Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональная характеристика репликона бактериофага N15 и конструирование на его основе экспрессионных векторов с регулируемым числом копий

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Функциональная характеристика репликона бактериофага N15 и конструирование на его основе экспрессионных векторов с регулируемым числом копий"

□030554Т6 "а правах рукописи

МАРДАНОВ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

Функциональная характеристика репликона бактериофага N15 и конструирование на его основе экспрессионных векторов с регулируемым числом копий

(03.00.15-генетика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МСЮКВА-2007

003055476

Работа выполнена в Лаборатории систем молекулярного клонирования Центра «Биоинженерия» Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Равин Николай Викторович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Муха Дмитрий Владимирович

кандидат биологических наук Летаров Андрей Викторович

Ведущая организация: Биологический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится ц/7» 2007 г. в// часов на

заседании Диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 117807, Москва, ул. Губкина, д.З Факс: (495) 132-89-62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.Й. Вавилова.

Автореферат разослан « /¿>» /Ч/^Р^Т^ 2007г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Г.Н.Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

До недавнего времени общепринятым было представление о том, что эукариотические организмы имеют линейные хромосомы, а бактериальные геномы представляют собой кольцевые молекулы. Однако, это правило не является универсальным, поскольку линейные плазмиды и хромосомы были найдены в различных прокариотических организмах. Первым обнаруженным линейным репликоном у прокариот является умеренный бактериофаг N15, который в лизогенном состоянии не интегрируется в хромосому Е. coli, а представляет собой линейную плазмиду с ковалентно замкнутыми теломерами. Позднее было установлено, что аналогичную структуру ДНК имеют линейные хромосомы и плазмиды спирохет Borrelia, одна из хромосом Agrobacterium tumefaciens, а также профаги умеренных бактериофагов PY54 и фК02.

Информация о молекулярных механизмах репликации линейных хромосом с ковалентно-замкнутыми теломерами у прокариот весьма ограничена. В частности, до проведения этой работы практически отсутствовали данные о свойствах репликационных белков линейных плазмид и механизмах регуляции их репликации и числа копий, необходимые для разработки моделей репликации. Основное внимание в настоящей работе посвящено изучению этих проблем на примере бактериофага N15. Тот факт, что N15 является не просто плазмидой, а умеренным фагом, позволяет предположить, что репликация его ДНК может следовать разным механизмам в плазмидном состоянии и при литическом развитии, с участием различных репликационных белков.

Одним из практических применений фундаментальных знаний в области репликации плазмид и контроля экспрессии их генов является конструирование векторов для продукции целевых белков. Escherichia coli является одним из наиболее привлекательных объектов, используемых для продукции гетерологичных белков вследствие того, что она способна к быстрому росту до высоких концентраций на простых средах, ее генетика достаточно хорошо

!

изучена, доступен большой набор клонирующих и экспрессионных векторов и мутантных штаммов.

Идеальный экспрессионный вектор должен обеспечивать высокий уровень синтеза продукта в случае индукции при минимально низком базовом уровне экспрессии, что необходимо, в первую очередь, при экспрессии продуктов, которые могут быть токсичны для клетки. Большинство современных систем экспрессии гетерологичных белков в Е coli обладают относительно узким диапазоном регуляции. Вследствие этого системы, обладающие низким базовым уровнем экспрессии, не позволяют достичь высокого уровня синтеза продукта при полной индукции, а системы с высоким максимальным уровнем имеют обычно и достаточно высокий базовый уровень экспрессии. Таким образом, задача создания экспрессионных систем, сочетающих высокий максимальный уровень экспрессии продукта с большим диапазоном регуляции (т.е. низким базовым уровнем), продолжает оставаться актуальной. Цели и задачи исследования

Основная цель работы состояла в функциональной характеристике генов, обеспечивающих репликацию ДНК фага N15, изучении механизмов регуляции числа копий профага и конструировании на основе репликона N15 векторов для экспрессии целевых белков в Е. coli. Основные задачи работы:

1. Исследование механизмов регуляции числа копий профага N15 и миниплазмид на его основе.

2. Изучение механизмов действия антирепрессоров N15 и их влияние на репликацию и число копий профага.

3. Функциональная характеристика репликационного гена герА и установление роли репликационных белков клетки-хозяина в репликации профага N15 и ДНК фага N15 в ходе литического развития.

4. Конструирование и характеристика экспрессионных векторов на основе репликона N15, число копий которых может регулироваться.

Научная новизна и практическая значимость работы

Исследован механизм регуляции числа копий плазмидного профага N15. Идентифицирован промотор репликационного гена герА фага N15 и показано,

2

что контроль репликации и числа копий профага осуществляется на уровне продукции репликационного белка RepA. Экспрессия герА регулируется на уровне инициации транскрипции за счет репрессии герЛ-промотора СВ белком фага N15. Этот механизм обеспечивает синтез RepA на определенном уровне, соответствующем числу копий профага на уровне 3-5 на хромосому, и коррекцию случайных флуктуаций числа копий. Инактивация СВ репрессора в результате связывания с ним белков-антирепрессоров приводит к активации промотора герА и увеличению числа копий профага N15. Этот механизм контроля репликации реализуется при активации литического развития фага в лизогенной культуре.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что RepA является многофункциональным белком, обладающим активностями ДНК-хеликалы, праймазы и, вероятно, связывающийся с сайтом инициации репликации. Показано, что бактериальный инициаторный белок DnaA не требуется для репликации N15 и, более того, является не позитивным, а негативным регулятором числа копий.

Полученные в первой части работы данные о механизмах репликации и контроля числа копий N15 были использованы для решения практической задачи - создания новых систем экспрессии белков в Е coli, сочетающих низкий базовый уровень синтеза продукта и широкий диапазон его регуляции. Основная идея нашего подхода состоит в использовании регулируемого промотора в сочетании с плазмидным репликоном, число копий которого может регулироваться в широком диапазоне, от 3-4 до 100 на хромосому. Диапазон регуляции синтеза продукта расширяется за счет перемножения эффектов активации промотора и эффекта дозы гена. Для создания этих систем экспрессии были использованы репликон и регуляторные элементы бактериофага N15. Были сконструированы два экспрессионных вектора, pN15E4 и pN15E6, а также штамм Ecoli, позволяющий активировать репликацию и регулировать число копий векторов, и обеспечивающий их стабильное наследование в неселективных условиях. Полный регуляторный диапазон новой экспрессионной системы составляет более чем 15000 раз, что

3

является одной из наибольших величин для единичного экспрессионного вектора в Е. coli на сегодняшний день. Важным преимуществом новых систем экспрессии по сравнению с большинством коммерчески доступных векторов, актуальным при экспрессии токсичных для клетки продуктов, является низкий базовый уровень синтеза продукта в отсутствии индуктора, что было проиллюстрировано в этой работе клонированием гена эндонуклеазы рестрикции в отсутствии соответствующей метил азы. Апробация работы

Полученные в диссертации результаты были представлены на следующих международных и российских конференциях: «Plasmid Biology-2004» (Corfu, Greece, 2004), международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004» (Москва, 2004). 8-ой международной школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2004), 10-й международной школе конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2006). Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, подана заявка на получение патента РФ, по которой получено положительное решение. Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 105 страницах машинописного текста и включают 26 рисунков и 7 таблиц. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Цели и задачи исследования», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Цитированная литература», который содержит 6 отечественных и 175 иностранных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Механизмы регуляции числа копий профага N15

Профаг N15 представляет собой линейную плазмиду, число копий которой составляет 3-5 на хромосому. Анализ свойств линейных и кольцевых миниплазмид, сконструированных на основе репликона N15 показал, что

плазмиды, включающие наряду с репликационным геном герЛ также и ген основного фагового репрессора сВ, являются низкокопийными, как и профаг N15, в то время как число копий миниплазмид, не содержащих сВ, существенно выше. Механизмом такого контроля может быть пропорциональная зависимость числа копий от уровня экспрессии гена герА, транскрипция которого может контролироваться на уровне связывания СВ репрессора с промотором герА Для проверки гипотезы мы проанализировали влияние СВ репрессора на уровень активности предполагаемого промотора герА.

Определение активности предсказанного промотора герА гена, а также анализ механизмов его регуляции, проводили методом репортерного гена. Для этого две репортерные конструкции Pn.pA~lacZ были интегрированы в хромосому Ecoli. Первая конструкция содержала фрагмент ДНК N15, включающий только промотор герА, а вторая - весь участок между Ркрл и началом герА. Таким образом, были получены штаммы Х256 и Х258, соответственно. Для определения влияния СВ на активность Ргерл в репортерные штаммы вводили плазмиду pGZ-сВ, обеспечивающую конститутивную экспрессию СВ репрессора. За уровень активности промотора принимали количество синтезируемой с его помощью ß-галактозидазы, которую определяли с помощью метода Миллера.

В результате (Табл.1) было установлено, что (i) предполагаемый промотор РКрА действительно активен в клетках E.coli и (и) РгерА эффективно репрессируется СВ белком. Транскрипционная активность фрагмента генома N15, включающего помимо PKpA весь участок до начала герА (штамм À258) оказалась примерно вдвое ниже, чем самого промотора (штамм >.256), но столь же эффективно репрессируемой СВ, что свидетельствует о том, что РпрА является единственным промотором герА, а основной контроль экспрессии герА осуществляется на уровне репрессии его транскрипции. •<"

Ранее были идентифицированы два белка фага N15, являющихся «антирепрессорами», - продукты генов 31 (AntA, Ravin et al., 1999) и 471 (gp471). Понятие «антирепрессор» подразумевает в этих случаях фаговые

белки, экспрессия которш нарушает установление и поддержание л изо генного состояния; механизмы их действия установлены не были.

Таблица !_■ Регуляция транскрипции гена герЛ. Приведены средние значения из 3 независимых измерений, погрешность не превышала 10%.

штамм Регуляторные Активность р-1алактозидазы :

ф актор м (ед. Миллера)

X2S6 - 1611

AntA 1741

йТ>471 1822

С В 17

С В + AntA 146

СВ + gp471 139

Х25а - 822

СВ 13

Для определения того влияет ли экспрессия антирепрессорных белков на число копий мин и плаз ми а, основанных на регишконе N15, в штаммы Е. соИ, содержащий низкокопнйную кольцевую плазмиду рМСЮ, дополнительно вводили векторы-продуценты ангирепресоров. В обоих случаях гены антирепрессоров были клонированы в экспресс ион ном векторе рВЛ024 под контролем индуцируемого арабннозой агаРмо промотора, - ллазмвды рСА12 и рВ А0471. Штаммы ОН 10В/р^С10+рСА 12 и ОН1 ОВ/рЖ 10+рВАО-471 выращивали до середины логарифмической фазы роста, а затем вносили в среду арабинозу до концентрации 0.1%, что обеспечивало полную индукцию агаРып промотора и синтез анти реп рессор а. Анализ препаратов плазм ид ной ДНК, выделенных в ра: личные моменты времени после индукции (Рис. 1) Показывает, что экспрессия обоих антирепрессоров приводит к увеличению

Рисунок /. Влияние антирепрессоров AntA и gp471 на число копий плазмиды pNC 10. 1. - маркер мал. массы (ДНК фага лямбда, обработанная Hindll!) Дор. 2, 3, 4 - препараты плазмидной ДНК, выделенные из штамм a DHJ0B/pNC10+ рСА12 через 0, 60, 180 мин после «-pCAi2[2J)t™ индукции синтеза антирепрессора. Р0АЕМ71 («■[ д0р 55 7 „ то же. но для штамма DH10B/ pNCiO+pBAD-471_

числа копий pNC 10 в 20- 50 раз.

1 2 3 4 5 5 Г Ап'А

-pNCIt!

Поскольку число копий pNCIO определяется уровнем экспрессии rep А, антирепрессор может либо непосредственно активировать его транскрипцию (будучи транскрипционным фактором) или нарушать репрессию траснкрипции герА, обусловленную СВ. Для проверки этих предположений мы исследовали влияние антирепрессоров на активность РпрА и уровень его репрессии посредством СВ. Для этого в репортерные штаммы Х256 и Х258 дополнительно вводили плазмиды-продуценты антирепрессоров и определяли активность ß-галактозидазы, в зависимости от экспрессии AntA или gp471. В результате было установлено (Табл.1), что антирепрессоры не влияют на активность РгерА, но заметно снижает уровень его репрессии СВ репрессором.

Представленные выше результаты показывают, что антирепрессоры AntA и gp471 препятствуют связыванию СВ репрессора с операторными сайтами, что приводит к активации литического развития в целом и, в частности, к активации репликации N15 и увеличению числа копий. Наиболее вероятным механизмом является прямое связывание антирепрессора с репрессором, делающее его нефункциональным. Для проверки этого предположения мы протестировали возможность такого взаимодействия AntA-CB и gp471-CB в двугибридной системе в Е coli описанной в работе (Dmitrova et al., 1998). Эта система основана на способности гетеродимера белка LexA, содержащего один ДНК-связывающий домен дикого типа Lex+ и один мутантный (LexA408) домен, репрессировать транскрипцию с промотора, контролируемого соответствующим гибридным оператором (ор408/ор ). После замещения доменов димеризации белков LexA+ и LexA408 исследуемыми пептидами, гибридные белки синтезируются совместно, и их способность взаимодействовать оценивается по наблюдаемому уменьшению экспрессии химерного репортерного генаsßA'.lacZ, регулируемого гибридным оператором.

Из результатов (Табл.2) видно, что копродукция гибридных пептидов, состоящих из доменов LexA-DBD и LexA408-DBD, соединенных с gp471 и СВ, соответственно, привела к значительной (в 10 раз) репрессии репортерного промотора По отдельности гибридные пептиды вызывали существенно более слабую репрессию. Эти данные свидетельствуют о том, что репрес'сор СВ и

7

антирепрессор gp471 могут взаимодействовать т vivo. Результаты, полученные в случае AntA антирепрессора, не позволяют однозначно сделать вывод о его взаимодействии с СВ, поскольку коэкспрессия LexA408:CB и LexA+:AntA приводила к более низкому уровню репрессии всего в 2.2 раза.

Таблииа 2 Анализ взаимодействий репрессор-антирепрессор в бактериальной двухгибридной системе. Приведены средние значения из 3 независимых измерений, погрешность не превышала 10%.

индукция pMS604 LexA408 1-87 : pDL804 Lex+ 1-87 : Активность Р-галактозидазы относительно уровня в отсутствии репрессии.

нет - - 1

СВ - 0.88

- AntA 0.87

- ЙР471 0.91

СВ AntA 0.90

СВ gp471 0.95

5тМ IPTG - - 1

СВ - 0.63

- AntA 0.59

- gp471 0.83

СВ AntA 0.45

СВ BP471 0.086

Такая репрессия может объясняться как взаимодействием СВ - Ап1А, так и быть результатом репрессии промотора каждым пептидом по отдельности (репрессия в 1,6 раза в случае ЬехА408:СВ и в 1,7 раза в случае ЬехА+:АтйА). Однако, принимая во внимания явную гомологию между АпгА и gp471 (Рис.2), можно предположить, что механизм действия АгЛА аналогичен.

М5_др4 7.1 МУУВЗЮ,ВААУ5ССЙК1.03а1.3СЬС^У1СМ73ТУМАВ>6йг$,1МИШдарЕВМЗЙ1М7Ш1---^КБТОгШЕИКОАОЕ

Рисунок 2. Сравнение аминокислотных последовательностей АшА и §р471

2. Функциональная характеристикарепликационного гена герА

Ранее было установлено, что минимальный репликон фага N15,

обеспечивающий репликацию кольцевой миниплазмиды, включает только один

ген, герА Репликация линейной плазмиды дополнительно требует наличие

теломерных последовательностей и гена протеломеразы.

8

Было установлено (Ravin et al., 2003), что сайт инициации репликации фага N15, от-/, расположен в 3' -концевой части герА гена. Он содержит три копии последовательности GATCCA, А/Т богатый участок длиной 22 нт ( 18.2% G+C) между двумя из этих повторов и последовательность ТТТТССАСС, на один нуклеотид отличающуюся от консенсусной последовательности сайта связывания инициаторного белка Е coli., DnaA. В этой части работы мы исследовали функциональные свойства RepA, а также роль DnaA в репликации фага N15 и репликации N15 в процессе литического развития.

2.1 Анализ аминокислотной последовательности RepA белка

RepA - крупный белок, имеющий молекулярную массу 149 кД (1324 ак). Анализ последовательности RepA выявил несколько характерных мотивов (Рис. 3). Участок длиной около 100 аминокислот, расположенный в N-концевой части белка имеет мотив EGFATG, сходный с мотивом EGYATA, который характерен для многих бактериальных праймаз. Второй характерный мотив, вероятный сайт связывания ионов Mg2+, также представлен в RepA (DnD). Еще один характерный мотив, AGMGSGKS, соответствует консенсусной последовательности (G/A xxGxGKS) сайта связывания нуклеотидов А-типа, присутствующий в том числе и в различных ДНК-хеликазах.

N15 RepA - ! ^T/EGFATGA.

III II PA a j r.CYATA /

1000 1100 1200

1324aa

WB-a WB-b

N15 RepA AGMGSGKS--------DE

I I I I I II

PA a GPGGSGXS--------DE

cone G i.-vyGKS--------DE

Рисунок 3 Локализация специфических мотивов в RepA белке.

Участок белка RepA, выделенный серым цветом, имеет гомологию с последовательностями праймаз плазмид семейства IncI/IncP и репликазным белком а фага Р4. Показаны положения праймазных мотивов EGFATG и DxD (MgJ+), хеликазных мотивов WB-a и WB-b (Walker box A. G/A xxGxGKS и Walker box В, DE) и НТН мотива on - участок RepA. соответствующий положению N15 on сайта в пределах гена герА___

Поиск последовательностей, которые могли бы обеспечивать связывание RepA с ДНК, дал два результата. Во-первых, участок между 24 и 45 аминокислотами способен формировать Helix-tum-Helix (НТН) структуру, характерную для ДНК-связывающих участков. Второй район, найденный в С-концевой части RepA, имеет гомологию с рядом бактериальных и эукориотических белков, которые проявляют активности хеликазы и связываются с оп-сайтами.

2.2 Репликация миниплазмид, основанных нарепликоне N15, в штаммах Е. coli, содержащих температурно-чувствительные мутации в генах существенных для репликации.

В первой серии экспериментов была исследована зависимость репликации кольцевых (pNCIO) и линейных (pG591) миниплазмид, основанных на репликоне фага N15, от мутаций в бактериальных генах, существенных для репликации. Для этого использовали штаммы E.coli, несущие температурно-чувствительные мутации в генах dnaA (штамм С2307, мутация dnaA46), dnaG (штамм С-5582 мутация dnaG3), dtiaB (штамм GC2307, мутация dnaBlü) и dnaC (штамм Q173, мутация dnaC28). В качестве положительного контроля использовали штамм Е. coli С, не содержащий мутаций в репликационных генах. В качестве отрицательного контроля был использован штамм Ах727 (dnaX2016), содержащий температурно-чувствительную мутацию в гене dnaX, кодирующем одну из субъединиц ДНК-полимеразы III Е. coli.

Репликация pNCIO и pG591 может быть активирована при помощи антирепрессора ant А, ген которого был клонирован в векторе pBAD24 под контролем промотора araPbad-> индуцируемого арабинозой (плазмида рСА12). Плазмиды рСА12 и pNCIO (или pG591) вводили в штаммы Е. coli, содержащие температурно-чувствительные мутации (пермессивная температура - 30°С, непермессивная температура - 42°С) в репликационных генах. Культуры выращивали при 30°С до середины логарифмической фазы роста, вносили 0.1% арабинозы, обеспечивая полную индукцию агаРВАр промотора и разделяли на две части, которые инкубировали при 30°С или 42°С в течение ещё 2 часов.

10

(rifiaGji 1С 11 t2 13 14 HfiV <Ш/ЛЖ<<Ж.9Ш

Рисунок 4. Репликация кольцевой плазм иды pNCIO в штаммах Е. coli, имеющих тем пературно-чувствительные мутации в генах, ответственных за репликацию. Положения полос, соответствующих линеаризованным плазм ядам pNCIO и рСА12 показаны стрелками, Дорэжки К 4, 7. 10, 15. IК - ДНК, выделенная до активации репликации pNCIO. ©стЕлЬййе дорожки - ДНК, выделенная через 2 часа после активации репликации, проведенной при указанных температурах.

£ со;! С GC-2037 Ах727 С-5582

(ConUol) {ÖnaB7Q) iünaX2016) (OnaGSl

1 2 3 4 5 6 7 8 3 10 11 12 13 14 15

30 42

pGE.91 -pGA12 -

Рисунок 5. Репликация линейной нлазмиды pG591 а штаммах Е. coli имеющих температурпо-чувствительные мутации и генах, ответственных за репликацию. I [дазмидная (дор. l-t 2) и in суммарная (дор. 13-15) ДНК была выделена из штаммов /■_.'. coli, содержащих нлазмиды pG591 и рСА I ?.. обработана рестриктазой Nhel и анализирована с помощью электрофореза и агарозном геле (дорожки 1-12) или Саузерн-блот анализа (дор. 13-15). Дор. 1,4. 7, 10, 13 - ДНК. выделенная до активации репликации р(i591 (см. детали в тексте). Остальные дорожки ДНК, выделенная через 2 часа после активации репликации, проведенной при 30':,С или 42°С.

Препараты плазмидиой ДНК выделяли из образцов, отобранных до и после индукции, проведенно 1 при различных температурах и анализировали с помощью рестрикшюнного 1нали за. и электрофореза в агарозном геле. Увеличение числа копий рМСЮ (рС591) относительно рСА12 свидетельствует о репликации pNC10 (р 05911 и соответствующих условиях.

Полученные результаты [Рис, 4 и 5) показывают, что на репликацию ми ни плазм ид не влияет мутации в генах сЬшЛ, с!паС и с!поВ, В гоже время, как и

1 2 3 4 5 6 7 3 3 10 11 12

ожидалось, для репликации миниплазмид необходима ДНК-полимераза клетки хозяина. Наиболее интересный и неожиданный результат этого эксперимента заключался в том, что, несмотря на наличие «праймазных» мотивов в RepA, репликация кольцевых и линейных миниплазмид зависит от DnaG праймазы клетки-хозяина (штамм С-5582).

2.3 Литическое развитие фага N15 в штаммах, содержащих температурно-чувствителъные мутации в репликационных генах

Ранее было показано, что герА необходим как для репликации плазмидного профага так и для репликации N15 в процессе литического развития, однако, зависимость от репликативных функций клетки-хозяина может быть в этих случаях различной. Поэтому мы исследовали влияние мутаций по генам dnaA, dnaG, dnaB и dnaC на ход литического развития фага N15. Для этого штаммы Е. coli, содержащие температурно-чувствительные мутации в репликационных генах, инфицировали фагом N15 при 30°С или 42°С. Эффективность инфекции клеток С-2307, С-5582, GC 2037, Q173, а также контрольных штаммов Е. coli С и Ах727, «clear-plaque» мутантом фага N15 количественно определяли как количество фагов в среднем образующихся при инфекции единичной клетки («урожай»). Образование фагового потомства предполагает репликацию ДНК N15 в соответствующих условиях. Полученные результаты показывают, что N15 продуктивно инфицирует штаммы Е. coli С, С-2307, С-5582, GC 2037, Q173, как при 30°С, так и при 42°С. В то же время, как и следовало ожидать, фаг N15 не дает потомства на штамме Ах727 при непермиссивной температуре. Таким образом, литическое развитие N15, а, следовательно, и литическая репликация, не зависит от хозяйских генов dnaA, dnaB, dnaC, а также и от dnaG.

В частности, эти результаты указывают на независимость репликации ДНК фага N15 от DnaG праймазы в случае инфекции. Для подтверждения этого результата мы напрямую определили эффективность синтеза ДНК N15 методом Саузерн-блот анализа на суммарной ДНК, выделенной из инфицированных N15 клеток С-5582. Из полученных результатов (Рис. 6) видно, что репликация ДНК

N15 в этих условиях происходит одинаково эффективно при ЗО'С или 42°С и, следовательно, действительно не зависит от DnaG.

Далее мы протестировали, будет ли репликация ДНК N15 также независима от DnaG во время логического развития фага в случае, если оно инициировано в лизогеиной культуре, т.е. ее исходным субстратом является не инфицирующая фаговая ДНК, а линейная плазм и да той же структуры, что и pG591. Полученные результаты показали, что в этом случае репликация ДНК N15 зависит от DnaG: число копий плазм иды N15 увеличивается при 30°С, но не при 42°С (Рис. 6).

А В

С-5582 (dnaG3) С-5582 {сЗпэвЗ) £ coli С

1= 0 20 mm 40 min 60 mm 12 3 4 5 6 7

Рисунок 6.

(A) Репликация ДНК фага h 15 при инфекции клеток С5582 при 30°С или 42°С, Суммарная клеточная ДНК была выделена в указанные моменты времени после начала инфекции и анализирована с помощью Саузерн-блот анализа с N15-специфическим зондом.

(B) Репликация ДНК фага N15 после активации литического развития в лизогенном штамме.

Плазмидаш ДНК из штаммов С-5582 (дорожки 2-4) и Е. coli С (дорожки 5-7), содержащих профаг N15 и плазмиду рСА12, была выделена, обработана EcoRl и проанализировала е помощью электрофореза.

Дорожки 2 и 5 - ДНК. выделенная до активации литического развития. Остальные дорожки - ДНК. выделенная через i час после активации литического развития, проведенной при 30°С или 42°С.

Положение рСА12 указано стрелкой, остальные полосы являются результатом обработки ДНК N15 ЕсоЮ (9.01: 8.83; 8.77; 8;48; 7.32; 2.62; 0.74; 0.56 тпн)._

Таким образом, репликация ДНК фага N15 зависит от бактериальной DnaG праймазы в случае, если она инициируется в состояния профага, но ие требует DnaG в случае фаговой инфекции. Такая разница в необходимости DnaG может быть объяснена различными механизмами репликации линейной плазмиды и репликации ДНК NJ5 во время инфекции. В ходе репликации профага N15

двунаправленная репликация инициируется с orí сайта, расположенного в гене герА. После дупликации левой теломеры, протеломераза разрезает теломерный сайт с образование Y-подобной структуры. После репликации правого теломерного сайта происходит его процессинг, приводящий к образованию двух линейных молекул (Ravin et al., 2003). Наши результаты показывают, что DnaG праймаза необходима для репликации, осуществляющейся таким способом, являющимся по существу комбинацией стандартного 0-механизма и действия протеломеразы, а также для репликации кольцевых миниплазмид основанных на репликоне N15 (Рис. 7).

cosL

teIRL

cosR

DnaG - independent ? lambda-like late replication

cosRL

L

Рисунок 7. Возможные механизмы образования различных форм ДНК N15 и ее репликации при литическом развитии.

(A) Преобразование фаговой ДНК в линейную плазмиду (Сварчевский, 1986)

(B)-Репликация линейного плазмидного профага (Ravin et al., 2003)

(C) Репликация ДНК N15 при активации литического развития в лизогенной культуре (Ravin, 2003)

(D) Возможный DnaG-независимый путь литической репликации ДНК фага при инфекции (Mardanov and Ravin, 2006).

Показано предполагаемое участие продуктов генов TelN (Т) и RepA (R) в различных этапах репликации или образования теломер._

Механизм репликации фага N15 во время литического развития изучен плохо. Исходя из того, что гены аппарата упаковки ДНК фага N15 очень

14

похожи на соответствующие гены фага лямбда, можно предположить, что на поздней стадии литического развития репликация ДНК фага N15 происходит подобно фагу лямбда, т.е. по механизму «катящегося колеса» (Рис. 7). В случае инфекции молекула ДНК |>ага>Л5 замыкается по когезивным концам, образуя кольцевую молекулу, которая, в принципе, может реплицироваться по механизму «катящегося колеса» сразу после своего образования. Такая репликация может не зависеть от ОпаСт, а функция праймазы обеспечиваться КерА, В случае, если логическое развитие инициируется в лизогенной культуре, исходным еубегратом является не кольцевая молекула, а линейная молекула лрофага. Репликация такой молекулы, как и линейных миниплазмид, зависит от ОпаС.

2.4 Функциональная роль потенциального ЛпаА-бокса в оН-сайте N15

Представленные выше результаты показывают, что репликация N15 не зависит от ОпаА, Мы протестировали, действительно ли предполагаемый О п аА-бокс, расположенный в оп-сайте, существенен для репликации миниплазмид, основанных на репликоне N15. Для этого мы провели сайт-направленный мутагенез этого района, введя мутации, изменяющие последовательность ТТТТССАСС этого сайта на ТТСТСТАСС. но не изменяющие аминокислотную последовательность КерА. Эти мутации были успешно введены как в кольцевую (рКС04), так и в линейную (р0591) шништазмиды, что указывает на то, что предполагаемый ЭпаА-бокс не является абсолютно необходимым для их репликации.

2 3 4 э в

Рисунок 8. Слияние мутаций в БпаА -сайте на »1 -►! число копий кольцевых и линййНых миниплазмид.

м ; 1, 4 * маркер молекулярной массы, длины

фрагментов указаны вт.и.н. «•7 - | 2,-ДНК из штамма ОН1 ОВ/рПАС \ 0+р0591.

3, - ДНК ж штамма ПНЮВ/рОА010+р0591опЗ-4

5, - ДНК из штамма ОН 1 ОВ/рОАС I (Н-рНС04

6, - ДНК из штамма ОН 1 ОВ/'рОАО И>рМС04опЗ-4 На дор. 2,3,5,6 верхние полосы соответствуют N15-плазмидам, нижние - рРАШО.__

2 3. 2.0 "

В следующем эксперименте мы сравнили число копий у пар плазмид, содержащих и не содержащих мутации в DnaA-боксе: pNC04ori3-4 с pNC04 и pG591ori3-4 с pG591. Мы установили, что нарушение DnaA-бокса увеличивает число копий кольцевой плазмиды pNC04 в 3.6 раза а линейной плазмиды pG591 - 2.1 раза (Рис 8.). Таким образом, DnaA, вероятно, является негативным, а не позитивным регулятором инициации репликации N15.

3. Экспрессионные векторы на основе репликона фага N15

Целью этой части работы является создание систем экспрессии белков в клетках £. coli, сочетающих высокий уровень экспрессии продукта с большим диапазоном регуляции (т.е. низким базовым уровнем). Основная идея нашего подхода состоит в использовании регулируемого промотора в сочетании с плазмидным репликоном, число копий которого может регулироваться в широком диапазоне, от 3-4 до 100 на хромосому. Диапазон регуляции синтеза продукта расширен за счет перемножения эффектов активации промотора и эффекта дозы гена.

Выбор в качестве основы для создания новой экспрессионной системы фага N15 был обусловлен целым рядом его специфических особенностей. Во-первых, кольцевая плазмида, включающая только гены герА и сВ, является низкокопийной (3-5 копий на хромосому). Геном N15 содержит ген антирепрессора antA, продукт которого может инактивировать СВ, в результате чего число копий миниплазмиды возрастает в 50-100 раз. Во-вторых, фаг N15 обладает собственной системой сегрегационной стабильности, обеспечивающей его стабильное наследование в неселективных условиях.

Таким образом, геном N15 содержит все. необходимое для создания искусственной стабильной системы экспрессии с широкими возможностями регуляции процесса: участок размером около 6 т.п.н., способный обеспечивать репликацию низкокопийной миниплазмиды, ген антирепрессора {antA), в результате экспрессии которого число копий плазмиды может быть увеличено в 50-100 раз, и оперон (sop), за счет экспрессии которого in trans достигается её стабильное наследование.

16

3.1 Конструирование экспрессы он НЫх р!\'15И векторов

Были сконструированы экспрессионные вектора на основе репликона фага N15. Все N15 векторы включают фрагмент ДНК фага N15 (с 28887 по 35000 н.п), который содержит гены 34, 35, 36, герА и сВ. Этого фрагмента достаточно для репликации кольцевой низкок опий ной плазм иды, более того, гены 34 - 36 несущественны для репликации (Ravin et al., 2003). На Рис. 9 показана структура pN15E векторов. Сконструированные экспресеионные вектора pNl5E4 и pN15E6 имеют разные индуцируемые промоторы,

(А)

мезг

АНН

L»

MCSî

-<ЯИ Ш]

araC tm ТО ton

Notll

.4

1ч 35 35 герА çB

pN13E4 (9214 bp)

«Ч'нша-а-

34 35 36 герА ce

PN15E6

¡9251 bp)

(В)

so

MCS1

TTTGGGCTAG CAGGAGGAAI .TAGTCCftTOOGABQ TCAGATCTGGGCCCGAC Nhel

MCS2 SO

Ncol

Sat! Bgill Apal GAATTCATTAMGAGGA GAA ATTAA С CÄP3 GGA G Ç ÎCA G AT CT GGGC CC GA С

Ncol

Sac! Bgill Apal

Рисунок 9. Сконструированные рЫ15Е вектора.(А) Схема рМ5Е векторов

Гены показаны серыми стрелками, промоторы - черными стрелками, терминаторы

транскрипции-закрашенными прямоугольниками,

(В) Последовательность ВЬлилинкеров (МСЗ) векторов рМ 15Е. Показаны только уникальные сайты. Стартов;. й колон АТС, находящийся в сайге Ксо! выделен серым.

Первый вектор, pNl.'>E4, содержит регуляторные элементы арабилозного оперона Е. coli - ген агаС и агаР^« промотор, д&тее следует полилинкер MCS (MCS 1), который включает последовательность сайта связывания рибосом SD между Nhel и ¿pel сайтами, перед трансляционном старт-кодоном (ATG) в Ncol сайте, В случае, если трансляция клонируемого гена должна ини циироваться с его собственного старт-кзяона, ген должен быть клонирован по сайту Spei. После полилинкера слетует терминатор транскрипции фага лямбды ТО,

введенный с целью предотвращения транскрипции нецелевых генов вектора при индукции araPßAD промотора

Второй вектор, pN15E6, вместо агаРвло содержит сильный промотор фага Т5, перекрывающийся двумя Lac операторами, полученный из pQE60 (QIAGEN). После промотора следует полилинкер MCS2, включающий сайт связывания рибосом и трансляционный старт кодон, расположенный в Ncol сайте. Два терминатора транскрипции располагаются рядом с промотором: четыре тандемные копии терминатора транскрипции Т1 рибосомного оперона Е. coli rrnB в их естественной ориентации расположены перед промотором. После полилинкера расположен терминатор транскрипции фага лямбда, ТО.

Нуклеотидные последовательности векторов представлены в GenBank под номерами EF392865 (pN15E4) и EF397941 (pN15E6).

3.2 Конструирование штамма Е. coli DH31soplacI

Для обеспечения корректного функционирования экспрессионных векторов был сконструирован штамм Е coli, содержащий интегрированные в хромосому ген антирепрессора antA под контролем araPBAD промотора, регуляторный ген арабинозного оперона агаС и sop оперон фага N15. Для обеспечения репрессии РТ5-lac промотора в отсутствии индуктора в хромосому также был интегрирован ген репрессора лактозного оперона lacfi , обеспечивающий высокий уровень синтеза Lacl. Фрагмент ДНК (Рис. 10), содержащий все выше описанные гены, был интегрирован в хромосому Е coli штамма DH10B по методике описанной в работе (Platt et al., 2000), в результате чего был получен штамм DH31sopLacI. В случае необходимости интегрированный фрагмент может быть перенесен в другие штаммы Е. coli методом PI - трансдукции.

Psop Pbad

bio tj]— cat - lacl -^л-Ш^-sopA sopB £ antA-^Ш- araC —jjl gal attL P|acl° Tsop gttR

Рисунок 10 Расположение регуляторных элементов в хромосоме сконструированного штамма DH3lsoplacI. Гены показаны серыми стрелками, промоторы - черными стрелками, терминатор транскрипции Tsop - закрашенным прямоугольником.

3.3 Характеристика сконструированных экспрессионных систем

Векторы рЖ5Е являются низкфкопййными плазмидами. Штамм ПН 31зор1.ас1 дает возможность регулировать число копий векторов, инактивируя СВ репрессо 1 с помощью АША антирепрессора, ген которого интегрирован в хромосому под Контролем агарл,1л промотора. Для этого достаточно активировать п гомотор внесением в среду арабинозы.

Для количественной огенки диапазона регуляции числа копий рМ15Е4 б штамм ОН3150рЬай1/рШ 5Е4 была введена референсная плазмида рАСУС184, число копий которой не зависит от АпгА. Штамм ОН.? 1$ор1асИ\М 15Е4+ рАСУС! 84 выращивали до середины логарифмической фазы роста, затем вносили арабинозу до концентрации 0.2%, что обеспечивало полную индукцию агаРвАО промотора. Изменение числа копий плазмиды рЫ15Е4 определяли, проводя электрофоре™ чес кий анализ препаратов плазмидной ДНК, путем сравнения ннтенсивиостей полос, соответствующих рЫ 15 Е4 и реферсной гшазмиде рАСУС 184 па цифровых фотографиях гелй. Результаты, представленные на Рис. 11 показывают, что число копий рМ15В4 при внесении арабинозы в среду увеличивается примерно в 10 раз в течение 2-х часов. Аналогичный результат был получен для вектора рМ15Е6.

(А)

30 60 90 120 150 130 mill

" pN15Е4

■ рАСУ С181

Рисунок 11. Увеличение числа копий вектора pN 15Е4 в штамме DH31 soplad после внесения арабинозы гз среду,

(A) Анализ препарате» плазмидной ДНК из штамма !3H31soplacI, содержащего плазмиды pN 15Е4 и рАСУС184, выделенных в различные моменты времени после внесения арабинозы в среду.

(B) Количественный анализ относительных иптенеивностей полос, соответствующих плазмидам f>Nl$E4 и рАСУСШ на панели А. Интенсивности полос были определены с помощью программы TINA 2.07d.

Стабильное наследование плазмидного профага N15 обеспечивается за счет правильного распределения реплицированных молекул между дочерними клетками при делении, обусловленного sop опероном профага, включающего гены sopA и sop В Продукты этих генов действуют in trans, связываясь с четырьмя см-дейстующими центромерными сайтами, IR (Ravin and Lane, 1999). Поскольку pN15E векторы содержат один из центромерных сайтов, IR1, расположенный в repА гене, можно предполагать, что векторы будут стабильно наследоваться в отсутствии антибиотика в штамме DH31sopLacI, продуцирующем Sop белки. В следующей серии экспериментов мы определяли стабильность наследования pN15E векторов в неселективных условиях. Полученные результаты показывают (Рис. 12), что скорость потери pN15E4 в штамме DH31sopLacl не превышает 0.01% на генерацию, в то время как в штамме DH10B, не содержащем sop оперон N15, вектор быстро теряется.

100 о

■О 99'5% Рисунок I DH31 soplad

12 Наследование

вектора pN15E4 в штаммах DH10B и DH31 soplad при выращивании культур без антибиотика.

dh10b

20 30

generations in the absence of selection

Для количественного

определения диапазона регуляции экспрессии использовали репортерный ген {3-галактозидазы, который клонировали в обоих экспрессионных векторах. Для сравнения мы клонировали lacZ в коммерческом экспрессионном векторе pQE60 (Qiagen), в результате чего была получена плазмида pQE60-!acZ.

Результаты количественного определения р-гапактозидазы в различных условиях индукции приведены в Таблице 3. Как следует из полученных результатов, pNl5E4 имеет самый низкий базовый уровень экспрессии (0.3

MU), который в 10 раз ниже, чем в случае вектора pN15E6 (3 MU) и более чем в 200 раз ниже, чем в случае pQE60. Активация промотора увеличивает экспрессию в 100 раз (штамм DH10B), в то же время одновременная активация промотора и увеличение числа копий вектора (штамм DH31 soplad) приводит к увеличению уровня р-галактозидазы в 7640 раз через 3 часа, и в 23000 раз -через 6 часов. Таким образом, синтез белка только качественно коррелирует с числом копий плазмиды, которое увеличивается в 10 раз.

Таблииа 3. Уровни продукции ß-галактозидазы, обеспечиваемые экспрессионными векторами pN15E и pQE.

Плазми да Штамм-хозяин активность ß-галактозидазы без индукции индукторы активность ß-галактозидазы через 3 часа после индукции диапазон регуляции (разы)

pN15E4 -lacZ DH10B 0,16 ±0,01 арабиноза 15 ± 1,2<2) 94

DH31 soplacl 0,33 ±0,03 арабиноза 2521 ±90(3) 7639

pN15E6 -lacZ DH31 soplad 3,0 ±0,16 IPTG 10090 ±900 3363

IPTG + арабиноза 47430 ±1600 15877

pQE60-lacZ DH31 soplacl 70 ±8 IPTG 64020 ±1500 915

SG13009/ pREP4 2625 ±160 IPTG 71660 ±600 27

Экспрессионная система DH31sopacI/pN15E6 обеспечивает другое «окно» регуляции синтеза продукта. Общий диапазон регуляции синтеза продукта в DH31sopacI/pN15E6 составляет более 15000 раз - один из наибольших, описанных для экспрессионных векторов Е. coli. Базовый уровень экспрессии в этом случае примерно в 10 раз выше, чем у pN15E4, в то время как максимальный уровень экспрессии ß-галактозидазы сравним с таковым в случае pQE60. Вектор pQE60, однако, обладает гораздо более узким диапазонам регуляции вследствие значительно более высокого уровня экспрессии в неиндуцированном состоянии.

Как было установлено, сконструированные нами экспрессионные системы, в отличие от системы pQE, обеспечивают низкий базовый уровень экспрессии

продукта, что может быть важным преимуществом сконструированных систем в случае клонирования и экспрессии генов, продукты которых токсичны для клетки. Для проверки этого предположения, мы проклонировали ген эндонуклеазы рестрикции Ес118Кх в отсутствии гена, кодирующего соответствующую метилазу.

Ген Ес118Ю был успешно клонирован в экспрессионном векторе рЫ15Е4. В случае векторов рМ15Е6 и рС>Е клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды, получить не удалось. На следующем этапе мы провели эксперимент, целью которого было подтвердить функциональную активность клонированной в рМ15Е4 рестриктазы. Для этого культуру ОН31БорЬас1/рЫ15Е4-ес/ выращивали при 37°С в ЬВ бульоне до середины логарифмической фазы роста, затем добавляли арабинозу до 0.1%, что приводило к активации синтеза рестриктазы. Препараты суммарной клеточной ДНК выделяли до индукции, а также через 3 часа после ее начала и анализировали с помощью электрофореза. Как следует из результатов, представленных на Рис. 13, индукция синтеза рестриктазы приводит к деградации высокомолекулярной хромосомной ДНК. Таким образом, клонированный ген является функционально активным.

Рисунок 13 Элекгрофоретический анализ препаратов ¿тото5ота| суммарн0й ДНК, выделенной из штамма Г)НЗ 1 вор/рЫ 15Е4-Ес1 до (дорожка 2) и через 2 часа (дорожка 3) после начала индукции синтеза рестриктазы Ее! 18Кг На дорожке 1 нанесен маркер молекулярного веса. Отмечено положение геномной ДНК и одновременно выделяемой РНК.

ЮкЬ-ЗКЬ-

Полученные результаты показывают, что низкий базовый уровень

экспрессии в системе DH31sopLacI/pN15E4 действительно позволяет

клонировать токсичный продукт.

' При полном использовании потенциала двух сконструированных

векторных систем pN15E активность генов может контролироваться в

диапазоне более чем 150 000 раз. Строгий контроль уровня транскрипции,

22

возможность регулирования активности генов количественно в сверхшироких диапазонах являются основными преимуществами созданных нами экспрессионных систем, открывающими новые перспективы для изучения клеточной физиологии и контролируемой экспрессии гетерологичных генов.

1. Идентифицирован промотор репликационного гена герА фага N15 и показано, что он может быть репрессирован белком СВ фага. Инактивация СВ репрессора в результате связывания с ним белков-антирепрессоров приводит к активации промотора герА и увеличению числа копий профага

2. Репликационный белок RepA фага N15 участвует в инициации репликации и обладает активностями праймазы и хеликазы.

3. Инициаторный белок DnaA Е coli не требуется для инициации репликации N15 и является негативным регулятором числа копий миниплазмид, основанных на репликоне N15.

4. На основе репликона фага N15 сконструированы два вектора для экспрессии целевых белков в клетках Е. coli, содержащих регулируемые промоторы. Сконструирован штамм Е. coli, в хромосому которого интегрирован ген антирепрессора N15 под контролем промотора арабинозного оперона, позволяющий активировать репликацию и увеличивать число копий векторов. Диапазон регуляции синтеза продукта в созданных системах экспрессии расширен за счет перемножения эффектов активации промотора и увеличения числа копий вектора.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Марданов A.B., Равин Н.В. (2004) Новые экспрессионные векторы с

регулируемым числом копий и индуцируемыми промоторами на основе

ВЫВОДЫ

N15.

репликона фага N15. Тезисы конференции «Ломоносов-2004», т.1., с.21. Москва.

2) Марданов А.В., Страхова Т.С., Равин Н.В. (2004) RepA белок линейной плазмиды N15 обладает праймазной и хеликазной активностями. Тезисы 8-й международной школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века», с.20-21. г. Пущино.

3) Mardanov A.V., Ravin, N.V. (2004) Replication of phage N15 in the linear prophage mode and in course of lytic growth requires different host replication functions. Abstracts of the conference "Plasmid Biology-2004", Corfu, Greece. Опубликовано в журнале Plasmid, 2005, 53, p.31-32

4) Марданов A.B., Страхова T.C., Равин Н.В. (2004) RepA-белок бактериофага N15 обладает активностью ДНК хеликазы. Доклады академии наук, том' 397, № 2, с. 217-219.

5) Mardanov A.V., Ravin N.V. (2006) Functional characterization of the repA replication gene of linear plasmid prophage N15. Research in Microbiology, 157,

6) Смагин В. А., Марданов А. В., Равин H. В. (2006) Создание экспрессионных векторов с независимой регуляцией активности промотора и числа копий. Тезисы 10-й международной школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века», с.396. г. Пущино.

7) Марданов А.В., Равин Н.В. (2007) Инициаторный белок DnaA Escherichia coli является негативным регулятором репликации линейного фага-плазмиды N15. Генетика, т. 43, №1, стр. 45-51.

Заявка на патент:

Марданов А.В., Равин Н.В. (2006) Вектор на основе репликона бактериофага N15 и рекомбинантный вектор для регулируемой экспрессии целевого гена в клетках Escherichia coli, штамм Escherichia coli, обеспечивающий возможность регуляции числа копий вектора, и система экспрессии. Заявка на Патент РФ №2006110089.

176-183.

Принято к исполнению 15/03/2007 Исполнено 16/03/2007

Заказ № 167 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495)975-78-56

www.autoreferat.ru