Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активация детерминант LT-энтеротоксина и Тс-резистентности под влиянием УФ-света и плазмид

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Активация детерминант LT-энтеротоксина и Тс-резистентности под влиянием УФ-света и плазмид"

12(5 0 5 9 2

?ОСС:иШЯ АКАдд.йЯ «ШЩИКСКХ КЛУК ОРД1НА ТРУДОВОГО КРАСНОЮ ЭПШ5! НАУЧНО-ЖСЩОВАТЕПЬСШ! ИНСТИТУТ ЗШ^ГШОГДО П шОСРОЕЖОПК 1ШП1 ПОЧЕТНОГО АГЛД2.НКА. К.Ф.ГА1ШЕИ

Ка правах рукописи ' тишгова ирша глебовна

АКТШАЩй ©ТШКНАНТ 1Я -ЭНТЕРОТОКСГША И

тс-резистентносги под влиянием уф-свзта и шаля.

03.00.07. - микробиология 03 .СО .15. - генетика

Автореферат диссертации на соясканяе ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992 год

Работа выполнена в научно-исследовательском Ордена Трудового Красного Знамени институте эпидемиологии к шкробпслогик имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН.

доктор биологических наук Т.С .Ильина Доктор медицинских наук, профессор Е.А .Ведылина Ведущая организация - Московская медицинская академия им. 11.14.Сеченова, кафедра микробиологии

в 14 часов на заседании специализированного совета К001.07.01 по присуждению учаной степени кандидата наук в научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАШ ( 123098, ул.Гамалеи, 18 ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НШШ им. Н.Ф.Гамалеи РАШ.

Научный руководитель: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Г.Скавронская Официальные оппоненты:

Защита диссертации

Автореферат разослав Ученый секретарь Специализированного совета доктор медицинских наук

Е.И.Коэтелоза

j

. i Актуальность проблемы.

•"Представленные в работе исследования касаются изучения ггуляции функций генов, детерминирующих признаки бактерий, су-гсгвенные для их болезнетворного действия: генов, контролируете типичный фактор патогенносги бактерий -LT -токсин ( термофильный энтеротоксин кишечной палочки ) и антибиотикорезис-

ihthoctb.

для выяснения причин ряда микробиологических и эпядемио->гическнх закономерностей все более важными являются сведения генетических основах регуляции функций генов, контролирующих тйства бактериальных клеток и их патогенетическое действие, »вестно, что активность генов определяется регуляторнши стру-7рамя оперонов, а схемы регуляции генов весьма разнообразны, шестно также, что клеткам, в частности бактериальным, свойст--!нны регуляторные системы "общего" порядка, регулирующие функ-m больших групп генов. Наиболее детально охарактеризованной :с темой такой регуляции является так называемая sos -система, ¡мо наименование этой системы говорит о том, что ее функциони-ванпе способствует выживанию бактерий при губительных для них здействиях, какими являются повреждения клеточной ДНК и оста-вка ее синтеза.

Индукторами sos -системы являются многие химические аген-, количество которых все увеличивается в усложняющихся эколо-ческих условиях. Одним из наиболее активных sos-индукторов ляется постоянно присутствующий в природе физический агент --свет. Все это говорит о широкой возмоаности контакта бакте-й с sos -индукторами.

SOS -регуляции подлежит ряд процессов, относящихся непо-

.средственно к ДНК - репарация и мутагенез. В ходе исследования репарации и мутагенеза, а также индукции профагов и была открыта и изучена sos -система регуляции ( ft adman,-)9?5¡ v«itícin,l975; Little,Mount,1982s Little,1984 )

Било установлено, что основными регуляторными элементами SOS -систешз являются белки-продукты генов 1ехА и гесА . Ьелок Lex4 является репрессором всех генов, относящихся к SOS-системе, белок RecA имеет несколько функций, одной из которых является активация расщепления белка lexA , что приводит к индукции SOS -генов. Сигналом к активации протеазной активности белка йесА служат повревдени ДНК. Насколько широка роль sos -системы э жизнедеятельности бактерий - вопрос, остающийся невыясненным, Известно лишь, что sos -регуляция является существенной для некоторых функций, не относящихся непосредственно к метаболизму ДНК ( остановка дыхания после УФ-облучения бактерий, продукция колиданов, клоациаа), С другой стороны, функции ряда SOS-индуцируемых генов остаются неизвестными, '

В литературе есть сведения о той, что продукция ЪИ -токсина кишечными палочкам» увеличивается под действием митомицина С, который является одним из SOS -индукторов iíeaaceon,Moon,1975 ). В этих экспериментах количество токсина определяли по его цито-токсическому действии на культуру адренальных клеток мыши. На основании описанных данных мохио было предположить, что оперон, кодирующий zt -токсин, входит в группу sos-регулируемых генов. Известно также, что присутствие некоторых плазмид влияет на способность бактерий продуцировать токсины.

Сказанное и определило основную цель настоящего исследования. которая состояла в выяснении участия sos -системы в регу-

лящш функций генов,.детерминирующих W -энтеротоксин кишечной палочки и антибиотикорезистентность. Наряду с этим была исследована возможность влияния на активность изучаемых генов плазглид, характерной особенностью которых является активация некоторых sos -индуцируемых процессов. Задачи исследования i

1. Конструирование штаммов со слййняямй оперойов, позволяющих анализировать транскрипционную активность генов elt ( i/г-ток-сина), tet (Тс-резцстенгности) и kan ( Km-резистентности).

2. Исследовать возможность УФ-ищздкции анализируемых генов и зависимость этой индукции от генов lexA и гесА -ключевых генов sos -регуляции.

3. Исследовать действие плазшд, несущих гены mucAB , на транскрипционную активность анализируемых генов и зависимость этого действия от 1ехД и гесА генов бактерии-хозяина.

4. Осуществить исследования с длазмидамя, дефектными по функции генов шисАВс целью выяснения, зависят ли выявленное действие плазмид от функции их аисАВ генов.

Научная новизна: Установлено, что:

- активность генов токсинообразования ( elt ) и теграциклинрезис-тентности ( tet ) подвержена индуцирующему действию УФ-света. Индуцирующее действие УФ-света наблюдается на' фоне конститугив-яой активности генов elt и tet .

- эффект УФ-света относительно выражения гена' elt является ^ехА зависимым, но не зависит от гена *~есА , что позволяет расценивать этот эуфект как своеобразную sos -подобную индукцию.

- УФ-индуцирующее действие относительно гена elt проявляется

как в кишечных палочках, гак и з салыонеллах, т.е. как я рад других 60s -функций не зависит от особенностей генов umu .

- плазшда pHMIOI увеличивает проявление активности генов eltii tet в интактных клетках.

- действие плазмвды pKMIQI относительно активности гена elt не зависит от генов lexA и гесА , т.е. не является sos-индукцией.

Практическая ценность:

Сконструированы штаммы E.coll , содерхащие слияния оперо-нов elt:slac , tett«lac и tan«:1aо , которые позволяют анализировать транскрипционную активность этих генов in vivo. Указанные генетические системы могут быть использованы в различных исследованиях, предусматривающих анализ транскрипционной активности плаз-мидных генов токсинообразования ( XT -токсина ), тетрациклин- и каяамишнрезистеятности.

Сконструированы изогеяные пары шташов E.coll , несущих делецию лакгозного оперона я различающихся присутствием мутаций lexA и хесА. Указанные пары шташов могут быть использованы дяя выяснения участия sos -системы в регуляции изучаемых явлений.

Публикакии. Основное содержание диссертации изложено в 4 работах, опубликованных в печати.

Апробация. Материалы диссертации представлены на 2-ой Всесоюзной конференции по бактериальным токсинам, Рига, Юрмала, 1989г. Диссертация апробирована на научной конференции отдела генетики и молекулярной биологии бактерий НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР.

Объем работы.Настоящая работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, описания полученных результатов, обсуждения и выводов. Диссертация изложена на 137 стр. машинописи, содержит 17 рисунков и 10 таблиц. Слисок

литературы включает 180 названий.

Материалы и методы. Использованные в работе шташы Escherichia coli и Salmonella typhimurium получены от М.Касадабана [США), Ф.Кийярде (Франция), Б.Зшгса (США), Г.Уокера (США), из штекции лаборатории генетики эписом, лаборатории генетики бак-герий, а также сконструированы в ходе настоящей работы.

В качестве полноценной питательной среды использовали L-»ульон и L -агар (к L -бульону добавляли 1% бакто-агара Дифко). I качестве минимальной среда использовали среду А. В качестве ййференциальной среды использовали среду МакКонки (Дифко) с до-авлеаием 10 г лактозы на I л. Для определения LT -токсина бакте-ии выращивали на среде сауе ;

После автоклавирования добавляли на I л среды 6,25 мл глю-ззы (40$), I мл глаточного раствора солей (MgS04 -5/Í, млсlgQ,b%, scij -0,5'/, H2so^ -0.001$, лпнкошщин 70 мкг/мд, доводили pH до ,6. Для получения плотной среды добавляли 1,2% Purified агара гфко.

L -аминокислоты и азотистне основания добавляли в конечной едентрации 20 мкг/мл, тиамин (Bj-) -0,01%. Xgai (5-бром-4-хлор-•индолил- - D -галактозид) (Serva ) растворяли в диметилсульф-:сиде и добавляли до концентрации 40 мкг/мл. Антибиотики до^ав-ли в следующих концентрациях: ампициллин (Ар) - 25 мкг/мл, ка-мипин (&т ) - 40 мкгД'л, тетрациклин (Тс) - 20 мкг/мл, рифампи-н (Ra ) - 40 шг/мл, стрептомицин (Вт ) - 100 мкг/мл.

казашновые кислоты без витаминов (Дифко) - 20 г

дрожяевой экстракт (Дидко)

- 6 г

- II,4 г

- Г л

К2нро4 . 3 Н^О

%Р

.Получение фаголизатов и лизогенизадав бактериофагом Mu dl (Ар lac) проводили как указано М.Касадабаном ( Caeadaban, Cohen, 1379).

УФ-ивдукцяя ß> -галактозидазы. Культуру выращивали в минимальной солевой среде с необходимыми добавками и Km . Свежую ночную культуру разводили в 20 раз и подращивали 2 часа при 32° с аэрацией, а затем облучали в ростовой среде по 5 мл в чашках Петри, используя лампу ЕУФ-15. Облученные и контрольные интакт-ные культуры инкубировали в тех яе условиях, отбирая пробы через 30 мин. Пробы по 4,5 мл фиксировали добавлением 0,5 мл 'раствора хлорамфеникола I мг/мл, а затем использовала для определения активности ß -галактозидазы.

Определение активности ß -галактозидазы проводили по реакции фермента с его субстратом ОНФГ, как описано в руководстве (Миллер,1976), затем измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длинах волн 420 нм и 550 нм. Расчет активности фермента в пробе веди по формуле

Е420 ~ 1,65'Е550

А=-

0,0075.t

где и E55Q - оптическая плотность при соответствующих длинах волн, a t - время реакции с ОНФГ. Активность фермента выражается в условных единицах. Этот показатель использовался для построения графиков зависимости А (активности фермента) от оптической плотности культуры B55Q. Определение удельной активности ß-галактозидазы в расчете на оптическую плотность культуры вели по

формуле E420-I,75.E55û

. А = ——--х 1000

УД 600* *

где Eqqq - оптическая плотность культуры при длине волны 600 нм.

Определение и -энтеротоксина на чашках (Бикен-тест)СHonda et al,1981) проводили с культурами, выращенными в течение 18час в виде капель на плотной среде саге . При этом использовали антисыворотку к холерному токсину, который в иммунологическом отношении очень близок Ш -энтеротоксину (Dallas,Gill,Falkow,1979). Выросшие клетки лизировали, обрабатывая их раствором ЭДТА 0,2 М (рН=8) и параш хлороформа в течение 10 мин в эксикаторе. После лизиса клеток в лунку рядом с выросшей культурой вносили гипериммунную сыворотку кролика, 3-кратно иммунизированного внутримышечно очишенным холерным токсином ( Sigma ,СП1А). Образование полосы преципитации в геле мезду выросшей культурой л лункой с сывороткой регистрировали через 18 час.

• Иаыунойерментный метод ELISA (S-venerholmrHolmgreri,1978 ) в модификации Ю.В.ВертнеЕй использовался для количественного деле:шя LT-токсдна в ультразвуковых лис; тах бактериальных культур. В качестве контроля и для построения калибровочной кривой использовали разведения очищенного холерного токсина (Calbiochem). Антитоксическая гппериммунная сыворотка была получена трехкратной иммунизацией кролика препаратом холерного токсина ( Signa, США).

Элекгрофоретическю! анализ ддазмидной ДКК. Плазмпднув ДНК выделяли согласно руководству (.'.!аша гл с,Фрач,Сэмбу к,1984), использовав методику лизиса бактерий с помошью додедалсульфата натрия и очистку плазмидной ДНК центрифугированием в градиенте -ло-ристого цезия. Обработку рестриктазаыи осуществляли согласно рекомендациям фирмы Pharmacia (Швеция)В качестве молекулярных стандартов использовали ДКК фага лямбда, обработанную рестрикта-

ЗОЙ HindlII .

Определение наличия генов elt в рекомбинантных плазмидах, Плаядадную ДНК, выделенную по Борнхефт и Стодольсии (Bornhoeît, Stodolsky,1981 ), гибридизовали с молекулярным радиоактивным зондом, в качестве которого использована шзкомолекулярные фрагменты ДНК плазмиды EWD299 , полученные после обработки эндонук-леазаш рестрикции Xbal и EcoRl и содержащие проксимальную часть оперена энтеротокекка LT е.coli Cspicer,Moble,1982 ). Используемые фрагменте ДНК метили (j^pJ - dCTP фирмы Amersham (Англия) в реакции ник-трянсляции с реактивами и в соответств1Ш с рекомендациями ширмы. Гибридизацию ДНК выполняли по методике Р.Де-виса и соавт. (Девис, Богстайн, Рог, 1984).

Статистический анализ, где это указано, проводили по программе "Различие между средними групп: оценка дисперсии".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Конструирование слияний оперонов elts slac , tetttlac и kan tt lac с. помощью фага Иа <11 (Ар lac) и доказательства их наличия.

Все изученные гены имеют плазшдаую локализацию и находятся в составе шшзшды p"VZ357 -производной плазмиды RT4 . Гены Тс- " и -резистентности - природные гены шшзшды RP4 . Ген elt-знтеротоксина клонирован в этой шюзшде. по BaaHI сайту, расположенному внутри гена Ыа . контролирующего Ар-резястентносгь. Источником его клонирования явилась плазмидь штамма H74/II4, выделенного от человека. Наличие гена ш -токсина и утрата Ар-резистентности отличают ппазмиду pVZ357 от плазмиды взд . Остальные признаки плазшды етч , в том числе и свойство широкого кру-

-lira хозяев, сохранились у гошзшщн PVZJ57 , что позволило провести эксперименты на раалччкьи ролях бактерий - кишечных палочках п салмонеллах.

Для определения транскргшгдоннаГ; активности генов был использован rfiaг Mu dl(Aplec),несущий в сбог.м составе ллктозни"- опе-рон, не кмеютй собственного промотора. При интеграции фагл в анализируемый ген, лактозный оперон fera оказывается под контролем изучаемого промотора и по активности^ -галактозидазы кояно судить о транскрипционной активности изучаемого гена.

Схема получения плазгжд со слияниями оперонов изображена на рис. I. Исходный шгада с плазкпдоп pVZ35? был лизогенизиро-ван (Тагом Мм di и затем популяция лизогенннх клонов была использована в качестве донора для передачи плазшд в ттамм^К 5097. Оба штамма имели делегата хромосомного лактозкого оперона. Плазмиды с интегрированным (Тагом Ыи di отбирал« по маркерам плазулды - Km -или Тс-резистенткости, и по маркерам ijara - Ар-резястектности и Ъас+ фенотипу. Полученные клоны проверяли на способность проду-отоовать lt -токсин с помощью Бякен-теста я наличие неселектиру-емнх маркеров ангибиогякорезпстентносги. Клоны, потерявшие способность продуцировать XT -токсин или резистентность к одному из антибиотиков, предположительно несли niar Mu di, интегрированный в соответствующей ген, что л привело к его инактивации.

Для дальнеп'дах исследований был взят клон, потерявший способность продуцировать LT -токсин, который при гибрпдизациониои анализе плазшгдяой ДНК обнаружил изменения в гене IT -токсин ¡1лаз:.ида этого кила бгН-ч обозначена PVZ14- . Были поставлены опыты по гибридизации ДНК плазшд с молекулярный радиоактивным зондом, представлявшим собой фрагмент оперона ЬТ -гогс.;.:а.

wzm

¡vim

/ \

Йи*/^ лей

V у j

rei^

MudUfífM

Mu äß &2

a

Рио. I. С хеш получения плоздшд с кнтегрировяинш.: фагса îîu ai < áp lac ).

На радиоавтографе плазмидкой ДНК, рестртированной андонуклеа-зой HindIIl »после блот-гибридизации с зондом плазмида PV2357 -исходная, обнаруживает 2 гибридизующихся фрагмента, плазмида PVZ14 - только один фрагмент, причем большего мол. веса. Молекулярный зонд представлял собой Xbal -ScoRI фрагмент плазмиды KWD299 . С помощью этого зонда моют было обнаружить 2 Hirdlll фрагмента, содержащих материал оперона elt , их ми и видим у исходной плазмиды. Плазмида pVZ14 сохраняет только один, проксимальный фрагмент, т.е. участок с которого начинается транскрипция. На основании этх данных можно полагать, что интеграция фага Mu. <it нарушила структуру оперона М -токсина, но при этом сохранилась его регуляторкая часть.

Наличие слияний оперонов tetttlac я kan::lnc в клонах, потерявших соответственно Тс- я Km -резистентность доказывала возможность восстановления функций генов, т.е. Тс- и Ха -резистентности при точном исключении í¡ara Mu <il (Лр1ас).Для гена Тс-резис-тентности наличие слияния оперонов било подтверждено при рестряк-ционном анализе ДНК плазмиды pVZ357-Tc45 , который обнаружил структурные изменения во фрагменте, содержащем материал оперона tai; .

2. Анализ активности оперонов ЬТ -токсина, Тс- и Кш -резистентности при воздействии УФ-света,

В первой серии экспериментов с полученными плазмидамн pVZ14 было установлено, что УФ-облучеяяе конечных палочек и салмонелл приводит к увеличению активности уЗ -галактозидазы (рис. 2-3). Эффект УФ-облучсння обнаруживается на фоне конститутивной активности гена. УФ-индукция по своей выраженности не высока, по четко воспроизводима и статистически достоверна. Наблюдается зависи-

1 | 0.8

i 0

Й о

о

6 0.4 2

0.0

-------Т ....... -----1------------г.......

! у ........,...,1 .. ¡У - | 1

| 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 : Оптеокая плотность Е^

Рно. 2. Индукция £ -галакгозидвзы под действием УФ-евета в штамме Х.соХ! (1А1303 . е - культура облучена УФ-сввтом в дозе 10 Дд/м2, о - иеойлучевный контроль.

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 Оптическая шотяость В650

Рио.З. Активность £> -галактозидазц в пробе в зависимости от оптачвокоИ пло^яостя культуры В^урЬ1шиг1шп Ь1е046 рТ214. о -культура облучена УФ-светом в дезе Ю»/«2! О - штатная культура.

Дога УЭ-скзгаСДз и"2)

Рис. 4 . Иядугагая спиеза fi -галактозидазд в УФ-ойлучзншх и leil" штсшшх 2. coll в завлснаоота от 'дазы У® -свата. В - QAI303 lories -J- -Ш301 1ехД1.

мость УФ-индуквди от дозы облучения как у кишечных палочек, так и у салмонелл (рис, 4).

Для выяснения вопроса об участии sos -регуляции в УФ-индук-ции гена хт -токсина гхлазмида PVZ14 была передана в специально сконструированные язогеяяые штаммы E.coli , несущие мутации в генах 1ехА и гесА -ключевых генах sos -системы. Проведенные опыты показали, что УФ-индукции практически не наблюдается в lex дефектном штамме (рис. 4). Однако УФ-индукция оказалась возможной в гесА -дефектном штамме, хотя пик активности ß> -галак-тозидазы смещен в сторону низких доз. Это дает основание считать, что хотя УФ-индукция гена LT -токсина зависит от функции гена 1ехА , она не является типичной SOS -индукцией.

Поскольку оперон IT -токсина имеет плазмидную локализацию, нельзя было абсолютно исключить возможность того, что УФ-индуци-руемое увеличение активности гена i/г -токсина связано не с активацией транскрипции, а с увеличением числа копий плазмиды. С целью подтвердить или исключить такую возможность-было испытано действие УФ-света относительно других генов, локализованных на той же плазшще. Такими генами явились гены Тс- и Km-резистентности. В опытах со слиянием оперонов tetuiac также была обнаружена 7Ф-индукция, которая выражалась в увеличении активности ß -галакгозидазы после УФ-облучения (табл. I). Увеличения же активности гена Ки-резистентности при УФ-облучешш-не наблюдалось. Поскольку УФ-индукция наблюдалась только для двух из трех испытанных генов, кажется вероятным, что этот эффект определяется не увеличением числа копий плазмиды, а усилением транскрипции. Об этом же свидетельствует гот факт, что из 69 первично отобранных клонов Ьас+ыГ только 12 оказались УФ-индуцифльными. хртя промоторы, к

которым подключен lac оперон в этих клонах, не были идентифицированы, очевидно, что не все гены, локализованные на плазмиде, подвергаются УФ-лндукции.

Таблица I

Фактор увеличения активности /> -галактозидазы ( А /А„ )к в штамме 5097 pVZ357-Tc45.

Фактор увеличения активности ^-галактозидазы Аивд/Ак .

Jè опыта Индукция УФ-светом 5 Дк/м2 Индукция Тс 0,1 мкг/мл

I 1,59 -

2 1,45 . -

3 1,06 -

4 1,49 9,2

К Аинд ~ удеЛ1>ная активность fi -галактозидазы через 2час после индукции ; Ак - "удельная активность J!> -галактозидазы без индуцирующего воздействия.

Индуцирующее действие УФ-света на функцию опероиа VS -токсина оказалось однотипным в кишечных палочках и салмонеллах. Известно, что эти бактерии имеют значительные различия в umu генах, абсолютно необходимых для некоторых sos -регулируемых процессов (мутагенез и Вейгль-реакгивавдя). Отсутствие существенных различии в эффекгивности УФ-индукции оперояа XT -токсина у шыеч-ных палочек и салыонелл позволяет считать, что УФ-индукция этого опероиа подобно ряду других SOS функций не относится к числу за-

висимнх от генов шш .

3. Изучение влияния плазглиды pKMIOI на выражение оперонов ЬТ -токсина, Тс-резистентности и гена sfiA .

Известно, что SOS-индуцируемая мутабильность бактерий может увеличиваться под влиянием плазмид, несущих аналоги шшШЗ генов, гены аисАВ. Мы испытали действие такой плазмиды, pKMIOI, на УФ-индукцию оперона LT -токсина. При этом какого-либо действия плазмиды на УФ-индукцию обнаружено не было. Вместе с тем, оказалось, что присутствие плазмиды значительно увеличивало базальный фон активности р -галактозидазы, т.е. увеличивало активность оперона LT -токсина в интактных клетках как у кишечных палочек, так и у салмонелл (рис. 5). Аналогичный эффект плазмиды наблюдался и в отношении гена Тс-резисгентности.

Активирующее действие плазглиды было подтверждено в экспериментах по определению И-токсина иммуноферментным методом в ли-затах изогенных штаммов салмонелл, несущих исходную плазмиду и PVZ357 и различающихся наличием плазмиды pKMIOI (табл. 2).

В исследованиях со слиянием оперонов elttilac на изогенных штаммах Е. coll нами было показано, что действие плазмиды относительно активации этого гена является lexA и гесА независимым, т.е. не может рассматриваться как результат SOS-индукции, в отличие от мутагенного и прогективного действия плазмиды, которое является 1ехА и гесА зависимым.

Чтобы выяснять, связан ли плазмидный эффект с локализацией изучаемых генов на плазмиде, было испытано действие плазглиды pKMIOI относительно одного из 80S-индуцируемых хромосомных генов. В качестве такого гена был использован ген sfiA в штамме со слиянием оперонов ail и лактозного, сконструированном Кийярде

I

е

А В /ч

/ ♦ \

•_♦ «\.

/

в

« | | I Г

* и I ш • и I и I и • » («8>

Рео. 5 . Индукция синтеза -галактоаидазы в птадаах в.оо11(а) в В.-ЬурЫвчг1ш1 (В).

Бое птаын» несут пяаямвду уТ&М . Дозе УФ-света 10 Да/»2, о - интактяне культуры + - УФ-ойяучеяие

ф - интакгвыв культуры о плазшдой рКШ01 л - плаэмида рКШО! + УФ-обдучение. .

Таблица 2.

Количественное определение LT -токсина методом ELISA в штаммах S.typhimuxium hisG46 pVZ357 И hisG46 pVZ357pKM101.

Количество токсина

» опыта Шташ ь1вС46 Ыб(*брУгз57рКМ101

мкг/мл х 10~^мкг/кл мкг/мл х КГ^мкг/кл

1 I? 2,9 17 8,0

2 14,5 3,0 20 3,0 3. 18 3,0 23 5,7

4 17,5 ' 1,8 19,5 . 9,0

5 15 3,0 22,5 5,0

6 16,5 3,0 21,5 5,0

7 18 1,1 27 2,3

Среднее 17 2,5 21,5 5,4

(($и111агаеЪ et а1,1982).Проведенные опыты показали, что активность этого гена в присутствии плазмиды рКШШ увеличивается (табл.3), так же как активность генов ьт -токсина и Тс-резистентности. Следовательно, плазмвда рКШШ оказывает влияние на активность генов как плазмидной, так и хромосомной локализации. Это позволяет полагать, что в основе активирующего действия плазмиды лежит не увеличение копийности плазмиды, а активация функция оперона, так же как ,. в случае УФ-индуквди. .

С целью выяснения, связано ли действие плазмиды рКШШ на выражение гена LT -токсина с ее тисАВ генами, было изучено действие полученных Уокером мутантных клонов этой плазмиды, измененных по функции генов иис .

Таблица 3

• Средние значения удельной активности р -галакгозидазы

в штампах УСЦ7 и КУ7 рКМ-101.

Средняя удельная активность Фактор _£ -галактозидазы_увеличения

й опыта Штамм Р037 Р037рКМ1О1

1 19,8 32,3 1,6

2 18,1 25,9 1,4 •

Одной из таких шхазмид является плазмида PGW12, утратившая способность придавать УФ-мутабильность салмонеллам ( Walker, 1978 ). В опытах со слиянием оперонов Ы -токсина и лактозного было установлено, что эта пдазмида в большей степени, чем исходная - pKMIOI - увеличивает базальный уровень Jb -галактозидазы.

Вторая использованная мутантная плазмида, р®Я1б, в большей мере, чем pKMIOI, увеличивает спонтанную и индуцированную частоту 'мутаций, что является следствием точковой мутации в регулятор-ной области оперона вис ( Perry et а1,1985 )• Эта плазмида увеличивала базальный уровень J& -галакгозидазы в равной степени с плазмидой pKMIOI. Вместе с тем, в ее присутствии не наблюдается УФ-индукции активности fi -галактозидазы как у кишечных палочек, так и у салмонелл.

Данные, полученные в опытах с мутантными плазмидами, позволяют сделать два вывода: мутационные изменения плазмид-производ-ных pKMIOI отражаются на функции оперона XT -токсина, однако, активирующему действию плазмиды не препятствует утрата функций тис генов. По-видимому, активирующее действие плазмиды зависит от каклх-ro других функций, присущих этой плазшде. Более четкого гакдочглшя сделать нельзя из-за недостатка даиных.

- 23 -

Активирующее действие плазмиды на изучаемые опероны, как и индуцирующие действие УФ-света на эти опероны, представляет практический, медицински-значимый интерес, т.к. относится к функции синтеза одного яз факторов вдгогенности бактерий в антибиоти-корезистентноств. Вместе о тем, хочется подчеркнуть, что полученные результаты ставят вопрос, касающийся механизмов бактериального мутагенеза. Такой вопрос возникает в связи с данными последних лет о связи между транскрипционной активностью генов и частотой мутаций в них, а также зависимости процессов репарации от транскрипционной активности генов (Savic,Kanazlr,l972j Bolret al, 1985t Uachanl,Bohr,Hanawalt,1986; Mellon,Hanawalt, 1989 ). Это вопрос о роли активирующего транскрипцию действия УФ-света и плазмиды рКШШ в мутагенезе, индуцированном УФ-сзетом или опосредованном алазмидой pKMIOI.

ВЫВОДЫ

1. Активность генов токсинообразования ( eit) игетрацик-линрезистенгности ( tat } подвержена индуцирующему действию УФ-света. Индуцирующее действие УФ-света наблюдается на фоне конститутивной активности генов elt и tot .

2. Эффект УФ-света относительно выражения гена elt является lexA -зависимым, во не зависит от гена гесА , что позволяет расценивать этот эффект как своеобразную sos -подобную индукцию.

3. УФ-инду циру юцее действие относительно гена elt проявляется как в кишечных палочках, так и в салмонеллах, т.е. как и ряд других SOS -функций не зависит от особенностей генов шаи

{ umuDC и umuST ).

4. Шшамида pKMIQI увелииивает проявление активности генов elt и tet в интактных клетках.

5. Действие плазмиды pKMIOI относительно активности гена elt не зависит от генов 1ехА и гесА , т.е. не является SOS-индукцией.

6. Сконструированные генетические системы могут быть использована в различных исследованиях, предусматривающих анализ транскрипционной активности плазмддных генов токсинообразования

(LT -токсина), тетрациклин- и канамиаднрезястентности.

СПШОа РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДЖСЕРТАЦДО

1. Андреева И.В., Тиганова И.Г., Скавронская А.Г. Летальное и мутагенное1 действие УФ-света на сальмонеллы, несущие дикий или мутантный аллели 1ехд -гена кишечной палички.// Генетика. -1981. -Т.Ш1, & I. -G.60-65.

2. Скавронская А.Г., АлешкинГ.И., Тиганова И.Г., Русина О.Ю., Андреева И.В.Демкин В.В., Стриханов С.Н. SOS -индуцибель-ность tet -детерминанты плазмиды И** .//Молекул, генетика, ми-кробиол. и вирусол. -1988 8. -С.17-23.

3. Тиганова И.Г., Русина О.Ю., Андреева И,В., Демкин В.В., Бруханский Г.В., Алешкин Г.И., Скавронская А.Г. УФ-индуцибель- . ность оперона 11 -токсина.//Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -1989. -Я 7. "С.29-35.

4. Тиганова Й.Г., Русина О.Ю. sos -индукция оперона термолабильного энтеротоксина Escherichia coli ( И).

2-я; Всесоюзная конференция "Бактериальные токсины". Тезисы. Юрмала,, Латвия, 1989. -С.132.