Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства векторов, сконструированных на основе репликона pMBI и онкогенных вирусов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Свойства векторов, сконструированных на основе репликона pMBI и онкогенных вирусов"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ

АКАДЕМИЯ НАУК УССР

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

ОВЕЧКО Николай Николаевич

УДК 547.963.3

СВОЙСТВА ВЕКТОРОВ, СКОНСТРУИРОВАННЫХ НА ОСНОВЕ РЕПЛИКОНА рМВ1 И ОНКОГЕННЫХ

ВИРУСОВ

(03.00.03 — молекулярная биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев 1987

Работа выполнена в лаборатории биохимии вирусов Института вирусологии АМН СССР им. Д. И. Ивановского.

Научные руководители:

член-корреспондент ВАСХНИЛ Т. И. Тихоненко, кандидат биологических наук В. Н. Калинин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н. С. Дяченко, доктор биологических наук В. А. Кордюм

Ведущая организация: '

Институт цитологии АН СССР

Защита состоится « Л^.» . ^-^(¡р а <-(' ( 198 $ г. в /У . час. на заседании Специализированного совета К 016.11.01 Института молекулярной биологии и генетики АН УССР по адресу: Киев-143, ул. Заболотного, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и генетики АН УССР.

Автореферат разослан « » _. 1 кл. ^Ьй1 198¿1 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук Л. Л. Лукаш

© Институт молекулярной биологии и генетики АН УССР

., ■ i ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1 Актуальность проблемы. '""""ТСйюйировакле генетического материала, введение его в реципи-мтше клетки и экспрессия, осуществляются с помощью векторных ;кстем. Развитие генетической инженерии неразрывно связано с де-:эльншл изучением свойств векторов,а создание новых векторов ос-К:отся одной из ваштейших задач в этой области исследований.

В зависимости от поставленных задач используются различные шстеш для клонирования, экспрессии генетической информации, )дно- или двурепликонные, интегративние, зписошне инкалсидирую-даеся и т.д. К векторам для клонирования предъявляются такие тре-Зованля как небольшой размер, репликация под ослабленным коятро-I9M, наличие надежного селективного маркера.

В гетошшвертх зкепэри:юнтах трояо используются плазж-щ, сконстртпровхтдае на основе репликона pMBI, снабженные мар-tepaMK ус то йчкл ости к 2-3 аитибиотккак. Кшгдой из маркеров содер--SET едшютвенишй участок узнавания специфической рестрпкцисшюй эндопуклоазой. При встройке 'фгахнонта гет*рологячоой ДШС по одному из Ts eux участков маркер будет яшжтявяровая. Оелекттж клеток, пееулш; гкбркднут конструкции, осун/гегпжхют в два птапа: сначала отбиршзт клана бактерий m признаку шггактпого маркера, а затон проводят селешш» кленов у котогчх функция гена.испо.ть-- . говенного для встройки,, нарушена вставкой.

Наличие довольно протяженной яуклеотядноЯ иослоцоватольпос™ ти, кодируйте!! сбоптчзпаг'улъ резкотгитизсть, неизбежно

ведет к увелнченп'о гилзкулярней касса рск'-'^пнантной ЛИК, что в . ряде случаев пгкалптелыго, В то то врг-ия, для рзплк>га1ггя плазмид типа рШКЫЕХ достаточно участка, говела примерно 650 пар нук-Д^от.пдов ( Kir:vra et al., 1902),

В связи с этим особый интерес представляют данные (iilthonett-Ito -ii а1», 1979 ) о бактериальной плазмвдэ pöaii, которая способна сообщать клеткам фенотип Ga.L+ ; бактаргд Б»coli , несущие * эту юшзмиду, жизнеспособны только в том случао, если в них присутствует другая илазмида, рМВЭ. Следовательно, селекцию бактерий, несущих плазмвдн, сконструированные на основе репликона pf.BI, мокко проводить на принципиально новой основе - использовании ограничения цитотоксических свойств плазмиды pGall.

I

Цели и задачи исследования

Цель-исследования - изучить способность компенсации цитотоксичного действия плазмиды pGall на хозяйскую клетку различ-ншли плазмидами, сконструированными на основе репликона pMBI; разработать новый подход к селекции бактерий е.coli, несущих "безмаркерние"плаз.\шдц, на основе компенсации цитотоксичного действия плазмиды pGall; на основе репликона рЖ1 сконструировать вектор, несущий онкоген малоизученного бычьего аденовируса третьего типа, который мокко использовать для изучения системы селекции на основе плазмиды pGail.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Определить связь цитотоксичного действия плазшда pGall, на хозяйскую клетку, с синтезом нормальных продуктов оиерона тетращшшнрезистентностп сосуществующей плазмида.

2. Исследовать свойства совместимости плазмиды pGail с -другими плазмидами сконструирсзаишага на. основе репликона рШ31.

. 3. Получить и клонировать фрагмент ДНК бычьего аденовируса третьего типа, способный трансформировать клетки эукариот.

' ' Научная новизна исследования

В результате проведенной работы впервые создана система селекции клонов в»coli несущих'" безмаркерше " плазмиды, сконструированные на основе репликона pMBI; определена возможность использования этой систем селекции. Изучен механизм цитотоксичного действия плазмида pGa.il . Показало, что у ддазмкд сконструированных на основе репликона pMBI свойство совместимости овязако с участком ДНК не относящимся к"мшшмсльному" решшко-ну, и. определено, что этот участок не ограничивается областью расположенной от до участка узнаваниях рестриктазой i-vuix плазмида рВВ322 . На основе онкогена бычьего аденовируса третз его' типа сконструирован новый траисфорглирущнй вектор. При клонировании фрагмента вирусной ДНК была обнаружена гетерогенность вирусных геномов популяции; клонированы и охарактеризована две форш ояквденсодвржашего фрашеята генома.

Практическая значимость работы

Разработанная система, селекции е. сои , несущих " безмар-герше " плазмпда, сконструированные на основе реплшсска р?.®1, юзволяет производить близкий к 100$ отбор клонов бактерий в ген-юинясенерных экспериментах. Связь со свойством совместимости участка, не относящегося к " минимальному " репликону, плазмид, сконструированных на основе решшкона рГДВХ, необходимо "/читывать при конструкции новых векторов и создании бактериальных иташоз. Энкоген малоизученного бычьего аденовируса третьего типа - это ноши маркер для эукариотических векторов, обеспечивающий трансформированный фенотип клеток. Векторы, сконструированные на основе этого онкогена могут быть использовали в генаошшзнерной практике для внесения чужеродной генетической информация, а также для изучения особенностей взаимодействия онкогена вируса с клетками эукариот.

Апробация работы и публикации результатов исследования.

Материалы диссертации доложены и обсуздены на конференции по программе АМН СССР " Ген " ( 1982 г.), на Всесоюзной конференции " Рэкомбш1алтные ,ЩЖ " Шущяно, 1982 г.), на заседании Ученого совета кафедры вирусологии биологического Факультета Московского Государственного университета им. М.В.Ломоносова { 1983 г. ), на итоговых научных конференциях лаборатории биохимии вирусов Института вирусологии им. Д.Я.Ивановского АШ СССР ( 1982,1383 гг.), на. конференции отдела кинетики хишггескпх и биологических процессов Отделения Института химической физики АН СССР ( 1985 г.).

Основные положения диссертации изложены в 3 печатных работай.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из слодукпшх разделов: введение, обзор литературы, материалы и метода, результат исследований, обсуждение получениях результатов, выводы. Диссертация написана на русском языке. Список литература включает 204 источника иэ которых 7 отечественных и 197 иностранных. Объем работа 128 машинописных листов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРШШТМЪНЬ!Х ИССВДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЗДЕНИЕ

I. Связь нормальной функции тетрацпклинового оперона с ограничении« цитотоксичности пдазмицы pGali

Ранее было показано, что сконструированная на основе решш-кона pMBl и галактозного оперона E.coli плазыида pGali , сообщает клеткам, не способным расти на минимальной среде с га-

• лактозой, как единственным источником углерода, фенотип Gal+ , Было определено, что метки E.coli , несущие pGali , жизнеспособны лишь в том случае, если в них присутствует другая

• плазшда, рМВЭ, такзю оо;г,ер;чащая реюшкон р'ЛЗХ, которая ограничивает число копий тйжит pCaii до I на бактериальную хромосому (Файзуллин с соавт., 1978; Тихонеííko с соавт., 1979).

Представлялось кнтвресияч ¿>няс£шть; способны ли другие пдаз-•миды, отличные от рМВЭ, ограничивать цнтотоксичное действие ,. pGa.li ц не нужна ли для ох-раничения нормальная функция, детерминанты тетрациклинустойчибости, которая присутствует в рМВ9. Последнее могло иметь место, потому, что при конструировании pGali чужеродный генетический материал встраивался в структурную облает* рперона тетрациклинустойчивости вектора (рис. I),

Feo. I. Физическая й генетическая карты илаэмцдн pGali,

При этом, в принципе могла формироваться детерминанта "гибридного" белка, обладающего цитотоксичннми свойствами, и ограничение • цитотоксичности pGall и плазмидой рМВ9 могла объясняться кон-' куренцкей нормальных продуктов экспрессии оперона тетрациклин-резистентности рМБ9 с "гибридным" белком.

Для экспериментальной проверки указанного предположения били использованы две гибридные плазмиды р601 и р589, сконструиро-. ванные на базе рвпз22 , которые так ке как и рШЗЭ имеют ori pMBI. ¿601 и р589 несут по-разному инактивироватмЧ оперон тетрацшслтарезистентноотп. В случао pSOI причиной инактивации является вставка чужеродного генетического материала в структурную область тетрациклянового оперона; в случае р589 - вставка в промоторноц области оперона.

В результате трансформации бактерий л.coli KS 302 , содер-нагаих плазмиды pCQI и р50Э, pGall , образованно Сз1+ клонов наблщздооь о такой ле частотой кате и в случаи трансформации Е,coli КЗ 302/ 302/рМВЭ, пяазшщой pßall

РестрпщиовлнЗ анализ плазмпдпой ДНК, выделенной пз лолучея-нух клонов, показе«, что в обоих случаям присутствуют pßall - специфические EooR~l .. фрахттеятн лрогаченностш I,? т.п.н., 23 г.л.а,, п токяп шюечвднпя Д!Ш р60т нлп j?.'38D в лппя^поЧ фгр^п (pne, 2), В СЛучао 1тссЛ«Д0ВаКП;Х пгагг.?* 5ГЗ _;0"/рб01 /рСг.ГГ п Ks зо2/р5 в э / ? £ а 11 , соотастствешг» Слелотатслмю, л '

трппоуоруонгл* присутствуют з нптактпом п:?де как рзздазптп?я плазмида, так и вновь введенная pGaii

Таким образом, pSOI я 7 яоторш; шштяэяп детерминанта

тетрзитш^пуотойчт^сто, евоссблн тан st«s, как и рЧВЭ, огрзштт-вать цп-готог.оичпое действие рйч?л , Наличие нормальных продуктов оперола тотр^цпк.ттнустоЧтйлооте для а того но обязательно.

2. Система солзкцшх клопов е.coli нссушх бвзмарнерпне

нлазмкдн.сконструирозаише на основе рэплшюна рШЛ,

Представляло интерес выяснить сохраняют ли яизнеспособность бактерии в.coli получившие при трзнсформацкштплазмяду

pGall и криптпческий репликон, а такие определить, способна ли pGaii обеспечить присутствие вспомогательного репликона в интактной форме. Для этого E.coli трансуормиро-

23 т.п.h, 9 т.п.h.

.-1 ' S

т.п.h.

}

s

. -Jd,8 т.п.h.

! ; I 2 3

1,7 т.п.h.

1

L „ J

4 5 6

"1,7 т.п.h.

Pire. 2. Электрофоретическая подвижность продуктов гидролиза рестртшионной эндонуклеазой EccRi плазглидной ДНК штаммов КЗ 302/pcOI/pGalI

;; KS 302/p5B9/pGali (треки 3,6, - соответст-

венно); ДНК фага (треки 1,4, ); треки 2,5, •- натив-иая пдая.мздная ДН2С соответствующих штаммов.

вали смесями ;.лазмвд pOaii + pf.lB9 и pGall + р58Э в соотношение копий 1:6; селекцию трансформированных клеток проводили толъ-'Ко .на Gal+ признак, т.е. в условиях, в которых вторая плазмида не проявляет никаких свойств, кроме способности ограничивать число копий pGall . Последующая проверка маркеров антибиоткко-устойчивости показала, что все Gai+ клоны обладали признаками, которые детерминируются "криптическтаи", в условиях трансформации, roía амидами (таблица I)..

Результаты рестрикционного анализа плазмид выделенных из трансформантбв pGaii/p589 оказался идентичным пртаеден-

ным на рис. 2, что доказывает наличие в трансформантах плазмвд обоих полов. Таким образом, используя эффект ограничения цито-чгаксичного действия pGall , можно клонировать E.coli , несущие' кргептические плазмида о репликоном pMBI.

Ранее было показано, что плазмида pGall легко элиминируется При рОСТе клеток В НеселекТИВНЫХ УСЛОВИЯХ (Tikchonenko

Таблица I

"Безмаркерные" плазмиды в, Gai+ трансформантах E.coli

Трансформирующие плазмиды Частота Gai+ транс-гао|)мантов на I мкг Из них

pGall + р1ЯВ9 pGall + р589 I pGal3 6-Ю2 7-I01 2,8-ГО4 Тс2 - I00JS Ар Тс2г 100$

et al. , 1979; Файзуллин с соавт., 1978), в то время как для jMB9 характерна длительная перспстенция в бактериях. Наши эксперименты показали, что аналогичные процессы происходят и в случае к.coli ( pSaii/p589 . После 10 генераций на богатой

среде, Gal+ фенотип сохраняется примерно лишь у 10% клеток, в то время как фенотип "криптической" плазмиды проявляется более чем у 90% меток (таблица 2). Следовательно, инкубация в неселективных условиях мояет служить способом элишгаашт pGali при получении очщегошх препаратов крштяческпх плпзшд.

Таблица 2

Элиминация pGaii из клонов E.coli , нссугдо: "бсз'лпр-

Kepime" плазмиды

Клоны Проверено Из них Гбезгюркер- 1 ÍV - л.

КЗ 302 pGn.il/pMB9 КЯ 302 pGalX/p589 379 (ТОО%) 290 (I00& 46 (10/П 360 (90/S) 24 (IOS) 1 268 (90$)

3. Изучение связи свойств совместимости с определении? участком ЛН1С

В связи с теп, что ограничение числа копий сосуществующих плазмид в одной ¡слетке плазмид происходит только в том случае, если эти плазмиды совместит ( НегсЬИеЫ еь а1. ,1976), мы более детально исследовали совместимость различных рекомбинапт-иых плазмид сконструированных на основе репликона рШ31.

Опыты по изучен;® совместимости плазмид показали, что плазми-да рГЛВЭ проявляет строгухз несовместимость с родственкш реплико-ном - PBR327 (таблица 3). Это бил неожиданный результат, так как шсазмвда PBR327 отличается от совместимой с рШЭ плазш-ды pBR322 только отсутствием участка ле:-:аг:его нике ori { Covarrubias et al. , I981) и не относящегося к последова-

тельности "минимального" решшкона, с которым но литературным дашшлг связаны свойства совместимости плазмид ( Tomizavja and Itoh , 1У81; Haohinoto-Gotoh and Timinia , 1901).

Таблица 3

• Совместимость плазмид с полной ¡шл частичной делецией участка ДНК расположенного мекду orí и концом оперона Тс г рЬй322

Реципиент Пяазмпдиая ДНК Селективный маркер Частота появления клонов на I мкг ДНК

Н3101/рКВ9 32? Лрг 0

рд25 Арг 0

р601 Лрг 2-Ю3

НВ101/р а 25 р Ш39 Тог 0

рВЕЗ27 Тсг 1,8-Ю3

pBR325^pr То1" 2-Ю3

На сегодняшний день несовместимость плазмид объясняется различным воздействием репрессора репликации на инициацию синтеза .НОВЫХ КОПИЙ сосуществующих ШШЗМИД ( Hashimoto-Gotoh and Timntie,19£ Репрессор репликации - PHKI. синтезируется на участке инициации репликации, с противоположной цепи; если последовательности кодирующие .PHKI у двух плазмид различаются, то и ингибиругощее действие репрессора будет различным. Например, несовместимость плазмид рМВ9 it CoiEl связана с более эффективным ингибированием репликаций CdlBI, PHKI плазмиды рМВ9 (Haahimoto-Gotoh and Timmia, 1981).

На основании имеющихся литературных данных нельзя объяснить различий в свойствах совместимости плазмид рвпзгг п рвнзг?, Y.K. участок инициации репликации в последовательность кодирую-' ЩЩ PHKI ЭТИХ плазмид ПОЛНОСТЬЮ идентичны (Covarrubias et al.,

1981). Следовательно, можно предположить, что последовательность ДНК pBR322 , расположенная от 1440 до 2500 п.н., или часть ее, связана со свойством совместимости.

С целью определения минимального участка, связанного с изменением свойств совместимости, било получено делеционное производное плазмиды pBR325 - рд25 (рис. 3). Эта плазмида несет последовательность необходимую для репликации и никелеаащую область до участка узнавания рестриктазой Pvuii (2065 п.н.). В таблице 4 представлены результаты перекрестной трансформации различными плазмидами и р!.1ВЭ. Как видно из представленных данных, плазмида с полностью или частично делегированной последовательностью, расположенной шехе ori ( pBR327 и рд25, соответственно), строго несовместимы с плазмидой рМВ9. Не было обнаружено ни одного трансформанта, тлевшего фенотип вносшой плазмиды, независимо, била это p3R327 , 5 плп рЬШЭ. Полученные данные свидетельствуют о том, что участок генома рзкз22 , расположенный ниже последовательности узнавания рестриктазой Pvuii связан со свойством совместимости. Следовательно, область генома плазмиды pMBI связанная с совместимостью не ограничивается областью "шшкмалъного реп-ликона".

Имеющиеся литературные данные о значении участка последовательности, расположенного между ori и концом оперона тетрацик-линрезистентности плазмиды pBR322 , а также данные о значении аналогичного участка плазмиды ColEl , никак не объясняют несовместимость исследованных нами плазмид. Так известно, что деления фрагмента Пае П С плазмиды ColEl и аналогичного участка плазмиды рВП322 , представленного в Нае П В фрагменте (17302352 п.н.), приводит к повышению числа копий плазмид. Однако, в работах Pritchard et al. (1975), Meacock and Cohen (1979)

было показано, что кепийяоеть и совместимость плазмид не имеют взаимосвязи. Последовательность ДНК pBR322 , отсутствующая у плазмиды pBR327 , кодирует " bom-aits ", необходимый для опосредованного переноса при конъюгации ( Covarrubias et al. , 1981) и репрессор репликации белок йор t который транскрибируется с участка последовательности I9I6-2I06 п,н. ( 3ош ■ Tomiaara, 1983). Делеция участка ДНК PBR322 , расположенного дпетально от Pvuii сайта приводит к нарушению синтеза и функций белка Нор . Это подтверждается повышением числа копий плазмиды

pBR326 , которая не содержит эту область ( Covarrubias et ai., 1981). Так как последовательность ДНК расположенная ниже участка инициации репликации у плазмид pBR326 ц рд25 идентична/ то можно сделать вывод о том, что плазмида рд25 таете не кодирует функционально активного белка Rop . Следовательно, сравнение свойств совместимости плазмид рд25, несущей интактную область " bom-site " и pBR327 , не содеркащей ее, позволяет определить связь последовательности " bom-site " со свойством совместимости.

Идентичность результатов, полученных при изучении совместимости плазмид pBR327 и р л 25 с плазмидами рМВ9 и pBR322/p6oi , pBR325Apsy позволяет сделать вывод о том, что участок "bom-site " не связан со свойством совместимости.

Как указывалось, область Пае П В фрагмента (1730-2352 п.н.), PBR322 кодирует репрессор репликации. Мы попытались обнаружить промотор этого репрессора с помощью известного свойства гена ji-лактамазы усиливать экспрессия при появлении других промотор-в.ых последовательностей перед собственным промотором этого гена ( stuber and Bujard , 1981). Следствием усиления экспрес-

сии этого гена является повышение резистентности бактерий, содержащий такую плазыиду, к ампициллину. Для проведения опытов были сконструированы плазмиды рд R и рлВ , производные pBR322 (рис. 3). В результате элиминации Pvuii - EcoRl - фрагмента плазмида pBR322 , район прилежащий к участку узнавания рест-риктазон Pmti значительно приближен к промотору гена лактамазы (плазмида p&R). Описанная выше плазмида рд25, в отличие от р is R несет перед промотором гена р -лактамазы участок последовательности ген& хлорамфеииколацетидазн, транскрипция которого происходит в направлении противоположном направлению транскрипции гена ампицшшшреэистентности.

Следовательно, различие резистентности бактерий несущих плазмиды р л R п р л 25 может свидетельствовать о наличии промоторной области в районе прилежащем к участку узнавания рестриктазой Pvuii плазмиды Bam HI .В качестве контроля, показывающего возмокность активации экспрессии р -лактамазы дополнительным промотором, служила плазмида рдВ , полученная путем элиминации Pvuii - Bam Н I- фрагмента pBR322 . В этой конструкции сохранен "контр-тетрациклиновый" промотор, расположенный в райо-

tie участка узнавания рестриктазой Hind щ t для которого показана способность активировать ген ji -лактамазы ( stuber and Bujard, 1981). Результаты исследования способности бактерий, несущих плазмида рд25, рдБ или р д R , расти на среде с добавлением различных количеств ампициллина, представлены в таблице 4. Из представленных данных видно, что плазмида рд 25 обеспечивает бактериям способность расти на среде с концентрацией антибиотика не более I мг/мл; уровень резистентности бактерий, несущих рдН оказался существенно выше: они способны расти на среде содержащей до 3 от/мл амтпщшгоша. Еще более резкое возрастание резистентности (до 13 мг/мл) наблюдается при наличии в клетках плазмид рд В, р 31*322 и PBR327

Таблица 4

Резистентность к ампициллину бактерий е.coli IIBI0I несущих различные плазмиды

Плазмида Концентрация ампициллина .в мг/мл

I 2 ■ 3 4 5 10 13

. рд 25 + - - - - — -

РД R + + + - - - -

РД в + + + + + +

pBR327 + + + + + + +

pBR322 + + + + + + +

Однако, относительно низная резистентность бактерий штамма НВ101/р<\25 могла быть обусловлена токсичным влиянием на бактерию продукта, синтез которого инициируется на сохранившемся участке гена хлорамфеникол-ацетилазы.

Для выяснения этого вопроса мы исследовали динамику роста бактерий содержащих плазмида: рс.25, р&В л рВй322 . Сна оказалась практически идентичной во всех случаях, что свидетельствует об отсутствии негативного влияния указанного продукта.

Следовательно, можно заключить, что усиление экспрессии гена -лактамазы плазмида рд я , по сравнению с рд25, связано с появлением перед промотором этого гена промоторной последовательности, а именно области РтиП сайта рвизгг . Такой вывод согласуется с данными об обнаружении в районе Пае Ш С фрагмента

(1949-2489 п.н.) pBR322 участка связывания РШС-подимеразы ( Viest et al. , 1980).

4. Конструирование и свойства вектора на основе онкогена бычьего аденовируса третьего типа

Успешное использование трансформированного фенотипа, как маркера векторов эукариот, позволило широко применять геном онкоген-ных вирусов для конструкций эукариотических йекторов. IIa этом основании мы решили изучить возможность использования бычьего аденовируса третьего типа (Bay 3), как основу длч конструкции новой плазмиды. В качестве маркера был использован не весь геном вируса, а лишь часть его, которая по имевшимся данным (igarashi et ul. , 1978) способна обеспечить, при введении в клетку, трансформированный фенотип,

ДНК вируса (вирус подучен от В.С.Золманзон, Институт молекулярной биологии ЛИ СССР), клонированного пз одной бляшки тчщ-ролизовалп рестриктазой EooRl . При анализе электрофоротя-ческой подвижности продуктов гидролаза била обнаружена гетерогенность фрагмента D , Были обнаружены две дксяфотшв форма фрагмента, что,'свидетельствовало о существования в х-лонпроваииом вирусе смешанной популяции. Для того, чтоб« получить очщвнпый генетический материал различии* представителей скепашюи популяции, EcoPJD -фрагменты с различной иодвиаиостью б1Ш1 олтро-ваш из агарозного геля и после переосагденлл этанолом тс лкгк-ровали с гпдролизованной Ecoiti плазмпдоц рШЭ25 . По-

лученным материалом трансформировали компетентную культуру Е.coli HBI01. Из выросших колоний были отобраны глого с фенотипом Ар+,Тс+См~, что свидетельствовало о налички вставки в область гена хлорамфениолацетилазы. Плазмидаузо ДПК, тщелеп-iiyi) йз полученных клонов, гидролигювали рестриметснкой сндонук-леазой EcoRI и методом электрофореза в areрозном голсг проводили идентификацию содержащихся в них фрагаентов генома вируса Bay Айализ показал, что плазмиды, неерше fV-ашент в гетерогешш (рис* 4).

Йа йредстШзленйоМ на рисунке на треках 4 и 5 видны полосы, Ьоответствуюпдае плазШдам двух типов ( 5 и 9), несущих раз-. лйчНыё формы фрагмента D , выделенные при исследовании вирус-

Рис.4.

Ь rf/iSrJl^-nh J .«Lit * **• ь« t.'. * U , «.л «>Лб ¡."W UiJ £

I 2 3 4 5

Электрофоретическая подвижность продуктов гидролиза ДНК Bay 3 и плазшд D 9,г> 5 рестриеционной эндонунлеазой ЕсоИ (треки 6,5,4 соответственно ); стрелками ука^.. заны две полосы гетерогенного фрагмента ДНК вируса. Треки 2 и 3 - ДНК плазмид 5 и 9 в на -тивном виде. Трек I - ДНК фага Я гидролизованная вътХ.

Рис.5.

Злектронномикроскоштчеекое иссле,* дование гетеродуплекса плазмяД О 5 и09

13

ной ДЕК. Для более точного определения различи!! в протяженности фрагментов был проведен гетеродуплексный анализ плазмид, несущих различные формы Bay 3. На рисунке 5 представлены результаты электронномикроскопического исследования ( выполненного совместно с А.С.Маховым, Институт им. Д.И.Ивановского, АШ СССР). Одноцепочечная петля, указанная стрелкой , была измерена; ее длина, по результатам измерения пяти различных гетеродуплексов, составляет 250* 40 п.н. Результаты проведенного исследования свидетельствуют такяе о том, что кавдая из плазмпд гибридизова-лась с обеими формами D -фрагмента вирусной ДЩК-

Представлялось интересным опредзлить локализацию вставки внутри исследуемого фрагмента. С этой целью было проведено рест-рш'ционное картирование фрагментов в составе гибридных плазмид.

^¡tm шнщш

¿'-Joiv

1 л'^Жл ' г.'Й

Рис.6.

Электрофоретическая подвики ость продуктов гидролиза ДНК Bay 3, D 9, D 5 я фага X ( трекп 1,2, 3,4, соответственно), рестрикци-оняой эвдонуклеазой BbrI.

_______1*

3

Стрелкой с цифрой I на фотографии указана полоса соответствующая BbrI -Е-^рагменту ДЕК вируса Bay 3. Идентичные зоны обнаруживаются на треках,куда были нанесены продукты гидролиза плазмяд В 5 и D 9. Фрагмент вьг^с плазмид в 5 и в9 различается по своей подвижности , что обусловлено различием в протяженности. Если бы вставка в геном вируса локализовалась справа от HindiII-E фрагмента Ba.v 3, то наблюдалась бы гетерогенность Bbrl-A фрагментов плазмид D 5 и d 9 , а так как фрагмент А двух плазмид имеет идентичную подвижность, можно

заключить, что вставки локализуются слева от Hind Ш - Е фрагмента ДНК вируса Bav 3 (рис. 7).

о

к 1 t 1 «

& н VИ

EccRl (а) H.WiJI (н)

D5,D3 m

и

■ 1

А

Рис. 7. Локализация участков узнавания рестриктазами Hind Ш и EcoRl на молекулах ДНК вируса Bay 3 и плазмидах D5 и D9.

Из приведенных вше данных можно сделать вывод о том, что заполученной гетерогенной популяции вируса Bay 3 содержатся вирусы различающиеся протяженностью цепи ДНК. Различие составляет-¿50+40 п.н.; это вставка локализующаяся в левой частя EcoRl фрагмента вирусной ДНК.

Исследование трансформирующей активности (проведенное Грл-ненко Н.Ф.» Институт молекулярной биологии АН ССОР!) векторов

в 5 и 5 9 показало, что они способны трансформировать клетки Rat~2 tk . Трансформирующая активность этих плазмнд одинакова, следовательно, вставка в левой части Есомь - Фрагмента не изменяет функций последовательности связанной о траис-формпрущей активностью ДНК вируса Bay 3.

t

ВЫВОДЫ

I. Ограничение цитотокспчпости плазшцщ pGaii осуществляется не только плазмидой рМВ9, по и другими плаэмвдаш! оковст-.руированныш на основа репликона pMBI.

2. Ограничение цитотоксичности плазмида pGali не связано с продуктами экспрессии оперона тетрациклинрезистентности, а происходит в результате ограничения числа ее копий.

3. Ограничение цитотоксичности вектора pGali позволяет отбк-ратьклош бактерий E.coli несущие безмаркернне плазмиды сконструированные на основе решшкона рИВ1

4. Обнаружена связь свойства совместимости илазмэды р2Н322

с участком последовательности ДИК не относящимся к " минимальному реияикону " ;,делеция участка последовательности расположенного от oi-i до конца оперона тетрациклинрезистентности приводят к изменению свойства делетированшх плазмид.

5. Обнаружена гетерогенность исследованной популяции бычьего аденовируса третьего Tiaia ; клонирован онкоген аденовируса и установлены размер и локализация вставки.

6. Вектор, сконструированный на основе ДНК бычьего аденовируса третьего тина можно использовать для введения в клетки аукариот

я тзгаш для изучения Езалкодейотвия онкоген-хромосома.

СПИСОК

работ опубликованных по материалам диссертация :

X. Калинин В.Н. .Лопаева А.й., Лунин В. Г., Овечко I1.II., Скршпшк Е.А.,' Смирнов А,Д. " Повая рзстрищионпая эндонуклэаза j'bxi перспективны?, аналогHindill-1. Сборник докладов Всесоюзной конференции " .Рекомбинантнае ДНК стр 14-15, Пущина,1982г.

2. Калинин В.Н., Овечко H.H., Грановский H.H. " Новая система селекции " криптическихяплазглид на основе репликона рМВГ'. Вопросы медицинской химии, 1983, Ш, стр 8-1I.

3. Овечко H.H., Калинин В.Н., Тихонеико Т.Н. " Влияние делецяй

в области ori - Тс плазмиды pBR322 на ее совместимость с ре-шшконом pMBI Молекулярная генетика,микробиология и вирусология, 1986, №9, стр. 12-16.

Л 68772 15.12. 1987 г. Объем 1 п. л. Зак. 1606. Тир. 100.

Тиопография ОИХФ АН СССР