Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Воздействие факторов патогенности шигелл на макрофаги при моделировании инфекционного и вакцинального процессов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Воздействие факторов патогенности шигелл на макрофаги при моделировании инфекционного и вакцинального процессов"

На правах рукописи

Кудрявцева Людмила Юрьевна

¿е

ВОЗДЕЙСТВИЕ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ ШИГЕЛЛ

НА МАКРОФАГИ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИЯ ИНФЕКЦИОННОГО И ВАКЦИНАЛЬНОГО ПРОЦЕССОВ

03.00.07. - микробиология

.Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском ордена Трудового Красного Знамени институте эпидемиологии и микробиологии .имени Н.Ф.Гамалеи РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Ю. А. Белая

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук.

профессор В.М.Бондаренко

доктор биологических наук . А.Н.Носков

Ведущая организация:

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ им.Г.Н.Габричевского

Защита диссертации состоится 996 г. в 4L часов на

на заседании диссертационного совета К 001.07.01 в научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи РАМН по-адресу: 123098, Москва. ул.Гамалеи, 18.

С диссертацией можно Н.Ф.Гамалеи РАМН. Автореферат разослан .

ознакомиться в библиотеке НИИЗМ имени 19g5 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Е.И.Коптелова

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Острые бактериальные кишечные инфек-• ции. в том числе дизентерия, . представляют серьезную проблему здравоохранения ввиду высокой заболеваемости и смертности, особенно среди детей, и большой социально-экономической значимости [В.И.Покровский. 1995. М.И.Наркевич, Г.Г.Онищенко, 1991. И.Л.Ша-ханина. Т.П.Чернова. 1990, Доклад ВОЗ, 19913.

Одной из ключевых задач в решении этой проблемы является выяснение механизмов и закономерностей взаимодействия патогенных бактерий с организмом и определение роли факторов патогенности возбудителя- в развитии иммунных реакций.

Проведенные в последние годы исследования, посвященные выявлению значения вирулентности возбудителей кишечных инфекций в иммунитете, показали, что различные по вирулентности штаммы шигелл оказывают разнохарактерное по выраженности и направленности воздействие на иммунную' систему. Вирулентные штаммы шигелл вызывают изменения, выражающиеся, в частности, в стимуляции стволовых кроветворных клеток в направлении Т-клеточного звена иммунитета и гемопоэза, усилении гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), торможении антителообразования, а также колейкомогенном действии в присутствии вируса лейкоза Раушера [Ю.А.Белая, 1982, Ю.А.Белая с соавт., 1987, А.В.Санин с соавт., 1988, Т.Н.Николаева с соавт.. 1991].

Установлено также, что вирулентные штаммы вызывают угнетение формирования иммунологической памяти [А.Ф.Фролов. В.А.Борисов. 1984, 1988].

Авирулентные штаммы шигелл, напротиз, стимулируют преимущественно функции В-клеточного звена иммунитета, вызывая умеренную стимуляцию гемопоэза и ГЗТ. Введение живой дизентерийной вакцины из аттенуированных авирулентных мутантов Shigella flexnerl 2а 516М и S.sonnei 6S вызывает выраженный профилактический и им-мунотерапевтический эффект на людях [Ю. А.Белая, 1970,'J0. А.Белая с соавт., 1985, 1937, 1988, Ш.Назаров, 1982, Б.Бабажанов, 1984, Г.В.Султанов, 1981, А.В.Буркин, 1989].

Известно, что при инфекционных заболеваниях, характеризующихся внутриклеточные паразитизмом, важную роль играют макрофаги.

Шигеллы и сальмонеллы являются факультативными внутриклеточ-

ными паразитами. Исследованию мононуклеарной фагоцитирующей системы (МФС) при кишечных инфекциях посвящено достаточно большое число работ [Е.Д.Равич-Биргер, 1967, С.М.Самбуров, 1979. И.С.Фрейдлин, 1984. Петровская В.Г.. Бондаренко В.М.. 1994, G.B.Mackanes, 197J]. Однако значение вирулентности возбудителей кишечных инфекций и их отдельных факторов патогенности в макрофа-гальной реакции целенаправленно практически не исследовалось. До начала наших исследований имелись лишь единичные работы в этом направлении [Ю.А.Белая и др.. 1968, Л.К.Степанова. Ю.А.Белая. 1977, Л.К.Степанова. 1980. В.М.Бондаренко. 1976. Э.Л.Тейбер, 1979]. Между тем для понимания особенностей иммунологической перестройки организма при шигеллезном и сальмонеллезном инфекционных процессах определение роли вирулентности и отдельных факторов патогенности возбудителей'в фагоцитарной реакции является одной из первостепенных задач.

Все вышесказанное определило цели и задачи настоящего исследования .

Цель работы: изучение закономерностей и некоторых механизмов взаимодействия вирулентных и авирулентных штаммов шигелл и их факторов патогенности - 0-, К-антигенов и шига-токсина, с клетками МФС при моделировании инфекционного, вакцинального процессов и интоксикации.

Задачи работы.

1. Изучение влияния живых микробных клеток вирулентных и 'авирулентных штаммов шигелл и сальмонелл на интактные и активированные макрофаги в культуре In vitro при световой и электронной микроскопии.

2. Определение ферментативной активности макрофагов в присутствии вирулентных и авирулентных шигелл и отдельных факторов патогенности - 0-. К-антигенов и токсических биологически активных веществ.,

3. Выделение и' характеристика шига-токсина как фактора патогенности энтеробактерий, разработка иммунологической тест-системы для выявления его у различных бактерий, определение роли в фагоцитарной реакции.

4. Изучение роли факторов патогенности шигелл и сальмонелл (О-. К-антигенов. шига-токсина) в качестве иммуномодуляторов фагоцитов в интегративном тесте клеточной кооперации In vitro при

моделировании инфекционного, вакцинального процессов и интоксикации.

5. Получение и изучение . протективных и иммуномодулирующих свойств нового препарата "КбБ" - стимулятора фагоцитоза.

Научная новизна. Впервые проведены систематические, многоплановые исследования значения вирулентности знтеробактерий и их факторов патогенности во взаимодействии с клетками МФО..

Установлено, что вирулентные и авирулентные шигеллы. их индивидуальные факторы патогенности - 0-,К-антигены и токсины, -оказывают различное воздействие на фагоциты. Вирулентные шигеллы и их токсическиз биологически активные вещества вызывают глубокие и продолжительные деструктивные изменения клеток МФС. приводящие к нарушению функциональной активности и гибели этих клеток. Фагоциты гаракенных вирулентным штаммом животных при повторном заражении оказываются более чувствительными к цитотоксическому действию шигелл. Авирулентные бактерии обусловливают преходящие мор-фофункциональные изменения, преимущественно стимулирующего характера. Макрофаги вакцинированных животных приобретают способность к ускоренной активации своей функциональной активности.

Установлено, что в основе механизма цитотоксического действия вирулентных шигелл'лежит лабилизация и деструкция мембран лизосом и других внутриклеточных органелл и угнетение ферментативной активности фагоцитирующих клеток под действием токсических биологически активных веществ этих бактерий.

Отдельные индивидуальные антигены как факторы патогенности обладают различным воздействием на макрофаги. О- (ЛПС) и К-антигены шигелл способны резко . стимулировать синтез лизосомальных ферментов. Однако, в отличие от О-алтигена, обладающего токсическими свойствами для чувствительных клеток, в том числе макрофагов, К-антиген Б.50ппе1 практически не токсичен.

Установлено широкое распространение антигена шига-токсина у различных представителей кишечных бактерий. Впервые показано, что антиген шига-токсина является альтернативным фактором патогенности по отношению к кислым К-антигенам: он обнаруживается у всех штаммов, имеющих нейтральные О-антигены. и не обнаруживается у штаммов, синтезирующих кислые К-антигены. В случае утраты кислых К-антигенов в процессе мутаций у бактерий определяется наличие антиген? шига-токсина.

Установлено появление при инфекционном процессе и интоксикациях антигенспецифической (на 0- и К-антигены) и антигеннеспеци-фической (на вига-токсин) гипгрчувствительности лейкоцитов крови, тестируемой в микрокультуре in vitro по выраженности и направленности миграционной.активности клеток. '

Показана дэзовач зависимость усиления миграционной активности лейкоцитов крови мышей в присутствии 0-, К-антигенов и особенно шига-токсина in vitro при интоксикации, вызванной липополиса-харидом (ЛПС), и токсическом шоке, обусловленном шига-токсином.

Показана прямая корреляция усиления миграционной активности лейкоцитов крови in vitro в присутствии шига-токсина от тяжести сальмонеллезного инфекционного процесса.

Усиление миграционной активности лейкоцитов крови in vitro в присутствии шига-токсина является ранней высокочувствительной реакцией тревогй. свидетельствующей о выраженных патологических нарушениях в организме.

Практическая значимость работы.

Разработан и (.'Характеризован новый высокоиммуногекный нетоксичный иммуномодулятор фагоцитоза - "K6S".

Разработана иммунологическая тест-система для выявления антигена шига-токсина в культурах бактерий и препаратах токсина на различных этапах его получения.

Получены дополнительные .данные о способности вакцинного штамма S.flexnerl 2а 516М, входящего в состав разработанной ранее в'лаборатории живой дизентерийной вакцины, продуцировать антиген шига-токсина и стимулировать при иммунизации образование антител против него.

■ Определение миграционной активности лейкоцитов крови in vitro в присутствии шига-токсина может быть использовано • в качестве критерия оценки ?яжести патологических нарушений при инфекционном процессе и интоксикациях. при оценке реактогенности и. иммунологической безопасности вакцинных препаратов.

Результаты исследований были защищены 2 авторскими- свидетельствами.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференции "Иммунологические аспекты инфекционной патологии", 1981; VI < Всесоюзной конференции по клинической биохимии, морфологии, иммунологии инфекционных болезней. 1983; Всесоюзном симпозиуме, посвя-

ценном 100-летию создания Мечниковым фагоцитарной теории иммунитета, 1983; II Всесоюзном съезде инфекционистов, 1985; II Всесоюзной конференции "Актуальные ропросы теоретической и прикладной иммунологии", 1987; научной конференции "Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактериальных препаратов", 1988; XVIII съезде Всесоюзного научного общества микробиологов, эпидемиологов, паразитологов им. И.И.Ме"никова, 1989; VI съезде Всесоюзного научного общества микробиологов, эпидемиологов, паразитологов им. И.И.Мечникова, 1991; Республиканской научно-практической конференции "Новые методы диагностики и лечения", 1-995.

Работа апробирована на совместной научной конференции, группы иммунологии энтеральных инфекций, лаборатории генетики вирулентности бактерий и лаборатории естественного иммунитета НИИШ им.Н.Ф.Гшалеи РАМН 20 июня 1995 года.

Материалы работы"используются в учебном процессе кафедры инфекционных болезней лечебных факультетов ММА им.Н.М.Сеченова МЗ РФ.

По материалам диссертации опубликовано 23 работы.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на не страницах машинописного текста,• содержит 20 таблиц, .35 рисунков и ' состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных исследований (Б глав), заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего источников, включая 93 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы.

В работе использованы родственные пары вирулентных и ' авирулентных вакцинных штаммов: . Shigella flexneri 2а 516 и .G.flexneri 2а 516М; S.flexneri За 52 и S.fiexneri За 55;' S.sonnei 478 и S.sonnei 63; Salmonella typhimurium N415 и 30 красный.

Авирулентные штаммы шигелл получены Ю.А.Белой [1968], сальмонелл - Л.К.Степановой [1980].

Для получения пига-токсина и выявления его распространения среди различных бактерий было использовано, более 49 штаммов представителей Shigella. Salmonella. Yersinia, Campylobacter. E.coli и полученных из них К"-мутантов.

О-антигены (ЛПС) и полисахариды шигелл и сальмонелл были выделены совместно с В.Г.Летрухиным методом Westphal. Jahn [1962].

Поверхностный К-антиген из S.sonnei 6S выделен методом водно-солевой экстракции с последующим ультрацентрифугированием и фракционированием черев сефадекс 6-200.

Шига-токсин был получен совместно с Ю.Ф.Белым из штамма Shigella dysenterlae l N973 (Voile 30). модифицированным методом Brown [19821. . •

Для получения, антитоксической сыворотки использовали инакти-вированный глютаральдегидом токсоид [Brown, 1982].

В работе использовали мышей инбредных линий BALB/c, СВА, C57BL/6, гибридов первого поколения Fi (СВАхС57В1У6) и нелинейных белых мышей, самцов в возрасте от 8 до 16 недель, весом 16-20 г и кроликов весом 2.5-3.5 кг.

Фагоцитарную реакцию в культуре мышиных перитонеальных макрофагов ставили по методу [Ю.А.Белая и соавт.. 1968].

Электронно-микроскопические.исследования монослойной культуры макрофагов, а также во взвеси свежеполученных перитонеальных макрофагов, зараженных шигеллами. сальмонеллами или после внесения токсинов, проводили совместно с Ф.М.Кирилловой. В.Л. Поповым, Л.В.Диденко с помощью ультрамикротома "Ультротом-111-LKB8800" (Швеция) и электронного микроскопа JEM-100В (Япония) при увеличениях от 5000 до 50000.

Активность катепсина О (ЕС 3.4.23.5) определяли в 1ой и 2ой субклеточных фракциях клеток селезенки мышей после дифференциального центрифугирования [Weissmann, Themas, 1962] по методу Anson [1'936]. Белок определяли в фильтрате по Lowry [1951].

Активность 5-нуклеотидазы определяли1в суспензии неразрушенных перитонеальных макрофагов мышей по методу Dixon и Purdom в модификации М.А.Туманян. Г.Б.Кирилличевой [1984]. •

Скрининговый тест клеточной миграции (СТКМ) из микрокультур in vitro осуществляли с небольшой модификацией оригинального метода, предложенного А.П.Сусловым [1989]. Кровь брали из ретроор-битального синуса глаза 3-4 мышей каждой группы, после^обработки получали суспензию, содержащую 2-4 млн лейкоцитов в 1 мл, которую помещали в лунки плоскодонного планшета со средой культивирования. В качестве разрешающих тест-антигенов■in vitro использовали в зависимости от задач эксперимента ЛПС шигелл или сальмонелл. К-антигены сальмонелл или шигелл Зонне. шига-токсин в концентрациях от Ю-2 до. 10"14 мг/мл. Учет реакции проводили после 18-20 ч

.культивирования в термостате и определяли индекс миграции по вы- -числению соотношения диаметров зон миграции лейкоцитов в опыте (с антигеном) и контроле (без добавления антигенов). Достоверным показателем торможения или ускорения миграции считали ИМ >20%.

Реакцию коагглютинации ставили на планшетах с и-образным дном, в рядах которых с использованием петель аппарата Тагачи титровали исследуемый материал (фильтраты бактерий, шига-токсин, ЛИС)'. Затем в каждый ряд. лунок вносили соответствующие диагнссти-кумы. Учет реакции проводили через 18 ч.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по программам выш зления средних показателей и достоверности их различий по t-критерию Стьюдента.

Результаты собственных исследований.

Было показано, что вирулентные нигеллы размножались внутри перитонеальных макрофагов, образовывали микроколонии и вскоре вызывали лизис клеток. Гибель 50% макрофагов наступала, как правило, через 3 часа после заражения, 80-100% клеток - черев 24 часа.

В отличие от вирулентных, авирулентные шигеллы не размножались внутри клеток и не вызывали' цитотоксического действия, постепенно перевариваясь. Тагам образом, нами были получены данные.' подтверждающие даблюда1!шееся ранее • различное воздействие вирулентных и авирулентных шигелл на макрофаги ПО.А.Белая и др.,1968. Yee¿ Buffenmeier, 1970. В.М.Бондаренко. 1976].

Электронно-микроскопич'еское исследование в динамике при заражении культуры перитонеальных макрофагов мышей линии СВА бактериями вирулентных и авирулентных штаммов показало различия в ци-тотоксическом действии шигелл уже на самых ранних стадиях фагоци-•тоза (1-3 ч). Вирулентные штаммы вызывали выраженные структурные изменения в макрофагах, свидетельствующие об активации внутриклеточных процессов - усиленное образование транспортных везикул, изменение плотности цитоплазмы, скопление и слияние лизосом. В более поздние сроки отмечались разрывы мембран фаголизосом. вакуолизация цитоплазмы, деструкция цитоволя и размножение бактерий. Некоторыми авторами [Sansonettl, 1986] плотный материал, окружавший фагосому в клетках Hela после заражения их вирулентными ши-геллами, расценивался как сократительный белок. В последующих работах этой группы авторов [Rasselon, 1991] сократительному белку, образующему так называемые stress fiber, отводится большая роль в

распространении шигелл внутри клетки и продвижении их по направлению к ядру.

В макрофагах, .инфицированных авирулеитными гаигеллами. показатели цитотоксичности были значительно менее выражены и появлялись позже, бактерии подвергались разрушению.

В наших исследованиях впервые было установлено повышение чувствительности макрофагов к цитотоксическоыу действию вирулентных шигелл. выявляемое после повторного заражения культуры макрофагов вирулентным штаммом. При вакцинации животных авирулентнш штаммом шигелл. напротив, увеличивалась поглотительная способность макрофагов, усиления цитотоксического действия при заражении вирулентными шигеллами не происходило. Повышение чувствительности "иммунных" макрофагов к вирулентным шигеллам носило специфический характер и не распространялось на сальмонеллы.

Вместе с тем в сравнительных опытах при иммунизации мышей сальмонеллами высокой вирулентности перитонеальные макрофаги животных приобретали не только более выраженную поглотительную способность. .но также большую устойчивость к внутриклеточному размножению и цитотоцсическому действию сальмонелл.

Эти данные свидетельствуют о различной функциональной активности "иммунных" макрофагов в отношении одного и того же возбудителя (шигелл) в зависимости от вирулентности штамма и разной роли макрофагов в резистентности организма к кишечным инфекщим, вызванным разными возбудителями (шигеллы. сальмонеллы) ■ и имеющим разный патогенез заболевания.

Основную роль в катаболизме микроорганизмов макрофагами, как известно, играет лизосомальный аппарат, функциональная актйв'ность которого определяется состоянием мембран и активностью содержащихся в нем ферментов. Изучена активность одного из основных маркеров лизосомальных протеолитических ферментов - катепсина 0 -при моделировании инфекционного и вакцинального процессов. Использованная нами методика определения катепсина Р раздельно в лизосомальной и цитоплаэматической фракциях (ЛОТ. ЦПФ)■позволила получить представление о состоянии мембран лизосом и функциональной активности ферментов под воздействием шигелл.

В результате проведенных исследований впервые была1 установлена различная выраженность и динамика активности лиаосоыального фермента катепсина Р в ЛОФ и Щ© в зависимости от вирулентности

штаммов шиРелл' (РИЬ.- 1).

РИС. 1; АКТИВНОСТЬ КАТЕПСИНХ' !)■ в^МЬийОН&ЛЬМ И Ш0ПЛАЗМАТИЧЕСК0Й ФРАКЦИЯХ СТШЕНОЦИТОВ1 ШЙЙ ПОСЛЕ' ВВЕДЕНИЯ ВИРУЛЕНТНОЙ' (А) и АВИРУЛЕНТНОЯ СБ) КУЛЬТУР Ш№ЕДЛ МЕКСНЕРА

- цитоплаэматическая Фракция, --- лййосоиальная фракция,

I - первичное введение бактерий. 11 - вторичное введение , вирулентных бактерий:

Установлено, что вирулентные шигеллы вызывают уже через 1 3 часа после заражения выброс фермента в НПФ и истощение лизосом, повышение активности фермента в ЛОТ через 3 суток и на протяжении всего срока наблюдения (до 2 месяцев). В эти же сроки сохранялась высокая активность Фермента в ЦПФ, что свидетельствует о выраженном воздействии вирулентных шигелл прежде всего на увеличение проницаемости мембран лизосом. Лабилйзация мембран лизосом носила готологический характер, поскольку лизосомалышй фермент обнаруживался в ЦПФ в значительных количествах и продолжительное время. Последнее, возможно, было связано не только с длительной функциональной активностью лизосом и периодическим "выбросом" фермента в цитоплазму, но также нарушениями катаболизма катепсина Б в цитоплазме.

При введении Сачтерий авирулентных штаммов шигелл кривые активности катепсина 0 з ЛСФ и ЦПФ в целом повторяли таковые, характерные для вирулентных !сультур. и имели также фазный характер, однако были менее выражены. Вместе с тем, увеличение активности

.фермента в ЛСФ наступало раньше (через 1 сутки вместо 3 суток), было более выраженным в эти сроки и продолжалось лишь в течение 2 недель.

Авирулентные штаммы шигелл. таким образом, не вызывали резких пертурбаций в .функциональной активности лизосомалыюго аппарата. Лабилизация мембран носила характер физиологического ответа на внешнее, раздражение: быстрый, но достаточно большой выброс фермента из лизосом. не сопровождавшийся патологической лабшшза-циеч мембран лизосом и характеризующийся поэтому не столь высокой и не продолжительной активностью фермента в цитоооле.

Повторное эаражение животных вирулентными пшгеллами вызывало быструю патологическую реакцию повышения активности катепсина Б в ЦПФ и угнетение ферментативной активности лизосом.

В отличие от этого, после предварительного введения (иммунизации) зшвотным вакцинного штамма и затем заражения вирулентными пшгеллами наблюдалось быстрое повышение активности фермента в ди-эосомах - с последующим кратковременным повышением активности фермента в цитоплазме.

Наши данные.о воздействии вирулентных шигелл на мембраны ди-восом и фаголизосом клетки были подтверждены другими авторами [гапБОпеШ еЬ а1., 1986).

Полученные нами данные были использованы для разработки способа дифференциации вирулентных и авирулентных шигелл. защищенного авторским свидетельством N1075163 в 1982 г.

Изучено воздействие шигелл на функциональное состояние наружной плазматической мембраны фагоцитов.: тестированное по определению активности 5-нуклеотидазы (3.1.3.5). При интрагастральном введении мышам шигелл Флекснера, различной вирулентности было установлено, что вакцинный штамм З.Пехпег1 516М оказывает1 преимущественно активирующее, вирулентный штамм, наоборот, тормозящее действие на функциональную активность наружной мембраны макрофагов.

Таким образом, было показано, что БАВ вирулентных'шигелл оказывают сильное деструктивное воздействие не только на мембраны лизосом • и фаголизосом. но также на цитоплазматическую мембрану.. снижая тем самым функциональную активность макрофагов.

Изучение воздействия индивидуальных 0-- и К-антигенов З.Пехпег! и Б.еоппе! различной вирулентности на ферментативную

активность фагоцитирующих клеток селезенки мышей, тестированную по активности лизосомального энзима катепсина В, показало, что О-антигены З.Пехпег1 и Э.эоппе! в испытанных дозах (0,01-1.0 мкг/мыиь) независимо от вирулентности штаммов вызывали повышение активности фермента в лизосомах. не оказывая дестабилизирующего воздействия на мембраны лизосом, и уменьшали активность фермента в ППФ. очевидно, активируя катаболические процессы в цитоплазме. К-антиген Б-Боппе! вызывал повышение активности фермента в лизосомах и не изменял активности фермента в цитоплазме, что' свидетельствует о тем, что он не вызывает лабилизации мембран лизосом даже в относите тьно больших дозах. Биологически активные вещества супернатантов вирулентных культур обладают дестабилизирующим воздействием на мембраны лизосом и способствуют выходу лизосомальных ферментов в цитозоль (Рис. 2).

РИС. г. АКТИВНХТЬ КАТЕПСИНА О в КЛЕТКАХ СЕЛЕЗЕНКИ МЫШЕЙ при ВНУТРИВЕННОМ ВВЕДЕНИИ АНТИГЕНОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ШИГЕЛЛ

[ [ - цитоплазматическая фракция, |—| - гаэосомальчая фракция.'

Таким образом, установлено, что способность вирулентных ши-гелл нарушать проницаемость мембран лизссом, коррелирующая с ци-тотоксической активностью живых вирулентных бактерий, не связана с 0-и К-антигенами. Она обусловлена действием БАВ. обнаруженных нами в супернатанте живых вирулентных шигелл. Эти БАВ лабильны к

физико-химическим воздействиям и утрачивают свсдо при

изготовлении чистых препаратов 0- и К-антигенов.

К-антигер шигелл Зонне был подвергнут специальному дазууеде в -соответствии с требованиями, предъявляемыми ,к .б.иолог.доеским да-муномо^уляторам. Препарат-иммуностимулятор .фагоцитоза "К65",' полученный из вакцинного штамма S.sonnei 6S, оказался безвредным, обладающим высокими протзктивными свойствами, в.особенности против бактерий гомологичного вида. Индекс эффективности (ИЭ), "K6S" при заражении мышей вирулентными штаммами S.sonnei составлял 25-30, при заражении S.tvpni - 10-18, при заражении вирулентным штаммом шигелл Флекснера -2. Он обладал неспецифической профилактической активностью, защищая 70-81% животных при совместном введении с .брюшнотифозной вакциной и последующем заражении 6,6 LD50 S.typhi. ED50 Е^кци™ у.гВ.едаиралась в 5-10 раз. Препарат "K6S" был защищен авторским свидетельством N1363566 "Способ получения нового иммуностимулятора .ф^г'одау.оза" в 1985 г.

Шкга-токсин имеет, несомненно. ..Ордащое значение в инфекционном процессе. Вместе с тем, несмотр? ДО большой интерес к нему в последние годы, его роль в вирулеитдосуи дсу.аеуся не flciioíi.

Был получен.и охарактеризован чистый предает да,ига-токсина. Молекулярная масса голотоксина составляла 61 jkD, А-субъещщш -32 kD, В-субгединивд - около 9 kD. LD50 очищенного шига-токсина составляла 33.8 по белку, выход препарата из кулотуральной среди - 26Z. Эти данные близки характеристикам препарата ши-га-токсина, полученным другими авторами.

Иммунизацией кроликов токсоидом, полученным путем обработки шига-токсина глютаральдегидом, с использованием полного адьюванта Фрейнда приготовлена специфическая антитоксическая сыворотка. На основе этой сыворотки нами впервые была разработана иммунологическая тест-система для выявления шига-токсина в реакции коаггдю-тинации на планшете, чувствительность которой составляла 25-50 нг/мл токсина по белку. Она не уступала разработанным другими авторами более сложным вариантам радиоиммунологического и иммуно-ферментроро анализа (радиоиммуноблот и знзимоиммуноблот), предназначенным для скрининга штаммов E.coli, продуцирующих;LT и ST знтеротоксины.

Параллельно была приготовлена также тест-система для.выявления 0-антигена S. dysenterlae 1 в реакции коагглютинащи.

- йЗ -

В результате определения .андаена шита-токсина ;в культуралъ-ных фильтратах различных антеробакт.ерий было установлено, что антиген тага-токсина обнаруживается не только у, исследованных 34 штаммов S.dysenterlae 1. .находящихся в S и R форме, но также у 5 дт&умрв S.-flexnerl la, Jb я 2а, б штаммов S.anatun, S.london, S.ityphimurium. S. enter!tidis, 8 штаммов Y. pseudotuberculosis I и ¡I|I;I .сероваров, E.coll .055 и E.coll 0114. Антиген шига-токсина обнаруживался у этих культур независимо от наличия специфических О-анякгекрв, S- ,и R-форм и вирулентности штаммов.

■Вмесце с тем

установлено, что ~~ "

антиген .щига-токсина не обнаруживался у

S.dysenterlae 2, ■S-форм S.sonnel, S.newcastle, S.iboydU, ■Campylobacter и S.typhi. Он, однако, выявлялся после утраты этими бактериями в процессе спонтанной мутации поверхностных К- или Ви-антигенов (Рис.3).

Впервые была установлена, таким образом, закономерная обратная корреляция между синтезом бактериями антигена шига-токсина и кислых К^-аятигенов.'

Бактерия «орыа Антигенная колонка структура Антиген вига-токсина Виоумнт-ность

5.typhi, E.coll. Campylobacter S .VI - + , -

S.dysenterlae 2-10. S.nencastle. S.taydll, E.coll S - f, -

S.sonnel s R ITOt—B +, -

sshmtlf* s (веа йк-w) к.ВЛ.Л.Е я ip.cepq^pki МУТ&ИТУ iR 4r. "

S.dysenterlae 1, S.flexnerl, S ^pseudotuberculosis, -E.coll, V.cholerae иутшти " R 0-faT (ГК- 0 + ♦ , -

S.typhi

-о?

«О

Цгтагам

антиген I S.sonnel шга-токенна | IS t .1 S»R

♦ I R

♦ I '

'■JSJ

антиген юл-а-токсина

PlB. 3. ИМГ А-ТОКСИН - АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ КИСЛОЮ К-АНТИГЕНУ «АКТОР ПАТ0ГЕН1ЮОТ ГРМЮТЯИЦАТЕЛЬШЧ БАКТЕРИЯ

Ка основании подученных нами результатов и анализа данных литературы было сделано заключение, что шита и шита-подобные токсины, очевидно, являются альтернативными по отношению к кислым К-и Ви-антигенам факторами патогенности этих бактерий. Потенциальная способность к синтезу шита- и шигаподобного токсинов, очевидно, заложена в геноме многих,-если не всех энтеробактерий, а возможно и других грам-отрицательных бактерий.

Роль шига-токсина в патогенезе и иммунитете, несмотря на казалось бы свою очевидность, все-таки до настоящего времени остается не ясной.

Известно, что он обладает цито-, йейро- и энтеротоксич-ностью. Основой для всех этих биологических свойств токсина, по-видимому, является ингибиция синтеза белка на стадии элонгации на уровне 60S рибосом клетки CJ.Brlg et al., 19873.

Методом электронной микроскопии нами было исследовано воздействие шига-токсина на культуру макрофагов. В аналогичных условиях был испытан ЛПО S.flexnerl 2а 516. Было установлено, что наряду с морфофункциональными изменениями, свидетельствующими об ингибиции синтеза белка в макрофагах, под дейстьием шита-токсина происходит лизис митохондрий.

В ходе наших исследований впервые была показана способность других, нежели S.dysenterlae 1. штаммов энтеробактерий вызывать продукцию антител против шига-токсина.: Иммунизация кроликов живыми бактериями S.flexnerl 2а 516 и S.flexnerl 516М приводила к образованию антител к антигену шига-токсина. Эти сыворотки можно использовать для приготовления иммунологической тест-системы (РКА) для выявления антигена шига-токсина в культурах бактерий. Была получена, таким образом., дополнительная информация о свойствах вакцинного штамма S.flexnerl 2а 516М. в ответ на введение которого в организме образуются антитела не только к специфическому О-антигену, но также к антигену шига-токсина.

Эти антитела не обладали превентивными свойствами к биологически активному шига-токсину. Тем не менее антиген шига-токсина сенсибилизировал иммунокомпетентные к-"тки. Можно предположить, что таким же свойством облагают любые другие штаммы энтеробактерий. не имеющие кислых К-антигенов.

Известно, что одной Из наиболее ранних иммунных реакций на внедрение в организм инфекционных агентов является изменение миг-

рационной активности клеток МХС. Реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) посвящена большая литература. Большинство исследователей с РТМЛ связываю? наличие клеточного иммунитета. Что же касается альтернативной реакции - ускорения миграции лейкоцитов, то исследований по выявлению закономерностей этой реакции при инфекционном и вакцинальном процессах и интоксикациях практически не проводилось. Отсутствуют специальные исследования по определению значения вирулентности и отдельных факторов патогенкости возбудителей в этой реакции.

Для определения роли факторов патогекности возбудителей в изменении миграционной активности клеток мы использовали скринин-говый тест клеточной миграции (СТКМ) лейкоцитов крови In vitro [А.П.Суслов. 19793, являющийся интегративным тестом клеточной кооперации -в микрокультуре с использованием в качестве разрешающих антигенов in vitro индивидуальных С-. К-антигенов шигелл, сальмонелл и шига- токсина. г

Выло установлено, что у здоровых интактных мышей СБА миграционная активность лейкоцитов (МАЛ) крови In vitro в присутствии ЛПС шигелл Зонне, К-сальмонеллезного антигена и шига-тсксина у большинства из них (66-68%) оставалась без существенных изменений; у части животных (27,8%) наблюдалась РТМЛ; ускорение МАЛ отмечалось лишь в 4,5% случаев.

После иммунизации мыгаей корпускулярной сальмонеллезной вакциной D серогруппы при введений относительно больших доз происходило усиление МАЛ в отношении гомологичного 0-сальмонеллезного антигена, в части случаев усиление МАЛ к шига-токсину.

После заражения интактных мышей высоко вирулентной культурой S.dublln и возникновения инфекционного процесса, тестированного по гибели животных в группе, наблюдалась резкая стимуляция МАЛ в присутствии 0-, К-сальмонеллезного "антигенов, а также шига-токсина. Была отмечена корреляция показателей ускорения МАЛ с тяжестью инфегашонного процесса: чем вцше была смертность животных, тем более высокие показатели ускорения МАЛ отмечались в этой группе (Рис. 4).

При заражении мышей, вакцинированных оптимальными дозами корпускулярной сальмонеллеэной вакцины, наблюдалось угнетение МАЛ к 0-специфическому и К-антиг^ну сальмонелл. Если принимать во внимание распространенное мнение, что РТШ является показателем

. . -1В'-клеточного иммунитета, то ( эти данные можно расцени- ' гив«/» и«»«™ w вать как приобретение иммунитета к 0- и К-антигенам в результате иммунизации.

Наши экспериментальные данные, показавшие . корреляцию усиления МАЛ крови с тяжестью инфекционного процесса, находятся в соответствии с не- . давно полученными результатами использования СТКМ' при дизентерии и сальмо-неллезах на людях [О.Ф.Белая, 1994, А.Б.Жу-мабекова» 1992, В.Л.Черкасов и др.. 1994].

Нами впервые было установлено, что наиболее чувствительным разрешающим тест-антигеном в этой реакции является шига-токсин. Шига-токсин выявлял при тяжелом инфекционном процессе неспецифическую сверхчувствительность лейкоцитов крови проявляющуюся в ранней и выраженной стимуляции МАЛ в присутствии этого токсина In vitro.

Исследована МАЛ крови мыйей при воспроизведении интоксикации с помощью ЛПС S.flexneri 2а. Установлено (Табл. 1), что большие дозы ЛПС (4.0 и 2,0 мг) вызывали достоверную стимуляцию МАЛ (ИМ=50%) в присутствии этого же антигена in vitro. По мере уменьшения дозы ЛПС. вводимой мышам. МАЛ In vitro приобретала характер торможения.''

При использовании в этом опыте в качестве разрешающего антигена шига-токсина отмечалась четкая закономерная прямая дозовая зависимость направленности v выраженности МАЛ от уровня эндоток-семуи, вызванной введением мышам ЛПС шигелл Флекснера: выраженное усиление МАЛ на дозы.от 4.,О до 0,1 мг, постепенный переход в торможение на дозы 0.01 мг, выраженное торможение МАЛ при введении

о о

О'

о о о о .0 о о о 20 33 33 33 33 40 50 50 50 60. 67 80 83 100 100

-100-60 -60-40 -20 0 20 40 60 80.100 120 140' МАЛ X

РИС. 4. МИГРАЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ'КРОВЙ" ИНТАКТНЫХ и ИНИЩИРОВАННЫХ S.dublln ЫШЕЙ в пгасутстш In V1UO ШИГА-ТОКСИНА '

- торможение МАЛ.

стимуляция МАЛ.

Таблица 1. Миграционная активность лейкоцитов крови (МАЛ) мышей после введения ЛПС S.flexneri, шига-токсина и К-сальмонелле&ного антигена при разрешении In vitro в СТКМ гомологичным и гетерологичным антигенами

Сенсибилизация животных МАЛ (ИМ %) при разрешении in vitro:

Антиген Доза (¿Вы) (мкг/мышь) ЛПС шигелл Флекснера шига-. токсином К-сальмонелл. антигеном

4000,0 ЛПС 2000,0 шигелл 1000,0 Флекснера 100,0 10,0 1.0 контроль (0) +30 . +70 +10, -10 -28 -30 -30 +5. -17 +55 +70 +28 +40, -15 +18. -18 + 8. -30 +10. -15

10 1,6 Шига- 5 0,75 ТОКСИН 2 0,15 о,г 0.015 ¿01 0,0015 ¿,001 0.00015 ' контроль (0) +20, -25 +18. -25 +10, -30 -40 -30 +10, -18 + f, -10 +55 +50 +30. -30 +15 -35 +20. -38 +20 -40 +10. -10

К-антиген 100,0 из штамма 10,0 Э.typhimuгium 1,0 30 кр. 0,1 контроль (0) +25 +Й8. -18 +15. -25 -50 +10. -10 +20. -20 +10, -20 +15. -30 + 5, -30 +10

"+" - максимальные значения ускорения, - торможения МАЛ

на различные концентрации антигенов In vitro; ИМ > ± 20» - достоверное изменение МАЛ. .

мышам ЛПС в дозе 0,001 мг. Таким образом, показано, что ускорение МАЛ в присутствии специфического антигена коррелирует со степенью интоксикации, вызванной ЛПС зндотоксемией._ Шига-токсин в качестве разрешающего антигена являлся более чувствительным тест-антигеном для определения интоксикации, вызванной эндотоксином шигелл Флекснера.' Реакция эта носила неспецифический характер, так как ЛПС шигелл Флекснера и шига-токсин не имеют общих, антигенов.

'При воспроизведении шига-токсического шока путем введения шига-токсина. в дозах от 10 до 0,002 Юбо и тестирования в СТКМ в присутствии шига-токсина получены также дозозависимые изменения МАЛ: от значительного ускорения при введении животным 10-2 ЬПбо

до торможения МАЛ (0,2 LD50) и отсутствия изменений МАЛ на дозу 0,002 LD50. На гетерологичный антиген - ЛПС шигелл Флекснера In vitro - лейкоциты всех групп животных в этом опыте отвечали только торможением МАЛ, как это'наблюдалось в контроле.

Таким образом, в дополнение к установленной нами выше корреляции усиления МАЛ с тяжестью Инфекционного процесса, установлена прямая дозовая зависимость ускорения МАЛ при введении.эндотоксина шигелл Флекснера и шига-токсина.

Отсутствие стимуляции МАЛ при введении ¡разных, в том числе больших доз нетоксичного К-сальмонеллезного антигена, подтверждает общий вывод о том. что стимуляция МАЛ наблюдается только при патологических нарушениях в организме.

Ускорение МАЛ отмечается уже через 3 ч после введения патогенных бактерий или токсинов и продолжается в течение 7-10 суток. Направленность и выраженность МАЛ, таким образом, зависит от вида

Таблица 2. Вирулентность шигелл и функциональная активность: клеток фагоцитирующей системы .■..-.

Показатели Живые бактерии ' Факторы вирулентности

вир. авир. 0-аг К-аг Зонне К-аг сальм БАВ шига-токсин

1.Летальность ' для мышей 2.Цитотоксическое действие 3.Лабилизация мембран лизосом фаголизосом 4. Наружная цитоплаз-матическая мембрана 5.Лизис митохондрий 6.Ингибиция синтеза белка 7.Усиление миграции лейкоцитов крови + + + + + + + + + + 5.Д031 I - + + + + ' +.. + + , + + м.дозы

Функциональная активность макрофагов в целом 1 ♦ ft "ШШГ Hf&u t 4 1 }

Использованные методы: 2 - культура ткани перитонеальных макрофагов; 3 - активность лизосомального фермента катепсина Б в ЛСФ и ЦПФ, электр.микр.; 4 - определение 5-нуклеотидазы ("+" - повышение, "-" - снижение активности); Б, 6 - электр.микр.; 7 - СТКМ.

иммуномодулирущего агента, дозы введения и времени ее определения.

Сводные данные проведенных нами экспериментальных исследований по воздействия шигелл различной вирулентности и .отдельных факторов патогенности на функциональную активность макрофагов представлены в табл. 2.

Выполненная нами работа представляет фрагмент нового научного направления - исследование механизмов и закономерностей воздействия ' возбудителей инфекционных заболеваний и факторов их патогенности на иммунный гомеостаэ, в частности на клетки МФС.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что вирулентные шигеллы и их токсины вызывают глубокие и продолжительные деструктивные морфофункциональ ные изменения в организме животных, приводящие к нарушению функциональной активности и гибели клеток МТС. При заражении вирулентными штаммами шигелл фагоциты приобретают повышенную чувствительность к цитотоксическому действию этих бактерий. Авирулентные бактерии обусловливают преходящие изменения преимущественно стимулирующего характера. "Иммунные" макрофаги приобретают способность к ускоренному повышению функциональной активности.

2. В основе механизма цитотоксического действия вирулентных -шигелл и. их токсинов.лежит лабилизация и деструкция мембран лизо-сом, фаголи8йсом, митохондрий, цитоплазматической мембраны и угнетение функциональной активности макрофагов, тестированной по изменению активности лизосомальн'огО фермента катепсина Б и экто-фермента недужной цитоплазматической мембраны - 5-нуклеотидаэы.

3. Впервые получен нетоксичный поверхностный К-антиген З.БОпое1 6Б. обладающий способностью активировать функции клеток М1С, усиливая ферментативную активность-ЛИ80С0М и не оказывая деструктивных изменений мембран внутриклеточных органелл. Разработанный на его основе препарат "ИбБ" может быть' использован в качестве иммунологически безопасного, ареактогенного и эффективного стимулятора фагоцитов.

4. Установлено, что антиген шига-токсина широко распространен среди различных' видов кишечных бактерий и является альтернативным фактором патогенности по отношению к кислым поверхностным К-антигенам этих бактерий. На основе гомогенного препарата ¡ли-

га-токсина и антисыворотки к нему разработана высоко чувствительная тест-система для реакции коаггдютинации, позволяющая выявлять антиген шига-токсина в концентрации 25-50 нг/мл.

5. При электронно-микроскопическом изучении воздействия пш-га-токсина на макрофаги показана связь деструктивного действия токсина с повреждением мембран, нарушением белкового синтеза и лизисом митохондрий.

6. По данным скринингового теста клеточной миграции (СТКМ) лейкоцитов крови ив смешанных микрокультур in vitro при воспроизведении экспериментальной инфекции, вакцинации и интоксикации впервые изучены и установлены закономерности фазовых изменений направленности и выраженности миграционной активности клеток в динамике в зависимости от вида и дов факторов патогенности - 0-, К-антигенов и шига-токсина. использованных в качестве сенсибилизирующих или разрешавших агентов.

Установлена прямая доеовая зависимость усиления миграционной активности лейкоцитов крови от тяжести инфекционного процесса и интоксикации.

7. Усиление миграционной активности лейкоцитов в присутствие шига-токсина in vitro является высокочувствительным показателем антигеннеспецифической сенсибилизации лейкоцитов, коррелирующей с выраженными нарушениями в гомеостаэе, в том числе иммунном» при тяжелых патофизиологических нарушениях в организме. Этот тест в перспективе может быть использован для оценки тяжести и лрогноза инфекционного процесса и интоксикаций, оценки реактогенности, иммунологической безопасности и эффективности вакцин.

Установлено, что К-сальмонеллезный протективный антиген даже в больших дозах не обладает способностью усиливать миграционную активность лейкоцитов, в оптимальных протективных дозах вызывает РТМЛ, что является дополнительным доказательством его безопасности и иммунологической эффективности.

8. Получены дополнительные данные к характеристике вакцинного штамма S.flexneri 2а 516М. который, в отличие от вирулентной культуры, не обладая дестабилизирующими свойствами в отношении клеточных мембран, повышает, активность лизосомальных ферментов и создает устойчивость макрофагов к цитотоксическому действию возбудителя, увеличивая тем самым их функциональную активность; а также обусловливает антителообразование к антигену шига-токсина.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белая Ю.А.. Попова (Кудрявцева) Л.Ю.. Быстрова С.М.. Николаева Т.Н. Повышение чувствительности иммунных'макрофагов к ци-тотоксическому действию вирулентных шигелл // Ж.микробиол.-1982.- N?.- С. 69-73.

2. Белая Ю.А., Хасман Э.Л.. Попова (Кудрявцева) Л.Ю. Активность катепсина Д.в спленоцитах и вирулентность шигелл в эксперименте //Ж.микробиол.- 1984.- N.11,- С.72-76.

3. Кудрявцева Л.Ю.. Хасман Э.Л.. Быстрова С.М. Функциональная активность макрофагов при вакцинации живой дизентерийной вакциной в эксперименте // Сб.н.тр. "Живая дизентерийная вакцина". -М.. 1985,- С. 48-53.

4. Кирилличева Г.Б.. Кудрявцева Л.Ю., БёлаяЮ.А.. Туманян М.А. Функциональная активность макрофагов при заражении вирулентным и авирулентным штаммами дизентерийного микроба // Ж.микробиол. - 1987.- N 5.- С. 76-79.

5. Кириллова Ф.М.. Кудрявцева Л.Ю., Попов В.Л.. Белая Ю.А. Электронно-микроскопическое изучение взаимодействия вирулентного и авирулентного штаммов Shigella flexnerl с макрофагами перитоне-ального экссудата мышей // Ж.микробиол.- 1988.- N 10.- С. 8-11.

6. БёлаяЮ.А., Белая О.Ф., Кудрявцева Л.Ю., Петру хин В. Г. Выявление антигена шига-токсина в связи с другими факторами вирулентности - 0- и К-антигенами энтеробактерий // Ж.микробиол.-1993.- N 4.- С. 13-20.

7. Белая Ю.А., Хасман Э.Л..' Попова (Кудрявцева) Л.Ю.. Быстрова С.М. Способ дифференциации вирулентных и авирулентных шигелл // АВТ. СВИД. N 1075163 от 03.05.1982.

8. Белая Ю.А.. Кудрявцева Л.Ю.. Петрухин В.Г.. Сергеева Н.С. Способ получения препарата, стимулирующего фагоцитоз // Авт. свид. N1363566 от 29.12.1985.

9. Степанова Л.К.. Попова (Кудрявцева)- Л. Ю^. Агеева В. А.. Быстрова С.М.. Николаева Т.Н. Взаимодействие возбудителей кишечных инфекций с иммунными макрофагами in vitro в зависимости от вирулентности и антигенной фуктуры бактерий // Теэ. докл. конф. "Иммунологические аспекты, инфекционной патологии".- Таллин, 1981.- С. 124-126.

10. Белая Ю.А.. Николаева Т.Н.. Попова (Кудрявцева) Л.Ю.. На-

заров Ш.Н.. Бабажанов Б.Б.. Кибальчич Л.Н. Иммунологическая реактивность. вирулентность шигелл и иммунорегулирующая терапия при дизентерии // Тез. докл. VI Всесоюзной конференции по клинической биохимии, морфологии и иммунологии инфекционых болезней.- Рига. 1983.- С. 18-19.

11. Попова (Кудрявцева) Л.Ю.. Белая Ю.А.. Хасман Э.Л.. Быст-рова С.М. Различная энвиматическая реактивность спленоцитов при заражении вирулентными и авирулентными штаммами шигелл // Фагоцитоз и иммунитет. Тез. докл. Всесоюзного симпозиума, посвященногс 100-летию создания Мечниковым фагоцитарной теории иммунитета.-М., 1983.- С. 181.

12. Белая Ю.А.. Кудрявцева Л.Ю.. Хасман Э.Л. Различная способность вирулентных и авирулентных штаммов шигелл изменять активность лизосомального энзима катепсина Д в клетках селезенки зараженных животных // Сб.н.тр. "Молекулярная и клеточная регуляция инфекционного иммунитета".- М.. 1985.- С. 71-76.

13. Bejlaa Ю.А.. Назаров Ш.Н.. Кудрявцева Л.Ю.. Бабаджано! Б.Б.. Николаева Т.Н. Иммунотерапия дизентерии Флекснера и Зонне с помощью живой пероральной вакцины // Тез. докл. II Всесоюзного съезда инфекционистов,- 1985.- С. 95-97.

14. Кирилличева Г.Б.. Кудрявцева Л.Ю.. Белая Ю.А.. Туманян М.А. Изменение активности 5-нуклеотидазы макрофагов мышей npi1 введении шигелл различной вирулентности // Сб.н.тр. "Теоретические проблемы эпидемиологии и инфекционной иммунологии гч современном этапе".- Нальчик. 1986.- С. 116.

15. Белая Ю.А.. Николаева Т.Н.. Кудрявцева Л.Ю. Воздействие вирулентных и авирулентных бактерий на различные звенья иммунно{ системы // Тез. докл. II Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы теоретической и прикладной иммунологии: механизмы противоин-фекционного иммунитета".- Саратов, 1987.- С.29.

16. Белая Ю.А., Николаева Т.Н.. Степанова Л.К., Кудрявцев; Л.Ю., Агеева В.А., Снегирева А.Е.. Шапошникова Г.М.. Петрухш В.Г. Исследование иммунологической безвредности и эффективное™ вакцин против дизентерии и брюшного тифа // Тез. докл. Республиканского -съезда эпидемиологов, инфекционистов, микробиологов.-Таллин. 1987,- С. 19-20.

17. Кудрявцева Л.Ю.. Петрухин В.Г.. Белая Ю. А.. Попов,В. Л, Воздействие живой дизентерийной вакцины на функциональную актив-

иость макрофагов // Тез. докл. научной конференции "Актуальные проблемы прикладкой иммунологии, биотехнологии и производства бактериальных препаратов".- Пермь. 1988.- С. 149^150.

18. Кирилличева Г.Б., Кудрявцева Л.Ю.. Соловьева М.С. Влияние вакцинного штамма шигелл на ферменты цитоплазматической мембраны макрофагов // Тез. докл. научной конференции "Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактериальных препаратов".- Пермь, 1988.- С. 10-11.

19. Белая Ю.А.. Николаева Т.Н.. Кудрявцева Л.Ю. Иммунологическая оценка безвредности и эффективности вакцин против кишечных инфекций // Сб.н.тр. "Иммуно-биологические препараты нового поколения и методы их контроля".- М.. 1989,- С. 136-140.

20. Белая Ю.А., Николаева Т.Н.. Кудрявцева Л.Ю. Значение вирулентности шигелл в индукции клеточных и гуморальных реакций организма // Тез. докл. XVIII съезда Всесоюзного научного общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова.-Алма-Ата. 1989.- Т. 2.- С. 40.

21. Николаева Т.Н.. Кудрявцева Л.Ю. Экспериментальные подходы к разработке иммунологических критериев оценки безвредности и эффективности дизентерийных и брюшнотифозных вакцин // Тез. докл. VI Всесоюзного съезда Всесоюзного научного общества микробиологов. эпидемиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова.- М.. 1991.Т. 2.- С. 193.

22. Белая Ю.А.. Кудрявцева Л.Ю.. Петрухин В.Г.. Белая 0.$. АнтИгены шига токсина у вирулентных и авирулентных штаммов шигелл и сальмонелл // Теэ. докл. VI Всероссийского съезда Всесоюзного научного общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова.- М., 1991.- Т. 1.- С. 60.

23. Кудрявцева Л.Ю., Белая О.Ф. Ускорение миграции лейкоцитов в смешанной культуре как показатель тяжести инфекционного процесса и интоксикации // Тез. докл. Республиканской научно-практической конференции "Новые методы диагностики и лечения".- г.Казань. 1995.- С. 341-343.