

о

_ о гс

Ш (-.

=Г о

S М : ^

! *

«

100 00 69 40 20

Shiga v/.t + BFA

-

Shlaa vj.€

T47D

LA.1_I_I_I-1-

0.1 1 10 100 1000

КОНЦЕНТРАЦИЯ ТОКСИНА (НГ/МЛ)

Fnc.e Кинетика включения зИ-леяцина клетками T47D предварительно обработанными брефельдином А, а затем диким и мутантным (delta nut) вариантами "шига токсина. Клетки инкубировали с или без брефельдина А (2ккг/мл) в течение 20нмп, затем добавляли вига токсин. Через 3 часа после инкубации с токсином определяли включение эН-леяцина. о-дакиа вариант токсина,- д-delta rait; о -ятся» вариант токсина+брефельдич A: A-delta mut+брефельдин А.

Предварителькая обработка сенсибилизированных клеток А431 брефельдином А также защипает клетки от интоксикации пига токсином I рис*.9! . Эксперименту с клетками А431, сенсибилизированными к действию шига токсина обработкой масляной кислотой подтвердил.!, что шига токсии так гге как и в исходно чувствительных к токсину клетках Т471), после стадии зкдоцитоза транспортируется в аппарат Гольджи. Такие результаты согласуются с полученными ранее данкькм указывающими на необходимость транспортировки токсина в аппарат Гольджи после гндоиитоза IБалДу1е К. ег. а1., 1991 1.

1 10 100 1000

онцент рация токсина (нг/мл)

Рис.9 Способность брефельдина А зашивать сенсибилизированные масляной кислотой А431 клетки от действия шига токслна. А431 клетки инкубировали с масляной кислотой 12ыМ) в течение 48часов. Брефельдин А добавляли до концентрации 2мкг/мл, а затем через 15ыин к клеткам добавляли шига токсин. Включение зН-леицина измеряли через Зчаса после инкубации с токсином.

• -ллс-т.ч;: ¿ipiMTiHn»:- тага токсин;,*: токсин+Орефельдин А.

В то же гремя в наиих экспериментах клетки A4.il , обработанные масляной кислотой оказались е той же степени чувствительными и к мутантному варианту токсина (delta nut). А субьединица которого не содержит участка в котором происходит разрезание трипсином на М и А2 полипептиды (рис .10*) .Однако, цитотоксичность делзционного варианта токсина для А«1 клеток была ниже в сравненчи_£,, диким типом шига токсина, что может быть связано с более низкой эффективность«: транспорта внутри клетки делеционного варианта токсина. С другой сторона, остаточная цитотоксичность делеционного зарианта шига токсина может объясняться сукветвоеание в А субъединице шига токсина альтернативных . участков чувствительных к действии внутриклеточных протзаз. которые могут также осуществлять прстеолитическое растепление токсина.

100 80 60 40 20

mutant toxin --л /

Г

1

Shiga w.t.

Ьл. +

mutant toxin

0.1 i 10 100 1000

КОНЦЕНТРАЦИЯ ТОКСИНА (НГ/МЛ)

Рис.10 Кинетика включения эН-леииина в суммарный белковый

продукт б клетках А431 сенсибилизированных наслянои кислотой к действию шига токсина, о-дик:1й вариант шига тохсина; д-delta кит »-масляная кислота-дикин вариант ьяга тикс;:ла: А-масляная кислота»áe*ti cat.

Таким образом, как in vivo, так и In vitro шга токсин инактивирует эукариотические рибосомы, . модифицируя 2BS p-PHiv. Эта специфическая активность токсина шигелли проявляется Б удалении одного основания аденина в положении 4324 с 3'-конца в 26S р-РНК. Метод удлинявшейся затраЕки, который был использован для локализации места модификации в 26S. р-РНК является высокочувствительным методом определэния активности токсинов, которые функционирует как N-гликозидазы.

Изучение эффекта полученных мутаций в А субьедитше токсина позволило подтвердить значение протеолитического разрезания А субьединицы токсина для проявления его биологической активности внутри клетки. Наши эксперименты показали, что мутант токсина лишенный участка чувствительного к растеплению трипсином (delta nut), так же как и другой ыутантныя вариант токсина, в котором два аргинина заменены на гистидины (В247.250Н) обладают меньшей по сравнению с диким вариантом цитотоксичностью для различных линия эукариотических клеток. Протеолитическое расщепление А субьединицы шкга токсина на Al и А2 фрагменты является важным условием для проявления его иитотсксичности. Процессинг токсина может осуществляться на различных стадиях проникновения токсина в клетку.Полученные нами экспериментальные данные позволяют заключить, что протеолитическое растепление шига токсина может происходить в аппарате Гольдги, лизо в другом клеточном компартыенте в ходе транспорта токсина внутри клетк.:.

Некоторые эксперикгнты (отмечены звездочкой) были выполнена в райках ^ совместных исследования с лабораторией С.Олснеса в Институте раковых исследовании в Осло, Норвегия.

выводы

1.Токсин шигеллы обладает m vivo специфическом активностью, которая заключается в модификации основания аденина. в полизнии 4324 с 3'-конца в 285 р-РНК. Метод удлинявшейся затразки могэт бить использован как высокочувствительный метод опредепения специфическое активности токсинов 1г. vivo, которые обладают сходкын с шига токсином механизмом действия. •

2.Протеолитическое расщепление А субьединицы кига токсина на Al и А2 фрагменты является валяна условием для проявления его цитотоксичности. Получены варианты шига токсина с кутацияии в области разрезания А субьединицы на Al и А2 фрагменты. Мутанткье варианты обладаат меньшей по сравнению с дикмм вариантом токсина цитотоксичностью для различных линий эукариотических клеток. Введенные мутации не оказызают непосредственного влияния на энзиматическую активность шига токсина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1.E.H Дубинина., Е.В. Лукьянов.. 10.В. Козлов.. А.А.Баев. Механизм действия шига токсина. - ЛАН СССР., 1988, т.302, 1, с. 226-228.

2.K.Sandvlg.. E.Dublnlna., O.Garred., K.Prydz., J.V.Koslov.. S.H.Hansen., В van Deurs. Entry of Shiga toxin Into cells. -Zentralolatt fur Bacterlologle, Gustav Fisher Verlag, Stuttgart/New York. 1993, v.273, p.296-305.

3.K.Sandvlg., E.Dublnlna., O.Garred., K.Prydz., J.V.Kozlov., S.H.Hansen., В van Deurs. Protein toxins: aode of action and cell entry. - Biochemical Society Transactions, in: Endocytosls, Toxins, Immunotoxlns and Viruses., 1992, v.20, p.724-727.

4-Kozlov J.Y., Dublnlna E.N., LuKyanov E.V. Simplified method to detect of shlga toxin and similar toxics In cells. Bacterial protein toxins.. Veldhoven. June 30-July 5. 1991.

p.p.5.6., BjoK of abstracts.

5.¡О.В.Козлов., E.В.Лукьянов.. E.H.Дубинина. The organization of the operons coding for shiga-like toxins. - Тезисы докладов 4-rc Европейского симпозиума "Bacterial protein toxins", Италия, Уроино. 3 989.

6.Kozlov J.V., Dubinins E.N., Garred C., Obnec S., Sandvlg K. Effect of nicking of A submit on cytotoxicity. - Тезису докладов 6-го Езропеяского симпозиума "Bacterial protein toxins", Шотландия, Стирлинг, 1993.