Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области"

На правах рукописи

003464792

ЕВТЕЕВА НАДЕЖДА ИВАНОВНА

БИОРАЗНООБРАЗИЕ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ В ПРИРОДНЫХ МЕСТООБИТАНИЯХ НИЖЕГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ

03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о :г' ■ о

Нижний Новгород 2009

003464792

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского» Федерального агентства по образованию (ГОУ ВПО ННГУ им. Н.И. Лобачевского)

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Речкин Александр Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Смирнов Василий Филиппович

доктор биологических наук, профессор Гоготов Иван Николаевич

Ведущая организация: Институт экологии Волжского бассейна РАН

(г. Тольятти)

Защита состоится ¿¡> 2009 года в «_ /Г » часов на

заседании диссертационного совета Д.212.166.12 при Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина 23, корп. 1, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского.

e-mail: ecology@bio.unn.ru факс: (831)465-85-92

Автореферат разослан «/£» ^uZfirnj?^2qq9 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Г.А. Кравченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Микроорганизмы семейства ЕгЯегоЬас1ег1асеае регулярно выделяются из почвы и воды, сохраняют жизнеспособность в широком диапазоне абиотических факторов среды, нередко обладают патогенностью для многих беспозвоночных и позвоночных животных, и человека. Способность утилизировать углеводы, спирты, аминокислоты, целый комплекс циклических органических соединений; участие в процессах нитрификации, денитрификации, аммонификации, азотфиксации позволяет энтеробактериям занимать различные местообитания (Ленгелер, 2005).

Полагают, что возбудители сапронозных инфекций, к которым относятся и бактерии семейства ЕшегоЪаЫепасеае, способны существовать в двух экологических фазах - сапрофитической (во внешней среде) и паразитической (в организме хозяина), и, следовательно, образовывать параллельно существующие части популяции - внеорганизменную и организменную (гостальную) (Сомов 1988; Литвин, 1993, 2003; Бухарин, 1997). Не исключено, что переход бактерий из одной среды существования в другую (внешняя среда—организм хозяина) представляет собой один из способов так называемой поведенческой адаптации микроорганизмов, позволяющей, в конечном счете, обеспечить их выживание как вида. При этом экология патогенных микроорганизмов в сапрофитической фазе существования изучена крайне недостаточно.

Этиологическая значимость и потенциальная патогенность энтеробактерий обуславливает необходимость более тщательного изучения биоразнообразия данной группы возбудителей, природных местообитаний, условий формирования симбиоценозов и длительности существования их резервуаров. Будучи весьма актуальной, с эпидемиологических позиций, проблема заслуживает целенаправленного популяционно-экологического анализа - как применительно к конкретным микроорганизмам, так и в сравнительно-экологическом аспекте. Не менее значимым представляется исследование физиолого-биохимических различий, определяющих внутривидовое разнообразие штаммов из разных местообитаний.

Цель исследования.

Выявить распространение и биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях на территории Нижегородской области, а также некоторые физиолого-биохимические свойства, определяющие адаптационные возможности и потенциальную патогенность этиологически значимых представителей семейства Enterobacteriaceae (на примере Klebsiella pneumoniae).

Задачи исследования.

1. Охарактеризовать биоразнообразие энтеробактерий в следующих природных объектах:

- микробоценозы общественных насекомых и субстратов, с которыми они активно контактируют;

- вегетативные и генеративные части некоторых медоносных растений, посещаемых пчелами;

- содержимое кишечника дождевых червей как основных аккумуляторов почвенной микрофлоры.

2. Сравнить физиолого-биохимические свойства штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из разных местообитаний.

Научная новизна работы. Показаны новые местообитания микроорганизмов сем. Enterobacteriaceae в природной среде: насекомые - растения - почва.

Впервые показано, что микробоценоз медоносных пчел включает не менее 18 видов, представителей 10 родов сем. Enterobacteriaceae; в составе микробоценозов вегетативной и генеративной частей медоносных растений обнаруживается не менее 14 видов, представителей 9 родов семейства Enterobacteriaceae; энтерофлора дождевых червей включает не менее 12 видов, представителей 9 родов сем. Enterobacteriaceae.

Впервые выявлена возможная резервуарная роль субстратов муравейников в отношении энтеробактерий.

Впервые показаны различия физиолого-биохимических свойств штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из резервуаров «почва-растения» и «насекомые-человек», которые отличались адаптационными свойствами и параметрами,

определяющими их потенциальную патогенность.

4

Практическая значимость работы.

Результаты исследований могут быть использованы экологами и микробиологами, зоологами, ботаниками и энтомологами, а также эпидемиологами [ля поиска бактерий с «непрофессиональным» паразитизмом, при разработке эффективных противоэпидемических и профилактических мероприятий.

Характеристика пейзажа общей энтерофлоры пчел может способствовать ациональному подбору оптимальных антимикробных препаратов для лечения болезней этих насекомых.

Различия в литической активности клебсиеллезного бактериофага по отношению к штаммам из групп «почва-растения» и «насекомые-человек» показывают необходимость расширения пула фагов, входящих в состав препарата, за счет «природных» штаммов, с целью повышения его валентности и литической активности.

Выявленные особенности разнообразия «природных» штаммов энтеробактерий открывают новые направления исследования структуры популяций различных возбудителей сапронозов.

Полученные данные могут быть включены в программу спецкурсов и учебные особия по экологии потенциально-патогенных микроорганизмов.

Положения, выносимые кз защиту.

1. Микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae являются естественными эмпонентами консорций: насекомые - растения - почва.

2. Общая микрофлора медоносных пчел включает не менее 18 видов, эедставителей 10 родов сем. Enterobacteriaceae.

3. Вегетативная и генеративная части медоносных растений содержат не енее 14 видов, представителей девяти родов сем. Enterobacteriaceae.

4. Энтеробактерии девяти родов с доминированием p. Klebsiella и р. itrobacter обнаруживаются в пищеварительной системе дождевых червей.

5. Штаммы клебсиелл, выделенные из различных природных источников, гличаются физиолого-биохимическими свойствами, что позволяет объединить их в уппы по местообитанию.

Апробация работы. Результаты работы представлены на VIII Всероссийской популяционном семинаре «Популяции в пространстве и во времени» (Н. Новгород 2005), научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний» (Н. Новгород, 2006), на 10-1 Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века (Пущино, 2006), Всероссийской научной конференции "Современные проблем! медицинской микробиологии" (Санкт-Петербург, 2007), XII Нижегородской сесси молодых ученых (естественнонаучные дисциплины) (Н. Новгород, 2007), D Всероссийской научной конференции «Принципы и способы сохранени биоразнообразия» (Йошкар-Ола, 2008), XIII Нижегородской сессии молодых учены (естественнонаучные дисциплины) (Н. Новгород, 2008), IV международной научнс практической конференции «Научное пространство Европы - 2008» (София, 2008), Всероссийском, с международным участием конгрессе студентов и аспиранто биологов «Симбиоз - Россия 2008» (Казань, 2008).

По материалам диссертации опубликовано 18 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа в объеме 14 . листов состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методе исследований, собственных результатов и их обсуждения, выводов, спи« цитированной литературы и приложения (17 страниц). Диссертация иллюстрирова* 30 рисунками и 15 таблицами. Библиографический указатель включает 1' источников литературы (112 отечественных и 63 иностранных).

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научно!» руководителю к.б.н. Речкину А.И. за профессиональные советы, квалифицированну помощь и поддержку при написании диссертации, а также к.б.н. Г.Н. Ладыгино д.м.н. Н.А. Добротиной, д.м.н. И.В. Соловьевой, к.б.н. А. Мочеловой, Ю. Мацков< за участие и рекомендации; зав. кафедрой и директору НИИМБРЭ д.б.н. В.: Новикову и декану биологического ф-та д.б.н. А.П. Веселову за предоставление ба: для исследований; к.б.н. Г.А. Кравченко за помощь при подготовке к защите; зг лабораторией Р.В. Власовой за поддержку и понимание; к.б.н. А. Бабаеву, к.б.н. ' Уткину, А. Нижегородцеву за советы; а также А. Игнатову и своей семье моральную и материальную поддержку.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

В данной главе рассматриваются современные представления об экологии потенциально-патогенных микроорганизмов сем. Enterobacteriaceae, возможные природные местообитания и участники циркуляции энтеробактерий в консорции: насекомые - растения - почва.

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Материалы исследования.

Материалы исследования были отобраны в периоды цветения медоносных растений на нескольких экспериментальных площадках в 8 районах Нижегородской области в радиусе 2 км от пасек. Материалами исследования служили:

1) пчела медоносная (Apis mellifera)\

2) типичные для Нижегородской области медоносные растения: кипрей узколистный (Chamaenerium angustifolium (L) Scop; липа сердце видная (Tilia cor data. Mill,); клевер луговой (Trifolium pretense L.); одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale Wigg.)\ малина обыкновенная (Rubus idaeus L.). У медоносных растений исследовали энтерофлору генеративной и вегетативной частей;

3) растительные компоненты куполов муравейников (Formica (s.str.) aquilonia Yarr., Formica(s.str.) pratensis Retz.), поверхность листьев растений вблизи муравейников;

4) содержимое кишечника дождевого червя (Lumbricus terrestris L.).

Пробы представляли собой суспензии микроорганизмов, полученные в результате смыва с поверхности листьев медоносных растений, компонентов муравейников; разведения содержимого кишечника дождевых червей в физиологическом растворе; дезинтеграции пчел (5—6 особей), тканей листьев, стеблей и цветов медоносных растений. Все манипуляции проводились с соблюдением правил асептики.

5) 19 штаммов Klebsiella pneumoniae, изолированных из различных природных местообитаний.

2.2 Методы исследования.

2.2.1. Выделение бактерий сем. Enterobacteriaceae проводили на питательных средах: Эндо, Плоскирева, Висмут-сульфит агар, Олькеницкого. Идентификация микроорганизмов проводилась с использованием пластин биохимических, дифференцирующих энтеробактерии (ПБДЭ). Результаты интерпретировали по схемам и таблицам Определителя бактерий Берджи (1998).

2.2.2. Изучение физиологических свойств штаммов кяебсиелл, характеризующих их адаптационные возможности:

2.2.2.1. Анализ азотфиксирующей активности - по способности к росту на элективной безазотяой среде Эшби (Блохина,1986).

2.2.2.2. Установление чувствительности штаммов к различным концентрациям хлористого натрия в среде (2,5% и 6,5%) на селективном питательном бульоне (Блохина,198б).

2.2.2.3. Оценка чувствительности штаммов к действию эфирных масел (мятное, гвоздичное, кориандровое, скипидар, цитраль, эвкалиптовое, лавандовое) — методом репликаций (для водонерастворимых лекарственных средств) (Фармацевтические методы..., 1997).

2.2.2.4. Изучение антагонистических или синергетических взаимодействий исследуемых штаммов со стандартным штаммом Е. coli МП, продуцирующим бактериоцины (Блохина,1986).

2.2.3. Исследование факторов патогенности штаммов.

2.2.3.1. Лецитиназную (Бергер, 1982) и гемолитическую (Бухарин, 2005), ДНК-азную и фосфатазную активность оценивали методом посева на специальные питательные среды: желточный, кровяной агар, среды с добавлением ДНК и фосфатов (Приказ №535).

2.2.3.2. Определяли способность к адгезии на эритроцитах человека по методу Брилиса (Брилис, 1986).

2.2.3.3. Для поиска генов термостабильного и термолабильного токсинов

энтеробактерий проводили ПЦР с использованием тест-системы "E.coli tox (LT, ST)";

для обнаружения шигаподобных токинов 1-го и 2-го типов, определяющих

8

>атогенность энтеробактерий — ПДР с использованием тест-системы "E.coli tox (VT-VT-2)" (Жеребцова, 2007).

2.2.3.4. Тестировали исследуемые культуры на чувствительность к 18 нтибиотикам различных классов (НИЦФ, Санкт-Петербург) стандартным диско-[иффузионным методом (Маркова, 2005).

2.2.3.5. Оценка возможности применения поливалентных бактериофагов «ИмБио», Н.Новгород) против потенциально-патогенных штаммов клебсиелл по 1етоду Аппельмана (Габрилович, 1968).

2.2.4. Статистическая обработка результатов с помощью программ Microsoft 7ле1, Statistica5.ll.

Глава 3. Результаты и их обсуждение 3.1. Поиск местообитаний энтероба!стерий в природной среде

В настоящей работе представлены результаты поиска природных [естообитаний энтеробактерий в системе: насекомые—растения—почва, [роанализировано более 480 проб природных субстратов. Всего идентифицировано 154 штамма бактерий сем. Enterobacteriaceae, представителей 10 родов.

Представители семейства Enterobacteriaceae обнаружены во всех исследуемых убстратах. Изолированные культуры идентифицировали как представители родов erratia, Hafrtia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Morganella, Providencia, 'scherichia, Envinia. Наиболее часто во всех субстратах обнаруживали бактерии одов Erwinia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter.

Выявлено разнообразие природных местообитаний энтеробактерий, в качестве эторых могут выступать: кишечник дождевых червей, субстраты муравейников, едоносные растения, пчелы.

3.2. Спектр энтеробактерий в составе микробоценоза медоносных пчел

Впервые проведен целенаправленный анализ микробоценоза медоносных пчел целью характеристики пейзажа энтеробактерий. Спектр энтеробактерий в составе икробоценоза пчёл оказался более разнообразным, чем описывалось ранее, и сшочал 18 видов, представителей 10 родов семейства Enterobacteriaceae (рис. 1).

Рис. 1. Спектр родов энтеробактерий в составе общей микрофлоры пчел

Подобный феномен, на наш взгляд, объясняется способностью пчел в процессе медосбора посещать большие территории, контактируя с различными медоносными растениями, микрофлора которых также весьма разнообразна, что подтверждают наши дальнейшие исследования. Так, в составе микрофлоры пчел особенно часто присутствовали эрвинии (30%). Эти же бактерии превалировали в энтерофлоре цветов медоносных растений: одуванчик (78%), малина (57%), липа (46%). Впервые в микробоценозе пчел обнаружены бактерии родов Morganella, Providencia, Serratia, что расширило теоретические представления об энтерофлоре этих насекомых.

При сравнении видового разнообразия энтеробактерий пчел и медоносных растений (критерий Манна-Уитни) показаны статистически значимые различия (р=0,02), что может свидетельствовать о специфике данных местообитаний, но н исключает циркуляции энтеробактерий в трофической системе: пчелы - медоносны растения.

Обращает на себя внимание высокая встречаемость в природны местообитаниях микроорганизмов-«лидеров» инфекционной патологии человек! таких как Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus. Среди названных труп, обнаружены следующие виды: Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, EnterobacU cloacae, Citrobacter freundii, Citrobacter amalonaticus, Proteus vulgaris, Protei mirabilis.

3.3. Медоносные растения как резервуар энтеробактерий в природе

Микробоценозы медоносных растений, тем более возможность их бы

резервуаром для энтеробактерий изучены крайне недостаточно. Согласно даннг

10

::: стоящего исследования, в составе энтерофлоры медоносных растений обнаружены 14 видов, представителей девяти родов семейства Enterobacteriaceae.

При сравнении видового разнообразия энтеробактерий на вегетативной и перативной частях медоносных растений статистически значимых различий не Гяаружено. Микрофлора вегетативных частей медоносных растений представлена .. серобактериями р. Erwinia, Citrobacter, Serratia, Hqfkia, Escherichia, Enterobacter

Исследование внутритканевой микрофлоры показало присутствие в тканях ;тьев таких родов энтеробактерий, как Erwinia, Escherichia и Citrobacter. Описаны /чаи выделения из филлосферы и тканей растений штаммов цитробактера, : зсобных к азотфиксации, что обеспечивает их выживание в средах с недостатком : эта (Andrews, 1991).

В составе микробоценоза. генеративной части медоносных растений ^ларужены энтеробактерии р. Erwinia, Citrobacter, Serratia, Hafnia, Escherichia, . terobacter, а также микроорганизмы p. Klebsiella, p. Providencia и p. Proteus. При im у всех исследованных видов растений выявлены микроорганизмы родов ibsiella, Citrobacter и Enterobacter, что, возможно, связано с химическим составом .ветков, их сигнальными метаболитами: тритерпеновые соединения; витамины В, А, \ минералы (железо, магний, калий, бор, сера и др.), являющимися аттрактантами " i определенных штаммов (Ленгелер, 2005).

Рис. 2. Спектр родов энтеробактерий на вегетативной и генеративной частях :. юносных растений

1С. 2).

%

60 -

И

Среди обнаруженных микроорганизмов по частоте выделения доминировал, бактерии рода Erwinia. Erwinia herbicola является типичным эпифитным патогенны» галлообразующим микроорганизмом, широко распространенным среди растени] (Покровский, 1999). Эрвинии изолированы нами со всех исследованных rpyni растений, что свидетельствует о способности эпифитных микроорганизмов жить н различных растениях, и не противоречит известным фактам о специфическо приспособленности эпифитов-симбионтов или эпифитов-паразитов к определенны] растительным организмам (Zinniel, 2002).

В составе микробоценоза медоносных растений обнаружены представители те же родов энтеробактерий, что и в микрофлоре медоносных пчел. Вышесказанно позволяет рассматривать медоносные растения в качестве потенциальны резервуаров энтеробактерий в природной среде и возможных участников циркуляци диких штаммов в системе медоносные растения-пчелы.

3.4, Исследование энтерофлоры содержимого кишечника дояадевы червей

Одним из постоянных местообитаний энтеробактерий является почва. Показав роль почвенных беспозвоночных, в частности, дождевых червей в аккумуляци микроорганизмов почвы (В.А. Вызов, 2005). В настоящей работе оценивал потенциальную возможность дождевых червей быть природным резервуаро энтеробактерий.

Выявлено, что микробоценоз пищеварительного тракта дождевых черве включает 12 видов, представителей девяти родов сем. Enterobacteriaceae, cpeí которых достоверно чаще обнаруживаются Citrobacter (40%) и Klebsiella (371 (рис.3). Из содержимого кишечника дождевых червей изолированы Hafiiia spj. Enterobacter spp., Providencia spp., Proteus spp., Serratia spp., Erwinia spp., Escherich spp.

При пассаже через пищеварительный тракт дождевых червей возможен i только рост численности бактериальных популяций, но и активизация покоящих' клеток, некультивируемых форм бактерий, персистирующих в почве и i обнаруживаемых классическими микробиологическими методами (Вызов, 2005), че

на наш взгляд, может объясняться разнообразие энтеробактерий, обнаруженных в кишечном содержимом дождевых червей.

Рис. 3. Спектр родов энтеробактерий в содержимом кишечника дождевых I червей

Обращает внимание значительная обсемененность червей представителями юдов Citrobacter (40%), Klebsiella (37%), Enterobacter (19%), Erwinia (16%), также наиболее часто выделяющимися из растений и пчел. По-мнению ряда ¡исследователей, именно почва является естественным резервуаром для многих j возбудителей сапронозов. Растения служат источником инфицирования наземных животных и являются звеном, выносящим возбудителей из почвы, где они постоянно битают, в наземные экосистемы (Бухарин, Литвин, 1997).

3.5. Исследование пейзажа энтеробактерий в компонентах муравейника и шллосфере соседствующих растений

Другим звеном выноса микроорганизмов из почвы могут быть муравейники. Муравейники - специфические биотопы, формирующиеся в почвенном и здпочвенном ярусах и достигающие в лесных экосистемах высокой плотности, -роме того, растительные компоненты (хвоя и кора голосеменных растений), эторые составляют основную массу субстратов купола исследуемых нами ■ муравейников, содержат эндосимбионтов сем. Enterobacteriaceae (Duncan, 1972). 1 Постройки муравьев как специфические местообитания отличаются от интактной : эчвы не только обогащением органикой, особым микроклиматом, но и

механическим составом материала гнезда, представляющего собой рыхлый, грубогумусированный субстрат (Корганова, Рахлеева, 2005).

Известно, что многие виды муравьев поддерживают высокоразвитые симбиотические отношения с другими насекомыми и растениями, что, на наш взгляд, может способствовать распространению микрофлоры, сосредоточенной в их гнездах.

Поиск энтеробактерий в микробоценозе муравейников проведен впервые. Показано, что субстраты муравейников содержат микроорганизмы 11 видов и семи родов семейства Enterobacteriaceae-, Klebsiella spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp., Providencia spp., Serratia spp., Erwinia spp., Escherichia spp. — и могут выступать в качестве природного местообитания энтеробактерий.

Следует отметить, что субстраты муравейников и филлосфера соседствующих растений весьма сходны по микробному пейзажу (р. Enterobacter выделен в 44 и 67% соответственно), что, вероятно, является следствием тесных трофических взаимоотношений в системе «муравейник—растения» (рис.4).

Рис. 4. Представители родов энтеробактерий в субстратах муравейников и филлосфере соседствующих растений

Компоненты муравейников представляют собой систему, обеспечивающую важнейшие в биогеоценотическом плане процессы, в том числе и процесс фиксации молекулярного азота, осуществляемый энтеробактериями.

Микрофлора субстратов муравейников оказалась во многом идентична энтерофлоре дождевых червей, что может быть связано, с одной стороны, с' условиями обитания муравьев, с другой — с несомненным богатством органически:

субстратов муравейников, близким по составу с органическим веществом почвы, утилизируемым дождевыми червями.

3.6. Распространение энтеробактерий в природной системе «насекомые— растения—почва»

Выявлено разнообразие природных местообитаний (дождевые черви, субстраты муравейников, медоносные растения, пчелы), где энтеробактерии являются естественными обитателями, осуществляющими определенную биологическую роль.

При сравнении наиболее часто обнаруживаемых во всех исследуемых субстратах родов энтеробактерий, таких как Erwinia, Enterobacter, Klebsiella и Citrobacter показано статистически достоверное доминирование микроорганизмов рода Erwinia в энтерофлоре медоносных растений и бактерий родов Enterobacter, Klebsiella и Citrobacter в пищеварительном тракте дождевых червей (рис. 5).

и дождевые черви ■ медоносные растения ¡я пчелы

Рис. 5. Соотношение родов энтеробактерий в исследуемых местообитаниях (*- достоверные различия частот встречаемости микроорганизмов в местообитаниях дожд.черви - медоносные растения; ** - достоверные различия частот встречаемости микроорганизмов в местообитаниях дожд.черви - пчелы; # - достоверные различия частот встречаемости микроорганизмов в местообитаниях пчелы - медоносные растения)

Достаточно частое выявление вышеназванных родов энтеробактерий в системе «насекомые—растения—почва» позволяет предположить их функциональную значимость в исследуемых местообитаниях.

Всего Медоносные растения Пчелы Дождевые черви Растения вблизи муравейников Субстрат муравейников Исследуемый субстрат

00 о ro о сл œ <o —t о СЛ м СП Количество обследованных проб

ag 4P 130 (63%) 82 (92%) 93 (89%) 17 (71%) 38 1 (67%) Количество проб, содержащих энтеробакгерии

со (О œ ш со á А 00 Erwinia herbicola Количество проб, содержащих бактерий вида...(%)

ID u 0) _ь _Ь i сл Citrobacter freundii

0) —к C5 со СО 01 1 1 Citrobacter amalonaticus

-д. 05 Citrobacter diversus

05 Providencia aicaiifaciens

05 со 05 ' 1 i Providencia rettgeri

to N О) N5 i i Proteus vulgaris

w 1 ОТ 1 • i Proteus mirabilis

0) со А О ■ 00 Escherichia coli

-1 M i 1 ■ 1 Escherichia adecarboxylata

00 (О 05 СЛ сл о Enterobacter cloacae

N5 ' i 05 i аз Enterobacter aerogenes

1 N3 1 ai 05 Enterobacter intermedium

_ь I I4J i 1 05 Enterobacter sakazakii

—к M -Л i 1 1 Enterobacter gergoviae

M M N5 —к О —i N5 _i CD Klebsiella pneumoniae

-4 со M <о i ■ Klebsiella oxytoca

oo 05 го <о 05 i Hafnia aivei

<0 (0 ■vi ' i Serratia marcescens

ro 14) Л i i Serratia iiquefaciens

1 t t 1 05 Serratia ficaria

_i ' 1 ' 05 i Serratia plymutica

_i 1 А 1 1 Morganella morganii

Сравнение видового разнообразия энтеробактерий исследуемых местообитаний оценивали с помощью меры Уиттекера, позволяющей дифференцировать местообитания по степени «благоприятности» для энтеробактерий. Степень «благоприятности» местообитания определяет диапазон доступных бактериям ресурсов, которые могут быть использованы большим числом видов. Так, наиболее «благоприятным» местообитанием энтеробактерий является организм медоносных пчел (табл.1). Возрастание в сообществе межвидовой конкуренции повышает вероятность, что имеющиеся ресурсы будут использоваться полностью. Менее «благоприятными» местообитаниями для энтеробактерий являются растительные субстраты муравейников и растения вблизи них. В связи с тем, что часть ресурсов не используется, видовое разнообразие этих сообществ беднее, чем в более «благоприятных» сообществах.

3.7. Изучение физиолого-биохимических свойств штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из различных местообитаний

3.7.1. Распространение бактерий Klebsiella sp. в исследуемых природных субстратах

На сегодняшний день бактерии Klebsiella spp. входят в число основных возбудителей внутрибольничных инфекций, заболеваний различного характера. В ходе исследования клебсиеллы изолированы из 20% проб всех исследованных субстратов и обнаруживались в энтерофлоре изученных объектов с разной частотой (рис. 6), во всех исследуемых субстратах клебсиеллы составляли значительную долю изолятов.

Рис. 6. Распространение бактерий р.Klebsiella в природных местообитаниях

Вышесказанное послужило основанием к дальнейшему изучению их биологических свойств.

Всего исследовано 19 штаммов Klebsiella pneumoniae из разных местообитаний, в том числе 2 штамма изолированы от больных людей, 4 - от пчел, 4 — от растений, 5 — из кишечного содержимого дождевых червей и 4 — из субстратов муравейников.

3.7.2. Изучение адаптационных возможностей штаммов Klebsiella pneumoniae

Согласно полученным данным, штаммы Klebsiella pneumoniae были объединены в 2 группы, связанные с местообитанием: «почва—растения», «насекомые—человек».

Исследование физиолого-биохимических свойств изолированных штаммов Klebsiella pneumoniae, определяющих их адаптационные возможности: азотфиксирующей активности, было направлено на выявление устойчивости к высокой концентрации хлористого натрия в среде, действию эфирных масел, бактериоцинам Е. coli.

Слабый рост или его отсутствие на безазотистой среде Эшби отмечен у штаммов, изолированных от растений и дождевых червей.

Устойчивость к высокой концентрации хлористого натрия (6,5%) в среде отмечена у 63% исследуемых штаммов Klebsiella pneumoniae. Чувствительность наблюдалось преимущественно у культур, изолированных от дождевых червей. Таким образом, штаммы Klebsiella, изолированные из местообитаний «почва— растения» оказались достоверно менее адаптированными к отсутствию источников азота и высокой концентрации хлористого натрия в среде.

В поддержании видового разнообразия бактериальных популяций также велико

значение антагонизма. Микроорганизмы, продуцирующие бактериоцины, могут

полностью изымать из сообщества отдельные виды бактерий (Алимов, 1992). Из-за

антагонизма численность видов может поддерживаться на низком уровне, что

приведет к снижению межвидовой конкуренции, а это, в свою очередь, может

явиться причиной повышения видового разнообразия. Исследования

антагонистической активности E.coli Ml7, продуцирующей колицины, были

направлены на оценку выживаемости и конкурентоспособности разных штаммов

Klebsiella pneumoniae. Способность колицинов подавлять рост клебсиелл показана

18

для культур, изолированных от растений и дождевых червей, остальные штаммы оказались резистентными к данным бактериоцинам.

Штаммы из группы «насекомые—человек» обладали большей устойчивостью к действию практически всех эфирных масел, чем представители группы «почва— растения».

Выявлено биоразнообразие адаптационных возможностей штаммов клебсиелл, выделенных из различных местообитаний: 63% исследуемых штаммов оставались жизнеспособными в средах с высокой концентрацией солей, 67% — при отсутствии доступного азота, 52% — резистентны к антимикробному действию эфирных масел и 84% — к действию колицинов. Исследование адаптационных способностей показало правомочность объединения изучаемых штаммов в группы по местообитанию.

3.8.2. Исследование потенциальной патогенности штаммов Klebsiella pneumoniae

Дифференциацию штаммов Klebsiella pneumoniae на 2 группы по местообитанию подтверждают и данные по изучению факторов патогенноста

ДНК-азная активность обнаружена у 37% штаммов, большинство из которых изолированы из кишечного содержимого дождевых червей. Аналогичная способность показана для ряда штаммов, выделенных от растений, что, с нашей точки зрения, может объясняться циркуляцией энтеробактерий в системе «почва— растения», где растения служат звеном, выносящим популяции микроорганизмов из почвы. Кроме того, у штаммов из группы «почва—растения» обнаружена лецитиназная и гемолитическая активность (рис. 7).

Разнообразные ферменты — факторы патогенности (ДНКаза, лецитиназа, гемолизины, фосфатаза), обнаруженные нами у штаммов Klebsiella pneumoniae, изолированных преимущественно из местообитаний «почва—растения», согласуются с мнением Бухарина О.В. и Литвина В.Ю. (1997) о том, что в природной среде сосредоточено биоразнообразие генетических вариантов микроорганизмов.

Человек

Насекомые

Почва

Растения

[аЛецитиназная ИФосфатазная ВДНКазная И Гемолитическая | Рис. 7. Количество штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из различных природных местообитаний, обладающих ферментами - факторами патогенности

(*- достоверные различия)

По способности адгезироваться на эритроцитах человека исследуемые штаммы также можно разделить на 2 группы. Низкая и средняя степень адгезивности отмечена у штаммов, изолированных от насекомых.

Способность к адгезии иногда может иметь решающее значение для успеха в борьбе за существование, кроме того, адгезивная активность является одним из важнейших факторов, обуславливающих патогенность бактерий и развитие патологического процесса. Специфичность адгезии обусловлена наличием комплементарных структур у адгезинов микробов и лигандов чувствительных к ним эукариотических клеток макроорганизма.

Циркуляция штаммов Klebsiella pneumoniae у медоносных пчел — в ближайшем окружении человека, в дальнейшем может привести к модификации генов, ответственных за адгезию и повысить степень проявления этого фактора патогенности.

Поскольку бактерии p. Klebsiella все чаще вносят свой вклад в этиологию внутрибольничных заболеваний, возрос интерес к использованию специфических бактериофагов для лечения и профилактики ряда инфекций, в том числе, и вызванных Klebsiella pneumoniae.

Проведённые исследования позволяют предположить наличие двух групп штаммов, так называемых «человеческих» и «природных», по отношению к которым показана статистически достоверная дифференциация литической активности фага. Это подтверждает положение о специфике рецепторов фага к определенным комплементарным поверхностным структурам клеточных стенок бактерий, выделенных из различных субстратов.

Обращает на себя внимание феномен лизиса бактериофагом штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных от насекомых, что заставляет предполагать идентичность поверхностных структур этих штаммов и штаммов, изолированных от человека.

Не менее четко дифференциация штаммов на две группы в зависимости от их местообитания прослеживается и при исследовании антибиотикорезистентности. Спектр антибиотикорезистентности шире у штаммов из группы «почва—растения». Выявлено достоверное различие резистентности к аминогликозидам штаммов из

разных групп (рис.8).

%

"Насекомые - "Почва -

человек" растения"

Япенициллины а цефалоспорины шаминогликозиды втетрациклины

вполимиксин шлевомицетин намикацин

Рис. 8. Доля штаммов Klebsiella pneumoniae, устойчивых к антимикробным препаратам (%)

Все исследуемые штаммы были полирезистентны к антимикробным препаратам: 63% — к 6—9 препаратам одновременно, 37% •—-к 4—5 препаратам. Наибольшая устойчивость отмечена к карбенициллину, азлоциллину, ристомицину, линкомицину, фузидину.

По-мненгао Ленгелера, проблема антибиотикорезистентности — это проблема эпидемии генов резистентности в глобальных сетях экосистем микроорганизмов (Ленгелер, 2005). Распространение генов резистентности обуславливает биоразнообразие популяций бактерий в природных сообществах, характеризующееся наличием плазмид резистентности.

Поиск генов - факторов патогенности энтеробактерий, кодирующих термолабильный, термостабильный токсины и шигоподобные цитотоксины, не выявил положительных вариантов среди исследуемых штаммов.

Таким образом, показано биоразнообразие штаммов, изолированных из различных природных местообитаний, по адаптационным способностям и свойствам, определяющим потенциальную патогенность (рис. 9).

Рис. 9. Биоразнообразие штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из природных местообитаний (*- достоверные различия)

Внутривидовое биоразнообразие штаммов Klebsiella pneumoniae обеспечивается, скорее всего, популяционными механизмами, в основе которых лежит исходная гетерогенность популяции по любому из жизненно-важных признаков.

Селективные процессы, происходящие при попадании в новую среду обитания, не уничтожают эту гетерогенность, а как бы «смещают» ее в соответствующем направлении путем изменения процентного соотношения особей с адекватными среде свойствами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Природная среда - основной резервуар для микроорганизмов-возбудителей сапронозов, среди которых особое значение имеет семейство Enterobacteriaeeae. Обладая широким диапазоном экологической толерантности данные микроорганизмы способны занимать различные экологические ниши, в том числе быть участниками консорций насекомые—растения—почва. В данной работе расширены теоретические представления о возможных природных местообитаниях энтеробактерий, среди которых отмечены: пчелы, медоносные растения, компоненты муравейников, содержимое кишечника дождевых червей.

Показано биоразнообразие энтеробактерий в исследуемых местообитаниях. Наиболее часто во всех местообитаниях обнаруживались бактерии родов Erwinia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, что может свидетельствовать об их функциональной значимости. Биоразнообразие энтеробактерий выявлено и внутри популяции штаммов Klebsiella pneumoniae, изолированных из различных местообитаний. Физиолого-биохимичесхие признаки и степень проявления факторов патогенности позволили объединить исследуемые штаммы в группы по местообитанию: «почва—растения», «насекомые—человек», что согласуется с позицией В.Ю. Литвина и В.О. Бухарина (1997) о двух параллельно существующих частях популяции условно-патогенных микроорганизмов - внеорганизменной и организменной, причем внеорганизменная (природная) — является доминирующей.

выводы

1. Установлено биоразнообразие бактерий семейства Enterobacteriaceae в природных местообитаниях (пчелы, медоносные растения, субстраты муравейников и дождевые черви). Идентифицированы представители родов Serratia, Haftiia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Morganella, Providencia, Escherichia, Erwinia. Наиболее часто во всех субстратах выявлялись бактерии родов Erwinia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter,

2. Показано, что микробоценоз медоносных пчел включает не менее 18 видов энтеробактерий, представителей 10 родов. Впервые в составе энтерофлоры пчел обнаружены микроорганизмы родов Morganella, Providencia, Serratia.

3. В состав микрофлоры вегетативной и генеративной частей медоносных растений входят не менее 14 видов энтеробактерий, представители 9 родов с доминированием микроорганизмов р. Erwinia.

4. В микробоценозе кишечника дождевых червей обнаружены 12 видов энтеробактерий, представители 9 родов, й установлено доминирование микроорганизмов Klebsiella spp. и Citrobacter spp.

5. Выявлено биоразнообразие штаммов Klebsiella pneumoniae по физиолого-биохимическим признакам и факторам патогенности, позволяющее объединить их в группы, связанные с местообитанием: «почва-растения», «насекомые-человек».

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК:

1. Речкин А.И. Поиск новых резервуаров для персистенции и участников циркуляции энтеробактерий в естественных экосистемах / Речкин А.И., Евтеева Н.И. // Вестник Нижегородского университета им. H.H. Лобачевского. 2007, №6. С. 99-103 (принято к печати 23.11.2007). .

2. Речкин А.И. Микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae в природных сообществах / Речкин А.И., Евтеева Н.И. // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2008, Т. 1. С. 222-225.

24

П. Статьи, доклады, тезисы докладов региональных и всероссийских :онференций:

1. Евтеева Н.И, Энтеробактерии в ближайшем окружении человека / втеева Н.И., Речкин А.И. // Популяции в пространстве и во времени. Сборник :атериалов УШ Всеросс. популяцион. семинара. Н. Новгород, 2005. С.89-91.

2. Речкин А. И. Пейзаж энтеробакгерий разных природных резервуаров / ечкин А. И., Евтеева Н. И., Касаткина Е. О. // Новые технологии в профилактике, и агностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний. Матер, научн. шференции. Н.Новгород, 2006. С. 59-61.

3. Евтеева Н.И. Экологические аспекты существования энтеробакгерий / атеева Н. И., Речкин А. И. // Материалы Всероссийской научной конференции Современные проблемы медицинской микробиологии"/ Под ред. А.П. Щербо, В.Д. щикова, В.Г. Кубася. СПб.: ГНУ ИОВ РАО, 2007. С.188-189.

4. Чернышева А.Ю. Энтеробактерии как компонент содержимого опечника дождевых червей (Lumbricus terrestris L.) / Чернышева А.Ю., Евтеева ,И. // Сборник материалов III Всеросс. научн. конференции «Принципы и способы хранения биоразнообразия». Пущино, 2008. С. 95-96.

5. Евтеева Н.И. Klebsiella sp. в природной среде / Евтеева Н.И., Речкин И. //«Научная мысль информационного века - 2008». Прага, 2008. Т. 11. С. 9-11.

6. Евтеева Н.И. Компоненты муравейника как потенциальный резервуар геробактерий в природной среде // Сборник материалов III Всеросс. научн. аференции «Принципы и способы сохранения биоразнообразия», Пущино, 2008. 61-62.

7. Evteeva N.I. The new places of reservation Enterobacteriaceae in natural terns / Evteeva N.I., Rechkin A.I. // Материалы IV международной научно-практич. 1ференции «Научное пространство Европы - 2008». София, 2008. Т. 21. С. 28-30.

8. Евтеева Н.И. Новые природные резервуары и биологические свойства зммов Klebsiella pneumoniae I Евтеева НЛ., Речкин А.И. П Сборник науч.тр. I ¡росс., с междунар. участием конгресса студентов и аспирантов биологов шбиоз Россия 2008». Казань, 2008. С. 114-119.

Заказ {3 Тираж У СО Экз. ООП ВВАГС

603950, Н.Новгород-292, пр. Гагарина. 46

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Евтеева, Надежда Ивановна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Ы. Условно-патогенные бактерии в природе. Экологические аспекты

1.1.1. Сапрофитическая природа возбудителей

1.1.2. Типы природных резервуаров бактерий 13 1.2. Возможные резервуары энтеробактерий в природе

1.2.1. Почва как среда обитания микроорганизмов

1.2.1.1. Влияние дождевых червей {Lumbricus terrestris L.) на почву

1.2.1.2. Видовой состав бактерий кишечной группы, встречающихся в почве

1.2.2. Муравьи и их гнезда

1.2.3. Растения как резервуары энтеробактерий в окружающей среде

1.2.3.1. Формирование эпифитной микрофлоры

1.2.3.2. Источники питания эпифитной микрофлоры

1.2.3.3. Состав микроорганизмов на надземных органах растений

1.2.4. Пчелы как резервуар энтеробактерий в природе

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Поиск новых резервуаров энтеробактерий в природной среде

3.1.1. Пейзаж энтеробактерий в составе общей микрофлоры медоносных пчел

3.1.2. Анализ энтерофлоры медоносных растений

3.1.2.1. Исследование энтерофлоры липы сердцевидной

3.1.2.2. Исследование энтерофлоры цветов малины

3.1.2.3. Исследование энтерофлоры цветов одуванчика

3.1.2.4. Исследование энтерофлоры вегетативной части кипрея узколистного

3.1.2.5. Исследование микрофлоры вегетативной части клевера лугового

3.1.2.6. Медоносные растения как резервуар энтеробактерий в природе

3.1.3. Исследование пейзажа энтеробактерий в компонентах муравейника

3.1.4. Исследование энтерофлоры содержимого кишечника дождевых червей

3.1.5. Природные резервуары бактерий сем. Entevobacteriaeae

3.2 Распространение бактерий Klebsiella sp. в исследуемых природных субстратах

3.3.Изучение физиоло го-биохимических свойств штаммов Klebsiella pneumoniae, изолированных из различных источников

3.3.1. Изучение адаптационных свойств 92 3.3.1.1 .Способность фиксировать атмосферный азот

3.3.1.2. Способность роста при высоких значениях хлористого натрия 94 в среде

313.1.3. Антагонистическая активность штаммов

3.3.1.4. Устойчивость штаммов к действию эфирных масел

3.3.2. Исследование потенциальной патогенности штаммов

3.3.2.1. Поиск генов, кодирующих токсины энтеробактерий

3.3.2.2. Изучение антибиотикорезистентности штаммов

3.3.2.3. Исследование гемолитической, лецитиназной, фосфатазной и ДНК-азной активностей

3.3.2.4. Анализ адгезивности культур к эритроцитам человека

3.3.2.5. Исследование лизогенности культур клебсиеллезным бактериофагом (1^мБио, Н. Новгород)

3.3.2.5.1. Исследование литической активности клебсиеллёзного бактериофага в отношении штаммов, изолированных от насекомых

3.3.2.5.2. Лизирование бактериофагом штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из почвы

3.3.2.5.3. Лизирование бактериофагом штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных от растений

3.3.2.5.4. Исследование литической активности поливалентного бактериофага в отношении штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из организма человека

3.3.3. Физиолого-биохимические свойства штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из различных местообитаний

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области"

Актуальность проблемы определяется недостаточной изученностью экологии энтеробактерий, их роли в естественных экосистемах, в местах резервации, а также возможных участников циркуляции в природной среде.

Микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae регулярно выделяются из почвы и воды, сохраняют жизнеспособность в широком диапазоне абиотических факторов среды, нередко обладают патогенностыо для многих беспозвоночных и позвоночных животных, и человека. Способность утилизировать углеводы, спирты, аминокислоты, целый комплекс циклических органических соединений; участие в процессах нитрификации, дёнитрификации, аммонификации, азотфиксации, позволяет энтеробактериям занимать различные местообитания (Ленгелер, 2005).

Ряд авторов (Литвин, 1991, 2003; Сомов 1988; Бухарин, 1997) высказывались о принципиальном наличии у возбудителей сапронозных инфекций, к которым относятся и бактерии семейства Enterobacteriaceae, двух сред обитания - внешняя среда и организм хозяина, и, соответственно, двух экологических фаз - сапрофитической и паразитической, и двух параллельно существующих частей популяции — внеорганизменной и организменной (гостальной). Не исключено, что и переход бактерий из одной среды существования в другую (внешняя среда - организм хозяина) — тоже вынужденный ход микроорганизмов, позволяющий, в конечном счете, обеспечить их выживание как вида. В целом, следует подчеркнуть, что экология патогенных микроорганизмов в сапрофитической фазе существования изучена крайне слабо.

Сообщества микроорганизмов, в свою очередь, представляют собой составные части экологических систем, что, безусловно, определяет актуальность изучения видового разнообразия бактерий в природных местообитаниях.

С позиций современной экологии микроорганизмов актуальным является не только изучение разнообразия видов бактерий, но и физиолого-биохимических различий, определяющих внутривидовое разнообразие штаммов из разных местообитаний (Ленгелер, 2005).

Этиологическая значимость и потенциальная патогенность энтеробактерий обуславливает необходимость более тщательного изучения биологии данной группы возбудителей: прежде всего, местообитаний во внешней среде, условий формирования симбиоценозов и длительности существования их резервуаров. Будучи весьма актуальной, с эпидемиологических позиций, проблема заслуживает целенаправленного популяционно-экологического анализа - как применительно к конкретным микроорганизмам, так и в сравнительно-экологическом аспекте.

Цель исследования.

Выявить распространение и биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях на территории Нижегородской области, а также некоторые физиолого-биохимические свойства, определяющие адаптационные возможности и потенциальную патогенность этиологически значимых представителей семейства Enterobacteriaceae (на примере Klebsiella pneumoniae).

Задачи исследования.

1. Охарактеризовать биоразнообразие энтеробактерий в следующих природных объектах:

- микробоценозы общественных насекомых и субстратов, с которыми они активно контактируют;

- вегетативные и генеративные части некоторых медоносных растений, посещаемых пчелами;

- содержимое кишечника дождевых червей как основных аккумуляторов почвенной микрофлоры.

2, Провести сравнительный анализ физиолого-биохимических свойств штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из разных местообитаний, определяющих их адаптационные возможности и потенциальную патогенность.

Научная новизна работы.

Показаны новые местообитания микроорганизмов сем. Enterobacteriaceae в природной среде: насекомые - растения - почва.

Впервые показано, что микробоценоз медоносных пчел включает не менее 18 видов, представителей 10 родов сем. Enterobacteriaceae.

Впервые показано, что в составе микробоценозов вегетативной и генеративной частей медоносных растений обнаруживаются не менее 14 видов, представители девяти родов семейства Enterobacteriaceae.

Впервые охарактеризован состав энтерофлоры дождевых червей, включающий не менее 12 видов, представителей девяти родов сем. Enterobacteriaceae.

Впервые показана возможная резервуарная роль субстратов 1 муравейников в отношении энтеробактерий.

Впервые показаны различия физиолого-биохимических свойств штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из резервуаров «почва-растения» и штаммов, выделенных из резервуаров «насекомые-человек», которые отличались адаптационными свойствами и параметрами, определяющими их потенциальную патогенность.

Практическая значимость работы.

Результаты исследований могут быть использовапы экологами и микробиологами, зоологами, ботаниками и энтомологами, а также эпидемиологами для поиска бактерий с «непрофессиональным» паразитизмом.

Характеристика пейзажа общей энтерофлоры пчел будет способствовать рациональному подбору оптимальных антимикробных препаратов для лечения болезней этих насекомых.

Различия в литической активности клебсиеллезного бактериофага по i отношению к штаммам из групп «почва-растения» и «насекомые-человек» показывают необходимость расширения пула фагов, входящих в состав препарата, за счет «природных» штаммов, с целью повышения его валентности и литической активности.

Выявленные особенности разнообразия «природных» штаммов энтеробактерий открывают новые направления исследования структуры популяций различных возбудителей сапронозов.

Полученная в ходе исследования информация о потенциальных природных резервуарах энтеробактерий может быть использована при разработке эффективных противоэпидемических и профилактических мероприятий.

Полученные в ходе исследования результаты могут быть использованы при составлении пособий по экологии потенциально-патогенных микроорганизмов.

Положения, выносимые на защиту.

Микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae являются естественными компонентами консорций: насекомые - растения — почва:

Общая микрофлора медоносных пчел включает микроорганизмы не менее 18 видов, представителей 10 родов сем. Enterobacteriaceae.

Вегетативная и генеративная части медоносных растений содержат не менее 14 видов, представителей девяти родов сем. Enterobacteriaceae.

Энтеробактерии обнаруживаются в пищеварительной системе дождевых червей и представлены бактериями девяти родов с доминированием микроорганизмов p. Klebsiella и p. Citrobacter.

Штаммы клебсиелл, выделенные из различных природных источников, отличаются физиолого-биохимическими свойствами, что позволяет объединить их в группы по местообитанию.

Апробация работы. Результаты работы представлены на VIII Всероссийском популяционном семинаре «Популяции в пространстве и во времени» (Н.Новгород, 2005), научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний» (Н.Новгород, 2006), на 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2006), Всероссийской научной конференции "Современные проблемы медицинской микробиологии" (Санкт-Петербург, 2007), XII Нижегородской сессии молодых ученых (Естественнонаучные дисциплины) (Н.Новгород, 2007), III Всероссийской научной конференции «Принципы и способы сохранения биоразнообразия» (Йошкар-Ола, 2008), XIII Нижегородской сессии молодых ученых (Естественнонаучные дисциплины) (Н.Новгород, 2008), IV международной научно-практической конференции «Научное пространство Европы -2008» (София, 2008), I Всероссийском, с международным участием конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз - Россия 2008» (Казань, 2008).

По материалам диссертации опубликовано 18 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа в объеме 144 страниц (основного текста) состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, имеется приложение из 17 страниц. Диссертация иллюстрирована 30 рисунками и 15 таблицами. Библиографический указатель включает 175 источников литературы (112 отечественных и 63 иностранных).

Заключение Диссертация по теме "Экология", Евтеева, Надежда Ивановна

ВЫВОДЫ

1. Установлено биоразнообразие бактерий семейства Enterobacteriaceae в природных местообитаниях (пчелы, медоносные растения, субстраты муравейников и дождевые черви). Идентифицированы представители родов Serratia, Hafnia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Morganella, Providencia, Escherichia, Erwinia. Наиболее часто во всех субстратах выявлялись бактерии родов Erwinia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter.

2. Показано, что микробоценоз медоносных пчел включает не менее 18 видов энтеробактерий, представителей 10 родов. Впервые в составе энтерофлоры пчел обнаружены микроорганизмы родов Morganella, Providencia, Serratia. t 3. В состав микрофлоры вегетативной и генеративной частей медоносных растений входят не менее 14 видов энтеробактерий, представители 9 родов с доминированием микроорганизмов p. Erwinia.

4. В микробоценозе кишечника дождевых червей обнаружены 12 видов энтеробактерий, представители 9 родов, и установлено доминирование микроорганизмов Klebsiella spp. и Citrobacter spp.

5. Выявлено биоразнообразие штаммов Klebsiella pneumoniae по физиолого-биохимическим признакам и факторам патогенности, позволяющее объединить их в группы, связанные с местообитанием: «почва-растения», «насекомые-человек».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В природной среде сосредоточено значительное количество разнообразных микробных популяций, среди которых наибольший интерес представляют патогенные и потенциально-патогенные микроорганизмы всвязи с их высокой этиологической значимостью. Таким образом, информация о местах резервации и участников циркуляции энтеробактерий в природной среде представляется эпидемически значимой. Природные резервуары устойчивы. Это достигается благодаря их эшелонированное™, способности к кумуляции хозяев и переносчиков паразитических видов, наличия хозяев, выполняющих функцию усилителя, способности к смещению < в другие экологические ниши.

В данной работе представлены результаты поиска природных местообитаний энтеробактерий в системе: насекомые — растения — почва. В ходе исследования обнаружены представители семейства Enterobacteriaceae во всех исследуемых субстратах. Изолированные культуры идентифицировали как представители родов Serratia, Hafnia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Morganella, Providencia, Escherichia, Erwinia. Наиболее часто во всех субстратах обнаруживали бактерии родов Erwinia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter.

В результате исследования расширены имеющиеся на сегодняшний день представления о спектре энтеробактерий в составе общей микрофлоры медоносных пчел, включающем представителей 10 родов с доминированием микроорганизмов p. Erwinia. Представление о пейзаже энтеробактерий расширено в результате обнаружения бактерий родов Providencia, Morganella, Serratia. Установлено доминирование микроорганизмов p. Erwinia как в микрофлоре пчел, так и в энтерофлоре медоносных растений. Кроме того, практически все роды энтеробактерий, обнаруженные у пчел, встречались на цветах медоносных растений, что косвенно может свидетельствовать о циркуляции природных штаммов энтеробактерий в системе: пчелы -медоносные растения.

В составе энтерофлоры медоносных растений обнаружены представители девяти родов энтеробактерий, что позволяет рассматривать данные растения как потенциальный резервуар энтеробактерий в природной среде и возможных участников циркуляции диких штаммов в системе медоносные растения - пчелы.

В микрофлоре цветов медоносных растений обнаружено почти в два раза больше родов энтеробактерий, чем в филлосфере, что может быть связано с богатым составом питательных веществ, используемых микроорганизмами.

В ходе исследования природных субстратов показано, что субстраты муравейников содержат микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae, представителей семи родов, и могут выступать в качестве природного i резервуара энтеробактерий. Микробный пейзаж субстратов муравейников оказался во многом сходным с энтерофлорой дождевых червей, что может быть связано, с одной стороны, с условиями обитания муравьев, и, с другой стороны, несомненным богатством органических субстратов муравейников, сходных по составу с органическим веществом почвы, утилизируемым дождевыми червями.

Исследование содержимого кишечника дождевых червей представляло интерес в плане аккумуляционной роли беспозвоночных животных. Установлено доминирование микроорганизмов Klebsiella spp.($l%) и Citrobacter spp.{ 40%) в кишечной микрофлоре дождевых червей, представленной девятью родами энтеробактерий. Почва, по мнению ряда исследователей, является первичным резервуаром энтеробактерий в природе, в то время, как растения - звено, выносящее возбудителя в наземные экосистемы (Бухарин, Литвин, 1997).

Любая стратегия порождает разнообразие тактики, и смена экологической ниши бактериальной клеткой с ее переходом в организм хозяина будет сопровождаться неизменным появлением новых биологических характеристик у бактерий, облегчающих адаптацию патогена к новым условиям среды обитания. При этом следует иметь в виду, прежде всего, те структурно-функциональные перестройки у бактерий возникающие в изменяющейся экологической среде (Бухарин, 1994).

В нашей работе проводилось сравнение адаптационных свойств и потенциальной патогенности штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из различных природных резервуаров. Выявлено биоразнообразие адаптационных возможностей изученных штаммов, выделенных из различных местообитаний, позволяющее объединить их в группы «почва-растения», «насекомые-человек».

Таким образом, в ходе исследования выявлено разнообразие природных местообитаний энтеробактерий, в качестве которых могут выступать дождевые черви, субстраты муравейников, медоносные растения, пчелы и обеспечивать циркуляцию этих бактерий в природных экосистемах, где I данные микроорганизмы можно рассматривать как естественных обитателей, осуществляющих свою биологическую роль. Кроме того, показано биоразнообразие энтеробактерий в исследуемых местообитаниях, выражающееся как на уровне видов, так среди штаммов (на примере Klebsiella pneumoniae).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Евтеева, Надежда Ивановна, Нижний Новгород

1. Алексахина Н.Н., Мирясова Л.В., Баснакьян И.А. Влияние оксидов металлов на рост, гемолитические и серологические свойства Klebsiella pneumoniae//Микробиология. 2002. №6. С. 13 - 18.

2. Алешукина А.Н. Медицинская микробиология.- Ростов: Феникс, 2003.-480с.

3. Аркадьева З.А, Безбородов A.M., Блохина И.Н., Воробьёва Л.И., Головлёв Е.Л., Головлёва Л.А., и др. Промышленная микробиология. М.: Высш. шк.,1989.-688с.

4. Африкян Э.К. Энтомопатогенные бактерии и их значение. Ереван: Изд-во АН Армянской ССР, 1973. 362 с.

5. Бергер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М: Медицина, 1982. 224с.

6. Берджи. Определитель бактерий. Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита. М.: Мир, 1997.

7. Блохина И.Н., Ладыгина Т.Н., Соколова К.Я. и др. Методы идентификации бактерий. Горький, 1986. 76 с.

8. Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условно-патогенных бактериях // Микробиология. 1997. №4. С. 20 26.

9. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса //Микробиология. 2001. № 4. С. 67-74.

10. Бондаренко В.М. «Острова» патогенности бактерий //Микробиология. 2001. №6. С. 54-61.

11. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П., Лешнер А.А. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов // Лабораторное дело. 1986. №4. С. 210-212.

12. Бухарин О.В. Биомедицинские аспекты персистенции бактерий // ЖМЭИ. 1994. №5, С. 4-13.

13. З.Бухарин О.В., Стадников А.А., Усвяцов Б.Я. Особенности взаимодействия бактерий с эритроцитами и их роль в развитии инфекционного процесса // Микробиология, эпидемиология и иммунология. 2006. №4. С.25 — 28.

14. Н.Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я, Ханина Е.А. Способ определения антигемоглобиновой активности микроорганизмов (патент РФ №2262705). М.,2005. 29с.

15. Бухарин О. В., Литвин В. Ю. Патогенные бактерии в природных экосистемах. Екатеринбург, 1997.

16. Бызов Б.А. Зоомикробные взаимодействия в почве. М.: ГЕОС, 2005. с.213.

17. Ваксман С.А. Актиномицеты. М: Мир, 1945. С 89.1<8.Вигоров Л.Н. О выделении веществ проростками пшеницы при гуттации //Природа. №2. 1954.

18. Возняковская Ю.М. Микрофлора растений и урожай. Л: Колос, 1969. 240 с.

19. Габидуллин З.Г., Габидуллин Ю.З., Ахтариева А.А., Мамбетова Э.Ф. Характеристика свойств, определяющих персистенцию моно- и ассоциатированных культур условно патогенных энтеробактерий // Микробиология. 2006. №4. С. 62-64.

20. Габрилович И.М. Практическое пособие по бактериофагии. М.: Высш. шк.,1968.-190с.t

21. Гинцбург A. JI. Мезанизм действия и природа факторов, индуцирующих образование некультивируемых форм Salmonella tiphymurium //Микробиология. 1999. №6. С.3-8.

22. Гинцбург A. JT., Романова Ю.М. Некультивируемые формы бактерий и их роль в сохранении сапронозов во внешней среде // Микробиология. 1997.3. с. 116-121.

23. Голиченков М. В., Нейматов A.JT. Сезонная динамика микробиологической активности серых лесных почв под муравейниками Lasius niger // «Муравьи и защита леса»: Матер.ХП Всеросс. мирмекол. симп. Новосибирск, 2005. С.218-220.

24. Головлев E.JI. Экологическая стратегия бактерий: специфика проблемы// Микробиология. 2001. Т.70, №4, С. 437-443.

25. Государственная Фармакопея СССР. МЗ СССР. М.:Медицина, 1989. Вып.1. 333 с.

26. Гоггшалк Г. Метаболизм бактерий. М: Мир, 1982. С. 280-285

27. Голубев В.И., Бабьева И.П. Методы выделения и идентификации дрожжей. М: Пищевая промышленность, 1979

28. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий. JI: Издательство ленинградского университета, 1989. 247с.

29. Гузев B.C., Бызов Б.А. Морфометрический анализ бактерий, ассоциированных с почвенными многоножками // Микробиология. 2006. Т.75, №2. С. 264-270.

30. Домарадский И. В. Некоторые проблемы адаптации патогенных бактерий к окружающей среде // Микробиология. 1997. №4. С.29-34.

31. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. М.: Наука, 2004. С.253-257.

32. Егоров Н. С., Баранова И.П. Бактериоцины. Образование, свойства, применение // Антибиотики и химиотерапия. 1999. Т.44, №1. С.33-40.

33. Ефимова Н.М., Каменева М.А., Функнер Е.В. Бактериофаги биологические антисептики // Тр. Межд. науч. конф.: Рациональное природопользование, здоровье населения. Пермь, 2001. Т. 4. С. 206-208.

34. Жеребцова Н.Ю., Баймиев А.Х., Валишин Д.А. Генетические маркеры патогенности условно патогенных энтеробактерий, выделенных у детей и подростков при острых кишечных инфекциях // Микробиология. 2007. №2. С. 3-8.

35. Зуева Л.П., Поляк М.С., Кафтырева Л.А. и др. Эпидемиологический мониторинг антибиотикорезистентности микроорганизмов с использованием компьютерной программы WHONET (методические рекомендации). СПб., 2004. 42с.

36. Иванов Н.Р., Бриль Г.Е. Экология и патогенность // Микробиология. 1984. №9. С.З -9.

37. Иванов Д.Р., Крапивина И.В. Этиология внутрибольничных инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, и профиль их антибиотикорезистентности // Микробиология. 2007. №5. С. 90-93.

38. Иванова Т.Н. Микробиологические особенности дисбиоза кишечника у жителей крайнего севера. Пермь. 2007. Автореферат.

39. Климова С.Ю., Нетрусов А.И., Цавкелова Е.А., Чердынцева Т.А. Микроорганизмы — продуценты стимуляторов роста растений и их практическое применение // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т.42, №2. с. 133- 143.

40. Коганова Г. А., Рахлеева А.А. Ценотические отношения в муравейниках: разнообразие и распределение раковинных амеб (Protista, Testacea) // «Муравьи и защита леса»: Матер.ХП Всеросс. мирмекол. симп. Новосибирск, 2005. С. 106-110.

41. Крапивина И.В., Галеева Е.В. Антибиотикочувствительность и молекулярные механизмы резистентности к бета-лактамазам грамотрицательных микроорганизмов возбудителей внутрибольничных инфекций // Микробиология. 2007. №5. С. 16-20.

42. Кулагин B.C. Роль муравьев в циркуляции энтомопатогенных кристалломорфных бацилл в лесном биоценозе // Муравьи и защита леса. Материалы 4 Всесоюзного мирмекологического симпозиума. М., 1971. С. 4851.

43. Кулдай Д.Г., Лиходод В.Г. Бактериоциногения. Л.: «Медицина», 1966. 203с.

44. Литвин В.Ю. Сапрофитическая фаза в экологии возбудителей инфекционных заболеваний // ЖМЭИ. 1985. №6. С.98-103.

45. Литвин В.Ю., Пушкарева В.И. Факторы патогенности бактерий: функции в окружающей среде // Микробиология. 1994. 35. с.83-87.

46. Литвин В.Ю. Эколого-эпидемиологические аспекты случайного паразитизма некоторых патогенных бактерий //ЖМЭИ. 1986. №1. С.85-91.

47. Литвин В.Ю. Категории общей эпидемиологии в связи с проблемой сапронозов//ЖМЭИ. 1988. №3. С.93-99.

48. Литвин В. Ю. Общие закономерности и механизмы существованияпатогенных микроорганизмов в почвенных и водных экосистемах // Экология iвозбудителей сапронозов: Сб. науч. тр. М., 1988. С. 20-34.

49. Литвин В. Ю. Потенциальная патогенность и случайный паразитизм микроорганизмов // Потенциально патогенные бактерии в природе: Сб. науч.тр. М., 1991. С. 9-30.

50. Литвин В. Ю., Емельяненко Е. Н., Пушкарева В. И. Патогенныебактерии общие для человека и растений: проблема и факты // t

51. Микробиология. 1996. №2. С. 101-104.

52. Литвин В. Ю., Коренберг Э. И.,Природная очаговость болезней: развитие концепции к исходу века// Природная очаговость болезней: исследования института Гамалеи РАМН. Под ред. Проф. Э. И. Коренберга. М.:Русаки. 2003. С. 12-34.

53. Лобакова Е.С. Ассоциативные микроорганизмы растительных симбиозов. М. 2004. 48с. Автореферат.

54. Мавзютов А.Р., Бондаренко В.М., Жеребцова Н.Ю. Факторы патогенности оппортунистических энтеробактерий и их роль в развитии диареи // Микробиология. 2007. №1. С.89-97.

55. Маркова Ю. А., Романенко А. С., Духанина А. В. Выделение бактерий семейства Enterobacteriaceae из растительных тканей. // Микробиология. 2005. Т.74, № 5,С. 663-666.

56. Микрофлора почв, www.ssmu.ru.html, 2006.

57. Мишустин Е.Н. Почвенные организмы как компоненты биогеоценоза. М.,1984. 246с.

58. Мнацаканов С.Т., Коцинян М.Е. О выделении энтеробактерий у КРС // Биологический журнал Армении. 1984. №2. С. 100-152.

59. Навашин С. М. Отечественному пенициллину 50 лет: история и прогнозы // Антибиотики и химиотерапия. 1994. Т.39, №1. С. 3-10.

60. Непомилуев В.Ф., Федоров М.В. Основные формы ризосферных бактерий клевера и их количественное содержание в ризосфере по фазам развития растения и года его жизни // Микробиология. 1954. Т. 23, №4.

61. Нетрусов А.И., Цавкелова Е.А., Чердынцева А.И. Образование ауксинов бактериями, ассоциированными с корнями орхидей // Микробиология. 2005. Т.74, №1. С. 55 62.

62. Новикова Н.С. Бактериальная флора надземных органов растений. Изд. АН УССР. 1965.I

63. Перетц Л.Г., Медвинская К.Г. Гигиена и санитария. М., 1965. 27с.

64. Перцовская М.И. Санитарная микробиология. М.: Медицина, 1989. 254с.

65. Пивоваров Ю.П., Лапенков М.И., Меренюк Г.В. Определитель санитарно-значимых микроорганизмов. Справочник. Изд. «Штиинца». Кишинев. 1982. 156 с.

66. Подборнов В. М. Клещи и сальмонеллы // Дезинфекционное дело. №2. 2000.

67. Покровский В.И., Малеев В.В. Актуальные проблемы инфекционнойпатологии//Эпидемиология и инфекционные болезни. 1999. №2. С.17-20.i

68. Покровский В.И. Энтеробактерии. М.: Медицина, 1990. 321с

69. Покровский В.И. Медицинская микробиология. М: ГЭОТАР Медицина, 1999. С. 352-353.

70. Поправке С. А. Растения и пчелы. М.: Агропромиздат, 1985. 240 с.

71. Приказ №535. Об унификации микробиологических (бактериологических)методов исследования, применяемых в клинико-диагностическихлабораториях лечебно-профилактических учреждений. М., 1985. 36с.133

72. Проворов Н.А., Воробьев Н.И., Андронов Е.Е. Макро- и микроэволюция бактерий в системах симбиоза //Генетика. 2008 Т. 44, №1. С. 12-26.

73. Прозоров А.А. Горизонтальный перенос генов у бактерий: лабораторное моделирование, природные популяции, данные геномики // Микробиология. 1999. Т.68, №5. С.632-646.

74. Розенберг Г.С., Мозговой Д.П., Гелашвили Д.Б. Экология. Элементы теоретических конструкций современной экологии. Самара, 1999. 395 с.

75. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Высшая школа, 1964. 328 с.

76. Романова Ю.М., Гинцбург A.JT. Есть ли сходство в механизмах образования "некультивируемых форм" у грамотрицательных бактерий и спор у бацилл? // Молекулярная генетика. 1993. №6. С.34-37.

77. Романова Ю.М., Гинцбург A.JI. Участие мобильных элементов в формировании свойств патогенных бактерий // Микробиология. 1999. №5. С.22-29.

78. Романова Ю.М., Смирнова Т.А., Андреев A.JL, Ильина Т.С., Диденко JT.B., Цинцбург A.JT. Образование биопленок пример «социального» поведения бактерий // Микробиология. 2006. Т. 75, №4. С. 556-561.

79. Романова Ю.М., Бошнаков Р.Х., Баскаков Т.В., Гинцбург A.JT. Механизмы активации патогенных бактерий в организме хозяина // Микробиология. 2000. №4. С.7-11.

80. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. Под редакц. проф. JL Б. Борисова. М: Медицина, 1984. 256 с.

81. Салимов P.M. Выделение и выживаемость гафний и шигелл в различных медах //Повышение продуктивности сельскохозяйственных животных: Сб. науч. тр. Приморский сельхозинститут, 1978. Вып.47. С.60-66.

82. Солдатченко B.C. История применения эфирных масел в медицине. 2007. http://www.aroma-doctor.com/history

83. Сомов П.П., Литвин В.Ю. Сапрофитизм и паразитизм патогенных бактерий: экологические аспекты. Новосибирск: Наука, 1988. 207с.

84. Супотницкий М.В. Микроорганизмы токсины и эпидемии. М., 2000.

85. Телесманч Н.Р., Ломов Ю.М., Бардых И.Х. Адгезивные и некоторые другие свойства энтеробактерий, изолированных из объектов внешней среды Ростовской области в 2002 году // Микробиология, эпидемиология и иммунология. 2004. №6. С. 3- 6.

86. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. — М.: Наука, 1968.-90с.

87. Тиунов А.В., Добровольская Т.Г., Полянская Л.М. Микробные комплексы в стенках жилых и покинутых нор дождевых червей Lumbricus terrestris L. дерново-подзолистой почве.//Почвоведение, 2001. №5. с. 594-599.

88. Третьякова Е.Б., Добровольская Т.Г., Бызов Б.А., Звягинцев Д.Г. Сообщества бактерий, ассоциированные с почвенными беспозвоночными // Микробиология. 1996. Т.65, №1. с. 102-110.

89. Туктаров В.Р., Тетрациклины. М: Наука, 2000. С. 52.

90. Фёдоров М.В. Почвенная микробиология. М., 1974. 113с.

91. Холодный Н.Г. Летучие выделения цветов и листьев как источника питания микроорганизмов // ДАН СССР. 1944. Т. 43, №2.

92. Хомяков Н.В., Добровольская Т.С., Нечитайло Т.Ю. и др. Судьба бактерий в кишечнике дождевых червей // Экология и биология почв. Материалы междунар. науч. конф. Ростов-на-Дону, 21-25 апреля 2005г., 2005. с. 523-528.i135

93. Хомяков Н.В., Харин С.А., Нечитайло Т.Ю. и др. реакция микроорганизмов на воздействие пищеварительной жидкости дождевых червей // Микробиология. 2007. Т.76, №1. с.55-64.

94. Цавкелова Е.А., Климова С.Ю., Нетрусов А.И., Чердынцева Т.А. Микроорганизмы — продуценты стимуляторов роста растений и их практическое применение // Прикладная биохимия и микробиология.2006. Т.42, №2. с. 133 143. <

95. Штейнхауз Э. Микробиология насекомых. М: Иностранная литература, 1950.767с.

96. Штейнхауз Э. Патология насекомых. М: Иностранная литература, 1952. 840с.

97. Шустрова Н.М., Дубровский Ю.А. Природные резервуары условно-патогенных бактерий // Потенциально-патогенные бактерии в природе.

98. Amellal N., Burtin G., Bartoli F., Heulin T. Colonization of Wheat Roots byan Exopolysaccharide-Producing Pantoea agglomerans Strain and Its Effect on

99. Rhizosphere Soil Aggregation Applied and Enviromental Microbiology, Vol. 64, i

100. No. 10. Oct. 1998, p. 3740-3747

101. Anderson J.M. soil organisms as engineers: microsite modulation of macroscale processes // Linking Species and Ecosystems. C.J. Jones, J.H. Lawton (eds.). Champan and Hall, New York. 1995. p. 94-106.

102. Andrews J., Hirano S. Microbial ecology of leaves. New York: Springer, 1991.449р.

103. Bagley S. T. Isolation of Klebsielleae from within living wood // Applied and environmental Microbiology, July 1978, p. 178-185

104. П0. Bagley S. T. Primary Klebsiella Identification with MacConkey-Inositol-Carbenicillin Agar// Applied and environmental Microbiology, Sept. 1978, p. 536538

105. Bagley S. T. Significance of Fecal Coliform-Positive Klebsiella // Applied and environmental Microbiology, May 1977, p. 1141-1148

106. Barak J. D., Gorski L., Pejman Naraghi-Arani, Amy O. Charkowski2 Salmonella enterica Virulence Genes Are Required for Bacterial Attachment to Riant Tissue // Applied and environmental Microbiology, Oct. 2005, Vol. 71, No. 10 . p. 5685-5691

107. Beattie, G. A., Lindow S. E. The secret life of foliar bacterial pathogens on leaves. Annu. Rev. Phytopathol. 1995.33:145-172.

108. Beattie, G. A., Lindow S. E. Bacterial colonization of leaves: a spectrum of strategies. Phytopathology 1999. 89:353-359

109. Brandl M. Т., Lindow S. E. Cloning and Characterization of a Locus Encoding an Indolepyruvate Decarboxylase Involved in Indole-3-Acetic Acid Synthesis in Envinia herbicola Applied and Enviromental Microbiology, Vol. 62, No. 11,Nov. 1996, p. 4121-4128

110. Burwen, D. R., S. N. Banerjee, and R. P. Gaynes. Ceftazidime resistance among selected nosocomial gram-negative bacilli in the United States. J. Infect. Dis. 1.-994.170:1622-1625.

111. Byzov B.A., Kurakov A.V., Tretyakova E.B., e.a. Principles of the digestion of microorganisms in the gut of soil millipedes: specificity and possible mechanisms//Appl. Soil. Ecol. 1998. v.9. p. 145-151.

112. Chelius M. K. Immunolocalization of dinitrogenase reductase produced by Klebsiella pneumoniae in association with Zea mays L. // Applied and environmental Microbiology, Feb. 2000, p. 783-787

113. Chernin L., Ismailov Z., Haran S. Chitinolytic Enterobacter agglomerans antagonistic to fungal plant pathogens // Applied and environmental Microbiology, May 1995, p. 1720-1726

114. Chiarini L., Tabacchioni S., Beverino A. Interactions between rhizosphere microorganisms under iron limitation // Arch. Microbiol. 1993. V. 160. P. 68-73.

115. Duncan D. W. Klebsiella biotypes among coliforms isolated from forest environments and farm produce // Applied and environmental Microbiology, Dec. 1972, p. 933-938

116. Edwards C.A., Lofty J.R. Biology of Earthworms. London, Chapman & Hall, 1977. 190p.

117. Haahtela K. Root -associated N2 fixation (acetylene reduction) by Enterobacteriaceae and Azospirillum strains in cold-climate spondosols // Applied and environmental Microbiology, Jan. 1981, p. 203-206

118. Haahtela K. Associative nitrogen fixation by Klebsiella spp.: adhesion sites and inoculation effects on grass roots // Applied and environmental Microbiology, Nov. 1986, p. 1074-1079

119. Halda-Alija L. Incidence of antibiotic-resistant Klebsiella pneumoniae ands

120. Enterobacter species in freshwater wetlands // Letters in Applied Microbiology 2004, 39, 445-450

121. Han Ch., Salonen N.Culture-Independent Analysis of Fecal Enterobacteria in Environmental Samples by Single-Cell mRNA Profiling // Applied and Environmental Microbiology. 2004. Aug. P. 4432-4439.

122. Jacobs J. L., Sundin G. W. Effect of Solar UV-B Radiation on a Phyllosphere Bacterial Community // Applied and environmental Microbiology, Dec. 2001, Vol. 67, No. 12 p. 5488-5496

123. Janssen P. H. Identifying the Dominant Soil Bacterial Taxa in Libraries of 16S rRNA and 16S rRNA Genes. Applied and Enviromental Microbiology, Mar. 2006, p.1719-1728

124. Jenks P. J., Akalin E., Bergan T. Susceptibility testing of Klebsiella spp. an international collaborative study in quality assessment // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 1998. №42. P. 29-48.

125. Johan H. J. Leveau and Steven E. Lindow Appetite of an epiphyte: Quantitative monitoring of bacterial sugar consumption in the phyllosphere. PNAS, March 13, 2001, vol. 98, no. 6, p. 3446-3453.

126. Lichter A., Barash I., Valinsky L., Manulis S. The Genes Involved in Cytokinin Biosynthesis in Envinia hevbicola pv. gypsophilae: Characterization and Role in Gall Formation // J. of Bacteriology, Aug. 1995, Vol. 177, No. 15, P. 44574465

127. Lidija Halda-Alija Identification of indole-3-acetic acid producing freshwater wetland rhizosphere bacteria associated with Juncus effiisus L. Can. J. Microbiol./Rev. can. microbiol. 49(12): 781-787 (2003)

128. Leveau H.J., Lindow S.E. Appetite of an epiphyte: quantitativy monitoring of bacterial sugar consumption in the phyllosphere // PNAS: 2001. V.98, №6. P. 34463453

129. Makeschin F. Earthworms (Lumbricidae: Oligochaeta): Important promoters of soil development and soil fertility // Fauna in soil ecosystems. Recyclingprocesses, nutrient flexes and agricultural prodaction / Ed. Benckiser G. 1997. p. 173-223.

130. Materon L. A., Hagedom C. Competitiveness of Rhizobium trifolii Strains Associated with Red Clover (Trifolium pratense L.) in Mississippi Soils. Applied and Enviromental Microbiology, Nov. 1982, P. 1096-1101

131. Matsen J. M. Characterisanion of Klebsiella isolates from natural receiving waters and comparison with human isolates // Applied Microbiology, Oct. 1974, p. 672-678

132. McCoy R. H. Potential pathogens in the environment: isolation, enumeration, and identification of seven genera of intestinal bacteria associated with small green pet turtles // Applied Microbiology, Apr. 1973, p. 534-538

133. Neilson A. H. Acetylene reduction (nitrogen fixation) by Enterobacteriaceae isolated from paper mill process waters // Applied and environmental Microbiology, Aug. 1976, p. 197-205

134. Ming Guo, Shulamit Manulis, Isaac Barash, and Amnon Lichter The operon for cytokinin biosynthesis of Envinia herbicola pv. gypsophilae contains two promoters and is plant induced. Can. J. Microbiol./Rev. can. microbiol. 47(12): 1126-1131 (2001)

135. Monier J.M. . Lindow S.E Aggregates of Resident Bacteria Facilitate Survival of Immigrant Bacteria on Leaf Surfaces. Microbial Ecology, Vol. 49, No. 3, April, 2005, p. 343-352

136. Monier J.M., Lindow S.E. Frequency, size, and iocalization of bacterial aggregates on bean leaf surfaces // Appl. Environ. Microbiol. 2004. №70, P. 346355t

137. Morris C.E., Monier J.M. The ecological significance of biofilm formation by plant-associated bacteria // Annu.Rev.Phytopathol. 2003. №41, P. 429-453

138. Ochuba G.U., Riesen V.L. Fermentetion of polysaccharides by Klebsielleae and other facultative bacilli // Applied and environmental Microbiology, May 1980, p. 988-992

139. Parle J.N. A microbial study of earthworms casts // J. Gen. Microbial. 1963. v.31. p.13-22.

140. Г53. Pofschun R., Ullmann U. Klebsiella spp. as Nosocomial Pathogens: Epidemiology, Taxonomy, Typing Methods, and Pathogenicity Factors // Clinical Microbiology Reviews. 1998. Oct. P. 589-603.

141. Ramey B.E., Koutsoudis M. Biofilm formation in plant-microbe associations // Current opinion in microbiology. 2004. №7. P.602-609

142. Sahly H., Podschun R. Clinical, Bacteriological, and Serological Aspects of Klebsiella Infections and Their Spondylarthropathic Sequelae // Clinical and diagnostic laboratory immunology, July 1997, Vol. 4, No. 4 p. 393-399

143. Schroder, D. Intracellular endosymbiotic bacteria of Camponotus species (carpenter ants): systematics, evolution and ultrastructural characterization/ D. Schroder, H. Deppisch, M. Obermayer, G. Krohne // Mol Microbiol . 1996. № 21. P. 479-489.

144. Seidler R. J. Potential pathogens in environment: cultural reactions and nucleic acid studies on Klebsiella pneumoniae from clinical and environmental sources // Applied and environmental Microbiology, June 1975, p. 819-825

145. Seidler R. J. Biochemical Characteristics and Virulence of Environmental

146. Group F Bacteria Isolated in the United States // Applied and environmental

147. Microbiology, Oct. 1980, p. 715-720 i

148. Steinhaus E. A. A study of the bacteria associated with thirty species of insects, 1941. Downloaded fromjb.asm.org by on July 30, 2007

149. Talbot H. W. Gas Chromatographic Analysis of In Situ Cyclitol Utilization by Klebsielleae Growing in Redwood Extracts // Applied and environmental Microbiology, Oct. 1979, p. 599-605

150. Talbot H.W., Seildler R.J. Cyclitol utilization associated with the presence of Klebsielleae in botanical environments// Applied and environmental Microbiology, May 1979, p. 909-915

151. Tiunov A.Y., Scheu S. Microfungal communities in soil, litter and casts of Lumbricus terrestris L. (Lumbricidae): a laboratory experiment.// Appl. Soil. Ecol. 2000. V.14. p. 17-26.

152. Toyoto K., Kimura M. Microbial community indigenous to the earthworms Lumbricus terrestris L.// Biol. Fertil. Soils. 2000. V.31, №3/4. p. 187-190.

153. Tsavkelova E. A. Bacteria associated with orchid roots and microbial production of auxin //Microbiological Research 162, 2007, p. 69-76

154. Widmer F. Analysis of nifH Gene Pool Complexity in Soil and Litter at a Douglas Fir Forest Site in the Oregon Cascade Mountain Range // Applied and environmental Microbiology, Feb. 1999, p. 374-380

155. Wilson M.; Hirano S. S., Lindow S. E. Location and Survival of Leaf-Associated Bacteria in Relation to Pathogenicity and Potential for Growth within the Leaf. Applied and Environmental Microbiology, Vol. 65, No. 4. Apr. 1999, p. 1435-1443

156. Yadav R. K. P., Karamanoli" K.and D. Vokou Bacterial Colonization of the Phyllosphere of Mediterranean Perennial Species as Influenced by Leaf Structural and Chemical Features. Microbial Ecology Vol. 50, No. 2 , August, 2005, p. 185196

157. Успехибиологическойнаукив1999г.http://bio. 1 septcmber.ru/article.php?rD=200000606. 2000174. http://www.sciteclibrary.ru/, 2009175. http://www.haerbiona.ru, 2008sг

158. Первоначально для выбора критерия, с помощью которого будет проводитьсяанализ, необходимо было определиться подходят ли данные под нормальноераспределение или использовать непараметрические критерии, t

159. Для определения нормальности распределения данных по биоразнообразию в изучаемых объектах пользовались критериями Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса и Шапиро-Уилка.