Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Условно-патогенные энтеробактерии: доминирующие популяции, биологические свойства, медико-экологическая значимость

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Условно-патогенные энтеробактерии: доминирующие популяции, биологические свойства, медико-экологическая значимость"



На правах рукописи

АНГАНОВА Елена Витальевна

УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫЕ ЭНТЕРОБАКТЕРИИ: ДОМИНИРУЮЩИЕ ПОПУЛЯЦИИ, / БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, МЕДИКО-ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 5 МАР 2012

Иркутск-2012

005013567

Работа выполнена в ГБОУ ДГ10 ((Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения и социального развития РФ и ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор,

Заслуженный деятель науки РФ Савилов Евгений Дмитриевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Данчинова Галина Анатольевна

(заведующая лабораторией трансмиссивных инфекций ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН)

доктор биологических наук Фадеева Татьяна Владимировна

(заведующая лабораторией микробиологии и гемостаза ФГБУ ((Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии» СО РАМН) доктор медицинских наук,

профессор Киклевич Видим Трофимович

(заведующий кафедрой детских инфекционных болезней ГБОУ ВПО ((Иркутский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ)

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки <<Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза» Уральского отделения Российской академии наук

Защита состоится « » . 2012 г. в_часов на заседании дис-

сертационного Совета ДМ 001.038.01 Федерального государственного бюджетного учреждения ((Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: л Иркутск, ул. К. Маркса, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан « » С^Су^Лг 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

¿¿ї&Гу? Кулеш Дмитрий Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время во всех странах мира наблюдается активизация условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) в инфекционной заболеваемости населения (Бондаренко В.М., 2011). Бактерии данной группы характеризуются выраженной неоднородностью, являясь с одной стороны представителями транзиторной нормальной микрофлоры человек, а с другой - возбудителями инфекционных заболеваний (Марри П.Р. с соавт., 2006; Егорова С.А., 2007; Бондаренко В.М., 2011 ). В связи с этим проблеме инфекций, обусловленных УПМ, особенно представителями семейства Eníerobacteriaceae, уделяется пристальное внимание (Ахтариева A.A., 2010). К числу наиболее распространенных инфекционных заболеваний этой группы относятся острые кишечные инфекции (ОКИ), занимающие одно из ведущих мест в инфекционной патологии детского возраста (Воротынцева Н.В. соавт., 2001; Жеребцова Н.Ю. с соавт., 2007; Денисюк Н.Б., 2011 ; Калуцкий П.В., 2011; Хворостухина А.И., 2011). Доля ОКИ, вызванных условно-патогенными энтеробактериями (УПЭ), в общей структуре ОКИ установленной этиологии, rio данным разных авторов, варьирует от 12,8-21,2 % до 34,1 % (Зуева Л.П., 2005; Жеребцова Н.Ю, 2006).

В связи с разноречивостью мнений относительно участия УПЭ в этиолог ии кишечных инфекций А.Р. Мавзютов с соавт. (2001 ), C.B. Егорова (2008), В.М. Бондаренко (2011) и JI.B. Михайлова (2011) отмечают, что для оценки их этиологической значимости при инфекционных процессах необходимо заключение об их патогенном потенциале, который недостаточно учитывается при верификации ОКИ. Кроме того, масштабы изменения патогенности УПЭ, являющиеся одной из причин увеличения их медицинской значимости, свидетельствуют о целесообразности изучения этого явления у данной группы бактерий как на фенотипическом, так и на молекулярно-генетическом уровне (Мавзютов А.Р. с соавт., 2002; Фиал-кина C.B., 2004; Жеребцова Н.Ю., 2006; Вершинин А.Е., 2008; Бондаренко В.М., 2011; Burgos Y. et al., 2010). В то же время патогенность и региональные особенности возбудителей острых кишечных инфекций, обусловленных УПЭ, до сих пор изучены недостаточно.

Одним из важнейших аспектов фенотипической характеристики УПЭ условно-патогенных энтеробактерий является их резистентность к антимикробным препаратам (АМП) (Страчунский JI.C., 2002; Скала JI.3. с соавт, 2004; Бочков И.А. с соавт, 2009; Tenover F.C, 2005). При этом, как отмечает А.Е. Бн-лев (2011), массовое распространение антибиотикорезистентных штаммов в популяциях условно-патогенных микроорганизмов стало важной проблемой клинической медицины, в связи с их более высокими адаптационными возможностями по сравнению с возбудителями классических инфекций.

На фоне информации о роли УПЭ в инфекционной патологии человека недостаточно изученной остается проблема их циркуляции в природных, в частности,

водных экосистемах. Между тем, адаптивные возможности бактерий данной группы и, соответственно, их потенциальные местообитания, экологические ниши, механизмы и формы существования в природе необычайно широки и многообразны (Бухарин О.В., 1997). Особое значение имеет изучение циркуляции бактерий данной группы в водных объектах, оказывающих существенное влияние на жизнедеятельность человеческой популяции (Мамонтова JIM. с соавт., 2000). Условно-патогенные микроорганизмы способны не только длительно обитать в субстратах внешней среды, в частности, в воде, но и накапливаться в ней. Выживанию и накоплению микроорганизмов в этих объектах способствуют факторы персистенции (Макаров В.Ю., 2007). Также у водных штаммов УПЭ выявлены адгезивная и гемолитическая активность, описаны ферменты ДНКаза, гиалурошщаза, некоторые протеиназы (Езепчук Ю.В., 1997; Кравченко О.С., 2009), резистентность к АМП (Загайнова A.B., 2010). Усиливающееся антропогенное воздействие на водные экосистемы определяет необходимость изучения циркуляции и биологических свойств УПЭ с позиций оценки их потенциальной эпидемической опасности и влияния на экологическое состояние микробиоценозов природных водоемов.

В рамках изучения биологической активности УПЭ важное значение имеет выявление их адаптационных возможностей, способствующих выживанию в различных условиях среды обитания, в частности, вариабельность ферментативного аппарата и способность к формированию биопленок. Роли биопленок в окружающей среде и организме хозяина в последнее время уделяется особое внимание (Романова М.Ю. с соавт., 2011; Chambless J.D. et al., 2006).

Исходя из вышеизложенного, цслыо работы является: выявить доминирующие популяции, фенотииические и генотипические характеристики, адаптационный потенциал условно-патогенных энтеробактерий на моделях острых кишечных инфекций и водных экосистем для оценки их медико-экологической значимости.

Для выполнения указанной цели поставлены следующие задачи:

1. Изучить спектр условно-патогенных энтеробактерий, выделенных при острых кишечных инфекциях установленной этиологии, у детей Иркутской области.

2. Изучить циркуляцию бактерий данной группы в микробных сообществах водных экосистем на модели крупнейших водоемов Восточной Сибири, их таксономическую характеристику, установить доминирующие и субдоминирующие популяции, видовое разнообразие.

3. Определить фенотипические характеристики условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от больных ОКИ, а также из водных объектов.

4. Определить и оценить частоту встречаемости у микроорганизмов генетических детерминант патогенное™.

5. Оценить резистентность к антимикробным препаратам УПЭ, выделенных от больных ОКИ и из водных объектов.

6. Провести анализ клинических аспектов острых кишечных инфекций, обусловленных бактериями семейства ЕШегоЬаМепасеае, их сопряженность с наличием генетических детерминант патогенное™ микроорганизмов.

7. Изучить адаптационный потенциал клинических и водных штаммов энтеробактерий в различных условиях существования (количественная оценка ферментативной активности, способность к образованию биопленок).

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Определен таксономический спектр условно-патогенных энтеробактерий, выделяемых при ОКИ, у детей Иркутской области, его смена в многолетнем аспекте, выявлены субдоминирующие популяции, изучены патогенные свойства, дана оценка влияния факторов патогенности на клинико-эиидемиологические особенности острых кишечных инфекций.

Полученные данные о фенотипических маркерах УПЭ вносят вклад в изучение патогенности бактерий данной группы, их участия на различных этапах инфекционного процесса.

Определены генетические маркеры УПЭ, информативные при оценке их этиологической значимости при ОКИ (/?/уЛ, МуВ, фА. (гтА, ¡гр-2). Показаны различия в частоте встречаемости генов патогенности у различных видов представителей семейства ЕШегоЬас/епасеае.

Показана значимость условно-патогенных энтеробактерий, их биологической активности, персистентного потенциала, распространенности генетических маркеров патогенности среди водных изолятов для оценки экологического состояния микробиоценозов водных экосистем и потенциальной опасности водной среды.

Получены данные об адаптационных возможностях УПЭ (вариабельность ферментативного аппарата УПЭ, способность к формированию биопленочных сообществ), что позволяет внести вклад в изучение их адаптации к различным условиям обитания.

Практическая значимость

Определены основные виды условно-патогенных представителей семейства ЕпЫгоЪаМепасеае в структуре ОКИ и маркеры их патогенности, существенно важные с клинической точки зрения.

Данные, полученные при определении фенотипических и генотипических факторов патогенности бактерий указанной группы, вносят вклад в оценку их этиологической и эпидемиологической значимости.

Мониторинг антибиотикоустойчивости УПЭ позволяет создать паспорт резистентности возбудителей ОКИ для построения формуляра АМП и определения политики их применения.

Разработанный способ определения гетерогенности микробных популяций по показателю антибиотикорезистентности УПЭ позволяет проводить оценку их экологического состояния и расширить возможности биотестирования водных экосистем.

Данные по исследованию микробиоценозов крупнейших водоемов Восточной Сибири могут быть использованы в качестве базовой информации для эколого-эпидемиологической оценки состояния водных экосистем.

Внедрение в практику

Материалы исследований используются в практике работы Управления Федеральной службы в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Республике Саха (Якутия) для целей микробиологического мониторинга поверхностных водоемов, работы Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Иркутской области для целей эпидемиологического надзора за острыми кишечными инфекциями; внедрены в учебный процесс на кафедре эпидемиологии и микробиологии ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» (акт внедрения № 16 от 22.10.2011). Результаты исследований использованы при издании учебных пособий для врачей: «Микробиологический мониторинг водных экосистем» (2008); «Техногенное загрязнение окружающей среды и инфекционная патология (юшнико-эпидемиологические обобщения)» (2008); «Проявление инфекционной патологии в условиях техногенного загрязнения окружающей среды» (учебное пособие для системы послевузовского профессионального образования врачей, утвержденный УМО по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России (УМО-17-28/78 от 26.02.2010), методических рекомендаций для врачей «Выявление факторов риска в эпидемиологическом анализе» (2011).

По результатам исследований получены свидетельства Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам (РОСПАТЕНТ) о государственной регистрации БД № 2010620379 от 14.07.2010 г. «Биопрофиль условно-патогенных энтеробактерий - возбудителей острых кишечных инфекций у детей»; № 2010620552 от 24.09.2010 г. «Таксономическая характеристика и биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов водных экосистем»; № 2011620192 от 11.03.2011 г. «Клинико-эпидемиологические особенности острых кишечных инфекций, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами»; № 2011620513 от 13.07.2011 г. «Антибиотикоустойчивость аутохтонных и аллох-тонных представителей микробного сообщества водных экосистем».

Положения, выносимые на защиту

1. Основными представителями условно-патогенных энтеробактерий в структуре бактериальных ОКИ установленной этиологии являются бактерии родов Enterobacter, Proteus, Klebsiella и Citrobacter (класс субдоминант). Данные виды энтеробактерий (а также Е. coli и Pantoeä) преобладают (с изменением степени доминирования) и в таксономическом спектре грамотрицательной составляющей микробиоценозов водных экосистем.

2. Условно-патогенные бактерии семейства Enterobacteriaceae характеризуются выраженной фенотипической и генотипической гетерогенностью, что необходимо учитывать при оценке их этиологической и эпидемиологической значимости. 6

3. Условно-патогенные энтеробактерии, выделенные от больных ОКИ, несут генетические маркеры патогенности, детерминирующие важные этапы взаимодействия возбудителя с клетками организма хозяина: адгезию, продукцию гемолизинов, размножение в тканях (ЫуА, ЫуВ, фА, л/аС./?л;Л, и-р-2). Наличие у клинических штаммов энтеробактерии генетических детерминант патогенности сопряжено с утяжелением клинической картины заболевания.

4. Распространенность условно-патогенных энтеробактерии, их таксономическая характеристика, степень доминирования, биологическая активность, персистентный потенциал, наличие генетических маркеров патогенности, антн-биотикоустойчивость являются индикаторами степени потенциальной опасности водных микробиоценозов.

5. Условно-патогенные бактерии сс^сИаваЕпгегоЬасГепассас (клинические и водные изоляты) характеризуются адаптационным потенциалом, отражающимся качественными и количественными проявлениями ферментативной активности, а также способностью к формированию биопленочных сообществ.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на: Российской научно-практической конференции, посвященной 100-летию профессора Е.В. Талалаева «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе» (Иркутск, 2002); Межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004); научно-практической конференции «Здоровье населения Иркутской области: проблемы и пути решения» (Иркутск, 2003); I межрегиональном семинаре «Организация санитарно-эпидемиологического мониторинга за острыми кишечными инфекциями» (Иркутск, 2006); научно-практической конференции «Оценка эколого-экономической ситуации загрязнения водных экосистем в бассейне оз. Байкал и управление экологическим риском» (Иркутск, 2006); научно-практической конференции «Среда обитания человека и санитарно-эпидемиологическое благополучие населения» (Улан-Удэ, 2006); III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Здоровая семья - здоровый ребенок», посвященной 20-летию образования Института педиатрии и репродукции человека СО РАМН (Иркутск, 2009); Всероссийском пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ (Москва, 2009); научной конференции с международным участием «Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней» к 90-летию кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Иркутского государственного медицинского университета (Иркутск, 2010); региональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Иркутск, 2010); III межрегиональном семинаре «Организация санитарно-эпидемиологического мониторинга за

7

острыми кишечными инфекциями» (Иркутск, 2010); международной конференции «Проблемы экологии»; Чтениях памяти профессора М.М. Кожова (Иркутск, 2010); II Международной научно-практической конференции «Экология, здоровье, спорт» (Чита, 2010); международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ, 2011); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Окружающая среда и здоровье населения» (Иркутск, 2011); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе» (Москва, 2011); пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды «Актуализированные проблемы здоровья человека и среды его обитания и пути их решения» (Москва, 2011).

Публикации

Основные положения диссертационной работы нашли отражение в 59 научных публикациях, в т.ч. 22 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, 2 монографии, 3 пособия для врачей, из них утвержденных УМО но медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России - 1, методических рекомендациях для врачей - 1, базы данных, получившие Свидетельства РОСПАТЕНТа - 4.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, отраженных в 7 главах, главы обсуждения полученных материалов, выводов, списка использованных источников литературы. Работа изложена на 302 страницах, иллюстрирована 112 рисунками и 25 таблицами. Список литературы содержит 398 работ, из них 285 отечественных и 113 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В работе представлены результаты изучения УПЭ, выделенных от детей, больных ОКИ, поступивших на лечение в Иркутскую областную инфекционную больницу; от здоровых детей, посещающих детские дошкольные учреждения (2006-2010 гг.); из вод крупнейших водоемов Восточной Сибири и Севера: река Ангара (Иркутская область), река Лена на всей ее протяженности, от верховья (Иркутская область) до впадения в море Лаптевых (Республика Саха (Якутия) (1999-2008 гг.). Анализ заболеваемости острыми кишечными инфекциями, в т.ч. обусловленной УПЭ, проводили по материалам Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Иркутской области (2000-2010 гг.); клинического течения ОКИ - с использованием медицинской карты стационарного больного (2006-2010 гг.). Объем выполненных исследований приведен в таблице 1.

Таблица I

Объекты и объем выполненных исследований

Направление исследований Количество

Копрофильтраты детей Водные объекты Всего

Больные ОКИ Здоровые

Антибиотикоустойчивость 1695 128 8518 10341

Антилизоцимная активность 924 128 504 1556

Продукция ДНК-азы 924 128 504 1556

Гемолитическая активность 924 128 504 1556

Адгезивная активность 924 128 504 1556

Протеолитическая активность 924 128 504 1556

Продукция фосфатазы 924 128 504 1556

Молекулярно-генетические исследования (кол-во штаммов / кол-во исследований) 175/1050 65 / 390 89/623 329/2063

Определение вирулентности (внутрибрюшинная проба) (кол-во штаммов / кол-во животных) 15/45 5/15 9/27 29/87

Экспериментальные исследования по количественному определению ферментативной активности УПЭ 168 - 168 336

Экспериментальные исследования по определению способности образовывать биопленки 240 120 120 480

Анализ заболеваемости острыми кишечными инфекциями (2000-2010 гг.) Информ. бюллетени - 14

Анализ многолетней динамики частоты встречаемости УПМ (2000-2010 гг.) Штаммы УПМ -5924

Анализ клинического течения ОКИ (2006—2010гг.) Ст. уч. ф. № 0003/у-931

Примечание:«-» - исследования не проводились.

Отбор проб воды, фильтрацию через мембранные фильтры, выделение культур микроорганизмов, их идентификацию проводили но общепринятым методикам (Приказ МЗ СССР № 535 от 22.04.85; Краткий определитель Берджи, 1997; Поздеев O.K., 2002; Марри П.Р., 2006 и др.). Биохимические свойства микроорганизмов определяли с помощью коммерческих гест-систем «Enterotest» фирмы Lachema (Чехия). Для выборочной идентификации использовали бака-нализатор Sceptor (BectonDickinson, USA). Определение щелочной фосфатазы, продукции ДНК-азы, протеолитической (ПА) и гемолитической (ГА) активности осуществляли согласно стандартным методам (Частная медицинская микробиология..., 2005), адгезивной активности - по методу С.С. Гизатулиной с соавт.

(Способ оценки..., 1991), персистентных свойств-по методике О.В. Бухарина (Бухарин О.В., 1999; Методические рекомендации..., 2001). Определение антибиотикорезистентности микроорганизмов и оценку результатов проводили согласно МУК 4.2.1890-04.

Оценку вирулентности in vivo проводили по способности вызывать гибель белых мышей путем введения в/б 0,5 мл суспензии белым мышам в количестве трех для каждой бактериальной культуры, отмечая изменения через 6,24,48 и 72 часа и 10 суток (Методические указания..., 1999). Эксперименты выполняли на беспородных белых мышах в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными МЗ СССР (1977), «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1986).

Для определения количественных показателей ферментативной активности исследуемые микроорганизмы культивировали при нескольких температурных режимах: 4 °С, 24 °С, 30 °С и 37 °С. Использовали две питательные среды: 1) необогащенная среда - физраствор, забуференный 0,1 M фосфатным буфером, или так называемая «голодная» питательная среда; 2) обогащенная среда Красильникова или полная синтетическая среда. Количественное определение ферментативной активности микроорганизмов проводили в соответствии с общепринятыми методиками: Мп-пероксидазную - по НАДН (Asada Y. et al., 1987); липазную - по олеиновой кислоте, уреазу - по мочевине (Хазиев Ф.Х., 1990). Активность каталазы определяли спектрофотометрически по убыли 0,06 M Н202 в растворе, содержащем Н202, культуральный фильтрат и 0,05 M фосфатный буфер pH 7.0. Определение формирования биопленок штаммами условно-патогенных энтеробактерий проводили в соответствии с общепринятыми методиками (Ша-гинян И.А. с соавт., 2007; O'Toole G.A. et al., 2000).

Молекулярно-гепетическиеметоды. Экстракцию тотальной бактериальной ДНК из бактериальных суспензий исследуемых микроорганизмов (107 КОЕ/мл) проводили согласно «Методическим рекомендациям по детекции...» (1998). Для ПЦР-амплификации использовали стандартный набор «АмплиСенс-1» (производство ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), амплификатор «Mastercycler» (фирма «Eppendorf»). Подбор температуры отжига праймеров осуществляли экспериментальным путем, а также используя данные литературы (Бондаренко В.М. с соавт., 2004; Фиалкина C.B., 2004; Жеребцова Н.Ю., 2006; Вершинин А.Е., 2008) и рекомендации НПФ «Литех». На один образец использовали 15 мкл реакционной смеси: 5-х PCR-буфер 3,0; MgS04 -1,0; dNTP -1,0; олигонуклеотидные праймеры - по 1,0; Tag-полимераза - 0,2; исследуемая проба - 5,0; деионизированная вода - 2,8.

Бактерии тестировали методом ПЦР на наличие генов вирулентности. Использовали праймеры к ряду генов, обнаруженных в составе «островков» патоген-нос-ги Е. coli, контролирующих адгезию S-типа (s/aÀ-(F1 ) 5'-cggtgtgcgtagttcaat-3', (RI) 5'-cacccgcatggataaaaa-3'; sfaG-{Y2) 5'-tgccgggaacacagaccatag-3', (R2) 5'-caatcttgataccgccagcattc-3') и 1 типа (fim A-(F3) 5'-cgacgcatcttcctcattcttct-3',

(R3) 5'-attggttccgttattcagggttgtt-3'); продукцию гемолизинов (hlyA - (F4) 5'-cacgcgtgccgacaagtt-3', (R4)-5'-gccacatcccggaaatcaat-3'; /j/y5-(F5)-5'-cgacgtcgcct-tgatgata-3', (R5)-5'-tccccctgcttaatactgagat-3'); синтез железорегулируемого белка (irp- 2-(F6)-5'-gttgctgtccatcaagcacg-3', (R6)-5'-gccggaaagcctggccttta-3'). Праймеры синтезированы в НПФ «Литех» (г. Москва). Анализ продуктов ПЦР проводили гель-электрофорезом в агарозе (камера электрофоретическая «SE-2»), Использовали агарозу производства «Sigma» (США) на трис-боратном буфере, добавляли 1% р-р бромистого этидия. Амшшфицированный фрагмент идентифицировали по размеру, используя для сравнения маркер молекулярного веса ДНК Gene Ruler 100 bp DNA Ladder Plus. Результаты документировали с использованием видеосистемы гель-документирования и программы «Gel Imager».

Статистические методы. Статистическую обработку эпидемиологических данных и результатов микробиологических исследований проводили с применением общепринятых параметрических и непараметрических критериев статистики (Ашмарин Н.П. с соавт., 1962; Лакин Г.Ф., 1980; Гланц С., 1999; Са-вилов Е.Д. с соавт., 2004,2011). Для анализа эпидемиологической обстановки по ОКИ применяли интегральный статистический критерий - суммарный индекс эпидемиологической ситуации (ИЭС) (Методический подход..., 2011). Для количественной оценки степени доминирования микроорганизмов, принадлежащих к различным таксономическим группам, использовали шкалу Е.Л. Любарского (Баканов А.И., 1987); для оценки микробиоценозов водных экосистем - коэффициент Серенсона (S) (Одум Ю., 1975), для определения разнообразия - индекс видового разнообразия Margalef (d) (Margalef R., 1958). Показатель «Л», характеризующий состояние системы «лизоцим - антилизоцим», определяли как соотношение числа лизоцимактивных и антилизоцимактнвных микроорганизмов (Плотников А.О. с соавт., 2000). Оценку гетерогенности микробных популяций и состояния микробиоценозов водных экосистем проводили в соответствии с разработанным способом по показателю антибиотикорезистентности (ИАР) с позиции кластерной структурированности.

Автор выражает благодарность сотрудникам Иркутской областной инфекционной клинической больницы. Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского СО РАН, Иркутской межобластной ветеринарной лаборатории, учреждений Роспотребнадзора за содействие в проведении данных исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Заболеваемость и спектр возбудителей острых кишечных

инфекций у детей Иркутской области

Анализ многолетней заболеваемости ОКИ установленной этиологии в Иркутской области за период 2000-2010 гг. выявил ее значимый рост (р < 0,01), в т.ч. и у детей до 14 лет, что отражает эпидемиологическую ситуацию в РФ за последние годы. В возрастной структуре заболевших ОКИУЭ имело место

увеличение доли детей до 14 лет (р < 0,01). Одновременно отмечалось значимое повышение уровня заболеваемости ОКИ бактериальной этиологии (среднемно-голетний коэффициент регрессии +11,8 °/000). Эпидемиологическая ситуация по ОКИ бактериальной этиологии в Иркутской области достигла «порогового» уровня (0,92) в начале анализируемого периода (2000 г.) и оставалась относительно стабильной до 2004 г. Ухудшение ситуации отмечено в период с 2005 по 2008 гг., когда показатели индекса эпидемиологической ситуации превышали «пороговые» значения (1,08-1,12).

Изучение спектра микроорганизмов, выделяемых при острых кишечных инфекциях, показало преобладание УПМ, которые значимо (р < 0,01) превышали долю патогенов (1,5 ± 0,1 %) и вирусных агентов (43,2 ± 1,4 %) и обусловливали более половины всех ОКИУЭ (55,3 ± 0,4 %). Среди условно-патогенных возбудителей ОКИ абсолютно доминировали представители семейства Enterobacteriaceae (около 90 %). Спектр условно-патогенных энтеробактерий был представлен бактериями родов Proteus, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Morganella, Hafnia, Kluyvera, Serratia, Providencia и Pantoea. На смену состава условно-патогенных энтеробактерий в первую очередь оказывало влияние содержание бактерий родов Proteus, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Morganella, составивших около 95 % всех представителей данного семейства.

За период наблюдения (2000-2010 гг.) спектр УПЭ, выделенных при острых кишечных инфекциях, претерпел существенные изменения, характеризующиеся значимым увеличением доли Klebsiella spp. (г = 0,79; р < 0,01), тенденцией к росту доли Enterobacter spp.. варьированием частоты встречаемости Proteus spp., Citrobacter spp. и Morganella spp. (рис. 1).

Рис. 1. Таксономический и количественный спектр условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от детей, больных ОКИ, за 2000-2010 гг. (%).

Выявлены изменения в распределении УПЭ по классам доминирования. В 2000 г. в класс субдоминант (границы класса по доле от 14 до 36 %) входили только энтеробактерий родов Proteus и Citrobacter, прочие представители се-

мейства Enterobacteriaceae (Klebsiella, Enterobacter и Morganella) относились к второстепенному классу (границы класса по доле от 6 % до 14 %). В конце исследуемого периода произошли существенные изменения в таксономическом составе УПЭ, а именно: представители родов Klebsiella и Enterobacter, согласно доле бактерий каждого рода в общей численности, перешли в класс субдоминант, а Morganella - в редкий класс (границы класса по доле от 0 до 6 %). Таким образом, в 2010 г. при отсутствии абсолютных доминант и доминант спектр УПЭ, выделенных от больных острыми кишечными инфекциями, был представлен субдоминирующими бактериями родов Enterobacter, Proteus, Klebsiella и Citrobacter (табл. 2).

Таблица 2

Оценка степени доминирования бактерий семейства ЕгЛегоЬас1ег'шсеае, выделенных от больных острыми кишечными инфекциями (по шкале доминирования)

Балл Класс (по степени доминирования) Границы классов по доле рода Родовая принадлежность микроорганизма

2000г. 2010г.

5 Абсолютный доминант 64 < N < 100 - -

4 Доминант 36 < N < 64 - -

3 Субдоминант 14 < N < 36 Proteus Citrobacter Proteus Citrobacter Klebsiella Enterobacter

2 Второстепенный 6 < N < 14 Klebsiella Enterobacter Mganella

1 Редкий 0 < N < 6 другие Mganella другие

Примечание: «-» - отсутствие.

Фенотинические и генотипические маркеры патогенности условно-патогенных энтеробактерий

Определение фенотипических признаков у УПЭ позволяет, во-первых, проводить мониторинг патогенности бактерий данной группы, во-вторых, является (наряду с другими) критерием их этиологической значимости. Современный уровень изучения биологических свойств микроорганизмов показывает, что, как отмечает В.М. Бондаренко (2011), количественный показатель не всегда определяет способность изолята вызывать заболевание, которое в большей степени связано с реализацией патогенного потенциала возбудителя. Для каждого вида возбудителей характерен комплекс маркеров (фенотипических и генотинических) патогенности, благодаря которым осуществляется развитие инфекционного процесса.

Проведенная комплексная оценка фенотипических признаков клинических штаммов энтеробактерий, коррелирующих с их патогенностью, позволила установить, что исследуемыми фенотипическими свойствами обладала значимо большая часть (р<0,01) протестированных штаммов. При этом у 50,9 ± 1,6 % исследованных микроорганизмов отмечены персистентные свойства-антилизоцимная активность (АЛА), направленная на инактивацию факторов естественной резистентности организма человека; около 40 % штаммов продуцировали щелочную фосфатазу, способствующую увеличению проницаемости клеточных мембран, и обладали адгезивной активностью, направленной на прикрепление и колонизацию эпителио-цигов слизистых оболочек. Данные свойства встречались значимо чаще (р < 0,05) по сравнению с другими признаками. У третьей части микроорганизмов отмечены' протеолитическая и гемолитическая активность, оказывающая повреждающее действие на клеточные мембраны; у 26,5 ± 1,4 %- способность экспрессировать фермент патогенности ДНКазу, вызывающий повреждение структуры нуклеиновых кислот (рис. 2).

Рис. 2. Частота встречаемости свойств, коррелирующих с патогенностью, среди УПЭ, выделенных из фекалий детей, больных ОКИ (%).

Выявлена неоднородность различных представителей клинических штаммов энтеробактерий по наличию фенотипических маркеров патогенности (рис. 3).

Так, среди различных энтеробактерий более высокая (р < 0,05) частота встречаемости фосфатазной и протеолитической активности отмечена у штаммов Proteus s pp. (при этом большим уровнем ферментативной активности обладали штаммы P. mirabilis), адгезивной активности - у штаммов Enterobacter spp. (преимущественно за счет Е. aerogenes) и гемолитической - у Klebsiella s pp. (данный признак среди штаммов К. pneumoniae встречался в два раза чаще, чем среди К. oxytoca). Антилизоцимная активность чаще (р < 0,05) отмечалась у Klebsiella spp., Citrobacter spp. и M. morganii, продукция ДНКазы - у Klebsiella spp. и Proteus spp.

щелочной активность активность ДНК-азы активность

фосфатазы

я Enterobacter spp. п Proteus spp. ■ Klebsiella spp.

_S Citrobacter spp._DM. morganii_

Рис. 3. Биопрофиль клинических штаммов УПЭ по фенотипическим маркерам патогенности.

Проявленная условно-патогенными энтеробактериями гетерогенность по фенотипическим маркерам позволила условно разделить их на четыре группы: 1 - штаммы, характеризующиеся наличием более двух маркеров; 2 - штаммы с двумя маркерами; 3 - штаммы с 1 маркером; 4 - не обладающие исследованными свойствами. Установлено, что значимо чаще (р < 0,05) встречались клинические штаммы энтеробактерий, у которых отмечалось более двух фенотипических признаков (39,4 ± 1,6 %), а также сочетание двух маркеров (32,9 ± 1,5 %). В то же время были выделены микроорганизмы, характеризующиеся отсутствием фенотипических маркеров - 9,5 ± 1,1 % (рис. 4).

О более двух маркеров (1) О два маркера (2)

И один маркер (3) □ отсутствие (4)

Рис. 4. Ранжирование клинических штаммов УПЭ по наличию фенотипических признаков: Р, 2 3 4< 0,01.

Среди бактерий родов Proteus и Klebsiella значимо преобладали штаммы с наличием более двух фенотипических признаков (67,1 ± 2,6 % и 54,4 ±3,0 % соответственно), а у Enterobacter и Citrobacter - с двумя признаками (57,9 ± 5,6 % и 54,3 ± 4,2 %). Наличие самого большого комплекса (пяти из шести исследуемых) фенотипических маркеров патогенности значимо чаще выявлялось у штаммов Klebsiella spp. (8,8 ± 1,7 %).

Установлено, что клинические штаммы УПЭ характеризовались значимо (р < 0,01) более высоким потенциалом патогенное™ по сравнению с микроорганизмами, полученными из фекалий детей контрольной группы. Так, УПЭ, выделенные от здоровых детей, реже (р <0,01) обладали исследованными фенотипическими признаками; частота их встречаемости варьировала от 2,3 % (продукция фосфатазы) до 9,3 % (адгезивная активность). Кроме того, среди энтеробактерий, выделенных от детей контрольной группы, чаще по сравнению с клиническими УПЭ (р < 0,01) отмечались штаммы четвертой группы, т.е. не обладающие исследованными свойствами (около 70 %); пятая часть (22,7 ± 3,7 %) характеризовалась одним фенотипическим признаком. Также у здоровых детей значимо реже (р < 0,01) выделялись УПЭ с двумя признаками (7,8 ± 2,4 %), и не было выявлено штаммов с сочетанием более двух признаков. Следует отметить, что спектр фенотипических маркеров среди клинических штаммов энтеробактерий оказался значительно шире (5 маркеров) по сравнению со штаммами контрольной группы (2 маркера).

Таким образом, проведенные исследования показали, что условно-патогенные энтеробактерий, выделенные от больных ОКИ, гетерогенны по наличию фенотипических признаков; среди них преобладают штаммы, которым свойственно наличие комплекса факторов патогенности, в то же время каждый десятый штамм не обладает фенотипическими маркерами, необходимыми для проявления патогенности.

Патогенность клинических штаммов in vivo - наиболее признанный маркер их этиологической значимости. Проведенная оценка вирулентности клинических штаммов энтеробактерий in vivo показала, что при тестировании 13 культур (К. pneumoniae -5,Р. mirabilis - 2, P. vulgaris -1, M. morganii -2,Е. cloacae - 2, C.freimdii - 1 ), обладающих комплексом фенотипических признаков, гибель 88,2 % мышей наблюдалась через 24 часа, 11,8 % - через 48 часов. Штаммы энтеробактерий, изолированные от больных ОКИ, характеризующиеся отсутствием маркеров патогенности, в течение 10-дневного наблюдения не вызывали гибели лабораторных животных. Штаммы энтеробактерий, выделенные от здоровых детей, характеризующиеся отсутствием маркеров патогенности, также не вызывали гибели лабораторных животных.

Исследования последних лет показывают эффективность индикации у УПЭ генетических маркеров патогенности с помощью молекулярно-генетических методов, в частности, ПЦР. В связи с этим проведено изучение наличия и распространенности генетических маркеров патогенности у клинических штаммов условно-патогенных энтеробактерий. Для определения нуклеотидных последовательностей генов, контролирующих продукцию факторов патогенности, использовали праймеры, амплифицирующие фрагменты sfaA- и л/аС-генов, детерминирующих продукцию фимбрий S-типа, генаfimA, обеспечивающего синтез фимбрий 1 типа; ЫуА- и hlyB-генов, контролирующих продукцию токсических веществ - гемолизинов; /Ур-2-гена, детерминирующего синтез сидерофора, участвующего в транспорте железа внутрь клетки. Тестирование коллекции из 175 штаммов У ПМ показало, что у 41 изолята (23,4 ±3,2 %) выявлены нуклеотидные

последовательности генов, кодирующих фимбриальные факторы адгезии, продукцию гемолизинов и синтез железорегулируемого белка. При этом генетические детерминанты патогенности обнаружены у бактерий восьми родов (рис. 5).

Рис. 5. Спектр клинических штаммов энтеробактерий с наличием генетических детерминант патогенности (%).

Установлено, что чаще встречались гемолитические детерминанты (ЫуА и (или) МуВ - 13,4 ± 2,6 %), вызывающие цитопатические изменения и являющиеся одним из важнейших факторов вирулентности энтеробактерий, и генетические детерминанты адгезивной активности энтеробактерий Б-типа и (или) 1 типа-11,7 ± 2,4 %. Частота выявления нуклеотидных последовательностей генов, ассоциированных с продукцией гемолизинов и адгезией, оказалась значимо более высокой (/? < 0,01) по сравнению со встречаемостью других исследуемых генов. Так, в пуле исследуемых культур искомые ампликоны при использовании прай-меров к ЫуА и МуВ определены у 17 штаммов (9,7 ± 2,2%), $/аА - 13 (7,4 ± 1,9 %); 5/аС- 8 (4,6± 1~5 %), /гт А ~ А (2,3 ±1,1 %), 1гр-2 - 2 (1,2 ±0,3 %) (рис. 6).

Рис. 6. Частота обнаружения генетических маркеров «островов» патогенности среди условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от больных ОКИ (п= 175).

Проведенные исследования показали генетическую неоднородность популяции клинических штаммов энтеробакгерий по признаку патогенности. Установлено, что среди УПЭ, обладающих указанными генетическими детерминантами, наибольшую долю составили Klebsiella spp. и Citrobacter spp. (39,0 и 24,4 % соответственно среди штаммов с наличием генетических маркеров патогенности; 9,1 ± 2,1 и 5,7 ± 1,7 % соответственно среди всех протестированных УПЭ). Кроме того, клинические штаммы Klebsiella spp., значимость которых в этиологии ОКИ в последние годы возрастает, несут самый большой набор генетических детерминант патогенности по сравнению с другими энте-робактериями (рис. 7).

Рис. 7. Частота обнаружения генетических детерминант патогенности у клинических штаммов Klebsiella spp.: 1 - доля среди клебсиелл; 2 - доля среди всех протестированных энтеробактерий.

У Klebsiella spp. выявлены практически все изучаемые генетические маркеры «островов» патогенности. При этом наибольшая частота обнаружения была характерна для нуклеотидных последовательностей генов hlyA и sfaG.

Установлена неравномерность распространенности генетических детерминант патогенности у культур, полученных от детей разных возрастных групп. В большинстве случаев (85,3 %) маркеры «островов» патогенности были обнаружены у культур, выделенных от детей до 3 лет (группа риска). Кроме того, у клинических штаммов, выделенных от детей этой возрастной группы, отмечен самый широкий набор генетических детерминант патогенности. Так, у культур указанной группы детей выявлены 100 % детерминант sfaG,fimA и irp-2; а также 88,2 % ЫуВ, 82,3 % hlyA и 76,9 % sfaA. Результаты по выявлению генетических маркеров патогенности у культур, выделенных от больных разных возрастных групп, сопоставимы с исследованиями Н.Ю. Жеребцовой (2006), показавших, что при выявлении нуклеотидных последовательностей hlyA, hlyB, sfaG, cnfl, estB-генов на культуры, полученные от детей до 3-х лет, приходилась самая большая доля данных детерминант.

Следует отметить, что среди энтеробактерий, изолированных от детей контрольной группы, встречаемость генов оказалась значимо более низкой и характеризовалась единичными находками (гены lily А - 3,1 %, ф - 1,5 %).

Клинические аспекты ОКИ и их сопряженность с наличием генетическим детерминант патогенности условно-патогенных энтеробактерий

Для изучения сопряженности клинических проявлений ОКИ с наличием генетических детерминант патогенности УПЭ проведен анализ клинического течения ОКИ у детей, госпитализированных в Иркутскую областную клиническую инфекционную больницу. Установлено, что этиологическая структура выделенных энтеробактерий была представлена бактериями 10 родов и 22 видов, преимущественно родов Enterobacter, Proteus, Klebsiella, Morganella и Citrobacter, Частота их встречаемости превышала долю энтеробактерий других родов (р < 0,01).

Основную часть заболевших составляли дети в возрастной группе до 3 лет (около 80 %). Доминировало среднетяжелое течение заболевания (88,8 ± 0,3 %). При этом у больных до 3 лет тяжелая форма ОКИ встречалась чаще, чем в других возрастных группах (около 8 %). Средняя продолжительность заболеваний острыми кишечными инфекциями составила 5,9 койко-дней с более длительным течением у детей двух возрастных групп: до 3 лет и 3-7 лет. Значимо чаще о < 0,01) ОКИ протекали по типу острого гастроэнтерита и энтероколита (более 70 % всех острых кишечных инфекций).

При анализе отдельных клинических показателей ОКИ (длительность лихорадки, средняя продолжительность болезни, наличие рвоты, диареи и т.д.) установлено, что продолжительность госпитализации составила 5,6 ± 0,5 дней; средняя продолжительность лихорадки - 4,1 ± 0,2 дней, средняя максимальная температура - 37,9 ± 0,06 °С. Почти у половины больных (42,5 ± 1,8 %) лихорадка наблюдалась в течение 4-6 дней, у десятой части детей (11,1 ± 1,8 %) сохранялась в течение 7 и более дней. Рвота регистрировалась более чем у половины больных (51,3 ± 1,8 %). Почти у третьей части (27,9 ± 1,6 %) детей рвота была однократной; повторная рвота встречалась значимо реже - у 17,0 ± 1,3 % (р < 0,05). Продолжительность диареи составила 4,4 ± 0,1 дней. Кратность стула менее 5 раз в сутки отмечалась у подавляющего большинства детей (85,1 ± 0,05 %).

Факторный дисперсионный анализ обнаружения генетических маркеров «островков» патогенности у штаммов энтеробактерий, выделенных от больных ОКИ, и клинических проявлений заболеваний показал наличие значимых связей между наличием генетических маркеров и клиническими проявлениями острых кишечных инфекций (табл. 3).

„ л иилт

Оценка связен между наличием генетических маркеров патогенности клинических штаммов энтеробактерий с проявлениями ОКИ

Таблица 3

Клинические проявления ОКИ Наличие ЫуВ, hlyA, sfaA, sfaG, fimA, irp-2

Критерий Фишера (F)

P

Продолжительность лихорадки

3,80

p<0,01

Степень подъема температуры (мах)

4,4

р < 0,01

Продолжительность рвоты

1,50

р > 0,05

Продолжительность диареи

1,65

р < 0,01

Анализ связей между характеристикой выделенных от больных детей штаммов УПЭ и клиническими проявлениями вызываемых ими инфекций показывает, что наличие у возбудителя генетических детерминант патогенности значимо сопряжено с увеличением продолжительности и уровнем лихорадки, а также с длительностью диареи у детей, больных ОКИ. При наличии у клинических штаммов генетических детерминант патогенности в испражнениях больных чаще обнаруживаются патологические примеси (р < 0,01), а при наличии полиантибио-тикорезистентности наблюдалась более продолжительная лихорадка (р < 0,01).

Следует отметить, что во всех исследованных случаях генетические маркеры выявлены у штаммов, выделенных при среднетяжелых и тяжелых формах ОКИ. При этом культуры, несущие генетические детерминанты «островков» патогенности, статистически чаще (р < 0,05) выявлялись при тяжелых формах ОКИ (12,2 %) по сравнению со штаммами, у которых данные детерминанты не выявлены (0,7 %). При тяжелом течении ОКИ были выделены штаммы, несущие следующие генетические детерминанты: ген высокой патогенности - irp-2 (К. pneumoniae, S. odorifera); гены, ответственные за продукцию гемолизинов - hlyA и hlyB (К. pneumoniae, С. koseri), а также за адгезию S-nuvd-sfaA (Е. intermedins). Штаммы бактерий, несущие генетические маркеры «островов» патогенности, в 73,2 ± 6,9 % случаев обладали полирезистентностью к антимикробным препаратам.

Обобщая раздел работы по изучению условно-патогенных энтеробактерий на модели ОКИ, следует отметить, что спектр клинических штаммов УПЭ был представлен субдоминирующими популяциями бактерий родов Enterobacter, Proteus, Klebsiella и Citrobacter, в многолетнем аспекте отмечалось смена их таксономического и количественного состава. Клинические штаммы УПЭ характеризовались преобладанием таких фенотипических признаков, как антилизо-цимная, адгезивная активность и продукция фосфатазы. При этом доминировали штаммы, обладающие сочетанием двух и более маркеров, характеризующих их потенциал патогенности. Фенотипические маркеры патогенности у энтеробактерий, выделенных от больных ОКИ, обнаруживались значимо чаще по сравнению со штаммами контрольной группы. Кроме того, у клинических штаммов энтеробактерий выявлены генетические детерминанты патогенности, установлена их сопряженность с клиническим течением ОКИ, что свидетельствует об их этиопатогенетической значимости при острых кишечных инфекциях.

Условно-патогенные энтеробактерии в микробных сообществах

водных экосистем и их биологические свойства

Следующим разделом работы явилось изучение таксономической характеристики УПЭ и их биологических свойств на модели микробиоценозов водных экосистем. Условно-патогенные микроорганизмы, являясь сочленами естественных экосистем, широко распространены в окружающей среде, характеризуются вариабельностью их биологических свойств, возможностью патогенизации под воздействием различных факторов и формирования эпидемических вариантов возбудителей. Особое значение имеет изучение циркуляции бактерий данной группы в водных объектах, оказывающих существенное влияние на жизнедеятельность человеческой популяции.

Статус биоценоза в поверхностных водах составляют две экологически различные группы микроорганизмов - аутохтонные и аллохтонные бактерии (Калина Г.П., 1988). Изменение соотношения бактерий двух различных экологических групп может привести не только к нарушению нормального экологического состояния водоема, но и к ухудшению его санитарно-эпидемиологических показателей (Плотников А.О. с соавт., 2000). Среди аллохтонных бактерий наиболее распространены энтеробакгеры, клебсиеллы, провиденции и т.д. Большую часть указанных микроорганизмов принято считать условно-патогенными, т.к. при определенных обстоятельствах они могут иметь этиологическое значение в возникновении и развитии факторных и ассоциативных инфекционных болезней (Макаров В.Ю. с соавт., 2007).

Проведенные исследования показали, что грамотрицательная составляющая микробиоценозов исследованных водных объектов (реки Ангара и Лена) была представлена микроорганизмами различных семейств (Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Moraxellacceae, Aeromonadoceae, Alcaligenaceae), среди которых абсолютными доминантами являлись бактерии семейства Enterobacteriaceae (река Лена - 75,6 %; река Ангара - 88,6 %). Учитывая, что энтеробактерии составляли существенно большую часть (р < 0,05) микробиоценозов водоемов, а также отличались наиболее широким спектром, для систематизации значимости различных представителей данного семейства проведена количественная оценка степени доминирования микроорганизмов. При этом не было выявлено микроорганизмов, относящихся к классу абсолютных доминат (границы класса по доле от 64 % до 100 %). Все микроорганизмы относились к четырем классам (доминант, субдоминант, второстепенный и редкий классы). При этом в класс доминант (границы класса по доле от 36 % до 64 %) вошли только штаммы одного рода -Escherichia, представленные двумя фенотипами: ферментирующие и неферментирующие лактозу. Субдоминантами оказались бактерии рода Enterobacter, составившие в биоценозе р. Ангары около трети всех штаммов бактерий; р. Лены -19,4 %. Микроорганизмы данного рода были представлены бактериями трех видов: Е. cloacae, Е. aerogenes и Е. gergoviae, среди которых типовой вид (Е. cloacae) доминировал. При этом частота встречаемости штаммов Е. cloacae в р. Ангаре оказалась значимо выше (р < 0,05) по сравнению с р. Леной. Другая особенность спектра микробного

сообщества реки Лены - значительная частота встречаемости штаммов Klebsiella spp., которые наряду с Enterobacter spp. вошли в класс субдоминант. Доля данных бактерий в микробном сообществе р. Ангары был несколько ниже (второстепенный класс доминирования). Также следует отметить штаммы родов Pantoea (река Лена) и Citrobacter (река Ангара), частота встречаемости которых в микробном сообществе водоемов позволила отнести их к второстепенному классу доминирования. Микроорганизмы других родов семейства Entcrobacteriaceae по степени доминирования относились к редкому классу: бактерии рода Proteus (оба водоема), родов Morganella и Citrobacter (река Лена), а также штаммы родов Pantoea, Serratia, Hafnia и Edwardsieila (река Ангара) (табл. 4).

Таблица 4

Оценка степени доминирования бактерий семейства ЕШегоЬас(епасеае микробных сообществ рек Ангара и Лена (по шкале доминирования)

Степень (класс) доминирования Баллы

5 4 3 2 1

Абсолютный доминант Доминант Субдоминант Второстепенный Редкий

Границы классов по доле (%) 64 < N < 100 36 < N < 64 14 < N < 36 6 < N < 14 0 < N < 6

Водный объект Таксономическая принадлежность микроорга> низма

река Лена - Escherichia Enterobacter Klebsiella Pantoea Proteus Citrobacter Mqanella

река Ангара - Escherichia Enterobacter Klebsiella Citrobacter Proteus Pantoea' Serratia Hafnia Edardsiella

Следует отметить, что за период наблюдения не отмечалось смены таксономического спектра УПЭ микробиоценозов изучаемых водоемов, и колебания частоты встречаемости отдельных представителей семейства Еп(еюЬас1епасеае находились в пределах класса. В то же время выявлены изменения их популяций на уровне разнообразия.

Изучение варьирования содержания УПЭ в составе микробиоценозов водных объектов, приуроченных к районам биологического загрязнения, показало, что в районе городов Ангарск и Иркутск, испытывающих выраженный антропогенный прессинг, индексы видового разнообразия (с1) УПМ (по Я. Магаа1сГ) микробного сообщества реки Ангары оказались, во-первых, практически равными (6,95 и 6,59 соответственно), во-вторых, были выше по сравнению с истоком реки (4,43). По р. Лене в районе г. Якутска данный индекс составил 5,86; а с учетом всей протяженности реки - 4,47. При этом наиболее демонстративно различия микробных сообществ водоемов, а также различных их участков, показывают индексы видового разнообразия УПЭ по сравнению с бактериями других семейств. Сравнение микробных сообществ между отдельными участками реки Ангары с 22

использованием коэффициента сходства Серенсона (Б) показало, что наибольшая близость выявлена между количественным составом микробных сообществ р. Ангары в районе гг. Иркутск и Ангарск (0,72), наименьшая - между указанными городами и истоком реки (0,58).

Таким образом, показатели индекса видового разнообразия и коэффициента сходства характеризуют изменение содержания грамогрицательных УПЭ в микробных сообществах водных экосистем и отражают направленность их трансформации.

Информативной характеристикой микробиоценозов водных экосистем является также и их ранговое распределение по параметрам «доминирование - разнообразие» условно-патогенных представителей семейства ЕШегоЬас1епасеае. Показано, что для микробиоценоза реки Ангары (по сравнению с р. Леной) характерна более «уплощенная» кривая (большее разнообразие энтеробактерий при данном числе видов) (рис. 8а, б).

Изучение фенотипических характеристик водных изолягов условно-патогенных энтеробактерий показало, что более трети всех микроорганизмов

обладали антилизоцимной активностью, способствующей их выживанию во внешней среде, и продуцировали фосфатазу. Частота встречаемости антилизоцимной активности и щелочной фосфатазы значимо (р < 0,05) превышала проявление других фенотипических признаков: адегезия и продукция ДНКазы выявлена у 17,5 ± 1,9 % и 14,3 ± 1,8 % штаммов УПМ соответственно; гемолитическая и протеолитическая активность - у 7,9 ± 1,3 % и 11,1 ± 1,3 % соответственно (рис. 9).

продукция ГА ПА продукция АЛА адгезивная

щелочной ДНКазы активность

фосфатазы

Рис. 9. Характеристика фенотипических свойств водных изолятов УПЭ (%).

Среди водных изолятов энтеробактерий преобладали (р < 0,05) штаммы, характеризующиеся одним фенотипическим признаком (41,3 ±2,1 %), и значимо реже (по сравнению с клиническими штаммами) встречались штаммы, обладающие двумя и более маркерами (рис. 10).

□ более 2 маркеров (1) 02 маркера (2) ЕЗ 1 маркер (3) СЗотсутствие

Рис. 10. Ранжирование водных штаммов условно-патогенных энтеробактерий по наличию фенотипических признаков: Р, , < 0,01; Р„ , < 0 01' Р„ , < 0 01'

Р24>0,05. 3 2 3 3'4 ' '

Результаты проведенных исследований позволили установить наличие выраженной корреляционной связи между распространенностью УПЭ в структуре 24

микробиоценозов и наличием у них таких свойств, как перснстснция (г = 0,786; р < 0,05), адгезивная активность (г = 0,875; р < 0,01) и продукция ДНКазы (г = 0,871; р < 0,01). Также установлена зависимость между значимостью УПМ (но шкале доминирования) и наличием у них сочетанности фенотипических проявлений. Так, микроорганизмы, обладающие несколькими фенотипическими признаками, входили по шкале доминирования в классы доминант, субдоминант и второстепенный класс. В то же время штаммы Klebsiella spp., уступающие, согласно ранжированию, по доле в составе энтеробактерий микробного сообщества штаммам Е. coli и Enterobacter spp., имели наиболее высокий показатель выявления сочетанных фенотипических признаков. Данные микроорганизмы (Е. coli, Klebsiella spp. и Enterobacter spp.) имели самый широкий спектр (4 из 6) фенотипических свойств. Наиболее высокая частота встречаемости соче ганного проявления фенотипических признаков была характерна для Klebsiella spp. (пятая часть штаммов данного рода), а биопрофиль Е. coli характеризовался наибольшим разнообразием фенотипических проявлений (5 вариантов).

Проведенные исследования показали, что фенотипические признаки не только характеризуют биопрофиль отдельных водных изолятов, но также являются одним из показателей состояния микробиоценоза водной экосистемы. Изучение на модели реки Лены вариабельности фенотипических свойств условно-патогенных представителей семейства Enterobacteriaceae в зависимости от точки отбора проб воды показало, что у энтеробактерий микробиоценозов р. Лены в районе г. Якутска («опытный» район) по сравнению с рекой на всей ее протяженности (контрольный район) чаще (р < 0,01) выявляли наличие одного (50,0 ± 3,4 и 33,3 ± 3,7 % соответственно) и двух (30,6 ± 3,1 и 18,5 ± 3,0 % соответственно) фенотипических свойств. Микроорганизмы, обладающие сочетанием 3 и 4 признаков, были характерны только для микробного сообщества «опытного» участка реки (2,7 ±1,1 и 11,1 ± 2,1 % соответственно). Проведенные исследования показали, что у энтеробактерий, выделенных в районе г. Якутска, по сравнению со штаммами контрольного участка значимо чаще отмечалась продукция ДНК-азы -25,0 ± 2,9 и 3,7 ± 1,4 % соответственно (р < 0,01), щелочной фосфатазы -41,7 ±3,3 и 29,5 ±3,5 % соответственно (р < 0,05), а также адгезивная активность - 22,2 ± 2,8 и 11,1 ± 2,4 % соответственно (р < 0,01). Практически все штаммы, обладающие гемолитической активностью, были выявлены на «опытном» участке (р < 0,05). Для микробного сообщества данного района был характерен и значимо более высокий уровень распространенности персистентных свойств энтеробактерий: 52,8 ±3,1 и 18,5 ± 3,0 % соответственно (р < 0,01). По критерию Вилкоксона направленность изменений фенотипических признаков бактерий на «опытном» и контрольном участках носила статистически значимый характер (Т = 1 при п = 6; р < 0,05).

Как было указано выше, из исследованных фенотипических признаков у водных штаммов энтеробактерий наиболее часто отмечалось свойство пер-систенции (ангнлизоцимная активность), способствующее выживанию на

популяционном уровне и накоплению микроорганизмов в объектах внешней среды. Проведенные исследования показали, что соотношение штаммов, продуцирующих лизоцим и обладающих антилизоцимной активностью, в целом по р. Лене (без учета г. Якутска) составило 6,87, что свидетельствует о нормальном экологическом состоянии биоценоза. В районе г. Якутска данное соотношение уменьшилось до 1,73, что отражает перестройку микробиоценоза в связи с повышением доли антилизоцимактивных штаммов. В целом по реке Лене количество лизоцимактивных (ЛА) представителей аутохтонной микрофлоры составило 85,9 ± 2,2 %, антилизоцимактивных условно-патогенных микроорганизмов -18,5 ± 3,1 %; в районе г. Якутска количество штаммов с ЛА уменьшилось до 73,5 ± 2,6 % (р < 0,01), а доля микроорганизмов с АЛА возросла до 52,8 ± 3,3 %

(Р<0,01).

Выявление у УПЭ, выделенных из вод поверхностных водоемов, особенно в районах антропогенного загрязнения, изменения биологических свойств, в частности персистентного потенциала, способности продуцировать ДНКазу, фосфатазу, проявлять гемолитическую, адгезивную и протеолитическую активность, характеризует состояние микробиоценноза водной экосистемы и свидетельствует о потенциальной опасности бактерий данной группы.

В связи с этим одним из аспектов оценки эколого-эпидемиологической значимости водных изолятов УПЭ является изучение наличия и распространенности среди них генетических детерминант патогенности. Однако в настоящее время в России данные исследования единичны. В частности, A.B. Загайновой (2010) выявлены генетические детерминанты «островов» патогенности (cnf-1, fimA, ehx) у клебсиелл, выделенных из вод различного вида водопользования. Проведенные нами исследования показали, что условно-патогенные энтеробактерии, выделенные из воды, характеризовались наличием генетических детерминанант патогенности, что свидетельствует об их потенциальной эпидемиологической значимости. В то же время частота их обнаружения (7,8 %) была ниже (р < 0,05) по сравнению с клиническими штаммами (23,4 %), отмечена встречаемость только двух генов: hlyA (3,4 %) и sfaG (4,5 %), а набор генетических детерминант не превышал одного маркера.

Оценка вирулентности водных штаммов энтеробактерий in vivo показала, что при тестировании четырех культур, характеризующихся наличием генетических детерминант патогенности, на 12 лабораторных животных гибель мышей наступала через 24 (75,0 %) и 48 часов (25,0 %). Штаммы энтеробактерий (количество культур - 5, количество биопроб - 15), характеризующиеся отсутствием генетических маркеров патогенности, не вызывали гибели лабораторных животных.

Антибиотикорезистентность условно-патогенных микроорганизмов

Клинические штаммы условно-патогенных энтеробактерий

Одной из важнейших фенотипических характеристик условно-патогенных энтеробактерий является их резистентность к антимикробным препаратам.

Изучение антибнотикорезиетентности УПЭ, выделенных из фекалий больных ОКИ, показало, что популяция энтеробактерий была представлена штаммами, неоднородными по отношению к АМП. Нами был разработан способ оценки гетерогенности микробных популяций с использованием индекса антибиотико-резистентиости (ИАР) с позиции кластерной структурированности. Учитывая величины и диапазоны величин ИАР, все индексы были сгруппированы в пять кластеров (шаг индекса составил 0,05). Соответственно, исследованные микроорганизмы были подразделены на: чувствительные (I), монорезистентные (II), умеренно-резистентные (III), полирезистентные (IV) и резистентные к максимальному количеству исследованных антибиотиков (V). Проведенные исследования показали, что по величинам ИАР все клинические штаммы энтеробактерий входили в три кластера: монорезистентными оказались 6,3 ± 0,6 % протестированных штаммов, более трети микроорганизмов проявили устойчивость к двум-пяти антибиотикам; значимо (р < 0,01) большую часть составили полирезистентные изоляты (табл. 5).

Таблица 5

Оценка антибиотикорезистентности (по ИАР) штаммов УПЭ, выделенных от детей с ОКИ (а) и контрольной группы (б)

Кластер Величина и (или) диапазон ИАР Штаммы УПЭ, выделенные от Р

больных ОКИ (а) здоровых детей (6)

1 0,0 0,0 58,5 ±4,7 р <0,01

II 0,05 6,3 ± 0,6 30,2 ±4,4 р<0,01

III 0,10 ä ИАР 5 0,25 38,8 ± 1,1 11,3 ±3,1 р <0,01

IV 0,30 s ИАР S0,95 54,9 ± 1,2 0,0 р < 0,01

V 1,0 0,0 0,0

Применение: а - Р„ < 0,01, Р„ lv < 0,01, Рш lv < 0,01; б - Р, „ < 0,01; Р, ш < 0,01;

Для сравнения укажем, что среди штаммов, выделенных от здоровых детей, в отличие от клинических штаммов, доминировали (р < 0,01) УПЭ, входящие в I кластер - 58,5 ± 4,7 % (чувствительные ко всем протестированным АМП) и во II кластер - 30,2 ± 4,4 % (монорезистентные). Как видно из данных таблицы, среди клинических УПЭ по сравнению с бактериями контрольной группы, значимо чаще обнаруживались умеренно- и полирезистентные штаммы и значимо реже — чувствительные и монорезистентные.

При проведении сравнительного анализа устойчивости представителей разных родов клинических штаммов энтеробактерий в первую очередь учитывали штаммы, составившие большую часть от всех тестируемых микроорганизмов (Enterobacter spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp., Proteus spp., M. morgann).

В результате проведенных исследований были выявлены монорезистентные штаммы среди бактерий родов Proteus, Enterobacter (каждый десятый штамм) и Citrobacter (около 5 %). К двум антимикробным препаратам проявили резистент-

ность ] 2,6 ± 0,8 % штаммов; к трем, четырем и пяти - примерно каждый десятый штамм. Свойство полиантибиотикорезистентности значимо чаше (р < 0,05) отмечалось среди Klebsiella spp. (70,0 ± 2,8 %) по сравнению с бактериями родов Citrobacter, Enterobacter и Morganella, среди которых множественная антибиоти-корезистентность установлена примерно у половины штаммов. Среди представителей рода Proteus данное свойство выявлено в 65,7 ± 2,4 % случаев (рис. 11).

% 90-1----—--

Klebsiella spp. Gtrobacter spp. Enterobacter Proteus spp. (4) M. morganii (5) (1) (2) spp. (3)

Рис. 11. Полиантибиотикорезистентность бактерий семейства Enterobacteriaceae, выделенных от больных ОКИ (%): Я „< 0,05; Р. , < 0,05; Р, , > 0,05; Р, 5 < 0,05.

В системе эпидемиологического мониторинга антибиотикорезистентности особое внимание уделяется устойчивости микроорганизмов к ß-лактамным антибиотикам. Результаты проведенных исследований показали, что к цефало-споринам 1 поколения были резистентны 74,6 ± 1,1 % штаммов; II и III поколений - третья часть протестированных штаммов; к АМН IV поколения отмечен статистически самый низкий {р < 0,01) уровень среди всех препаратов данной группы - 6,5 ± 0,6 %.

Немаловажное значение имеет изучение резистентности УПЭ к нелактамным АПМ. Установлено, что к нитрофуранам оказались резистентными около половины протестированных штаммов - 50,9 ± 1,2 %; к тетрациклинам -43,1 ± 1,2 % (прежде всего, за счет P. mirabilis, M. morganii и К. pneumoniae)', к хлорамфенико-лу - 27,6 ±1,1 %. Из всех аминогликозидов значимо меньший (р < 0,01) уровень резистентности отмечен к препарату III поколения - амикацину (7,1 ± 0,6 %); к аминогликозидам II поколения (гентамицину и тобрамицину) резистентность микроорганизмов составила 20,0 ± 0,9 и 15,2 ± 0,8 % соответственно, I поколения - 27,3 ± 1,1 %. Кроме того, небольшое количество (около 7 %) штаммов энтеробактерий были резистентны к фторхинолонам (ципрофлоксацину и офлоксацину).

Таким образом, проведенные исследования позволили установить структуру и уровень антибиотикорезистентности условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от детей, больных ОКИ, а также дать характеристику данного свойства 28

УПЭ с использованием ПАР, позволяющую проводить анализ резистентности клинических штаммов к антимикробным препаратам с позиций кластерной структурированности.

Водные штаммы условно-патогенных энтеробактерий

Принципиально важным информативным свойством водных штаммов условно-патогенных энтеробактерий является их отношение к антимикробным препаратам. Приобретение резистентности энтеробактерий к АМП демонстрирует их эволюционную изменчивость под воздействием факторов окружающей среды. Уровень антибнотикорезистентности микроорганизмов водных экосистем является одним из показателей испытываемой ими антропогенной нагрузки (Мамонтова Л.М. с соавт., 2000; Макаров Ю.А., 2007 и др.). К Тепоуег (2005) связывает повышение уровня антибиотикоустойчивости бактерий водных экосистем с усиливающимся процессом обмена генами резистентности между естественными обитателями водных экосистем и микроорганизмами, попадающими в водоемы со сточными водами. В то же время недостаточная изученность изменчивости данного свойства определяет необходимость совершенствования системы мониторинга за их природными популяциями с анализом популяционного биопрофиля водных изолятов условно-патогенных энтеробактерий.

Проведенные исследования позволили установить, что микробные популяции исследованных водных экосистем были представлены УПЭ, входящими по ИАР в три (река Ангара) и четыре (река Лена) кластера. Отличительной особенностью микробиоценоза реки Лены (в отличие от реки Ангары) является присутствие штаммов, входящих в I кластер (чувствительных ко всем использованным в работе антибиотикам, ИАР = 0,0), составивших 4,3 ± 0,3 %. Что касается монорезистентных условно-патогенных грамотрицательных микроорганизмов, то самой высокой (р < 0,05) частота их встречаемости была в истоке реки Ангары (27,8 ± 4,3 %). Распределение монорезистентных бактерий в микробных сообществах реки вблизи городов, испытывающих выраженную антропогенную нагрузку, выглядело следующим образом: в районе г. Ангарска данный показатель составил 4,5 ± 1,4; в районе г. Иркутска - 0,8 ± 0,2 % (р > 0,05). Количество монорезистентных штаммов микробной популяции реки Лены в районе г. Якутска оказалось примерно таким же, что и в микробном сообществе реки на всей ее протяженности: 6,1 ± 1,5 и 7,6 ± 0,5 % соответственно. Доминирующая часть УПЭ микробных сообществ изучаемых водоемов относилась к III кластеру -умеренно-резистентные (0,10 < ИАР < 0,25). Самая высокая частота встречаемости умеренно-резистентных штаммов была характерна для микробного сообщества реки Лены на всей ее протяженности (68,3 ± 0,8 %), а также реки Ангары в ее истоке и в районе г. Иркутска (58,4 ± 4,7 и 64,6 ± 2,4 % соответственно).

Особый интерес представляет оценка частоты встречаемости полирезистентных микроорганизмов (IV кластер), объединяющих большую группу бактерий, характеризующихся значительным количеством ИАР в диапазоне от 0,30 до 0,95. Установлено, что, частота встречаемости полиантибиотикоустойчивых

штаммов энтеробактерий в целом по реке Лена составила 19,8 ± 0,7 %, в то же время в районе г. Якутска удельный вес бактерий с данным свойством оказался в два раза выше {р < 0,01). Аналогичная картина отмечалась и в отношении р. Ангары, в истоке которой количество полиантибиотикоустойчивых штаммов составило 13,8 ± 3,3 % и оказалось значимо (р < 0,05) меньшим, чем в районе городов, где доля микроорганизмов, входящих в IV кластер, увеличилась почти в три раза (табл. 6).

Таблица 6

Оценка антибиотиокрезистентности (по ПАР) водных штаммов условно-патогенных энтеробактерий

Кластер

Водный объект 1 II III IV V

% Р % Р % Р % Р %

го X ф с; на всей протяженности 4,3 ±0,3 ю о_ 7,6 ±0,5 ю сэ 68,3 ±0,8 ю о 19,8 ±0,7 ю о 0,0

го 0) О. в районе г. Якутска 0,0 V а. 6,1 ±1,5 л о. 53,5 ±3,2 V о. 40,4 ±3,1 V о. 0,0

03 о. то в районе г. Ангарска 0,0 ю 4,5 ± 1,4 ю 49,2 ± 3,5 ш 46,3 ±3,5 ю 0,0

X < го в районе г. Иркутска 0,0 о" л 0,8 ±0,2 о о V 64,6 ± 2,4 о о V 34,6 ± 2,5 о о V 0,0

0) о. исток реки Ангары 0,0 о. 27,8 ±4,3 о. 58,4 + 4,7 а 13,8 ±3,3 о. 0,0

На исследованных участках водоемов количество полирезистентных штаммов оказалось значимо меньшим по сравнению с частотой встречаемости умеренно-резистентных микроорганизмов (р < 0,05), за исключением участка в районе г. Ангарска, где количество бактерий, входящих в IV и III кластеры, оказалось практически равным.

Таким образом, использование индекса антибиотикорезистентности позволяет дать оценку гетерогенности микробных популяций водных экосистем и провести сравнительную оценку по данному признаку микробиоценозов разных водоемов, а также микробных сообществ различных участков одного водоема.

Многолетние исследования показали, что экологическое состояние водной экосистемы оценивается как благополучное, если в микробной популяции, представленной условно-патогенными грамотрицательными энтеробактериями, присутствуют микроорганизмы первого кластера (чувствительные ко всем АМП) и (или) монорезистентные (II кластер); доля умеренно-резистентных штаммов (III кластер) составляет более половины всех штаммов, а полирезистентных (IV кластер) - менее 25 % от исследованных микроорганизмов.

Несомненный интерес представляет также изучение антибиотикорезистентности представителей аутохтонной составляющей исследованных водных объектов. Анализ антибиотикорезистентности данной группы микро-

организмов показал наличие различий в уровне изучаемого показателя не только между данными микроорганизмами на разных участках реки, но также и между представителями указанной группы и условно-патогенными грамо-трицагельными микроорганизмами. Сравнивая антибиотикорезистентность бактерий двух групп, следует отметить, что частота встречаемости условно-патогенных грамотрицательных бактерий, входящих в I и II кластеры, была меньшей по сравнению с представителями аутохтонного сообщества. В то же время энтеробактерии чаще характеризовались полиантибиотикорезистент-ностыо. Данная тенденция прослеживалась как в отеношении исследованных водоемов, так и на отдельных участках рек, и в основном носила значимый характер (рис. 12).

ЕПузловно-латогенные микроорганизмы ЕЗаутохтонные

исток реки р. Ангара в р. Ангара в р. Лещ на всей р. Лена в районе Ангары (1) районе г. райэне г. протяженности г.Якутска

Иркутска (2) Ангарска (3)

Рис. 12. Полиантибиотикоустойчивость условно-патогенных и аутохтонных бактерий микробиоценозов рек Ангары и Лены (%).

Значительные различия выявлены в частоте встречаемости полиантибио-тикорезистентных УПЭ в зависимости от удаленности от берега и расположения населенных пунктов. Известно, что береговая часть водоема испытывает в большей степени влияние различных видов сточных вод. Исследование 30 створов (от верховья реки Лены в районе г. Усть-Кут до ее устья в районе моря Лаптевых) позволило установить, что процент резистентных штаммов, входящих в микробное сообщество фарватера реки, по критерию знаков оказался более низким (р = 0,01) по сравнению с таковым у бактерий береговой зоны реки, где более выражено влияние населенных пунктов и рекреационных зон. Суммарный показатель полиантибиотикорезистентных штаммов на середине р. Лена составил немногим более 10 % и был значимо ниже (р < 0,05) по сравнению с микробиоценозом береговой зоны, где количество резистентных микроорганизмов увеличилось в 1,6 раза. Проведение статистического анализа (критерий Вилкоксона) уровней антибиотикоустойчивости микроорганизмов, выделенных из реки Лены в пяти створах, показывает, что количество устой-

чивых штаммов бактерий ниже населенных пунктов (по течению реки) было существенно более высоким (Т = 0; р < 0,01).

О важности изучения показателя антибиотикоустойчивости условно-патогенных энтеробактерий водных экосистем свидетельствует проведение корреляционного и регрессионного анализов, результаты которых показали наличие выраженной связи между содержанием бактерий данной группы и количеством штаммов бактерий, обладающих множественной антибиотикоустойчивостью (\,у= 1,6 %; Яу/х; г = 0,73; р < 0,01).

Таким образом, установлено, что характеристика антибиотикорезистснтности позволяет не только представить распространенность данного свойства среди водных изолятов УПЭ, но и дать оценку экологического состояния микробиоценозов поверхностных водоемов но указанному показателю.

Адаптационный потенциал условно-патогенных энтеробактерий, выделенных из различных источников (клинический материал и водные объекты)

Изучение адаптационного потенциала условно-патогенных энтеробактерий, выделенных из разных источников (организм человека, внешняя среда), к различным условиям обитания позволило выявить значительные различия по их ферментативной активности. В разных условиях культивирования (различный температурный режим, питательные среды) энтеробактерий инициируют перестройку метаболических процессов, обеспечивающих их адаптацию. Так, у водных изолятов УПЭ активизация ферментов, способствующих выживанию во внешней среде (Мп-иероксидаза, каталаза, целлюлаза и др.), наблюдается при низких температурах. Например, наиболее высокая активность каталазы отмечалась при низкой температуре, а при воздействии высоких температур активность фермента снижалась (рис. 13).

ЕЗЕ. cloacae QE.aerogenes 13 К. pneucmiae □ P. rrabilis

Рис. 13. Изменение активности каталазы водных штаммов энтеробактерий при различных температурах культивирования.

Можно полагать, что высокие уровни активности каталазы требуются для детоксикации перекисей, выработке которых способствует возрастание растворимости кислорода и его доступности при низких температурах (Варвашевич Т.Н. с соавт, 1986).

У клинических штаммов, напротив, наибольший уровень кагалазной активности отмечался при более высокой температуре. Так, если активность каталазы водного штамма P. mirabilis при 4 °С составила 1,06 ед./мг, то при повышении температуры до 37 °С наблюдалось снижение активности до 0,67 ед./мг. У клинического штамма P. mirabilis активность данного фермента, составлявшая при критически низкой температуре 0,46 ед./мг, при 30 °С увеличилась до 1,07 ед./мг. Водный штамм К. pneumoniae обладал каталазной активностью только при температуре (0,44 ед./мг), а клинический штамм - только при 30 °С (0,54 ед./мг).

Синтез клиническими штаммами каталазы при более высоких температурах обеспечивает их адаптацию к условиям существования в организме хозяина. Бактерии, находясь во внутренней среде человека, вызывают его защитную реакцию: лейкоциты и макрофаги начинают продуцировать перекись водорода, направленную на уничтожение микроба. Фермент каталаза, являясь защитной системой бактерий, превращает лейкоцитарную перекись в воду (Деева И.Б, 2004). При этом чем выше каталазная активность бактерий, тем эффективнее они защищаются от организма хозяина.

Одним из ферментов жизнеобеспечения микроорганизмов является цел-люлаза. Установлено, что у клинических штаммов целлюлаза обнаруживалась только при оптимальной температуре культивирования (37 °С), а штаммы бактерий, выделенные из воды, проявили ферментативную активность при различных температурных режимах: от стрессового низкого до оптимального и субоптимального. Например, водный штамм Е. cloacae продуцировал целлюлазу при оптимальной температуре (0,079 ед./мг), а P. mirabilis - при критически низкой температуре (0,06 ед./мг). У штамма Е. aerogenes, также выделенного из воды, целлюлаза присутствовала при 24 °С (0,048 ед./мг), 30 °С (0,035 ед./мг) и 37 °С (0,039 ед./мг). Активность целлюлазы С. freundii проявилась при двух температурах культивирования: 30 °С (0,958 ед./мг) и 37 °С (0,05 ед./мг).

Также показано, что активность таких ферментов, как уреаза и липаза, у клинических штаммов энтеробактерий была выше аналогичных количественных показателей штаммов, выделенных из воды (табл. 7). В организме хозяина уреаза приводит к сдвигу рН среды в очаге воспаления и способствует разрушению эпителиальных клеток, а липаза облегчает адгезию и проникновение в ткани. При существовании микроорганизма в воде необходимость в синтезе данных факторов снижается.

Таблица 7

Соотношение активности (ед./мг) липазы и уреазы водных и клинических штаммов условно-патогенных энтеробактерий

Штамм Температура, °С

4 °С 24 °С 30 °С 37 °С

липаза

Е. cloacae 1 :1,3 1 :2,8 1 :2,2 1 : 1,5

Е. aerogenes 1 :1,8 1 :1,6 1 :1,8 1 : 1,1

уреаза

Е. cloacae 1 : 7,3 1 : 33,1 1 :24,1 1 : 19,2

Е. aerogenes 1 : 20,0 1 :29,4 1 : 27,9 1 :20,2

Культивирование микроорганизмов на различных питательных средах («голодная» среда и полная синтетическая среда Красильникова) показало, что клинические и водные изоляты УПЭ проявили разный уровень ферментативной активности на данных средах. У клинических штаммов ферментативная активность на полной синтетической среде была выше, чем на «голодной». Так, активность липазы клинического штамма С. freundii на полной среде при всех температурах культивирования превышала уровень активности данного фермента на «голодной» среде от 0,6 до 5 раз. Практически только на полной среде проявлял липазную активность клинический штамм P. mirabilis (4 °С - 0,74 ед./мг; 24 °С - 0,8 ед./мг; 30 °С - 0,86 ед./мг; 37 °С - 1,01 ед./мг). Аналогичные данные получены и в отношении оксиредуктаз. В частности, у С. freundii и P. mirabilis уровни Mn-пероксидазы на полной среде превышали аналогичные показатели на «голодной» среде в 3,5-9,8 раз.

Водные изоляты, в отличие от клинических, обладали вариабельной активностью ферментов, часть из них были активны при выращивании на полной питательной среде (оксиредуктазы К. pneumoniae и С. freundii), другие - на «голодной» среде (липаза К. pneumoniae и P. mirabilis).

Таким образом, проведенные исследования показали вариабельность ферментативной активности микроорганизмов в условиях различного температурного режима и состава питательных сред. В организме человека микроорганизмы вырабатывают ферменты, являющиеся факторами защиты и «агрессии» бактерий. При снижении температуры до значений, соответствующих температуре окружающей среды, и изменении доступности питательных элементов наблюдается перестройка метаболических процессов в сторону оптимизации; метаболизм микроорганизмов переключается с характерного для паразитирования в организме человека на сапротрофный, способствующий выживанию во внешней среде.

Одним из механизмов формирования фенотипической устойчивости является способность бактерий к развитию биопленочных сообществ. Для условно-

патогенных энтеробактернй, обитающих как в организме человека, так и в окружающей среде, способность к образованию биопленок является одной из возможностей выживания в различных условиях существования.

Учитывая, что биопленки обеспечивают бактериям большую устойчивость к неблагоприятных факторам воздействия по сравнению со свободно плавающими клетками (Costerton J.W. et al., 1999), в ближайшие годы мишенью для воздействия на инфекционный и микробный процессы станут не только сами бактерии, но также и микробные бионленки (Белобородова Н.В., 2011).

Проведенные исследования показали, что способностью образовывать биопленки обладали как клинические (Е. cloacae, C.freimdii, P. mirabilis, E. aerogenes и К. pneumoniae), так и водные (Е. coli, Е. cloacae и Е. aerogenes) штаммы УПЭ, что отражает их адаптационный потенциал. Следует отмстить, что способность к формированию биопленочных сообществ у штаммов, выделенных из разных источников, была различной. Среди клинических изолятов частота встречаемости штаммов с хорошей (I группа, ОП > 0,05), умеренной (II группа, ОП < 0,05) и фоновой (III îpynna, ОП = 0,0) степенью пленкообразования оказалась примерно равной (около трети штаммов в каждой группе). Среди водных изолятов УПЭ значимо преобладали (р < 0,01) штаммы с умеренной способностью к формированию биопленок (66,7 %)

Оценка степени пленкообразования УПЭ при различных температурных режимах показала, что клинические штаммы проявили хорошую способность к формированию биопленок при температурах 37 °С и 30 °С; умеренную - в основном при 24 °С; неспособность к пленкообразованию - преимущественно при 4 °С. У водных изолятов УПЭ степень пленкообразования, соответствующая I группе, отмечалась при 30 °С и 24 °С; а умеренная способность к формированию биопленочных сообществ была выявлена при всех температурных режимах.

Следует отметить, что при экстремально низкой температуре способность энтеробактернй образовывать биопленки снижалась, особенно у клинических штаммов. Так, при 4 °С уровень адсорбции кристалвиолета этанолом в единицах оптической плотности соответствовал фону у штаммов Е. cloacae, С. freundii и Е. aerogenes.

Обращает на себя внимание тот факт, что среди клинических штаммов условно-патогенных энтеробактернй способность к формированию биопленочных сообществ при всех температурах (в т.ч. при экстремально низкой) была выявлена только у К. pneumoniae, что может свидетельствовать о высоких адаптационных возможностях клебсиелл (рис. 14). У других клинических штаммов энтеробактернй способность к образованию биопленок была выявлена только при 24 °С, 30 °С и 37 °С.

Рис. 14.

37 30 24 4 t°

Образование биопленок клиническими штаммами К. pneumoniae.

Среди водных штаммов неспособность формировать биопленки при более низких температурах была отмечена только у Е. coli. Другие представители энтеробактерий, изолированные из воды, обладали способностью к пленкообра-зованию при всех температурах (рис. 15).

et 0,1

^ 0,09

й 0,08

? 0,07

о 0,06

с 0,05

га 0,04

S 0,03

| 0,02

Ё 0,01

° 0

1 >

ж

Ш-а о

■

•

й ■УЖ vv"v ■Km

>т , гТ^Ш

Рис. 15.

37 30 24 4

BE.coli НЕ.cloacae ЕЭE.aerogenes Образование биопленок водными штаммами энтеробактерий.

Также следует отметить, что клинические изоляты характеризовались более высокой степенью пленкообразования по сравнению с водными штаммами.

Проведенные исследования показывают, что выявленная у водных и клинических штаммов УПЭ способность к образованию биопленочных сообществ является одной из стратегий выживания бактерий в различных условиях существования (организм человека и окружающая среда).

выводы

1. Основными представителями условно-патогенных энтеробактернй в структуре бактериальных ОКИ установленной этиологии являются бактерии родов Enterobacter, Proteus, Klebsiella и Citrobacter (класс субдоминант), характеризующиеся сменой вариантного и количественного состава в многолетнем аспекте. Данные виды энтеробактернй (а также Е. coli и Pantoea) преобладают (с изменением степени доминирования) и в таксономическом спектре грамотри-цательной составляющей микробиоценозов водных экосистем.

2. Патогенность УПЭ, характеризующихся выраженной фснотипической неоднородностью, определяется свойствами конкретного штамма, а не видовой или родовой принадлежностью. Среди клинических штаммов УПЭ преобладают (р < 0,01) изоляты, которым свойственно наличие двух (32,9 ± 1,5 %) и более (39,4 ± 1,6 %) маркеров, коррелирующих с патогенностыо.

3. Клинические штаммы условно-патогенных энтеробактернй обладают феногипическими маркерами (антилизоцимной, адгезивной, фосфатазной (40-50 %), гемолитической и протеолитической (около 30 %) активностью, а также продукцией ДНКазы (26,5 ± 1,4 %), способствующими реализации их патогенного потенциала и обеспечивающими их участие на различных этапах инфекционного процесса. При этом УПЭ, выделенные от больных ОКИ, значимо чаще (р < 0,01) характеризовались наличием фенотипических признаков по сравнению со штаммами контрольной группы.

4. Условно-патогенные энтеробактернй, выделенные от больных ОКИ, несут генетические маркеры патогенности (23,4 ± 3,2 %), детерминирующие важные этапы взаимодействия возбудителя с клетками организма хозяина: адгезию, продукцию гемолизинов, размножение в тканях (hlyA, hlyB, sfaA, sfaG, finiA, irp-2), свидетельствующие об их этиопатогенетической значимости. Наиболее широкий набор генетических маркеров патогенности выявлен у бактерий рода Klebsiella, доля которых в структуре ОКИ у детей в последние, годы значимо возрастает.

5. В большинстве случаев генетические детерминанты патогенности обнаружены у культур, выделенных от детей до 3 лет, у которых отмечен и самый широкий набор генетических маркеров. У детей указанной возрастной группы риска отмечается и наиболее тяжелое клиническое течение ОКИ.

6. Популяция клинических штаммов УПЭ гетерогенна по отношению к антимикробным препаратам и характеризуется значительным распространением антибиотикорезистентых штаммов (свойством полирезистентности обладают 54,9 ± 1,2 %, более трети микроорганизмов резистентны к двум -пяти препаратам, монорезистентны лишь 6,3 ± 0,6 % штаммов). Клинические штаммы энтеробактернй обладают более высоким (р < 0,05) уровнем резистентности к ß-лактамным антибиотикам и низким - к фторхинолонам и аминогликозидам III поколения.

Энтеробактерии, выделенные от больных ОКИ, характеризуются более высокой частотой встречаемости антибиотикорезистентных штаммов но сравнению со штаммами контрольной группы, среди которых не было выявлено полирезистентных штаммов и отмечено значимое (р < 0,01) преобладание чувствительных (58,5 ± 4,7 %) и монорезистентных (30,2 ± 4,4 %) УПЭ.

7. Условно-патогенные энтеробактерии, выделенные из водных объектов, характеризуются значимо более редкой (по сравнению с клиническими штаммами) частотой встречаемости исследованных фенотипических признаков, среди которых преобладают штаммы с одним маркером (41,3 %). Биопрофиль водных штаммов УПЭ характеризуется преобладанием персистентных свойств, способствующих их выживанию в окружающей среде. В районах антропогенного загрязнения наблюдается усиление биологической активности УПЭ (адгезивная, антнлизоцимная, фосфатазная, ДНКазная и гемолитическая активность), определяя экологическую значимость данной группы бактерий.

8. Водные штаммы УПЭ обладают генетическими маркерами патогенно-сти, что свидетельствует об их потенциальной эпидемиологической опасности. Вместе с тем частота обнаружения данных детерминант была ниже (р < 0,05) по сравнению с клиническими штаммами и характеризовалась встречаемостью только двух генов (¡ilyA, sfaG) и минимальным набором генетических маркеров патогенное™.

9. Условно-патогенные энтеробактерии, выделенные из водных объектов, в отличие от клинических, среди которых не обнаружены штаммы, чувствительные ко всем протестированным АМП, характеризовались принадлежностью (по индексам антибиотикорезисгентности) к 4 кластерам (чувствительные, moho-, умеренно- и полирезистентные). Гетерогенность микробных популяций УПЭ по антпбиотикорезистентности отражает экологическое состояние микробиоценозов водных экосистем, и данный показатель может быть использован в качестве инструмента оценки при их биотестировании.

10. Содержание грамотрицательных условно-патогенных энтеробактерий в микробиоценозах водных экосистем определяет потенциальную опасность водного объекта, оказывая влияние на уровень антибиотикорезистентности штаммов. При повышении удельного веса УПЭ на 1 % имеет место увеличение содержания антибиотикорезистентных штаммов на 1,6 % (г = 0,7381; mr = ±0,131; р< 0,01). Х'У

11. Для условно-патогенных энтеробактерий, изолированных от больных ОКИ и водных объектов, характерен выраженный адаптационный потенциал, реализуемый путем перестройки их ферментативной активности и формирования биопленочных сообществ, определяя тем самым способность выживания бактерий как в организме хозяев, так и в окружающей внешней среде.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В отношении условно-патогенных эптеробактерий, выделяемых при острых кишечных инфекциях:

1. Для выявления смены таксономического и количественного состава условно-патогенных этиологических агентов острых кишечных инфекций и оценки их патогенно сти следует проводить анализ доминирования представителей данной группы с определением важнейших факторов патогенности.

2. Для подтверждения этиопатогенстической значимости УПЭ, выделяемых при острых кишечных инфекциях, рекомендуется определение генов «островов» патогенности (МуВ, ЫуА, х/аЛ, я/аС.^тА, /гр-2).

3. Проводить мониторинг антибиотикоустойчивости УПЭ, что позволит создать паспорт резистентности возбудителей ОКИ для построения формуляра АМП и определения политики их применения.

Для расширения возможностей, повышения информативности биотестирования циркуляции УПЭ в водных экосистемах и выявления их потенциальной опасности целесообразен комплексный подход, отражающий следующие аспекты:

1. Оценка структуры микробиоценоза водных экосистем (доля условно-патогенных микроорганизмов); таксономическая характеристика условно-патогенной составляющей микробиоценоза, структурированность степени доминирования различных представителей УПЭ и их оценка с использованием различных дополнительных показателей (видового разнообразия, индекс анти-биотикорезистентности).

2. Оценка уровня распространенности и выраженности биологической активности и персистентного потенциала УПЭ с анализом их популяционного биопрофиля.

3. Выявление генетических детерминант патогенности, ответственных за адгезивную, инвазивную активность и другие свойства, для определения потенциальной опасности УПЭ водных микробиоценозов.

4. Определение гетерогенности микробных популяций по показателю анти-биотикорезистентности с позиции кластерной структурированности и оценка на ее основе состояния микробиоценозов водных экосистем.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Видовое разнообразие и антибиотикорезистентность микробных сообществ водных экосистем / JT.M. Мамонтова, A.B. Марков, Е.В. Анганова и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2001. - № 4 (18). - С. 64-69.

2. Принципы организации микробиологического мониторинга / Л.М. Мамонтова, A.M. Кондратьева, A.B. Марков, Е.В. Анганова и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2001. - № 4 (18). - С. 50-55.

3. Мамонтова Л.М. Биологическая характеристика энгеробактерий, выделенных от больных в гг. Иркутск, Ангарск, Якутск / Л.М. Мамонтова, Е.В. Анганова // Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточном регионе: Матер. Рос. науч.-практ. конф. - Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 2002.-С. 178-180.

4. Мамонтова Л.М. Биологические свойства энтеробактерий, выделенных от больных, проживающих в гг. Иркутск, Ангарск, Якутск / Л.М. Мамонтова, Е.В. Анганова, E.H. Рычкова // Сибирь - Восток. - 2002. - № 4 (52). -С. 15-17.

5. Сравнительная характеристика биологических свойств Shigella flexneri, выделенных от больных из городов Якутска и Красноярска / Н.Г. Иванова, Н.В. Зуенок, Е.В. Анганова, A.B. Марков и др.// Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе: Матер. Рос. науч.-практ. конф. - Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 2002. - С. 172-175.

6. Антибиотикорезистентность микроорганизмов, выделенных от госпитализированных больных на различных территориях / Е.В. Анганова, Л.М. Мамонтова, Н.Г. Иванова, В.И. Иларова и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН: Матер, науч.-практ. конф. «Здоровье населения Иркутской области: проблемы и пути решения». - 2003. - № 3. - С. 105-110.

7. Характеристика микробиоценозов окружающей среды и человека на различных территориях / Е.В. Анганова, Л.М. Мамонтова, Н.В. Зуенок, В.И. Иларова и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН: Матер, науч.-практ. конф. «Здоровье населения Иркутской области: проблемы и пути решения». - 2003. - № 3. -С. 110-113.

8. Анганова Е.В. Фенотипический профиль возбудителей бактериальных кишечных инфекций установленной этиологии у детей в гг. Иркутск, Ангарск, Якутск / Е.В. Анганова, Л.М. Мамонтова // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. -2004. - № 1, Т. 3. - С. 72-75.

9. Анганова Е.В. Фенотипы лекарственной устойчивости возбудителей ОКИ-УЭ у детей в г. Иркутску / Е.В. Анганова, Л.М.Мамонтова, Н.И. Громадзинская // Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование: Матер. Межрегион, науч.-практ. конф. - Иркутск. ИГУ, 2004. - С. 67-69.

10. Антибиотикорезистентность микроорганизмов, выделенных от больных на различных территориях / Л.М. Мамонтова, Е.Д. Савилов, В.А. Астафьев, 40

E.B. Анганова и др. // Актуальные вопросы клинической медицины: Матер. XII науч.-нракт. конф. - 2004. - С. 202-204.

11. Обеспечение эпидемической безопасности питьевого водоснабжения населения России / А.Е. Недачин, Т.З. Артемова, P.A. Дмитриева, Т.В. Доскина, J1.B. Иванова, Е.Д. Савилов, JI.M. Мамонтова, Е.В. Анганова // Современные проблемы медицины окружающей среды: Матер. Пленума науч. совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздрава и соцразвития РФ.-М., 2004. - С. 29-33.

12. Анганова Е.В. Заболеваемость острыми кишечными инфекциями н биологические свойства их возбудителей на различных территориях Восточно-Сибирского региона / Е.В. Анганова, Е.Д. Савилов, JI.M. Мамонтова // Бгол. ВСНЦ СО PAMII. - 2005. - № 8 (46). - С. 168-172.

13. Клинико-эпидемиологнческис особенности острых кишечных инфекций установленной этиологии у детей в г. Усть-Илимск / Е.В. Анганова, JI.M. Мамонтова, Т.В. Сухова, Т.В. Гвоздик // Сибирь - Восток. - 2005. - № 7. -С. 14-16.

14. Проблемы эпидемической безопасности питьевого водопользования населения России / А.Е. Недачин, Т.З. Артемова, P.A. Дмитриева,..., Е.В. Анганова // Гигиена и санитария. - 2005. - № 6. - С. 14-18.

15. Анганова Е.В. Оценка качества реки Лена по сапитарно-бактериологичсским показателям / Е.В. Анганова, А.П. Протодьяконов // Бюл. ВСНЦ СО РАМИ. - 2006. - № 6 (52). - С. 129-131.

16. Основы эпидемической безопасности питьевого водопользования населения России / А.Е. Недачин, Т.З. Артемова, ..., Е.В. Савилов, Е.В. Анганова // Экология человека, гигиена и медицина окружающей среды на рубеже веков: состояние и перспективы развития: Матер. Всерос. науч. конф. - М., 2006. -С. 107-127.

17. Оценка антибиотикоустойчивости возбудителей кишечных инфекций на различных территориях Восточно-Сибирского региона / Е.В. Анганова, E.H. Рычкова, H.A. Абель, JI.B. Парышева // Сибирь - Восток. - 2006. - № 10. -С. 12-14.

18. Оценка влияния биологического загрязнения водоемов на инфекционную заболеваемость / В.А. Астафьев, Л.М. Мамонтова, Е.В. Анганова, A.B. Духанина и др. // Оценка эколого-экономической ситуации загрязнения водных экосистем в бассейне оз. Байкал и управление экологическим риском: Матер, науч.-практ. конф. - Иркутск: ИГТУ, 2006. - С. 5-8.

19. Эколого-эпидемиологическая оценка качества вод реки Лены / Е.Д. Савилов, Ю. А. Долженко, А.П. Протодьяконов,..., Е.В. Анганова и др. - Новосибирск: Наука, 2006,- 136 с.

20. Эпидемиологический анализ биологического загрязнения водоемов Сибири и Севера / М.Ф. Савченков, Е.Д. Савилов, Л.М. Мамонтова, В.А. Астафьев, A.B. Духанина, Е.В. Анганова // Проблемы инфекционной патологии в регионах

Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: Матер. III Рос. науч. конф. с междунар. участием. - Новосибирск, 2006. - С. 28-29.

21. Анганова Е.В. Антибиотикорезистентность бактерий микробиоценоза реки Лены / Е.В. Анганова, Л.М. Мамонтова, А.П. Протодьяконов// Тез. IX съезда ВН'ПОЭМП. - М„ 2007. - Т. 2. - С. 204.

22. Анганова Е.В. Характеристика микробного сообщества реки Лены / Е.В. Анганова, Е.В. Рычкова // Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ: Матер. 2-го Байкальского микробиологического симпозиума с междунар. участием. - Иркутск: Изд-во ин-та географии им. В.Б. Сочавы СО РАМН. - 2007. - С. 9.

23. Анганова Е.В. Особенности антибиотикоустойчивости бактерий микробиоценоза реки Вилюй / Е.В. Анганова, E.H. Рычкова, Е.Д. Савилов // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2007. - № 2 (54). - С. 72-74.

24. Особенности микробиологического мониторинга водных экосистем / Е.В. Анганова, В.А. Астафьев, Л.М. Мамонтова, Е.Д. Савилов // Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ: Матер. 2-го Байкальского микробиологического симпозиума с междунар. участием. - Иркутск: Изд-во ин-та географии им. В.Б. Сочавы СО РАМН. - 2007. - С. 7.

25. Савилов Е.Д. Эпидемиологический анализ биологического загрязнения водоемов Сибири и Севера / Е.Д. Савилов, Е.В. Анганова, Л.М. Мамонтова // Актуальные вопросы частной эпидемиологии: Тез. IX съезда ВНПОЭМП. - М.,

2007.-T. 1.-С. 194-195.

26. Анганова Е.В. Клинико-эпидемиологическая характеристика острых кишечных инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами / Е.В. Анганова, Е.Д. Савилов // Вестник Рос. воен.-мед. академии: Материалы Всерос. науч. конф., Санкт-Петербург, 17-18 апр. 2008 г. - С. 528-529.

27. Антибиотикорезистентность бактерий микробиоценозов водных объектов как показатель аптропотехногенной нагрузки на водоем (на примере реки Лены) / Е.В. Анганова, А.Д. Курносов, И.Ю. Самойлова, Е.Д. Савилов // Сиб. мед. жури. - 2008. - № 1. - С. 75-77.

28. Биологическое загрязнение поверхностных водоемов Восточной Сибири и Севера / Е.Д. Савилов, Е.В. Анганова, М.Ф. Савченков, В.А. Астафьев и др. // Гигиена и санитария. - 2008. - № 3. - С. 16-18.

29. Техногенное загрязнение окружающей среды и инфекционная патология (клинико-эпидемиологические обобщения): пособие для врачей / Е.Д. Савилов, C.B. Ильина, Е.В. Анганова и др. - Иркутск: РИО ИГУУВа,

2008.-28 с.

30. Условно-патогенные микроорганизмы в водных экосистемах Восточной Сибири и их роль в оценке качества вод / Е.Д. Савилов, Л.М. Мамонтова, Е.В. Анганова, В.А. Астафьев // Бюл. СО РАМН. - 2008. - № 1 (129). -С. 47-51.

31. Анганова E.B. Острые кишечные инфекции у детей па фоне выделения условно-патогенных микроорганизмов / Е.В. Анганова // Казанский мед. жури. - 2009. - Т. 90. - № 1. - С. 111-112.

32. Анганова Е.В. Микробиологический мониторинг водных экосистем / Е.В. Анганова, Е.Д. Савилов // Методологические проблемы изучения, оценки и регламентирования биологических факторов в гигиене окружающей среды: Сб. материалов Пленума науч. совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ. - М., 2009. - С. 38-39.

33. Анганова Е.В. Антибиотикоустойчнвость бактерий микробиоце-поза реки Лены в районе г. Якутска, Хангалассокго и Намского районов (республика Саха (Якутия) / Е.В. Анганова, И.Ю. Самойлова // Сиб. мед. журн. - 2009. - № 7, Ч. 2. - С. 211-212.

34. Духанина A.B. Особенности микробиологического пейзажа некоторых биотопов у больных острыми кишечными инфекциями установленной этиологии / A.B. Духанина, Е.В. Анганова // Сиб. мед. журн. - 2009. - № 7, 4.2.-С. 209-210.

35. Микробиологический мониторинг водных экосистем: пособие для врачей / Е.Д. Савилов, Е.В. Анганова, Е.В. Кичигина, В.А. Астафьев и др. - Иркутск: РИО ИГИУВа, 2009. - 28 с.

36. Самойлова И.Ю. Таксономическая характеристика микробиоценоза реки Лены в районе г. Якугска, Хангаласского и Намского районов (республика Саха (Якутия) / И.Ю. Самойлова, Е.В. Анганова, Е.Д. Савилов // Сиб. мед. журн. - 2009. - № 7, Ч. 2. - С. 192-194.

37. Условно-патогенные микроорганизмы в микробном сообществе реки Лены / Е.В. Анганова, Е.Д. Савилов, A.B. Духанина,Н.В. Ермолаева//Экология: Матер. I Междунар. науч.-нракт. конф. «Экология. Здоровье. Спорт». - Чита, 2009.-С. 286-289.

38. Адаптационный потенциал бактерий рода Shigella к разным условиям культивирования / Л.А. Беловежец, Ю.А. Маркова, Е.В. Анганова, A.B. Духанина и др. // Ж. инфекционной патологии. - 2010. - Т. 17, № 4. - С. 29-30.

39. Анганова Е.В. Биологические свойства условно-патогенных бактерий водных экосистем / Е.В. Анганова // Гигиена и санитария. - 2010. -№ 5. - С. 67-68.

40. Анганова Е.В. Клинико-эпидемиологические особенности острых кишечных инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у детей г. Иркутска / Е.В. Анганова // Якутский мед. журн. - 2010. -№ 1 (29). - С. 66-68.

41. Анганова Е.В. Эшерихиозы в Иркутской области / Е.В. Анганова, Л.А. Распопина // Ж. инфекционной патологии. - 2010. - Т. 17, № 4. -С. 27-28.

42. Антибиотикоустойчнвость микроорганизмов озера Байкал как индикатор антропогенного влияния / Е.В. Верхозина, В.А. Верхозина, Е.Д. Савилов,

E.B. Анганова // Проблемы экологии: Тез. Междунар. науч. конф. - Иркутск: ИГУ, НИИ биологии, 2010. -С. 391.

43. Антилизоцимиая активность бактерий водных экосистем / Е.В. Анганова, A.B. Духанина, Н.В. Ермолаева, H.H. Чемезова // Сиб. мед. журн. -2010.-№6.-С. 193-194.

44. Изменение активности экзоферментов бактерий рода Enterobacter в зависимости от источника выделения и условий культивирования / Ю. А. Маркова, Л.А. Бсловежец, Е.В. Анганова, A.B. Духанина и др. / Проблемы экологии: Тез. Междунар. науч. конф. - Иркутск: ИГУ, НИИ биологии, 2010. - С. 353.

45. Клинико-эпидемиологические особенности острых кишечных инфекций у детей Иркутской области / Е.В. Анганова, A.B. Духанина, Н.В. Ермолаева, H.H. Чемезова // Ж. инфекционной патологии: Матер, науч.конф. с междунар. участием «Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней». - Иркутск: ИГМУ, 2010. - Т. 17, № 3. - С. 18-19.

46. Проявление инфекционной патологии в условиях техногенного загрязнения окружающей среды: учебное пособие для системы послевузовского профессионального образования врачей, утв. УМО по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России / Е.Д. Савилов, Е.В. Анганова, C.B. Ильина,

B. А. Астафьев и др. - Иркутск: РИО ГИУВа, 2010. - 52 с.

47. Савилов Е.Д. Микробиологический мониторинг водных экосистем / Е.Д. Савилов, Е.В. Анганова // Гигиена и санитария. - 2010. - № 5. -

C. 56-58.

48. Савилов Е.Д. Биологические свойства возбудителей острых кишечных инфекций / Е.Д. Савилов, C.B. Ильина, Е.В. Анганова// Инфекционная патология в условиях техногенного загрязнения окружающей среды: клинико-эпид. исследования. - Новосибирск: Наука, 2010. - С. 121-127.

49. Сборник стандартных операционных процедур при серологической диагностике кишечных инфекций: пособие для врачей / С.А. Верещагина, Т.С. Белохвостикова, М.В. Пешкова, И.Д. Митрохович, Е.В. Анганова и др. - Иркутск: РИО ИГИУВа, 2010. - 24 с.

50. Ферментативная активность бактерий водных экосистем / Е.В. Анганова, A.B. Духанина, H.H. Чемезова, Н.В. Ермолаева / Проблемы экологии: Тез. Междунар. науч. конф. - Иркутск: ИГУ, НИИ биологии, 2010. - С. 373.

51. Характеристика условно-патогенных возбудителей острых кишечных инфекций / Е.В. Анганова, H.H. Чемезова, Н.В. Ермолаева, J1.A. Распопина // Ж. инфекционной патологии. - 2010. -Т. 17, № 1-2. - С. 12-13.

52. Анганова Е.В. Оценка эпидемиологической ситуации по острым кишечным инфекциям в Иркутской области / Е.В. Анганова // Бюл. «Здоровье населения и среда обитания». - 2011. - № 8. - С. 19-22.

53. Анганова Е.В. Анализ заболеваемости острыми кишечными инфекциями населения Иркутской области / Е.В. Анганова, A.B. Духанина, ЕЛ. Кичигииа // Сиб. мед. жури. - 2011. - № 6. - С. 230-232.

54. Анганова Е.В. Бактерии рода Klebsiella в этиологической структуре бактериальных ОКИ, оценка их патогенности на уровне фено- и генотипа / Е.В. Апганова, А.В. Духанина, Е.Д. Савилов // Эпидемиологии и вакципо-профилактика. - 2011. - № 6 (61). - С. 62-65.

55. Анганова Е.В. Характеристика микробного сообщества реки Ангары (Иркутская область) / Е.В. Анганова, А.В. Духанина, Е.Д. Савилов // Проблемы здоровья и экологии. - 2011. - № 2 (28). - С. 129-132.

56. Выявление антибиотикоустойчивых микроорганизмов в экстремальных местообитаниях экосистемы оз. Байкал / Е.В. Верхозина, В.А. Верхозина, Е.Д. Савилов, Е.В. Анганова // Матер. Междунар. конф. «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний». - Улан-Удэ (Россия) - Улан-Батор (Монголия), 2011. - С. 46-47.

57. Эколого-эпидсмиологическая оценка биологического загрязнения водных экосистем Сибири / Е.Д. Савилов, В.А. Астафьев, М.Ф. Савченков, Е.В. Анганова // Матер. Всерос. науч-практ. конф. с междунар. участием «Окружающая среда и здоровье населения». - Иркутск: НЦРВХ СО РАМН. -2011. -С. 71-77.

58. Эпидемиологические особенности острых кишечных инфекций, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами (база данных): per. номер 2011620192 (11.03.2011) / Е.В. Анганова, А.В. Духанина, Н.В. Ермолаева // ОБПБТ. - 2011. - № 2 (75). - С. 684.

59. Анганова Е.В. Некоторые особенности микробиологического мониторинга водных экосистем (на примере реки Лены) / Е.В Анганова // Бюл. «Здоровье населения и среда обитания». - 2012. - № 2. - С. 18-20.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

АМП

АЛА

ГА

ИАР

ИЭС

КОЕ

ОКИ

ОКИУЭ

оп

ПА

УПМ

УПЭ

- антимикробные препараты

- антилизоцимная активность

- гемолитическая активность

- индекс антибиотикорезистентности

- индекс эпидемиологической ситуации

- колониеобразующие единицы

- острые кишечные инфекции

- острые кишечные инфекции установленной этиологии

- оптическая плотность

- протеолитическая активность

- условно-патогенные микроорганизмы

- условно-патогенные энтеробактерии

Подписано в печать 28.12.2012. Бумага офсетная. Формат 60х84'/16. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 2,0 Тираж 100 экз. Заказ № 025-12.

РИОНЦРВХ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmail.com)

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Анганова, Елена Витальевна

Список сокращений

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1. Условно-патогенные микроорганизмы и их патогенный потенциал

1.2. Условно-патогенные энтеробактерии в инфекционной патологии человека, в т.ч. в этиологической структуре острых кишечных инфекций

1.3. Условно-патогенные энтеробактерии в микробных сообществах водных экосистем и их биологические свойства

1.4. Молекулярно-генетическая характеристика условно патогенных энтеробактерий

1.5. Антибиотикоустойчивость как одно из важнейших свойств условно-патогенных микроорганизмов

1.6. Адаптационный потенциал условно-патогенных энтеробактерий

ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования (эпидемиологические, микробиологические, молекулярно-генетические, статистические)

ГЛАВА 3. Эпидемиологический анализ заболеваемости острыми кишечными инфекциями, в.т.ч. вызванными условно-патогенными энтеробактериями, в Иркутской области и г. Иркутске. Спектр микроорганизмов, выделяемых при ОКИ.

ГЛАВА 4. Условно-патогенные энтеробактерии в микробных сообществах водных экосистем Восточной Сибири, доминирующие популяции, значимость в оценке трансформации микробных сообществ

ГЛАВА 5. Биологическая активность условно-патогенных энтеробактерий

5.1. Фенотипические проявления условно-патогенных представителей семейста Enterobacteriaceae, выделенных из фекалий больных острыми кишечными инфекциями

5.2. Биологическая активность УПЭ водных экосистем

ГЛАВА 6. Антибиотикорезистентность условно-патогенных микроорганизмов

6.1. Антибиотикорезистентность условно-патогенных энтеробактерий, выделенных из фекалий больных ОКИ

6.2. Антибиотикорезистентность водных изолятов условно-патогенных энтеробактерий

ГЛАВА 7. Результаты выявления у условно-патогенных энтеробактерий генетических маркеров «островов» патогенности

ГЛАВА 8. Клинико - эпидемиологические аспекты острых кишечных инфекций, сопровождающихся выделением условно-патогенных энтеробактерий

ГЛАВА 9. Адаптационный потенциал условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от больных и из водных объектов (вариабельность ферментативной активности, способность к формированию биопленок).

ГЛАВА 10. Обсуждение результатов исследований 228 ВЫВОДЫ 263 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 265 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМП - антимикробные препараты

АБП - антибактериальные препараты

АЛА - антилизоцимная активность

АИА - антиинтерфероновая активность

АКА - антикомплементарная активность

АлфА - антилактоферриновая активность

БЛРС - бета-лактамазы расширенного спектра (Extended spectrum beta-lactamases - ESBL)

ГА - гемолитическая активность

ДДМ - диско-диффузионный метод

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ИАР - индекс антибиотикорезистентности

ИЭС - индекс эпидемиологической ситуации

ИМС - инфекции мочевой системы

КА - кровяной агар

КОЕ - колониеобразующие единицы

MAP множественная антибиотикорезистентность

МИК - минимальная ингибирующая концентрация

МХА - агар Мюллера - Хинтон

НГОБ - неферментирующие бактерии

ОКИ - острые кишечные инфекции

ОКИУЭ - острые кишечные инфекции установленной этиологии

ОКИНУЭ - острые кишечные инфекции неустановленной этиологии

ОКБ - общие колиформные бактерии

ОП оптическая плотность

ПА - протеолитическая активность

ПЦР - полимеразная цепная реакция

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы

УПЭ - условно-патогенные энтеробактерии

ТКБ - термотолерантные колиформные бактерии

ЭПКП - энтеропатогенная кишечная палочка

NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standarts (Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам США)

CLSI - Institute of Clinical and Laboratory Standards (Институт клинических и лабораторных стандартов)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Условно-патогенные энтеробактерии: доминирующие популяции, биологические свойства, медико-экологическая значимость"

Актуальность проблемы. В настоящее время во всех странах мира наблюдается активизация условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) (Бондаренко В.М., 2011). Бактерии данной группы характеризуются выраженной неоднородностью, являясь, с одной стороны, представителями транзиторной нормальной микрофлоры человека, а с другой,- возбудителями инфекционных заболеваний (Марри П.Р. с соавт., 2006; Егорова С.А., 2007; Бондаренко В.М., 2011). В связи с этим, проблеме инфекций, обусловленных УПМ, особенно представителями семейства Enterobacteriaceae, уделяется пристальное внимание (Ахтариева A.A., 2010). К числу наиболее распространенных инфекционных заболеваний относятся острые кишечные инфекции (ОКИ), занимающие одно из ведущих мест в инфекционной патологии детского возраста (Воротынцева Н.В. соавт., 2001; Жеребцова Н.Ю. с соавт., 2007; Денисюк Н.Б., 2011; Хворостухина А.И., 2011; Калуцкий П.В., 2011). Доля ОКИ, вызванных условно-патогенными энтеробактериями (УПЭ), в общей структуре ОКИ установленной этиологии, по данным разных авторов, варьирует от 12,8-21,2% до 34,1% (Зуева Л.П., 2005; Жеребцова Н.Ю., 2006).

В связи с разноречивостью мнений относительно участия УПЭ в этиологии кишечных инфекций, А.Р. Мавзютов с соавт. (2001), С.А.Егорова (2008), В.М. Бондаренко (2011), JI.B. Михайлова (2011) отмечают, что для оценки этиологической значимости УПЭ при инфекционных процессах необходимо заключение об их патогенном потенциале, который недостаточно учитывается при верификации острых кишечных инфекций. Кроме того, масштабы изменения патогенности условно-патогенных энтеробактерий, являющиеся одной из причин увеличения их медицинской значимости, свидетельствуют о целесообразности изучения этого явления у данной группы бактерий, как на фенотипическом, так и на молекулярно-генетическом уровне (Мавзютов А.Р. с соавт., 2002; Фиалкина C.B., 2004; Жеребцова Н.Ю., 2006; Вершинин А.Е., 2008; Бондаренко В.М., 2011; Burgos

Y. et al., 2010). В то же время, патогенность и региональные особенности возбудителей острых кишечных инфекций, обусловленных УПЭ, до сих пор изучены недостаточно.

Одним из важнейших аспектов фенотипической характеристики условно-патогенных энтеробактерий является их резистентность к антимикробным препаратам (АМП) (Страчунский Л.С., 2002; Скала JI.3. с соавт., 2004; Бочков И.А. с соавт., 2009; Tenover F.С., 2005). При этом, как отмечает А.Е. Билев (2011), массовое распространение антибиотикорезистентных штаммов в популяциях условно-патогенных микроорганизмов стало важной проблемой клинической медицины, в связи с их более высокими адаптационными возможностями по сравнению с возбудителями классических инфекций.

На фоне информации о роли условно-патогенных микроорганизмов в инфекционной патологии человека недостаточно изученной остается проблема их циркуляции в природных, в частности, водных экосистемах. Между тем, адаптивные возможности бактерий данной группы и, соответственно, их потенциальные местообитания, экологические ниши, механизмы и формы существования в природе необычайно широки и многообразны (Бухарин О.В., 1997). Особое значение имеет изучение циркуляции бактерий данной группы в водных объектах, оказывающих существенное влияние на жизнедеятельность человеческой популяции (Мамонтова JIM. с соавт., 2000). Условно-патогенные микроорганизмы способны не только длительно обитать в субстратах внешней среды, в частности, в воде, но и накапливаться в ней. Выживанию и накоплению микроорганизмов в объектах внешней среды, в т.ч. в воде, способствуют факторы персистенции (Макаров В.Ю., 2007). Также у водных штаммов УПЭ выявлены адгезивная и гемолитическая активность, описаны ферменты ДНКаза, гиалуронидаза, некоторые протеиназы (Езепчук Ю.В., 1985; Кравченко О.С., 2009;), резистентность к антимикробным препаратам (Загайнова A.B., 2010). Усиливающееся антропогенное воздействие на водные экосистемы определяет необходимость изучения циркуляции и биологических свойств УПЭ с позиций оценки их потенциальной эпидемической опасности и влияния на экологическое состояние микробиоценозов природных водоемов. В рамках изучения биологической активности УПЭ важное значение имеет выявление их адаптационных возможностей, способствующих выживанию в различных условиях среды обитания, в частности, вариабельность ферментативного аппарата и способность к формированию биопленок. В связи с этим роли биопленок в окружающей среде и организме хозяина в последнее время уделяется особое внимание (Романова М.Ю. с соавт., 2011; СЬашЫеББ Л). е1 а1., 2006).

Исходя из вышеизложенного целью работы является: выявить доминирующие популяции, фенотипические и генотипические характеристики, адаптационный потенциал условно-патогенных энтеробактерий на моделях острых кишечных инфекций и водных экосистем для оценки их медико-экологической значимости.

Для выполнения указанной цели поставлены следующие задачи.

1. Изучить спектр условно-патогенных энтеробактерий, выделенных при острых кишечных инфекциях установленной этиологии, у детей Иркутской области.

2. Изучить циркуляцию бактерий данной группы в микробных сообществах водных экосистем на модели крупнейших водоемов Восточной Сибири, их таксономическую характеристику, выявить доминирующие и субдоминирующие популяции, видовое разнообразие.

3. Определить фенотипические характеристики условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от больных ОКИ, а также из водных объектов.

4. Определить и оценить частоту встречаемости у микроорганизмов генетических детерминант патогенности.

5. Оценить резистентность к антимикробным препаратам условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от больных ОКИ и из водных объектов.

6. Провести анализ клинических аспектов острых кишечных инфекций, обусловленных бактериями семейства Еп1егоЬас1епасеае, их сопряженность с наличием генетических детерминант патогенности микроорганизмов.

7. Изучить адаптационный потенциал клинических и водных штаммов энтеробактерий в различных условиях существования (количественная оценка ферментативной активности, способность к образованию биопленок).

Научная новизна и теоретическая значимость работы Определен таксономический спектр условно-патогенных энтеробактерий, выделяемых при ОКИ, у детей Иркутской области, его смена в многолетнем аспекте, выявлены субдоминирующие популяции, изучены патогенные свойства, дана оценка влияния факторов патогенности на клинико-эпидемиологические особенности острых кишечных инфекций.

Полученные данные о фенотипических маркерах условно-патогенных энтеробактерий вносят вклад в изучение патогенности бактерий данной группы, их участия на различных этапах инфекционного процесса.

Определены генетические маркеры УПЭ, информативные при оценке их этиологической значимости при ОКИ {ЫуА, МуВ, з/аА, я/аО, \тА, 1гр-2). Показаны различия в частоте встречаемости генов патогенности у различных видов представителей семейства Еп1егоЬас1епасеае.

Показана значимость условно-патогенных энтеробактерий, их биологической активности, персистентного потенциала, распространенности генетических маркеров патогенности среди водных изолятов для оценки экологического состояния микробиоценозов водных экосистем и потенциальной опасности водной среды

Получены данные об адаптационных возможностях УПЭ (вариабельность ферментативного аппарата УПЭ, способность к формированию биопленочных сообществ), что позволяет внести вклад в решение проблемы по изучению их адаптации к различным условиям обитания.

Практическая значимость

Определены основные виды условно-патогенных представителей семейства Еп1егоЬас1епасеае в структуре ОКИ и маркеры их патогенности, существенно важные с клинической точки зрения.

Данные, полученные при определении фенотипических и генотипических факторов патогенности бактерий указанной группы, вносят вклад в оценку их этиологической и эпидемиологической значимости.

Мониторинг антибиотикоустойчивости УПЭ позволяет создать паспорт резистентности возбудителей ОКИ для построения формуляра АМП и определения политики их применения

Разработанный способ определения гетерогенности микробных популяций по показателю антибиотикорезистентности УПЭ позволяет проводить оценку их потенциальной опасности и расширить возможности биотестирования водных экосистем.

Разработанный способ определения гетерогенности микробных популяций по показателю антибиотикорезистентности УПЭ позволяет проводить оценку их экологического состояния и расширить возможности биотестирования водных экосистем.

Данные по изучению микробиоценозов крупнейших водоемов Восточной Сибири могут быть использованы в качестве базовой информации для мониторирования водных экосистем.

Внедрения. Материалы исследований используются в практике работы Управления Федеральной службы в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Республике Саха (Якутия) для целей микробиологического мониторинга поверхностных водоемов; в практике работы Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Иркутской области для целей эпидемиологического надзора за острыми кишечными инфекциями; внедрены в учебный процесс на кафедре эпидемиологии и микробиологии ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» (акт внедрения №16 от 22.10.2011). Результаты исследований использованы при издании учебных пособий для врачей: «Микробиологический мониторинг водных экосистем» (2008); «Техногенное загрязнение окружающей среды и инфекционная патология (клинико-эпидемиологические обобщения)» (2008); «Проявление инфекционной патологии в условиях техногенного загрязнения окружающей среды» (учебное пособие для системы послевузовского профессионального образования врачей, утввержденный УМО по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России (УМО -17-28/78 от 26.02.2010), методических рекомендаций для врачей «Выявление факторов риска в эпидемиологическом анализе» (2011).

По результатам исследований получены Свидетельства Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам (РОСПАТЕНТ) о гос. регистр. БД № 2010620379 от 14.07.2010г. «Биопрофиль условно-патогенных энтеробактерий - возбудителей острых кишечных инфекций у детей»; № 2010620552 от 24.09.2010г. «Таксономическая характеристика и биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов водных экосистем»; № 2011620192 от 11.03.2011г. «Клинико-эпидемиологические особенности острых кишечных инфекций, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами»; № 2011620513 от 13.07.2011г. «Антибиотикоустойчивость аутохтонных и аллохтонных представителей микробного сообщества водных экосистем».

Положения, выносимые на защиту:

1. Основными представителями условно-патогенных энтеробактерий в структуре бактериальных ОКИ установленной этиологии являются бактерии родов Enterobacter, Proteus, Klebsiella и Citrobacter (класс субдоминант). Данные виды энтеробактерий (а также E.coli и Pantoea) присутствуют (с изменением степени доминирования) и в таксономическом спектре грамотрицательной составляющей микробиоценозов водных экосистем.

2. Условно-патогенные бактерии семейства Еп1егоЬас1епасеае характеризуются выраженной фенотипической и генотипической гетерогенностью, что необходимо учитывать при оценке их этиологической и эпидемиологической значимости.

3. Условно-патогенные энтеробактерии, выделенные от больных ОКИ, несут генетические маркеры патогенности, детерминирующие важные этапы взаимодействия возбудителя с клетками организма хозяина: адгезию, продукцию гемолизинов, размножение в тканях (ЫуА, МуВ, я/аА, я/аС, АтА, ггр-2). Наличие у клинических штаммов энтеробактерий генетических детерминант патогенности сопряжено с утяжелением клинической картины заболевания.

4. Распространенность условно-патогенных энтеробактерий, их таксономическая характеристика, степень доминирования, биологическая активность, персистентный потенциал, наличие генетических маркеров патогенности, антибиотикоустойчивость являются индикаторами степени потенциальной опасности водных микробиоценозов.

5. Условно-патогенные бактерии семейства Еп1егоЬас1епасеае (клинические и водные изоляты) характеризуются адаптационным потенциалом, отражающимся качественными и количественными проявлениями ферментативной активности, а также способностью к формированию биопленочных сообществ.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на: Российской научно-практ. конференции, посвящ. 100-летию профессора Е.В. Талалаева «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе» (Иркутск, 2002); Межрегиональной научно-практ. конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004); научно-практической конференции «Здоровье населения Иркутской области: проблемы и пути решения» (Иркутск, 2003); I межрегиональном семинаре «Организация санитарноэпидемиологического мониторинга за острыми кишечными инфекциями» (Иркутск, 2006); научно-практ. конференции «Оценка эколого-экономической ситуации загрязнения водных экосистем в бассейне оз. Байкал и управление экологическим риском» (Иркутск, 2006); научно-практ. конференции «Среда обитания человека и санитарно-эпидемиологическое благополучие населения» (Улан-Удэ, 2006, Управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по республике Бурятия); III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006); Всероссийской научно-практ. конференции «Здоровая семья - здоровый ребенок», поев. 20-летию образования Института педиатрии и репродукции человека СО РАМН (Иркутск, 2009); Всероссийском пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ (Москва, 2009, ГУ НИИ ЭЧ И ГОС им. А.Н.Сысина РАМН); научной конференции с международным участием «Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней» (к 90-летию кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Иркутского государственного медицинского университета) (Иркутск, 2010); региональной научно-практ. конференции с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Иркутск, 2010); III межрегиональном семинаре «Организация санитарно-эпидемиологического мониторинга за острыми кишечными инфекциями» (Иркутск, 2010); международной конференции «Проблемы экологии». Чтения памяти профессора М.М. Кожова (Иркутск, 2010); II Международной научно-практ. конференции «Экология, здоровье, спорт» (Чита, 2010); международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ, 2011); всероссийской научно-практ. конференции с междунар. участием «Окружающая среда и здоровье населения» (г. Иркутск, 2011); всероссийской научно-практ. конференции с между нар. участием «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе» (Москва, 2011); Пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды «Актуализированные проблемы здоровья человека и среды его обитания и пути их решения» (Москва, 2011).

Публикации

Основные положения диссертационной работы нашли отражение в 59 научных публикациях, в т. ч. в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций - 22, монографиях - 2, пособиях для врачей - 3, из них утвержденных УМО по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России - 1, методических рекомендациях для врачей -1, базах данных, получивших Свидетельства РОСПАТЕНТа - 4.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, отраженных в 7 главах, главы обсуждения полученных материалов, выводов, списка использованных источников литературы. Работа изложена на 302 страницах, иллюстрирована 112 рисунками и 25 таблицами. Список литературы содержит 398 работ, из них 285 отечественных и 113 зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Анганова, Елена Витальевна

выводы

1. Основными представителями условно-патогенных энтеробактерий в структуре бактериальных ОКИ установленной этиологии являются бактерии родов Enterobacter, Proteus, Klebsiella и Citrobacter (класс субдоминант), характеризующиеся сменой вариантного и количественного состава в многолетнем аспекте. Данные виды энтеробактерий (а также E.col и Pantoea) присутствуют (с изменением степени доминирования) и в таксономическом спектре грамотрицательной составляющей микробиоценозов водных экосистем.

2. Патогенность УПЭ, характеризующихся выраженной фенотипической неоднородностью, определяется свойствами конкретного штамма, а не видовой или родовой принадлежностью. Среди клинических штаммов УПЭ преобладают (р<0,01) изоляты, которым свойственно наличие двух (32,9±1,5%) и более (39,4±1,6%) маркеров, коррелирующих с патогенностью.

3. Клинические штаммы условно-патогенных энтеробактерий обладают фенотипическими маркерами (антилизоцимной, адгезивной, фосфатазной (40-50%), гемолитической и протеолитической (около 30%>) активностью, а также продукцией ДНКазы (26,5±1,4%), способствующими реализации их патогенного потенциала и обеспечивающими их участие на различных этапах инфекционного процесса. При этом УПЭ, выделенные от больных ОКИ, значимо чаще (р<0,01) характеризовались наличием фенотипических признаков по сравнению со штаммами контрольной группы.

4. Условно-патогенные энтеробактерии, выделенные от больных ОКИ, несут генетические маркеры патогенности (23,4±3,2%), детерминирующие важные этапы взаимодействия возбудителя с клетками организма хозяина: адгезию, продукцию гемолизинов, размножение в тканях (hlyA, hlyB, sfaA, sfaG, fimA, irp-2), свидетельствующие об их этиопатогенетической значимости. Наиболее широкий набор генетических маркеров патогенности выявлен у бактерий рода Klebsiella, доля которых в структуре ОКИ у детей в последние годы значимо возрастает.

5. В большинстве случаев генетические детерминанты патогенности обнаружены у культур, выделенных от детей до 3-х лет, у которых отмечен и самый широкий набор генетических маркеров. У детей указанной возрастной группы риска отмечается и наиболее тяжелое клиническое течение ОКИ.

6. Популяция клинических штаммов УПЭ гетерогенна по отношению к антимикробным препаратам и характеризуется значительным распространением антибиотикорезистентых штаммов (свойством полирезистентности обладают 54,9±1,2%, более трети микроорганизмов резистентны к двум-пяти препаратам, монорезистентны лишь 6,3±0,6% штаммов). Клинические штаммы энтеробактерий обладают более высоким (р<0,05) уровнем резистентности к В-лактамным антибиотикам и низким - к фторхинолонам и аминогликозидам III поколения.

Энтеробактерии, выделенные от больных ОКИ, характеризуются более высокой частотой встречаемости антибиотикорезистентных штаммов по сравнению со штаммами контрольной группы, среди которых не было выявлено полирезирезистентных штаммов и отмечено значимое (р<0,01) преобладание чувствительных (58,5±4,7%) и монорезистеных (30,2±4,4%) УПЭ.

7. Условно-патогенные энтеробактерии, выделенные из водных объектов, характеризуются значимо более редкой (по сравнению с клиническими штаммами) частотой встречаемости исследованных фенотипических признаков, среди которых преобладают штаммы с одним маркером (41,3%). Биопрофиль водных штаммов УПЭ характеризуется преобладанием персистентных свойств, способствующих их выживанию в окружающей среде. В районах антропогенного загрязнения наблюдается усиление биологической активности УПЭ (адгезивная, антилизоцимная, фосфатазная, ДНКазная и гемолитическая активность), определяя экологическую значимость данной группы бактерий.

8. Водные штаммы УПЭ обладают генетическими маркерами патогенности, что свидетельствует об их потенциальной эпидемиологической опасности. Вместе с тем, частота обнаружения данных детерминант была ниже (р<0,05) по сравнению с клиническими штаммами, и характеризовалась встречаемостью только двух генов (ЫуА, з/аС) и минимальным набором генетических маркеров патогенности.

9. Условно-патогенные энтеробактерии, выделенные из водных объектов, в отличие от клинических, среди которых не обнаружены штаммы, чувствительные ко всем протестированным АМП, характеризовались принадлежностью (по индексам антибиотикорезистентности) к четырем кластерам (чувствительные, моно-, умеренно- и полирезистентные). Гетерогенность микробных популяций УПЭ по антибиотикорезистентности отражает экологическое состояние микробиоценозов водных экосистем и данный показатель может быть использован в качестве инструмента оценки при их биотестировании.

10. Содержание грамотрицательных условно-патогенных энтеробактерий в микробиоценозах водных экосистем определяет потенциальную опасность водного объекта, оказывая влияние на уровень антибиотикорезистентности штаммов. При повышении удельного веса УПЭ на 1% имеет место увеличение содержания антибиотикорезистентных штаммов на 1,6% (гх>у= 0,7381; тг = ±0,131; р<0,01).

11. Для условно-патогенных энтеробактерий, изолированных от больных ОКИ и водных объектов, характерен выраженный адаптационный потенциал, реализуемый путем перестройки их ферментативной активности и формирования биопленочных сообществ, определяя тем самым способность выживания бактерий как в организме хозяев, так и в окружающей внешней среде.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В отношении условно-патогенных энтеробактерий, выделяемых при острых кишечных инфекциях:

- Для выявления смены таксономического и количественного состава условно-патогенных этиологических агентов острых кишечных инфекций и оценки их патогенности следует проводить анализ доминирования представителей данной группы с определением важнейших факторов патогенности.

Для подтверждения этиопатогенетической значимости УПЭ, выделяемых при острых кишечных инфекциях, рекомендуется определение генов «островов» патогенности (ЫуВ, ЫуА, я/аА, з/аС, /гтА, ¡.гр-2).

- Проводить мониторинг антибиотикоустойчивости УПЭ, что позволит создать паспорт резистентности возбудителей ОКИ для построения формуляра АМП и определения политики их применения.

Для расширения возможностей, повышения информативности биотестирования циркуляции УПЭ в водных экосистемах и выявления их потенциальной опасности целесообразен комплексный подход, отражающий следующие аспекты:

- Оценка структуры микробиоценоза водных экосистем (доля условно-патогенных микроорганизмов); таксономическая характеристика условно-патогенной составляющей микробиоценоза, структурированность степени доминирования различных представителей УПЭ и их оценка с использованием различных дополнительных показателей (видового разнообразия, индекс антибиотикорезистентности);

- Оценка уровня распространенности и выраженности биологической активности и персистентного потенциала УПЭ с анализом их популяционного биопрофиля;

- Выявление генетических детерминант патогенности, ответственных за адгезивную, инвазивную активность и другие свойства, для определения потенциальной опасности УПЭ водных микробиоценозов;

- Определение гетерогенности микробных популяций по показателю антибиотикорезистентности с позиции кластерной структурированности и оценка на ее основе состояния микробиоценозов водных экосистем.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Анганова, Елена Витальевна, Иркутск

1. Абаев Ю.К. Проблема инфекции в педиатрии / Ю.К. Абаев // Медицинские новости. 2007. - №4. - С. 8-17.

2. Агаева P.A. Некоторые эпидемические данные об острых кишечных заболеваниях, сопровождающихся выделением бактерий рода Proteus / P.A. Агаева//Журн. микробиол.-1978.-№5,- С. 146-147.

3. Андреев В.А. Сравнительная оценка питательных сред Мюллер-Хинтон и АГВ / В.А. Андреев, A.M. Иванов /Тезисы IX съезда Всерос. научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 2627 апреля 2007г.-М., 2007.-Т.З.-С.6-7.

4. Амшарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях /И.П. Амшарин, A.A. Воробьев,-1962.- 180с.

5. Астафьев В.А. Заболеваемость острыми кишечными инфекциями и биологическое загрязнение окружающей среды в Сибири : Автореф. дисс. докт. мед. наук. 14.00.30- эпидемиология,- НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН,-Иркутск,- 2007. 38с.

6. Баканов А.И. Количественная оценка доминирования в экологических сообществах / А. И. Баканов // ИБВВ АН СССР.- 1987,- 63 с. Деп. в ВИНИТИ. 08.12.1987, № 8593-В87.

7. Байковская Ю.В. Острые кишечные инфекции у детей в г. Томске //Ю.В. Байковская, С.Ю. Попадейкина, С.Я.Шишикина// Журнал инфектологии.-201 l.-T.3.-№ З.-С. 29.

8. Белобородова Н.В. Клиническое значение микробных биопленок /2011/ http://www.internist.ru / 25.12.2011/

9. Белова Е. Лечение острых кишечных инфекций: к детям нужен особый подход/ Фармацевтический вестник //http://medicina-online.ru/articles /2007/ 48047/2.03.2010/

10. Беляев Е.И. Пути усовершенствования препаратов, нормализующих микрофлору кишечника / Е.И. Беляев // Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция.- Горький.-1988.- С.74-79.

11. Березин А.Г. Характеристика и клиническое значение бета-лактамаз расширенного спектра / А.Г. Березин, Ромашов О.М., Яковлев С.В., Сидоренко С.В. // Антибиотики и химиотерапия.- 2003.- Т.48.-№7.

12. Бернасовская Е.П. Острые кишечные инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами / Е.П. Бернасовская, В.Н. Бычковский, С.И. Бидненко. К.: Здоровье.- 1984,- 152с.

13. Бешлиев Д.А. Диагностика и лечение острого пиелонефрита / Д.А. Бешлиев, J1.A. Ходырева// Журн. Трудный пациент,- 2007.- №12-13.-С.5-9.

14. Биоценоз-сберегающая терапия кишечных инфекций у детей / А.А. Новокшонов, В.Ф. Учайкин, Н.В. Соколова, О.Н. Тихонова и др. //http://www.medgate.ru/article/2008/116358/ 15.03. 2010/

15. Билалов Ф.С. Особенности некоторых биологических свойств штаммов Escherichia coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями: Дисс. . канд. биол. наук.- 03.00.07- микробиология.-Челябинск, 2007.- 113 с.

16. Богданов М.Б., Черненькая Т.В. Алгоритмы и организация антибиотикотерапии / М.Б. Богданов, Т.В. Черненькая // Руководство для врачей.- М.: Издательский дом Видар-М, 2004.- 219с.

17. Боковой А.Г. Роль условно-патогенных микроорганизмов в этиологии острых кишечных инфекций и проблема дизбактериоза кишечника у детей: Дисс. . д-ра мед. наук.- Москва, 1991.- 255 с.

18. Бондаренко В.М. Антилизоцимная активность как генетически контролируемый фактор патогенности энтеробактерий / В.М. Бондаренко,

19. A.JI. Яблочков // в Сб.: Персистенция микроорганизмов,- Куйбышев.-1987.-С. 85-89.

20. Бондаренко В.М. Гемолизины энтеробактерий и их связь с вирулентностью возбудителя / В.М. Бондаренко, A.B. Голубев // Журн. микробиол., эпидемиологии, иммунологии.-1988.-№11.-С.102-109.

21. Бондаренко В.М. Проблема патогенности клебсиелл / В.М. Бондаренко,

22. B.Г.Петровская, Н.И.Нестерова. Ульяновск, 1996.-132с.

23. Бондаренко В.М. Адгезивная активность клинических штаммов клебсиелл/ В.М. Бондаренко, Wu Gang, М.М. Barcus // Журн. Микробиол. эпидемиологии, иммунологии.-1996. -№2.-С.104.-109.

24. Бондаренко В.М. Современные представления о молекулярно-биологических основах патогенеза шигеллезов / В.М. Бондаренко, М.З. Шахмарданов // Журн. микробиол., эпидемиологии, иммунологии.-1998.-№6.-С. 88-92.

25. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса / В.М. Бондаренко // Журн. микробиол., эпидемиологии, иммуноллогии.-1999.-№5.-С. 34-39.

26. Бондаренко В.М., Аганова О.В., Виноградов H.A. Роль бактериальной протеазы, деградирующий секреторный иммуноглобулин А, В персистенции клебсиелл // Журн. микробиол., эпидемиологии, иммунологии -2000.-№4. -Приложение С. 12-16.

27. Бондаренко В.М. «Острова» патогенности бактерий / В.М. Бондаренко // Журн. микробиол.-2001.-№4.-С.67-74.

28. Бондаренко В.М. Секретируемые факторы патогенности энтеробактерий / В.М. Бондаренко, А.Р. Мавзютов, Е.Golkocheva// Журн. Микробиол,- 2002, №1-С.84-90.

29. Бондаренко В.М. Клебсиеллы и клебсиеллезы /В.М. Бондаренко, С.В. Фиалкина, О.В. Агапова.- Тверь: Изд-во «Триада».- 2008. — 160 с.

30. Бондаренко В.М. Механизмы формирования патогенности оппортунистическими микроорганизмами / В.М. Бондаренко // Инфекционные болезни.- Матер. II Ежегодного Всерос. Конгресса по инфекционным болезням,- 2010.-т.8.-Прилож.№1.-С.42-43.

31. Бондаренко, В. М. Генетические маркеры вирулентности условно патогенных бактерий / В. М. Бондаренко // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2011-1.-N3.-C. 94-99.

32. Бондаренко В.М. Роль условно-патогенных бактерий при хронических воспалительных процессах различной локализации / В.М. Бондаренко.-Тверь: Изд-во «Триада».-2011-2.-88с.

33. Боковой А.Г. Роль условно-патогенных микроорганизмов в этиологии острых кишечных инфекций и проблема дизбактериоза кишечника у детей: Дисс. . д-ра мед. наук.- Москва, 1991.- 255 с.

34. Бочков И.А. Условно патогенные микроорганизмы, выделяемые у амбулаторных пациентов урологического профиля / И.А. Бочков, С.С. Саргсян // Материалы VIII съезда Всерос. об-ва эпидемиологов, микробиологов, паразитологов.-М,- 2002.- Т.З.- С. 138-139.

35. Бочков И.А. Влияние лечебных бактериофагов на условно-патогенную и симбиотическую микрофлору толстой кишки / И. А. Бочков, Э.С. Лавренева, Л.П. Юрков // Эпидемиология и инфекционные болезни,- 2009,-№2-С. 48-51.

36. Брилис В.И. Адгезивные свойства лактобацилл: Автореф.дис. канд. мед наук. М,-1983.-20с.

37. Брилис В.И., Брилене ТА., Ленцнер Х.П. Способ определения адгезивных свойств бактерий. А.с. 1076441 СССР, МКИ С12К1/00 #3421146/28-13. Заявл. 22.02.82; Опубл. 28.02.84.

38. Брода П. Плазмиды (перевод с англ.) / П. Брода. М,- 1982,- 224с.

39. Бухарин О.В. Антилизоцимный тест как маркер персистенции микроорганизмов / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов // Теоретическая и прикладная иммунология: Тез. докл. 1 всесоюзн. конф. -М., 1982. С.58-34.

40. Бухарин O.B. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов /О.В. Бухарин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии,- 1984,- N 2,- С. 27-28.

41. Бухарин О.В. Персистенция бактерий / О.В. Бухарин,- Актовая речь. Оренбург,-1992,- 32с.

42. Бухарин О.В., Литвин В.Ю. Патогенные бактерии в природных экосистемах. Екатеринбург: УрО РАН.-1997.-277 с.

43. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий / О.В. Бухарин М,-Екатеринбург.-УрО РАН,- 1999.-368с.

44. Бухарин О.В. Значение персистенции бактериальных патогенов для клинической практики / О.В. Бухарин // Российские медицинские вести.-2000.-№3.-С. 18-26.

45. Бухарин О.В. Проблемы персистенции патогенов в инфектологии / О.В. Бухарин //Журн.микробиол. 2006. №4. - С.4 - 8.

46. Бушуева E.H. Факторы вирулентности условно-патогенной микрофлоры при урогенитальных инфекциях /E.H. Бушуева// Раздел: Материалы УШсъезда Всерос. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.- М., 2002.-Т. 1.- С. 146.

47. Васильев Б.Я. Острые кишечные заболевания. Ротавирусы и ротавирусная инфекция / Б.Я. Васильев, Р.И.Васильева, Ю.В,Лобзин.- Серия «Мир медицины».-СПб: Изд-во «Лань»-2000.-272 с.

48. Вершинин А.Е. Видовой состав микрофлоры и перспективы вакцинотерапии при хроническом простатите / А.Е. Вершинин : Автореф. дисс. канд.мед.наук, 03.00.07- микробиология, Москва, 2008.-21с.

49. Виноградова Л.А. Изучение биологического загрязнения воды в условиях антропогенной нагрузки /Л.А. Виноградова // Гигиенические аспекты изучения биологического загрязнения объектов окружающей среды: Мат. X Всесоюз. конф,- М:,1988.-С. 55-56.

50. Воробьев А.А. Возможности лабораторной диагностики инфекций, вызванных бактериями рода Campylobacter / А.А.Воробьев, Л.А.Сичинский, С.А. Дратвин // Журн. микробиологии, эпидемиологии, иммунологии.-2000. -№1.-С. 95-103.

51. Воротынцева Н.В. Острые кишечные инфекции у детей / Н.В. Воротынцева, Л.Н. Мазанкова. М.: Медицина, 2001.- 480 с.

52. Владимиров Ю. А. Зачем нужна белковая кристаллография/ Ю.А. Владимиров//Журн.Природа.-2003.http://vivovoco.rsl.rU/VV/JOURNAL/NATURE/l 103/PROT.HTM /9.03.2010/

53. Влияние Протокола по антимикробной терапии на частоту и прогноз нозокомиальной пневмонии у больных с тяжелой травмой / Д.Н. Проценко, А.И. Ярощецкий, С.В. Яковлев, Б.Р. Гельфанд и др. // Инфекции и антимикробная терапия,- 2005.-т.7.-№2.

54. Гебеш В.В. Современные эффективные методы в лечении больных острыми кишечными инфекциями / В.В. Гебеш // Кишечные инфекции.-1991.- Вып.22.- С. 46-50.

55. Гемолитическая активность бактерий рода Enterobacter / А.А. Ахтариева, Т.А. Савченко, Р.З. Саляхов, А.А. Камалова// Журн. Успехи современного естествознания.-2003.-№8.- С. 72.

56. Генетические маркеры патогенности условно-патогенных энтеробактерий, выделенных у детей и подростков при острых кишечных инфекциях / Н.Ю. Жеребцова, А.Х.Баймиев,Д.А. Валишин, А.Р. Мавзютов // Журн. эпидем.,микробиологии и иммунобиол.-2007.-№2.-С.З-8.

57. Гизантулина С.С. Условно-патогенные энтеробактерии при ОКИ у детей раннего возраста и совершенствование их микробиологической диагностики: Автореф. . канд. мед. наук.- М.,1989.- 20с.

58. Гинцбург А.Л. Генодиагностика инфекционных заболеваний / А.Л. Гинцбург // Журн. Микробиол,- 1998.- №3.- С. 86-95.

59. Гинцбург А.Л. Современное состояние и перспективы молекулярно-генетических методов в решении задач медицинской микробиологии / А.Л.

60. Гинцбург, H.A. Зигангирова, Ю.М. Романова // Журн. Микробиол,- 1999.-№5.- С.22-26.

61. Голошва Е.В. Персистентные характеристики энтеробактерий, выделенных в динамике экспериментального дисбактериоза / Е.В.Голошва,

62. A.В.Алещукина, Л.Н.Терновская // Материалы VIII съезда Всерос. об-ва эпидемиологов, микробиологов, паразитологов,- М.- 2002.-С. 161-162.

63. Голубев В.А. Характеристика HIy-плазмид различного происхождения и их значение для вирулентности энтеробактерий: Автореф. дисс. канд. биол. наук,- М., 1984,- 22с.

64. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц.- Пер. с англ.-М., Практика,- 1999,- 459с.

65. Грачёв М. А. Метод выделения высокоочищенной ДНК для использования в полимеразной цепной реакции / М. А. Грачёв, С. Ю. Кузнецова, Т. А. Щербакова // Молекулярная биология. 2006. - №1. - С. 180183.

66. Григорьева Л.В. Состояние разработки проблемы биологических факторов окружающей среды в УССР / Л.В. Григорьева // Гигиенические аспекты биологического загрязнения объектов окружающей среды: Мат.Х Всесоюзн. конф,- М,- 1988.- С.62-64.

67. Гриценко В.А. Влияние абиотических факторов на антилизоцимную активность и другие биологические характеристики энтиробактерий / В.А. Гриценко // В сб. : Персистенция микроорганизмов.- Куйбышев.-1987,- С.110-116.

68. Громова Г.Г. Клинико-микробиологическая оценка эшерихиозной бактериурии у детей / Г.Г. Громова, A.A. Вялкова, Ю.А.Брудасов,

69. B.А.Гриценко: Материалы 1 съезда нефрологов,- 1996,- С. 267.

70. Давыдовский И.В. Учение об инфекции (биологический аспект проблемы) / И.В. Давыдовский.-М.: Медицина.-1956.- 107с.

71. Дубинина И.Г. Роль метода полимеразной цепной реакции в генодиагностике / И.Г. Дубинина, С.Н. Щербо// Новые генетические технологии,- М,- 1998,- Сб.1.- С. 20-43.

72. Дьяков С.И. Методы быстрого определения чувствительности микробов к антибиотикам / С.И. Дьяков, Н.Ю. Ильина, И.К. Лебедева // Антибиотики.-1983,- №7.-С.545-554.

73. Дьяков С.И. Современные методы и средства быстрого определения чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам и химиопрепаратам / С.И. Дьяков, И.К. Лебедева, С.В. Сидоренко // Военно-мед. журнал,- 1996.-№3.- С. 44-47.

74. Евтодиенко В.Г. Этиологический фактор при острых кишечных инфекциях: Мат. УШсъезда ЭМИП,- М.: 2002,- Т.2.- С. 169.

75. Егорова С.А. Патогенный потенциал микроорганизмов рода Klebsiella, как возбудителей острых кишечных инфекций / С.А. Егорова, Л.А. Кафтырева, М.А.Макарова // Вестник Военно-мед. Академии, Приложение 2 (22).- 2008.- С.535-536.

76. Егорова С.А. Характеристика бактерий рода Klebsiella, выделенных при дисбиозах кишечника: Автореф.дис. канд. мед. наук,- 03.00.07-микробиология. С-Петербург,- 2007. 22с.

77. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий / Ю.В. Езепчук.-М. Медицина,-1985 .-240с.

78. Ерастова Е.Н. Клебсиеллезная инфекция у онкологичечких больных. К-серовары, выдлеяемые при этом возбудителе / Е.Н. Ерастова, Б.С. Киселева, А.З. Смолянская //ЖМЭИ.- 1984,- №2.- С. 19-23.

79. Жеребцова Н.Ю. Генетические маркеры патогенности условно-патогенных энтеробактерий, выделенных у детей и подростков при острых кишечных инфекциях / Н.Ю. Жеребцова, А.Х. Маймиев, Д.А. Валишин, А.Р. Мавзютов// ЖМЭИ.- 2007,- №2,- С. 3-8.

80. Зайцева Е.А. Система анализа микробиологических и молекулярно-генетических маркеров для выявления высоковирулентных штаммов Listeria monocytogenes: Автореф. дисс.докт. мед. наук.-03.02.03.- микробиология.-НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.-Москва.-2010.-43с.

81. Захарова И.Н. Инфекции мочевой системы у детей: современные представления об этиологии / И.Н. Захарова // Журн. Нефрология и диализ.-2001.-Т.З.-№1 / http://www.nephro.ru/magazine/article/

82. Захарова Ю.В. Оптимизация принципов коррекции состояний микрофлоры толстой кишки у жителей Кемеровской области / Ю.В. Захарова, Л.А. Леванова // Журн. медицина в Кузбассе.- 2009.-№2,- С.30-35.

83. Зубков М.Н. Неферментирующие бактерии. Acinetobacter spp.: таксономия, классификация, характеристика, клиническое значение, идентификация, антибиотикорезистеность / М.Н.Зубков // Инфекции и антимикробная терапия,- 2003.-Т.5.- №2.

84. Зуев В.А. Литическая активность бактериальных вирусов / В.А. Зуев,-М.: Медицина,- 1969,- 184с.

85. Зуева Л.П. Эпидемиология / Л.П. Зуева, Р.Х. Яфаев //Учебник.-СПб: ООО «Издательство ФОЛИАНТ», 2005.-752с.

86. Зятикова Л.Е. Клинико-эпидемиологическая характеристика клебсиеллезного энтероколита у новорожденных детей / Л.Е. Зятикова, Л.А. Чурина, А.И. Шемонова // Всерос. съезд инфекционистов, 3-й,- М.-Смоленск.-1989.-С.130-132.

87. Иванова В.В. Заномерности взаимоотношений макроорганизма и возбудителей инфекционных болезней у детей / В.В. Иванова, Е.А. Корнева // Вестн. РАМН.-2000.-№ 11.- С. 7-11.

88. Инвестиции в здравоохранение: Отчет о мировом развитии.-1993.-Вашингтон, 1993 .-240с.

89. Инфекционная «агрессивность» окружающей среды: Концепция микробиологического мониторинга / JLM. Мамонтова, Е.Д. Савилов, А.П. Протодьяконов и др.- Н., Наука, 2000.-240с.

90. Информационное письмо МАКМАХ. Состояние антибиотикорезистентности грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций в отделениях интенсивной терапии,- М.-1997.- С.8.

91. Итоги и перспективы изучения проблемы острых кишечных, респираторных инфекций и гепатитов у детей / A.B. Горелов, JI.M. Милютина, А.Р. Рейзис, Д.В. Усенко и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни.-2009.-№2.- С.51-57.

92. Калина Г.П. Методический подход к изучению условно-патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды /Г.П. Калина // Гигиена и санитария,-1982,- №1,- С.40.

93. Калина Г.П. Микроэволюция антропофильных прокариот как фактор изменения активности эпидемических процессов. Микроэволюция патогенности / Г.П. Калина // ЖМЭИ.- 1991,- №5-, С.71-74.

94. Калмыкова А.И. Пробиотики: терапия и профилактика заболеваний. Укрепление здоровья /А.И. Калмыкова.- НПФ «Био Веста», СибНИПТИП СО РАСХИ - Новосибирск,- 2001. - 208с.

95. Катосова Л.К. Микрофлора мочи у детей с хроническим обструктивным пиелонефритом: Автореф. дис. канд. мед.наук.- Москва.- 1993.-23с.

96. Клинические особенности энтеробактерной инфекции у детей / В.П. Молочный, И.И. Протасеня, Л.М. Тимохина, И.В. Лущекова и др. // Дальневосточный журнал инфекционной патологии,- 2005.-N 7.-С.75-76.

97. Клинико-лабораторная характеристика сальмонеллезно-ротавирусной микст-инфекции у детей / Г.М. Филиппова, И.В. Иванов, О.Е Ефименко, Е.Ю. Котубей и др. // Журнал инфектологии.-201 l.-T.3.-№ 3.-С.99.

98. Константинова Ю.А. Применение пробиотиков в лечении вирусно-баткериальных кишечных инфекций у детей раннего возраста// Ю.А. Константинова,С.Е. Чащина, Н.А. Петрова // Журнал инфектологии. -2011.-Т.3.-№3.-С. 58.

99. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. Учебник.-СПб: «Специальная литература».-1998.- 591с.

100. Косько В.Н. Клинико-адаптационные механизмы и возможности их коррекции у детей разного возраста, больных дизентерией: Автореф. дис. д-ра мед.наук.-К., 1995.-25с.

101. Кравченко О.С. Бактерии рода Enterococcus в озере Байкал: распределение, видовой состав, механизм адаптации: Диссертация . кандидата биологических наук: 03.00.16, 03.00.07.- Бурят, гос. ун-т,- Иркутск, 2009,- 143 с.

102. Краснов В.В. Острые кишечные инфекции у детей. Современные представления / В.В. Краснов // Ремедиум Приволжье.- 2011.-№ 5/ http://www.remedium.ru/public/journal/remvolga/2011/

103. Красноголовец В.Н. Клебсиеллезные инфекции / В.Н. Красноголовец, Б.С. Кисилев -М.: Медицина,-1996,- 256 с.

104. Крылов В.Н. Роль горизонтального переноса генов бактериофагами в возникновении патогенных бактерий / В.Н.Крылов // Журн. Генетика,- 2003.-Т.39.-№5,- С.595-620.

105. Кулаев И.С. Бактериолитические ферменты микробного происхождения в биологии и медицине / И.С.Кулаев // http://www.pereplet.ru/obrazovanie/stsoros/275. html/1997^

106. Лакин Г.Ф. Биометрия /Г.Ф. Лакин,- учебное пособие для биол. спец. вузов, 4-е изд., перераб. и доп.- М.: Высшая школа, 1990.- 352 с

107. Леви М.И. Быстрый метод определения чувствительности бактериальных культур к различным антибиотикам в жидкой среде / М.И. Леви, И.А.Горожанкина, Л.А. Сагатовская // Антибиотики.- 1967.- №1- С. 5765.

108. Леви М. И Ускоренный отбор предпочтительных антибиотиков для терапии больных с гнойными осложнениями / М.И. Леви, Ю.Г. Сучков // В кн.: Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней,- С.-Петербург,- 1999,- С. 35-36. (1)

109. Леви М.И. Ускоренный отбор эффективных антибиотиков для лечения больных госпитальными инфекциями / М.И. Леви, Ю.Г. Сучков, В.Я. Прохоров, В.А. Терушкин // Дезинфекционное дело. №3. -1999.- С. 34-40.3)

110. Лобзин Ю.В. Клиника, диагностика и лечение актуальных кишечных инфекций / Ю.В. Лобзин, В.М. Волжанин, С.Н. Захаренко.- СПб.: ИКФ «Фолиант», 1999,- 122с.

111. Лопухов Л.В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике / Л. В. Лопухов, М. В. Эйделыитейн // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2004. - Т. 2. -№3. - С. 96-106.

112. Лубянова И.П. Современные представления о метаболизме железа с позиции профпатолога / И.П. Лубянова // Актуальные проблемы транспортной медицины. 2010. - №2 (20). - С. 47-57.

113. Мавзютов А.Р. Молекулярно-генетическая характеристика клинических штаммов E.coli внекишечного происхождения / А.Р. Мавзютов, В.А. Гриценко // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.-2001,- №3.- Приложение 1.- С.25-26.

114. Мавзютов А.Р. «Острова» патогенности условно-патогенных энтеробактерий / А.Р. Мавзютов, С.В.Фиалкина, В.М. Бондаренко // Журн. микробиол.-2002.- №6- С.5-9.

115. Макаров Ю.А. Микробиологическая оценка воды природных водоемов Зейско-Буреинской равнины / Ю.А. Макаров, Н.Е. Горковенко// Электронныйнаучный журнал «Исследовано в России»http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2007/123pdf.

116. Малый В.П.Общая характеристика острых кишечных инфекций / В.П. Малый// Клиническая иммунология. Аллергология. Инфектология,- 2010.-№7. с. 14-30.

117. Малышкин А.П. Антилизоцимная активность сальмонелл / А.П. Малышкин // В сб.: Факторы естественного иммунитета.- Куйбышев,- 1983.-с.81-84.

118. Мальцев С.В. Что такое биопленка? / С.В. Мальцев, Г.Ш. Мансурова,-«Практика».- 2012.- http://mfvt.ru.

119. Мамонтова JI.M. Основы микробиологического мониторинга водных экосистем и контроля питьевой воды: Автореф. дисс. докт. биол. наук.-03.00.16.-НИИ биологии при ИГУ.- Иркутск,-1998,- 40с.

120. Марри П.Р. Клиническая микробиология. Краткое руководство / П.Р. Марри, И.Р. Шей.- Пер. с анг,- М.: Мир, 2006.- 425с.

121. Маслова Э.И. Ферменты патогенности бактерий рода клебсиелла-энтеробактер /Э.И. Маслова // Кишечные инфекции в Казахстане.- Алма-Ата,-1980.-Т.21.-С.36-40.

122. Марголина Г.Л. Санитарно-микробиологическая характеристика валдайстких озер / Г.Л. Марголина, И.Н. Цедрик //Гигиенические аспекты изучения биологического загрязнения объектов окружающей среды: Мат. X Всесоюз. конф.- М:,1988.-С. 93-94.

123. Марков А.В. Условно-патогенные микроорганизмы в крупнейших водоемах Восточной Сибири и их роль в гигиенической оценке качества вод: Автореф. дисс. канд. мед. наук.- М., 2004.- 23с.

124. Мартыненко Л.М. Факторы патогености Klebsiella pneumoniae и их роль в патогенезе острой кишечной инфекции у детей первого года жизни: Дисс.докт. биол. наук. 03.00-07- микробиология.-Ростов-на-Дону- 1996.-398с.

125. Медицинская микробиология. Под ред. В.И. Покровского, O.K. Поздеева. М.: ГЭОТАР-Медицина, 1998.- 1200с.

126. Мельников Н.И. Ферменты патогенности и токсины бактерий / Н.И. Мельников, В.Н. Мельников, М.Г. Гимранов .-М.:Изд-во «Медицина».- 1969.-251с.

127. Методические рекомендации по выявлению гемолитических, адгезивных и энтеротоксигенных энтеробактерий № 28-6/7 от 23.02.87.- 13с.

128. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения, утв. зам. преде. Госкомсанэпиднадзора 22.06.1995.- М., 1995.- 7с.

129. Методические рекомендации по детекции оперона ctx AB у холерных вибрионов с помощью полимеразной цепной реакции, утв. зам. министра здравоохранения России.-Иркутск, 1998.- 10с.

130. Методический подход к оценке эпидемиологической ситуации по обобщенному критерию / Е,Д, Савилов, Г.И. Алексеева, М.В.Мальцева, В.А. Астафьев, А.Ф. Кравченко, Е.И.Бурцева // Эпидемиология и инфекционные болезни.-№ 1 .-2011.- С. 17-20.

131. Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями № 13-7-2/1759 от 11 ,10.1999г.

132. Механизмы выживания бактерий / О.В. Бухарин, А.Л. Гинцбург, Ю.М. Романова, Г.И. Эль-Регистан. М.:Медицина.-2005.-367с.

133. Митрохин С.Д. Инфекции центральной нервной системы: современный алгоритм микробиологического исследования / С.Д. Митрохин // Инфекции и антимикробная терапия.-2002,- Т.4.-С.188-189.

134. Митрохин С.Д. Значение энтеробактерий в инфекционной патологии человека / С.Д. Митрохин // Инфекции и антимикробная терапия.- 2005.- Т. 7,- №2.// http://old.consilium-medicum.com/media/infektion/0502/69.shtml/

135. Михайлова Л.В. Биология условно-патогенных микроорганизмов, вызывающих острые кишечные инфекции: Диссер.канд. мед. наук.-03.02.03-микробиология.-Волгоград. 2011.-136с.

136. Навашин С.М. Рациональная антибиотикотерапия / С.В. Навашин, И.Л. Фомина,- М.:- 1982.

137. Нарушение нормального состава кишечных бактерий: клиническое значение и вопросы терапии / Э.П. Яковенко, А.В. Яковенко, Н.А. Агафонова, А.С. Прянишникова и др. // Болезни органов пищеварения.-2008.-N 2.-С.41-46.

138. Некоторые особенности острых кишечных инфекций у детей первых 2-х лет жизни в г. Шахты / Гревцев Ю.В., Кононенко Л.П., Шумских И.В. и др. : Мат. VIII съезда ЭМИП.-2002,- Т.2.- С.29.

139. Некоторые факторы патогенности Е. coli, выделенных от больных с инфекционными осложнениями / Ф. С. Билалов, 3. Г. Габидуллин, М.М.Туйгунов, Э. Ф. Мамбетова // Известия Челябинского научного центра. -2006. №2.-С. 123-126.

140. Немцева Н.В. Определение свежего фекального загрязнения воды поверхностных водоемов /Н.В. Немцева, И.А. Мисетов, Г.П. Алехина // ЖМЭИ,- 1994,- 44.- С.120-123.

141. Николаев Ю.А. Биопленка — «город микробов» или аналог многоклеточного организма?/ Ю. А. Николаев Ю.А., В. К. Плакунов // Микробиология.-76(2)- 2007.- С.149-163.

142. Ныркова О.И. Эффективность использования современного перорального антибиотика «Альфа Нормикс»в терапии бактериальных диарей /О.И. Ныркова, М.К. Бехтерева // Журнал инфектологии.-2009.-Т.1-№2-. С. 51.

143. Одум Ю. Основы экологии Ю. Одум.- 1975.-740с.

144. Ольховиков А.И. Клинико-эпидемиологичекие особенности кишечных инфекций, вызванных условно-патогенными возбудителями у детей первого месяца жизни/ А.И. Ольховиков, A.C. Соколова // Журнал инфектологии.-2011.-Т.3- №3.- С.83.

145. Особенности острых кишечных инфекций у детей в Мордовии / О.И. Петров, В.Ф. Павелкина, Н.П.Амплеева, Р.З.Альмяшева и др. // Журнал инфектологии.-2011.- Т.З.-№ 3,- С.85-86.

146. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: МУК 4.2.1890-04 Методические указания.- М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России,- 2004.-91с.

147. Орлова К.А. Экспресс-детекция и выявление генов факторов патогенности бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций: Дис. . канд. биол. наук : 03.00.07 : Москва, 2004.- 144 с.

148. Особенности ОКИ у детей раннего возраста /A.B. Доценко, О.Н. Черных, С.П. Кокарева, С.В. Никитина, Ю.А. Бутузов// Журнал инфектологии,- 2011-. Т.3.-№3.-С.45.

149. Павловский E.H. Курс паразитологии человека / E.H. Павловский.- М., Л., 1934,- 592с.

150. Падейская E.H. Фторхинолоны в клинике инфекционных заболеваний / E.H. Падейская // Инфекции и антимикробная терапия.- 2005.- Т.П.- №3.

151. Панасюк Е.Ю. Особенности биоразнообразия условно-патогенных бактерий озера Байкал и их значение при оценке качества воды: Автореф. дис.канд.мед.наук.- Иркутск.- 2002.-25с.

152. Пак С.Г. Стратегия совершенствования специфической лабораторной диагностики инфекционных заболеваний / С.Г. Пак, О.Ф Белая//

153. Инфекционные болезни,- Матер. II Ежегодного Всерос. Конгресса по инфекционным болезням 2010.-т.8.-Прилож.№1.-С.236-237.

154. Первушина JI.A. Антилизоцимный признак микроорганизмов в бактериологической диагностике и лечении воспалительных заболеваний внутренних женских половых органов: Автореф. дисс. канд. мед. наук. Челябинск. -1990.-23с.

155. Петровская В.Г. Общие принципы генетического контроля патогенности бактерий / В.Г.Петровская, В.М.Бондаренко // Журн. микробиологии, эпидемиологии, иммунологии.-1994.-№3.- С. 106-110.

156. Пехов А.П. Плазмиды бактерий/ А.П. Пехов. -М,- 1986.-223с.

157. Поздеев O.K. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В.И.Покровского.- М.:ГЭОТАР-МЕД, 2002,- 768с.

158. Покровский В.И. Эпидемический процесс в эпоху научно-технического прогресса / В.И.Покровский, Б.Л.Черкасский, Ю.П. Солодовников // Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней : Вопросы общей эпидемиологии,- М.: Медицина, 1993.- Т. 1.-С.62-66.

159. Покровский В. И. Сальмонеллезы / В.И. Покровский, Б.Л. Черкасский.-М.,1995.-224с.

160. Поляк М.С. Основы антибиотикотерапии / М.С.Поляк. СПб.: Издательство «Анатолия».-2003.-56с.

161. Практикум по микробиологии: учеб. Пособие для студ. ВУЗов / Под ред. А.И. Нетрусова. М.: Издательский центр «Академия». - 2005. - 608 с.

162. Принципы организации микробиологического мониторинга / Л.М. Мамонтова, A.M. Кондратьева, A.B. Марков,Е.В. Анганова и др. // Бюл.ВСНЦ СО РАМН.- 2001,- №4 (18).-С.50-55.

163. Приказ МЗ СССР «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» № 535 от 22.04.85.

164. Применение статистических методов в эпидемиологическом анализе / Е.Д. Савилов, JI.M. Мамонтова, В. А. Астафьев, С.Н. Жданова.- М.: МЕДпресс-информ, 2004.- 112с.

165. Проблема острых кишечных инфекций у детей в Краснодарском крае / О.К.Александрова, Т.Н. Перепелкина, В.П. Клиндухов, Т.В. Шевырева и др.//Журнал инфектологии.-2011.-T.3.-C.23.

166. Прокопьева М.В. Оценка антропогенного загрязнения водной экосистемы р. Лены: Автореф. дисс.канд. мед. наук.- М., 2004.- 18с.

167. Прозоркина Н.В. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии. / Н.В. Прозоркина, П.А. Рубашкина.-2008.-384с.

168. Радциг М.А. Действие наночастиц серебра на бактерии: жизнеспособность, образование биопленок и Quorum Sensing регуляция / М.А. Радциг, О.А.Кокшарова, И.А. Хмель // http://rusnanotech08.rusnanoforum.ru/

169. Резник В.И. Роль вирусов в этиологии острых кишечных заболеваний/ В.И. Резник, E.H. Присяжнюк, Л.А. Лебедева //Дальневосточный журнал инфекционной патологии. -2009.- №16.- С. 37-42.

170. Решедько Т.К. Особенности определения чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом / К.Г.Решедько, О.У. Стецюк // Лабораторная диагностика,- КМАХ.- 2001.-Т.З,- №4.

171. Речкин А.И. Поиск новых резервуаров для персистенции и участников циркуляции энтеробактерий в естественных экосистемах / А.И. Речкин, Н.И. Евтеева // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского.-2007,- №6,- С. 99-103.

172. Рожнова С.Ш. Сальмонеллезы в России: затишье перед бурей / С.Ш. Рожнова, Акулова Н.К., Христюхина O.A. // Эпидемиология и инфекционные болезни,-2011.-№2,-С. 9-12.

173. Романова Ю.М. Участие мобильных элементов в формировании свойств патогенных бактерий / Ю.М. Романова, A.JI. Гинцбрук // Мол .генетика.-1999.- С.22-29.

174. Романова Ю.М. Мобильные генетические элементы и их роль в эволюции патогенных бактерий / Ю.М. Романова, Т.С. Ильина, A.JI. Гинцбрук // Вестник РАМН.-2001.- №4.-С. 15-19.

175. Романова Ю.М. Бактериальные биопленки как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина / Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // ЖМЭИ,- 2011,- №3.- С. 99-109.

176. Роль иммуномодулятора гепон в комплексной терапии острых кишечных инфекций у детей /A.A. Новокшонов, В.Ф. Учайкин, Н.В.Соколова, Г.М. Курбанова и др./ http://www.medlinks.ru/article.phpsid/ 2009 (15 марта 2010)

177. Руднев И.А. Тиолзависимые гемолизины как факторы патогенности клебсиелл / И.А. Руднев// Журн. Микробиол.-1993.-№6.-С. 31-32.

178. Руднов В.А. Современное клиническое значение синегнойной инфекции и возможности ее терапии у пациентов отделений реанимации / В.А. Руднов // Инфекции и антимикробная терапия.-2002.-Т.4.- с. 170-177.

179. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии / Под ред. Л.Б. Борисова.-2-e изд., перераб. и доп.-М.: Медицина. 1984.-256с.

180. Сазыкин Ю.О. Антибиотики и оболочка микробной клетки / Ю.О. Сазыкин, П.С. Навашин.- Изд. ВИНИТИ.- Итоги науки и техники.- М.: 1991,-185с.

181. Сазыкин Ю.О. Современные пути поиска новых антибактериальных агентов: предложения и дискуссии / Ю.О. Сазыкин // Антибиотики и химиотерапия,- 1998.- №12.- С. 4-7.

182. Саляхов Р.З. Гемолитическая активность клинических штаммов бактерий рода Serratia / Р.З. Саляхов, З.Г. Гибидуллина, A.A. Ахтариева// Журн. Успехи современного естествознания,- 2003.-№8,- С. 73.

183. Сергевнин В.И. Этиологическая структура и экологическая классификация острых кишечных инфекций / В.И. Сергевнин // Эпидемиол. и инфекционные болезни,- 1997,- №6,- С.8-9.

184. Сергевнин В.И. Эпидемиология острых кишечных инфекций / В.И. Сергевнин.-Пермь: ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А.Вагнера Росздава, 2008.-280с.

185. Сергиев В.П. Инфекционные болезни и цивилизация: прошлое, настоящее, будущее / В. П. Сергиев,H.A. Малышев, И.Д. Дронов.-М., 2000.-207с.

186. Сергиев В.П. Инфекционные болезни на рубеже веков: осознание биологической угрозы/ В.П. Сергиев, H.H. Филатов; отв. ред.В.Л.Шульц.; Центр исследования проблем безопасности РАН.- М.: Наука, 2006.- 572с.

187. Сидоренко C.B. Клиническое значение резистентности микроорганизмов к антимикробным препаратам / С.В.Сидоренко // Рос. мед. вести,- 1998,-№1,-С. 28-34.

188. Сидоренко C.B. Есть ли будущее у антибактериальной терапии / С.В.Сидоренко // Антибиотики и химиотерапия.- 1999,- №1. С. 3-5.

189. Сидоренко C.B. Антибиотикограмма: диско-диффузионный метод. Интерпретация результатов / C.B. Сидоренко, В.Е. Колупаев,- Смоленск, 2000,- 28с.

190. Сидоренко C.B. Инфекционный процесс как "диалог" между хозяином и паразитом /С.В.Сидоренко // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001.-Том 3,- № 4.- С. 301-315.

191. Сидоренко C.B. Бета-лактамазы расширенного спектра: клиническое значение и методы детекции / C.B. Сидоренко // Инфекции и антимикробная терапия,- 2002.-Т4. -№6. С. 164-170.

192. Сингер М. Гены и геномы / М. Сингер, П. Берг (Перевод, с англ. Т. С. Ильиной, Ю. М. Романовой). М.: Мир, 1998. - 373 с.

193. Скала JI.3., Сидоренко C.B., Нехорошева А.Г. Практические аспекты современной клинической микробиологии / Л.З. Скала, С.В.Сидоренко, А.Г.Нехорошева М.: Лабинформ.-1997.- С.52-102.

194. Скала Л.З. Практические аспекты современной клинической микробиологии /Л.З.Скала, С.В.Сидоренко, А.Г.Нехорошева, И.Н.Лукин, С.А.Грудинина Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2004.- 312 с.

195. Смолянская А.З. Условно-патогенные бактерии кишечника -возбудители инфекций кишечной и внекишечной локализации/ А.З. Смолянская.- Всерос. съезд микробиологов и эпидемиологов, 5-й: Тез.докл,-М., 1985.-С.280-282.

196. Совершенствование нормативной и методической базы бактериологического мониторинга качества питьевой воды / Л.В. Иванова, А.Е. Недачин, H.H. Буторина, A.B. Загайнова и др. // Гигиена и санитария.-2007.-N 5.-С.36-39.

197. Соколов В.Ю. К вопросу о механизме антилизоцимной активности бактерий / В.Ю. Соколов, А.П. Луда В сб. : Персистенция микроорганизмов.-Куйбышев.-1987,- С.120-125.

198. Соловых Г.Н. Система «лизоцим антилизоцим» микроорганизмов в формировании водных сообществ пресноводных водоемов: Дисс.докт. биол. наук. 03.00.07 — Оренбург, 1995. —226 с.

199. Способ оценки состояния микрофлоры кишечника человека по количеству адгезивно-активных бактерий и типу адгезинов / Гизатулинга С.С., Биргер М.О., Кулинич Л.И., Фиш Н.Г. и др. // Клиническая микробиология.- 1991.-С.21-23.

200. Стент Г. Молекулярная биология вирусов бактерий / Г. С тент.- М.: Мир,-1965,- 467с.

201. Страчунский Л.С. Состояние антибиотикорезистентности в России / Л.С.Страчунский //Клиническая фармакология,- 2000.-№2.- С.6-9.

202. Страчунский Л.С. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии / Л.С.Страчунский, Ю.Б.Белоусов, С.Н. Козлов,- 2002,- 382с.

203. Строганов В.П. Феномен резистентности / В.П. Строганов // Микробиолог и клиницист,- 1998.- №5 (11).

204. Супотницкий М.В. Микроорганизмы, токсины и эпидемии. М., 2000.-376с.

205. Тец В.В. Бактериальные сообщества. В кн.: Клеточные сообщества / Под ред. В. Теца. -Санкт-Петербург: Изд-во СП6ГМУ.-1998. С. 15-73.

206. Тимаков В.Д. Ферментативная активность бактерий в связи с их вирулентностью / В.Д. Тимаков, Д.Г. Кудлай, В.Г. Петровская // ЖМЭИ.-1968, вып. 3,- с. 3-16.

207. Титов Л.П. Стратегии контроля резистентности микроорганизмов к антибиотикам: международный и национальный опыт / Л.П. Титов, В.И.Ключенович// В кн. Резистентность микроорганизмов к антимикробным препаратам,- Минск,- 2003.- С. 4-13.

208. Титов Л.П. Классификация, номеклатура и эволюция значимых для медицины бактерий. -http://www.itlab.anitex.by/msmi/bmm/01.2006/4.html /13.03.2010/.

209. Тотолян А.А. Генетика патогенности микроорганизмов / А.А. Тотолян // Вестник РАМН. 2000. - № 11. - С. 29-32.

210. Урсова Н.И. Базовые функции кишечной микрофлоры и формирование микробиоценоза у детей /Н.И.Урсова // Практика педиатра. http://medi.ru/doc/jO 10603 30.htm /2006.

211. Файзуллина Р.А. Об опыте применения препарата Энтерофурил в детской практике / Р.А. Файзуллина // http://www.medvestnik.rU/archive/2008/5/1077.html /29.03.2010/.

212. Фиалкина С.В. Генетические детерминанты патогенности клинических штаммов Klebsiella pneumoniae : Автореф. дисс.канд. биол.наук, 03.00.07-микробиология, Москва, 2004. 24с.

213. Фомина И.П. Современное значение орального цефалоспорина III поколения цефиксима в терапии бактериальных инфекций/ И.П.Фомина, Л.Б.Смирнова //Журн. Инфекции и антимикробная терапия/- 2002/-Т.4, №3.

214. Формирование биопленок клиническими штаммами бактерий комплекса Burkholderia cepacia в зависимости от их фенотипических и генотипических характеристик / И.А.Шагинян, Г.А.Данилина, М.Ю.Чернуха, Г.В.Алексеева, А.Б. Батов // ЖМЭИ.-2007.-№1, С.3-9.

215. Фролов А.Ф., Зарицкий A.M., Фельдман Ю.А. Еще раз об условной патогенности микроорганизмов (ответ оппоненту) // Журн. микробиологии, эпидемиологии, иммунологии.-1989.- №5.- С.96-98.

216. Фролов В.М. Клинико-иммунологические особенности и лечение кишечной инфекции клебсиеллезной этиологии / В.М.Фролов, Н.Д. Ющук, H.A. Пересадин // Журн. Инфекционные болезни.- 1994.- С. 67-70.

217. Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии / Ф.Х. Хазиев,- М.: Наука. 1990. - 189 с.

218. Ходырева Л.А. Клинико-лабораторные аспекты диагностики, течения и прогноза мочевой инфекции: Автореф. дисс. . док. мед.наук: 14.00.40/ ФГУ «НИИ урологии Росмедтехнологий».- Москва.-2007.-39с.

219. Худяк Э.И. Частота обнаружения условно-патогенных баткерий семейства кишечных у больных острыми кишечными заболеваниями и у здоровых детей / Э.И. Худяк, Л.А. Савицкая, У.А. Бахадырова // Мед.журн. Узбекистана,- 1983,- №2,- С.28-30.

220. Цинзерлинг А. В. Современные инфекции / А. В. Цинзерлинг. СПб.: Сотис, 1993. - 363с.

221. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие / Под. Ред. A.C. Лабинской, Л.П. Блинковой, A.C. Ещиной.-М.:ОАО «Издательство «Медицина», 2005.-600 с.

222. Чакветадзе С.С. Острые нарушения пищеварения у детей 1-го года жизни/ С.С. Чакветадзе // Медицинский научный и научно-методический журнал .-2005,- №27,- С.3-23.

223. Чистович Г.Н. Патогенез стафилококковой инфекции / Г.Н. Чистович.-Г.Н. Чистович. 1961. Л.: Медгиз, 1961,- 216 с.

224. Шагинян И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекций.- .- 2000. -Т 2,-№3.

225. Шеенков Н.В. Роль антилизоцимной активности бактерий в развитии инфекционного процесса и пути ее регуляции: Автореф. дисс. канд. мед.наук.-Челябинск.-1993.

226. Шеенков Н.В. Антилизоцимная активность бактерий рода Brucella / H.B. Шеенков, M.B.Скачков, А.Г. Яковлев, М.Б. Шерстнева // Журн. микробиол.-2000.-№4.-Приложение.- С.99-100.

227. Шорникова Е.А. Диагностика состояния экосистем водотоков по гидрохимическим и микробиологическим показателям: Автореф. дисс.канд. биол. наук.-03-00-16.- Петрозаводск- 2007.-23с.

228. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия / С. Н. Щелкунов. -Новосибирск: Сибирское университетское изд-во, 2004. 496 с.

229. Эпидемиологические особенности острой кишечной инфекции (ОКИ) в г. Новочеркасске / З.Д. Макагонова, Г.Т. Календжян, С.Ф. Аксенова, О.А.Стрижак и др.- Материалы VIII съезда Всерос. об-ва ЭМП.- М., 2002.-Т.1.- С. 73.

230. Эпидемиологический мониторинг антибиотикорезистентности микроорганизмов с использованием компьбтерной программы WHONET: методические рекомендации / Зуева Л.П., Поляк М.С., Кафтырева Л.А., Колосовская Е.Н. и др.- Спб.- 2004,- 69с.

231. Эколого-эпидемиологическая оценка качества вод реки Лены / Е.Д. Савилов, Ю.А. Долженко, А.П. Протодьяконов и др. Новосибирск : Наука,2006,- 136с.

232. Энделыитейн М.В. Разработка молекулярно-генетических методов для исследования В-лактамаз ТЕМ и SHV у клинических штаммов энтеробактерий : Автореф. дисс. канд.биол.наук.- 14.00.31- Москва.-2000.- 21с.

233. Эшерихиозы у детей в современных условиях / Т.С. Хорошева, М.К. Бехтерева, А.С. Кветная, О.И. Ныркова // Журнал инфектологии.- 2011.- Т.З.-№ 3.-С.102.

234. Ющук Н.Д. Клинико-иммунологическая характеристика кишечной клебсиеллезной инфекции / Н.Д. Ющук, В.М. Фролов // Сов. мед.- 1990.-№9.-С.79-83.

235. Яковлев В.П. Клинико-лабораторное обоснование назначения цефоперазон/ сульбактама больным с тяжелыми госпитальными инфекциями / В.П.Яковлев, Д.Л. Щавелев, С.В.Яковлев // Инфекции и антимикробная терапия.-2002,- Т.4.-№5.-С. 132-138.

236. Яковлев С.В. Амоксициллин/сульбактам новые возможности преодоления антибиотикорезистентности / С.В. Яковлев // Журн. Русский медицинский журнал. -2005.- т. 13.-№ 21. - С. 1418-1422.

237. Ярков А.И. Клинические проявления синдрома интоксикации при заболеваниях клебсиеллезной этиологии / А.И. Ярков, Л.С.Павлова, О.Н.Добромыслова// Всерос. съезд инфекционистов.- Смоленск.-1989.- С 128130.

238. Abbo A. Impact of multi-drug resistant Acinetobacter baumannii (MDR -AB) on patients clinical outcomes / A. Abbo, S.Navon-Venezia, Y. Siegman-Igra, Y. Carmeli // 45 th ICAAC. Abstract К-1302.-2006,- P. 336.

239. Abraham E. An enzyme from bacteria able to destroy penicillin / E Abraham, E Clain.- Natura.- 1940,- V.146.- P.837-839.

240. Adrews J.M. Determination of minimum inhibitory concentrations / J.M. Adrews // J. Antimicrib. Chemother.-2001,- 48 (SI).- P. 5-16.

241. Ambler R.P. The structure of b-lactamases / R.P. Ambler.- Pbilos. Trans. R.Soc. London Ser.- 1980.-289,- P.321-331.

242. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori / N.S. Akopyants, S.W.Clifton, D. Kersulyte et al. // J.Mol.Microbiol.-1998.-V.28.-P.37-53.

243. Arthur M. Distribution of erythromycin esterase and rRNA methylase genes in members of the family Enterobacteriaceae highly resistant to erythromycin / M. Arthur, A. Andremont, P. Courvalin // Antimicrob. Agents Chemother.-1987.-N.31.-P. 404-409.

244. Asada Y. NADH-oxidazing peroxidase produced by lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium / Y.Asada, M.Miyabe, M.Kikkawa, H. Kuwakara // J. Ferment. Technol. 1987. - V. 65. - № 4. - P. 483-487.

245. Bauer A.W. Antibiotic susceptibility testing by a standardized singl disk method / A.W. Bauer, W.M. Kirby, J.C Sherris, M. Turck // Amer J Clin Pathol.-1966,-N. 45,- P. 493-496/

246. Bauer M.E. Characterization of an RTX toxin from enterohemorrhagic Escherichia coli О 157:Н7/ M.E. Bauer, Welch // J. Infect. Immun.-1996.- V.64.- P. 167-175.

247. Bates P. R. Comparative epidemiology of rotavirus, subgenus F (types 40 and 41) adenovirus and astrovirus gastroenteritis in children / P. R. Bates et al. // J Med Virol. 1993 .-39(3):224-228.

248. Bender J. Lipases as Pathogenicity Factors of Bacterial Pathogens of Humans / J. Bender and A. Flieger // Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology.-2010, Part 29, 3241-3258p.

249. Bergogne-Berezin E. Opportunistic nosocomial multiply resistant bacterial infections their treatment and prevention./ E. Bergogne-Berezin, D. Deere, M.-L. Guillou // J. Antimicrob. Chemother.- 1993,- Vol.32.- Suppl. A.- P. 39-47.

250. Blanc-Potard A.B. The SPI-3 pathogenicity island of Salmonella enterica/ A.B. Blanc-Potard, J. Kayser, E.A. Groisman // J. Bacteriol.-1999, 181 : 998-1004.

251. Bloody diarrhea caused by Klebsiella pneumoniae : a new mechanism of bacterial virulence? / F. Guerin, C. Bouguenec, J. Gilquin et al. // Clin Infect Dis.-1998; 27(3).-P. 649-649.

252. Bobo L. D. PCR detection of Chlamydia trachomatis / L. D. Bobo. -Washington: ASM Press, 1993.- 235 p.

253. Brunder W. Genome plasticity in Enterobactericeae / W. Brunder, H. Karch // Int. J. Med. Microbiol.-2000,- V.290.- P. 1530165.

254. Burgos Y. Common origin of plasmid encoded alpha-hemolysin genes in Escherichia coli /Y.Burgos., L.Beu // BMC Microbiology.- 2010, 10:193 doi:10.1186/1471-2180-10-193.

255. Chambless J.D. A three-dimensional computer model of four hypothetical mechanisms protecting biofilms from antimicrobials / J.D. Chambless, S.M.Hunt, S.S. Philip //Appl. and Environmental Microbiology.-V.2006.-V.72.-P.2005-2013.

256. Characterization of the type 3 fimbrial adhesions of Klebsiella strains / T.A. Sebghati, T.K. Korhonen, D.B. Hornick et al. // Infect Immun. 1998; 66(6).- P. 2887-2894.

257. Cockerill F.R. Genetic Methods for Assessing Antimicrobial Resistance / F.R. Cockeril //Antimicrob Agents Chemother.- 1999.-V.43.- P. 199-212.

258. Cole S.T. Bacterial genomes-all shapes and sizes/ S.T Cole, I.Saint-Girons //In book Organization of the Prokariotic Genome. Edited by R.L.Charlebois. -1999,- P.35-57.

259. Comité de Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie. Technical recommendations for in vitro susceptibility testing // Clin. Microbiol. Infect.-1996.-2 (Suppl. 1 ). S 11 -25.

260. Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar typhimurium LT2/ M. Mcclelland, K.Sanderson, J.Speith at al.// Nature.- 2001.-Vol.413,- P.852-856.

261. Costerton J.W. Microbial Biofilms / J.W Costerton, Z. Lewandowski, D.E. Caldwell // Ann Rev Microbiol.-1995.-V.- 49.-P.711-745.

262. Costerton J.W. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections / J.W. Costerton, P.S Stewart, E.P. Greenberg // Science.-1999.-V.284.-P. 13181322.

263. Daigle F. Expression and detection of pap, sfa, afa encoded fimbrial adhesin systems among uropatogenic E. coli / F. Daigle, J. Harel, J. Fairbrother, P. Lebel // J. Microbiol. Infect. Dis.- 1990.- №9 (4).- P.281-283.

264. Davies D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents / D. Davies // Nat. Rev. Drug. Discov. 2003.-V.2.-P.114-22.

265. DeFlaun M.F. Genes and their varied hosts. In: Levy S.B., Miller R.V. Gene transfer in the environment / M.F. DeFlaun, S.B Levy // New York : McGraw №11 Publishing.-1991 .-N1 .-P.32.

266. Dobrindt U. Pathogenicity islands and phage conversion:evolutionary aspects of bacterial pathogenesis / U. Dobrindt, J. Reidl // J. Med. Microbiol.-2000.- V. 290(6).-P. 519-527.

267. Doolittle W.F. Lateral genomic/ W.F Doolittle // Trends.Genet.-1999.-V.15,-P.5-8.

268. Dubos R.J. Biochemical determinants of microbial diseases.-Cambridge.-1954.-152 p.

269. Ediin B.R. An outbreak of multidrug resistant tuberculosis among hospitalized patients with acquired immunodeficiency syndrome / B.R.Ediin, J.I.Tokars, M.H. Grieco, J.T. Crawford. // N. Engl. J.Med. 1992,- V.326.-P. 15141521.

270. Ericsson H.M. Antibiotic sensitivity testing. Report of an international collaborative study / H.M. Ericsson, J.C. Sherris.- Acta Pathol Microbiol Scand Sect B.-1971.- 217 (Suppl.)-P. 1-90.

271. European Committee for Clinical Laboratory Standards. Standard for quality assurance. Part I: Terminology and general principles. ECCLS Document. 1985; 2 (1).

272. European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (RUCAST) of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) // Clin. Microbiol. Infect.-2003.- №9,- P. 1-7.

273. Escherichia coli ehll gene-positive serotype 018ac:H31 associated with an outbreak of diarrhea in a neonatal nursery in Neuquen City, Argentina/ I. Chinen, M. Rivas, V. Soriano et al. // J. Clin. Microbiol. -2002,- V.40(4).- P. 1225-9.

274. Fath M.J. ABC Transporters: Bacterial Exporters / M. J. Fath, R. Kolter // Microbiological reviews. -1993. Vol. 57. №4. - P. 995-1017.

275. Finlay B.B. Common themes in microbial pathogenecity revisited / B.B. Finlay, S. Falkow // Microbial Mol Biol.- 1997.- N.6.-P. 36-69.

276. Genetics of virulence of enteropathogenic E.coli / J.B. Karper,T.K.McDaniel, K.G.Jarvis et al. // Adv Exp Med Biol.-1997-412:279-87.

277. Genetic organization of the she pathogenicity island in Shigella flexneri 2a / K. Al-Hasani, K. Rajakumar, D. Bulach et al. // Microb. Pathog.-2001.- V.30(l).-P.l-8.

278. Goodgame R. W. Viral causes of diarrhea / R. W. Goodgame // Gastroenterol Clin North Am. 2001. V. 30. P. 779-795.

279. Gottesman M. Bacteriophage lambda the untold story / M. Gottesman // J. Mol. Biol.-1999.- V.293.- P.177-180.

280. Hacker J. Influence of cloned Escherichia coli haemolisin henes, S.fimbria and serum resistance on pathogenicity in ditterent animal models / J. Hacker, H.Hof //Microbiol. Patogenesis.-1986.-N. 1.- P. 1533-1547.

281. Hacker J. Pathogenecity island of virulent bacteria: structure, funcrion and impact on microbial evolution / J. Hacker, G.Blum-Oehler, I. Muhldorfer // J.Mol.microbiol.-l 997.-V.23.-P. 1089-1097.

282. Hancock V. Biofilm formation by asymptomatic and virulent urinary tract infectious Escherichia coli strains / V.Hancock, L. Ferrieres, P. Klemm // FEMS Immunol. Med. Microbiol.- 2007.-V.51 .-P.212-219.

283. Hendrix R.W. Evolutionary relationships among diverse bacteriophages and prophages All the World,s a phage / R.W Hendrix, C.M. Magraret, R. Smith // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1999.- V. 96. Issue 5.-P. 2192-2197.

284. Hentschel U. Pathogenecity islands: the tip of the iceberg /U.Hentschel, J. Hacker//J. Microb. Infect.-2001.- V. 3. P. 545-548.

285. Huang Qing-Chunj. Physiological characters of the resistance mutant of Xanthomonas citri to amicarthiazol / Huang Qing-Chunj, Zhou Ming-Guoj, Ye ZhongYin // Acta Phytopathologica Sinica. 2003. - V. 33. - No. 1. c. 1-11.

286. Ingersoll M. Pathogenicity island of Shigella / M. Ingersoll, E.A. Groisman, A. Zychlisky // Curr Top Microbiol Immunol.-2002.-V.264(l).- P. 49-65.

287. Jacoby G. More extended spectrum beta-lactamases / G.Jacoby, A. Medeiros // Antimicrob. Agents Chemother.- 1991.- V.35.- P. 1697-1704.

288. Jaeger K.-3. Lipases of Bacterial / K.-3. Jaeger, RANSAC, S. et al. // FEMS of microbiology. 063opbi-nepeBecTH.-1994.-V. 15.- P. 29-63.

289. Karper J.B. The LEE Pathogenicity island of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escheerichia coli. Nova Actra Leopoldina. 2004.-V.88. N.-333,-P. 147-150.

290. Kelly T.M., Brenner D.J., Farmer J.J. Enterobacteriaceae // Mannual jf Clinical Microbiology / Ed. E.H. Lennette.- Washington, 1985.- P. 263-277.

291. Kirby W. Extraction of a highly potent penicillin inactivator from penicillin resistant staphylococci / W. Kirby.- Science.-1944,- V.99.- P. 452-455.

292. Kreft J. Evolution of pathogenic Listeria spesies. Nova Actra Leopoldina. 2004,- V.88. No 333. P. 173-183.

293. Krumperman P.H. Multiple antibiotic resistance indexing of Escherichia coli to identify high-risk sources of fecal contamination of foods/ P.H. Krumperman // Applied and Environmental Microiology. 1983,- Vol.46.- N.l. -P. 165-170.

294. Lee C.A. Pathogenicity islands and the evolution of bacterial pathogens / C.A. Lee // Infect. Agents Dis.-1996.-V.5.- P. 1-7.

295. Lopman B. Viral Gastroenteritis Outbreaks in Europe, 1995-2000 / B. Lopman et al. // Emerg Infect Dis, 2003. V. 9, № 1. P. 90-96.

296. Life in the 21 st Century: A Vision for All. The World Health Report- 1998, Geneva, WHO.-1998-24lp.

297. Livermore D.M. Beta-lactamases in laboratory and clinical resistence / D.M. Livermore // Clin. Microbiol. Rev. -1995,- Vol.8.- P. 557-584.

298. Maroncle N. Identification of Klebsiella pneumoniae Genes Involved in Intestinal Colonization and Adhesion Using Signature-Tagged Mutagenesis / N. Maroncle, D. Balestrino, C.Rich et.al. // Infect Immun. 2002. - Vol. 70 (8). - P. 4729-4734.

299. Margalef R. Information theory in ecology/ R. Margalef //Trans. Soc. Gen. Syst. Res. 1958. Vol. 3. P. 36-71.

300. Mathews C.K. An overview of the T4 development program / C.K.Mathews // Molecular Biology of Bacteriophage T4. Ed. Karam J.D. Washington, DC: Am.Soc.Microbiol.-1994.- P. 1-8.

301. Mattoes H.M. Optimizing antimicrobial pharmacodynamics dosage strategies for meropenem / H.M. Mattoes, J.L.Kuti, G.L.Drusano, D.P.Nicolau // Clin.Ther.-2004.-26(8).-P. 1187-1198.

302. Meyer K.S., Urban C., Eagan J.A., Berger B.J., Rahal J.J. Nosocomial outbreak of Klebsiella infection resistant to late-generation cephalosporins. Ann. Intern. Med. 1993,- V.19.-P. 353-358.

303. Mecsas J. Molecular Mechanisms of Bacterial Virulence: Type III Secretion and Pathogenicity Islands / Mecsas J., Strauss E.J. // Emerging Infectious Diseases. 1996. - Vol. 2, № 4. - P. 271 -290.

304. Millis K. B. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction / K. B. Millis, F. A. Faloona // Methods in Enzymology. 2007. -№155. - P. 335-350.

305. Murray B.E. In vitro studies of plasmidmediated penicillinase from Streptococcus faecalis suggest a staphylococcal origin. / B.M. Murray, B. Mederski-Samoraj, S.K. Foster, J.L. Brunton, P. Harford // J. Clin.Invest.-1986.-N.77.- P. 289-293.

306. Murray B.M. New aspects of antimicrobial resistance and the resulting therapeutic dilemmas / B.M. Murray // J.Infect. Dis. -1991.- V.163.-P. 1185-1194.

307. National Committee for Clinical Laboratory Standarts. Development of in vitro susceptibility testing criteria and quality control parameters. Approved quideline. NCCLS Document M-23A.- 1994.-12 (16).

308. Neu H.C. The crisis in antibiotic resistance / H.C. Neu // Science.-1992,-V.257.- P.1064-1073.

309. Noble W.C. Co- transfer of vancomycin and resistance genes from Enterococcus faecalis NCTC 12201 to Staphylococcus aureus / W.C.Noble, Z.Virane, RGA. Gree // FEMS Microbiol. Lett.-1992.-N.93.-P.-195-198.

310. Niyogi S.K. Enteroaggregative Klebsiella pneumoniae in association with childhood diarrhea/ S.K. Niyogi, A. Pal, U. Mitra et. al. // Indian J Med Res. -2000. Vol. 112. - P. 133-134

311. O" Brien T.F. Resistance to antibiotics at medical centres in different parts of the world and the International survey of antibiotic resistance group / T.F.O' Brien // J. Antimicrob. Cbemotber. .-1986,- Suppl.- P.-243-253.

312. Ochman H. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation // H. Ochman, J.G. Lawrence, E.A. Groisman //Nature 2004.-405.-P. 299-304.

313. Olson M.E. Biofilm bacteria: formation and compararive susceptibility of antibiotics / Olson M.E. et al. // Can. J. Vet. Res.- 2002,- V.66(2).-P.86-92.

314. O'Toole G.A. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development / G.A. O'Toole , R. Kolter // Mol. Microbiol.-1998,- V. 30,- P. 295-304.

315. O'Toole G.A. Biofilm formation as microbial development / G.A. O'Toole, H.B Kaplan, R.Kolter // Ann. Rev. Microbiol.- 2000.-V.54.-P. 49-79.

316. Pathogenicity islands and other virulence elements in Listeria / J. Kreft, J.A. Vazquez-Boland, S. Altrock et al. // Curr Top Microbiol Immunol.-2002.- V. 264(2).-P. 109-125.

317. Parashar U.D. Rotavirus and Severe Childhood Diarrhea / U.D. Parashar, C.J.Gibson, J.S.Bresee, R.I. Glass // Emerg Infect Dis .- 2006.-V. 12(2).- P.304-306.

318. Pass M.A. Multiplex PCRs for Identification of Escherichia coli Virulence Genes / M.A. Pass, R. Odedra, R.M. Batt // J. Clinical Microbiology.- 2000,-V.38(5).-P. 2001-2004.

319. Phillipon A., Labia R., Jacoby G. Extendedspectrum I lactomases. Antimicrob. Agents Chemother.- 1989,- V.33.- P. 1131-1136.

320. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / R. J. Saiki, D. H. Gelfan, S. Stoffel, S. J. Scharff, R. Higuchi // Science. 2006. - №239. - P. 487-491

321. Quinolone antibiotic in the treatment of Salmonella infections / M.O Asperilla, A. Raymond, R.A. Smego, L.K.Scott // Rev. Infect. Dis.-1990.-V.12,- P. 873-889/

322. Role of intraspecies recombination in the spread of pathogenicity islands within the Escherichia coli species/ S. Schubert, P.Darlu, O.Clermont et.al/PloS Pathog.-2009.-V.5(1).-P.257-265.

323. Roy C. Frequency of plasmid-determined betalactamases in 680 consecutively isolated strains of Enterobacteriaceae. / C. Roy, C.Segura, M.Tirado, R.Reig, M.Hermida, D.Teruel // Eur. J. Clin. Microbiol.-1985,- №4,- P. 146-147.

324. Ryder M.A. Catheter-Related Infections: It's All About Biofilm. Topics in Advanced/ M.A. Ryder // Practice Nursing Journal.- 2005.-V.5(3).

325. Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual / J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.- 1989. - V. 2,- 345 p.

326. Schauer D.B. Attacching and effacing locus of a Citrobacter freundii biotypethat causes transmissible murin colonic hyperplasia/ D.B. Schauer, S.Falkov // Infect.Immun.- 1993.-V.61,- P.2486-2492.

327. Sen K. Multiplex PCR for detection of Enterobacteriaceae in blood / K. Sen, D.M. Asher // Transfusoin.- 2001.- V. 41(11).-P. 1356-1364.

328. Sougakoff W. Plasmidmediated resistance to third generation cephalosporins caused by point mutations in TEM -type penicillinase genes / W. Sougakoff, S. Goussard, G. Gerbaud, P. Courvalin // Rev. Infect. Dis.-1988.- V.10.-P. 879-884.

329. Schmidt H. Pathogenicity Islands in Bacterial Pathogenesis / H. Schmidt, M. Hensel // Clinical Microbiology reviews.-2004.- V.17.-N1.- P. 14-56.

330. Short-course norfloxacin and trimethoprim-sulfamethoxazol treatment of sigellosis and salmonellosis in Egypt / Bassily S., Hyams K.C., N.A. El Masry et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg.-1994.-V.51-32.- P. 219-223.

331. Smith H.W. The toxic role of Alphahaemolisin in the pathogenesis of experimental E.coli infection in mice/ H.W. Smith, H.B. Huggins // J.of Gen Microb.-1985.- N.131. p. 395-403.

332. Tenover F.C. Novel and emerging mechanisms of antimicrobial resistance in nosocomial pathogens / F.C. Tenover // Am. J. Med.-1991.-V.91 (suppl B).-P. 7681.

333. Tenover F.C. Global problem of antimicrobial resistance / F.C. Tenover // Russ. Med.J.-2005.- P.1-6.

334. Tetz V.V. The effect of antimicrobial agents and mutagen on bacterial cells in colonies / V.V. Tetz // Med. Microbiol. Lett. 1996.-V.5.- P.426-436.

335. Thanassi D. G. Multiple pathways allow protein secretion across the bacterial outer membrane / D. G. Thanassi, S. J Hultgren// Current Opinion in Cell Biology. 2000. - Vol. 12. - P. 420-430.

336. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections / Costerton J. W., Veeh R., Shirtliff M. et. al. // Clin. Invest.-2003.-V. 112.-P.1466-1477.

337. Torres A.G. Pathogenicity island of intestinal E.coli / A.G. Torres, J.B. Kaper // Curr Top Microbiol Immunol.- 2002.-V. 264 (1).- P. 31-48.

338. Vandepitte J. Basic laboratory procedures in clinical bacteriology / J.Vandepitte, K. Engbaek, P. Piot, C.C. Heuck.-Geneva: World Health Organization. -1991.

339. Virulence factors (aerobactin and mucoid phenotype) in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli blood culture isolates / V. Vernet, A. Philippon, C. Madoulet et al. // FEMS Microbiol Lett. 1995;130 (1).- P. 51-57.

340. Wang C.Y. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalized patients clinical features, risk-factors and outcomes / C.Y. Wang, J.S. Jerng, K.Y. Cheng // Clin. Microbiol. Infect.- 2006.- V.12.- P. 63-68.

341. Watnick P. Biofilm, city of microbes / P.Watnick, R.Kolter // J. Bacteriol.-2000.- V.182.- P.2675-2679.

342. Weyant S.R., Moss W., Weaver R., Hollis D., Jordan J., Cook E., Daneshvar M. Identification of Unusual Pathogenic Gram-Negative Aerobic Bacteria (second edition). Atlanta, Georgia, 1999,- 791p.

343. Wiener J. Multiple antibiotic-resistant Klebsiella and Escherihia coli in nursing homes / J.Wiener, J.P.Quinn, P.A.Bradford et.al.- JAMA.-1999.- N 281,-P.517-523.

344. Wilhelmi I. Viruses causing gastroenteritis / I. Wilhelmi, E. Roman, A. Sanchez-Fauquier // Clin. Microbiol. Infect. 2003. V. 9. P. 247-262.

345. Wisplinghoff H. Molecular epidemiology of clinical Acinetobacter baumannii isolates from Europe and the U.S. using a new MLST scheme / H.Wisplinghoff, C. Hippler, S. Bartual, F. Rodriguez-Valera et al. // 45 th ICAAC. Abstract C2- 2006.-1428.- P. 126.