Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функционально-морфологическая характеристика патогенных энтеробактерий и механизмы регуляции их изменчивости

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Функционально-морфологическая характеристика патогенных энтеробактерий и механизмы регуляции их изменчивости"

Военно-меднцнпская ордена Ленина Краснознаменная Академия /'А 7

имени С. М. Кирова ^ -;-^

На правах рукописи

ТЕЦ

Виктор Вениаминович

УДК 579.8.083.13:575.2.

ФУНКЦИОНАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ИХ ИЗМЕНЧИВОСТИ

03.00.07 — Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

ЛЕНИНГРАД 1990

Работа выполнена в I Ленинградском ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте имени академика И. П. Павлова МЗ СССР

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Л. Б. БОРИСОВ

Официальные оппоненты: член-корреспондент АМН СССР, доктор медицинских наук, профессор А. А. ВОРОБЬЕВ;

доктор -медицинских наук, профессор Р. Б. ГОЛЬДИН,

доктор биологических наук, профессор В. Д. ЖЕСТЯНИКОВ

Ведущее учреждение ■— Ленинградский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток.

Защита состоится « ... »........ 1990 г. в .....часов

на заседании специализированного совета Д.106.03.05 при Военно-медицинской Академии им. С. М. Кирова (194175, Ленинград, ул. академика Лебедева, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Военно-медицинской Академии им. С. М. Кирова.

Автореферат разослан «...»....... 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук, профессор

Ю. И. Ляшенко

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Кишечные инфекции, вызываемые эшерихиями, шнгеллами и сальмонеллами, широко распространены в настоящее время, несмотря на существенное усовершенствование методов профилактики, диагностики и лечения. Длительное поддержание массивной циркуляции данных микроорганизмов в значительной степени связано с их высокой изменчивостью. Последняя проявляется в постоянном появлении новых О-серогрупп эшерихий, играющих важную роль в этнологии кишечных инфекций, смене преобладающих в инфекционном и эпидемическом процессах биотипов шнгелл, выраженной способности некоторых эшерихий и шнгелл к диссоциации, широком распространении внехромосомных факторов наследственности, несущих гены патогенности, устойчивости к антибиотикам и химиопрепара-там (Борисов Л. Б., 1976; Тимаков В. Д. и соавт., 1980; Брода П., 1982; Езепчук Ю. В., 1985; Тец В В., Борисов Л. Б., 1985, 1986, 1988; Пехов А. П., 1986; Смирнов Г. Б., 1988; Sansonetti Р. J. et al., 1981; Keusch G. Т. et al, 1982; Law D„ 1988).

Вирулентность различных микроорганизмов, как показано в последние годы, является полидетерминантным признаком-. Разнообразие способов сохранения информации о составляющих ее факторах в значительной степени объясняет высокую пластичность популяций патогенных микроорганизмов (Езепчук Ю. В., 1985; Петровская В. Г-, Бондаренко В. М„ 1985; Полоцкий Ю. Е. Бондаренко В. М., 1986; Покровский. В. И. ц соавт., 1989; Gaastra W., de Graaf F., 1982; Levine M. M„ 1983; Sansonetti. P. J. et al., 1983, 1986; Middlebrook J. L„ 1984; Binns M. M., 1985; Ketyi I., 1985). Вместе с тем крайне мало известно о быстро возникающих у бактерий изменениях вирулентности и антигенной структуры, которые мргут иметь место в ходе инфекционного процесса и. проявляются», в частности, в зависимости от температуры окружающей среды н присутствия антимикробных препаратов. Комплексного исследования влияния последних на отдельные факторы, ви-

рулентности а чувствительность к внешним воздействиям большинства клинически актуальных энтеробактерий, в том числе энтероинвазивных и энтеропатогенных кишечных палочек (ЭИКП и ЭПКП) и шигелл, не проводилось. Выбор ЭИКП и шигелл в качестве основного объекта изучения определялся данными о сходстве факторов вирулентности, генов патогенности и их расположения в хромосоме и плазми-дах у этих микроорганизмов, принадлежащих к разным родам, видам и серогруппам (Борисов Л. Б., 1976; Тима-ков В. Д. и соавт., 1980; Петровская В. Г., Бондаренко В. М., 1985; Полоцкий Ю. Е., Бондаренко В. М., 1986; Покровский В. И. и соавт., 1989; Sansonetti П. J. et ab, 1983, 1986; Baileau С. R. et а!., 1984; Small P. L. C„ Falkow S„ 1986). Для сравнения были исследованы ЭПКП и некоторые другие энгеробактерии, обладающие иными факторами вирулентности.

В последние годы объектом интенсивного изучения являются ипдуцибельные системы изменчивости — тепловой шок (ТШ) и SOS-ответ, регулирующие активность различных генов и играющие большую роль в жизнедеятельности бактерий, способствуя их адаптации к условиям окружающей среды (Левашев В. С. и соавт., 1984; Хесин Р. Б., 1984; Лендов В. А-, 1985; Witkin Е„ 1982; Gottesman S„ Neidhardt F. С., 1983; Walker G. С., 1984; Smith G. R., 1987). Важной особенностью многих контролируемых этими системами изменений является их обратимость. Основные успехи в изучении системы ТШ и SOS-ответа достигнуты на модели Escherichia coli. В то же время эпидемически значимые варианты этого микроорганизма исследованы недостаточно, а шигеллы практически не становились объектом систематического анализа. Полностью отсутствуют данные о роли этих систем в изменении у ЭПКП, ЭИКП и шигелл таких важных признаков, как вирулентность, чувствительность к антибиотикам, антигенность, н ряда других. Неизвестно, как изменяется активность SOS-ответа и системы ТШ в присутствии основных антимикробных препаратов, используемых для лечения данных инфекций. В значительной степени изучение этих вопросов тормозится отсутствием коллекций патогенных энтеробактерий, имеющих известные дефекты в генах, контролирующих работу системы ТШ и SOS-ответа. Вместе с тем детальное исследование регуляции изменений микробной вирулентности, не сопровождающихся утратой генов патогенности, может спо-

:обствовать дальнейшему прогрессу в профилактике, диагностике л лечении инфекций, вызываемых данными микроорганизмами.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы явилось изучение функционально-морфологических особенностей эпидемически значимых штаммов патогенных энтеробактерий и роли в их изменчивости индуцибельных ре-гуляторных систем ТШ и SOS-ответа. Очевидно, что такому исследованию должно было предшествовать изучение общих свойств использованных микроорганизмов, прежде всего их вирулентности, чувствительности к действию факторов внешней среды, мутабильности и наличия внехромосомных факторов наследственности, а также создание коллекции штаммов патогенных микроорганизмов, имеющих дефекты генов систем ТШ и SOS-ответа. В этой связи в работе были намечены следующие задачи:

1) комплексное изучение различных биологических свойств штаммов патогенных энтеробактерий, выделенных от больных;

2) конструирование штаммов патогенных энтеробактерий, имеющих дефекты генов систем ТШ и SOS-ответа, и изучение их биологических свойств, включая различные факторы вирулентности и чувствительность к факторам внешней среды;

3) изучение роли температуры культивирования в изменении биологических свойств патогенных энтеробактерий, а также участия в их регуляции системы ТШ;

4) изучение роли SOS-системы в изменчивости свойств патогенных энтеробактерий;

5) комплексный анализ роли антимикробных препаратов -в изменении биологических свойств бактерий, включая различные факторы вирулентности и активацию их SOS-системы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ- Проведено комплексное микробиологическое, биохимическое, электронно-микроскопическое и молекулярно-бнологическое изучение патогенных энтеробактерий, полученных от больных. Среди Е. coli одной серогруппы выделены штаммы, сохраняющие S-форму и различающиеся по ультраструктуре, наличию и выраженности отдельных факторов вирулентности, чувствительности к внешним воздействиям, .мутабильности, целостности молекулы ДНК, содержанию внехромосомных факторов наследственности и частоте S-R-днссоцнащш. Прослежены изменения отдельных факторов вирулентности при S-R-диссоциа-

дни у ЭИКП. Установлено существование корреляции между адгезивностью ЭИКП, ЭШ\П и Shigella flexneri 2а и количеством связанных с ними сиаловых кислот. Описаны ранее неизвестные особенности ультраструктурной организации колоний энтеробактерий. Выявлены различия выживания в присутствии антибиотиков микроорганизмов, находящихся в составе колонии и свободно растущих на плотной и в жидкой питательных средах. Впервые создана коллекция штаммов ЭПКП, ЭИКП и S. flexneri 2а, несущих дефектные гены, регулирующие активность ^систем ТШ и SOS-ответа. Установлено неописанное ранее участие этих систем в регуляции вирулентности исследованных энтеробактерий. Показано, что микроорганизмы, несущие дефектный ген гесА56 Е. coli К-12, имеют резко сниженную вирулентность при сохранении основных антигенов и иммуногенности. Впервые описаны зависящие от условий существования ультраструктурные изменения колонии и клеток непатогенных стандартных и патогенных штаммов энтеробактерий, имеющих повреждения генов систем ТШ и SOS-ответа. Предложено и теоретически обосновано использование периодической бактериальной культуры для изучения изменчивости и механизмов се регуляции у энтеробактерий. Показано, что данная модель дает возможность исследовать переходные состояния популяции энтеробактерий, подобные тем, которые могут возникать в течение гнфекциониого процесса in vivo. Установлено, что в ходе экспериментальной инфекции, вызванной Е. coli 0124, скачкообразно возрастает изменчивость возбудителя. Показана роль SOS-системы в регуляции естественной изменчивости популяций энтеробактерий. Выявлено участие различных антимикробных препаратов, широко используемых в клинической практике, в изменении активности этой системы- В результате комплексного изучения влияния субиигнбирующих концентраций антибиотиков на ЭИКП и S. flexneri 2а установлена роль этих препаратов в изменении различных факторов вирулентности н исходе взаимодействия микроорганизмов с факторами иммунной защиты.

Разработаны оригинальные способы: а) газохроматогра-бичсского анализа пуриповых и пиримидиновых оснований ДНК, б) приготовления силнлированных производных оснований нуклеиновых кислот, в) использования дифенила и гафталпна в качестве внутренних стандартов при газохрома-тографическом изучении нуклеиновых кислот, г) получения 4

рекомбинантиых штаммов S-формы патогенных эшерихий, д) снижения минимальной подавляющей концентрации антибиотиков при их совместном использовании с кофеином. Принципы изменения характера взаимоотношении микроба-паразита с организмом хозяина в присутствии субингибирую-щнх концентраций антибиотиков использованы в разработке методов профилактики и лечения заболевании слизистых оболочек.

Получены оригинальные: а) полимерный гелеобразующий материал с антимикробными препаратами для биомеднцнн-ских целей, б) штамм бактерий Е. coli 0124, имеющий сниженную вирулентность, пригодный для иммунизации животных с целью получения диагностических сывороток.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Полученные данные о факторах вирулентности у различных штаммов Е. coli одной серогруппы позволяют оценить пути сохранения в популяциях генов патогенности. Результаты изучения ультраструктурной организации колоний и выживаемости составляющих их бактерий в присутствии антибиотиков, а также действия последних на различные факторы вирулентности объясняют возможность расхождения эффективности лечения с результатами лабораторного выбора оптимального этиотропного препарата. Данные о роли нн-дуцибельных систем — ТШ и SOS-ответа — в регуляции свойств патогенных энтеробактерий представляют экспериментальную основу для оценки возможности и темпов их изменчивости в ходе инфекционного процесса in vivo и прп смене среды обитания. Снижение вирулентности различных энтеробактерий за счет введения гена гесА56 от Е. coli К-12 может быть использовано в качестве дополнительного способа при создании вакцинных штаммов. Установленное изменение активности различных факторов вирулентности патогенных ЭИКП н S. flexneri 2а при повышении температуры культивирования от 37°С до 42° С может быть использовано для оценки тактики лечения и предотвращения вторичных инфекций. Данные о влиянии антибиотиков на вирулентность бактерий, их взаимодействие с факторами иммунной защиты и активацию SOS-ответа позволяют по-новому оценить возможность н способы их использования для профилактики и лечения ряда инфекций, а также наметить пути снижения нежелательных эффектов индукции систем изменчивости микроорганизмов. Разработанные способы позволяют изучать

состав ДНК с помощью метода газожидкостной хроматографии, получать штаммы со сниженной вирулентностью за счет передачи им гена гесАБб от Е. coli, снижать в лабораторной работе МПК антибиотиков при использовании кофеина, повышать эффективность лечения и профилактики при ряде инфекционных состояний.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ. Получены 4 авторских свидетельства: «Способ изготовления стоматологических конструкций из алюминия и его сплавов» (№ 942734 от 16.03.82), «Полимерный гелеобразующий материал для биомедицинских целей» (№ 1134581 от 15.09.84), «Способ получения рекомбинантного штамма S-формы патогенных эшери-хий» (№ 1253141 от 22.04.86), «Штамм бактерий Escherichia coli VT2240,, используемый для получения диагностической О-сыворотки к эшерихиям серовара 0124» (№' 1378370 от 01.11.87). Получено одно положительное решение по заявке на изобретение «Антимикробный состав для подавления посторонней микрофлоры при выращивании микроорганизмов и культур тканей» (Заявка № 4105904, приоритет от 18.08.86, положительное решение от 12.06.89). Утверждены рационализаторские предложения: «Способ растворения пуриновых и пнримндииовых оснований нуклеиновых кислот», «Использование дифенила и нафталина в качестве внутренних стандартов при газожидкостной хроматографии нуклеиновых кислот», «Способ приготовления силилированных производных оснований нуклеиновых кислот», «Способ приготовления и нанесения антибактериального покрытия на проволочные шины, используемые в челюстно-лицевой хирургии», «Способ газохро-матографического анализа пуриновых и пиримнднновых основании в изотермическом режиме», «Антисептическая композиция пролонгированного действия», «Способ определения гемолитической активности бактерий», «Способ лечения кольпитов» (БРИЗ I ЛМИ им. акад. И. П. Павлова № 71 и № 72 от 13.10.78, № 87 и № 88 от 12-12.79, № 68 от 06.06.80, № 21 от 19.01.84, Jft 746 от 07.06.88, № 752 от 10.06.88). Разработанные способы и материалы внедрены в лечебную работу кафедр детской стоматологии, JIOP-болезней, акушерства и гинекология I ЛМИ им. акад. И. П. Павлова,, в экспериментальную работу кафедр микробиологии, ЛОР-болезней I ЛМИ им. акад. II. П. Павлова, 1ММИ им. И. М. Сеченова, института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова, Марийского государственного университета. Данные, полу-6

¡еппые в диссертационной работе, введены в курс лекций и практических занятий по микробиологии для студентов 1 ЛМИ. Результаты работы включены в комплекс данных программы научных исследований АН СССР и АМН СССР «Фундаментальные науки — медицине» и региональной программы «Профилактика инфекционных болезней».

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на конференции «Вопросы нммунологин и молекулярной биологии» (Нальчик, 1981), «Актуальные вопросы иммунологии аллергологии и молекулярной биологии» (Краснодар, 1983), «Количественный люминесцентный анализ многокомпонентных систем биологически активных веществ» (Ташкент, 1982), «Восстановнтельные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях» (Ленинград, 1986), VII Всесоюзном симпозиуме «Синтетические полимеры медицинского назначения» (Минск, 1985), Всесоюзных семинарах «Вопросы антибактериальной терапии инфекционных осложнений в неинфекционной клинике» (Москва, 1987), «Колонизационная резистентность к химиотерапевтическим и антибактериальным препаратам» (Москва, 1988), I съезде эпидемиологов, инфекционистов и гигиенистов Туркменистана (Ашхабад, 1986), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), II Всесоюзном съезде паразитоценологов (Киев, 1983), II Всесоюзной конференции по актуальным вопросам теоретической и прикладной инфекционной иммунологии (Саратов, 1987), Пленуме научного совета по микробиологии АМН СССР (Махачкала, 1987) (Томск, 1985), заседании ленинградского отделения Всероссийского общества микробиологов (1988). По теме диссертации опубликовано 38 работ, в том числе 16 статей в центральных журналах и 1 монография.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Среди энтероинвазивных эшерихий, относящихся к одной серогрулле, существуют штаммы, сохраняющие Б-форму, но различающиеся ультраструктурон, адгезнвностью, пене-трацнонной активностью и их изменениями при разных температурах, чувствительностью к внешним воздействиям, содержанием внехромосомных факторов наследственности, целостностью молекулы ДНК, частотой возникновения мутаций антибиотикоустойчивости и Б-И-диссоциации. Колонии патогенных энтеробактернй могут выступать в качестве органи-

зованной и отграниченной от внешней среды структуры, клетки которой менее подвержены действию антибиотиков.

2. Изменения важных для медицинской микробиологии свойств патогенных энтеробактерий зависят от функций гена гесА—активатора синтеза белков SOS-системы. В качестве индуктора этой системы могут выступать различные антимикробные препараты. У Е. coli серогрупп 0111, 0124, 0143 и S. flexneri 2а возможна замена собственного гена гесА на его дефектные варианты, переданные фагом PI от Е. coli К-12. Рекомбинанты с геном гесА56 имеют резко сниженную вирулентность при сохранении основных генов патогенности, антигенов и иммуногснности, лишены возможности восстанавливать поврежденный ген за счет законной рекомбинации. Передача гена гесА56 патогенным энтеробактериям может быть использована как дополнительный метод при создании вакцинных штаммов.

3. Изученные штаммы ЭИКП и S. flexneri 2а имеют минимум два уровня температурной регуляции активности факторов вирулентности. Первый функционирует преимущественно при изменении температуры от 18° С до 37° С, второй — от 37° С до 42° С. Изменения вирулентности при этом зависят от функций гена htpR (гроН) — активатора системы ТШ. Возможна передача дефектного гена htpR 15 от E._coli к S. flexneri 2а. Полученные рекомбинанты имеют HtpR фенотип и измененную регуляцию вирулентности в зависимости от температуры культивирования.

4. Антимикробные препараты в ингибирующих и субинги-бирующих концентрациях влияют на активность различных факторов вирулентности энтеробактерий и их выживаемость во внешней среде. Изученные препараты вызывают как усиление, так и ослабление отдельных факторов вирулентности. Первые этапы взаимодействия микроба и организма хозяина угнетаются рифампицином и тетрациклином, а усиливаются в наибольшей степени налидиксовой кислотой.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 298 с. машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (I—обзор литературы, II—материалы и методы, III— собственные данные, IV—обсуждение результатов) заключения, выводов и списка литературы. Глава I включает 3 раздела, содержащие данные о факторах вирулентности, ультраструктуре ЭПКП и ЭИКП, причинах и механизмах их изменчивости. Главы III и IV включают по 4 раздела. Первый из 8

них посвящен функционально-морфологической характеристике основных изученных штаммов, второй — роли гена гесА в изменении свойств патогенных энтеробактернй, третий — роли температуры в реализации свойств этих микроорганизмов, четвертый — изменчивости популяций энтеробактернй с нормальным и дефектным геном гесА. Диссертация содержит 67 таблиц, иллюстративный материал представлен 124 рисунками, включающими микрофотографии, электронограммы, полученные в трансмиссионном и сканирующем режимах, графиками и схемами. Указатель литературы включает 775 источников, в том числе 154 отечественных и 621 зарубежный.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальный материал включал бактерии родов Escherichia, Shigella и Salmonella, полученные из музеев культур I ЛМИ им. акад. И. П. Павлова, ЛИЯФ им. Б. П. Константинова, НИИЭМ им. Пастера, ГИСК им. Л. А. Тарасовича и международных коллекций. Часть патогенных штаммов, свежевыделенных от больных, получена из бактериологической лаборатории больницы им. С. П. Боткина. В экспериментах использованы лабораторные животные: морские свинки (самцы) массой 250—300 г. — 450 шт., кролики (самцы) -— 30 шт., беспородные белые мыши — 430 шт.

Морфологические и физиологические методы. Культивирование бактерий осуществляли на аминопептидной и мясопеп-тониой средах, минимальной среде М-9, в ряде случаев содержащей 0,4% триптона или 1% Casamino acid, триптофан и никотиновую кислоту. Для изучения свойств бактерий использовали среды: Левина, Симмонса. Эндо, Плоскирева, Хыо, Гисса, кровяной агар. Рост микробов оценивали по оптической плотности и количеству бактерий, образующих колонии на плотной питательной среде (КОЕ) (Кох А., 1983). Использованные штаммы хранились в виде лиофилыю-высушенных препаратов в ампулах. Морфологию изучали общепринятыми методами с использованием окрашенных фиксированных препаратов при обычной световой микроскопии и нативных — при фазово-коитрастной. Для электронно-микроскопического исследования использовали негативное конт-

растирование (Beenner S., Harne R. W., 1959) и просвечнва-ние ультратонких срезов. Препараты готовили по методу A. Ryter и Е. Kellenberger (1958). Материал фиксировали 1Лютаровым альдегидом и четырехокисью осмия (Jlynna X., 1980) и заливали в смолу Спурра. Срезы готовили на ультрамикротоме LKB-880Q. Препараты просматривали в электронном микроскопе JEM-1Q0C при ускоряющем напряжении 80 kV. Электронно-цитохимическое изучение мукополисаха-ридных капсул проводили с использованием окрашивания рутениевым красным (Kobayasi T., Saboe-Hansen G., 1971 )• При сканирующей электронной микроскопии препараты последовательно фиксировали в парах акролеина, и четырехокиси осмия, после чего напыляли золотом (Black J. Т., 1974) и изучали на сканирующем электронном микроскопе JSM-35 С. Биохимическую активность определяли общепринятыми методами с использованием дифференциально-диагностических сред. Дифференциацию S- и R-форм проводили по характеру роста на аминопептидной среде, морфологии колоний, характеру их свечения в кособоковом свете, агглютинабельности в растворе трипофлавина, спонтанной агглютинации в изотоническом растворе хлорида натрия и чувствительности к R-фагу. Чувствительность к антимикробным препаратам определяли методом дисков и серийных разведений для определения минимальной • подавляющей концентрации (МПК) (Нава-шин С. М., Фомина И. П., 1982; Ланчини Д., Паренти Ф., 1985). Колициногенность изучали с использованием эталонных штаммов (Fredericq Р., 1957), а также полученных М. С. Идиной в НИИЭМ им. Пастера. Умеренные бактериофаги выявляли на индикаторных штаммах Е. coli С и ABl 157. Агглютинацию на стекле и в пробирках ставили согласно общепринятым методикам. Агглютинирующие сыворотки к изученным штаммам получали иммунизацией кроликов живыми микробными культурами. Сыворотки хранили в лиофильно-высушенном виде при 4°С. Способность к гемагглютинации изучали но отношению к эритроцитам человека П(А) группы крови, морской свннки, барана и быка. В качестве ингибитора гемагглютинации использовали D-маннозу (Болгария). Реакцию ставили на стекле и в планшетах для микротитрования. Способность вызывать кератоконъюнктивит изучали на морских свинках (Sereny В, 1957). Животных заражали с помощью бактериологической петли или автоматической микропипетки. LD50 определяли на белых мышах при внутрнбрю-10

шинном заражении (Ашмарин И. П., Воробьев А. А., 1962). Легочную модель при интраназалыюм заражении белых мы-ыей использовали согласно методическим рекомендациям НИИЭМ им. Пастера (1977). Пробу отека лапы мыши ставили с микробными дизатами согласно методу, описанному Ю. Л. Вартаняном и соавт. (1978). Бактерии разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДИ-2 при 22 кГц. Контактный гемолиз эритроцитов оценивали по методу P. J. San-sonetti et. al. (1986) с некоторыми модификациями (Рац. предл. № 719 от 08.04.88 г.). Стандартную взвесь эритроцитов барана и испытуемых микробов смешивали по 0,5 мл в пластмассовых центрифужных стаканчиках. После центрифугирования и инкубации при 37° С, ресуспендироваиия, добавления холодного фосфатного буфера и повторного осаждения определяли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 (СССР). Взаимодействие бактерий с эпителиальными клетками исследовали на культурах HeLa и НЕр-2 (Hale Т. L. et а!., 1979; Haie Т. L., Formal S. В., 1981; Makino S. et al., 1986). Клетки выращивали на среде Игла с 10% телячьей сыворотки (Flow), инактивированной прогреванием при 56°С. Для изучения адгезии, внутриклеточного размножения и перехода бактерий между контактирующими клетками мопослой последних получали на покровных стеклах, для изучения инвазии — на дне пеннциллиновых флаконов. При изучении инвазии, внутриклеточного размножения и перехода бактерий между клетками последние после пенетрацнн отмывали от не-проннкших бактерий и инкубировали в среде, содержащей ка-иамицин и гентамицин. Определяли индекс адгезии (ИА), представляющий собой процент клеток, к которым прилипли 1 или более бактерий; адгезионное число I (АЧ1) — число бактерий, приходящихся на 1 эпителиальную клетку, включая инфицированные и неннфнцировапные; адгезионное число 2 (АЧ2) — среднее число бактерий, приходящихся па 1 инфицированную клетку; индекс инвазии (ИИ) — процент эпителиальных клеток, содержащих бактерии, в среде с ген-тамицином и канамицином; инвазионное число (ИЧ) — число бактерий, находящихся внутри 1 инфицированной клетки. Сиаловые кислоты определяли по методу L. Warren (1959). В качестве стандартов готовили различные разведения сиа-ловой кислоты (Sigma). Содержание сизловых кислот оценивали в мкМ на 109 бактерий. Взаимодействие бактерий с цельной кровью человека изучали, добавляя в последнюю IX 10я

микробов на 1 мл. Количественные высевы проводили в течение 3 ч инкубации при 37° С. Чувствительность микробов к бактерицидному действию нормальной сыворотки крови человека определяли по методу Р. Taylor (1972), делая высевы в течение 3 ч инкубации опытной смеси. Взаимодействие бактерий с системой комплемента сыворотки крови оценивали по зависимости расхода общих компонентов альтернативного пути, фактора В и СЗ-компонента от количества бактериальных клеток в инкубационной пробе (Козлов Л. В., Соля-ков Л. С., 1982; Nelson В., Ruddy S., 1979). Реагент. RB для определения факторов В готовили согласно Р. Н. Lesavre et ai (1979). Процент расщепления СЗ-компонента определяли по количеству образовавшегося СЗа-фрагмента, используя метод иммуноблоттиига и !251-мечеиые анти-СЗа-антитела, специфичные как к натнвной молекуле СЗ, так и ее малому фрагменту СЗа (Laeinmly U. 1\„ 1970; Jerechonia G. М., Palada G. A. F., 1982; Joiner К. A. et al., 1982). Взаимодействие, бактерий с макрофагоподобными линиями клеток P338-D1 и J.774.1 исследовали, получая их монослон в среде без антибиотиков. Бактерии добавляли в конечной концентрации 1,0—2,0ХЮ8 на 1 мл среды. После 1 ч ннкубащш клетки отмывали и еще через 30 мин. инкубации, необходимой для захвата адгезированных микроорганизмов, снимали со стекла и разрушали. Из полученной взвеси делали количественные высевы на плотную питательную среду. При изучении выживания бактерий в макрофагоподобных клетках их инкубировали в среде, содержащей канамицин и гентамицпн. Использованные линии макрофагоподобных клеток подробно охарактеризованы в ряде работ (Turco J., Winkler Н. 1982; Van Furth R. et al., 1985). Моделирование различных состояний микробных популяций проводили при периодическом культивировании (Тец В. В., Каминский Г. Д., 1984). Бактерии выращивали в колбах объемом 700,0 мл, содержащих 200,0 мл питательной среды, при постоянной аэрации. Число нитевидных форм учитывали па фиксированных окрашенных препаратах, а также при фазово-контрастной микроскопии микробных культур, выращенных на тонких агаровых пластинках. По размеру клетки разделяли фильтрованием через фильтры фирмы Millipore.

Методы изучения факторов, влияющих на изменчивость. Выделение ДНК бактерий проводили по методу J. Marmur (1961). Бактерии выращивали до второй трети фазы экспо-12

нснциального роста. Чистоту полученных препаратов оценивали спектрофотометрически при длинах волн от 220 до 320 им. Выделение ДНК плазмид осуществляли с использованием амплификации и без нее. Полученные препараты изучали электрофорезом в агарозе (Маниатис Т. и соавт., 1984), Для проверки кольцевой структуры илазмидиую ДНК обрабатывали эндонуклеазой фага Т4 (Clewell D. В.,Helinski D.R., 1972). Содержание основных и минорных компонентов ДНК определяли с помощью газохроматографического масс-спект-рометрнческого детектирования разработанными нами методами (Тец В. В., 1979; 1980 а, б; 1981 а). Триметилсиллльные эфнры основании получали обработкой проб N, О-бис-триме-тнлеилил-трифторацетамидом и триметилхлорсиланом (Gehr-ke G. W., Lakings D. В., 1971). Газохроматографическин масс-спектрометрнческий анализ проводили на приборе 5985Л Hewlett-Packard (США) с системой обработки данных на основе компьютера. Разделение осуществляли на стеклянной колонке «Scot» длиной 20 м п внутренним диаметром 0,5 мм. Газом-носителем служил гелии. Разделение проходило при программировании температур. Получение рекомбинантных штаммов бактерий осуществляли с помощью метода трапедукцпн фагом Р1 (Миллер Д., 1976). Для передачи вирулентным штаммам, находящимся в S-форме, генов от авирулентных R-форм был использован разработанный нами способ проведения транедукцин (Тец В. В., 1985). Чувствительность бактерий к УФ-облучению и факторам, препятствующим репарации-ДНК определяли согласно методам, описанным у Д. Миллера (1976). Частоту возникновения спонтанных мутаций по отношению к антибиотикам определяли с помощью флуктуа-ционного теста Лурия и Дельбрюка (Стен Г., Кэлнндар Р., 1981). Число одноцепочечных разрывов ДНК определяли по способу С. Д. Иванова и С. Ф. Савельева (1982). Пробы ДНК анализировали с помощью хроматографии на океиапатите (Erixon К-, Ahnstrôm G., 1979). Количество одно- и двухце-почечных участков ДНК определяли флуорометрическим способом (Brunk С. F. et al., 1979). Количество разрывов ДНК (п) выражали в единицах на 109 Д ДНК (Kanter Р. М., Schwart H. S., 1979). Активность $-галактозидазы измеряли при помощи хромогенного субстрата о-нитрофенил-р-О-галак-тозида (Миллер Д., 1976). Щелочную фосфатазу определял!! по методу P. Quillardett et al. (1982). Содержание фермента рассчитывали подобно (3-галактозндазе.

Статистические методы. Полученные результаты обрабатывали, используя методы вариационной статистики. Достоверность различий оценивали с помощью критерия Стыодента, U-критерия Вилкоксоиа-Мана-Уитни (Бейли Н., 1962; Губ-лер Е. В., 1978).

СОБСТВЕННЫЕ ДАННЫЕ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ФУНКЦИОНАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ ИЗУЧЕННЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ

Морфологические и биохимические свойства, чувствительность к антибиотикам. Все исследованные штаммы, по данным световой ц электронной микроскопии, а также по результатам изучения биохимической активности, имели свойства, характерные для представителей соответствующих родов и видов. Полученные результаты полностью соответствовали данным, приведенным в литературе (Борисов Л. Б., 1976; Ти-маков В. Д. и соавт., 1980; Голубева И. В. и соавт., 1985; Carpenter Р., 1974; Le Minor L., Rohde R., 1974; Orskov F., 1974). Спектр чувствительности исследованных штаммов к антимикробным средствам также соответствовал их родовым и видовым особенностям и свидетельствовал об отсутствии плазмид аитибиотикоустойчивости.

Ряд новых данных получен при исследовании ультраструктуры цельных микробных колоний и выживаемости находящихся в их составе клеток в присутствии антибиотиков. Изучение препаратов, приготовленных из отпечатков и срезов колоний, показало, что через 48 ч роста колонии формируются как цельные структуры, отграничивающиеся от внешней среды за счет поверхностной пленки и внешней капсуло-подобной оболочки клеток наружных слоев. Внутри колонии между бактериями возникают межклеточные контакты.

Поверхностная пленка колоний появляется на вторые сутки роста и хорошо видна при сканирующей и трансмиссионной микроскопии. В ее формировании принимают участие сливающиеся с ней мембранные пузырьки. Последние образованы, предположительно, из наружной мембраны бактерий и могут содержать внутри полисахариды и белки (Высоцкий В. В., Смнрнова-Мутушева М. А., 1984; Chatterjee S. N.,

Das J., 1967; Mulks M. H. et al„ 1980; Katsui N. et al., 1982).

Капсулоподобная оболочка бактерий 3—5 поверхностных слоев, расположенных как со стороны воздуха, так и со стороны питательной среды, по виду наиболее соответствовала микробному гликокаликсу (Costerton J. W. et al.r 1981; Ri-chelle-Maurer E., Moureau Z., 1987). Бактерии, находящиеся внутри колонии, ни в одном случае ее не имели. При культивировании бактерий в жидкой питательной среде подобную оболочку имела большая часть клеток исследованных штаммов. Некоторая специализация бактерий в колониях, вероятно, связана с различной интенсивностью жизнедеятельности, обусловленной месторасположением микробов. Считается, что ь микробных колониях существуют метаболические диффузионные градиенты, подобные таковым в тканях высших организмов (Перт Д. Н., 1978; Гудвин Б., 1979; Иванов В. Н., Угодчиков Г. А., 1984). Элементы диффереицировки и специализации клеток описаны ранее у цианобактерий и некоторых микроорганизмов, образующих нити-трихомы (Громов Б. В., 1976; Chase D. G., Erlandsen S. L„ 1976).

В пользу актуальности исследования колоний как целостных структур свидетельствуют результаты изучения выживаемости входящих в их состав клеток в присутствии антибиотиков. В двухсуточных колониях Е, coli 0124 и S. fJexineri 2а, перенесенных на 24 ч на агар, содержащий бактерицидные концентрации гентамицина или канамицина, большая часть микроорганизмов сохраняла свою жизнеспособность. Их количество в колонии в среднем составляло (2,4—8,0±0,5) X 108. Бактерии же из колоний, перенесенных на агар с антибиотиком с нарушением структуры последних, в аналогичных условиях проведения опытов полностью погибали. Не давали они роста и в жидкой питательной среде. В односуточных колониях бактерии в присутствии антибиотиков выживали хуже, чем в двухсуточных. Количество живых клеток в одно-суточных колониях после 24 ч инкубации составило для É. coli 0124 на среде с гентамицином — (1,8±0,7)ХЮ2, в контроле—(1,7±0,2) X107, для S. flexneri 2а на среде с гентамицином — (6,0±0,9) Х10г, с канамицином — (2,3±0,5)Х ХЮ4, в контроле—(5,1±0,3)ХЮ7.

Вирулентность в опытах in vivo. Кератоконъюнкти-вальная проба по В. Sereny (1957) показала,что основное число использованных штаммов ЭИКП, S. flexneri 2а и

S. sonnei, находящихся в S-форме, вызывают патологические изменения в глазу инфицированного животного на 2—3 день наблюдения. Исключение составляют Е. coli 0124 (штамм VT1248), находящиеся в S-форме и не вызывающие керато-конъюнктивит. Тест отека лапы мыши был использован для косвенной оценки энтероксической активности. Все изученные штаммы ЭИКП и шигелл, находящиеся в S- и R-форме, дают положительную реакцию в использованном тесте. Статистически значимых различий активности энтеро-токсина у S- и R-форм бактерий не обнаружено. Значение LD50 определяли для оценки вирулентности ЭПКП. У изученных штаммов Е. coli серогрупп 055 и 0111, находящихся в S-форме, она составила 2,0—6,0ХЮ7 бактерии.

Оценка отдельных факторов вирулентности in vitro. Вир}г-лентность исследованных штаммов является полидетерми-нантпым признаком, генетическая информация о котором расположена в хромосоме й плазмидах. Адгезивность исследовали на модели клеток HeLa. Все изученные штаммы были лишены пилей и не агглютинировали Зэ/а взвесь эритроцитов человека И группы крови, барана, быка и морской свинки. Штаммы неинвазивных и ннвазивных эшерихий, а также шигелл в использованных условиях проведения экспериментов были способны к адгезии на клетках HeLa. Наибольшие значения ИА зарегистрированы у Е. coli серогруппы 0124, находящихся в R-форме (штамм VT1241), и авирулентной S-фор-мы (Е. coli VT1248) — соответственно 100 и 98,0±0,9, а также R-формы S. flexneri 2а (штамм VT101) — 96,0+0,7. Эти же штаммы давали максимальные значения АЧ1 и АЧ2. Таким образом, по всем использованным критериям оценки адгезии лучшие показатели были свойственны авирулеитным S- и R-формам. Подобное поведение R-форм, имеющих различные дефекты ЛПС-слоя, описано у шигелл (ТимаковВ.Д. и соавт., 1980; Kopecko D., 1979). Инвазивность, включающую в себя пенетрационную активность, размножение внутри клеток н переход между контактирующими клетками, параллельно с пробой Шереня оценивали по способности вызывать контактный гемолиз эритроцитов. Полученные результаты свидетельствуют, что все изученные штаммы ЭИКП, кроме Е. coli VT1248 и S. flexineri 2а, находящиеся в S-формс, вызывали контактный гемолиз. Бактерии в R-форме не только сохраняли контактную гемолитическую активность, но даже превосходили по этому показателю исходные S-формы. 16

П е н е т р а ци о ни а я активность на модели клеток HeLa обнаружена у всех S- и R-форм исследованных штаммов ЭИКП и шигелл за исключением Е. coli VT1248. Размножение внутри клеток было свойственно всем штаммам, способным проникать в эпителиальные клетки. Так, через 2 ч роста у Е. coli VT1240 (S-форма) ИЧ составляло 17,3+0,1, а через 5ч — 57,2+1,2, у Е. coli VT1241 (R-фор-ма)—соответственно 10,0+0,3 и 81,2±3,3. Переход бак-терн й м е ж д у контактируют и м и к л е т к а м и, как недавно показано, также имеет индивидуальный генетический контроль (Makino S. et ai., 1986; Lett M С. et al„ 1989). Все изученные штаммы инвазивных энтеробактерий могут переходить из инфицированных клеток в интактные без выхода во внешнюю среду. Показатели ИИ у всех штаммов между 2 и 5 ч наблюдения возросли в 2—9 раз.

Дополнительным тестом оценки вирулентности инвазивных энтеробактерий служит проба с конго красным. Накопление красителя наблюдалось у всех исследованных штаммов ЭПКП, ЭИКП и шигелл, однако его распределение и интенсивность окраски были различными. Характерное для инвазивных штаммов окрашивание давали только S- и R-формы ЭИКП и S. flexneri 2а. Содержание сиаловых кислот изучали в качестве возможного фактора вирулентности. Как предполагают, сиаловые кислоты бактериальных и эука-риотических клеток играют важную роль в обеспечении нх взаимодействия (Costerton J. W. et al., 1981; Schauer R. et al., 1984, 1985). Полученные данные свидетельствуют, что наибольшее количество этого плисахарида имеют R-формы S. flexneri 2а и Е. coli, а также авирулентная S-форма Е. coli. В поисках связи сиаловых кислот с капсулой были изучены кипяченые и автоклавнрованные бактериальные культуры. В первом случае количество полисахарида не изменялось, во втором — незначительно снижалось. Полученные результаты подтверждаются и сведениями о химической природе капсулярных полисахаридов эшерихий изученной 0124 серо-группы, не содержащих сиаловые кислоты (Борисов Л. Б., 1976; Ботвинко И. В., 1985). Наличие данного полисахарида у S. flexneri 2а, не имеющих капсулы (Тимаков В. Д. н со-авт., 1980), также свидетельствует о том, что сиаловые кислоты исследованных штаммов представляют собой самостоятельную структуру, больше всего похожую на глнкокаликс бактерий, поскольку прослеживается корреляция между

2—125 17

количеством сиаловых кислот и адгезивиостыо микробов. Это согласуется с данными ряда авторов, показавших, что важнейшей функцией гликокаликса является прикрепление микроорганизмов и образование микроколоний (Costertoin J. W. et al., 1981; Shauer R., 1985; Riehelle-Maurer E., Moureau Z., 1987; Ceri H. et al., 1988).

Влияние на бактерии факторов иммунной защиты организма хозяина. Выживание'бактерий в цельной крови и нормальной сыворотке крови человека различалось у всех исследованных штаммов. Через 30 мин. инкубации Е. coli VT 1240 и S. flexneri VT100 в нормальной сыворотке крови гибли в 1000 раз сильнее, чем в цельной крови человека. Исследование бактерии, находящиеся в R-фор-ме, и авирулентные S-формы в обеих средах выживали в 100—10 000 раз хуже, чем соответствующие вирулентные

5-формы. Взаимодействие бактерий с макрофа-гоподобными клетками линий P338-D1 и J774.1 показало, что лучше всего захватываются и перевариваются R-формы микроорганизмов. Более подверженными фагоцитозу оказались авирулентные S-формы. Полученные данные о взаимодействии S- и R-форм ЭИКП и шигелл с макрофагопо-добными линиями клеток соответствовали таковым при использовании культур перитонеальных макрофагов (Тима-ков В. Д. и соавг., 1979; Фрейдлин И. С. и соавт., 1979; Кириллова Ф. М. и соавт., 1988).

Особенности факторов изменчивости. Состав.ДНК изученных штаммов был характерным для представителей соответствующего рода микроорганизмов. Определение содержания минорных компонентов также не выявило существенных различий между исследованными штаммами ЭПКП и ЭИКП (S- и R-формами). В состав их ДНК обнаружены

6-метиламинопурин в количестве 0,41—0,39+0,07 и 5-метил-цитозин — 0,32—0,42+0,08. Это соответствует данным о стандартных штаммах Е. coli С (Rudner R. et al, 1965) и свидетельствует в пользу отсутствия у изученных штаммов нарушений мутабильности, рекомбинации и репарации, связанных с дефектами метилирования аденина и цитозина (Mari-nus M. G. 1987). Число однонитевых разрывов ДНК оказалось характерным для использованных штаммов показателем. На примере Е. coli VT1240 установлено, что по их количеству различаются штаммы с высокой и низкой частотой S-R-диссоциации — соответственно 4,9±0,96 и 38,0±1,6. ¡8

Наибольшее количество разрывов среди других исследованных штаммов имели S. flexneri 2а — 34,0±1,9, наименьшее—' S. soninei — 2,06±0,2. У эшерихий различных серогрупп больше всего однонитевых разрывов обнаружено в ДНК, Е. coli 0143 — 9,17±0,47. Диссоциация не сопровождалась изменениями состояния метаболизма ДНК, которое можно было бы зарегистрировать по числу однонитевых разрывов. Содержание в и е х р о м о с о м н ы х факторов наследстве и н о с т п. Все вирулентные штаммы ЭИКП н шигелл кроме 140 МД плазмиды патогенности содержали криптнческие плазмиды с небольшой молекулярной массой (1,5—5,0 МД). Эти данные согласуются с результатами, полученными рядом исследователей, также отмечавших наличие у инвазнвных штаммов криптических плазмид со сходной молекулярной массой (Sansonetti Р. J. et al., 1982; Watanabe Н., Nakamu-га А., 1985). Набор криптическнх плазмид различался у изученных штаммов микроорганизмов, относящихся к разным родам и серогруппам в пределах одного вида — Е. coli 0124 с высокой и низкой частотой S-R-персхода. Диссоциация штаммов Е. coli 0124, склонных к образованию R-форм, не сопровождалась изменениями количества и молекулярной массы критических плазмид. Часть исследованных штаммов Е. coli 0124 содержала умеренные бактериофаги. Согласно имеющимся данным, среди эшерихий этой серогруппыли-зогенные штаммы могут составлять до 79,6э/в (Бабков В. В., Ленц Э. К., 1973). Несущие профаг и лишенные его штаммьг бактерий имели практически идентичные показатели по всем изученным признакам, включая вирулентность. Спонтанная индукция бактериофагов у исследованных штаммов происходила с различной частотой. Диссоциация не сопровождалась утратой фага. Индукцию бактериофагов можно было вызвать УФ-облучепием. Частота возникновения споптан-пых мутаций антпбиотикоустойчивости у исследованных бактерий различалась на уровне штаммов. Мутации устойчивости к рифампицину у Е. coli 0143 возникали в 10 раз реже, чем у Е. coli 0124. Диссоциация не сопровождалась изменением частоты возникновения спонтанных мутаций. Сходный характер имели и данные о встречаемости антибнотнкоустой--чпвых мутантов. В целом у всех исследованных штаммов чаще всего возникали и встречались мутанты устойчивости к рифампицину, реже — к ампициллину и хлорамфепнколу. Частота возникновения спонтанных мутации у изученных па-

тогеиных энтеробактерий (1,2хЮ~7—1,5>< 10^9) находилась в диапазоне величин, характерных для описанных в литературе стандартных штаммов эшерихий (Миллер Д., 1976; Гершепзон С. М„ 1983; Echols Н. 1982). Частота S-R-дис-со ци а цни резко различалась у исследованных штаммов Е. coli ссрогруппы 0124. Вирулентные штаммы имели частоту S-R-перехода 1,0ХЮ-2—1,0ХЮ-4, что согласуется с имеющимися данными .(Борисов Л. Б., Воскресенский А. М., 1979), а авирулентный штамм, находящийся в S-форме, — 1,0ХЮ~8. С подобной интенсивностью происходила диссоциация и у других изученных штаммов эшерихий и шигелл. Исключение S-R-перехода, равную 1,0ХЮ~2—1,0X10-3 и определяемую, составляли только S. sonnei, имеющие высокую частоту как известно, дефектами или утратой 120 МД плазмиды па-тогеиностн (Sansonetti Р. J. et al., 1981), У Е. coli 0124 можно предположить существование различных механизмов, обеспечивающих диссоциацию: низкую частоту S-R-перехода, вероятно, обусловливают спонтанные мутации, высокая может быть связана с влиянием внехромосомных факторов. В пользу этого свидетельствуют полученные данные об увеличении выхода R-форм в условиях амплификации плазмид с небольшой молекулярной массой и различном их содержании у «высоко» и «низко» диссоциирующих штаммов Е. coli 0124. Связь высокой частоты S-R-днссоциацни с функциями внехромосомных факторов наследственности уже показана у некоторых микроорганизмов (Милютин В. Н. и соавт., 1981, 1982; Jones W. et al., 1974). Чувствительность к У Ф - о б л уч е н и ю в условиях, допускающих темповую репарацию, у патогенных энтеробактерий варьирует в довольно широком диапазоне. У бактерий одного вида Е. coli она различалась в 1000 и более раз. Все исследованные штаммы, выделенные от больных, выживали хуже, чем Е. coli АВ1157. В пределах одной серогруппы 0124 вирулентные S-формы разных штаммов имели одинаковую выживаемость после УФ-облучения. Чувствительность авирулентных S-форм к УФ-облученшо была выше в 10—15 раз. Наиболее устойчивыми оказались вирулентные штаммы Е. coli 0124 и S. sonnei. Диссоциация не сопровождалась изменением чувствительности бактерий к УФ-облучению. Для многих штаммов прослеживается четкая корреляция между числом однопитевых разрывов ДНК н чувствительностью к УФ-свету. У штаммов Е. coli серо-групп 0124 и 0111, имеющих практически равное число одного

питевых разрывов п различную УФ-чувствительность, последняя связана с динамикой ликвидации повреждении ДНК. Полученные данные позволяют считать, что в пределах одного вида существуют штаммы, различающиеся организацией систем поддержания метаболизма ДНК, и в частности ее темповой репарации. В пользу этого свидетельствуют также результаты изучения кофеинзависимых путей репарации. Величина сублетальной дозы кофеина для изученных патогенных штаммов колебалась от 0,5 до 4,0 мкг/мл. В присутствии кофеина различия в выживаемости УФ-облученных бактерий исчезали. Известно, что в число кофеинзависимых путей репарации входят процессы пострепликативнои и SOS-репарации (Жестяников В. Д., 1979; Oban Н. et al„ 1986).

В целом выполненные в этом разделе работы исследования позволил!! оценить свойства основных патогенных микроорганизмов в пределах выделенных серогрупп и выбрать штаммы, пригодные для дальнейшего изучения.

РОЛЬ ГЕНА гесА В ИЗМЕНЕНИИ СВОЙСТВ ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

Получение рекомбинантных штаммов бактерий, несущих дефектные гесА-гены, было необходимым условием для изучения участия SOS-системы в регуляции свойств патогенных микроорганизмов. Выбор гена гесА определялся данными о его ключевых регуляторкых функциях в SOS-ответе и распространении среди различных эу- и прокариотов (Лаи-~ цов В. А., 1985; D'Ari R., 1985; Markham D et al„ 1985; Walker G. C., 1986). Трансдукцией от донорских штаммов Е. coli были получены рекомбинанты ЭПКП, ЭИКП, S. flexneri 2а, Е. coli К-12 и AB 1157, у которых подавлены все основные SOS-функции (ген гесА56), а также те, у которых активация SOS-ответа зависит от температуры культивирования (ген гссА441). Рекомбинанты S. flexneri 2а получили гены гесА56 пли recA441 Е. coli. Рекомбинанты патогенных эшерихий н шигелл проявляли в фенотипе все признаки SOS-отвста, характерные для донорских штаммов.

Морфологическая и биохимическая характеристики реком-бинантов. По данным световой микроскопии, все рекомбинанты сохраняли строение, свойственное исходным реципиентным штаммам. При электронно-микроскопическом изучении установлено, что мутанты с генами гесАбб и гесА441 в коло-

ниях имеют повышенное содержание бактерий нитевидной формы. В ультраструктуре клеток наблюдаются неописанные ранее изменения цитоплазматической мембраны, характеризующиеся появлением инвагинаций и мультиламелярных структур. В пользу влияния продукта гена гесА на мембраны свидетельствуют данные биохимического исследования (Gar-vcy N. et al., 1985; Tessman E. S., Peterson P., 1985). Все дефектные по гену гесА штаммы содержали повышенное количество везикулярных частиц, окруженных элементарной мембраной. Сходные глобулярные частицы описаны у ряда грамотрицательных микроорганизмов (Решилов Л. Н. и соавт., 1983; Chen L. et al., 1988).

Биохимическая активность и характер роста рекомбинантов на различных плотных и жидких питательных средах практически не изменялись, чувствительность к основным использованным антибиотикам также сохранялась.

Антигенность и иммуногенность не изменялись. В развернутой реакции рекомбинанты агглютинировались сыворотками в том же титре, что и соответствующие им исходные штаммы. Сыворотки, полученные при иммунизации кроликов исходными рекомбинантными штаммами, имели практически одинаковый тигр антител. Сохранение антигенной структуры рекомбинантов подтверждено в перекрестном истощении сывороток, полученных к различным рекомбинантам и исходным штаммам Е. coli VT1240 и S. flexneri VT 100.

Оценка вирулентности рекомбинантов проводилась с использованием тех же тестов, что и у исходных диких штаммов. Полученные данные свидетельствуют, что повреждение гена гесА влияет на вирулентность исследованных штаммов. Минимальные изменения отмечены у рекомбинантов ЭПКП, ЭИКП и шигелл с геном гесА441. На модели клеток HeLa установлено, что они сохраняют адгезивность, пенетрацион-ную активность, размножаются внутри клеток и переходят между контактирующими клетками. Рекомбинанты ЭПКП сохраняют прежние величины LDso, ЭИКП и S. flexneri 2а вызывают контактный гемолиз эритроцитов и кератоконъюнк-тпвит в глазу морской свинки, а также продуцируют энтеро-токенп. Среди других свойств изученных штаммов следует отметить повышенное содержание у рекомбинантов с геном гесА441 сиаловых кислот. Учитывая наличие у данных микроорганизмов сохраненной антигенной структуры, можно считать, что они несут все основные гены патогенное™, рас-

положенные как в плазмиде, так и в хромосоме. Исключение составил штамм Б. coli VT3251 серогруппы 0124, не вызывающий кератокоиъюнктивит в глазу морской свинки и неспособный к распространению между контактирующими клетками HeLa. Известно, что за этот признак отвечает ген virG, расположенный в плазмиде патогенности (Makino S. et а 1., 1986; Lett М. С. et al., 1989). Подтверждением того, что бактерии штамма Е. coli VT3251 имеют дефект гена virG, служит некоторое изменение их морфологии. Размножаясь внутри клеток, они приобретали сферическую форму, что характерно для virG-мутантов (Makino S. et al., 1986).

Патогенные эшерихии и шнгеллы с геном гесАБб имеют сниженную вирулентность. Изменение этого признака у гесА-дефектных штаммов показано также у V. cholerae и И. infulenzae (Goldberg I., Mekalanos J. J., 1986; Hoiseth S. K. et al., 1986) и, предположительно, может существовать у N. gonorrhoeae (Koomely M. et al., 1987). Среди всех полученных нами рекомбинантов только 2 штамма — S. flexneri VT220 н VT222. — вызывали кератокоиъюнктивит в глазу морской свинки (на 4—5 день). При этом сам инфекционный процесс был менее выражен. Бактерии большинства штаммов с геном гесА56 лучше прилипали к клеткам HeLa. Так, для Е. coli VT2240 ИА составлял 100, а для S. flexneri VT207— 98,0±1,0. Это увеличение адгезивности коррелировало с повышенным содержанием у бактерий данных штаммов спало-вых кислот. Пенетрацнонная активность рекомбинантов, а также их способность размножаться внутри клеток и переходить между контактирующими клетками не изменялись. Все гесА~-штаммы вызывали контактный гемолиз эритроцитов, находились в S-форме, сохраняли О-антиген и энтеротоксич-ность в использованном тесте. Таким образом, при наличии основных генов патогенности, расположенных в хромосоме и плазмиде, гесА~-штаммы тем не менее не обладают видимой активностью в модельных инфекционных процессах на лабораторных животных.

Характер чувствительности рекомбинантов к действию факторов иммунной защиты организма хозяина в значительной степени может объяснить особенности проявления вирулентности рекомбинантов с геном гесА56. В ы ж и в а е м о с т ь в дельной крови и нормальной сыворотке крови человека этих штаммов была снижена в 100—1000 раз. Комплемент и фактор В среди изученных штаммов наиболее

интенсивно расходовали Е. coli 0124 с геном гесА56 (штамм VT2240), которые были и наиболее чувствительны к бактерицидному действию сыворотки крови. В то же время реком-бинанты с геном гесА441 сохраняли в этих условиях жизнеспособность на достаточно высоком уровне. Взаимодействие с м а кр о ф а г о и о д о б н ы м и клетками сопровождалось повышенным поглощением рекомбинантов с геном гесА56 и гесА441, однако мутанты с геном гесА441 сохраняли устойчивость к инактивации внутри клеток, свойственную диким штаммам, в то время как несущие ген гесА56 — имели низкую выживаемость в данных условиях. Исходя из полученных результатов, можно предположить, что снижение вирулентности у штаммов с геном гесА56 обусловлено резким уменьшением их устойчивости при взаимодействии с факторами иммунной защиты организма хозяина.

Полученные данные позволяют считать, что у патогенных Е. coli серогрупп 0111, 0124, 0143 и S. flexneri 2а существуют гены гесА, подобные таковым у Е. coli К-12. Установлено, что эти бактерии с геном гесА56 имеют сниженную вирулентность при сохранении антигенной структуры и иммуноген-ности. Распространение гена гесА среди различных микроорганизмов свидетельствует, что его замена на дефектный, типа гесА56, может стать универсальным дополнительным методом, который наряду с существующими целесообразно использовать для снижения вирулентности патогенных энтеро-бактерий при создании вакцинных штаммов. На один из рекомбинантов Е. coli 0124 с геном гесА56, с успехом использованный для получения диагностических сывороток, получено авторское свидетельство на изобретение (Тец В. В., 1986).

Особенности изменчивости бактерий с дефектным геном гесА проявлялись в повышении у гесА56-мутантов чувствительности к УФ-облучению в 10000 раз и изменении частоты возникновения антибиотикоустойчивых мутантов. У рекомбинантов с геном гесА441 подобные изменения отсутствовали. Это согласуется с данными литературы о роли SOS-системы в возникновении мутаций (Walker G. С., 1984; Nohrni Т. et al., 1988). Бактерии с геном гесА441 имели повышенную частоту S-R-диссоциации.

Внехромосомные факторы наследственности рекомбинантов по своему составу не отличались от таковых у исходных диких штаммов. На примере лизогенного штамма Е. coli VT1240 установлено, что у гесА56-мутантов имеется десяти-24

кратное снижение содержания фага в среде. Повышение же активности RccA-белка у штамма Е. coli с геном гесА441 при 37° С увеличивает выход фаговых частиц в 10 раз. Аналогичное изменение содержание фага X в среде получено и у дефектных по гену гесА441 Е. coli К-12А,. Это согласуется с данными о роли гена гесА в индукции, фага К и свидетельствует, что образование фага у Е. coli 0124 также может контролироваться генами SOS-системы.

РОЛЬ ТЕМПЕРАТУРЫ В ИЗМЕНЕНИИ СВОЙСТВ ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

Получение рекомбинантных штаммов бактерии, несущих дефектный htpR-ген, осуществляли тем же способом, что и при изучении SOS-системы. Ген htpR(rpoH) был выбран, исходя из того, что он, подобно гену гесА в SOS-ответе, является положительным регулятором, контролирующим активацию других генов системы теплового шока (ТШ) (Neidhardt F. et al., 1983). Кроме того, htpR-ген можно считать одним из наиболее изученных в системе ТШ. Его распространенность показана среди большинства эукариотов и некоторых прокариотов (Войников В. К., Иванова Г. Г., 1988; Gottesman S., Neidhardt F., 1983; Pelham H. R. В., 1986; Paek K.-H., Walker G. С., 1987). В результате трансдукции от Е. coli МС4100 впервые были получены штаммы S. flexneri VT 1509 и VT 1510 с геном htpR15, которые по отношению к температуре проявляли свойства, присущие донорскому штамму Е. coli.

Морфофункциональные особенности нормальных и дефектных по гену htpR штаммов, выращенных при разных температурах. Строение нормальных и дефектных по htpR-ген у штаммов S. flexneri и Е. coli, выращенных при 30° С, согласно данным электронной микроскопии, было характерным для грамотрицательных палочек соответствующего рода и вида. У htpR-дефектных штаммов некоторые морфологические особенности отмечались после выращивания при 37° С. Значительная часть (44%) бактерий при этом содержала некристаллические гранулы, описанные у ряда микроорганизмов-мезофилов, прогретых при температуре 53°С (Mulks М. Н. et al., 1980). Некристаллические гранулы описаны также в клетках эукариотов, имеющих дефекты в генах-регуляторах системы ТШ (Pelham Н. R. В., 1986).

Для сравнения: шигеллы исходного штамма VT100, выращенные при 37° С, не содержали, подобных гранул, а при 42° С их можно было обнаружить только в 3,5% клеток. Таким образом, дефект гена htpR сдвигает температурный максимум, при котором возможно существование изученных энтеробактерий. При 37° С они ведут себя подобно интактным по гену htpR, выращенным при температуре около 50° С. Это подтверждает данные о необходимости функционирования гена htpR у бак-терий-мезофилов при температурах выше 35°С (Yura Т. et al., 1984; Zhou Y.-N, et al., 1988). Другим важным аспектом действия гена htpR является его влияние на скорость формирования микробных колоний. У рекомбинантов, инкубируемых при 37° С, через 24 ч колония покрывается толстой пленкой, более выраженной, чем у иптактных штаммов через 48 ч роста. К числу морфологических особенностей колоний бактерий с геном htpR15 следует отнести повышенное содерл<ание в них мембранных везикул, сливающихся с поверхностной пленкой. Раньше по времени у htpR_-6aKTepnii наступает н гибель клеток в колониях. Через 48 ч в иЗс центре уже имеется большое число деструктурированных микроорганизмов, в то время как у интактных штаммов последние начинают появляться на 3—5 сутки роста. Усиленное образование поверхностной пленки на колониях htpR-мутантой согласуется с данными о повышенной продукции экзололисахаридов штаммами энтеробактерий, имеющими повреждения в генах системы ТШ (Trisler P., Gottesman S., 1984; Maurizi М. R. et al., 1985). За счет ускоренного формирования толстой поверхностной пленки и капсулоподобных оболочек клеток в колониях у htpR-дефектных штаммов возникают выраженные диффузионные градиенты для питательных веществ и метаболитов, влияющие, как установлено, на скорость развития различных многоклеточных систем (Гудвин Б., 1979).

Биохимическая активность и агглютина-бельность в О-сыворотке бактерий с неповрежденным htpR-геном, выращенных при различных температурах (18— 20°С, ЗСГС, 37°С и 42°С), практически не различались. В зависимости от температуры менялась частота возникновения спонтанных мутаций устойчивости к антимикробным препаратам. В пределах использованных температур у изученного штамма максимальное количество мутантов возникало при 37°С. Частота S-R-диссоцнации у бактерий при разных температурах практически не изменялась.

Вирулентность изученных штаммов зависела от температуры культивирования. Можно проследить индивидуальный характер изменений-составляющих ее факторов. Адгезив-иость вирулентных штаммов, находящихся в S-форме, увеличивалась при переходе от 18—20°С к 42°С. Для Е. coli VT100 ИА при 18—20°С составлял соответственно 16,0+0,8 и 10,0rfc0,4, а при 42°С — 86,0+3,4 и 70,1+3,0. Увеличивалась, хотя и менее выраженно, в этом диапазоне температур адге-зивность R-форм и гесА~-штаммов. Адгезия авирулентных Е. coli VT ¡248, находящихся в S-форме, возрастала при переходе от 18—20°С к 37°С п снижалась при 42'С. ИА были соответственно равны 50,5+0,9; 96,0+2,0 и 61,5+3,1. Максимальная адгезивность htpR-мутантов зарегистрирована при 30°С. Содержание сиаловых кислот у штаммов с нормальными гесА- и htpR-генами возрастало в 20—90 раз при повышении температуры от 18—20°С до 37°С и - вновь падало при 42°С. Бактерии с дефектом гена гесА при комнатной температуре имели повышенное количество сиаловых кислот, которое незначительно возрастало при 37°С. У шигелл и эшерихий с геном htpR15 Е. coli наибольшее количество данного полисахарида можно обнаружить после культивирования при 30°С. Примерно одинаковое его количество связано с клетками htpR-дефектных штаммов, выращенных при 18— 20°С и 37°С. Увеличение содержания сиаловых кислот у всех исследованных штаммов сопровождалось возрастанием их адгезивности. И ив а з ив н ость изученных вирулентных штаммов с неизмененными генами гесА и litpR, находящихся в S-форме, была зарегистрирована при 37°С и отсутствовала после культивирования при 18—20°С. Установлено также, что иивазивность утрачивалась у этих бактерий и при 42°С — температуре активации системы ТШ. S-R-диссоциация и замена гена гесА на гесА441 сопровождались проявлением инвазив-ности у бактерий, выращенных при комнатной температуре. П с Ii е т р а ц и о и и а я активность микроорганизмов также чутко реагировала на изменения температуры культивирования. В диапазоне от 18—20°С до 42°С пенетрационная активность у исследованных интактных штаммов изменялась дважды: появлялась при 37°С и исчезала при 42°С. Эшерихии и шигеллы с геном гесА56 в незначительном количестве проникали в клетки после культивирования при 42°С, а с геном гесА441 — при 18—20 С. Бактерии с дефектным геном htpR при комнатной температуре сохраняли минимальную пепетра-

ционную активность. Максимальные значения последней зарегистрированы у S. flexneri с геном htpR 15 (штамм VT1510), выращенных при 30°С.,В целом совпали между собой результаты изучения у исследованных штаммов изменений нн-вазивностн и способности проникать в эпителиальные клетки. Это свидетельствует в пользу того, что именно с дефектом иенетрационной активности связана у исследованных штаммов утрата вирулентности при 18—20°С и 42СС. Подобные данные для ЭИКП и шигелл, выращенных при разных температурах, получены и другими авторами (Maurelii А. Т. et al., 1984; Hale T. L. et al., 1985; Oaks E. V. et al., 1985; Maurelii A. T., Sansonetti P. J., 1988). Рекомбинанты шигелл с геном htpR 15 E. coli максимальную пенетрационную активность проявляли при 30°С. Выращенные как при 30°С, так и при 37.ЭС они сохраняли все факторы вирулентности, в том числе и способность вызывать кератоконъюнктивит в глазу морской свинки. Такой фенотип у шигелл подобен описанному ранее VirR-, возникающему при повреждении гена virR. Вместе с тем полученные нами данные подтверждают представление о том, что htpR и virR-гены не идентичны (Gô-ransson M U., Uhlih В. E., 1984; Maurelii A. T., Sansonetti P. J. 1988; Gôransson M. U. et al., 1989). Дефекты генз recA также влияли на зависимость изменений вирулентности бактерий от температуры их культивирования.

Взаимодействие с факторами иммунной защиты бактерий с дефектом гена htpR показало, что они хуже, чем исходные дикие штаммы, выживают в цельной крови и нормальной сыворотке крови человека, а также меньше захватываются мак-рофагоподобными клетками. Чувствительность мутантов к инактивации внутри клеток при этом статистически значимо не изменялась. Взаимодействие с фагоцитирующими клетками нормальных и дефектных по гесА и htpR-генам микроорганизмов, выращенных при разных температурах, отличий не имело.

В целом полученные данные свидетельствуют, что система ТШ задействована в реализации важнейших свойств изученных патогенных энтеробактерий: их строении, организации колоний, старении, вирулентности и изменчивости.

ИЗМЕНЧИВОСТЬ ПОПУЛЯЦИИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ С НОРМАЛЬНЫМ И ДЕФЕКТНЫМ ГЕНОМ гесА

Гетерогенность микробных популяций по способности бактерий к активации SOS-ответа была изучена на клеточно-популяционном уровне, при этом основное внимание уделялось анализу сохранения и изменения данного признака. Исследования проводились с использованием периодического культивирования, позволяющего создавать условия соответствия микробной популяции среде обитания, а также состояние перестройки этого соответствия (Печуркин Н. С., 1978; Работнова И. И. и соавг., 1981; Гуревич Ю. Л., 1984). Образование нитевидных форм, превосходящих по размеру нормальные бактерии в 5—10 и более раз, является одним из косвенных фепотипнческих признаков ранней активации SOS-ответа. При использовании световой и электронной микроскопии установлено, что наибольшее количество нитевидных форм у Е, coli 0124 и Е. coli К-12 с неповрежденным гесА-гепом наблюдалось в фазы ускорения и замедления роста. Для Е. coli VT1240 оно составило соответственно 4,5±0,Зэ/о н 4,7±0,3%. Количество нитевидных форм нарастало скачкообразно. Столь же резко происходило и их исчезновение из популяции. Персистенцни нитевидных клеток не наблюдалось У Ё. coli VT2240, лишенных нормального белка RccA, увеличение содержания нитевидных форм наблюдалось только в фазу ускорения роста. Штамм Е. coli К-12, лизогенный по фагу X, образовывал нитевидные клетки в небольшом количестве также только при переходе к логарифмическому росту. Количество нитевидных форм на разных фазах роста у каждого из изученных штаммов в различных опытах оставалось достаточно постоянным, что свидетельствует о поддержании в популяции определенного уровня гетерогенности по данному признаку. Индукция умеренного фага Я, находящаяся под контролем SOS-системы, свидетельствует о глубокой активации последней (Devoret R., 1981; Brennt R., 1982). В использованных условиях количество фаговых частиц увеличивалось при переходе бактерий к стационарному росту более чем в 10 раз. Штаммы Е. coli К-12А, несущие ген гесА56, имели повышенный уровень индукции фага Я. Увеличения выхода фаговых частиц на различных фазах роста не наблюдалось. Прямое измерение активности генов гесА и sulA проводили у штаммов Е. coli GC2378 и

GC4415, несущих ген lacZ, кодирующий синтез ß-галактозида-зы под контролем промоторов генов соответственно гесА и sulA. Относительное увеличение содержания продуктов генов гесА и sulA наблюдалось в фазу замедления размножения этих бактерий. Таким образом, полностью совпали между собой по времени образование нитевидных форм, индукция фага X и максимальная относительная активность генов гесА и sulA. Полученные нами результаты соответствуют данным о возрастании активности гесА и 1ехА-зависимых функций SOS-ответа при переходе бактерий к стационарному росту (Dharmalingam К., Goldberg Е„ 1980; Little J. W., Mount D. \V„ 1982; Karu A. E., Belk E. D., 1982). Формирование нитевидных форм в фазу ускорения роста происходит, очевидно, за счет системы, которая препятствует делению клетки и, как предполагается, не активируется RecA-белком (Jaffe А., D'Ari R., 1985). Штаммы бактерий с геном гесА56 при переходе к стационарному росту не замедляют существенно скорости своего размножения. Это может свидетельствовать о том, что изменения активности гена гесА при периодическом культивировании требуются для адаптации популяции к изменяющимся условиям окружающей среды.

Чувствительность к факторам внешней среды и вирулентность бактерий на разных фазах роста были изучены на це-лостно-популяцнонном уровне. Установлено, что при периодическом культивировании изменяется чувствительность изученных штаммов к У Ф - о б л у ч е н и ю. Минимальные ее значения наблюдались у экспоненциально растущих микроорганизмов, а максимальные — в стационарной фазе роста. Так, УФ-чувствительность при дозе 30—40Дж/м2 различалась на этих фазах у Е. coli VT 1240 в 1000 раз, а у S. flexneri VT100 — в 50—100 раз. Все мутанты с геном гесА56, имеющие резко сниженную устойчивость к УФ-облу-чению, теряли способность изменять ее на разных фазах роста. Бактерии с геном гесА441 сохраняли такую способность, если до облучения выращивались при температуре 30°С. Полученные результаты соответствуют данным о повышении устойчивости к УФ-облучению при увеличении в клетке количества RecA-белка (Moreau Р. L. et al., 1982; Quillardet P. et al., 1982). Это свидетельствует о возможной связи изменения УФ-чувствительностп бактерий при периодическом культивировании с функциями гена гесА. Вирулентность бактерий также изменялась на различных фазах роста. По 30

данным кератоконъюнктизальной пробы Шереня, минимальная заражающая доза зарегистрирована в фазе замедления размножения и составила для Е. coli VT1240 (0,9±0,08) X Ю8 против (1,I7±0,08) ХЮ8 — у экспоненциально растущей и (6,5±1,03)Х 108 — у культуры в ранней стационарной фазе. В фазу замедления размножения бактерии имели и наибольшую пенетрационную активность. В этот же период микроорганизмы проявляли максимальную инвазивность и содержали наибольшее количество сиаловых кислот. Таким образом, у наследованных штаммов бактерий при периодическом культивировании наблюдается корреляция между моментом проявления максимальной вирулентности и активацией некоторых генов SOS-системы.

Изменчивость бактерий в ходе экспериментального инфекционного процесса была изучена на модели кератоконъюнкти-вальной пробы Шереня. Полученные данные свидетельствуют, что к концу второй недели инфекционного процесса, вызванного Е. coli 0124, происходило скачкообразное увеличение количества выделяемых мутантов устойчивости к произвольно выбранному антибиотику (рифампицину). При этом наблюдалось изменение антигенной структуры возбудителя, которое сопровождалось появлением и селекцией в глазу животного неагглютинирующихся форм Е. coli. Увеличение интенсивности изменчивости происходило в сроки, характерные для нарастания активности факторов специфической защиты в организме зараженного животного. Выявленный у патогенных эшерихий феномен индукции мутагенеза in vivo согласуется с данными о возникновении различных наследственных изменений в ответ на экстремальные воздействия на организм. Последний, как установлено, реагирует резким повышением своей мутабельности (Беляев Д. К., 1979; Лабас Ю. А., Крылов А. М„ 1983; Сапунов В. Б., 1983; Brown M. R. W., Williams P., 1985). Механизм такой изменчивости может быть связан с индуцибельным SOS-ответом (D'Arí R., 1985; Walker G. С., 1987).

Влияние антимикробных препаратов на изменчивость бактерий было изучено при кратковременном воздействии инги-бирующих концентрации и длительном — субингибирующнх. Объектом анализа служили представители ЭИКП и S. flcx-neri 2а. Антимикробные препараты выбирали с учетом данных ряда работ о современных методах лечения инфекций, вызываемых этими бактериями (Шувалова Е. П., 1976; De Mol P.

et al., 1987; Jewcs L. A„ 1987). Вирулентность и yc-тойчивость бактерий к факторам иммунной защиты изменялись в присутствии субингибирующих концентраций большинства использованных антимикробных препаратов. Адгезию усиливали налидиксовая кислота и хлорам-феникол, угнетали — тетрациклин и рифампицин. Усиление адгезии в присутствии налидиксовой кислоты показано ранее для некоторых штаммов Е. coli (Vosbeck К., 1982). Пенетра-ционная активность повышалась в присутствии всех исследованных препаратов, кроме тетрациклина. На внутриклеточное размножение использованные антимикробные средства не влияли. В присутствии тетрациклина и хлорамфеникола в первые 1,5 ч инкубации увеличивалась выживаемость бактерий в нормальной сыворотке крови человека. Микроорганизмы, выращенные в среде с рифампнцином и тетрациклином, лучше поглощались фагоцитирующими клетками. Противоположный эффект вызывали налидиксовая кислота и хлора мфеиикол. Налидиксовая кислота в ингибнрующей концентрации при кратковременном воздействии вызывала те же эффекты, что и в субингибирующей при длительном. Хорошо коррелировало с изменениями адгезивности бактерий содержание у них сиаловых кислот. Количество последних увеличивалось после кратковременного воздействия налидиксовой кислоты и хлорамфеникола и уменьшалось после контакта с тетрациклином и рифампнцином. Влияние субингибирующих концентраций антимикробных препаратов на изменчивость микробов проявлялось как в уменьшении, так и в увеличении частоты возникновения мутаций устойчивости к рифам-пицину и ампициллину. Частота S-R-диссоциации при этом не изменялась.

Одним из возможных путей влияния антимикробных препаратов на частоту возникновения мутаций является активация SOS-системы. Полученные данные свидетельствуют, что налидиксовая кислота и хлорамфеникол при кратковременном воздействии ингибирующих концентраций активировали гены recA, sulA и вызывали продукцию фага К, а в субингибирующих — ген гесА и синтез фага. Тетрациклин индуцировал SOS-ответ в меньшей степени. Налидиксовая кислота является известным активатором SOS-ответа (Walker G. С., 1984). Для других исследованных препаратов подобное свойство не описано. Влияние антибиотиков на выживаемость патогенных энтеробактерий, имеющих поврежде-32

ння ДНК, было изучено на модели УФ-облученных бактерий. Установлено, что в присутствии хлорамфеникола выживаемость Е. coli после УФ-облучения не меняется. В тех же условиях у авирулентных Е. coli VT1248 она значительно снижена. В присутствии рифампицина большинство исследованных штаммов после УФ-облучения гибли сильнее. Это согласуется с данными об особенностях действия рифампицина на метаболизм ДНК бактерий (Като Т., Шиноура Ю., 1981). Наиболее устойчивыми к действию антибиотиков в этих же условиях оказались использованные вирулентные штаммы Е. coli 0124 и S. sonnei. Усиление действия антибиотиков наблюдалось при блоке кофеннзависимых путей репарации. Снижение МПК антибиотиков происходило в присутствии субинги-бирующих концентраций кофеина. Выявленный эффект может быть использован в лабораторной практике (Тсц В. В. и соавт., 1989).

Подводя общий итог проведенному исследованию, можно заключить, что среди изученных штаммов патогенных энтеро-бактерий в пределах одного внда существует большая гетерогенность по наличию факторов вирулентности, мутабель-ности, распространенности внехромосомных факторов наследственности, чувствительности к внешним воздействиям и некоторым другим признакам. В колониях микроорганизмы проявляют ряд свойств, позволяющих им выступать в качестве целостной системы, имеющей элементы специализации среди составляющих ее клеток. У патогенных энтеробактерий в изменении вирулентности и ряда других важных для практической медицины свойств принимают участие системы ТШ и SOS-ответа. Регуляторные гены этих систем сходны у, патогенных и стандартных изученных штаммов Е. coli и S. Яех-neri 2а. В качестве активаторов данных систем могут выступать различные факторы внешней среды, в том числе и некоторые антимикробные препараты.

ВЫВОДЫ

1. Изученные штаммы патогенных энтеробактерий, выделенные от больных, обладают .морфологическими, биохимическими и серологическими свойствами, а также составом ДНК, характерными для соответствующего вида и серогруппы. В пределах одного вида Е. coli обнаружено большое разнообразие в распространении внехромосомных факторов наследственности, частоте возникновения спонтанных мутаций и

3—125 " 33

S-R-диссоциации, целостности молекулы ДНК и чувствительности к УФ-облучешпо. Последняя у Е. coli серогрупп 0143 и 0124 различается на 2—3 порядка. Наиболее устойчивыми к УФ-облучешпо среди изученных патогенных бактерий являются вирулентные штаммы Е. coli 0124 и S. sonnei, имеющие высокую частоту S-R-диссоциации.

2. Среди изученных штаммов Е. coli 0124, находящихся в S-форме, существуют вирулентные и авирулентные штаммы. Бактерии, относящиеся к последним, отличаются частотой S-R-диссоциации, числом однонитевых разрывов ДНК, чувствительностью к УФ-облучению, содержащимися плазмидами, адгезивностыо, характером изменений адгезии при повышении температуры до 423С и наличием жгутиков.

3. Патогенные штаммы изученных энтероинвазивных кишечных палочек и шигелл обладают рядом факторов вирулентности, включая адгезивность, пенетрационную активность, способность к размножению внутри клеток, переход между контактирующими клетками, наличие полноценного ЛПС-слоя клеточной стенки и энтеротоксичность. Комбинации указанных признаков обусловливают активность изученных штаммов в биопробах. Штаммы энтеропатогенных кишечных палочек вызывают гибель зараженных животных, имеют полноценный ЛПС-слой клеточной стенки. У бактерий всех видов, включая S. flexneri 2а, обнаружены связанные с клеточной стенкой сиаловые кислоты. Количество последних коррелирует с активностью процесса адгезии бактерий. Вирулентные штаммы Е. coli 0124, переходя в R-форму, могут сохранять многие факторы вирулентности — способность к проникновению в эпителиальные клетки, размножению в них и переходу между контактирующими клетками — и обладать повышенной адгезивностыо и увеличенным содержанием сиаловых кислот.

4. В колониях грамотрицательных бактерий родов Escherichia, Shigella и Salmonella наблюдается образование двух типов межклеточных контактов — плотное слипание наружных мембран и мембранные перемычки, имеющие внутри канал. Колония как кооперативная клеточная система отграничивается от внешней среды за счет поверхностной пленки и капсулоподобной оболочки у бактерий 3—5 поверхностных слоев. Микроорганизмы, находящиеся внутри такой системы, имеют повышенную выживаемость в присутствии антибиотиков.

5. На изменения важных для медицинской микробиологии :ьойств патогенных энтеробакгерип влияет ген гесА —• акти-!атор синтеза белков SOS-системы. У патогенных Е. coli се-югрупп 0111, 0124, 0143 и S. flexneri 2а возможна замена собственного гена гесА на его дефектные варианты — гесА56 i гесА441, переданные фагом PI от Е. coli К-12. Полученные зекомбинанты с геном гесА56 имеют резко сниженную виру-leiiTHOcTb при сохранении основных генов патогенности, ан-TireiiOB и иммуногенности. Эти бактерии лишены возможности восстанавливать поврежденный ген за счет законной рекомбинации. Передача гена гесА56 может быть использована как универсальный дополнительный метод при создании вакцинных штаммов. Патогенные Е. coli и S. flexneri 2а, имеющие только замену гена гесА па гесА56 от Е. coli К-12, не вызы-5 а ют гибели животных при иммунизации и могут быть исполь-юваны с целью получения диагностических сывороток.

6. Для моделирования in vitro некоторых состояний попу-тяций бактерий, возникающих in vivo, в том числе в ходе шфекционного процесса, и изучения механизмов изменчивости бактерий может быть использована периодическая микробная культура. При периодическом культивировании f Е. coli изменяются активность факторов вирулентности и генов SOS-системы, число однонитевых разрывов ДНК и чувствительность к УФ-облучепшо. Нормальные перестройки з бактериальных популяциях при периодическом культивиро-заннн связаны с функциями положительного регулятора 50S-OTBCTa — гена гесА. У бактерий, несущих дефектный ген гесА56, на разных фазах роста нарушено изменение скорости роста, чувствительности к УФ-облучению, адгезивности, количества связанных с клеткой сиаловых кислот.

7. В ходе экспериментального инфекционного процесса, зыззанного Е. coli 0124, наблюдается повышение интенсивности изменчивости возбудителя. Последнее регистрируется по скачкообразно возросшему выделению мутантов устойчивых к антибиотику рифампицину, а также по появлению и селекции в глазу морской свинки неагглютинирующихся форм Е. coli, по остальным признакам идентичных Е. coli 0124.

8. Изученные штаммы ЭИКП и S. flexneri 2а имеют как минимум два уровня температурной регуляции вирулентности. Первый функционирует при изменении температуры с 18°С до 37°С, второй — с 37°С до 42°С. В последнем случае у вирулентных штаммов усиливается адгезивность и резко снижает-

5* 35

ся пенсгра циопная активность. Все изменения факторов вирулентности имеют обратимый характер.

9. Изменения вирулентности бактерий изученного штамма S. flexneri 2а, выращенных при разных температурах, зависят от функций гена htpR—активатора системы теплового шока Возможна передача гена htpR15 от Е. coli к S. flexneri 2а Полученные рекомбинанты имеют HtpR~^eHOTiin, присущий донорскому штамму: продуцируют избыток полисахаридов, образуют нитевидные клетки, не растут при 423С. В htpR-де-фектных клетках Е. coli и S. flexneri 2а, как и у аналогичных мутантов эукариотов, при 37°С накапливаются некристаллические гранулы, в колониях наблюдается ускоренное старение клеток. Патогенные S. flexneri 2а с геном hlpR 15 максимальную вирулентность проявляют при 30°С и сохраняют ее при 18—20°С.

10. Антимикробные препараты, не будучи мутагенами, могут способствовать изменчивости бактерий. Тетрациклин, хлорамфеникол и налидиксовая кислота способны вызывать у Е. coli частичную или полную активацию SOS-системы, участвующей в регуляции изменчивости бактерий. Индукция SOS-ответа более выражена при кратковременном воздействии на бактерии ингибирующих концентраций этих препаратов. На фоне угнетения кофеинзависимых путей репарации ДНК наблюдается снижение минимальных подавляющих концентраций различных антибиотиков.

11. Антимикробные препараты влияют на вирулентность бактерий и их чувствительность к повреждающим факторам внешней среды. В субингибирующих концентрациях рифам-пицин и тетрациклин угнетают адгезивность и пенетрацион-ную активность изученных штаммов, увеличивают их выживаемость в нормальной сыворотке крови человека и угнетают фагоцитоз. Налидиксовая кислота и хлорамфеникол увеличивают выраженность всех перечисленных факторов. В результате кратковременного воздействия ингибирующих концентраций налиднксовой кислоты и хлорамфеникола также происходит усиление адгезии и пенетрации. Хлорамфеникол и рифампицин снижают выживаемость после УФ-облучения большинства изученных штаммов бактерий. Наибольший эффект наблюдается при использовании . рифампицина. Вирулентные штаммы Е. coli 0124 и S. sonnei в присутствии хлорамфеникола после УФ-облучения свою выживаемость практически не изменяют.

12. У изученных штаммов эптеропатогсиных и энтероин-вазивных кишечных палочек и шигелл выраженность и изменения некоторых морфологических и физиологических признаков, в том числе различных факторов вирулентности, связаны с регуляториыми функциями систем теплового шока и БОБ-ответа. Активация и угнетение этих систем необходимы для нормальной адаптации патогенных бактерий к условиям внешней среды. Ингибиторами и активаторами этих систем могут являться различные лечебные и антимикробные препараты.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение пурнновых и пнрнмндиновых оснований, входящих о состав РНК п ДНК., с помощью газожндкостнон хроматографип//Вопр. мед. .химии,—1979,—ЛЪ 5.—С. 585—589.

2. Газохроматографнческнй анализ пуриновых и пиримндниопых ос-цовапнй/'/Научно-лрактическая конференция молодых специалистов учреждений здравоохранения Ленинграда.—Л., 1979.—С. 71—72.

3. Использование масс-фрагмемтографин для анализа азотистых ос-(юнапни, входящих в состав ДНК//'Вопр. мед. химии.—1980.—Дел. г, ВИНИТИ, № 5247.

4. Газохроматографнческнй анализ нуклеиновых кислот/'/Успехи химии,—1980,—Т. 49.—№ 5. — С. 931—944.

5. Масс-фраг.чептографическнй анализ ДНК//'Деп. в ВИНИТИ, № 3867.—19»!.

6. Минорные компоненты ДНК энтсропатогснных кишечных палочек //Вопросы иммунологии и молекулярной биолопш.—Нальчик, 1981.— С. 48—49.

7. Определение целостности генома эптеропатогсиных бактерии с использованием флуоресцентной индикации/С. Д. Иванов//Количествеш1ый люминесцентный анализ многокомпонентных систем биологически активных вещестн.—Ташкент, 1982.—С. 78—79.

8. Два механизма проницаемости этидиума бромида в люминесцентном анализе интактных бактериальных клеток/С, Ф. Савельев, Л. М. Алек-спн/'/Там же.—С. 60—62.

9. Изменение структурной целостности генома энтеропатогенных бактерии после УФ-облучеипя/С. Д. Иванов//Матерналы Всесоюзного биофизического съезда—"М.. 1982.—Т. 11. — С. 307.

10. Способ изготовления стоматологических конструкций из алюминия н его сплавов/К. А. Макарон, И. А. Кравцова, И. В. Сармипа, М. М. Соловьев, Г. А. Хацкевнч,—Авт. свид. № 942734 от 16.03.82.

11. Молекулярно-генетическне механизмы адаптации микробных популяций в свете теории саморегуляции эпидемического нроцесса/Г. Д. Ка-мпнский/УВестц. АМН СССР.—1983.—Л1» 5,—С. 9—17.

12. Кринтические плазмиды энтеропатогенных кишечных палочек /Е. И. Кацер//Актуальиыс вопросы иммунологии, аллергологии н молекулярной биологии.—Краснодар, 1983.—С. 249.

13. Современное понимание сущности эпидемического процесса на популяцноином и молекулярно-генстическом уровнях/В. Д. Беляков, Г. Д. Каминскнй//Борьба с инфекционными заболеваниями в Литве.— Вильнюс, 1983—С. 68—77.

14. Фазовые изменения в периодических бактериальных культурах /Г. Д. Кампнскин/'/Журн. мнкробиол.—1984,—№ 8.—С. 24—31.

15. Полимерный гелеобразующий материал для биомеднцинских целей/Л. И. Шалыюва, Е. А. Трофимова, Б. С. Иванов, А. А. Усанов, В. М. Чуднова, А. Ф. Николаев, М. С. Плужников, Ю. Д. Игнатов, Е- Д- Андреева, 10. Н. Васильев, В. И. Чхаргпшвили, Г. Е. Роскпн, Э. И. Карчева—Авт. евнд. № 1134581 от 15.09.84.

16. Особенности УФ-чувствительности патогенных энтеробактерий// Жури, мнкробиол. — 1985,—№ 10.—С. 103—104.

17. Влияние ¡R-плазмид на полуляционную изменчивость бактерии /Л. Б. Борисов/УОстрые кишечные инфекции. Вып. 9.—Л.: Изд. НИИЭМ им. Пастора, 1985.—С. 98—102.

18. Определение структурной целостности ДНК патогенных бактерий/С. Д. Иванов//Журн. мнкробиол,—1985,—№ 6,—С. 20—23.

19. Проблемы саморегуляции в медицинской паразитоценологнн /В. Д. Беляков Г. Д. Камш1ский//Паразитоценология.—Киев: Иа\'кова Думка, 1985.—С 118-126.

20. Пленки на основе сополпмеров Сутилакрилата и натриевой соли N-вшшламидояитариой кислоты с регулируемым обезболивающим и антимикробным действием/Л. И. Шальнова, А. Ф. Николаев, В. М. Чуднова,

B. М. Трофимова, Ю. Н. Васильев, Б. С. Иванов, Ю. Д. Игнатов, Е. Д. Ан-дреева//Тез. докл. УП Всесоюзн. симпозиума «Синтетические полимеры медицинского назначения».—Минск, 1985.—С. 96—97.

21. Способ получения рскомбинантпого штамма S-формы патогенных эшерихий,—Авт. свид. № 1253141 от 22.04.86.

22. Молскулярно-пенетическне механизмы антигенной изменчивости микроорганизиов/Л. Б. Борнсов//Успе.хн совр. биол.—1986.—Т. 101:— Вып. 2,—С. 163—174.

23. Молекулярпо-генегнческис механизмы изменчивости микробов в смешанных популяциях/Л. Б. Борисов//Тез. докл. I съезда эпидемиологов, инфекционистов и гигиенистов Туркменистана.—Ашхабад, 1986.—Ч. 1.—

C. 9—10.

24. Особенности динамики ликвидации одноцеиочечных разрывов ДИК в процессе репарации УФ-облучешшх бактерий/С. Д. Иванов//Восстано-внтельные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях. Л„ 1986,—С. 41—42.

25. Изменение генетической информации микроорганизмов в смешанных популяциях/Л. Б. Борисов, Е. И. Ермолепко//Тез. докл. Пленума Совета по микробиологии АМН СССР «Смешанные инфекции» (Томск, 1986).—М„ 1986,—С. 7—9.

26. Роль RccA-белка в изменении морфологии, антигенной структуры п вирулентности патогенных эшерихий/О. В. Рыбальченко, Л. А. Кафты-рева//Острые кишечные инфекции. Вып. 10.—Л.: Изд. НИИЭМ им. Пас-тера, 1986,—С. 85—90.

27. Чувствительность энтеробактерий к внешним воздействиям в условиях угнетения синтеза бслка/Е. Н. Шмидт, Е. Н. Михалсико/уТам же.— С. 126—129.

28. Штамм бактерий Escherichia coli VT2240, используемый для получения диагностической О-сывороткн к эшерихпям серовара 0124.— Авт! свид. ЛЬ 1378370 от 07.11.87.

29. Влияние антибиотиков на изменчивость бактерий/Л. Б. Бори-сов//Тез. докл. Всесоюзн. семинара «Вопросы антибактериальной терапии инфекционных осложнений в неипфекционной клинике».—М., 1987.— С. 14.

30. Значение активности гесА-геиа в изменении ультраструктуры Escherichia coli/О. В. Рыбальченко/'/Журн. микробиол. —1987. — № 4.— С. 11—14.

31. Влияние генов SOS-снстемы и условий культивирования на физиологические свойства патогенных энтеробактерий/Л- Б. Борисов, Е. И. Ермоленко/Дез. Пленума Совета по микробиологии АМН СССР «Вопросы физиологии, метаболизма и идентификации микроорганизмов» (Махачкала, 1987).—М., 1987,—С. 7—10.

32. Влияние SOS-репарации энтеробактерии на их взаимодействие с системой комплемента/С. В. Андреев, А. М. Ищенко, В. А. Пасечник, //Бюлл. экспернм. биол. и мед.—1987.— № 5.—С. 596—598.

33. взаимодействие системы комплемента с патогенными эшернхиямк, дефектными по гену гесА/С. В. Андреев, А. М. Ищенко, В. А. Пасечник //Актуальные вопросы теоретической и прикладной инфекционной иммунологии. Механизмы противовирусного иммунитета. — М., 1987. —• С. 24—25.

34. Саморегуляция паразитарных систем/В. Д. Беляков, Д. Б. Голубев, Г. Д. Каминский.—Л.: Медицина, 1987.—240 с.

35. Влияние антибиотиков на популяциоиную изменчивость бактерий /Л. Б. Борисов//Антибнотикк и химиотерапия.—1988.—№ 4,—С. 299—303.

36. Взаимодействие энтеробактерии с эпителиальными клетками в присутствии субингибирующих концентраций антибиотиков и хнмиопрепа-ратов/Л. Л. Нормана/Колонизационная резистентность к химнотерапевти-ческим и антибактериальным препаратам.—М., 1988.— С. 213.

37. Антимикробный состав для подавления посторонней микрофлоры при выращивании микроорганизмов и культур тканей/Л. И. Шалыюва, Е, А. Трофимова—Авт. свид. N° 4105904/14 от 12.06.89.

38. Условия существования патогенных энтеробактерии и изменения их биологической активности/Л. Л. Норман, О. В. Рыбальченко, М. Г. Шаф-хпд//Острые кишечные инфекции. Вып. 12,—Л.: Изд. НИИЭМ им. Пасте-рэ, 1989.—С. 59—66.

/