Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль факторов патогенности шигелл и сальмонелл в развитии клеточного иммунного ответа при экспериментальном инфекционном и вакцинальном процессах

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль факторов патогенности шигелл и сальмонелл в развитии клеточного иммунного ответа при экспериментальном инфекционном и вакцинальном процессах"

Им правах рукописи

НИКОЛАЕВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

РОЛЬ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ ШИГЕЛЛ II САЛЬМОНЕЛЛ В 1*Л 5ШГПШ КЛЕТОЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ 'ЖС.'ПКРИ МЕНТАЛЬНОМ ИНФЕКЦИОННОМ II ВАКЦИНАЛЬНОМ ПРОЦЕССАХ.

0.1.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой С1СПСПИ док юра медицинских наук

Мпскпя - 1998 год

»

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Ю.А.Белая

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В.ГЛнходед

доктор медицинских наук, профессор Л.В.Погорельская

доктор медицинских наук, профессор В.В.Сергеев

Ведущая организации: Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ им. Г.Н.Габрнчсвского

Защита диссертации состоится час

на заседании Диссертационного совета Д00 1.07.01 в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН по адресу: 123098, Москва, ул.Гамалсн, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке 1111ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Автореферат разослан "2. "Л1(Нр№0{ 1998 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук

Е.И.Коп голова

ОЫЦЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЛПОТЫ

Актуальность проблемы. Острие кишечные инфекции, п том числе дизентерия и сальмонсллезы. продолжают оставаться важной медицинской и социальпо-жономичсской проблемой. обусловливая высокий уровень заболеваемости и постинфскщюнных осложнений (1?.И.Покровский, 1995, Г.Г.Опищенко , 1997, М L.Bennisli, 1941. Bull.WHO, 1991,). В последние годы наметилась тенденция к росту заболеваний острыми кишечными инфекциями, прежде всего дизентерией. Показатели заболеваемости в Российской Федерации на 100 ше.населения возросли с 127,7 в 1993 году до 184,7 в 1995 году ( Е.П.Беляев с соавг., 1997). На тгом фоне отмечается рост летальности в 1990-1995 гг. в 5 раз, по сравнению с периодом 1965-1984 г.г. (JI.[¿.Бродов с соавт., 1997). Множественная лекарственная )стойчнвость возбудителей и отсутствие высокоэффективных вакцин зафудняют проведение медикаментозного лечения, иммунотерапии и иммунопрофилактики лих инфекций.

В настоящее время достигнуты значительные успехи в изучении тонких механизмов напнеиеза, местных и системных клеточных иммунных реакций при развитии шигеллезной и сальмонеллсзной инфекций (П.П.Покровским с соавт.,1981, J1.B.11о]орел ьская.1986. S B Formal el all. 1983. G.K.Klunpel ct all., 1986, V.L Tesh.ct all., 1994).

Установлено, что основополагающие лтапы развития инфекции - иеиетрапия ннпелиальпых к.чеюк, внутриклеточное размножение. межклеточное распространение н цимнокснчсскни >ффекг. обеспечиваются наличием генетически дек'рмипнровапных факторов иагогснности возбудителей иолисахаридной и белковой природы (О- и К антигены, белки наружной мембраны, биологически активные пешее ша натнпных фильтратов, цитотоксины, Шнга-токсин) (Ю.Л.Белая. 1970. В.Г. Петровская. В.М.Бонларснко, 1994, T.IIale, 1991, M.Yoshikawa, C.Sasaka\va,199l. Г'..Г. Sansonctti, 1992).

Отмечено подавление функций нммунокомнетентных клеток, являющейся одной из причин развития вторичных иммуполефипитов, затяжных и хронических форм заболеваний (П1.11азаров.198(). II.Д. Ютцук. с соавт.,1992, S.H. Zwillicch et all..1989. M.M.Matlian. V.I.Matlian.l 991. O.B. Islam ct all.. 1995).

Однако вопросы, касающиейся роли вирулентности возбудителей кишечных инфекций и их отдельных факторов патогенности в формировании клеточных иммунных реакций различных уровней иммуной системы остаются не изученными.

Исследования такого направления необходимы не только для более полного понимания патогенеза инфекции данной этиологии, но и особенностей формирования протективного иммунитета и создания высокоэффективных вакцинных и иммуномодулирующих препаратов. Получение таких данных может явиться основой оценки и обоснования критериев иммунологической безопасности и эффективности вакцинных препаратов для иммунотерапии и иммунопрофилактики кишечных инфекций.

Исходя из вышеизложенного целью настоящей работы являлось: определить роль вирулентности и индивидуальных факторов патогенности наиболее распространенных энтеробактерий- шигелл и сальмонелл, в развитии клеточных иммунных реакций различных уровней лимфогемопоэтической системы, и на основе этих данных выявить возможности оценки вакцинных препаратов по степени их иммунологической безопасности и специфической активности.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить воздействие живых микробных клеток генетически родственных пар вирулентных и атгенуированных штаммов бактерий £.(1узеп/егше1, а.]]схпег'1 2а, $.50ппе1 на развитие клеточного иммунного ответа на различных уровнях иммунной системы- от стволовых кроветворных клеток до зрелых иммунокомпетентных Т- и В- лимфоцитов, при экспериментальном инфекционном и вакцинальном процессах.

2. Определить длительность и характер иммуноморфологических изменений в лимфоидных тканях кишечника (пейеровы бляшки, солитарные фолликулы), лимфоидных органах (тимус, селезенка) экспериментальных животных при введении генетически связанных штаммов шигелл.

3. Изучить значение вирулентности бактерий ЗМуьеШегше 1, 5./1ехпегг 2а, З.хотш в развитии реакции гииерчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и возможность индукции Т- супрессорных клеток при моделировании инфекционного и вакцинального процессов.

4. Определить роль кругшомолекулярной плазмиды инвазивности ЗЛузеШегше 1, 5./1ехпеп 2а и детерминируемых ею белков наружной мембраны в иммуномодулирующей активности возбудителя.

5. Определить значение отдельных индивидуальных полисахаридных и белковых антигенов (О- и К-тнпов) шигелл и сальмонелл, как факторов патогенное™ этих бактерий. в формировании клеточного иммунного ответа.

6. Изучить роль юксимообразования S.dysenteriae I в развитии клеточных иммунных реакции па модели экспериментальной инфекции и введении препарата Шнга-гокспна.

7. Исследовать влияние некоторых существующих и вновь разрабатываемых вакцин против дизентерии и брюшного тифа на клетки различных уровней лимфогемопо лпческой системы и па основе нолучениых данных оценить возможность определения их иммунологической безопасности и эффективности на доклиническом уровне.

8. Определить основные иммунологические критерии подбора вакцинных штаммов и оценки вакцинных препаратов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Впервые на модели возбудителей шигеллезной инфекции доказано значение пиру.тешносш в иммуномодулируюшем действии бактерий на клетки различных уровнен лимфогемопоэтической системы, включая стволовые кроветворные клетки, иммунокомпстснтные Г- и В- лимфоциты.

Вирулентные бактерии шигелл (S.dysenteriae I, S.flexneri 2а, S.sonnei), в отличие от бактерий аттенуированных генетически родственных мутантов, вызывают интенсификацию пролиферативно-дифференцировочных и

миграционных процессов на уровне стволовых кроветворных клеток и эрнтроидных предшественников, а также оказывают колейкомогенный эффект.

Выявлена зависимость гемопоэзстимулирующеи активности от вида и антигенного состава шигелл.

Показано, что бактерий вирулентых штаммов (S.dysenteriae 1, S.flexneri, S.sonnei) способствуют формированию интенсивной и длительно протекающей клеточно-опосредованной реакции ГЗТ.

Впервые установлена прямая зависимость интенсивности и продолжительности миграционной активности сплеиоцитов in vitro от вирулентности шигелл различных видов (S.dysenteriae 1, S.flexneri 2а, S.sonnet).

Показана возможность индукции Т-супрессорных клеток при моделировании шигеллезной инфекции.

Вьивлен ингибирующий, зависимый от вирулентности и антигенного состава эффект шигелл на функциональную активность В-лимфоцитов, синтезирующих антитела к специфическим и неспецифическому антигенам.

- Показано, что на фоне отсутствия длительной персистенции бактерий вирулентных шигелл в лимфоидных органах наблюдаются различной степени сосудистые нарушения, развитие дистрофических и деструктивных именений в тимусе, селезенке и слизистой тонкого кишечника. Аттенуированные бактерии вакцинного штамма &/7ехпеп 2а 516М активируют местные клеточные защитные реакции слизистой кишечника.

- Впервые выявлена многофункциональность свойств факторов патогенности шигелл и брюшнотифозных бактерий в иммуногенезе и дискретная иммуномодулирующая активность их на клеточные иммунные реакции.

Шига-токсин, биологически активные вещества нативных фильтратов вирулентных бактерий стимулируют дифференцировку стволовых кроветворных клеток в направлении эритропоэза, пролиферативно-миграционные

процессы в гемопоэтической системе и усиливают реакции ГЗ'Г;

Поверхностные полисахаридный и белково-полисахаридный К-антигены шигелл и сальмонелл оказывают кратковременный гемопоэзстнмулирующий эффект, сенсибилизируют Т-эффекторы ГЗТ и вызывают существенную активацию В-клеточного звена имимунитета;

Впервые показано повое функциональное значение белков наружной мембраны (БНМ), детерминируемых крупномолекулярной плазмидой инвазивности. Они активируют ранние этапы иммуногенеза на уровне СКК, антителообразующие клетки, синтезирующие антитела к гетерологичному антнгену(ЭБ), и Т- клеточно-опосредовалный иммунный ответ.

- Представлены научно обоснованные данные о возможности создания вакцинных штаммов и препаратов с заданными иммуногенными свойствами.

Впервые на моделях вакцинального процесса проведен сранительный анализ влияния некоторых разрабатываемых и коммерческих вакцин разного типа против кишечных инфекций на клетки различных уровней лимфогемопоэтической системы..

Показана гематологическая безопасность и эффективность живых дизентерийных вакцин Флекснера 2а 516М, Зонне 68 и новой химической

брюшнотифозной вакцины, содержащей в своем составе наряду с Ви- и О-, также поверхностный белково-гтолнсахаридный К-антиген.

Выявлено, что сорбированная химическая брюшнотифозная вакцина вызывает нарушения иммунологического гомеостаза, проявляющиеся в выраженной гсмопоэзстимулирующей активности, усилении клеточной миграции и оказывает слабый иммуностимулирующий эффект на иммунокомпетентные В-лимфоциты.

Установлена корреляция полученных нами экспериментальных данных с результатами определения ареактогенности и протективной эффективности этих вакцин при иммунизации людей.

На основании полученных данных предложены основные критерии иммунологической безопасности и эффективности вакцинных препаратов, которые, целесообразно использовать на стадии доклинических испытаний.

Использованный нами принцип сравнительного исследования иммунологической активности генетически родственных вирулентных и атгенуированных бактерий и их факторов патогенности модат быть использован при изучении иммунологических механизмов патогенеза и иммуногенеза инфекций различной этиологии. Этот принцип важен также при конструировании и оценке новых вакцинных препаратов, для выявления иммунологически значимых протекгивных антигенов и освобождения от иммуносупрессирующих, аллергизирующих и токсических компонентов.

Настоящие исследования вносят определенный вклад в решение одной из важнейших научных проблем медицинской микробиологии - определение взаимодействия факторов патогенности возбудителей инфекционных заболеваний и клеточного иммунитета.

Таким образом, в результате проведенных исследований получены приоритетные данные, создающие принципиально новые возможности для решения фундаментальных и прикладных проблем медицинской микробиологии.

Публикации. Основные материалы диссертации отражены в 25 статьях и 16 тезисах. Оформлено изобретение "Способ определения инфицирования кроветворных клеток" ЛС N1482400, методические рекомендации "Оценка вирулентности бактерий в реакциях гиперчувствителыюсти замедленного типа".

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на : конференции "Иммунологические аспекты инфекционной патологии" Таллин 1981,

1 Всесоюзной конференции "Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология" Москва 1982, Всесоюзном симпозиуме "Фагоцитоз и иммунитет" Москва 1983, 11 Всесоюзном съезде инфекционистов Ташкент 1985, 11 Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы теоретической и прикладной иммунологии. Механизмы противоинфекционного иммунитета" Саратов 1987, 1 Всесоюзном съезде иммунологов Москва 1989, VI Всесоюзном „ съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов Н.Новгород 1991, Международной конференции "Медицинская биотехнология, иммунология. Спид" Санкт-Петербург 1991, на совместном заседании Проблемных комиссий "Медицинская микробиология" и "Теоретическая и прикладная . инфекционная иммунология" НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН, 18 июня 1996 года.

Апробация диссертации проведена на совместной конференции отделов Медицинской микробиологии, Иммунологии НИИ ЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН 9 июля 1997 года.

Объем п структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), методической части, результатов собственных исследований (5 глав), обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 400 источников. Работа изложена на 250 страницах машинописного текста и ' иллюстрирована 54 рисунками и 18 таблицами.

Методы исследования.

В работе использованы следующие штаммы: вирулентный штамм S.Jlexueri 2а 516 pSFuo* и генетически связанные с ним бесплазмидный мутант S.Jlexueri 2а 516/4 (получен Ю.М.Романовой), аттеиуированный штамм S.flexneri 2а 516М (Ю.А.Белая, 1968). Вирулентный штамм S.sonnei 478, аттенуированный мутант S.sonnei 6S (Ю.А. Белая,1968). Вирулентный штамм S.dysenteriae 1 SC500 (inv*tox*) и его генетически связанные мутанты: нетоксигенный дериват S.dysenteriae SC 501 (inv* tox"), сохранивший способность вызывать положительную кератоконъюнктивальную пробу, содержит крупномолекулярную плазмнду инвазивности Мол.м. 140 MD и низкомолекулярную плазмиду Мол.м. 6 MD, важную для выражения полноценной структуры ЛПС, имеющий ■ транспозонопосредованную мутацию в tox-гене хромосомы. Неинвазивный токсигепный вариант S.dysenteriae 1 SC502 (inv tox* ), лишенный крупномолекулярной плазмиды инвазивности, но синтезирующий Шига-ч оксни и

S.ilysenterine SC 503 (iuvfox ')- авирулеитиый пстоксигенпьш мутант, не имеющий в смоем гаюме вышеперечисленных генетических детерминант (A.Fonlen el al!.. 1988). Все штаммы имели сероло! ичсски идентичный О-аптиген.

Специфические индииндуальные антигены и биологически активные вещества (флкюры naiominocni) шшелл и сальмонелл: лпноиолпеахаридм (JII1C). выделенные но методу O.Wcstphnl. K.Jahn (1965), поверхностный термолабильный К-ашигси S.smmci 6S (В.Г.Петрухин. 1975), Ви-аптигсн брюшнотифозных бактерий (M.Wehstcr, M.I.andy. 1952), поверхностный термолабильныи белково-полпеахарпдный К-антигеп сальмонелл, получен m штамма S.typhimurium 30 красный (О'К) по методу В.Д.Геккер, I l.C.Cepreenoii (1973). Препараты получены В.Г.Петрухиньш.

Ьноломпескн активные вещества (БАВ) шшелл представляли собой бесклеточные (фильтраты суточных культур живых микробных клеток,

Келки наружной мембраны (НИМ) получены О.Д.Новиковой по методу [i. I.iigtenhcrg с соавг. (1975).

Вакцинные препараты: живые дизентерийные вакцины шнгелл Флекспера 2а 516М и 'îoniie 6S ( 111П1 Г)М им. П.Ф.Гамалеи 1'ЛМН, Ю.А.Белая), химическая рибосомальпая вакцина Ssuimci (RVS-S) ( М1ПМ им.Г.П.Габричевского, В.11.JIeiiciicon). коммерческая сорбированная на гидроокиси аллюмипия брюшнотифозная вакцина (г. Ташкент) серия 328-6. спиртовая корпускулярная вакцина (III1I1 ')М. 11.1 lomород) серия 124. новая химическая брюшнотифозная вакцина, обобщенная комплексом Ви- и К-антигенов (НИИ ЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМ11, В.Д.Геккср. JI.К.Степанова. Ю.А.Белая. П.С.Сергеева), серии 1 и 20.

Эксперименты выполнены па мышах СВА, Balb/c, (СВЛХС57 Bl(, )F|, морских свинках, с использованием микробиологических, нммуноморфологнческих, иммунологических методов исследования.

В экспериментах по моделированию инфекционного и вакцинального процессов животным вводили живые микробные клетки, специфические индивидуальные антигены изученных штаммов шигелл, сальмонелл иптрагастральпо, внутрибрюпшнио, внутривенно, подкожно. Исследования проводили в динамике на 1. 3, 4. 7, 14, 21, 28 сутки и спустя 2 месяца от начала эксперимента.

Персистенцию шигелл в лимфоидных органах (тимус, селезенка), кишечнике и крови животных изучали посредством количественных бактериологических высевов суспензий органов на дифференциально-диагностические среды (Эндо, Плоскирева) с последующей общепринятой идентификацией шигелл.

Для гистологического анализа селезенку, тимус, фрагменты тонкого кишечника с пейеровой бляшкой или без нее фиксировали в смеси Карнуа. Срезы толщиной 5 мк, окрашивали гематоксилин-эозином и метиловым зеленым пиронином.

Воздействие инфекционных агентов на гемопоэз оценивали в тестах эндоколониеобразования, экзогенного клонирования СКК костного мозга, селезенки и периферической крови в сингенной системе (J.Till, E.McCulloch, 1961), пролиферации костномозговых клеток методом клеточного "самоубийства" при инкубации клеток костного мозга с- и без оксимочевины (1 мг/мл). Эритроиоэзстимулирующую активность определяли по образованию эндогенных КОЕс у плеторичных полицитемических мышей, эритропоэз у которых временно подавлен из-за блокады синтеза эндогенного эритропоэтина. Оценку лейкозогенных потенций бактерий вирулентных и аттенуированных шигелл и их специфических ЛИС проводили по выявлению вирусспецифических "фокусов" в селезенке чувствительных мышей при совместном инфицировании их вирусом лейкоза Раушера и изученных инфекционных агентов (А.В.Санин, 1980).

Функциональную активность иммунокомпетентных Т- лимфоцитов определяли в тестах кожной гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) in vivo и реакции торможения миграции макрофагов (РТММ) in vitro, основанных на способности сенсибилизированных Т- лимфоцитов индуцировать приток неспецифических макрофагальных клеточных элементов в место повторного введения специфического антигена и вырабатывать факторы, влияющие на миграционную активность макрофагов, после повторного контакта со специфическим антигеном ( А.П.Суслов, А.Д.Черноусов, 1979, T.T.MacDonald, P.B.Carter, 1981).

Исследование клеточной опосредованности кожной ГЗТ проводили при системном и местном адоптивном переносе примированных клеток селезенки в сингенной системе с учетом афферентной и эфферентной стадии развития реакции.

Функциональную активность В- нммунокомиетентных клеток оценивали медотом локального гемоииза в геле но Ы.КЛегпе, Л.А.ЫоЫт (1963), основанного на выявлении аптителообразующих клеток, синтезирующих антитела к гетерологичпому (эритроциты барана) и специфическому антигену (ЛПС) в селезенке инфицированных мышей.

Пролифератиппую активность иммуиокомпет ситных клеток селезенки определяли в реакции бласттрансформации в присутствии неспецифического Т-'митогена (КонА). В-митогена, специфического ЛПС и антигенных препаратов изученных штаммов шнгелл (УЗ лизат, БНМ), регистрируемой по включению меченного тритием тимидина в рснлицируюшучося ДНК (Л.В.Пронин, 1990).

Возможность индукции Т-суирессорных клеток при развитии экспериментального инфекционного и вакцинального процессов исследовали; у циклофосфап обработанных (200 мг/кг) и в последующем инфицированных мышей, по определению числа экзотшых КОЕс после трансплантации смешанной суспензии сиигсиных тимоцитов инфицированных мышей и костномозговых клеток интактных доноров сингеииым летал 1.но облученным реципиентам по методикам, описанным К.ТигкоИе (1985). Л.В.Санин с соавт.( 1986 ).

Статистическую обработку полученных данных проводили путем определения средних арифметических и средних геометрических значений с вычислением средних ошибок и доверительных интервалов. Достоверность различий между группами определяли с помощью критерия Стыодсита при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Псрснстснцни бактерии и иммуноморфологичеекие изменения в нммунокомпетентных органах при моделировании инфекционного н вакцинального процессов.

Развитие инфекционного процесса предполагает взаимодействие двух систем: инфекционного агента, обладающего факторами патогенности, и макроорганизма, его структурными и функциональными особенностями, в том числе клеточных факторов иммунологического гомеостаза. При этом патогенетические механизмы развития шигеллезной инфекции тесным образом связаны с местными и системными иммунными реакциями, включающими механизмы клеточного и гуморального иммунного ответа.

Результаты проведенных исследований показали, что развитие экспериментального инфекционного и вакцинального процессов, вызванных соответственно генетически родственными бактериями вирулентного и атгенуированного (вакцинного) штаммов 5./1ехпеп 2а 516 и 516М характеризуются различной динамикой перснстенции шигелл в нммунокомпетентных органах, периферической крови и сопровождается разнохарактерными иммуноморфологическими изменениями в них.

Вирулентные бактерии 5./1ехпеп 2а 516 более длительное время сохраняются в селезенке, тимусе и крови экспериментальных животных по сравнению с аттенуированным (вакцинным) штаммом 5./7ехпеп 2а 516М.

Морфологический анализ нммунокомпетентных органов (тимус, селезенка) и кишечника при моделировании инфекционного процесса выявил

пагоморфологические изменения: в ранние сроки экспериментальной инфекции (1- -3- сутки) наряду с сосудистой патологией отмечены определенные дистрофические и, в меньшей степени, деструктивные изменения в этих органах. В корковом веществе тимуса наблюдается появление масс иикнотичных лимфоцитов, в селезенке и пейеровых бляшках обеднение лимфоцитами В- и Г-зависимых зон. В тонком кишечнике наряду с застойным венозным полнокровием, отеком слизистой оболочки, отмечена интенсивная секреция слизи, увеличенное количество бокаловидных клеток в ворсинках и криптах, уплощение и десквамация клеток кишечного эпителия.

Наличие данных изменений в лимфоидных органах (тимус, селезенка) свидетельствуют о наличии системных нарушений. Появление масс пикнотических лимфоцитов в корковом веществе тимуса, падение массы органа на 1-е сутки могли быть результатом либо прямого токсического действия вирулентных шигелл и. их продуктов при внутрибрюшинном введении, либо стать следствием влияния неспецифических факторов, обусловленных стресс-реакцией на введение чужеродного повреждающего агента, а также усиленной миграции клеток в периферические лимфоидные органы и ткани.

Дальнейший этап инфекции характеризовался развитием компенсаторно -защитных реакций, о чем свидетельствовали гиперплазия пейеровых бляшек, повышенная пролиферативная активность в Т-зависнмых зонах, а также фолликулах, увеличение числа макрофагов, лимфоцитов и плазматических клеток в

собственном слое слизистой оболочки, указывающие на интенсивное формирование местных иммунных реакций.

Эффект воздействия аттенуированного (вакцинного) штамма 5./1ехпеп 2а 516М характеризовался развитием преимущественно пролиферативных процессов в тимусе, селезенке, активизацией защитных клеточных иммунных реакции в лимфоидной ткани кишечника на протяжении всего периода наблюдения

2. Влияние живых бактерий вирулентных и аттеиунрованных штаммов пшгелл на функциональную активность клеток различных уровней иммунной системы.

Формирование и развитие иммунного ответа сопровождается серией межклеточных кооперативных взаимодействий клеток лимфогемопоэтической системы, включающих стволовые кроветворные клетки (СКК), иммунокомпетентные Т- и В- лимфоциты, макрофаги.

Как известно, структурную основу иммунологического гомеостаза составляют плюрипотентные стволовые кроветворные клетки (ПСКК) костного мозга, благодаря пролиферации и дифференцировке которых в нормальном организме поддерживается необходимый уровень клеток, участвующих в иммунном ответе макроорганизма. Разработанный ,1.ТП1 и- Е.МсСиНосЬ (1961) метод определения селезеночных колоний (КОЕс), позволяет исследовать пролиферативную, миграционную активность СКК, интенсивность и направление их дифференцировки.

Нами проведен сравнительный анализ действия генетически родственных отличных по вирулентности шигелл различных видов Б./!ехпеп 2а516, З.йуьеМепае I па ранние этапы иммуногенеза. Выявлены четкие различия интенсивности эндоколониеобразующего эффекта у бактерий вирулентных и аттенуировапных штаммов (Рис. П.

ЭЛехпеп 2а

КОЕс

■ N516

■ №16М

□ N516/4

□ Контроль

5х107 1x1О7

1x10

1x10® 1x10 КОЕ/мл

Б.воппе/' КОЕс

З^уэеМегте 1 КОЕс

■ вС 500 ПвС 501

□ вС 502

□ БС 503

□ Контроль

5х10гКОЕ/мл

Рнс.1 Влияние живых бактерий шигелл на образование эндогенных КОЕс в селезенке сублеталыш облученных мышей СВА.

Бактерии вирулентных штаммов, обладающие всеми факторами патогсмиости для данного вида, оказывали выраженный стимулирующий эффект на образование эндогенных К01х в селезенке, но сравнению с апенуированными мутантами, лишенными хотя бы одного из этих факторов.

Наибольшая эпдоколоннеобразутощая активность из трех изученных видов ншгелл. с сохранением статистически значимых различий между вирулентными и агтенунрованными бактериями, выявлена при введении живых микробных клеток Ллошкч' 47Н и Ялопне! 65, различающихся но вирулентности, но имеющих одинаковую антигенную структуру, отличительной особенностью которой, является наличие кислого поверхностного полисахаридного К-аптигена.

О глубине и интенсивности влияния инфекционных агентов па гемопоэз свидетельствуют данные об изменении миграционно-пролиферативных процессов СКК костного мозга. Установлена зависимость уровня и динамики количественных изменений КОНс в костном мозге (КМ), периферической крови и селезенке животных от вида бактерий, их вирулентности и антигенного состава. Бактерии вирулентных штаммов вызывали более выраженное нарастание числа КОНс в ранние сроки, длительные изменения амплитуды количественных колебаний КОНс в КМ и усиление их миграции в периферическую кровь и селезенку (Рис.2).

Эффекты действия бактерий аттснуированных, в том числе вакцинных штаммов с остаточной вирулентностью носят более умеренный и менее длительный характер. Лттепуировашп.ш, неиивазивный мутант Б-Аехпеп 2а 516/4, не стимулируя количественное увеличение КОНс в КМ. способствовал их кратковременному "выбросу" в периферическую кровь.

Отмеченные изменения содержания СКК связаны либо с усиленным выбросом КОПс из КМ в циркуляцию и повышенным поступлением их в периферическую кровь и селезенку и/или являются результатом увеличения пула пролиферируюших костномозговых клеток.

*

костный мозг

КОЕс

БЛехпеп 2а

ПЕРИФЕРИЧЕСКАЯ КРОВЬ

КОЕс

Рис 2. Влияние живых бактерий шигелл на содержание КОЕс в костном мозге и периферической крови мышей СВА.

Результаты проведенных экспериментов показали, что вирулентные бактерии изученных видов шигелл вызывают интенсивную и длительную пролиферацию костномозговых клеток( увеличение СКК в 5-фазе клеточного цикла) и ослабленную, кратковременную или полное отсутствие таковой при введении атгепуированпых мутантов. Следует отмстить, что активность вирулентных бактерии £./7ехпеп 2а 516 и 5..тоиие/ 478 па иролиферагивный потенциал СКК мало отличилась между собой не зависимо от наличия К-антигсна (Рис.3).

Б./1ехпеп 2а

60 т 50 40 % 30 20 10 0

^■N516 СП N516171 СП N516/4 -Контроль

№1 п

7 сутки

Блоппе/

Рис. 3. Влияние живых бактерии шигелл на пролиферацию СКК костного мозга мышей СВА.

«

Известно, что повышенная пролиферация СКК представляет серьезную опасность для организма, поскольку может приводить к извращению нормальной дифференцировки СКК в ряды миэлоидных и лимфоидных клеток. Как показано ранее Д.Р.Кауленом, А.В.Саниным (1983, 1985), пролиферирующие предшественники, служат клетками мишенями для лейкозогенных вирусов .

В специально проведенном нами исследовании установлена стимуляция эритропоэза при введении вирулентного штамма S.Jlexneri 2а 516 у плеторичных полицитемических мышей. Введение же живых микробных клеток аттенуированного (вакцинного) штамма S.flexneri 2а 516М и его ЛПС не приводило к активации эритроидных предшественников.

Нами выявлено, что одновременное введение вируса лейкоза Раушера и вирулентных бактерий S.Jlexneri 2а 516 приводит к увеличению числа вирусспецифических "фокусов" на поверхности селезенки, что доказывает способность вирулентных шигелл активировать репродукцию вируса лейкоза Раушера за счет, по-видимому, стимуляции эритроидных клеток-мишеней. Бактерии аттенуированного (вакцинного) штамма S.Jlexneri 2а 516М такой активностью не обладали.

Таким образом, вирулентные бактерии шигелл вызывают выраженные и глубокие изменения в системе кроветворения экспериментальных животных, характеризующиеся интенсификацией . пролиферативно-дифференцировочных процессов на уровне СКК и эритроидных предшественников и усилением миграции клеток костного мозга на периферию. Эффект воздействия на эти процессы аттенуированных, лишенных отдельных факторов патогенности мутантов проявляется по многим показателям в меньшей степени и в более ранние сроки после введения. Выявлена зависимость гемопоэзстимулирующей активности от вида и антигенного состава шигелл.

Сама по себе способность шигелл стимулировать процессы гемопоэза не уникальна. Данные литературы показывают, что бактериальные антигены различного типа (растворимые, корпускулярные) обусловливают усиление пролиферативной активности стволовых клеток КМ и селезенки и повышение миграции их из КМ в периферическую кровь. Данные эффекты показаны для многих видов патогенных бактерий и их токсических продуктов (Д.Р.Каулен, А.В.Санин, 1982, S.S.Boggs et all, 1980, T.Yokochi et all.,1985).

Нам» imcpm.tc показана различная способность генетически родственных вирулентных и аттснуироватитых бактерии шигелл стимулировать гемопоэт, т.е. оказывать влияние на ранние этапы иммуногенеза, п частности на стволопые кроветворные клоки при моделировании инфекционного или вакцинального процессов у мышеи.

Как известно, развитие инфекционного процесса сопряжено с вовлечением в иммунный ответ иммунокомпстентных Г- . В- лимфоцитов и макрофагов, выполняющих различную функциональную нагрузку и обеспечивающих прежде всего иммунологические механизмы антибактериальном защиты на первом этапе иммунного ответа, предшествующего появлению специфических антител.

Успехи достигнутые фундаментальной иммунологией, в том числе в области клеточного иммунитета, позволяют ставить задачу о более глубоком изучении механизмов инфекционного и вакцинального иммунитета и разработке на основе полученных данных кршериек. характеризующих влияние вакцинных и других нммуномодулмрующнх препаратов на различные уровни и звенья иммунной сис темы.

11ачальпая фаза иммунного ответа обусловлена воздействием инфекционного ai сита н ею токсических продуктов па макрофаги, которые блокируют возбудителя, осуществляют его деструкцию и элиминацию. ")ти же клетки осуществляют ттроцессипг и презентацию антитепа и являются инициаторами развития и реализации специфического иммунного ответа, запуская, таким образом, реакцию иммушжомнетептных Т- н В-лимфоцитов (П.В.Мсдушшын . 1995. A.David, 1985 и др.).

В настоящее время установлена зависимость эффективности и функциональной активности клеток мононуклеарно -фагоцитирующей системы (МФС) от вирулентности энтеробактерий, обладающих мощными аитифагонитариыми факторами, способствующими внутриклеточному выживанию шигелл, сальмонелл и оказывающих цитотоксическое действие па клетки МФС (Ю.А.Белая, 1970. Л.Ю.Кудрявцева, 1996).

Среди клеточных иммунных реакций при развитии ншгеллезноп инфекции особое место принадлежит гипсрчувствителыгости замедленного (ГЗГ) типа, формированию которой способствует наличие местной (очаговой) реакции, в сочетании с длительной псрснстешшсй шигелл в эпителиальных клетках

кишечника (В.И.Покровский, В.И.Литвинов, 1990). Реакции ГЗТ позволяют оценить степень напряженности клеточно-опосредованных иммунных реакций макроорганизма, отражают функциональное состояние Т- клеточного звена иммунитета и являются проявлением защитных функций организма, направленных на поддержание иммунологического гомеостаза, способствуя элиминации возбудителя, усилению эффекторных функций макрофагов и киллерных клеток (Н.В.Медуницын, 1983, F.F.Nash, 1984, J.R.Baldridge et all., 1990).

1

ИР(%)

2--

0 -I-1-1-1-1-1

1 7 2 1 сутки

11

ИР(%)

о Ч-1-1-1-1-1-1

2 7 21 69 сутки

Рис. 4. Кожная реакция ГЗТ при однократной (1) и трехкратной (11) подкожной сенсибилизации мышей СВА Б./1ехпеп 2а.

Однако вопросы о корреляции ГЗТ с вирулентностью возбудителя и роли отдельных факторов патогенности, значение ее в вакцинальном иммунитете до настоящего времени оставались не изученными.

Нами установлено, что введение мышам вирулентных бактерий S.flexneri 2а 516 вызывает развитие интенсивной и длительно протекающей кожной реакции ГЗТ при однократной и, в особенности, трехкратной сенсибилизации животных, имеющей два пика своего развития .

Введение аттенуированного (вакцинного) штамма S.flexneri 2а 516М сопровождается менее выраженной и более кратковременной реакцией (Рис.4).

При нероральном инфицировании морских свинок S.flexneri 2а и тестировании ГЗТ в PTMJI in vitro бактерии вирулентного штамма вызывают значительную и длительную активацию иммуноцитов в присутствии специфических антигенов, выражающуюся в периодическом торможении и усилении миграции клеток. При введении аттенуированного штамма S. flexneri 2а 516М и бесплазмидного мутанта S.flexneri 2и516/4 реакция менее длительна и интенсивна (Рис.5).

N516

N516M

ИМ(%)

ИМ(%)

60 50 40 30 20 10 0 -10 -20 -30 -40

□ 50 мкг В Контроль

п

1

j и lj lJ 1

Зч. 1 3 7 14 21 28 сут. Зч. 1 3 7 14 21 28су г.

Рис.5. Миграционная активность спленоцитов морских свинок, зараженных S.flexneri2а, в присутствии ЛПС.

Аналогичная закономерность выявлена при изучении миграционных процессов снлсноцитов мьписй, инфицированных бактериями вирулентных штаммов 5,..то//ие/ и й.Лухе/Мепае /.

Известно, что миграционная активность иммунных клеток может быть обусловлена как непосредственным действием антигенов и биологически акшвпых веществ возбудителя, в особенности в первые часы и сутки после заражения, так и продуктами активации лимфоцитов, в частности лимфокнпами. Наши данные о фазной смене стимуляции и подавления миграции клеток селезенки находятся в соответствии с данными литературы, свидетельствующими об определенной последовательности выработки лимфоцитами альтернативных факторов иммупорегуляции (МЛФ и МИФ), совместное действие которых определяет в значительной степени позитивную и негативную хемокипетнчсскую регуляцию макрофагов и связано с процессами дифференциации и созревания лимфокин-иродуцпрующих лимфоидных клеток (Л.П.Суслов. 1988). Эго, верояшо, имеет определенный биологический смысл. Усиление миграции макрофагов в ранние сроки после заражения способствует притоку новых порций макрофагов, следующая затем - ингибиция миграции приводит к задержке их в очаге воспаления и необходима для полном деструкции и элиминации возбудителя. При ном длительная, повышенная миграционная активность под влиянием МЛФ. препятствуя скоплению макрофагов в очаге инфекции, может быть причиной генерализации инфекции. Полагают, что развитие этого феномена отражает ослабление напряженности специфического клеточного иммунитета и усиление функциональной активности Т-супрсссориых клеток с фенотипом ЬуЧ Г2* (М.У.ОогсЬп й аП.,1988).

Таким образом, нами впервые установлена зависимость сенсибилизирующего действия бактерий и выявлена прямая зависимость между силой и продолжительностью миграционных процессов снлсноцитов от вирулентности шигелл различных видов.

Паши экспериментальные данные согласуются с проведенными в последние годы клиническими наблюдениями о характерном динамическом изменении миграционной активности лейкоцитов крови у больных дизентерией и сальмонсллсзами: резкой стимуляции миграции лейкоцитов в остром периоде заболевания (1-4 сутки), коррелирующими с тяжестью инфекционного процесса и

последующим торможением ее в период реконвалесценции (В.Л.Черкасов с соавт.,1992, О.Ф.Белая ,1994).

В системе местного и системного адоптивного переноса нами доказан клеточно- опосредованный характер реакции кожной ГЗТ.

Показано, что введение клеток селезенки мышей, примнрованных бактериями вирулентного штамма <Ч./1ехпег! 2а 516 (4- и 7-е сутки), одновременно с подкожной сенсибилизацией (афферентная фаза) снижает уровень кожной ГЗТ у реципиентов и, напротив, приводит к увеличению кожной ГЗТ при введении спленоцитов после подкожной сенсибилизации на 4- или 7-е сутки (эфферентная фаза).

Спленоциты же мышей, сенсибилизированных аттенуированным (вакцинным) штаммом 3./1ехпеп 2а 516 М, как и иитактных животных, не оказывали влияния на обе фазы становления и развития местной кожной реакции ГЗТ.

Было высказано предположение, что наблюдаемая иммуносупрессия, вызываемая клетками селезенки мышей зараженных бактериями вирулентного штамма, возможно, связана с индукцией специфических Т-супрессоров, влияющих на период становления реакции (афферентная фаза) и является одним из механизмов коррекции иммунных реакций макроорганизма при развитии экспериментального инфекционного процесса.

Так предварительное введение мышам циклофосфана (ЦФ) в дозе 200 мкг/кг, избирательно элиминирующего предшественники Т-супрессорных клеток, при последующем заражении вирулентными бактериями приводило к увеличению у них кожной ГЗТ. Установлена также возможность индукции Т-супрессоров тимического происхождения. Совместное введение клеток нормального костного мола и тимоцитов мышей, которым за 1-2 суток до взятия клеток вводили вирулентные бактерии или их специфический ЛПС, сопровождалось уменьшением числа экзогенных колоний в селезенке сингенных реципиентов. Тимоциты мышей, инфицированных аттенуированным (вакцинным) штаммом &/7едгпеп 2а 516М супрессорным действием не обладали.

Значению ГЗТ в противоинфекционном иммунитете посвящено большое количество работ. Установлена корреляция между антибактериальной резистентностью и уровнем ГЗТ при развитии инфекций обусловленных

внутриклсточно паразитирующими бактериями (Listeria, Yersinia, Salmonella и др.), а также значение антигенов микробной клетки, в частности пептндогликанов, структура которых во многом определяет выраженность местной ГЗТ.

Авторы полагают, что способность некоторых видов вакцин вызывать стойкий иммунитет находится в прямой зависимости от их аллергизирующего воздействия (П.В.Медуницын, 1983). Однако, по мнению других исследователей, ГЗТ, давая определенный положительный эффект, является фактором защиты до определенных пределов. При чрезмерном, гиперергическом развитии эта реакция может быть причиной осложнений и неблагоприятных исходов, в частности это установлено при кишечных инфекциях, в том числе при дизентерии (А.Ф.Блюгер и др.,1980, A.A.Nash, 1985).

IIa основании проведенных нами исследований можно сделать заключение, что интенсивная реакция ГЗТ, возникающая в ответ на заражение бактериями вирулентных шигелл и сопровождающаяся индукцией Т-супрессоров, не является благоприятной для создания напряженного клеточного постинфекционного иммунитета. Более адекватной для развития клеточного иммунитета является введение атгенуированных, полноценных по' антигенной структуре штаммов, вызывающих умеренную реакцию ГЗТ.

В наших исследованиях выявлен зависимый от вирулентности и антигенного состава иммуномодулирующий эффект шигелл на функциональную активность В-лимфоцитов, синтезирующих антитела к специфическим и гстерологичному (ЭБ) антигенам. Характер этого действия у разных видов шигелл (S.flexneri 2а, S.sonnei, S.dysenteriae 1) неоднозначен. Бактерии вирулентных штаммов S.flexneri 2а 516 pSFuo+ и S.dysenteriae 1( inv+ /ох*) оказывают иммуносупрессирующин эффект в ранние сроки (4-7 сутки). Ингибирующий эффект вирулентного штамма S.sonnei 478 выражен не столь заметно в отношении АОК, продуцирующих специфические к ЛПС антитела. Он вызывает даже стимуляцию функциональной активности неспецифических B-лимфоцитов в этот период (Рис.6).

%

4 7 10 17 21 су т.

£/7елспеп 2а

■¡N516 ВДМ516М СП N516/4 Контроль

3 4 5 7 11 14 19 сут.

о/

/о

Б.$оппе'1

Рис.6. Влиянне живых бактерий вирулентных н аттенунрованных штаммов шнгелл на образование АОК к ЭБ(1) и специфическим ЛПС(11).

Отражением функционального состояния цммунокомнетентпых клеток, как известно, служит реакция бласттрансформацпи. являющаяся результатом кооперативного взаимодействия Т-, В- лимфоцитов и Л-клсток. Результаты наших дальнейших исследований выявили зависимость пролиферативпого ответа сплспоцигоп мышей, инфицированных живыми микробными клетками шигелл, в присутствии нссиецифичсского Т-митогена (КонА). специфического В- (ЛИС) . НИМ и УЗ лизатов гомологичных бактерий, от вирулентности бактерий и определенных генетически детерминированных факторов патогснпостн. Характерной особенностью действия вирулентных бактерий являлось преимущественно иммунодспрессирующее воздействие на бласттрансформацию клеток селезенки в ранние сроки после инфицирования в присутствии специфических БНМ (S.Jlexneri 2а 516), УЗ лизата (S.dysenleriae 1)} Т-митогепа при сохранении способности спленоцитов к спонтанной пролиферации. Лттенуированныс мутанты, лишенные факторов патогенности (способность к инвазии, токенпобразованию), оказывали иммуностимулирующий эффект на нролнферативную активность спленоцитов в присутствии изученных мптогенов.

Таким образом, результаты проведенных нами исследований доказывают значение вирулентности шигелл в иммуномодулирующем действии на клегки иммунной системы различных уровней.

Полученные данные явились основанием для дальнейших исследований по определению роли индивидуальных факторов патогенности возбудителей кишечных инфекций в развитии клеточных иммунных реакций. Решение этих вопросов, с нашей точки зрения, необходимо для понимания иммунологических механизмов патогенеза кишечных инфекций, формирования протективного иммунитета и создания высокоэффективных вакцинных и иммуномодулирующих препаратов.

3. Иммупомодулирующее денстпие отдельных факторов патогенности шигелл и сальмонелл на клеточные иммунные реакции.

Изучено влияние специфических О-, К- и Ви- антигенов, белков наружной мембраны (БНМ), биологически активных веществ нативных фильтратов (БАВ) и Шига-токсина, как факторов патогенности шигелл и сальмонелл( на функциональную активность клеток различных звеньев иммунной системы при моделировании экспериментального инфекционного и вакцинального процессов.

'Глблнца 1.

Влияние факторов патогенноети шигелл и сальмонелл на клетки

лимфогемопоэтической системы.

Факторы екк Гемопоэз Лнмфопоэз

патогенностн Пролиферация Миграция Эритропоэз Т-клетки В-клетки

(ГЗТ,РТМЛ (AOK,

РБТЛ) РБТЛ)

Шига-токсин itf TT TTT TTT T

БАВ нативных TTT TT

фильтратов виру-

лентных бактерий

ЛИС (20 мкг) ft TT TTT TTT TT

К- S.sonnei t T T T TTT

В и- S. typhi tt T T TT

К-сальмоиелл = T T T

ЛПС (2-5 мкг) f TT TT TT TTT

Б1Ш

S.flexnerUa

516 pSF ыо, ttt TT TTT TTT T

516М t T T T TTT

516 pSFui). = T T T TT

Результаты проведеных экспериментов позволили сделать вывод о многофункциональности свойств факторов патогенноети шигелл и брюшнотифозных бактерий в иммуногенезе вызываемых ими инфекций и дискретной активности их на клеточные иммунные реакции (Табл.1).

Токсичные факторы паюгспиостн- Шига-токсин, термолабильные биологически активные вещества (БАВ) нативных фильтратов патогенных культур шигелл, ЛПС в больших дозах, оказывают стимулирующее действие на гемопоэз и активируют Т-клеточное звено иммунного ответа. Шига-токсин, даже в малых дозах (0,00001 ЬРзо), вызывает длительное усиление пролиферативного потенциала костномозговых клеток и миграции их в периферическую кровь и селезенку. Полученные данные свидетельствуют о глубоких и длительных изменениях гемоноэза экспериментальных животных. На генетически связанных парах штаммов 5.<1у$еМепае1, отличающихся по наличию у бактерий крупномолекулярной плазмиды инвазивности и транспозонопосредовашюи мутации в области хромосомы, контролирующей синтез Шига-токсина, показано

значение функции токсинообразования в индукции Т- и В-клсточНо-опосредоваиных иммунных реакций.

Согласно данным литературы патогенетические механизмы действия Шига-и шига-подобных токсинов связывают с их способностью специфично повреждать клетки эпителия кишечника, эндотелиальные клетки сосудов, экспрсссирующис ОЬЗ рецепторы (МЛасешюг е1 а11.,1986, ,1.Е.5атие11 е1 а11.,1990, J.H.Brown е! а11.,1991). Согласно этой концепции именно сосудистые нарушения в кишечнике и ЦНС, являются причиной развития гемолитико-урсмического синдрома, геморрагического коллита и неврологических симптомов (А.О.О Впсп, К.К.11о1те.х, 1987, У.Ь.ТехЬ, J.E.Samuell, 1991). Работы последних лет показывают возможность вовлечения иммунологических механизмов в патогенез дизентерии и последующих системных повреждений (УХ-ТевЬ, А.О.О.Впсп, 1991).

В наших исследованиях впервые получены данные о влиянии Шига-токсина на клетки лимфогемопоэтической системы различных уровней.

В литературе нет единого мнения о биологической природе и механизмах действия БАВ нативных фильтратов шигелл. Имеющиеся в настоящее время немногочисленные данные об их роли в патогенезе дизентерийной инфекции свидетельствуют о сенсибилизирующем, цитотоксическом эффекте данных продуктов бактериальной клетки и влиянии на функциональную активность клеток МФС. Фильтраты (суиернатанты) вирулентных . культур вызывают более выраженную, по сравнению с аналогичными препаратами аттенуированных штаммов ннгибицию функциональной активности макрофагов, обладают дестабилизирующим воздействием на мембраны лизосом и способствуют выходу лизосомального фермента в цитозоль (Э.Л.Тейбср, 1982, Л.Ю.Кудрявцева, 1996).

Действие БАВ нативных фильтратов вирулентных культур не связано с эффектами эндотоксина, т.к. фактор термолабилен, и с действием Шига-токсина. поскольку реализация его активности отмечена через 24-48 часов после введения, а симптомы! обусловленные воздействием Шига-токсина, наблюдаются па 2-7 день развития инфекционного процесса (З.АзЬкепаг! Ы а11.,1990).

Наши исследования установили активность токсических факторов БАВ нативных фильтратов вирулентных бактерий шигелл на уровне С.КК, эритроидных предшественников и эффекторных Т- и В- лимфоцитов.

Нетоксичные факторы патогенноети-полисахариднын поверхностный К -антиген £голлет, микрокапсулярный высокополимеризированный полисахаридный Ви- и белково-полисахаридный К-антиген сальмонелл, имея отличительные особенности нммуномодулирующей активности на клетки иммунной системы различных уровней, в целом могут быть объединены в группу факторов патогенности, оказывающих умеренный гемопоэзстимулирующий эффект на образование эндогенных КОЕс. Существенно не влияя па миграцию стволовых клеток, они лишь в ранние сроки увеличивают процент КОЕс в 8-фазе клеточного цикла. Вместе с тем поверхностные полисахаридные антигены участвуют в формировании специфического и неспецифического иммунного ответа. Они сенсибилизируют Т-эффекторы ГЗТ и вызывают существенную активацию В-клеточного звена иммунитета. Важно отметить, что даже десятикратное увеличение дозы К-аитигена не вызывает иммунодепрессии, как это отмечено при

введении ЛПС шигелл.

Впервые полученные нами характеристики иммуномодулирующих свойств поверхностных полисахаридного К-антигена 5.50иие/ и белково-полисахаридного К-антигена сальмонелл на клетки лимфогемоиоэтической системы, в дополнении к имеющимся данным, полученным Л.К.Степановой (1970, 1988, 1991), Л.Ю.Кудрявцевой (1996), об их влиянии на клетки МФС, позволяют рассматривать возможность использования этих препаратов для специфической и неспецнфической иммунокоррекции при иммунотерапии и иммунопрофилактике иммунодефицитных состояний, в том числе при шигеллезе и брюшном тифе.

Активность специфических ЛПС 5./7едгяег/ 2а, £ \onnei, ЯАурМ в изученных тестах, в значительной степени зависела от дозы, вида и, в меньшей степеш^от вирулентности бактерий.

Было отмечено интересное явление, специфический ЛПС вирулентного штамма Я./7ехпеп' 2а 516 в относительно больших дозах (20 мкг/мышьА вогличие от ЛПС аттенуированного мутанта 8./1ехпеп 2а 516М, активирует репродукцию вируса лейкоза Раушера, приводит к увеличению вирусспецифических "фокусов" па поверхности селезенки.

Получены данные об участии ЛПС в развитии клеточного иммунного ответа при развитии экспериментального инфекционного и вакцинального процессов. Показана сенсибилизация Т- эффекторов ГЗТ к специфическому ЛПС шигелл.

.... I

выражающаяся в фазной многократной смсне активации и торможения миграции сплсноцнтов в присутствии данного антигена in vitro, более длительная и интенсивная при инфицировании животных бактериями вирулентных штаммов S.Jlexneri 2а 516, S.sonnei 478, по сравнению с клетками селезенки животных, сенсибилизированных бактериями аттснуироваппых мутантов. Значение эндотоксина в индукции В-клсточно-опосредованных иммунных реакций связано с активацией В- лимфоцитов, синтезирующих специфические к Л ПС антитела.

Известно, что процесс инвазии эпителиальных клеток кишечника опосредуется наличием у шигелл специфических белков наружной мембраны (БНМ). так называемых мсмбрап-ассоциированных белков (MAP), синтез которых контролируется генами крупномолекулярной плазмиды ипвазивпости. Плазмид-коднрусмые 1ра протеины являются важнейшими бактериальными лигапдами, обусловливающими адгезию и инвазию эпителиоиитов возбудителем. Полагают, что белки, секретируемые на поверхности батсриальных клеток взаимодействуют с рецепторами плазмолеммы энтероцитов, что приводит к интернализации шигелл (T.L.IIale, 1991). Ipa белки участвуют и в презентации ЛПС О-антигсиа антитслопродуцирующим клеткам Lamina propria, образовании протсктивпых антител (S.B.Formal ct all.,1991).

Результаты проведенных нами экспериментов показали, что Б11М.

выделенные из генетически связанных штаммов, оказывают разнохарактерное по

интенсивности и продолжительности действие па развитие клеточных иммунных

реакции. Фракции БНМ вирулентного плазмидосодсржащего штамма, в отличие от

БНМ бесплазмидного мутанта (S.Jlexneri 2а 516/4), вызывают выраженный

гемопоэзстимулирующин эффект, проявляющийся в стимуляции

эндоколониеобразования, длительном нарастании КОЕс в КМ и периферической

крови, усилении пролиферации костномозговых клеток. Они в большей степени

усиливают функциональную активность Т-эффекторов ГЗТ, вызывают в ранние

сроки активацию В- лимфоцитов, синтезирующих антитела к гстсрологичному

антигену (ЭБ), сменяющееся ингибицией в более поздние сроки. В отличие от этого

фракции БНМ, выделенные из аттенуировапных мутантов в меньшей степени

стимулировали гемопоэз, не влияли на пролиферативный потенциал СКК и

вызывали кратковременное нарастание КОЕс в КМ и периферической крови. Они

оказывали умеренное иммуностимулирующее действие на Т-лимфоциты и. в

I

большей степени, стимулировали антителообразующне клетку синтезирующие антитела к гетерологичному антигену.

Таким образом, нами установлено, что "инвазивные плазмндпые антигены" участвуют в формирование клеточного иммунного ответа при развитии инфекционного и вакцинального процессов. Полученные данные о действии БНМ аттенуированных мутантов на клетки лимфогемопоэтической системы представляют определенный интерес при конструировании новых эффективных вакцинных штаммов.

Важно отметить, что возможно изолирование того или иного фактора патогенности из сложного комплекса в составе бактериальной клетки, что позволит в перспективе получать необходимые штаммы и вакцинные препараты с заданными иммуногенными свойствами.

4. Доклиническая оценка иммунологической безопасности и иммунологической эффективности вакцинных препаратов для специфической профилактики шигеллезов и брюшного тифа.

Проведенные нами исследования по изучению клеточных механизмов инфекционного и вакцинального иммунитета, а также роли отдельных факторов патогенности на различные звенья иммунной системы, явились теоретической предпосылкой при сравнительном исследовании некоторых существующих и вновь разрабатываемых вакцин прошв дизентерии и брюшного тифа. Полученные данные необходимы прн выборе критериев оценки иммунологической эффективности и, что не менее важно, иммунологической безопасности вакцинных препаратов, а также для оптимизации вакцинального процесса.

На моделях вакцинального процесса исследована и установлена с использованием вакцин разного типа- живых дизентерийных Флекснера 2а 516М, Зопне 6S, рибосомалыюй Зонне 6S, химических и корпускулярных брюшнотифозных вакцин, характеристика их влияния па различные звенья иммунной системы.

.... »

Таблица 2.

Сравнительным анализ иммуткинннчсскин Псюнасносгн и эффективности вакцин ллп профилактики кишечных инфекции.

КРИТЕРИИ ВАКЦИННЫЕ ПРЕПАРАТЫ

Дизентерийные Брюшнотифозные

Флскснера Зоппе RVS-S КВнО Сорбиро

2а 516М 6S ванная

Гсмонои Эндогенные КОНс + ++ + + ++

Миграция: КМ + ++ + + ++

кровь + ++ + + ++

селезенка + + ++

11ролифсрация + + + - +++

Эригроиоэз +

Колсйкомогснпос - - -

действие

Т-клстки Т-ГЗТ Кожная реакция +

PTMJI: иитпбпция + + + + -

усиление - - - - +++

Т-с\ирессоры -

Н-клстки ЛОК к ЛИС +++ + ++

ЛОК к ЭЬ + ++ ++ ++ +

4.1. Живая дизентерийная вакцина Флекспера 2а 5I6M, как было отмечено выше, не вызывая деструктивных натоморфологичсских изменений в лнмфоидпых органах (тимус, селоснка), способствовала развитию преимущественно пролиферазивпых процессов п слишстои кишечника, свидетельствующих об активации клеточных местных защитных иммунных реакций.

Живые дизентерийные вакцины S.flexneri 2а S16M и S.sonnei 6S обладали умеренной эпдоколописобразующей и эритроиоэзстимулиругощей активностью; не вызывали существенных колебаний содержания КОНс в КМ, периферической крови; не стимулировали ( S.flexneri 2а 516М) или только в ранние сроки (S.sonnei 6S), пролиферативную активность костномозговых клеток и не обладали колейкомогенным действием. Вакцины обеспечивали включение Т-клеточного звена иммунного ответа, вызывая развитие непродолжительной клеточио-опосрсдовапной кожной реакции ГЗТ in vivo и /и vilro (PTMJI), не индуцировали образования Т-суирсссорпых клеток при развитии экспериментального вакцинального процесса.

Вместе с тем они оказывали значительный иммуностимулирующий эффект на функциональную активность В-лимфоцитов (Табл.2).

4.2. Рибосомальная дизентерийная вакцина Зонне .

Анализ иммунологической активности химической рибосомалыюй шигеллезн'ой вакцины (К\'8-8), представляющей собой нековалентный комплекс рибосом и специфического полнсахаридного Ь-гаптена, основанный на воздействии данной вакцины на гемопоэз в изученных тестах, позволил сделать вывод об ее иммунологической безопасности. Однако показатели иммунологической эффективности рибосомалыюй вакцины выявили слабый иммуностимулирующий эффект на Т- и В- клеточно-опосредованные иммунные реакции .

4.3. Химическая брюшнотифозная КВиО вакцина.

Новая химическая брюшнотифозная вакцина содержит наряду с полисахаридами О- и Ви-аптигенов также поверхностный протективный белково-полисахаридный К-антиген, общий для рода сальмонелл.

Как показали проведенные эксперименты, химическая КВиО брюшнотифозная вакцина вызывает умеренную, кратковременную стимуляцию гемопоэза, проявляющуюся в увеличении эндогенных КОЕс и усилении миграционных процессов костномозговых клеток в КМ и периферической крови на 1-е сутки после введения и не влияет на пролиферативную активность СКК. Она оказывает значительное иммуностимулирующее действие на функциональную активность В- лимфоцитов, синтезирующих специфические и неспецифические антитела. Усиливает активность иммунокомпетентных Т- лимфоцитов, умеренно сенсибилизируя их к специфическим О-, Ви-, К- брюшнотифозным антигенам, составляющим компонентам вакцины. Обогащение этой вакциной коммерческой спиртовой корпускулярной вакцины (СКВ), приводит к усилению протективного эффекта последней.

4.4. Коммерческая химическая сорбированная брюшнотифозная вакцина.

В сравнении с КВиО вакциной коммерческая химическая сорбированная на гидроокиси аллюминия брюшнотифозная вакцина, обладает выраженным гемопоэзвозмущающим эффектом, приводит к значительной стимуляции эндогенных КОЕс и длительному, существенному увеличению СКК в КМ, периферической крови и селезенке, происходящими на фоне длительного

повышения пролиферативной активности кроветворных костномозговых клеток. Обращает на себя внимание тог факт, чго введение коммерческой сорбированной брюшнотифозной вакцины вызывает значительное и длительное усилении миграции клеток селезенки в присутствии специфических брюшнотифозных Ви- , О-антигенов, что в соответствии с современными представлениями свидетельствует о серьезных нарушениях гомсостаза и иммуносуиресии. Результаты оценки иммунологической эффективности дайной вакцины выявили се незначительную иммуностимулирующую активность на В- лимфоциты. Все вышеизложенное позволяет сделать вывод об иммунологической небезопасности и слабой иммунологической эффективности коммерческой сорбированной брюшнотифозной вакцины.

Экспериментальные данные исследования дизентерийных и брюшнотифозных вакцин коррелируют с известными результатами клинических и эпидемиологических испытании ареактогенности. безопасности и эффективности этих вакцин при иммунизации людей..

Полученные нами данные позволяют сформулировать критерии иммунологической безопасности и эффективности вакцинных препаратов, основанных на следующих показателях:

-гематологическая безопасность- по оценке изменений в кроветворной системе, характеризующих темпы пролиферации, миграции и дифференцировки СКК в направлении миэло и лимфопоэза;

- иммунологическая активность- по оценке функционального состояния Т-клеточного звена иммунитета, являющегося одним из иммунологических механизмов коррекции реакций макроорганизма;

- по оценке функциональной активности иммунокомпстентных В-лимфоцитов, представляющих клеточную основу развития геморального иммунного ответа и синтеза протективных антител.

Таким образом, проведенные целенаправленные, сравнительные исследования позволили впервые получить фактические данные о роли вирулентности возбудителей кишечных инфекций, их факторов патогенности в иммунитете на уровне клеток лимфогемопоэтической системы и сформулировать критерии оценки иммунологической безопасности и эффективности

иммунотерапевтических и иммунопрофнлактических препаратов, которые целесообразно использовать на стадии их доклинических испытаний.

ВЫВОДЫ

1. Доказано значение вирулентности возбудителей кишечных инфекций в развитии клеточного иммунного ответа при инфекционном процессе. Установлено, что бактерии вирулентных штаммов Я.Аехпеп 2а, Ялоппег , $.(1узеп1епае 1 вызывают бурные реакции в лимфогемопоэтической системе от стволовых кроветворных клеток до зрелых эффекторных и регуляторных иммунокомпетентных клеток. Они усиливают миграционные, пролиферативные и диффереицировочные процессы, стимулируют эритропоэз и оказывают коленкомогенный эффект, вызывают интенсивную и длительную клеточно-опосредованную реакцию ГЗТ, индуцируют супрессорную активность Т-клеток, ингибируя функцию В-клеточного звена иммунитета.

2. Бактерии атгенуированных, генетически родственных мутантов, не вызывая глубоких изменений гемоиоэза, стимулируют умеренную специфическую сенсибилизацию Т-эффекторов ГЗТ, функциональную активность клеток мононуклеарно-фагоцитирующей системы и В-лимфоциты, синтезирующие антитела к специфическим и гетерологичиочу антигенам.

3. Показано, что развитие экспериментального инфекционного процесса, вызванного введением бактерий вирулентных шигелл, сопровождается индукцией Т. супрессорных клеток, подавляющих афферентную фазу реакции ГЗТ и образование

экзогенных КОЕс при совместной трансплантации клеток костного мозга интактных мышей и тимоцнтов инфицированных животных .

4. Выявлены различной степени сосудистые, дистрофические и деструктивные изменения в тимусе, селезенке, слизистой тонкого кишечника и более длительная персистенция шигелл в этих органах, при заражении бактериями вирулентного штамма 3./1ехпег1 2а 516, в отличие от бактерий генетически родственного аттенуированного мутанта.

5. Впервые установлена многофункциональность свойств факторов патогенности шигелл и брюшнотифозных бактерий в иммуногенезе и дискретная иммуномодулирующая активность их на клеточные иммунные реакции. Токсические

»акторы патогенности- Шига-токснн, биологически активные вещества нативных фильтратов, ЛПС в больших дозах, вызывав) 1 выраженные пролиферативные и миграционные реакции в гемопоэтической системе, стимулируют эритропоэз и усиливают реакции

ГЗТ. Нетоксичные факторы паин сппости- поверхностный полнсахаридный К-антигсп шигелл, Ви- брюшнотифозный п бслково-гюлисахарилный поверхностный К-антигсн сальмонелл оказывают кратковременный темопоэзстимулируюший 'эффект, сенсибилизируют Т-эффекторы ГТГ и вызывают существенную активацию клеток В-лимфоидного ряда и мононуклеарпо-фагоцнтирующей системы.

6. Впервые выявлено повое функциональное значение крупномолекулярной плазмиды иивазивиости 140 МП шигелл и контролируемых сю белков наружной мембраны, которые активируют ранние этапы иммуногенеза (СКК). антителообразующие В-клетки и Т-клеточпо-опосредованный иммунный ответ.

7. Данные экснсримешальпых исследований свидетельствуют о реальной перспективе прогнозирования и возможности получения вакцинных штаммов и иммунобиологических препаратов с заданными иммуногенными свойствами.

Представляется целесообразным создание вакцинных и иных иммунобиологических препаратов из аттспуированпых штаммов, сохранивших полноценные специфические О- и К- антигены.

8. Полученные данные об нммуномодулирующен активности поверхностного полисахаридного К-антнгсна Л'.л«/ше/ позволяют рассматривать его в качестве иммунологически безопасного препарата, рекомендуемого для специфической и неспецифической коррекции пммунодефнцитных состояний, в том числе при шигеллезе, для иммунотерапии п иммунопрофилактики кишечных инфекций.

9. Впервые на уровне клеток лпмфогсмопоэтичсской системы показана гематологическая безопасность и иммунологическая эффективность новой химической брюшнотифозной вакцины, содержащей в своем составе наряду с Ви- и О-, также поверхностный белково-полисахарпдный К-антиген. Обогащение этим препаратом коммерческой спиртовой корпускулярной брюшнотифозной вакцины приводит к значительному усилению ее протсктивного эффекта.

10. Результаты сравшпсльной оценки иммунологической безопасности и эффективности химической сорбированной брюшнотифозной вакцины выявили нарушения иммунного гомеостаза, проявляющиеся в выраженной гсмопоэзстимулирующсй активности, усилении клеточной миграции в присутствии специфических брюшнотифозных Ви-. О-антигснов и оказывает слабый иммуностимулирующий эффект на нммунокомпстснтные В-лимфоциты.

11. Впервые получены данные о действии живых дизентерийных вакцин Флекснера 2а 516М и Зонне 6S на различные этапы формирования клеточного иммунного ответа, свидетельствующие об их гематологической безопасности и иммунологической эффективности. Живые вакцины вызывают умеренную стимуляцию гемопоэза, не обладают колейкомогенным эффектом, обеспечивают включение Т-клеточного звена иммунного ответа, не индуцируют образования Т-супрессорных клеток, существенно стимулируют функциональную активность В-лимфоцнтов. Они оказывают активизирующее действие на местные клеточные иммунные реакции лимфоидной ткани кишечника, не вызывая сосудистых и деструктивных изменений в лимфогемопоэтических органах.

12. На основании пол)ченных данных предложены критерии оценки иммунологической безопасности и эффективности вакцинных препаратов. Вакцинные штаммы и вакцины должны отвечать следующим требованиям: умеренно стимулировать миграцнонно-пролиферативную активность СКК, не оказывать выраженного эритропоэзсгимулирующего воздействия, не обусловливать колейкомогенного эффекта, вызывать клеточно-опосредованную реакцию ГЗТ in vivo и in vitro и образование клеток иммунологической памяти, не индуцировать Т-супрессорные клетки, активно стимулировать В-лимфоциты, продуцирующие специфические антитела и не усиливать миграционную активность макрофагов при развитии вакцинального процесса.

Данные критерии целесообразно использовать при доклиническом испытании вакцинных штаммов, вакцин и других иммуномодулирующих препаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 .Степанова Л.К., Николаева Т.Н., Попова Л.Ю., Агеева В.А., Быстрова С.М. Взаимодействие возбудителей кишечных инфекций с иммунными макрофагами in vitro в зависимости от вирулентное! и и антигенной структуры бактерий.// Тез.докл.конф. "Иммунологические аспекты инфекционной патологии",-Таллин, 1981,- С. 124-126.

2. Белая Ю.А.,Попова Л.Ю.,Быстрова С.М.,Николаева Т.Н.Повышение чувствительности макрофагов к циготоксическому действию вирулентных шигелл // Ж.микробиол..-1982.- N7,- С.69-73.

3. Николаева Т.Н., Кибальчич Jl.ll. Реакция торможения миграции макрофагов при моделировании нпп еллезного инфекционного и вакцинального

процессов // Tci докл.1 Вссс. конф."Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология",- Москва, 1982,-С.73.

4. Белая Ю.Л.. Николаева Т.Н.. Попова JI.IO.. 11азаров III., Наба--',капов Б. Б., Кибальчич JI.II. Иммунологическая рсактнвпооь. вирулентность ппнелл и пммутюкоррегируюшая терапия при дизеигерин // Тез докл.VI Вссс. копф.но клинической биохимии, морфологии и иммунологии инфекционных болезней.-Рига. 19,43.- С. 18-19.

5. Белая Ю.Л.. Николаева Т.Н.. Кибальчич J1.II. Миграционная активность иммуноцитов при моделировании иифекциоиного и вакцинальною процесса при дизентерии // Тез. докл. Вссс. симп."Фагоцитоз и иммунитет".-Москва. 1983.-С.22-23.

6. Санин Л.В., Николаева Т.Н., Белая Ю.Л. Особенности реакции кроветворной и лпмфоидной ткани мышей па шигеллезную инфекцию и иммунизацию // Тез. докл. 1 Рсспубл. копф."Использование иммунологических и токсило!нческих методов при изучении патологических состояний".-Ташкент. 1983.-С.13-14.

7. Николаева Т.Н., Кибальчич Л.Н., Белая Ю.Л. Гнперчунствигслыюсть замедленного типа и вирулентность шигелл // Иммунология .- 1985.- N2,- С.80-81.

8. Санин A.B., Снегирева А.Г., Николаева Т.П. О взаимоотношении эритропотш п лнмфопоэза при экспериментальных инфекционных процессах и вирусном лейкозогенезе" // Экспериментальная онкология.- Москва. 1985,- v.l.- N4,-С.68-71.

О.С'анин A.B., Николаева Т.Н. Сравнительное изучение воздействия вакцинного и вирулентного штаммов шигелл Флскспсра па кроветворную систему мышеи// Сб."Дизентерийная вакцина",- Москва. 1985.-С.53-63.

10.Санин A.B., Малнкоп В.В., Николаева Т.П. Зависимость между способами получения линополисахарндоп бруцелл и их воздействием па гемонон // Ж.микробиология,- 1985,- N7.-C.95-99.

11.Санин A.B., Пронин A.B.. Николаева Т.П. Стимуляция и подавление образования кроветворных колоний в селезенке мышей иод воздействием ентпеттных сплспоцнтов. активированных конканавалшюм А//ВИПИ III N6975-B85.-1985,- 3.10.85.

12. Белая Ю.А., Николаева Т.П.. Назаров III., Кудрявцева JI.10.. Баба -лсапон Б.Б., Санин A.B.. Пик оласва Т.Н. Иммунотерапия дизеигерин Флскспсра и Зоппс с помощью живой пероралытои вакцины //Тез. докл.11 Вссс. съезда нпфекциопнегов.-ТашкепI.-1985,- С.95-97.

13. Санин A.B.. Николаева Т.П. О возможной роли Т-клсток в регуляции кроветворения in situ// Бто.ч. жеиерим. биолошн и мслишшы.-1986.-т. 102.-N 12.-С.751-754.

14. Николаева Т.Н.. Санин A.B.. Белая Ю.А. Различная способность живых бактерии вирулентною и авирулепгного штаммов Shigella jlexneri стимулировать селезеночное тндоколописобраэовапнс у мышей //Ж.микробиол.-1986.^ 1.- С.100-101.

15. Санин A.B., Прозоровский C.B.. Спсгиревва А.И.. Николаева Т.Н.. Гончарова С.А. Модуляция лсикозотснпых потенции вируса лейкоза Раутиера при смешанных инфекциях, осуществляемая lia уровне стволовых кроветворных клеток // СГ)."Смешанные инфекции".- 1986.-С.79-83.

16. Николаева Т.Н., Самии A.B., Белая Ю.А. Реакция кроветворной системы мышей на введение вирулентною и авирулеитного штаммов шигелл Флекснера 2а // Биологические iiayKH.-1987.-N6.- С.17-22.

П.Николаева Т.Н., Бубснцова Г.Н. Функциональная активность иммунокомпетентных клеток при экспериментальном заражении мышей вирулентным и авирулентным штаммами шигелл Флекснера 2а // ВИНИТИ.-N5432-В87.- 1987.-30.07.87.

18. Белая Ю.А., Николаева Г.Н., Кудрявцева Л.Ю.Воздействие вирулентных и авирулентных бактерий па различные звенья иммунной системы // Тез.докл.11 Всес. конф."Актуапы1ые вопросы теоретической и прикладной инфекционной иммунологии. Механизмы нротивоинфекионного иммунитета", Саратов.-1987.-С.29.

19.Санин A.B., Лапаева И.А., Маликов В.Е., Кузина Т.Н., Краснянская Т.А., Мысякин Е.Б., Николаева Т.Н., Кулыиин В.А., Львов В.Л., Синилова Н.Г., Дуплищева А.П. Стереотипные изменения в лимфогемопоэтической системе мышей, вызванные бактериальными иммупомодуляторами// Там же.-С.94.

20.Белая Ю.А.,Николаева Т.Н., Степанова Л.К., Кудрявцева Л.Ю., Агеева

B.А., Снегирева А.Е., Шапошникова Г.М.,Петрухин В.Г.Исследование иммунологической безвредпосш н эффективности вакцин против дизентерии и брюшного гифа// Тез.докл.У Рес. съезда эпндемиол., микробиол. и инфекционистов ЭССР. Таллин.-1987.-С. 19-20.

21. Агеева В.А., Степанова Л.К., Николаева Т.Н., Петрухин В.Г., Сергева Н.С. Оценка иммунологической безвредности новой брюшнотифозной вакцины, содержащей О-, Вн- и К- антиген// Тез.док. V съезда гигиенистов, санитарных врачей, эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов, Ташкент.- 1987.-T.2.-

C.124.

22. Николаева Т.П.,Сашш A.B., Белая Ю.А. Влияние вирулентных и авирулентных шигелл на кинешку. пролиферацию стволовых кроветворных клеток и эритропоэз у мышей // Иммунодо! mi.- 1988.-N1.-C.78-80.

23. Николаева Т.Н., Белля Ю.А. Изучение клеточных реакций иммунитета при экспериментальной дизентерийной инфекции и иммунизации живой дизентерийной вакциной как основа определения критериев иммунологической безвредности и эффективности // Тез.докл. конфер. посвящ.90-летию НИИВС, Пермь,- 1988.-С.147-149.

24.Николаева Т.Н., Белая Ю.А. Иммуномодулирующее воздействие вирулентных и авирулентных шигелл в экспернменте.-Сб. "Иммуномодуляторы в инфекционной иммунологии".- 19ХХ,- С.121-131.

25. Белая Ю.А., Николаева Т.Н., Кудрявцева Л.Ю. Значение вирулентности шигелл в индукции клеточных и плюральных реакций организма// Тез.докл.ХУ11 съезда Всес. общества эгшдемпол., микробиол. и паразитол. им.И.И.Мечникова, Алма-Ата,-1989.-С .10-11.

26.Николаева Т.Н., Белая Ю.А. Иммунодепрессивное действие вирулентных шигелл на антителогенез в эксперименте //Иммунология.- 1989.-N5.-C.84-86.

27. Николаева Т.Н., Белая Ю.А. Изучение роли ГЗТ в развитии экспериментальной дизентерийной инфекции и вакцинального процесса// Ж.микробиол.1989.-Ы12.-С.58-62.

28.Белая Ю.А., Николаева Т.П., Кудрявцева Л.Ю. Иммунологическая оценка безвредности и эффективное ш вакцин против кишечных инфекций //

4(1

Сб."Иммуиобиологнчсские препараты попою поколения и методы их кошроля",-1980.-С.136-140.

29.Белая Ю.А.. Николаева Т.П.. Кудрявцева JI.IO. Модуляция иммунного ответа в связи с вирулентностью нпиелл// Тез.докл.I Rece съезда нммунолоюв .-1989.-т. 1.-С.200.

30. Николаева Т.П.. Гордесва М.С.. Белая Ю.А. Клеточные иммунные реакции на ранних этапах развития экспсрнмсшалыюй дизешерийнои ннфекпии и вакцинального процесса у мышеи //Тез. докл.^'Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных физиологических и патологических соеюяниях". Челябинск.-)990,- С. 104-105.

31. Гордесва М.С.. Николаева Т.Н. Иммупоморфологичсское изучение лимфоидных органов при экспериментальном введении вирулентного и вакцинного штаммов шигелл Флскснсра 2а//Ж.микробиол. 1991.-N6.-C.75-80.

32. Николаева Т.Н., Белая Ю.А. Влияние индивидуальных антигенов Salmonella typhi па процессы гемопоэза экспериментальных живошых // Иммунология.-1991 .-N3.-C.56-59.

33. Николаева Т.Н., Кудрявцева Л.Ю. Экспериментальные подходы к разработке иммунологических критериев оценки безвредности и эффективности дизентерийных и брюшнотифозных вакцин // Тез. докл. VI Всес. съезда микробиол., эпидемнол. и паразитологов. Ниж.Новгород.-1991 .-т. 11.- С. 193.

34. Николаева Т.Н., Белая Ю.А., Кудрявцева Л.10., Степанова J1.K. Опенка рсактогсппости и эффективности иммупомодулнрутощей активности вакцин прогни кишечных инфекции в иммунологических тестах // Междуп. копф."Меднципская биотехнология, иммунизация. Спил". Санкт-Петербург,- 1991 .-С.5-7.

35. Николаева Т.П., Белая Ю.А. Влияние оппозптпых lio вирулентности Shigella sonne i на различные звенья иммунной системы //Ж. микробиол.-1992-N2.-С.22-26.

36. Николаева Т.Н.. Белая Ю.А.. Петрухни В.Г. Роль иоверхносшот К-апгигсна Shigella sonnet в индукции клешчнмх иммунных реакций // Иммунологня.-1992.-N2.-C.27-30.

37. Николаева Т.П.. Белая Ю.А. Влияние рнбосомалыюи пнпелдезпои вакнины Зонне на клеточные иммунные реакции// Ж.микробиол.-1992.-N7-X.-С..34-37.

38.Николаева Т.Н.. Бопдарснко В.М., Настпчкин И.А., Белая Ю.А. Роль белков наружной мембраны, детерминируемых 140 мсгадалыоп плазмидой ипвазивиости Shigella /lexneri. в индукции клеточных иммунных реакций// Ж.микробиол.-1995.-Ы1 .-С.33-36.

39. Николаева Т.П.. Бондарепко В.М.. Пастнчкни H.A.. Романова IO.M. Иммупомолулирующая способность бактерий Shigella flexneri, утративших нлазмиду ннвазивпости //Ж.микробиол.-1995.-N2.-С.50-54.

40. Николаева Т.П.. Бондарепко В.М. Изучение иммуиомодулирмощеи активное ¡и штаммов S.ifyxentcriac /. различающихся по способности к инвазии и продукции Шига-токсина'/ Ж.микробиол.-1995.-Ж).-С.57-58.

41. Николаева Т.П.. Бондарепко В.М., Пронин A.B. Роль токеннообразованпя S.tlvsenlcriac I lia различных этапах формирования клеточного пммунпою ответа экспериментальных животных// Ж.микробиол.-l 997.-N2.-C.6-10.