Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональная характеристика репликона бактериофага N15 и конструирование на его основе экспрессионных векторов с регулируемым числом копий

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Марданов, Андрей Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Репликация кольцевых бактериальных плазмид.

1.1 Сайты инициации репликации.

1.2 Репликационный аппарат E.coli.

1.3 Инициация и элонгация репликации, зависящие от плазмидных Rep белков.

1.4 Репликация фага-плазмиды Р4.

1.5 Репликация по механихму вытеснения цепи (Strand Displacement Replication).

1.6 Репликация по механизму катящегося кольца.

2. Регуляция репликации и числа копий плазмид.

2.1 Контроль с помощью антисмысловой РНК.

2.2 Контроль числа копий с помощью репрессора транскрипции и антисмысловой РНК.

2.3 Регуляция с помощью итеронов.

3. Векторы для экспрессии белков в клетках Е. coli.

3.1 Регулируемые промоторы.

3.2 Плазмидный репликон.

4. Особенности генетики и механизма репликации ДНК бактериофага N15.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Механизмы регуляции числа копий профага N15.

1.1 Идентификация промотора гена герА и изучение влияния СВ репрессора на уровень транскрипции герА.

1.2. Анализ роли антирепрессоров N15 в регуляции числа копий и уровня транскрипции герА.

1.3 Анализ взаимодействия репрессор-антирепрессор в бактериальной двугибридной системе.

2. Функциональная характеристика репликационного гена г ер А.

2.1 Анализ аминокислотной последовательности RepA белка.

2.2 Репликация миниплазмид, основанных на репликоне N15, в штаммах Е. coli, содержащих температурно-чувствительные мутации в генах, существенных для репликации.

2.3 Литическое развитие фага N15 в штаммах содержащих температурно-чувствительные мутации в генах, существенных для репликации.

2.4 Зависимость репликации фага N15 от DnaG клетки-хозяина.

2.5 Репликация N15 не зависит от хеликазы Rep Е. coli.

2.6 Функциональная роль потенциального DnaA-бокса в orí сайте N15.

3. Экспрессионные вектора на основе репликона фага N15.

3.1 Конструирование серии экспрессионных pN15E векторов.

3.2 Конструирование штамма Е. coli DH31soplacI.

3.3 Регуляция числа копий pN15E векторов.

3.4 Стабильное наследование pN15E векторов в штамме DH31 soplad.

3.5 Диапазон регуляции синтеза продукта в экспрессионных системах pN15E.

3.6 Клонирование и экспрессия гена эндонуклеазы рестрикции Ecll8Ki.

ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Регуляция репликации и конроль числа копий профага N15.

2. Функциональная характеристика герА.

3. Роль инициаторного белка DnaA Е. coli в регуляции репликации N15.

4. Векторы для экспресии белков в клетках Е. coli на основе репликона N15.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональная характеристика репликона бактериофага N15 и конструирование на его основе экспрессионных векторов с регулируемым числом копий"

До недавнего времени общепринятым было представление о том, что эукариотические организмы имеют линейные хромосомы, а бактериальные геномы представляют собой кольцевые молекулы. Однако, в течение последних двадцати лет это правило перестало быть универсальным, поскольку линейные плазмиды и хромосомы были обнаружены в различных прокариотических организмах. Первым обнаруженным линейным репликоном у прокариот является умеренный бактериофаг N15, который в лизогенном состоянии не интегрируется в хромосому Е. coli, а представляет собой линейную плазмиду с ковалентно замкнутыми теломерами. Позднее было установлено, что аналогичную структуру ДНК имеют линейные хромосомы и плазмиды спирохет рода Borrelia (Barbour and Garon, 1987; Fraser et al., 1997), одна из хромосом Agrobacterium tumefaciens (Allardet-Servent et al., 1993; Goodner et al., 1999), a также профаги умеренных бактериофагов PY54 (Hertwig et al., 2003) и фК02 (Casjens et al., 2003).

В то же время, информация о молекулярных механизмах репликации линейных хромосом с ковалентно замкнутыми теломерами у прокариот весьма ограничены. В частности, до проведения этой работы практически отсутствовали данные о свойствах репликационных белков линейных плазмид и механизмах регуляции их репликации и числа копий, необходимые для разработки моделей репликации. Основное внимание в настоящей работе посвящено изучению этих проблем на примере умеренного бактериофага N15. Тот факт, что N15 является не просто плазмидой, а умеренным бактериофагом, позволяет предположить, что репликация его ДНК может следовать разным механизмам в плазмидном состоянии и при литическом развитии, с участием различных репликационных белков.

Одним из практических применений фундаментальных знаний в области репликации плазмид и контроля экспрессии их генов является конструирование векторов для продукции целевых белков. Escherichia coli является одним из наиболее привлекательных объектов, используемых для продукции гетерологичных белков, вследствие того, что она способна к быстрому росту до высоких концентраций на простых средах, ее генетика достаточно хорошо охарактеризована, доступен большой набор клонирующих и экспрессионных векторов и мутантных штаммов.

Идеальный экспрессионный вектор должен обеспечивать высокий уровень синтеза продукта в случае индукции при минимально низком базовом уровне экспрессии, что необходимо, в первую очередь, при экспрессии продуктов, которые могут быть токсичны для клетки. Несмотря на это, большинство современных систем для синтеза гетерологичных белков в Е. coli обладают относительно узким диапазоном регулирования. Вследствие чего системы, обладающие низким базовым уровнем экспрессии, не позволяют достичь высокого уровня синтеза продукта при полной индукции, а системы с высоким максимальным уровнем имеют обычно и высокий базовый уровень экспрессии, что делает их мало пригодными для получения чужеродных белков, которые могут быть токсичными для бактериальной клетки. Таким образом, задача создания экспрессионных систем, сочетающих высокий максимальный уровень экспрессии продукта с большим диапазоном регуляции (т.е. низким базовым уровнем), продолжает оставаться актуальной.

Основная идея нашего подхода состоит в использовании регулируемого промотора в сочетании с плазмидным репликоном, число копий которого может регулироваться в широком диапазоне, от 3-4 до 100 на хромосому. Диапазон регуляции синтеза продукта раширяется за счет перемножения эффектов активации промотора и эффекта дозы гена. Для создания этих систем экспресии были использованы репликон и регуляторные элементы бактериофага N15.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основная цель работы состояла в функциональной характеристике генов, обеспечивающих репликацию ДНК фага N15, изучении механизмов регуляции числа копий профага и конструировании на основе репликона N15 векторов для экспрессии целевых белков в Е. coli.

При этом были поставлены следующие основные задачи:

1. Исследование механизмов регуляции числа копий профага N15 и миниплазмид на его основе.

2. Изучение механизмов действия антирепрессоров N15 и их вляние на репликацию и число копий профага.

3. Функциональная характеристика репликационного гена герА и установление роли репликационных белков клетки-хозяина в репликации профага N15 и ДНК фага N15 в ходе литического развития.

4. Конструирование и характеристика экспрессионных векторов на основе репликона N15, число копий которых может регулироваться.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Марданов, Андрей Владимирович

выводы

1. Идентифицирован промотор репликационного гена герА фага N15 и показано, что он может быть репрессирован белком СВ фага. Инактивация СВ репрессора в результате связывания с ним белков-антирепрессоров приводит к активации промотора герА и увеличению числа копий профага N15.

2. Репликационный белок RepA фага N15 участвует в инициации репликации и обладает активностями праймазы и хеликазы.

3. Инициаторный белок DnaA Escherichia coli не требуется для инициации репликации N15 и является негативным регулятором числа копий миниплазмид, основанных на репликоне№5.

4. На основе репликона фага N15 сконструированы два вектора для экспрессии целевых белков в клетках Е. coli, содержащих регулируемые промоторы. Сконструирован штамм Е. coli, в хромосому которого интегрирован ген антирепрессора N15 под контролем промотора арабинозного оперона, позволяющий активировать репликацию и увеличивать число копий векторов. Диапазон регуляции синтеза продукта в созданных системах экспрессии расширен за счет перемножения эффектов активации промотора и увеличения числа копий вектора.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Марданов А.В., Равин Н.В. (2004) Новые экспрессионные векторы с регулируемым числом копий и индуцируемыми промоторами на основе репликона фага N15. Тезисы конференции «Ломоносов-2004», т.1., с.21. Москва.

2) Марданов А.В., Страхова Т.С., Равин Н.В. (2004) RepA белок линейной плазмиды N15 обладает праймазной и хеликазной активностями. Тезисы 8-й международной школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века», с.20-21. г. Пущино.

3) Mardanov A.V., Ravin, N.V. (2004) Replication of phage N15 in the linear prophage mode and in course of lytic growth requires different host replication functions. Abstracts of the conference "Plasmid Biology-2004", Corfu, Greece. Опубликовано в журнале Plasmid, 2005, 53, p.31-32

4) Марданов A.B., Страхова T.C., Равин Н.В. (2004) RepA-белок бактериофага N15 обладает активностью ДНК хеликазы .Доклады Академии наук, том 397, № 2, с. 217-219.

5) Mardanov A.V., Ravin N.V. (2006) Functional characterization of the repA replication gene of linear plasmid prophage N15. Research in Microbioogy, 157,176-183.

6) Смагин В. А., Марданов А. В., Равин H. В. 2006. Создание экспрессионных векторов с независимой регуляцией активности промотора и числа копий. Тезисы 10-й международной школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века», с.396. г. Пущино.

7) Марданов А.В., Равин Н.В. (2007) Инициаторный белок DnaA Escherichia coli является негативным регулятором репликации линейного фага-плазмиды N15. Генетика, т. 43, №1, стр. 45-51.

8) Mardanov A.V., Strakhova T.S., Smagin V.A., Ravin N.V. (2007) Tightly regulated, high-level expression from controlled copy number vectors based on the replicon of temperate phage N15. Gene, (in press).

Патент:

Марданов A.B., Равин Н.В. (2006) Вектор на основе репликона бактериофага N15 и рекомбинантный вектор для регулируемой экспрессии целевого гена в клетках Escherichia coli, штамм Escherichia coli, обеспечивающий возможность регуляции числа копий вектора, и система экспрессии. Заявка на Патент РФ (№2006110089).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Марданов, Андрей Владимирович, Москва

1. Востров А. А., Малинин А.Ю., Рыбчин В.Н., Сварчевский А.Н. 1992. Конструирование линейных плазмидных векторов для клонирование в клетках Esherichia coli. Генетика, 28,186-188.

2. Голуб Е.И., Равин В.К. 1967. Новая система фаговой конверсии. Доклады АН СССР, 174,465-467.

3. Равин В.К. 1968. Функционирование генов умеренного бактирофага в лизогенных клетках, Генетика, 5,119-124.

4. Равин В.К. 1971. Лизогения. Издательство «Наука», Москва.

5. Сварчевский А.Н. 1986. Фазмида N15: особенности генетики и структура ДНК. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 1986. Ленинград.

6. Сварчевский А.Н., Рыбчин В.Н. (1984). Характеристика плазмидных свойств бактериофага N15. Мол. Генет. Микроб. Вирусол., 10,34-39.

7. Abeles, A. L., Т. Brendler, and S. J. Austin. 1993. Evidence of two levels of control of PI oriR and host oriC replication origins by DNA adenine methylation. J. Bacterid. 175:7801-7807.

8. Abeles, A. L., L. D. Reaves, B. Youngre-Grimes, and S. J. Austin. 1995. Control of PI plasmid replication by iterons. Mol. Microbiol. 18:903-912.

9. Acebo, P., M. T. Alda, M. Espinosa, and G. del Solar. 1996. Isolation and characterization of pLS 1 plasmid mutants with increased copy numbers. FEMS Microbiol. Lett. 140:85-91.

10. Allardet-Servent A., S. Michaux-Charachon, E. Jumas-Bilak, L. Karayan, and M. Ramuz. 1993. Presence of one linear and one circular chromosome in the Agrobacterium tumefaciens C58 genome. J. Bacteriol. 175, 7869-7874.

11. Alonso, J. C., and R. H. Taylor. 1987. Initiation of plasmid pC194 replication and its control in Bacillus subtilis. Mol. Gen. Genet. 210:476-484.

12. Austin, S. J., and K. Nordstrom. 1990. Partition-mediated incompatibility of bacterial plasmids. Cell 60:351-354.

13. Baneyx, F. (1999) Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr. Opin Biotech. 10:411-421.

14. Barbour A.G., and Garon C.F., 1987. Linear plasmids of the Borrelia burgdorferi have covalently closed ends. Science, 237,409-411

15. Barrett, K. J., Gibbs, W., and Calendar, R. (1972). A transcribing activity induced bysatellite phage P4. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 69,2986-2990.

16. Benkovic S.J, A.M. Valentine, and F. Salinas (2001) Replisome-mediated DNA replication. Annu. Rev. Biochem. 70:181-208.

17. Bernander R., S. DasGupta and K. Nordstrom. 1991. The Escherichia coli cell cycle and the plasmid R1 replication cycle in the absence of DnaA protein. Cell 64:1145-1155.

18. Blomberg, P., K, Nordstrom, and E. G. H. Wagner. 1992. Replication control of plasmid R1: RepA synthesis is regulated by CopA RNA through inhibition of leader peptide translation. EMBO J. 11:2675-2683.

19. Bowden, D.W., Twersky, R. S., and Calendar, R. (1975). Escherichia coli deoxyribonucleic acid synthesis mutants: Their effect upon bacteriophage P2 and satellite bacteriophage P4 deoxyribonucleic acid synthesis. J. Bacteriol. 124,167-175.

20. Bowers LM, Lapoint K, Anthony L, Pluciennik A, Filutowicz M. 2004. Bacterial expression system with tightly regulated gene expression and plasmid copy number. Gene. Sep29;340(l):ll-8.

21. Bramhill D., and A. Kornberg. 1988. A model for initiation at origins of DNA replication. Cell 54:915-918.

22. Brantl, S. 1994. The copR gene product of plasmid pIP501 acts as a transcriptional repressor at the essential repR promoter. Mol. Microbiol. 14:473-483.

23. Brantl, S., E. Birch-Hirschfeld, and D. Behnke. 1993. Rep protein expression on plasmid pIP501 is controlled by an antisense RNA-mediated transcription attenuation mechanism. J. Bacteriol. 175:4052-4061.

24. Brantl, S., and E. G. H. Wagner. 1996. An unusually long-lived antisense RNA in plasmid copy number control: in vivo RNAs encoded by the streptococcal plasmid pIP501. J. Mol. Biol. 255:275-288.

25. Brendler T., A. Abeles, and S.J. Austin. 1991. Critical sequences in the core of the PI plasmid replication origin. J. Bacteriol/ 173:3935-3942.

26. Brendler T.G., A.L. Abeles, L.D. Reaves, and S.J. Austin. 1991. Unique sequence requirements for the PI plasmid replication origin. Res. Microbiol. 142:209-216.

27. Brosius, J., M. Erfle, and J. Storella. 1985. Spacing of the 210 and 235 regions in the tac promoter. Effect on its in vivo activity. J. Biol. Chem. 260:3539-3541.

28. Calendar R, Lindqvist B, Sironi G, Clark AJ. 1970. Characterization of REP- mutants and their interaction with P2 phage.Virology. Jan;40(l):72-83.

29. Carleton, S. M., S. J. Projan, S. K. Highlander, S. M. Moghazeh, and R. P. Novick. 1984. Control ofpT181 replication. II. Mutational analysis. EMBO J. 3:2407-2414.

30. Casadaban and Cohen, Analysis of gene control signals by DNA fusion and cloning in Escherichia coli.J Mol Biol. 1980 Apr; 138(2): 179-207.

31. Casjens S.R., Gilcrease E.B., Huang W.M., Bunny K.L., Pedulla M.L., Ford M.E., Hourtz J.M., Hatfull G.F., and Hendrix R.W. 2003. The pK02 linear plasmid prophage of Klebsiella pxytoca. J. Bacteriol. 186: 1818-1832.

32. Cereghino, J. L., D. R. Helinski, and A. E. Toukdarian. 1994. Isolation and characterization of DNA-binding mutants of a plasmid replication initiation protein utilizing an in vivo binding assay. Plasmid 31:89-99.

33. Chattoraj, D. K., R. J. Mason, and S. H. Wickner. 1988. Mini-Pi plasmid replication: the autoregulation-sequestration paradox. Cell 52:551-557.

34. Chattoraj, D. K., and T. D. Schneider. 1997. Replication control of plasmid PI and its host chromosome: the common ground. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 57:145-186.

35. Christian R.B., 1990. Studies on P4 Bacteriophage Replication. Univ. of California, Berkeley. Ph.D. thesis.

36. Churchward, G., P. Linder, and L. Caro. 1983. The nucleotide sequence of replication and maintenance functions encoded by plasmid pSClOl. Nucleic Acids Res. 11:56455659

37. Dellis. S.,T. Scharz, K. Rutlin, R.B. Inman, and M. Filutowitcz. 1992. Two alternative structures can be formed by HF protein binding to the plasmid R6K gamma origin. J.Biol. Chem. 267:24426-24432.

38. Deneke J, Ziegelin G, Lurz R, Lanka E., 2000. The protelomerase of temperate Escherichia coli phage N15 has cleaving-joining activity. Proc Natl Acad Sci USA. Jul 5;97(14):7721-6.

39. Denjmukhametov MM, Brevnov MG, Zakharova MV, Repyk AV, Solonin AS, Petrauskene OV, Gromova ES. 1998. The Eel 18kl restriction-modification system: cloning, expression, properties of the purified enzymes. FEBS Lett., aug., 21., 433(3) 233-6

40. Diaz R., K. Nordstrom and W.L. Staundenbauer.1981. Plasmid RI DNA replication dependent on protein synthesis in cell-free extracts of E.coli. Nature. 289:326-328.

41. Diaz Orejas, R., Ziegelin, G., Lurz, R., and Lanka, (1994). Phage P4 DNA replication in vitro. Nucleic Acids Res. 22,2065-2070.

42. Dmitrova M, Younes-Cauet G, Oertel-Buchheit P, Porte D, Schnarr M, Granger-Schnarr M. 1998., A new LexA-based genetic system for monitoring and analyzing protein heterodimerization in Escherichia coli. Mol Gen Genet. Jan;257(2):205-12.

43. Dodd IB, Egan JB., 1996. DNA binding by the coliphage 186 repressor protein CI. J Biol Chem. May 10;271(19):11532-40.

44. Elvin, C. M., P. R. Thompson, M. E. Argall, P. Hendry, N. P. Stamford, P. E. Lilley, and N. E. Dixon. 1990. Modified bacteriophage lambda promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli. Gene 87:123-126.

45. Espinosa M., G. del Solar, F. Rojo, and J.C. Alonso. 1995. Plasmid rolling circle replication and its control. FEMS Microbiol. Lett. 130:120-123

46. C.C. Filip, J.S. Allen, R.A. Gustafson, R.G. Allen, J.R. Walker, Bacterial cell division regulation characterization of the dnaH locus of Escherichia coli, J. Bacteriol. 119 (1974)443-449.

47. Filutowicz, M., S. Dellis, I. Levchenko, M. Urh, F. Wu, and D. York. 1994. Regulation of replication in an iteron-containing DNA molecule. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 68:239-273.

48. Filutowicz, M., M. J. MacEachern, and D. R. Helinski. 1986. Positive and negative roles of an initiator protein at an origin of replication. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:96459649.

49. Flensburg, J., and Calendar, R. (1987). Bacteriophage P4 DNA replication. Nucleotide sequence of the P4 replicationgene and the eis replication region. J. Mol. Biol. 195,439445.

50. Frey J. and M. Bagdasarian. 1989.The molecular biology IncQ plasmids p 79-94. In C.M. Thomas (ed), Promiscuous plasmids of Gram-negative bacteris. Academic Press, Ltd., London, United Kingdom.

51. Giraldo R. and R. Diaz. 1992. Differential binding of wild-type and mutant RepA protein to oriR sequence suggest a model for the initiation of plasmid R1 replication. J. Mol. Biol. 28: 787-802.

52. Goodner BW, Markelz BP, Flanagan MC, Crowell CB Jr, Racette JL, Schilling BA, Halfon LM, Mellors JS, Grabowski G.1999. Combined genetic and physical map of the complex genome of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol.l81(17):5160-6.

53. Gottesman, S., Halpern, E., Trisler, P. 1981. Role of sulA and sulB in filamentation by Ion mutants of Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 148,265-73.

54. Grant, S. G., Jessee, J., Bloom, F. R., and Hanahan, D. (1990) Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. Proc Natl Acad Sei U SAH: 4645-4649.

55. Gruss A.D. and S.D. Ehrlich. 1989. The family of highly interrelated single-stranded deoxyribonucleic acid plasmids. Microbiol. Rev. 53:231-241

56. Guzman, L-M., Belin, D., Carson, M., J., and Beckwith, J. (1995) Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing arabinose Pbad promoter. J Bacteriol. 177:4121-4130.

57. Haring V., P.Scholz, E. Scherzinger, J. Frey, K.Derbyshire, G. Hatfull, N.S. Willets, and M. Bagdasarian. 1985. Protein RepC is involved in copy number control of the broad host range plasmid RSF1010. Proc. Natil. Acad. Sei. USA. 82:6090-6094

58. Haring V. and E. Scherzinger. 1989. Replication proteins of the IncQ plasmids, p. 95124 In C.M. Thomas (ed), Promiscuous plasmids of Gram-negative bacteris. Academic Press, Ltd., London, United Kingdom.

59. Hasunuma K., and M. Sekiguchi. 1977. Replication of plasmid pSC 101 in Escherichia coli K12 requirement for dnaA function. Mol. Gen. Genet. 154:225-230

60. Hertwig S., Klein I., Lurz R., Lanka E., and Appel B. 2003. PY54 a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends. Mol. Microbiol., 48, 989-1003

61. Higashi A., H.Sakai, Y. Honda, T.Tanaka, D.M. Miao, T. Nakamura, Y. Taguchi, T. Komano and M. Bagdasarian. 1994. Functional features of oriV of the broad host range plasmid RSF1010 in Pseudomonas aeruginosa. Plasmid 31:196-200

62. Highlander, S. K., and R. P. Novick. 1990. Mutational and physiological analyses of plasmid pT181 functions expressing incompatibility. Plasmid 23:1-15.

63. Holmes, M. L., F. Pfeifer, and M. L. Dyall-Smith. 1995. Analysis of the halobacterial plasmid pHK2 minimal replicon. Gene 153:117-121.

64. Y. Honda, H.Sakai, T. Komano and M. Bagdasarian. 1989. RepB is required in trans for the two single strand DNA initiation signals in oriV of plasmid RSF1010. Gene 80:155159.

65. Ingmer, H., and S. N. Cohen. 1993. Excess intracellular concentration of pSClOl RepA protein interferes with both plasmid DNA replication and partitioning. J. Bacteriol. 175:7834-7841.

66. Ingmer H., E.L. Fomg and S.N. Cohen. 1995. Monomer-dimer equilibritium of the pSClOl repA protein. J.Mol.Biol. 250:309-314.

67. Janniere, L., C. Bruand, and S. D. Ehrlich. 1990. Structurally stable DNA cloning vectors. Gene 87:53-61.

68. Kamio, Y., and Y. Terawaki. 1983. Nucleotide sequence of an incompatibility region of mini-Rtsl that contains five direct repeats. J. Bacteriol. 155:1185-1191

69. Kelman, Z., and M. O'Donnell. 1995. DNA polymerase III holoenzyme: structure and function of a chromosomal replicating machine. Annu. Rev. Biochem. 64:171-200.

70. Khan S.A., 1996. Mechanism of replication and copy number control of plasmids in Gram-positive bacteria. Genet. Eng. 18:183-201

71. Khan S.A., 1997. Rolling-cycle replication of bacterial plasmids. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61:442-455.

72. Kim, K., and R. J. Meyer. 1985. Copy number of the broad host-range plasmid R1162 is determined by the amount of essential plasmid-encoded proteins. J. Mol. Biol. 185:755767.

73. Kim, K., and R. J. Meyer. 1986. Copy number of broad host-range plasmid R1162 is regulated by a small RNA. Nucleic Acids Res. 14:8027-8046.

74. Kittell, B. L., and D. R. Helinski. 1992. Plasmid incompatibility and replication control, p. 223-242. In D. B. Clewell (ed.), Bacterial conjugation. Plenum Press, New York, N.Y.

75. Kolle R., W. Oertel and W. Goebel. 1978. Isolation and characterization of the minimal fragment required for autonomous replication("basic replicon") of a copy mutant (pKN102) of the antibiotic resistance factor Rl. Mol. Gen. Genet. 162:51-57.

76. Konieczny I., K.S. Doran, D.R. Helinski and A. Blasina. 1997. Role of TrfA and DnaA proteins in origin opening during initiation of DNAreplication of the broad host range plasmid RK2. J. Biol.Chem.272:20173-20178.

77. Konieczny B, Hefczyc J, Szygula B, Szygula J, Kossmann S.,2003., Effect of Rilmenidine(Tenaxum) on the activity of the autonomic nervous system in patients with hypertension and asthma. Wiad Lek. 56(11-12):527-31. Polish.

78. Kornberg, A., and T. Baker. 1992. In DNA replication. W. H. Freeman & Co., New York, N.Y.

79. Kozlowski, M., V. Thatte, P. C. K. Lau, L. P. Visentin, and V. N. Iyer. 1987. Isolation and structure of the replicon of the promiscuous plasmid pCUl. Gene 58:217-228

80. Krevolin, M. D., and Calendar, R. (1985). The replication of bacteriophage P4 DNA in vitro. Partial purification of the P4 a gene product. J. Mol. Biol. 182, 509-517.

81. Kumar, C., and R. P. Novick. 1985. Plasmid pTl 81 replication is regulated by two countertranscripts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:638-642.

82. Lin, L. S., and R. J. Meyer. 1986. Directly repeated, 20 bp sequence of plasmid R1162 is required for replication, expression of incompatibility, and copy-number control. Plasmid 15:35-47

83. Lindqvist, B. H., and Six, E. W. (1971). Replication of bacteriophage P4 DNA in a nonlysogenic host. Virology 43,1-7.

84. Lobocka MB, Svarchevsky AN, Rybchin VN, Yarmolinsky MB. 1996. Characterization of the primary immunity region of the Escherichia coli linear plasmid prophage N15. J Bacteriol.May;178(10):2902-10

85. Lutz, R. and H. Bujard. 1997. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/Ii-h regulatory elements. Nucleic Acids Res. 25:1203-1210

86. Maciag, I. E., J.-F. Viret, and J. C. Alonso. 1988. Replication and incompatibility properties of plasmid pUBl 10 in Bacillus subtilis. Mol. Gen. Genet. 212:232-240.

87. Maeser, S., P. Scholz, S. Otto, and E. Scherzinger. 1990. Gene F of plasmid RSF1010 codes for a low-molecular-weight repressor protein that autoregulates expression of the repAC operon. Nucleic Acids Res. 18:6215-6222.

88. Manen D., L.C. Upegui-Gonzalez and L. Caro. 1992. Monomers and dimmers of the RepA protein in plasmid pSClOl replication domains in RepA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8923-8927.

89. Mardanov AV and Ravin NV., 2006. Functional characterization of the repA replication gene of linear plasmid prophage N15. Res Microbiol. 57(2):176-83.

90. Masai H., Y. Kaziro and K.-I. Arai. 1983. Definition of oriR, the minimum DNA segment essential for initiation of R1 plasmid replication in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6814-6818.

91. Masai M. and K.-I. Arai. 1987. RepA and DnaA proteins are required for initiation of R1 plasmid replication in vitro and interaction with the oriR sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4781-4785.

92. Masai M. and K.-I. Arai. 1988. R1 plasmid replication in vitro: RepA- and DnaA-dependent initiation at oriR, 113-121 in R.E. Moses and W.C. Sammers (ed.), DNA replication and mutagenesis. American Society for Microbiology, Washington D.C.

93. McEachern, M. J., M. Filutowicz, S. Yang, A. Greener, P. Mukhopadyay, and D. R. Helinski. 1986. Elements involved in the copy number regulation of the antibiotic resistance plasmid R6K. Banbury Rep. 24:195-204.

94. McEacheron M.J., Bott M.A., Tooker P.A. and Helinski D.R. 1989. Negative control of plasmid R6K replication: Possible role ofintermolecular coupling of replication origins. Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:7942-7946.

95. Miller, J. H. (1972). Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

96. Miron, A., S. Mukherjee, and D. Bastia. 1992. Activation of distant replication origins in vivo by DNA looping as revealed by a novel mutant form of an initiator protein defective in cooperativity at a distance. EMBO J. 11:1205-1206.

97. Miroux B, Walker JE., 1996., Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.

98. J Mol Biol. Jul 19;260(3):289-98. Review.

99. Mukherjee, S., H. Erickson, and D. Bastia. 1988. Enhancer-origin interaction in plasmid R6K involves a DNA loop mediated by initiator protein. Cell 52:375-383.

100. Muller, A. K., F. Rojo, and J. C. Alonso. 1995. The level of the pUBl 10 replication initiator protein is autoregulated, which provides an additional control for plasmid copy number. Nucleic Acids Res. 23:1894-1900.

101. Nordström, K. 1990. Control of plasmid replication. How do DNA iterons set the replication frequency? Cell 63:1121-1124.

102. Nordström, K., S. Molin, and J. Light. 1984. Control of replication of bacterial Plasmids: genetics, molecular biology, and physiology of the plasmid R1 system. Plasmid 12:71-90.

103. Nordström, K., L. C. Ingram, and A. Lundbäck. 1972. Mutations in R factors of Escherichia coli causing an increased number of R-factor copies per chromosome. J. Bacteriol. 110:562-569.

104. Nordström, K., and E. G. H. Wagner. 1994. Kinetic aspect of control of plasmid replication by antisense RNA. Trends Biochem. Sei. 19:294-300.

105. Novick, R. P. 1987. Plasmid incompatibility. Microbiol. Rev. 51:381-395.

106. Novick R.P. 1989. Staphylococci plasmids and their replication. Annu. Rev. Microbiol. 43:537-565

107. Novick, R. P., S. Iordanescu, S. J. Projan, J. Kornblum, and I. Edelman. 1989. pT181 plasmid replication is regulated by a countertranscript-driven transcriptional attenuator. Cell 59:395-404

108. Pal, S., R. J. Mason, and D. K. Chattoraj. 1986. Role of initiator titration in copy number control. J. Mol. Biol. 192:275-285

109. Pal, S. K., and D. K. Chattoraj. 1988. PI plasmid replication: initiator sequestration is inadequate to explain control by initiator-binding sites. J. Bacteriol. 170:3554-3560

110. Patel, I., and D. Bastia. 1986. A replication origin is turned off by an origin "silencer" sequence. Cell 47:785-792

111. Patel, I., and D. Bastia. 1987. A replication initiator protein enhances the rate of hybrid formation between a silencer RNA and an activator RNA. Cell 51:455-462.

112. Pérez-Casal, J., A. E. Gammie, and J. H. Crosa. 1989. Nucleotide sequence analysis and expression of the minimum RepI replication region and incompatibility determinants of pCo91V-K30. J. Bacteriol. 171:2195-2201

113. Piatt, R., Drescher, C., Park, S-K, and Phillips, G. (2000). Genetic system for reversible integration of DNA constructs and lacZ gene fusions into the Escherichia coli chromosome. Plasmid, 43,12-23.

114. Pouwels, P. H., N. van Luijk, R. J. Leer, and M. Posno. 1994. Control of replication of the Lactobacilluspentosus plasmid p353-2: coding for the replication protein. Mol. Gen. Genet. 242:614-622

115. Pritchard, R. H. 1978. Control of DNA replication in bacteria, p. 1-22. In I. Molineux, and M. Kohiyama (ed.), DNA synthesis: present and future. Plenum Press, New York, N.Y.

116. Pritchard, R. H., P. T. Barth, and J. Collins. 1969. Control of DNA synthesis in bacteria. Symp. Soc. Gen. Microbiol. 19:263-297.

117. V.K. Ravin, M.G. Shulga, Evidence for extrachromosomal location of prophage N15, Virology 40 (1970) 800-807.

118. Ravin, N.V. (2003) Mechanisms of replication and telomere resolution of the linear plasmid prophage N15. FEMS Microbiol Lett. 221:1 -6.

119. Ravin, N., and Lane, D. (1999) Partition of the linear plasmid N15: interactions of N15 partition functions with the sop locus of the F plasmid. J Bacteriol. 181: 6898-6906.

120. Ravin N.V., Svarchevsky A.N., Deho G. The antiimunity system of phage-plasmid N15: identification of the antirepressor gene and its control by a small processed RNA // Mol. Microbiol. 1999. V. 34. P. 980-994.

121. N.V. Ravin, J. Rech, D. Lane, Mapping of functional domains in F plasmid partition proteins reveals a bipartite SopB-recognition domain in SopA, J. Mol. Biol. 329 (2003) 875-889.

122. N.V. Ravin, V.V. Kuprianov, E.B. Gilcrease, S.R. Casjens, Bidirectional replication from an internal ori site of the linear N15 plasmid prophage, Nucleic Acids Res. 31 (2003)6552-6560

123. Rasooly, A., and R. P. Novick. 1993. Replication-specific inactivation of the pTl 81 plasmid initiator protein. Science 262:1048-1050.

124. Rosenfeld, R., and N. B. Grover. 1993. Control of mini-Rl plasmid replication: a computer simulation. Plasmid 29:94-116.

125. I. Sasaki, G. Bertani, Growth abnormalities in Hfr derivatives of Escherichia coli strain C, J. Gen. Microbiol. 40 (1965) 365-376.

126. Sakai H. and T. Komano. 1996. DNA replication of the IncQ broad-host-range plasmids in gram-negative bacteria. Biosci. Biotechnol. Biochem. 60:377-382.

127. Scherzinger, E., V. Haring, R. Lurz, and S. Otto. 1991. Plasmid RSF1010 DNA replication in vitro promoted by purified RSF1010 RepA, RepB and RepC proteins. Nucleic Acids Res. 19:1203-1211.

128. Scholz P., V. Haring, B. Wittmann-Liebold, K. Ashman, M. Bagdasarian and E. Scherzunger. 1989. Complete nucleotide sequence and gene organization of the broad host range plasmid RSF1010. Gene 75:271-288.

129. Shah, D. S., M. A. Cross, D. Porter, and C. M. Thomas. 1995. Dissection of the core and auxiliary sequences in the vegetative replication origin of promiscuous plasmid RK2. J. Mol. Biol. 254:608-622.

130. Shine, J., and L. Dalgarno. 1974. The 39-terminal sequence of E. coli 16S ribosomal RNA: complementary to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:1342-1346.

131. Siegele DA, Hu JC., 1997., Gene expression from plasmids containing the araBAD promoter at subsaturating inducer concentrations represents mixed populations. Proc Natl Acad Sci USA. Jul 22;94(15):8168-72.

132. Simons, R.W., Houman, F., and Kleckner, N. (1987) Improved single and multicopy lac-based cloning vectors for protein and operon fusions. Gene. 53: 85-96.

133. Stenzel T.T., O. Patel and D. Bastia. 1987. The integration host factor of Escherichia coli binds to bent DNA at the origin of replication of the plasmid pSClOl. Cell. 49:709717.

134. Stenzel T, T. MacAllister, and D. Bastia. 1991. Cooperativity at a distance promoted by the combined action of two replication initiator proteins and a DNA binding protein at the replication origin of pSClOl. Genes Dev. 5:1453-1463.

135. Stormo, G. D., T. D. Schneider, and T. M. Gold. 1982. Characterization of translational initiation sites in E. coli. Nucleic Acids Res. 10:2971-2996.

136. Svarchevsky, A.N., & Rybchin, V.N. (1984) Physical mapping of plasmid N15 DNA. Mol.Gen. Mikrobiol. Virusol, 10,16-22,

137. Tabor, S., and C. C. Richardson. 1985. A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1074-1078.

138. Tait, R. C., C. I. Kado, and R. L. Rodriguez. 1983. A comparison of the origin of replication of pSa with R6K. Mol. Gen. Genet. 192:32-38

139. Takechi, S., H. Yasueda, and T. Itoh. 1994. Control of ColE2 plasmid replication: regulation of Rep expression by a plasmid-coded antisense RNA. Mol. Gen. Genet. 244:49-56

140. Thomas, C. M. 1988. Recent studies on the control of plasmid replication. Biochim. Biophys. Acta 949:253-263

141. Tocchetti A, Serina S, Terzano S, Deho G, Ghisotti D. 1998., Identification of two replicons in phage-plasmid P4.Virology. Jun 5;245(2):344-52.

142. Tocchetti, A., Galimberti, G., Deho, G., and Ghisotti, D.(1999). Characterization of the oril and orill origins of replication in phage-plasmid P4. J. Virol. 73, 7308-7316.

143. Tolun, A., and D. R. Helinski. 1981. Direct repeats of the plasmid incC region express F incompatibility. Cell 24:687-694

144. Trawick, J. D., and C. Kline. 1985. A two-stage molecular model for control of mini-F replication. Plasmid 13:59-69.

145. Tsutsui, H., A. Fujiyama, T. Murotsu, and K. Matsubara. 1983. Role of nine repeating sequences of the mini-F genome for expression of F-specific incompatibility phenotype and copy number control. J. Bacteriol. 155:337-344.

146. Uhlin B.E. and K. Nordstrom. 1978. A runaway-replication mutant of plasmid Rldrd-19: temperature-dependent loss of copy number control. Mol. Gen. Genet. 165:167-179.

147. Wagner, E. G. H., and R. W. Simons. 1994. Antisense RNA control in bacteria, phages, and plasmids. Annu. Rev. Microbiol. 48:713-742.

148. Walker J.E., M. Saraste and N.J. Gay. (1982). K coli F1 -ATPase interacts with a membrane protein component of a proton channel. Nature 298: 867-869.

149. Woelker B., and W. Messer. 1993. The structure of the initiation complexat the replication origin, oriC, of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 21:5025-5033

150. Woese, C. R., 0. Kandler, and M. L. Wheelis. 1990. Towards a natural system of organisms. Proposal for the domains Archaea, Bacteria and Eucarya. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4576-4579.

151. Wojtkowiak, D., C. Georgopoulos, and M. Zylicz. 1993. Isolation and characterization of ClpX, a new ATP-dependent specificity component of the Clp protease of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268:22609-22617.

152. Womble, D. D., and R. H. Rownd. 1986. Regulation of IncFII plasmid DNA replication. A quantitative model for control of plasmid NR1 replication in the bacterial cell division cycle. J. Mol. Biol. 192:529-548.

153. Womble, D. D., and R. H. Rownd. 1987. Regulation of mini-F plasmid DNA replication. A quantitative model for control of plasmid mini-F replication in the bacterial cell division cycle. J. Mol. Biol. 195:99-113

154. Yanisch-Perron, C., J. Vieira, and J. Messing. 1985. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene 33:103-119.

155. Yasueda, H., S. Takechi, T. Sugiyama, and T. Itoh. 1994. Control of ColE2 plasmid replication: negative regulation of the expression of the plasmid-specified initiator protein, Rep, at a posttranscriptional step. Mol. Gen. Genet. 244:41-48.

156. Zavitz, K. H., and K. J. Marians. 1991. Dissecting the functional role of PriA protein-catalyzed primosome assembly in Escherichia coli DNA replication. Mol. Microbiol. 5:2869-2873.

157. Ziegelin, G., Scherzinger, E., Lurz, R., and Lanka, E. (1993). Phage P4 a protein is multifunctional with origin recognition, helicase and primase activities. EMBO J. 12,3703-3708.

158. Ziegelin, G., Linderoth, N. A., Calendar, R., and Lanka, E. (1995). Domain structure of phage P4 a protein deduced by mutational analysis. J. Bacteriol. 177,4333-4341.

159. Zillig, W., A. Kletzin, C.Schleper, I. Holz, D. Janekovick, J. Hain, M.Lanzendorfer, and J. K. Kristjansson. 1994. Screening for Sulfolobales, their plasmids and their viruses in Icelandic solfataras. Syst. Appl. Microbiol. 16:609-628.