Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Организация оперонов шига и шига-подобного 1 токсинов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Организация оперонов шига и шига-подобного 1 токсинов"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ /имени В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

Оо'

А

На правах рукописи УДК 577.21.0

ЛУКЬЯНОВ Евгений Владимирович

ОРГАНИЗАЦИЯ 0ПЕР0Н0В ШИГА И ШИГА-ПОД0БН0Г0 I ТОКСИНОВ

03.00.03 — Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1990

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта АН СССР.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ

доктор биологических наук Ю. В. Козлов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, проф. А. П. Рысков кандидат биологических наук В. И. Башкиров

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ — Институт биоорганической химии АН СССР имени М. М. Шемякина

Защита состоится « » 1990 г. в часов на за-

седании специализированного совета Д 0С2.79.01 при Институте молекулярной биологии АН СССР имени В. А. Энгельгардта по адресу: М7984, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии АН СССР имени В. А. Энгельгардта'.

Автореферат разослан « » с£Н1Л<Ър$ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

А. М. Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Растущий интерес к бактериальным токсинам как специфическим белковым молекулам, избирательно поражающим эу-кариотичеекие клетки, сьязан с их ведущей ролью в патогенеае ряда инфекционных заболеваний. Являясь важнейшими факторами вирулентности, токсины, продуцируемые бактериальной клеткой, способствуют ее выживанию в органиЛме человека и животных. Поэтому ис-следов?ние генов токсинов и молекулярных механизмов,ответственных за их экспрессию, проливает свет не только на природу самих токсинов, но и на детали взаимоотношений паразита и хозяина.

При проникновении в клетку-мишень многие токсины используют те же пути, что и регуляторные белки (гормоны, факторы роста), и, следовательно, могут служить для изучения транспорта белков в эу-кариотическую клетку.

Изучение структурной организации молекул токсинов, большинство из которых состоят из двух или более компонентов,может быть полезным в выяснении процессов сборки сложных белковых систем и белок-белковых взаимодействий.

Исследования в этой области имеют и прикладное значение.Клонирование генов токсинов и определение их нуклеотидной последовательности открывает возможность создания методами генной инженерии дефектных токсинов, используемых для иммунизации, а также получения зондов, необходимых для дифференциальной диагностики заболеваний.Еще одной практически важной задачей является создание иммунотоксинов,которые могут быть использованы для направленного уничтожения определенных групп клеток, в частности, раковых.

Шига-токсин и шига-подобные токсины образуют семейство сходных цитотоксинов, продуцируемых рядом энтеробактерий, и, вероятно , являются самыми распространенными бактериальными токсинами в природе. Несмотря на то, что эти токсины интенсивно изучаются на протяжении последних нескольких лет, их структурные гены и механизмы, ответственные за экспрессию, до недавнего времени оставались относительно мало исследованными.

Цель работы- Исследование структурной и функциональной организации оперонов шига и шига-подобного токсинов.

Задачи. 1.Изучение положения генов шига-тиксина и структуры прилегающих участков в хромосомах различных штаммов БЫео] 1а иу-вепгеНае 1.

2. Индукция лизогениого фага, определявшего продукцию шига-подобного I токсина в штамме Escherichia coll ЕРЕС 026:НИ НЗО. Клонирование фрагмента ДНК, несущего гены токсина, и определение его нуклеотидной последовательности.

3. Сравнение нуклеотидных последовательностей структурных генов шига и шига-подобнго I токсинов, а также прилегающих участков.

4. Сравнительное изучение продукции токсин-специфических мРНК. Выявление механизмов, ответственных за неэквивалентную продукцию А и В субъединиц.

Научная новизна работы. В результате проведенной работы было показано, что гены, ответственные за продукцию шига-токсина, лежат на участке хромосомы, имеющем идентичную структуру у всех 10 исследованных штаммов Shigella dysenterlae 1 { из которых 13 -клинические изоляты ), причем во всех случаях гены шига-токсина тесно сцеплены с IS-элементом, родственным 13600-элементу Shigella sonnei. Независимо в геномах присутствует 15-20 копий IS-элемента, причем все штаммы различаются по положению 1-2 копий. Было показано, что в штамме Escherichia coll ЕРЕС 026:1111 НЗО гены, ответственные за продукцию шига-подобного I токсина, входят в состав лизогенного умеренного фага НЗО. Была определена нуклеотид-ная последовательность фрагмента ДНК, несущего эти гены, и проведено ее сравнение с соответствующими последовательностями из других токсин-конвертирующих фагов, а также с последовательностью фрагмента ДНК из Sh.dysenterlae 1 60R, несущего гены шига-токсина. Между участками ДНК, непосредственно прилегающими к оперонам шига и шига-подобного I токсинов выявлена значительная гомология. Показано, что на оперонах шига и шига-подобного I токсинов синтезируется бицистронная мРНК, причем для обоих оперонов одинаково положение ее 5'-концов, а также практически идентична картина ее - деградации. В штаммах Sh.dysenterlae 1 60R и E.coll НЗО продукция токсин-специфических мРНК регулируется содержанием свободных ионов железа в среде. Приведены свидетельства в пользу регуляции неравного соотношения количеств субьединиц А и В на уровне трансляции.

1 • Практическая ценность работы. Данные об организации генов шига токсина в геномах различных штаммов Sh.dysenterlae (в том числе и клинических изолятов) и шига-подобного I токсина в штам-

ме Е-coll ЕРЕС 02в:Н11 НЗО, а также о механизмах, определяющих продукцию токсинов, проясняют некоторые аспекты патогенеза дизентерии. Эти данные могут служить основой для получения штаммов-суперпродуцентов токсинов.Полученные конструкции могут быть использованы для создания химерных генов токсинов, а зонды использованы в целях диагностики.

Апробация работы. Результаты доложены на 6-ом симпозиуме СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Ленинград, 1988г.). 8-ом симпозиуме СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" (Иркутск, 1989г.), 4-ом Европейском симпозиуме "Bacterial protein toxins" (Италия, Урбино, 1989г.) и 2-ой Всесоюзной конференции "Бактериальные токсины" (Юрмала, 1989г.). Основные положения диссертации обсуждены и представлены к защите на заседании коллоквиума отдела генетической инженерии ИМБ АН СССР 13 июня 1990 года.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы.

Работа изложена на страницах машинописного текста, со-

держит таблицы-и рисунков. Библиография включает ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе были использованы лабораторные штаммы Sh.dysente-rlae 1 60R и 263R, продуцирующие шига-токсин, штаммы Sh.dysente-rlae 1 177, 179, 237, 239, 240, 312, 519, 904, 2338. 2358, 2458, 3208 и 3225 - клинические изоляты, и штамм E.coll ЕРЕС 026:Н11 НЗО, продуцирующий шига-подобный I токсин. Для генно-инженерных манипуляций использовались штаммы E.coll НВ101 и JM103, для манипуляций с фагом НЗО - Е-col i С600. Штаммы выращивали на средах Н, LB или 2УТ с добавлением ампициллина там, где это было необходимо. Для создания условий недостатка свободных ионов желе-"^ за в среды добавляли дипиридил до 200 мкМ/мл. Фаг НЗО индуцировали инкубацией культуры клеток E.coll НЗО в присутствии 2 мкг/ мл митомицина С. Получение лизата фага НЗО высокого титра, трансформацию, выделение плаэмидной ДНК, гель-электрофорез, обработку ДНК рестриктазами и другими ферментами проводили по Маниати-

су и др.[1984]. Извлечение ДНК из агарозного и акриламидного гелей проводили электроэлюцией на DE-бумагу [Dretren G. et al., 1981]. Хромосомную ДНК из Sh-úysenteriae 1 и E-col J выделяли по модифицированному методу [Slloary T.J. et al., 1984]. Клонирование фрагментов ДНК в составе фага М13ар8, выделение одно- и деухцепочечной фаговой ДНК, а также секвенирование по методу Сэнгера проводили согласно руководству фирмы Amersliam. Синтез одноцепочечных ДНК-зондов, перенос ДНК на нейлоновые фильтры и гибридизацию проводили, как описано в работе [Cliurcli G.M. and Gilbert W., 1984]. ДНК фага НЗО выделяли по методикам, предлагаемым фирмой Amersliam для выделения ДНК фага к. Секвенирование фрагментов ДНК, меченных по одному из концов, осуществляли химическим методом [Maxam A.M. and Gilbert К.. 1981] в модификации [Chuvpl1 о S.A., KravchenXo V.V., 1984]. Суммарную РНК выделяли из штамма E-colí JM103, несущего плазмиду pSHT23 (гены вига-токсина) или pSLT318 (гены шига-подобного I токсина), а также из штаммов Sli.dysenteríae 1 60R и E.coli НЗО [Chomczynsky P., Sac-chl К., 1987]. В качестве затравки в реакции синтеза кДНК с помощью обратной транскриптазы были использованы меченные полинук-леотидкинаэой фага Т4 по 5'-концу олигонуклеотиды Б'-GGTAAATTCC-TTCGCAACCAC-3' и 5'-GGCGTCGCCAGCGCACTTGC-3', любезно предоставленные Б.К.Черновым (ИМБ). Активность е-галактозидазы определяли. как это предложено Миллером Дж. [1976].

Клонирование генов шига-подобного I токсина и выделение хромосомной ДНК из штаммов Sti-dysenterlae 1 проводили в условиях BL2+EK.I, согласно правилам, разработанным в Национальном институте Здоровья США, для такого рода работ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Штаммы Sh.dysenteríae 1 продуцируют сильный шига-токсин, обладающий цитотоксическим, нейротоксическим и энтеротоксичес-ким действием. Некоторые энтеропатогенные штаммы E-coll продуцируют шига-подобный I токсин, обладающий практически идентичными свойствами. Молекулы обоих токсинов состоят из пяти одинаковых В-субьединиц, служащих для связывания с рецепторами клетки-мишени, и одной А-субьединицы, которая проникает в клетку и останав-

ливает синтез белка за счет инактивации большие субьединицы и>*-босом. что приводит к гибели клетки.

1. Изучение положения генов вига-токсина в геноне различных зташов Shigella dysenterlae 1.

Детерминанты, определяющие продукцию шига-токсина, локализованы на хромосоме Sii. dysenleriae 1. Однако, генетический анализ дал противоречивые результаты: в работе SekizaV.1 Т. et ai. [1987 3 эти детерминанты (slit) были сцеплены с маркерами tri*-pyrr, а в работе Tiramis К.Ь. et al. [19853 - с маркерами argE-asiiA. При клонировании иэ хромосомы Sli■ dysenterlae 1 60R величина ЕеoRl-фрагмента ДНК, несущего гены шига-токсина, составила 4,2Kb [Козлов Ю.В. и др., 5987], а из хромосомы Sli.ayьенгt— riae 1 381ST - 0Kb [Strockbine К.A. et al., 1988]. Эти фактк можно объяснить либо неидентичпос-i ьк генетических и физических карт хромосомы у разных итаммов, либо наличием в геноме Sli.ay-sentei" 1 ае 1 двух копий генов slit. Кроме того, непосредственнс. перед sht генами, клонированными в составе плазмиды PSHT23 иэ Sh.dyseateriae 1. 60R, была найдена последовательность, почт!', идентичная последовательности 13600-элемента Sli.soimei [Kozloi Yu.V. et al.,1988], но не фланкированная прямыми повторами, характерными для независимо передающихся IS-элементов. Это указывали на то, что гены шига-токсина, возможно, входят в состав транспозона, что объяснило бы их картирование в разных локусах-Это также могло быть и причиной нестабильности крупных фрагментов ДНК, несущих гены sht, в составе R-плазмид [Timmis K.S. et a I., 1980], или при клонировании в космидах [Козлов Ю.В. и др., 1987]. С другой стороны, к 0'-концу найденного IS-элемента прилегает участок из 120 нуклеотидных пар, представляющий собой инвертированный повтор его 3'-концевой последовательности. Такое необычное строение этой области ь свете вышеупомянутой нестабильности предполагало к возможность случайного появления IS-элемента ь составе клонированного 4,2Kb EcoRI-фрагмента рядом с slit генами в результате перестроек.

Для прояснения ьсех этих вопросов нами было проведено изучение района хромосомы Sh.Oysenteriae 1 60R < а также других

штаммов), несущего sht-гены, с помощью блот-гибридизации геномной ЛНК си специфическими одноиепочечными ДНК-зондами, комплементарными различным участкам EcoRI-фрагмента плазмиды pSHT23 (см. рис.1.). Использованные зонды и рестриктазы представлены ь табл. 1.

Результаты гибридизации, говорящие о том. что в хромосоме Sh.dysenteriae 1 60R действительно есть область, имеющая рест-риктную карту, совпадающую с картой клонированного 4,2Kb EcoRI-фрагмента, представлены на рис.2. В хромосоме присутствует также 10-20 копий 13-элемента, причем одна из них лежит перед генами slit и имеет структуру, идентичную ранее найденной (включая прилегавший инвертированный повтор в 120 пар нуклеотидов). Более того, мы получили одинаковую картину гибридизации с ток-син-специфичеокими зондами для Sh.dysetneriae 1 60R и 263R, а

Е IS600 sht A sht В Е

- 1 1 • j ,

i м i ; В;; S s' 'a ic

"б н ъ! Т -Гз"

ИЗ

Рис.1. Общее строение ЕсоЯ1-фрагмента ДНК,клонированного из генома 511.0у$еп1епае 1 60к ь составе плазмиды р5НТ23,и схема получения зондов. Прямоугольниками обозначены кодирующие части генов ьЫА и $111В. Область, гомологичная-13600 элементу, обозначена толстой линией с треугольниками на концах-Крупными стрелками обозначены большие инвертированные повторы в 120 пар нуклеотидов. Тонкими линиями обозначены фрагменты ДНК, клонированные в составе Фага М13вр8. Буквами обозначены сайты растриктаз: Е-ЕсоК1. А-Аес1. В-ВвШ. С-СГ г1. Н-ШтП 11. М-М1и1. 5-Мвр1 . Волнистыми линиями со стрелками обозначены направления считывания с одноиепочечных матриц при синтезе соответствующих ДНК-зондов (номера зондов указаны под стрелками).

Табл.

ДНК

Sh. dysen-teriae 1 60к

обрабатывали реетриктазами

E¡ . BI I, HI11, BI. HI , РП . BHI, EJ+BI), EJ+HIII. EI+BI. Е]+Н;, EI+BI1+HIII, BÍI+HIII. BIÍ+B1. НШ+В1. HIII+Hi

те же, что и для 1. 3, 6, а также P1I+EI .РП+НШ . MI. М1+Е1, М! +ВП

El. BHI, HUI, PI:

гибрлдизиьа.'ы с зондами

Ь

¡ El. BU, HUI, BU, Е1+НП1. I 0 i ei+bii. Bii+Hiii. Ei+Hin+в;; í

Обозначения: EI-EcoRI. BI I - Bglll, Hin-Hindlll, BI-Bti',.

HI-Hpal, PII-PvuII, BHI-BamHI, MI-MluI.

Табл.2.

ДНК | обрабатывали рестриктазамн | гибридизоналг

Sh. clysenteriae 1 i I с зондам!.

60R, 263R | El, ВП, HIII, El+h'IÜ,

I EI+BII, BII+HIII, EI+HII1+Б1I

60R, 312, 2338, | BHI. El. HIII, PII í í 2 4, !,.'»

3208 i !

177, 237, 519, | BHI, Ei 1 ?.,

S04, 2408 3225 | ¡

177, 173, 237, ¡

239, 240. 019, | KIIl 1 , í , o , i

904, 2358 2456,¡

3225 I :

е = с = = =====

Обозначения, как и в табл. i.

Рис.2.Схема строения участка хромосомы Sh.dysen-terlae 1 60R, несущего гены sht. Тонкими линиями с двойными стрелками обозначены фрагменты, которые обнаруживаются при блот-гиб-ридизации хромосомной ДНК со специфическими зондами и соответствуют рестриктной карте клонированного ранее EcoRI-фрагмента. Тонкими линиями с одинарными стрелками обозначены фрагменты, один конец которых лежит в ЕеoRl-фрагменте, а другой за его пределами (сбоку указана соответствующая рестриктаза). Над линиями указаны номера зондов, с помощью которых выявляется данный фрагмент, а в фигурных скобках - величины фрагментов (в КЬ). Буквами обозначены рестриктазы: B-BglII; E-EcoRI; G-Bgll: Н-Hindlll; M-Mlul: P- PvuII; X-Hpal.Остальные обозначения - как на рис.1.

также ряда штаммов-клинических изолятов ( см. табл.2.).

По-видимому, у всех штаммов гены sht тесно сцеплены с IS-элементом. В геномах всех штаммов независимо присутствует 15-го копий IS-элемента (т.е. примерно столько же, сколько в геноме Sit. (lysenteriae 1 60R). причем штаммы различаются по положению одной-двух копий, хотя в целом картина сходная. Следует отметить, что несущий гены токсина фрагмент ДНК из Sil. d.vseiiteriae 1 3818Т имеет отличающуюся структуру, причем несовпадение затрагивает только ту область, где у использованных нами штаммов лежит IS-элемент. Поэтому было бы интересно сравнить сцепление sht генов с генетическими маркерами.

__________ ______ ________________.=_а_*_

х.-UM1_н

2:3 { 8.5}

23 {7.5)___|М

123 { ШО)

12:3:4:5:6

М HB X Н G

■_1_I I

!• IS60P * sht А s MB

р * Т

а <б.о}

Г" TS (9.0) Ol—-

HM ни -HB

--- -j

' : .!

i 123 i

j : , i 1:3:4 {5.5}

t 3

HH

2i _t | 3 { 6.5} 125 . 13

-IG

4Kb

2

Сцепленное расположение IS-элементов и sht генов в хромосоме всех изученных нами штаммов Sh.dysenterlae 1 и идентичность прилегающих к sht генам участков свидетельствуют в пользу того, что эти структуры, возможно, входят в состав тран-спозона. Наши данные не отвергают также и наличия в геномах двух или более копий такого транспозона, если этот последний имеет достаточно крупные размеры.

2. Индукция фага НЗО. Клонирование и секвенирование фрагмента ДНК, несущего гены вига-подобного I токсина (slt-I).

Хромосомная ДНК штамма E.coll ЕРЕС 026:Н11 НЗО, который служит классическим объектом для выделения шига-прдобного I токсина, также гибридизовалась с зондами, специфичными к генам шига-токсина. Поскольку известно, что slt-I гены переносятся ».-подобными умеренными бактериофагами, мы попытались индуцировать в штамме E.coli НЗО выход фага из лизогенного состояния. С помощью инкубации культуры клеток в присутствии митомицина С нам удалось получить лизат, содержащий частицы фага,дающего бляшки на газоне штамма E.coli С600. По стандартным методикам, разработанным для фага х, мы получили лизат высокого титра и выделили фаговую ДНК. 8,5Kb EcoRI и 3,4КЬ Kpnl фрагменты, которые гибридизовались с токсин-специфическим зондом 2, клонировали в составе плазмид pBR322 и pUC18 соответственно. Обе полученные плазмиды обусловливали продукцию больших количеств шига-подобного I токсина в клетках E.coli IIB101 и JM103. Таким образом, в штамме E.coll НЗО детерминанты, ответственные за продукцию шига-подобного I токсина, входят в состав лизогенного умеренного к-подобного бактериофага НЗО.

Определение нуклеотидной последовательности клонированного Kpnl-фрагмента ДНК проводили химическим методом. Секвенирование проводили от сайтов рестрикции, расположенных как в полилинкере плазмиды, так и в Kpnl-фрагменте. На рис.3, представлена стратегия секвенирования.на рис.4. - общее строение, а на рис-5. - нуклеотидная последовательность Крп1-фра-гмента.

В приведенной нуклеотидной последовательности было найдено три открытых рамки считывания (ОРС) : А, В и С. Термини-

fcjral

TaqI

Mspl

Belli

Hlndlll

tpr.: BmHII ХавШ BaaHI Ncol alii I

1Kb

Рис.3. Стратегия секвенирования клонированного Крп!-фрагмента ДНК. Стрелками обозначено направление секвенирования и размеры секвенированных областей. Секвенирование проводили от указанных сайтов рестрикции, лежащих в данном фрагменте.

В

1КЬ

Рис.4. Общее строение клонированного 3.4КЬ Крп1-фрагмента ДНК. Прямоугольником обознаначен КрпI-фрагмент, горизонтальными стрелками - открытые рамки считывания, волнистой линией с точкой -транскрипт, образующийся на опероне шига-подобного I токсина.

GACTAGAAACAGCAGAAGTGAGGCCGCATGACGTTCACCGTAAAAACCATTCCTGACATG 60 CTCCTTGAGGCATATAGGAAATCAGTCCGAGGTAGCCCGAATACTGAACTGCAATCGTGC 120 CACAGTCAGAAAATACATTGGCGATAAAGAAGGGAAAAAGCACGCCGTCGTCAATGGCGT 180 CCTTATGGTTCATCGCGGATGGGGTAAAGATACTGATGCGTGATATCCGGCAGGTTCTTG 240 AGCGCTGGGGGGCATGGGCGGCAAATAACCATGAGGATGTTACATGGTCGCCCATTGCTG 300 CCGGATTTAACGGACTGATCCCCGAAAAAGTAAAATCACGTCCACAGTGTTGTGACGATG 360 ACGCGATGATTATATGCGGGTGTATGGCTCGCCTTAACAGGAACAACAGCGATCTGCATG 420 ACTTGCTGGTTGATTATTACGTGTTGGGGGAGACGTTCATGGCCCTGGCACTCGCACGGA 480 AACATGGGTGCTCTGACACCTGTATAGGTAAACGCCTTCACAAAGCGGAGGGGATTGTTG 540 AAGGCATCCTGATGATGCTGGGAGTGAGGCTTGAGATGGATCGGTATGTTGAGCGTGAAT 600 TGCCGGGAGGGAGAACCTCTGTATTTTATCAGCGAAAAAATAGTTTACGATCGTAAAAAT 660 CTGCATATCATGATAAGAGTCGTTACATTGCCACGCTGCTTAACCCGCCGATGCGCGGGT 720 TTTTTTGTACCCAGAATCCTGTGAGCTATACGGAAAGTACACAGAAAGGAAGGTGCGACC 780 ACAATTAATAACAAAATCTTAAAAATTGCACATGGCACTATTAGTTTTCTAAATATTGTG 840 TATTTTTTGTATTGCAGGATGACCCTGTAACGAAGTTTGCGTAACAGCATTTTGCTCTAC 900

GAGTTTGCCAGCCTCCCCCAGTGGCTGGCTTTTTTATGTCCCTAACATCCTGTGTATCAA 360 TAAATGTTGTTATCTACGTACGTCAAGTAGTCGCATGAGATCT GACCAGATATGTTAAGG 1020

-35 -10

TTGCAGCTCTCTTTGAATATGATTATCATTTTCATTX^CCTTATTGTTACGTTTATCCGGT 1080

GCGCCGTAAAACGCCGTCCTTCAGGGCGTGGAGGATGTCAAGAATATAGTTATCGTATGG 114 С

S.D. MK.I I I FRVLLFFF i

TGCTCAAGGAGTATTCTCTAATATGAAAATAATTATTTTTAGAGTGCTAACTTTTTTCTT 1200 I

VI FSVNVV KEFTLDFSTAK I

TGTTATCTTTTCAGTTAATGTGGTiCCCGAAGGAATT,TA,C.CTTAGACTTCTCCACTGCAAA 1260 !

. I

T с I

TY VDSL NVI R S A I GTPLQT I Í

GACGTATGTAGATTCGCTGAATGTCATTCGCTCTGCAATAGGTACTCCATTACAGACTAT 1320 !

(T) I

SSG GTSLLMI DSGSGDNLFA I

TTCATCACGACGTACCTCTTTACTGATGATTGATAGTCGCTCACGGGATAATTTGTTTCC 1380 i

t

A I

vdvrgidpeecrf'nnlrliv !

AGTTGATCTCACAGGGATAGATCCAGAGGAAGCGCGGTTTAATAATCTACGGCTTATTGT 1440 |

ERNNL-YVTGFVN RTNNVFYR I

TGAACGAAATAATTTATATGTCACAGGATTTGTTAACAGGACAAATAATGTTTTTTATCG 1500 I

FADFSHVTFPGTTAVTLSGD A

CTTTGCTGATTTTTCACATGTTACCTTTCCAGGTACAACAGCGGTTACATTGTCTGGTGA 1060 ¡

SSYTTLQRVAG-I SRTGMQ I N |

CAGTAGCTATACCACGTTACAGCGTGTTGCAGGGATCAGTCGTACGGGGATGCAGATAAA 1620 ¡

RHSLTTSYLDLMSHSGTSLT I

TCGCCATTCGTTGACTACTTCTTATCTGGATTTAATGTCGCATAGTGGAACCTCACTGAC 1680 I

QSVARAMLRFVTVTAEALRF i

GCAGTCTGTGGCAAGAGCGATGTTACGGTTTGTTACTGTGACAGCTGAAGCTTTACGTTT 1740 1

R QIQRGFRTTL DDLSCRSYV ¡

TCGGCAAATACAGAGGGCATTTCGTACAACACTGCATGATCTCAGTGGGCGTTCTTATGT 1800 I

MTAEDVDLTLNWCRLSSVLP ' ^ i

AATGACTGCTGAAGATGTTGATCTTACATTGAACTGGGGAAGGTTGACTAGTGTCCTGCC 1860 i

DYHGQDSVRVGRISFGSINA !

TCACTATCATGGACAAGACTCTGTTCGTGTAGGAAGAATTTCTTTTGGAAGCATTAATGC 1920 i

ILGSVALI LNCHHHASRVAR I

AATTCTGGGAAGCGTGCCATTAATACTGAATTGTCATCATCATGCATCGCGAGTTGCCAG 1980 :

MASDEFPSMCPADCRVRGIT

AATGGCATCTGATGAGTTTCCTTCTATGTGTCCGGCAGATGGAAGAGTCCGTGGGATTAC 204C :

H N К. I LWDSSTLGAILMRRT1 !

GCACAATAAAATATTGTCGGATTCATCCACTCTGGGGGCAATTCTGATGCGCAGAACTAT 2100 I S S • S.D. MKKTLLIAASLSFF _|

TAGCAGTTGAGGGGGTAMATGAAAAAAACATTATTAATAGCTGCATCCCTTTCATTTTT 2160

S A S A L A |_T_ PDCVTGKVEYTKV TTCAGCAAGTGCGCTCCCGACGCCTGATTGTGTAACTGGAAAGGTGGAGTATACAAAATA 2220

KDDDTFTVKVCDKELFTNRW TAATGATGACGATACCTTTACAGTTAAAGTGGGTGATAAAGAATTATTTACCAACAGATG 2280

KLQSLLLSAQ ITGMTVTIKT GAATCTTCAGTCTCTTCTTCTCAGTGCGCAAATTACGGGGATGACTGTAACCATTAAAAC 2340

NACHNGGGFSEV I F R * TAATGCCTGTCATAATGGAGGCGGATTCAGCGAAGTTATTTTTCGTTGACTCAGAATAGC 2400 TCAGTGAAAATAGCAGGCGGÀGATTCATAAATGTTAAATACATCTCAATTCAGTCAGTTG 2460 TTGCCGGTCTGATAATAGATGTGTrAGAAAATTTCTGCATGGTGAATCCCCCTGrGCGGA 2520 GGGGCGACTGGTGAACGGTATGATCTCTTTGATGATCGTAAGCGAGAATACGCGGGTTTG 2080 GTGGCACCAGGCCCAACTCACCGGGAGGCACCCGGCATCATGC'TGXATACAGAGATTAGG 2640 CATATATCCAGGCTCCTCATCGCAGGAGCCTTTTTACATGCAAAAAAAAGCCCGAGTGGG 2700

TTCGGGCAACAGCATGAGATACTTGCATTGÎCATTTTTATCGTGCGGATTTTAACCAGGA 2760 TTCATAAGGCTGCGCAACTGCGCGGCCTTTTTCGTATTTCGGGCTGTAGTCCCCGTGTGT 2820 CATTCAGGCTTCCGGACTACAGCCCACTCCATATCTGATTTAATACACTATCCCGGCCGG 2880

MTFKHYDVVRAASPSDL I

GAGGAATAATGACATTTAAACATTATGATGTTGTCAGGGCGGCGTCGCCGTCAGACCTTG 2940 I

AEKLTHKLKEGWQPFGSPVA I

CGGAAAAGCTGACACACAAACTGAAAGAGGGCTGGCAGCCGTTTGGTAGTCCGGTGGCCA 3000 I

1 TPYTLMQA I TAEGDVVVSG I

TAACCCCTTATACCCTGATGCAGGCGATTACAGCAGAAGGTGATGTCGTGGTCAGTGGTG 3060 I

ATEPDWYYV I VLAGQSNAMA I

CAACTCACCCGGATTCGTACTACCTCATCGTACTCCCCGGGCÂGTCCAATGCCATGGCTT 3120 I

YGEGLPLPDSYDAPDPRIKQ С

ACGCTGAAGGGCTTCCGCTGCCGGATTCATACGATGCTCCGGATCCGCGCATTAAACAGC 3180 1

I

LARRSTVTPGGAACRYNDI I I

TGGCGCGCCGCAGTACAGTGACGCCGGGTGGGGCTGCCTGCAGATATAACGATATTATTC 3240 I

PADHCLKDVQDWSTLNHPKA I

CGGCCGACCACTGCCTGCATGATGTGCAGGATATGAGTACGCTGAATCATCCGAAGGCAG 3300 I

DLSKGQYGCVCQGLHIAKKi. ACCTGAGCAAAGGGCAGTACGGCTGTGTCCGCCAGGGCTTACATATTGCCAAAAAACTGC 3300 LPD I PKNAG I LLVPS TCCCTGATATCCCGAATAACGCGGGGATCCTGCTGGTACCGAGCTC

Рис.О. Нуклеотидная последовательность 3.4Kb Kpni-фрагменть ЛНК. Справа от нуклеотидной. последовательности обозначены открытые рамки считывания: А и В, кодирующие, соответственно, А к В субъединицы шига-подобного I токсина, и С, кодирующая полипептид неизвестной принадлежности. Участки, по которым происходит отшепление сигнальных пептидов в полипептидах ОРС А и В, обозначены ломаной стрелкой. Подчеркнуты "-35" и "-10" области промотора оперона slt-I и S.D.-последовательности.Горизонтальными стрелками обозначены инвертированные повторы. Знаком х обозначено положение 5'-конца токсин-специфической мРНК. Волнистой линией подчеркнута последовательность предполагаемого р-незани-симого терминатора. Прерывистой линией подчеркнуты последовательности, комплементарные олигонуклеотидам, использовавшимся для определения положения 5'-концов токсин-специфических мРНК.В области ОРС А звездочками подчеркнуты нуклеотиды, по которым последовательность структурных генов шига-подобного I токсина отличается от таковой шига токсина [Козлов Ю.В. и др., 1987.). Е скобки взят аминокислотный остаток полипептида ОРС А, по которому отличаются шига и шига-подобный 1 токсины. Знаком * обоь-начены нуклеотиды, с которых прекращается полное совпадение с последовательностью фрагмента, несущего sht гены.

рующий кодон ОРС С находится за пределами секвенированной области. ОРС А и В разделены 12 парами нуклеотидов. Их последовательность полностью совпадает с последовательностью slt-1 генов, клонированных из фагов Н19В [De Grandis S. et al.,1987] и 933J [Jackson M.P. et al., 1987].Только 3 нуклеотидных замены в OFС А отличают последовательность slt-I генов от последовательности sht генов из Sh.ûysenteriae 1 60R [Козлов Ю.В. и др., 1987] v 3818Т [Strockblne N .A. et al., 1988],причем только одна из ни), приводит к замене 45-й N'-концевой аминокислоты треонина на серии. Аминокислотная последовательность зрелых полипептидов, кодируемых ОРС А и В, определенных нами с помощью правил von Heî-Jne G. et al.[1986], в дальнейшем подтверждена прямым анализов

- 14 -

-35 -10 ТТСаса-----------------TAtaaT

2. 5'- TAAGCTTCCACCTCTCTTTGAATATCATTATCATTTTCATTACCTTAT -3' 1015 -35 -10 - 1063

3. 5'- GATAATGATAATCATTATC -3'

»» •«**» ***•*« **

Рис.6. Гомология нуклеотидных последовательностей обобщенного промотора E.coli (1.), промотора генов slt-1 (2.) и обобщенного участка связывания Fur-белка (3.). В обобщенном промоторе большими буквами обозначены нуклеотиды. встречающиеся в промоторах E.coli наиболее часто.Двумя чертами подчеркнут нуклеотид, на котором инициируется синтез токсин-специфической мРНК. Звездочками в последовательностях 1 и 3 обозначены нуклеотиды, совпадающие с таковыми в последовательности промотора slt-I генов. Стрелками обозначены инвертированные повторы. Отмечены "-35" и "-Ю" области промоторов.

первичной" структуры А и В субьединиц [Talcao Т. et al., 1986J. Перед 0РС А и В найдены последовательности, гомологичные последовательности учаотка связывания рибосом Шайн-Дельгарно [Shine J. and Delsarrio L., 1970].Перед OPC А лежит последовательность, сходная о последовательностью обобщенного промотора E.coli [Haw-leu D.K. and McClure K'-R. 1983], и имеющая хорошо выраженные "-30" и "-10" области, разделенные 17 нуклеотидами (см. рис.6). &та последовательность полностью совпадает о таковыми, найденными для slt-I и sht генов. "-Ю" область входит в состав инвертированного повтора, имеющего ярко выраженную гомологию с участком связывания Fur-белка E.coli tDeLorenzo V. et а)., 1987], участвующего в железозависимой экспрессии ряда генов.

После ОРС В расположена последовательность р-незавиеимого терминатора (Brendel V. et al., 1986]. представляющая собой инвертированный повтор длиной 8 нуклеотидов с петлей в 6 нуклео-тидов. непосредственно после которых расположены 4 уридиновых остатка (см. рис.7.). Эта последовательность полностью совпадает с таковой slt-I генов иг фага Н19В (хотя расположена на 1

нуклеотид далее относительно предполагаемой точки начала транскрипции) [De Grandis S. et al., 1987], но не совпадает с таковой sht генов [Kozlov Yu.V. et al., 1988], и расположена на 3 нуклеотида дальше от точки начала транскрипции.

slt-1

С С А G С С U-A C-G C-G U-A C-G G-C 5" G-C AUCCA-HUUUU 1089

3"

sht

С С U G C-G U-A C-G C-G C-Ç C-G 5' G-C CUCCA-UUUCUU 1086

3'

Рис.7. Вторичная структура, образуемая мРНК в области предполагаемого р-неэависимого терминатора транскрипции slt-I и sht оперонов.Числа у крайних нуклеотидов указывает на их положение относительно точки начала транскрипции (см. рис.6.).

За исключением отдельных замен (вставок, делеций) в прилегающих к slt-1 генам участках нуклеотидная последовательность Kpnl-фрагмента совпадает с опубликованными последовательностями фрагментов ДНК, несущих гены токсина, из фагов Н19В и 933J [De Grandis S. et al., 1987; Jackson M.P. et al., 1987]. Вероятно, гены slt-I попали в состав геномов фагов из одного.источника относительно недавно, так что мутационный процесс привел лишь к небольшим изменениям последовательности ДНК а малозначащих районах.

С другой с?ороны,последовательности slt-1 и sht опероноз практически идентичны, хотя и различаются в районах термккгто-ров. Последовательности перед slt-I и slit генами полностью совпадают до 15-элемента,а далее имеет значительную гомологию (52* при выравнивании). Область, лежащая за терминатором slt-I генов, имеет с областью, лежащей за терминатором sht генов, еще

большую гомологию (64* при выравнивании). Все это. а также данные Stroekbine et al. U988) о наличии в хромосоме Sh.dysente-riae 1 3818Т участков гомологии о ДНК ^-подобного токсин-конве-ртируюшего фага 933J, указывает на возможность того, что гены slit появились ь геноме Shigella ь результате переноса умеренными фагами. Однако, нельзя полностью исключить и участие в этих процессах транспозонов. Возможно, использовались оба пути.

3. Изучение проыоторных свойств участка ДНК. расположенного перед геном shtB ( sltB-I ).

Анализ первичной последовательности предполагает наиболее вероятной следующую модель экспрессии slt-I (и sht) оперона: А и В субьединицы токсина синтезируются с бицистронной мРНК.транскрибирующейся с регулируемого промотора, расположенного перед sltA-I геном. Инициация трансляции индивидуальных субьединиц происходит с независимых участков связывания рибосом, и существование для гена sltB-I собственного S.D. участка, по-видимому, обеспечивает неэквивалентное соотношение количеств А и В субьединиц. Это соотношение, однако, может достигаться и за счет синтеза дополнительной моноцистронной.B-специфической мРНК.

Для проверки существования у гена slitB собственного промотора Alul-фрагмент ДНК (411 пар оснований), несущий С-концевую часть гена shtА. S.D.-последовательность и N-концевую часть гена slitB, клонировали в достроенный до тупых концов SalGI-сайт плазмиды YEp357 (см. рис.8 А). При этом N-концевая часть гена shtB сливалась с сохранением рамки считывания с кодирующей частью гена е-галактозидазы (lacZ/, так что-образующийся химерный ген sbtB-LacZ должен определять синтез белка, обладающего Э-га-лактозидазной активностью. Штамм E.coli JM103, несущий полученную плазмиду рА357, давал окрашенные колонии на богатой среде с XG&1, что говорит о наличии в клонированном Al и]-фрагменте участков, способных инициировать транскрипцию. Для выяснения положения этих участков был получен набор плазмид, содержащих делении в последовательности Alul-фрагмента перед началом shtB-гена (рис.8 Б.).Такие плазмиды обусловливали продукцию Р-галак-тозидазы в ¡втамме E.coli JM103, причем тестируемая активность равномерно возрастала с увеличением размеров сохраняемого участка перед началом гена slitB-lacZ без резких скачков или выхода

- 17 -

1 п-' __К1»! »на; ье)с: пи мни с.

«кгароашяе. траие«о{нм1м» С.сеЛ ЛП02

5»1С1N11 ЭрМ Н1аЛЛ)

структур» с тми 11кЬ-1*с2

• 11*7 рГОв

I ДТА стсслсстдашаицлссттрсг ссс • з'

та«, чралсфоэиьш«» I сс!1 Л1.0

Ьсая:,

Ьв!3 ишаг Мепем

«кг иро»«и»е. траигформлил* £ е©11

и "Г

Рис.8. Схема получения плазмиды рА307 (А.) и ее делеционных производных (Б.).

лт

:о< 101

о ц

Рис.9. Зависимость продукции 3-галактозидазы, обусловленной делеционными производными плазмиды рА357, от величины участка ДНК. сохраняемого перед впгв-1асг-геном. По оси абсцисс отложена величина сохраняемого фрагмента в нуклеотидных парах. По оси ординат - тестируемая активность 8-галактозидазы (в^ед.Миллера). Каждая точка определялась по результатам пяти независимых экспериментов. Соответствующий каждой точке фрагмент ДНК обозначен тонкой штриховой линией.

Вя«11 I

. а

г I

на плато ( см. рис-9 ). Такая кривая зависимости активности от длины фрагмента свидетельствует об отсутствии в этом фрагменте четко локализованного участка, обладающего выраженными промото-ркыми свойствами, и подтверждает данные компьютерного анализа нуклеитидной последовательности. По-видимому, обнаруживаемая промоторная активность является результатом неспецифической инициации транскрипции на участке ДНК, не имеющем терминатора и представленном в составе мультикопийной плазмиды. В пользу этого говорит и тот факт, что плаэмида рВА307 дает в 4-6 раз большую продукцию ß-галактозидазы, чем плазмида рНАЗОТ, т.е. промитир, лежащий перед sltA-1 геном, ь 3-0 раз активнее участка ДНК, лежащего перед sltB-I геном (см. рис.10)-

pstfir?.

I I

LTHI-A-Cl Н1шШ1*Асс1

i I

ХОСТРЛИР1НИ- ГЛН'1'H« YLp*57 дострмВ&НИ» Кденовмм

Рис-10. Схема получения плазмид рВАЗО? и рНАЗОТ.

iriutf фрагмента

дмгвровани« и трвн'Ф^рнаиия Е.соИ JM103

"1

ю1/Вк1П Hindll I acci/SbüI Sml/Hlndlll AcrJ/Sial

I rtilA I AB ! 1ас2 I ДА ABi'lacZ

!j' 'и ьд H—т

P S.L.

S.D. РМЛ1Т.7

' * c*' * IXAcctgcagä:AJÜCAACUTm. .-

Если бы большее количество В-еубъединицы по сравнению с А-субьединицей обусловливалось просто наличием дополнительного промотора, следовало ожидать обратную картину. Существует и еще одна возможность: считываемая с лежащего перед 5игВ геном^мРТГк более стабильна, чем основная бицистр'онная. За счет этого могли бы обеспечиваться большее, по сравнению с А-специфической, количество В-специфической мРНК, и, соответственно, более эффективная продукция Б-субьединицы. В этом случае, по-видимому, следовали бы ожидать наличия В-специфической мРНК в количестве, по крайней мере, не меньшем, чем основной бицистронной. Однако,, анализ с помощью метода удлиняющейся затравки (см. ниже) отвергает такую возможность.

- IS -

4. Картирование 5'-концов uPHK. кодирующих полипептиды иига-подобного I и иига токсинов.

Для определения участков инициации токсин-специфической мРНК был использован метод удлиняющейся затравки [Uhlent M. et al.,1982]. позволяющий картировать О'-концы мРНК. Меченные оли-гонуклеотиды, комплементарные началу ОРС А и ОРС В (см. рис.4.), были использованы в качестве специфических затравок в реакции синтеза комплементарной ДНК на суммарной РНК, выделенной из штамма E.coli JM103, несущего плаэмиду PSLT318 (slt-i оперон) или pSHT23 (sht оперон). Идентичность последовательностей промоторов slit и slt-1 генов предполагает сходные механизмы их регуляции. Известно, что продукция токсинов клетками Sh-dysente-riae 1 60К и E.coli ИЗО сильно увеличивается при недостатке свободных ионов железа в среде (и является низкой при их избытке). Поэтому, в ряде случаев,для связывания свободных ионов железа к среде, на которой выращивали клетки, добавляли хелатор железа - дипиридил. Вновь синтезированную ДНК анализировали электрофорезом в секвенируюшем геле. На рис.11, представлены результаты одного из таких экспериментов. При использовании А-специфической затравки положение наиболее интенсивных полос для slt-1 геноь и sht генов одинаково (см. рис.11 А.). Нуклеотид, соответствующий О1-концу специфической мРНК, в обоих случаях находится на расстоянии 7 нуклеотидоь от "-10" областей предполагаемых промоторов, найденных при помощи компьютерного анализа первичных последовательностей. Такое положение точки инициации транскрипции является вторым по частоте встречаемости в Е. coli [Ilarley В. et al., 1987] и совпадает с данными других работ [De Grandis S- et al., 1987,-Kozlov Yu.V. et al., 1988].При использовании В-спенифической затравки по всей длине геля обнаруживается большое количество полос, положение которых одинаково для slt-I и slit генов (рис.11 Б.).Их интенсивность близка к • интенсивности минорных полос, видимых при использовании А-спе-иифической затравки, и гораздо слабее интенсивности основных полос ( см. рис.11 А. ). По-видимому, в обоих случаях эти полисы появляются в результате деградации основной бицистронной мРНК. Как видно, в мультикопийном варианте гены токсинов практически полностью дерепрессированы даже при избытке свободных

- 20 -

12 Б. 123

Рис. 11. Определение положения 5'-концов токсин-специфической мРНК. А. кДНК, синтезированная на суммарной РНК с использованием А-епецифической затравки. 1 - РНК из Е-culi JM103 ( jjSLTSI 6 > ; 2 - РНК из E-culi JM103 ( pSHT231 . 1 и 2 - клетки вынашивали На среде 2YT (избыток железа). Слева в качестве маркеров нанесены продукты реакции ли Sangei et al.[1977] с одно-иепочечной матрицы ДНК шага БХшиЬ, несущего смысловую испъ ге-lior ilî-i . с использованием том же затравки. Стрелкой указано положение С'-концов основных slt-1 и sht специфических мРНК. Ь- кДНК. синтезированная на суммарной РНК с использованием Ь-иПециФнчеиКоГ', затравки. 1.3- РНК из JM103 ( pSLT318 Í ; 2 -•'Иг. i;;- JMl03(pSHT23) . 1,2- клетки выращивали на среде 2YÏ ; t - на lof: же среде.ни с добавлением дипиридила до 200 мкМ/мл. С-.ъевь нанесены продукты реакции по Sango с матрицы ВХшрБ v использованием Ь-специшической затравки.

Рис.12. Определение 5"-концов токсин-специфической мРНК, продуцируемой штаммами S)i. dysentí— rlae 1 60R и E.coli H30. А -кДНК, синтезированная с использованием A-специфической затравки; Б - кДНК. синтезированная с испльзованием В-специфической затравки. 1,3- тотальная РНК из Sh.dysenteriae 1 60R; 2,4-тотальная РНК из E.coli НЗО. 1,2- клетки выращивали на среде 2YT с добавлением дипиридила; 3, 4 - клетки выращивали на среде 2YT. Маркеры на А и Б те же, что и на рис. 11.

ионов железа, и не наблюдается сколь-нибудь заметной индукции транскрипции токсин-специфической мРНК при их недостатке (см. рис.11 Б, дорожка 3). Кроме того, в случае slt-I генов (см.рис. 11 А, дорожка 1) имеются интенсивные полосы, соответствующие специфической мРНК больших размеров, чем основная, что говорит о возможной экспрессии этих генов в составе мультикопийной пла-змиды и с других промоторов.

Как отмечалось выше, "-10" области промоторов генов шига и шига-подобного I токсинов входят в состав инвертированных повторов, имеющих выраженную гомологию с участком связывания Fur-белка. В работе Calderwood S.B. and Mekalanos J.J. [1987] била прямо показана негативная регуляция экспрессии slt-1 генов продуктом локуса fur E.coli. Мы также наблюдали увеличение продукции токсин-специфической мРНК при выращивании штаммов в условиях недостатка свободных ионов железа как для slt-1 генов E.coli НЗО, так и для sht генов Sh.dysenteriae 1 60R (см. рис.12.).По-видимому, продукция шига и шига-подобного I токсинов регулируется на уровне транскрипции, причем в железозависимой экспрое-

сии sht генов в Sh. dysenteriae 1 участвует репрессор. сходный с продуктом гена fur Е. col 1.Возможно. в составе мультикопийных плазмид опероны токсинов не регулируются в клетках E.coli из-за недостаточного количества Fur-белка. Следует также отметить, что наблюдается практически одинаковая картина деградации токсин-специфической ыРНК в Sh.dysenteriae и E.coli. Кроме того, для s 11—I генов в хромосоме E.coli НЗО не наблюдается экспрессии с расположенного дистально дополнительного промотора.

Совокупность данных подтверждает модель, согласно которой sht и slt-I гены транскрибируются сходным образом как один оперон в виде бицистронной мРНК, а необходимое соотношение субье-диниц токсинов, вероятно, достигается на уровне трансляции.

ВЫВОДЫ.

1. В штамме Escherichia coll ЕРЕС 026:Н11 НЗО гены, ответственные за продукцию шига-подобного I токсина, входят в состав лизогенного умеренного фага НЗО. Определена первичная последовательность оперона шига-подобного I токсина. Выявлена значительная гомология, между участками ДНК, непосредственно прилегающими к оперону шига-подобного I токсина из умеренного фага НЗО и оперону шига-'токсина из Shigella dysenteriae 1 60R.

2. Гены,ответственные за продукцию шига-токсина, лежат на участке хромосомы, имеющем идентичную структуру у всех 15 исследованных штаммов Shigella dysenteriae 1, и тесно спеплены с lS-олементом. Независимо в геномах присутствует 15-20 копий IS-элемента, причем штаммы различаются по положению 1-2 копий.

3. На оперонах шига и шига-подобного I токсинов синтезируется бицистронная мРНК, имеющая одинаковое положение 0'-концов. В штаммах Sh.dysenteriae 1 60R и E-coll НЗО продукпия токсин-специфической мРНК регулируется содержанием свободных ионов железа в среде. Приведены свидетельства в пользу того, что необходимое соотношение количеств А и В субьединиц токсинов достигается на уровне трансляции.

Список'работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Ю.В.Козлов, Е.Н.Дубинина, Е.В.Лукьянов, А.А.Баев. Механизм действия шига-токсина.-ДАН СССР. 1988, т.302. 1, с-226-228.

2. Ю.В.Козлов, А.А.Кабишев. Е.В.Лукьянов, Е.Н.Дубинина, А.А.Ба-

«

ев. Структура оперона шига-токсина; механизмчдействия токсина.-Тезисы докладов 6-го симпозиума СССР-Италия "Макромолекулы в Функционирующей клетке". Ленинград, 1988.

3. Yu.V. Kozlov, A.A. Kablshev, E.V. Lukyanov, and A.A. Bayev. The priaary structure of the operons coding for Shigella dysen-tertae toxin and temperate phage H30 shlga-lllce toxin-- Gene, 1988. v.67, p.213-221.

4. Ю.В.Козлов. E.В.Лукьянов. Е.Н.Дубинина. Организация оперонов шига и шига-подобного токсинов.-Тезисы 8-го симпозиума СССР-ФРГ. "Организация генома и регуляция активности генов",Иркутск. 1989. 0. Ю.В.Козлов. Е.В.Лукьянов, Е.Н.Дубинина. The organization of the operons coding for Shiga and shiga-llke toxins.-Тезисы докладов 4-го Европейского симпозиума "Bacterial protein toxins". Италия, Урбино,7 1989.