Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Научно-практическое обоснование применения стимуляторов роста микроорганизмов ТС-1 в промышленной технологии культивирования энтеробактерий

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Научно-практическое обоснование применения стимуляторов роста микроорганизмов ТС-1 в промышленной технологии культивирования энтеробактерий"

На правах рукописи

ОЛИФЕРОВА Элеонора Виюловна

Научно-практическое обоснование применения стимулятора роста шкроорганнзмов ТС-1 в промышленной технологии культивирования

энтеробактерий

03.00.23. - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

»"V

1

Ставоополь - 2000 г.

Работа выполнена на кафедре эпизоотологии и микробиологии Ставрополье государственной сельхозакадемии и Армавирской биофабрике.

Научный руководитель -

доктор ветеринарных наук, профессор Тутов Иван Кириллович.

Официальные оппоненты -

доктор биологических наук, старший научн сотрудник Ермолова Любовь Степановна; доктор химических наук, профессор Брыкалов Анатолий Валерьевич.

Ведущая организация - Кубанский государственный аграрный университет.

Защита диссертации состоится «<?/2000 г. в « /с?» часо] заседании диссертационного совета К 113.50.03 при Ставрополье государственном университете (355009 г. Ставрополь, ул. Пушкина, 1, корпу ауд. 401).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан « Ж »/¿^Х^у^у 2000

г.

Ученый секретарь. ,

диссертационного совета Зимова Л

ршзъо

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность темы. Широкое применение молекулярной биологии, биохимии, микробиологии, генной и клеточной инженерии в биологической, медицинской, ветеринарной практике за последние два десятилетия, по мнению академика М.Н.Манакова (1996), привело к форменной революции в производстве лекарственных средств, вакцин, сывороток и разработке нового поколения диагностикумов.

Необходимость массового применения биопрепаратов в животноводстве вызвана широким распространением в природе различных инфекционных болезней, многие из которых представляют серьезную опасность для человека и животных. По данным международных организаций ООН (МЭБ, ФАО, ВОЗ), в мире ежегодно регистрируется свыше 500 тысяч очагов различных болезней. В связи с этим исключительно важным является поиск путей повышения качества биопрепаратов диагностического, профилактического и лечебного действия.

Одним из методов решения этой проблемы является применение в промышленной технологии культивирования микроорганизмов различных факторов и стимуляторов роста. В последние годы разработано и внедрено в производство большое количество основ для питательных средств и биостимуляторов из растительного, животного сырья, продуктов микробиологического синтеза, фитогормонов (Н.Н.Ситяшин с соавт., 1988; Л.Н.Воробьев, 1989).

В период с 1995 по 1997 годы сотрудниками кафедры эпизоотологии и микробиологии Ставропольской госсельхозакадемии был разработан стимулятор роста микроорганизмов ТС-1 (СРМ ТС-1), который по своей природе является культуральной жидкостью ассоциации микроорганизмов «чайного» гриба. СРМ ТС-1 недостаточно изучен с точки зрения воздействия на основные свойства микроорганизмов, в том числе и энтеробактерий, при добавлении в среды их культивирования.

Представители семейства Еп(егоЬас1епасеае были нами избраны в качестве объектов исследований в связи с широким распространением в природе и

огромной этиопатогенетичсской значимостью в инфекционной энтеропатс гии животных и человека.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является учное обоснование целесообразности применения СРМ ТС-1 в промышлен технологии культивирования энтеробактерий путем изучения его влияния биологические свойства эшерихий и сальмонелл. Для её достижения были ставлены следующие задачи:

- изучить распространение и этиологическую структуру эшерихиозов и с; монеллезов сельскохозяйственных животных и птиц в Ставропольском iq

- провести селекционную работу с наиболее важными в этиологическом ношении музейными и производственными штаммами энтеробактерий и ределить оптимальные концентрации СРМ ТС-1 для каждого типа изу мых микроорганизмов;

- изучить в лабораторных и производственных условиях влияние СРМ Т на морфологические, культурально-биохимические, антигенные свойс энтеробактерий, а также степень их диссоциации и чувствительность к ш торым химиотерапевтичсским препаратам;

- определить антигенную активность производственных штаммов эшерю выращенных на средах со СРМ ТС-1, в условиях промышленного изго: ления агглютинирующих О-коли сывороток;

- определить иммуногенную активность эшерихиозных и сальмонеллез! моновакцин, полученных с использованием экспериментальных сред СРМ ТС-1;

- определить выживаемость (резистентность) энтеробактерий, полученны? средах со СРМ ТС-1, в процессе сублимационного высушивания.

1.3. Научная новизна работы. Впервые было изучено влияние СРМ ' 1 на основные свойства энтеробактерий родов Escherichia и Salmonella, ра: ботана технология приготовления высокопродуктивных сред и эксперт тально обоснована перспективность и целесообразность использования данн

стимулятора в промышленной технологии получения энтеробактсрпа.п !• препаратов диагностического, профилактического и лечебного действия.

Нами установлено, что высокий стимулирующий эффект СРМ ТС-1 сопряжен с изменениями основных биологических свойств изучаемых энтср бактерии. Кроме того, испытания показали, что стимулятор роста в срсл;\ культивирования способствует более длительному поддержанию стабильное!г «Sw-форм энтеробактсрий и повышению резистентности микробных клеток i стрессовым возденстпиям сублимационного высушивания.

1.4. Практическая значимость работы. Обобщены сведения по распространению и этиологической структуре эшерихиозов и сальмонеллезов животных в Ставрополье ч крае. Разработана технология приготовления высокоэффективных сред для культивирования эшерихий и сальмонелл, которая обеспечивает повышение качества энтеробактериальных биопрепаратов. Применение СРМ ТС-1 позволяс, добиться экономической эффективности в размере 268,7 тыс. руб. при затратах на получение стимулятора 1,8 тыс. руб.

Основные положения совершенствования процессов промышленного культивирования микроорганизмов с использованием СРМ ТС-1 используются в учебном процессе при проведении курсов «Микробиология и иммунология» и «Биотехнология» на кафедре эпизоотологии и микробиологии СтГСХА.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту

1. Крайне широкое распространение энтеробактсриозов побудило к проведению исследовании но совершенствованию качества производственных энтеробактериальных биопрепаратов.

2. СРМ ТС-1 обеспечивает высокую степень накопления активной биомассы отдельных серотипов энтеробактерий в процессе культивирования.

3. Данный биопродукт не влияет на основные биологические свойства энтеробактерий наиболее распространенных родов Escherichia и Salmonella.

4. При применении СРМ ТС-1 для культивирования энтеробактерий значительно повышается антигенная активность эшерихий и иммуногенная актив-

ность моновакцин, а также увеличивается число жизнеспособных клеток в прс цессе их сублимации.

1.6. Апробация. Материалы диссертации доложены на Международно научно-практической конференции, посвященной 70-летию Ставропольско НИВС (Ставрополь, 1999), Всероссийской конференции по биотехнологи (Ставрополь, 1999), 11-ой региональной конференции по «Актуальным проблс мам ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавка зе» (Ростов, 1999), на ежегодных научно-практических конференциях Ставрс польской ГСХА (1997, 1998, 1999, 2000).

1.7. Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

1.8. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзо ра литературы, собственных исследований, выводов, практических предложе ний, списка литературы, включающего 285 отечественных и 94 зарубежных ис точника, приложения.

Работа изложена на 169 страницах машиноииси, иллюстрирована 20 таб лицами, одним рисунком и 6 фотографиями.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Диссертационная работа выполнена на кафедре эпизоотологии и микро биологии Ставропольской госсельхозакадемии в период с 1996 по 2000 годы Экспериментальная её часть по испытанию СРМ ТС-1 в производственных ус ловиях была проведена на Армавирской биофабрике; отдельные исследовани: - в бактериологическом отделе Ставропольской краевой ветеринарной лабора тории.

Основной объект исследований - СРМ ТС-1, представляющий собо£ фильтрат культуральной жидкости природной ассоциации микроорганизме! «чайного» гриба.

Для его испытания на основании анализа годовых отчетов районных вет-лабораторий и ветотчетностей Управления ветеринарии МСХ Ставропольскогс

края за период с 1992 по 1996 годы по распространению и этиологической структуре эшерихиозов и сальмонеллезов животных и птиц были отобраны наиболее значимые в этиопатогенетическом отношении серотипы эшерихий и сальмонелл.

Селекцию производственных и музейных штаммов эшерихий и сальмонелл проводили по признаку стабильности «Б»-форм колоний и типичности проявления основных биологических свойств. В работе использовали штаммы эшерихий серотипов 08, 015, 020, 029, 078, 0101, 0111, 0115, 0139, М17; Salmonella typhimurium, S.dublin, S.abortusovis и S.choleraesuis. У культур штаммов энтеробактерий, многократно пересеваемых на производственных питательных средах и на средах со СРМ ТС-1, изучали степень накопления биомассы, морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические, антигенные свойства, степень их диссоциации, чувствительность к некоторым химиотерапевтическим препаратам.

Накопление биомассы изучали путем посевов эшерихий и сальмонелл в МПБ с определенным для каждого штамма содержанием СРМ ТС-1, последующего центрифугирования бульонных культур и взвешивания осадка.

Морфологические и тинкториальные свойства исследовали путем микроскопии окрашенных и неокрашенных мазков из агаровых и бульонных культур по общепринятым методикам.

Культуральные свойства определяли по характеру роста на жидких и плотных питательных средах.

Биохимическую активность штаммов оценивали по способности сбраживать углеводы и многоатомные спирты в средах Гисса, утилизировать цитрат-ные соли, образовывать индол и сероводород с использованием индикаторных бумажных систем для межродовой дифференциации энтеробактерий.

Антигенные свойства исследовали с помощью наборов диагностических Околи сывороток Армавирской биофабрики и сальмонеллезных О- и Н-агглюти-

нирующих монорецепторных сывороток, изготовленных Краснодарской биофабрикой в соответствии с «Наставлениями», утвержденными в 1980-1984 г.г.

Степень диссоциации производственных штаммов онтеробактерий изучали с помощью метода последовательных разведений культур, посевов их на чашки Петри и подсчета колоний с признаками «1Ъ>-форм.

Для определения чувствительности культур штаммов к некоторым группам химиотерапевтических препаратов пользовались дисками, содержащими ампи-окс, ампициллина тригидрат, байтрил, бензилпенициллин, бисептол, гентами-цин, доксициклин, лактобрил, лсвомицетин, линкомицин, неомицин, нитроксо-лин, норилет, пироксикам, ремантадин, тетрациклин и эритромицин, в соответствии с «Методическими указаниями по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных», утвержденными ГУ В МСХ СССР 30.10.1971 года.

Определение антигенной активности отобранных штаммов эшерихий (08, 015, 0101, 0111) проводили на кроликах, которых иммунизировали антигенами, полученными на средах со СРМ ТС-1. Работу проводили в соответствии с «Инструкцией по изготовлению и контролю агглютинирующих О-коли сывороток», утвержденной ГУВ МСХ СССР 13.08.1980 года.

Иммуногенную активность энтеробактерий, культивируемых на средах со СРМ ТС-1, изучали путем изготовления экспериментальных серий эшерихиоз-ных и сальмонеллезных моновакцин, иммунизации ими морских свинок и заражении последних предварительно подтитрованными летальными дозами гомологичных штаммов. Эшерихиозную вакцину готовили из штамма 899 (серо-тип 015), сальмонеллезную - из штамма S.typhimurium № 371.

Получение и технологический контроль осуществляли в соответствии и инструкциями «По изготовлению и контролю поливалентной гидроокисьалюми-ниевой формол-тиомерсаловой вакцины против эшерихиоза поросят, телят, ягнят» (ТУ 46-21-988-81) и «По изготовлению и контролю концентрированной формол-квасцовой вакцины против сальмонеллеза телят» (ТУ 42-21-166-75).

Выживаемость энтеробактерий в процессе сублимационного высушивания изучали путем культивирования энтеробактерий в бульонах Хоттингера со СРМ ТС-1, соединении полученных культур с защитной средой, замораживании до -40 (-50)°С и последующей лиофилизации в сублимационных установках ТГ-50.4/1. До и после высушивания культуры подвергали разведению, посевам на чашки Петри с МПБ и подсчету количества жизнеспособных микробных клеток. Работу проводили в соответствии с действующей «Инструкцией по изготовлению и контролю бивалентной вакцины против сальмонеллеза свиней из аттенуированных штаммов S.typhimurium № 3 и S.choleraesuis № 9» (ТУ 9384-061-0414985-94).

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Эпизоотологлческое обоснование основных исследований по теме диссертационной работы

Для обоснования исследований по теме диссертации и отбора наиболее распространенных и значимых в этиопатогенетическом отношении серотипов эшерихий и сальмонелл для испытания СРМ ТС-1, нами были изучены некоторые аспекты эпизоотологии эшерихиозов и сальмонеллезов животных и птиц в Ставропольском крае.

Анализ ветдокументации показал, что эти заболевания регистрировались во всех 26 районах края. При этом большинство хозяйств остаются стационарно неблагополучными по названным эитеробактсриозам.

Из 35 зарегистрированных в регионе патогенных серотипов эшерихий у крупного рогатого скота наиболее часто выделяли 08 (в 33% случаев), 015 (13%), 09 (12%); у мелкого рогатого скота - 08 (39%), 078 (17%) и 015 (14%); у свиней 026 (18%), 08 (14%), 09 (13%); у птиц - 01 (29%), 015 (18%), 078 (13%), 02 (11%); у пушных зверей - 078 и К99 ( по 19%), 08, К88 и 987Р (по 13%).

Преимущественное значение в этиологической структуре сальмонеллезов животных имели S.dublin, S.typhimurium, S.choleraesuis, S.abortusovis, для птиц отряда куриных - S.gallinarum, водоплавающих - S.enteritidis. При этом уста-

новлено, что у различных видов животных заболевание вызывали разные типы сальмонелл.

2.2.2. Селекция отобранных штаммов энтеробактерий.

Определение оптимальных концентрации СРМ ТС-1 для культивирования эшерихий и сальмонелл

Учитывая высокую диссоциативную активность энтеробактерий (особенно эшерихий), отобранные для работы штаммы эшерихий и сальмонелл подвергали селекционному отбору. В результате для проведения каждой серии опытов в качестве исходных были использованы стабильные по признакам «Б»-форм культуры названных микроорганизмов.

Для определения оптимальных концентраций СРМ ТС-1, обеспечивающих наибольший выход биомассы энтеробактерий, использовали МПБ, содержащий 0,1-0,2-0,3-0,4-0,5-1,0-2,0-3,0-4,0-5,0% стимулятора. В серии лабораторных и производственных опытов была выявлена ростстимулирующая активность данного биопродукта в отношении эшерихий штаммов: 08, 015, 0101, 0111 и Salmonella typhimurium, S.dublin, S.abortusovis и S.choleraesuis. При этом на эшерихиях двух штаммов 020 и 0139 данный эффект не подтвердился. В результате производственных опытов были установлены оптимальные для каждого штамма энтеробактерий концентрации СРМ ТС-1 в среде культивирования. Так, стабильно высокое накопление общей биомассы эшерихий происходит при введении в МПБ 0,2% стимулятора для 08, 0,3% - для 015 и 0111 и 0,4% - для 0101. Оптимальные концентрации СРМ ТС-1, обеспечивающие наибольший выход общей биомассы S.typhimurium - 4-5%, S.dublin и S.abortusovis - 2%, S.choleraesuis -1-2%.

2.2.3. Изучение влияния СРМ ТС-1 на основные биологические свойства энтеробактерий

В промышленном производстве биопрепаратов важным является сохранение основных свойств производственных штаммов микроорганизмов. Последние должны быть представлены однородной популяции бактерий с характерными морфологическими, культурально-биохимическими, антигенными при-

знаками и высокой иммуногенной активностью (Е.И.Хабарова с соавт., 199 / Поэтому возникла необходимость установить - не сопряжено ли повышена метаболической активности энтеробактерий с изменениями их основных видо вых свойств под действием СРМ ТС-1 в среде культивирования.

2.2.3.1. Морфологические свойства эшерихий и сальмонелл Детальному изучению мы подвергали агаровые культуры десятых генераций рабочих штаммов энтеробактерий, пересеваемых на обычных производственных средах (в качестве контроля) и на средах со СРМ ТС-1. Нами исследовано около 700 окрашенных и неокрашенных мазков из агаровых и бульонных культур эшерихий и сальмонелл, выращенных при температуре 37°С в течение 18-20 и 20-24 часов соответственно.

В мазках эшерихии и сальмонеллы опытных и контрольных образцов, представляли собой грамотрицательные палочки мелких (1,0x0,5 мкм) и средних (2,5-3,0x0,6 мкм) размеров с закругленными концами, беспорядочно расположенные друг относительно друга в поле зрения микроскопа. В свежих бульонных культурах все исследуемые бактерии проявляли высокую подвижность.

Тинкториальные свойства опытных и контрольных культур энтеробактерий оставались неизменными. Микробные клетки всех образцов типично окрашивались анилиновыми красителями простым методом и по Граму.

2.2.3.2. Культуральные свойства эшерихий и сальмонелл Культуральные свойства производственных штаммов энтеробактерий изучали на МПЛ, МПБ, агарах и бульонах Хоттингера, содержащих СРМ ТС-1 и без него. Посевы проводили параллельно и исследовали, сравнивая характер роста культур одного штамма на разных по составу питательных средах.

На плотных и жидких средах экспериментальные штаммы проявляли признаки роста, строго характерные для эшерихий и сальмонелл. При этом сохранялись без изменений видовые особенности микроорганизмов.

При детальном сравнении всех показателей экспериментальных и контрольных штаммов одного серотнпа мы выявили существенные различия в ско-

рости и объемах накопления бактериальной массы. Так, концентрация в опытных средах эшерихий в 1,5 раза, сальмонелл - в 1,5-2,0 раза превышала концентрацию в контрольных. При этом продолжительность экспоненциальной фазы роста энтеробактерий на средах со СРМ ТС-1 сокращалась на 2-4 часа.

2.2.3.3. Частота диссоциации эшерихий и сальмонелл

Одним из важнейших аспектов промышленной технологии культивирования микроорганизмов является сохранение и поддержание стабильности «S»-форм микроорганизмов, поскольку именно в этом состоянии проявляется их наивысшая активность в плане вирулентности, токсигенности, антигенности и, в конечном итоге, иммуногенности.

Все известные представители семейства Enterobacteriaccae обладают выраженной склонностью к диссоциации. Наиболее ярко она проявляется у эшерихий, что создаст немало трудностей в работе с ними в условиях производства. Поэтому в своих исследованиях мы сочли необходимым изучить воздействие СРМ ТС-1 на диссоциативную активность производственных штаммов энтеробактерий.

Для решения этой задачи использовали метод последовательных разведений агаровых культур эшерихий и сальмонелл десятых генераций, с высевом суспензий в разведении 110"9 на чашки Петри и подсчетом числа диссоциированных колоний.

В результате установили, что СРМ ТС-1 при многократных пересевах способствует снижению степени диссоциации у сальмонелл в среднем на 5-7%, а у эшерихий - на 3-13%, что чрезвычайно важно в производстве биопрепаратов.

2.2.3.4. Биохимические свойства эшерихий и сальмонелл Для изучения основных биохимических свойств представителей родов Escherichia и Salmonella мы использовали набор дифференциально-диагностических и селективных срсд, а также индикаторные бумажные системы для межродовой дифференциации энтеробактерий.

Агаровые культуры десятых генераций, полученные путем пассажем контрольных и экспериментальных средах, смывали 0,9%-ным раствором и трия хлорида и стабилизировали концентрацию по бактериальному стандар; до 10 ЕД. После этого по общепринятым методикам производили посев иол\ ченных суспензий на среды Гисса с моносахарами и спиртами, содержащие ре актив Андредэ, а также на среды Эндо, Левина, Смирнова и Симонса.

Ферментативная активность опытных штаммов, пересеваемых на средах со СРМ ТС-1, оставалась абсолютно идентичной контрольным, при этом сохранялись все видовые биохимические признаки, на основе которых действуют принципы межродовой дифференциации энтеробактерий. Так, многократно пересеваемые на средах со СРМ ТС-1 эшерихии сохраняют способность сбраживать лактозу и сахарозу, образовывать индол, а сальмонеллы - сбраживать дульцит, выделять сероводород и утилизировать цитраты.

2.2.3.5. Антигенные свойства эшерихнй и сальмонелл Изучение антигенных свойств рабочих штаммов эшерихии и сальмонелл, пересеваемых на опытных и контрольных средах проводили методом экспресс-идентификации энтеробактерий в РА на стекле с сальмонеллезными моноре-цепторными О- и Н-агглютинирующими и О-коли агглютинирующими сыворотками в соответствии с утвержденными в 1980-1984 годах «Наставлениями». В качестве антигенов для постановки реакции использовали инактнвированные на водяной бане 18-20-часовые агаровые культуры эшерихнй и живые 20-24-часовые агаровые культуры сальмонелл.

В целом РА с гомологичными моновалентными сыворотками одинаково четко протекала и в контроле и в опыте с образованием видимых конгломератов и полным просветлением жидкости на стекле в течение 2-3 минут с момента постановки реакции. Это означает, что эшерихии и сальмонеллы, длительно культивируемые на средах со СРМ ТС-1, сохраняют высокую агглютинабиль-ность и видовые антигенные свойства.

2.2.3.6. Чувствительность эшерихий и сальмонелл к некоторым группам химиотерапевтических препаратов

В работе использовали метод диффузии в агар с применением дисков фабричного и собственного изготовления, пропитанных различными химиотера-певтическими препаратами антимикробного действия.

Установлено, что в целом эшерихии и сальмонеллы проявляют высокую чувствительность к антибактериальным препаратам байтрилу и норилсту, которые обладают широким спектром бактерицидного действия в отношении грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, микоплазм в чрезвычайно низких концентрациях, а также к ампициллина тригидрату, ампиоксу, гентами-цину.

В целом, несмотря на незначительные колебания чувствительности к препаратам между сероварами, контрольные и опытные штаммы энтеробактерий одного серотипа, полученные на разных по составу питательных средах, реагируют на них сравнительно одинаково.

2.2.4. Изучение антигенной активности производственных штаммов эшерихий, культивируемых на средах со СРМ ТС-1, в условиях промышленного получения диагностических О-коли

сывороток

В промышленной технологии получения диагностических сывороток, основополагающим моментом является приготовление качественного бактериального антигена для иммунизации животных-продуцентов. В связи с этим было изготовлено 6 серии О-коли сывороток с использованием в качестве антигенов эшерихий штаммов 08, 015, 0101 и 0111, выращенных на средах со стимулятором роста и 6 контрольных серий. Всего в опытах было использовано 120 кроликов.

В результате установлено, что титр анти гел к одному серотипу эшерихий выше у кроликов, иммунизированных экспериментальными антигенами. Кроме того, наличие испытуемого биопродукта в среде культивирования способствует снижению частоты самоагглютинации производственных штаммов эшерихий (таблица 1).

Таблица 1

Антигенная активность эшерихмозных антигенов, полученных на средах со СРМ ТС-1

Контроль анти- Разведения сыворотки

Серотип гена на самоагглютинацию 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400

н 3 л о а. Га л ц о п. н 3 Контроль н л -а о о. ¡2 л г; О О. н ■д г; О О. н 3 Ч О о. л с; о о.

О о Ъ£ О X о Ьй б О я о « О О « О О ^ О о « О о а

08 + + 4 100 4 100 4 100 4 100 4 100 4 100 4 114 15 100 4 125 12 100 4 125 12 100 4 133 3 100

015 + ++ 4 100 4 100 4 105 М 100 4 114 15 100 4 133 3 100 4 100 2.5 100 4 143 М 100 15 175 2 100

0101 - - 4 100 4 100 4 100 4 100 4 100 4 100 4 100 4 100 4 125 12 100 16 164 22 100 3 200 15 100

0111 + + 4 100 4 100 4 100 4 100 4 100 4 100 4 108 12 100 13 89 17 100 10 94 12 100 2,5 76 13 100

Среднее в % к контролю 100 100 101,3 100 103 100 ИЗ 100 122 100 128 100 132 100

Примечание: в числителе - среднее количество крестов в РА

в знаменателе - в процентах к контролю «-» - реакция отрицательная «+» - положительная в 1 крест «++» - положительная в 2 креста «+»-сомнителы1ая

В соответствии с «Инструкцией по изготовлению и контролю агглютинирующих О-коли сывороток» для практического применения выпускают моновалентные сыворотки с титром антител не ниже 1:3200 с оценкой реакции в 3-4 креста. Приготовленные нами опытные серии агглютинирующих сывороток к антигенам 08, 015 и 0101 давали РА с гомологичными антигенами с оценкой 34 креста в разведении 1:6400 и их активность на 33-100% превышала активность контрольных серий.

2.2.5. Технология изготовления и контроля опытных серии эшерихиозной и сальмонеллезной моновакпин, полученных при использовании эксперимен ккп.ных сред

Для изучения вопроса возможной изменчивости иммуногснной активности вакцин при использовании для культивирования энтеробактерий сред со СРМ ТС-1, мы изготовили несколько опытных и контрол! ix серий моновакцин из штаммов E.coli 899 (015) и S.typhimurium № 371, провели вакцинации ими морских свинок и заразили последних летальными дозами i омологичных культур.

Приготовленные серии вакцин были стерильными и безвредными для лабораторных животных.

Для подтверждения специфичности иммунитета .• ответ на введение эшерихиозной вакцины в качестве контрольных для заражения морских свинок использовали два вирулентных штаммов - гомологичный 015 и гетерологичный 0115. При этом показатели иммуногснной активность опытных и контрольных серий эшерихиозной моновакцины практически не отличались друг от друга (таблица 2).

Таблица '

Иммуногенная активность эшсрнхпозной вакцины из штамма 899 (015), полученной на опытных и контрольных средах

Группа животных Общее количество морских свинок в 3-х опытах Заражение LDI00 015 Заражение LDjqo 0115

всего пало % выжило % всего пало % выжило <7о

Вакцинированные опытной серией вакцины 30 15 1 7 14 93 15 14 93 1 7

Невакциниро-ванные 24 12 12 100 - - 12 11 92 1 8

Вакцинированные контрольной серией вакшшм 30 15 2 13 13 87 15 14 93 1 7

ИТОГО 84 42 15 - 27 - 42 39 - 3 -

Так, морские свинки, вакцинированные опытными и контрольными сериями вакцины, проявляли одинаково высокую устойчивость (93-87% выживших) к введению летальной дозы гомологичной культуры штамма 015. Кроме того, 93%-ная гибель вакцинированных животных после введения LDiqo гстероло-гичного штамма 0115 доказала высокую специфичность иммунитета, создавшегося в ответ на введение экспериментальных серий вакцины.

Что касается сальмонеллезной моновакцины из штамма S.typhimurium № 371 (таблица 3), то опытные сё серии предохраняли от гибели 100% вакцинированных лабораторных животных, тогда как контрольные серии - только 87%.

Таблица 3

Иммуногенная активность сальмонеллезной вакцины из штамма 8.1урЫтипит № 371, полученной на опытных и контрольных средах

Группа животных Общее количество морских свинок в 3-х опытах Заражение LD(oo S.typhimurium животных, вакцинированных в дозах, см5

0,25 0,5

всего пало % выжило % всего пало % выжило %

Вакцинированные опытной серией вакцины 30 15 - - 15 100 15 - - 15 100

Невакцшшрован-ные 15 15 15 100 - - - - - - -

Вакцинированные контрольной серией вакцины 30 15 2 13 13 87 15 2 13 13 87

ИТОГО 75 45 17 - 28 - 30 2 - 28 -

Таким образом, полученные нами результаты контроля испытуемых серий энтеробактериальных моновакцин по стерильности, безвредности и иммуно-генной активности в полной мере соответствовали требованиям действующей нормативно-технической документации, а в отдельных случаях даже превышали показатели контрольных вариантов.

2.2.6. Контроль выживаемости сальмонелл, культивируемых на экспериментальных средах, в процессе сублимационного высушивания

Для испытания был использован аттенуированный штамм S.typhimurium № 3, который выращивали в течение 20-24 часов при температуре 37° в 0,5-литровых флаконах (по 250 см3 среды в каждом) с обычным бульоном Хоттин-гера и бульоном Хоттингера, содержащим 4% СРМ ТС-1.

Для концентрирования микробной массы сальмонелл полученные во флаконах бульонные культуры центрифугировали в режиме 2000 тыс. об/мин 40 минут - 1 час, отбирали 200 см3 прозрачной надосадочной жидкости и к остав-

шимся 50 см3 концентрата в соотношении 1:1 добавляли защитную сахарозо-желатиновую среду. После чего суспензию перемешивали, расфасовывали по 2,0 см3 в ампулы и по 4,0 см3 - в пенициллиновые флаконы. Технологическую обработку биоматериала и подсчет числа жизнеспособных клеток сальмонелл до и после сублимационного высушивания осуществляли в соответствии с «Инструкцией по изготовлению и контролю бивалентной вакцины против сальмонеллеза свиней из аттенуированных штаммов БЛурЫтипит №3 и З.сЬокгаеБШБ №9» (ТУ 9384-061-0414985-94). Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4

Выживаемость вЛурЫтигшт, полученных на опытных и контрольных средах, в процессе сублимационного высушивания

Л'и опытов Количество жизнеспособных сальмонелл

Опыт Контроль

,10 сушки после сушки % выживших до сушки после сушки % выживших

1 8,20 10ю 4,65 Ю10 57 10,5010'° 3,6510ю 35

2 20,0 10ю 10,9510'° 55 5,2510ю 2,2510ю 43

3 44,65 10'° 18,1510ю 41 9,0010'° 4,1510ю 46

4 10,3010ю 3,2010ю 31 22,2010ю 3,5010ю 16

5 23,9010ю 19,7010'° 82 19,35 10ю 14,4010'° 74

6 11,2610ю 8,6510ю 77 6,6810ю 4,2210ю 63

X 19,7210ю +6,1 10,8810'° ±2,7 55 12,16 Ю10 ±3,1 5,3610ю +2,0 44

Р <0,05 <0,02 <0,02 <0,05

В целом показатель резистентности опытных культур БЛурЫтипит №3 на 11% выше контрольных. Это означает, что СРМ ТС-1, включенный в состав среды культивирования, оказывает позитивное воздействие на биосинтетические механизмы адаптации бактериальных клеток к стрессовому воздействию условий сублимационного высушивания.

Кроме того, применение СРМ ТС-1 в промышленной технологии культивирования энтеробактерий при изготовлении энтеробактериальных биопрепаратов обеспечивает экономический эффект в сумме в среднем 268,7 тыс. рублей при затратах на приготовление стимулятора 1,8 тыс. рублей.

ВЫВОДЫ

1. В результате исследовании установлено, что из большого разнообразия циркулирующих в природе ссротипов энтеробактерий преимущественное значение в этиологии эшерихиозов на Ставрополье имеют 02, 08, 09, 015, 020, 026, 078, 0101, 0111, 0115, 0138, 0139, К88, К99; сальмонеллезов - S.dublin, S.typhimurium, S.choleraesuis, S.abortusovis, S.gallinarum и S.enteritidis.

2. Разработана технология приготовления производственных питательных сред, содержащих СРМ ТС-1, для культивирования энтеробактерий.

3. На отдельных штаммах энтеробактерий выявлен и подтвержден ростсти-мулирующий эффект изучаемого препарата. Так, использование СРМ ТС-1 для выращивания эшерихий позволяет увеличить выход функционально активной биомассы на 13-26%, для сальмонелл - на 28-43%.

4. Установлено, что концентрации СРМ ТС-1, обеспечивающие наибольший выход биомассы, для разных штаммов одного серотипа энтеробактерий индивидуальны. Так, для эшерихий 08 - это 0,2%, 015 и 0111 - 0,3%, 0101 -0,4%; для S.typhimurium - 4,0%, S.dublin, S.abortusovis и S.choleraesuis - по 2,0%.

5. Применение СРМ ТС-1 в промышленной технологии культивирования энтеробактерий не вызывает у последних изменений основных биологических показателей. Это подтверждено результатами исследований по изучению морфологических, культурально-биохимических, антигенных свойств тестируемых микроорганизмов и их чувствительности к некоторым группам химиотерапев-тических препаратов антимикробного действия.

6. СРМ ТС-1 способствует снижению частоты диссоциации у эшерихий в среднем на 3-13%, у сальмонелл - на 5-7%, что весьма важно в производстве биопрепаратов.

7. Использование данного стимулятора в технологии приготовления агглютинирующих О-коли сывороток позволяет увеличить на 33-100% антигенную активность производственных штаммов эшерихий и получить высокочувствительные монорецепторные сыворотки, реагирующие с гомологичными антигенами в РА на 3-4 креста в разведении 1:6400, что превышает инструктивные параметры.

8. Энтеробактериальные вакцины, изготовленные с использованием в технологической схеме выращивания энтеробактерий данного стимулятора роста, проявляют высокую степень иммуногенной активности. Так, эшерихиозная моновакцина из штамма 899 предохраняет от гибели 93%, сальмонеллезная из штамма БЛурЫтипит №371 - 100% лабораторных животных после введения 1ЛЭ|оо вирулентных гомологичных культур при 100%-ной гибели всех невакци-нированных животных. Полученные показатели в полной мере соответствуют действующей нормативно-технической документации по изготовлению этих препаратов.

9. СРМ ТС-1 в среде культивирования способствует повышению резистентности и, как следствие, увеличению на 11% выхода жизнеспособных клеток сальмонелл в процессе сублимационного высушивания. Это доказывает его положительное влияние на механизмы адаптации бактерий к неадекватным воздействиям физических стресс-факторов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для получения высокоэффективных биологических препаратов диагностического, профилактического и лечебного действия предлагаем использовать СРМ ТС-1 в технологии промышленного культивирования энтеробактерий. С этой целью рекомендуем проводить предварительную работу по определению

индивидуальных для каждого штамма эшерихий и сальмонелл концентраций СРМТС-1.

2. Питательные среды, содержащие СРМ ТС-1, предлагаем использовать бактериологическим лабораториям в качестве элективных сред для выделения и накопления микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae.

3. Результаты проведенных исследований считаем необходимым использовать в учебно-педагогической работе при проведении курсов «Микробиология и иммунология» и «Биотехнология».

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Тутов И.К., Олиферова Э.В. Распространение и этиологическая структура колибактериозов в Ставропольском крае // Вестник ветеринарии, 1997. - №2. -С. 68-72.

2. Тутов И.К., Соловьева С.Я., Ожередова Н.А., Олиферова Э.В. Роль Escherichia coli в патогенезе отравлений у животных // Вестник ветеринарии, 1997.-№3.-С. 68-70.

3. Олиферова Э.В. Влияние стимулятора роста микроорганизмов ТС-1 на основные свойства энтеробактерий // Диагностика, лечение и профилактика заболеваний с.-х. животных: Сб. науч. тр. / Ставроп. ГСХА. - Ставрополь, 1998. -С. 55-58.

4. Олиферова Э.В. Антигенная активность эшерихий, выращенных на средах с добавлением СРМ ТС-1 // Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе: Материалы П-ой региональной конференции / Донской ГАУ. - Ростов-на-Дону, 1999. - С. 30-31.

5. Олиферова Э.В. Морфологические и физиологические особенности эшерихий и сальмонелл, выращенных на средах со СРМ ТС-1 // Диагностика, лечение и профилактика заболеваний с.-х. животных: Сб. науч. тр./ Ставроп. ГСХА. - Ставрополь, 1999. - С. 36-39.

6. Олиферова Э.В. Обоснование применения СРМ ТС-1 в промышленной технологии производства биопрепаратов // Актуальные вопросы диагностики,

профилактки и борьбы с болезнями с.-х. животных: Тезисы / ВНИИЭВ, Ставроп. НИВС. - Ставрополь, 1999.-С. 299-301.

7. Олиферова Э.В., Тутов И.К. Оценка основных показателей технологического контроля экспериментальных энтеробактериальных вакцин, полученных с использованием СРМ ТС-1 // Современные достижения биотехнологии - вклад в науку и практику XXI века: Материалы Всероссийской конференции / РАСХН, Ставроп. СНИИСХ, Ставроп. ГСХА. - Ставрополь, 1999.-С. 53.

8. Тутов И.К., Ситьков В.И., Веревкина М.Н., Светлакова Е.В., Олиферова Э.В. Разработка промышленной технологии приготовления и производственного применения СРМ ТС-1 // Современные достижения биотехнологии - вклад в науку и практику XXI века: Материалы Всероссийской конференции / РАСХН, Ставроп. СНИИСХ, Ставроп. ГСХА. - Ставрополь, 1999.-С. 81.

9. Олиферова Э.В. Изучение влияния СРМ ТС-1 на основные свойства энтеробактерий // Диагностика, лечение и профилактика заболеваний с.-х. животных: Сб. науч. тр. / Ставроп. ГСХА. - Ставрополь, 2000 (находится в печати).

Заказ № 49

Тираж 100 экз.

Подп. к печ. 25.10.2000

СтГСХА, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический, 12.