Изучение некоторых свойств фазмиды N15 как потенциального фагового вектора

Санькова, Татьяна Петровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение некоторых свойств фазмиды N15 как потенциального фагового вектора
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение некоторых свойств фазмиды N15 как потенциального фагового вектора"

На правах рукописи

САНЬКОВА Татьяна Петровна

ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ СВОЙСТВ ФАЗМИДЫ N15 КАК ПОТЕНЦИАЛЬНОГО ФАГОВОГО ВЕКТОРА

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2003

Работа выполнена на кафедре биофизики Санкт-Петербургского государственного политехнического университета

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Рыбчин Валентин Николаевич

кандидат биологических наук, доцент Сварчевский Александр Николаевич

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Киселев Олег Иванович

доктор биологических наук, профессор Яковлева Елена Павловна

Ведущая организация: Государственное Учреждение

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН г. Санкт-Петербург

Защита состоится « { » (¿^РАл? 2003 г. в

Л.

часов на заседании

диссертационного совета К 208.088.01 при Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 193376, г. Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии.

Автореферат разослан «£ % __ЛШш г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Лг , Караваева А.В.

US2I

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Развитие современной молекулярной биологии и генетики, успешное секвенирование геномов различных организмов, внедрение методов генной инженерии в разные отрасли биотехнологии и медицины во многом определены созданием многоцелевых векторов для переноса чужеродной генетической информации. На основе ДНК бактериальных плазмид, фагов, вирусов и хромосом микроорганизмов создано большое число кольцевых векторов, в том числе и челночных, различного назначения. Тем не менее, для решения практически каждой новой конкретной фундаментальной или прикладной задачи создаются новые 1 или модифицированные векторы. Однако оказалось, что существующие

векторы принципиально не подходят для клонирования некоторых участков геномной ДНК высших эукариотов, для обеспечения безопасного i генотерапевтического лечения и получения рекомбинантных

фармакопрепаратов высокой чистоты. В связи с этим, актуальным является изучение линейных природных форм ДНК для создания на их основе векторов нового типа. Особый интерес представляет исследование свойств генома уникальной природной фазмиды N15, сочетающей свойства плазмиды и фага (Равин, 1967). Геном профага N15 представлен плазмидной линейной молекулой ДНК с ковалентно замкнутыми теломероподобными концами (Рыбчин и Сварчевский, 1984). Эти свойства фазмиды N15 позволяют рассматривать ее как объект для создания на его основе фагового и линейного плазмидного вектора. Решение этой актуальной проблемы предусматривает исследование генома фазмиды N15, экспрессии генов, 1 контролирующих развитие фага, структурных особенностей фаговых частиц,

определение допустимого объема вносимой генетической информации, возможности совмещать полезные свойства фазмиды N15 и других фаговых и плазмидных векторов путем создания их гибридов. Настоящая работа посвящена изучению фага N15 в качестве потенциального вектора. Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении роли различных участков генома фазмиды N15, существенных для литического ' развития фага N15 и поддержания состояния профага в виде линейной

плазмиды.

Для достижения поставленной цели были намечены следующие задачи:

1 - определить области функциональной гомологии фазмиды N15 и лямбдоидных бактериофагов;

2 - идентифицировать условно-летальные мутации по репликации фага N15 и картировать их положение в геноме методом спасения маркера на штаммах Е. coli, несущих плазмиды с клонированными фрагментами гер-области;

3 - получить инсерционные мутанты фазмиды N15 и с помощью рестрикционного анализа определить их положение на плазмидной ДНК;

■-•vlbHAfli

■ ,U1£KA I * ЛгтербурГ (л-у j

< ОЭ №03аКт/Л^

4 - оценить емкость природной головки фага N15 и определить возможный размер чужеродной ДНК в составе генома N15, не нарушающий формирование фаговых частиц;

5 - на основе фазмиды N15 создать модель линейного плазмидного вектора, несущего чужеродный репликон.

Научная новизна.

Продемонстрирована функциональная гомология фазмиды N15 и лямбдоидного фага ф80 в области поздних генов и серологическое родство этих фагов.

Генетическими методами показано, что мутации, локализованные в области гена герА фазмиды N15, одновременно приводят к нарушению репликации, специфической для литического цикла развития фага, и к нарушению поддержания состояния плазмидного профага (репликации плазмиды).

Методом рестрикционного анализа инсерционных мутантов фазмиды N15 идентифицированы области генома, существенные и несущественные для вегетативного развития фага, а также картирован ген лизогенной конверсии.

Показано, что значительное увеличение длины генома фага N15 не оказывает влияния на его способность к вегетативному развитию.

Чужеродный мультикопийный репликон Со1Е1 в составе ДНК фазмиды N15 с инактивированным геном г ер А обеспечивает репликацию линейной плазмиды.

Научно-практическое значение. Результаты, полученные в работе:

1 - картирование в геноме фазмиды N15 протяженных участков, несущественных для вегетативного развития фага и/или для поддержания плазмидного состояния профага,

2 - демонстрация возможности значительно увеличивать длину ДНК, упаковываемую в головку фага, и

3 -замена собственного низкокопийного репликона линейной плазмиды N15 на чужеродный мультикопийный репликон,

позволяют рассматривать фазмиду N15 8 качестве основы для создания:

а) фагового вектора большой емкости, пригодного для клонирования хромосомной ДНК с протяженными участками аномальной структуры (палиндромами),

б) вектора, не содержащего потенциально опасных для здоровья человека последовательностей, и, следовательно, перспективного для использования в генотерапии,

в) челночного линейного вектора.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Фаг N15 относится к группе лямбдоидных бактериофагов.

2. ЯерА-область генома фазмиды N15 контролирует репликацию ДНК как в лизогенном состоянии (в линейной форме), так и при литическом развитии (в кольцевой форме).

3. Области генома фага N15 с координатами на линейной плазмидной карте 11,0-15,2 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов) и 41,2-41,4 т.п.н. (ген лизогенной конверсии) являются несущественными ни для плазмидных, ни для фаговых свойств фазмиды.

4. Область, существенную для литического развития, составляют протяженные районы структурных генов и участок с координатами 10,0910,86 т.п.н., включающий ген Q, регулирующий литическое развитие фага.

5. Участки генома, существенные для стабильного поддержания плазмидного состояния, расположены в координатах 0-10,1 т.п.н. плазмидной карты N15 и в области, правее координаты 43,44 т.п.н., и составляют около 30% длины ДНК фазмиды.

6. Фаг N15 сохраняет способность к вегетативному развитию при увеличении длины его генома, по крайней мере, на 16% по сравнению с природной фаговой ДНК.

7. Чужеродный мультикопийный репликон кольцевых плазмидных векторов в составе ДНК дефектной фазмиды N15 осуществляет репликацию линейной ДНК с ковалентно замкнутыми теломероподобными концами. Апробация работы. Материалы диссертации доложены на симпозиумах по молекулярной генетики бактерий и бактериофагов, "Cold Spring Harbor", Нью-Йорк, 1993 и 1995 гг., а также на II Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, февраль 2000 г.). Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, состоит из введения, основной части, содержащей три главы («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Экспериментальные результаты»), обсуждения результатов, выводов, библиографического указателя использованных литературных источников. Текст иллюстрирован 25 рисунками. Часть результатов представлена в 14 таблицах. Библиографический указатель включает 132 наименования работ, из них 105 на английском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования использовали бактериофаг N15+ (дикий тип), полученный от В.К. Равина (Центр «Биоинженерия» РАН, Москва), а также температурочувствительные и амбер-мутанты фага N15 из коллекции СПбГПУ. Для транспозиционного мутагенеза применяли фаг XI 105cl 857Pam80nin5, несущий в своем составе транспозон "mini-kan", и бактериофаг PlclrlOO.Cm, содержащий транспозон Тп9. В работе также использовали штаммы лямбдоидных бактериофагов ф80+, ф80 v/r и бактериальные штаммы E.coli С, и E.coli К12 (К802, М7010, НВ101, KS55) из коллекции СПбГПУ.

Для приготовления жидкой и агаризованной питательной среды, при работе с бактериями и бактериофагами по двуслойному методу (Адаме, 1961), использовали аминопептид (Ленинградский мясокомбинат). При необходимости в среды добавляли антибиотики. Антифаговые сыворотки к бактериофагам Ш5Д, и ф80 получены в НИИЭМ РАМН (СПб).

Общие методы работы с бактериями и бактериофагами описаны в руководствах (Клаус и Хейс, 1970, Миллер, 1976). Стабильность плазмидного профага определяли после 10 клеточных генераций как отношение количества колоний лизогенов к общему числу выросших колоний, а частоту лизогенизации - как отношение числа образовавшихся колоний лизогенов к количеству инфицированных клеток.

Плазмидную ДНК фазмиды N15 и ее мутантов выделяли из лизогенных клеток стандартными экспресс-методами (Маниатис и др., 1984). Трансформацию клеток выполняли кальциевым методом, используя модификацию стандартной методики (Sambrook et ah, 1989).

В работе использовали векторы pUC19 и pTZ19RJLl производства НПО "Ферментас" (г. Вильнюс). Рестрикционный анализ плазмид проводили по стандартным методикам (Маниатис и др., 1984), используя рестриктазы BamHI, BglTT, EcoRI, EcoRV, Hindill, Sail, Xhol, Mlul, Hpal, Eco47III, PstI и стандартные рестрикционные буферы производства фирмы "Pharmacia" (Швеция).

Для компьютерного анализа нуклеотидных или аминокислотных последовательностей использовали npoipaMMy BLAST на сервере NCBI.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение свойств фазмиды N15 как лямбдоидного фага

Сравнительное изучение антигенной активности бактериофага N15 и лямбдоидных фагов X и ф80 к различным антифаговым сывороткам показало, что антиген отростка фага N15, также как и ф80, отличен от X. Антифаговая сыворотка к фагу N15 обладает слабой активностью по отношению к фагу ф80, но не наоборот (табл. 1). При смешивании препарата фага с избытком гомологичных антител наблюдали постепенное уменьшение числа бляшкообразующих частиц. Процесс инактивации мог быть прерван в любое время путем разведения смеси фаг - антитело. При этом не наблюдалось обратимости процесса инактивации, и титр фага не повышался. Исходная концентрация фагов, одинаковая во всех экспериментах, равнялась 109 ед/мл. Оптимальное время действия сыворотки составляло 20 мин. (табл. 1).

Результаты, представленные в таблице 1, доказывают серологическое родство фазмиды N15 и лямбдоидного фага ф80.

Таблица 1.

Кросс-антигенная активность бактериофагов N15, X и ф80

N15 ф80 Я

Р/Ро К* Р/Ро к Р/Ро К

Сыворотка N15 №3960** 6-10'3 2,58 10"1 1,16 1 0

Сыворотка Ф80 №170 1 0 10"3 3,44 1 0

Сыворотка Я. №1303 1 0 1 0 5-10"4 3,80

* - коэффициент скорости связывания антисыворотки с бактериофагом рассчитан по формуле Kt = 2,3 D/(lgP0:P) (Адаме, 1961), где D - кратность разведения сыворотки (здесь D = 10); t - время действия; Р0 и Р - исходная и конечная концентрации бляшкообразующего фага. ** - номер партии кроличьей сыворотки.

Коллекции фаговых мутантов ф80 и N15, полученные на кафедре биофизики СПбГПУ, позволили сконструировать гибриды этих фагов. В серии экспериментов по спасению маркера amber-мутанты (am) фага ф80 были протестированы на способность развития в клетках Е. coli Su", лизогенных по мутантному по конверсии фагу N15. Показано, что большинство испытанных поздних мутантов фага ф80 эффективно «спасаются» на этих лизогенах. Отобранные на лизогенах по фагу N15 рекомбинанты обладали иммунитетом фага ф80 и не содержали маркера устойчивости к канамицину (Кш19), расположенного в гене конверсии профага N15. В результате были получены гибриды фазмиды N15 и лямбдоидного фага ф80 и продемонстрирована функциональная гомология поздних генов этих фагов. Оказалось, что в области генов репликации лямбдоидных фагов гомология между N15 и ф80 отсутствует, что указывает на особый механизм репликации ДНК фазмиды N15, отличный от лямбдоидных фагов.

2. Изучение условно-летальных мутантов фазмиды N15, дефектных по репликации

Частоту образования Su" лизогенов а/ийег-мугантами фага N15 определяли как отношение числа образовавшихся колоний лизогенов

(устойчивых- к фагу ф80у/>) к числу инфицированных клеток. Последнее определялось, как число фаговых инфекционных центров в нулевой момент времени, после сорбции и удаления неадсорбировавшихся фагов, плюс число лизогенных колоний. Результаты опытов позволили выделить группу, состоящую из четырех супрессор-чувствительных - аш-мутантов фага N15 (ат-15, ат-51, ат-69, ат-76), которые имели низкую частоту образования Би" лизогенов (10'5-10"6), отличающуюся от частоты лизогенизации Би" клеток другими мутантами или фагом дикого типа (-10*1) (табл. 2).

Таблица 2.

Свойства условно-летальных мутантов фазмиды N15

Реверсия: Лизогены гесА' 8и+30°

Би/Би* (39°/30°) Образование Би" Стабильность 30° Стабильность 42° НВ101 ХЬ-1

ат15 2-Ю"6 2-10"5 1-10"2(*) К*)

ат51 <10"7 4-10"6 М0"2(*) 104(*)

ат69 ат7б <10"7 1-Ю"6 7-10"6 1-Ю'5 1(*) 10"3(*) К*) 1(*)

ат57"с" 3-Ю"7 -

ат82 МО'6 5-Ю"2

атЮ 1-Ю"7 МО-1 все 1 все 1

ат2 ат58 ат87 <10"7 2-10'7 МО'5 ООО

с3&24 3-Ю"8 3-Ю"1 - 1Н К*)

1Б52 <10"7 7-Ю'1 < 1-Ю'6 1(*) 1(*)

1Б62 <10'7 6-10"1 < 1-Ю"6 1(*) К*)

1в85 4-10"7

18102 <10"7

<10'7 все 1 все 1 все 1 все 1

Х&61 МО5

1891 1-Ю"7

N15'" 1 1-Ю'1 1 1 1 1

(*) - мелкие негативные колонии (н.к.)

Стабильность плазмидного состояния температурочувствительных (й) мутантов фага N15 определяли как отношение числа лизогенных колоний (устойчивых к фагу ф80уг>) к общему числу выросших колоний, высеянных после длительной инкубации при температуре 42°С. Данные, приведенные в

таблице 2, показывают, что мутанты ts-52 и ts-62 не поддерживают плазмидного состояния при непермиссивной температуре 42°С, в то время как другие лизогены по ts-мутантам были стабильны и не отличались по этому свойству от лизогснов по фагу дикого типа. Обращает на себя внимание тот факт, что мутанты ts-52 и ts-62 обнаруживают некоторую нестабильность профага даже при пермиссивной температуре 30°С. Это означает, что при этой температуре соответствующие мутантные продукты, активные в литическом развитии фага, оказываются неспособными со стопроцентной эффективностью поддерживать плазмидное состояние.

Известно, что развитие фага N15 дикого типа не зависит от RecA-продукта клетки-хозяина. Оказалось, что большинство проверенных нами в этой работе фаговых мутантов также эффективно размножаются в клетках Е. coli г ее К (табл. 2). В то же время четыре аш-мутанта (am-15, am-51, am-69 и am-76), дефектные по лизогенизации, а также мутанты ts-52 и ts-62 и C3ts24, отличающиеся нестабильностью профага, имели пониженный урожай фаговых частиц на лзсА'-штаммах (табл. 2). Все эти мутанты формировали на газонах reck"-клеток очень мелкие "точечные" негативные колонии, а также имели пониженную эффективность титрования на гесА' штаммах, что свидетельствует о снижении урожая фага на клетку (табл. 2). Как видно из свойств этих мутантов, они являются дефектными как по фаговой, так и по плазмидной репликации. Зависимость литического развития фагов с частично измененным продуктом гена репликации от RecA белка клетки может быть объяснена участием этого белка в образовании специфических форм ДНК N15, способных упаковываться в фаговый капсид.

I Картирование условно-летальных (ts- и am-) мутаций по репликации

проводили методом спасения маркера при непермиссивной температуре 39°С на штаммах Е. coli Su", содержащих рекомбинантные плазмиды. В данной

t работе были использованы плазмиды pUC19 и pTZ19RJLl, в которые были

клонированы различные фрагменты гер-области фазмиды N15. Контрольное титрование всех мутантов проводили на штамме Е. coli Su"/pUC19 при температуре 30°С. Как показано на рис. 1, шесть (из двадцати трех проанализированных) мутаций локализованы в гер-области во фрагментах, имеющих следующие координаты на плазмидной карте N15: 5,254-6,524 т.п.н. (ts62), 6,524-7,400 т.п.н. (am51, ат76), 7,485-8,253 т.п.н. (ат69), 8,2538,604 т.п.н. (ts24, ts52). Эффективность титрования условно-летальных мутантов по репликации на клетках Е. coli Su" с соответствующими рекомбинантными плазмидами при температуре 39 С составляла 10"J - 10"'. Остальные исследованные мутанты имели титр на уровне реверсии к дикому

типу (1С)"7 - 10"5) на всех штаммах с рекомбинантными плазмидами. Анализ нуклеотидной последовательности rep-области (GenBank ас. п. AF064539) показал, что все шесть мутаций расположены в одной и той же протяженной открытой рамке считывания ORF1324 (в гене rep К), которой соотвекп-вует белок размером 1324 аминокислотных остатка (белок RepA).

4,5 5,0 5,5 6,0 6,5

I . I_I_|_

Hindlll Mlul

Hindin

repA 7,0

7,5

8,0

-И

8,5 9,0 т.п.н.

гт

Mlul" PstI

PstI Mlul PstI

ara76

: j i am69 j.ts52j I

c3ts24

Рис. 1. Локализация клонированных в векторе фрагментов фазмиды N15 на плазмидной карте N15. Картирование шести условно-летальных мутаций по результатам спасения маркера.

Праймазный домен и^ьаа^гз Геликазный домен

Проведенный компьютерный анализ продукта гена герА фазмиды N15 (белка ЯерА) позволил обнаружить в его ^концевой части высоко консервативный праймазный домен, характерный для праймаз ряда конъюгативных плазмид и репликативного альфа-белка бактериофага Р4. В центральной части белка ЯерА также присутствует высоко консервативная аминокислотная последовательность, характерная для участвующих в инициации репликации геликаз, обнаруженных у многих вирусов животных и человека.

На основании полученных результатов можно предположить, что продукт гена герА фазмиды N15 обладает доменной структурой и является полифункциональным белком с геликазной и праймазной активностями. При этом он участвует как в литической репликации, так и в репликации

плазмиды, так как у всех картированных в repA-области мутантов нарушены оба способа репликации.

3. Получение, характеристика и картирование инсерционных мутаций фазмиды N15

С целью получения бляшкообразующих вариантов фазмиды N15 с маркерами устойчивости к антибиотикам была проведена серия экспериментов по ' инсерционному мутагенезу фазмиды тремя I различающимися по размеру транспозонами: "mini-kan" (1,88 т.п.н.), Тп9

(2,638 т.п.н.) и Тп9* (2,884 т.п.н.). Двойственность природы фазмиды N15 позволяет использовать при ее мутагенезе различные способы. В рабоге были f получены инссрционные мутанты как в результате транспозиции дефектного

транспозона "mini-kan" в профаги N15c3 и N15te52, так и в результате пассирования фагов N15 дикого типа и N15c3 на штаммах, содержащих Тп9 в составе профага PI.

Большинство инсерционных мутантов было получено при мутагенезе профага N15c3 транспозоном "mini-kan", расположенным в геноме бактериофага Ä.1105с1857Ранг80ш>г5. Инсерционные мутанты по условиям отбора могли быть как жизнеспособными, так и дефектными. Действительно, у восьми из 15 проверенных лизогенов профаги оказались дефектными по способности образовывать негативные колонии (табл. 3). Шесть -образовывали спонтанно фаги, которые формировали негативные колонии нормального размера и при повторном заражении чувствительных клеток придавали лизогенным клеткам устойчивость к канамицину. Один мутантный I профаг (N15c3Kml4) имел пониженный уровень спонтанной индукции, а

образовавшиеся спонтанные фаги формировали на газоне чувствительных клеток мелкие негативные колонии. Изучение стабильности плазмидного состояния инсерционных мутантов показало, что профаг N15c3Kml4 одновременно с нарушением литического цикла развития отличается также нестабильностью. Пониженная стабильность обнаружена и у дефектного профага N15c3Km20. Все остальные инсерционные мутанты оказались стабильными (табл. 3). Среди лизогенных клеток, содержащих инсерционные мутанты, два штамма с профагами N15c3Kml9 и N15c3Km29 оказались чувствительными к фагу ф80у/У. Это свойство сохранялось и при повторном заражении чувствительных клеток. Поэтому был сделан вывод, что у указанных мутантов инсерция транспозона произошла в ген cor, детерминирующий лизогенную конверсию. Оба мутанта способны формировать негативные колонии, а их профаги стабильно наследуются в

лизогенных клетках (табл. 3). Таким образом, показано, что ген лизогенной конверсии может быть инактивирован без нарушения других фаговых и плазмидных функций фазмиды N15. Получение мутантов по конверсии было необходимо для преодоления устойчивости лизогенов к суперинфекции фагом N15.

Таблица 3.

Свойства инсерционных мутантов фазмиды N15 и координаты сайтов посадки транспозонов

Мутанты Устойчивость к фагу ф80У1г* Способность образовывать н.к.** Стабильность профага (%) Координаты инсерции (т.п.н.) Ориентация транспозона ***

N1503 Г + 100

№5сЗКтЗ Г - 100 25,14 +

№5сЗКт4 Г + 100 11,80 -

№5сЗКт6 Г - 100 38,40 +

№5сЗКт7 Г - 100 10,06 -

№5сЗКт8 Г - 100 10,43 -

N15cЗKшl0 Г + 100 13,48 -

М5сЗХт11 Г + 100 15,23 +

К15сЗКлп14 Г +/- 6 44,01 +

Ш5сЗКт15 Г - 100 10,76 -

N1503X11116 Г + 100 14,96 -

Ш5сЗКт19 в + 100 41,33 +

N1503X11120 Г - 25 25,80 +

N1503X11121 Г - 100 10,30 -

N1503X11129 8 + 100 41,42 -

Ш5сЗКт38 Г - 100 40,01 +

N151852 Г + 66

N151852X11123 Г + 62 10,99 +

N15cЗCml г + 100 4,10 +

Ш5Ст2 г + 100 11,70 +

* г - устойчивость, в - чувствительность;

** «+»- есть н.к. (негативные колонии),«-» - нет н.к., «+/-» - мелкие н.к.;

*** «+»- соответствует ориентации "ппш-кап"-транспозона с левым ХЬо1-фрагментом размером 0,577 т.п.н., и ориентации транспозоновТп9 и Тп9* с левым ЕсоМ-фрагментом размером 1,205 т.п.н.,«-»- обратная ориентация.

Картирование инсерционных мутаций фазмиды N15 проводили с помощью рестриктаз ВатН1, НтсИИ и ХЬо1. Ориентацию и точную локализацию сайтов посадки транспозонов определяли на основании сравнения размеров продуктов гидролиза плазмид всеми тремя рестриктазами. Результаты физического картирования представлены в таблице 3 (координаты сайтов посадки и ориентации транспозонов) и на рис. 2 (локализация транспозонов на физической карте профага).

Нами был разработан удобный метод отбора инсерционных мутантов с использованием темпсратурочувствительного мутанта по репликации N151852. Кинетика потери профага N151852 в непермиссивных условиях (см. табл. 2) свидетельствует о том, что при высокой температуре репликация практически сразу останавливается. Это позволяет после инсерционного мутагенеза профага N151852 отбирать только те колонии, в которых интеграция транспозона произошла в профаг, а не в бактериальную хромосому, (по признаку потери устойчивости лизогенных клеток к канамицину при повышенной температуре). Таким способом была получена серия инсерционных мутантов, один из которых (ЪП51852Кт23) использовался в дальнейшей работе для конструирования линейных рекомбинантных копийных плазмид и был проанализирован более подробно (табл. 3, рис. 2). Этот бляшкообразующий вариант фазмиды имеет координату сайта посадки транспозона 10,99 т.п.н. Это позволяет довольно точно локализовать границу между существенной и несущественной для вегетативного развития областями генома. Стабильность профага Ш51852Кт23 в пермиссивных условиях практически не отличается от стабильности исходного профага N151852 (табл. 3).

ТП.Н.

inc сВ его Q

<-\®3 /

telL telN сА г е р A i |

Lys cosRL Head

Tail

cor parBA telR

-1-г

I I

ts62 am76 am69 ts5v'

Cml

KmlOKmll 16

Km21 Km8 Kml5 Km23 Cm2 Km4

№

Cml

Kml34 Km 133 Kml40 Kml36

N15

Km3 Km20

ршВОб

Km6

Km29

Km38Kml9 Kml4

I I I

Kml35 Kml37 Kml38

Рис. 2. Расположение условно-летальных и инсерционных мутаций фазмиды N15 на генетической карте плазмиды N15 и ее линейной мини-производной.

Кроме плазмид, содержащих маркер устойчивости к канамицину, была получена плазмида N15 с маркером устойчивости к хлорамфениколу. Для ее конструирования использовали транспозон Тп9, входящий в состав бактериофага PI. Получение таких вариантов позволяет судить о размере дополнительного генетического материала, который может упаковываться в головку N15, так как размер транспозона Тп9 превышает размер транспозона "mini-kan".

Метод получения инсерций хлорамфениколустойчивых транспозонов основан на пассировании бактериофагов N15 на штаммах, содержащих профаг PlclrlOOCm. Полученный таким образом инсерционный мутант щ

N15Cm2 формирует нормальные негативные колонии и стабильно наследуется в лизогенных клетках (табл. 3). В результате гидролиза плазмиды N15Cm2 рестриктазами EcoRI и BamHI установлена координата сайта посадки транспозона Tn9 (11,70 т.п.н.) на плазмидной карте N15 (табл.3, рис. "

2). Полученный ранее мутант N15c3Cml (Сварчевский, 1986), содержащий транспозон Тп9*, картирован в точке 4,10 т.п.н. (табл. 3, рис. 2).

В работе осуществлен транспозонный мутагенез линейной мини-плазмиды N15 ртВОб, которая содержит три из семи BamHI-фрагментов исходной плазмиды N15c3Cml: концевые (10,18 и 11,76 т.п.н.) и фрагмент, ближайший к левому концевому (6,87 т.п.н.). Клетки Е. coli с плазмидой ртВОб инфицировали фагом Я. 1105. После инкубации отбирали независимые колонии, устойчивые к высокой экспериментально подобранной дозе неомицина (500мг/л). При этом вырастали только те клетки, которые несли "mini-kan" транспозон в составе мультикопийной плазмиды, и не росли устойчивые к канамицину клетки, имеющие посадку в хромосому. В результате было отобрано 24 независимых варианта клеток, устойчивых одновременно к хлорамфениколу и канамицину. Из них были выделены плазмиды. Показано, что при трансформации они передают новым клеткам é

оба эти признака одновременно. Это доказывает, что инсерция канамицина произошла именно в плазмиду ртВОб. Результаты рестрикционного картирования некоторых инсерций "mini-kan''-транспозона в плазмиду ртВОб ,

отражены на рис. 2. Обращает на себя внимание тот факт, что все мутации располагались либо в центральном, либо в правом BamHI-фрагменте мини-плазмиды.

Проведенный анализ транспозонных мутаций фазмиды N15 и ее линейной мини-плазмиды ртВОб показывает, что инсерции, не затрагивающие ни плазмидных, ни фаговых свойств фазмиды, локализованы в двух областях генома (рис. 2). Первая область расположена в гене лизогенной конверсии 41,179-41,415 т.п.н. (GenBank, ас. п. AF064639). Две независимо полученные посадки транспозона с координатами 41,33 и 41,41 картируются очень близко и транспозоны находятся в разных ориентациях.

Вторая область представлена участком с координатами 10,99-15,23 т.п.н., который несет гены с неизвестными функциями, возможно, отвечающими за рекомбинационную систему фага (Сварчевский, 1986). Инсерции, затрагивающие литическое развитие, разбросаны по геному. Они локализованы в небольшом участке с координатами 10,09-10,86 т.п.н., в котором обнаружено четыре из восьми инсерций указанного типа, и в протяженном районе между двумя областями, несущественными для фазмиды N15 (также четыре посадки в геном N15). Этот протяженный участок кодирует структурные гены. Таким образом, показано, что инсерции

> в области поздних генов, а также генов его (9,967-10,212) и Q(10,199-10,945)

(GenBank, ас. п. AF064639) приводят к нарушению литического цикла фага, но не влияют на стабильное поддержание плазмиды. Инсерция Кт14, затрагивающая как плазмидные свойства фазмиды N15, так, возможно, и

^ литические, расположена на правом конце физической карты профага в

пределах рагВА области, определяющей стабильное поддержание плазмиды N15 (Grigoriev and Lobocka, 2001). При транспозонном мутагенезе линейной мини-плазмиды ршВОб отмечаются преимущественно те же области локализации транспозона, что и в целом геноме. Координаты самой правой, не нарушающей стабильности мини-плазмиды, мутации Rml37 (43,44 т.п.н.) и мутации Km 14 (44,01 т.п.н.) могут обозначать условную границу между областью генома несущественной и существенной для поддержания стабильного плазмидного состояния фазмиды N15 (рис. 2).

Интересно, что в области 0-10 т.п.н., была найдена только одна инсерция Cml (4,10 т.п.н.). Отсутствие инсерционных мутаций в области, 4.110 т.п.н. согласуется с нашими данными, что эта область является существенной как для литической так и для плазмидной репликации. Область 0-4 т.п.н. важна для поддержания плазмиды в линейной форме, в частности,

* для образования теломеры (ген íelN) (Сварчевский и Рыбчин, 1984) и регуляции выбора литического или лизогенного пути развития (локус immA) (Ravin et al,. 1999).

* 4. Изучение возможности увеличения размера генома N15 при сохранении инфекционности фага

Введение в ДНК последовательностей, несущих устойчивость к антибиотикам, неизбежно связано с увеличением длины генома. Увеличение размера фаговой ДНК и оценка возможностей такого увеличения при сохранении инфекционности является одной из важных задач исследования фазмиды N15 как потенциального фагового вектора. Как показано выше (табл. 3), ДНК N15 с дополнительным генетическим материалом размером 1,87, 2,64 и даже 2,88 т.п.н. может упаковываться in vivo в фаговые головки без нарушения литических функций фага. Для дальнейшей проверки емкости головки фага N15 нами был получен рекомбинант, содержащий два

транспозона. Скрещивание между бактериофагами N15c3Kml9 и N15c3Cml, а также между N15c3Kml9 и N15Cm2 проводили по стандартной методике. Полученным урожаем фагов заражали клетки Е. coli HB 101 и после инкубации в течение 60 мин при 30°С клетки высевали на плотную питательную среду, содержащую антибиотики хлорамфеникол и канамицин. В выросших колониях проверяли наличие профага, выделяли спонтанно образовавшиеся фаги, ими повторно инфицировали чувствительные клетки и отбирали клетки, устойчивые к двум антибиотикам одновременно. Наличие транспозонов в ДНК рекомбинанта проверяли в дальнейшем рестрикционным анализом плазмидной ДНК. Полученные рекомбинанты N15c3Kml9Cml, «

N15c3Kml9Cm2 и N15Kml9Cm2 при лизогенизации чувствительных клеток сообщают им устойчивость к обоим антибиотикам, стабильно наследуются в лизогенных клетках и формируют негативные колонии нормального размера на газоне чувствительных клеток. %

Результаты проведенного гидролиза рекомбинантных профагов рестриктазами EcoRI и BamHI подтвердили, что профаг, несущий два маркера устойчивости к антибиотикам, возник в результате рекомбинации, а не транспозиции Тп9 или Тп9* в плазмиду N15c3Kml9. Суммарная длина вставки в ДНК N15, размер которой составляет 46,36 т.п.н., равна 4,52 и 4,77 т.п.н. соответственно. Таким образом, увеличение длины упаковываемой ДНК более чем на 10% не влияет на способность фага N15 к вегетативному развитию.

С помощью инсерционного мутагенеза нами было установлено наличие областей генома N15 несущественных для фагового развития, и областей, несущественных ни для фагового развития, ни для поддержания плазмидного состояния. Такие области могут быть удалены при использовании ДНК фага N15 для конструирования фагового вектора внедрения. Известно, что t

мутанты с укороченными молекулами ДНК более устойчивы к нагреванию или действию хслатирующих соединений (Херши, 1975). Для получения нелетальных делеционных мутантов фага N15 мы высевали фаги на газон чувствительной культуры клеток с добавлением в питательную среду 3,5 мМ '

ЭДТА. Следует отметить, что дальнейшее увеличение концентрации ЭДТА приводило к ингибированию роста клеток бактериального газона. Предварительное прогревание лизатов при 55°С в течение 80 минут приводило к незначительному (менее, чем на порядок) уменьшению инфекционности фагов. В данных условиях только одна из 106 фаговых частиц X давала негативную колонию, что соответствует частоте спонтанного образования протяженных (до 13% генома) делений в ДНК фага X (Hendrix et al., 1983). В то же время на частицы фага N15 такая концентрация ЭДТА не оказывала заметного влияния, что свидетельствует о неплотной упаковке

ДНК в фаговом капсиде. Было проведено сравнительное тестирование чувствительности к ЭДТА производных фага N15 (N15c3Cml и N15Cm2Rml9) с увеличенным размером генома. Они также оказались одинаково нечувствительными к действию 3,5 мМ ЭДТА. Причем, увеличение фагового генома N15 даже на 10% (N15Cm2Kml9) все еще, по-видимому, не приводит к достаточно плотной упаковке ДНК в фаговую головку. Экспериментальные данные позволяют рассчитывать на возможность создания на базе N15 фагового вектора большой емкости, так как максимальный (пока не установленный) размер упаковываемой в капсид ДНК N15 окажется, очевидно, значительно больше, чем у классических фаговых векторов на основе фага X.

Для изучения возможности дальнейшего увеличения размера генома фазмиды N15 без нарушения инфекционности фага нами осуществлен следующий эксперимент. Штамм Е. coli KS55, обладающий polA^ фенотипом был трансформирован рекомбинантной плазмидой pHind4, в составе которой имеется клонированный в вектор pUC19 фрагмент ДНК N15. Трансформанты лизогенизовали фагом N15 с маркером устойчивости к хлорамфениколу. Полученные таким образом клетки, несущие две различные плазмиды, отбирали на селективной среде с двумя антибиотиками (100мг/мл Am и 50мг/мл Cm) при 30°С. На рис. ЗА представлена схема образовавшихся в клетке структур. При переносе на повышенную температуру 42°С клетки приобретали ро/А"-фенотип. При этом PolA-зависимая репликация рекомбинантной плазмиды pllind4, так же как репликация исходной плазмиды pUCl 9, была подавлена - титры клеток KS55 с соответствующими

А.

Рис. 3. Схема образования (А) и структура (В) линейной рекомбинантной плазмиды N15Cml-pHind4 (бляшкообразующий вариант).

плазмидами падали на 3 - 4 порядка по сравнению с титрами при 30°С.

В то же время в условиях проводимого эксперимента эффективно происходит рекомбинация между плазмидами через гомологичный участок N15. Результаты электрофоретического анализа выделенных плазмид подтвердили наличие рекомбинантных структур (рис. ЗВ). При трансформации этими плазмидами новых клеток Е.соН М7010 устойчивость к ампицилину и хлорамфениколу передаются одновременно, что свидетельствует о присутствии этих маркеров на одной и той же рекомбинантной молекуле ДНК. Трансформанты М7010/№5Ст1-рНтс14 оказались способными производить жизнеспособные фаговые частицы, которые, в свою очередь, при лизогенизации клеток передавали лизогенам устойчивость к ампицилину и хлорамфениколу. Это позволяет предполагать, что молекула ДНК рекомбинантного фага N15 размером 53,93 т.п.н., которая на 16% превышает размер фагового генома дикого типа, способна упаковываться в головку жизнеспособного фага.

5. Получение, свойства и картирование рекомбинантных линейных плазмид N15 с чужеродным репликоном

В клетки Е.соН К802 (гее4) лизогенные по фагу Ш51в52Кт23 путем трансформации были помещены мультикопийные кольцевые плазмиды р11С 19 или рТЕ191ии с клонированными в них различными фрагментами ДНК фазмиды N15. В результате клетки приобрели устойчивость к канамицину и к ампицилину (рис. 4). Условно-летальная мутация по репликации &52, картированная в гене герА во фрагменте 8,253-8,604 т.п.н., приводит к неспособности фазмиды N15 поддерживать лизогенное состояние в непермиссивных условиях (табл. 2). Клетки К802(№51з52Кт23) с различными вариантами рекомбинантных корезидентных плазмид высевали на твердую питательную среду с двумя антибиотиками. При этом устойчивые к ампицилину и канамицину при температуре 42°С колонии клеток контрольного штамма К802(Ш51852Кт23)/риС19 образовывались с частотой меньше, чем 10~7 (табл. 4). Оказалось, что эффективность титрования лизогенов с рекомбинантными плазмидами, содержащими фрагмент фазмиды N15, составляет от 10"5 до 10"3 по отношению к количеству клеток при 30°С (табл. 4). При этом повышение титров наблюдалось только у клеток гес (К802) и не имела места для гес'-клеток (НВ101).

Выжившие при непермиссивной температуре устойчивые к ампицилину и хлорамфениколу колонии были в дальнейшем проанализированы. Оказалось, что все они содержали большую линейную

30° Ар + Сп. 42°

Рис. 4. Схема образования линейных рекомбинантных плазмид с активным репликоном Со1Е1.

Таблица 4.

Эффективность титрования гес" (штамм НВ101) и гес+ (штамм К802) лизогенов по фагу Ш51б52Кгп23, трансформированных рекомбинантными плазмидами при температуре 42°С

30°, Ар+Кш 42°, Ар+Кт Примечание

НВ1010852 Кш23) 1 5-Ю"7

НВ101(1в52 Кт23)/риС19 1 5-10 7

НВ101(Ь>52 Кт23)/рНт<14 1 3-Ю"7

К802(1в52 Кт23) 1 ю-7 реверсия фага 10"7

К8020з52 Кт23)/риС19 1 10"7

К802(1б52 Кт23)/рНтс14 1 Ю'Мо"4

К802({в52 Кт23)/рМ1и11 1 ю-3

К802(й52Кт23)/рМ1и11Дря1 1 10"4-10"5

К802(1в52 Кт23)-рМ1и5 1 ю-2 спасение 1в52 (см. рис. 1)

К802(1з52 Кт23)-рЯУ9 1 ю-4

плазмиду, образовавшуюся в результате рекомбинации по гомологии между исходными кольцевой и линейной плазмидами. Новые линейные структуры обладали повышенной копийностью, легко выделялись и стабильно поддерживались как в гее', так и в г ее клетках (100% колоний клеток, выросших после ~ 9-10 генераций в жидкой среде при пермиссивной температуре без селекции, сохраняют устойчивость к обоим антибиотикам при 42°С). Однако наблюдается заметное снижение скорости роста клеток, содержащих линейные рекомбинангные плазмиды, по сравнению с соответствующими лизогенами фага N15. Структуры геномов линейных мультикопийных плазмид, содержащих Со1Е1 репликон, их размеры, а также локализация чужеродных вставок установлены путем рестрикционного анализа по четырем ферментам рестрикции (рис. 5).

М5Ь52Кш23

Есо47Ш ХЬоГ

| | тер А аяЦ ? +

11-1—СЩ-ДДи^-Мв

0 12 3

V V V Нра1

НрНпк14 Есо47Ш ХЬо!

10 11 ¡1213 14 15 16 17 181 ТЛ.Н 48.25 вша!

52.94

Рис. 5. Структуры рекомбинантных линейных плазмид с репликоном Со1Е1

Предварительное картирование было проведено с помощью рестриктазы Xhol, для которой на плазмидной карте N15 имеется один сайт рестрикции (6,35 т.п.н.), а второй расположен в "мини-kan" транспозоне (Oka et al., 1981) и рестриктазы Smal, для которой сайты действия имеются только в "мини-kan" транспозоне и в полилинкере вставленных векторов (за исключением pMlul lApst).

Увеличение размера фрагмента 5,69 т.п.н. для рестриктазы Есо471П ровно на одну длину гшазмиды pHind4, pMlull или pMlul lApst позволяет сделать вывод об инсерции мономерной структуры. Аналогично, увеличение » левого концевого Hpal фрагмента (6,69 т.п.н.) плазмиды на величину

линеаризованных плазмид pRV9 и pSal 12 соответствует структурам, представленным на рисунке 5. Наличие на электрофореграммах (данные не приводятся) всех рекомбинантных линейных плазмид фрагментов Eco47III * (3,21 т.п.н.) и Hpal (5,88 т.п.н.), соответствующих концевым фрагментам

плазмиды N15, однозначно подтверждает линейность образовавшихся в результате эксперимента in vivo рекомбинантных плазмид. Полученные линейные рекомбинантные плазмиды на основе ДНК фазмиды N15 с чужеродным решшконом ColEl могут служить моделью линейного плазмидного мультикопийного вектора.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительное изучение антигенной активности бактериофага N15 и лямбдоидных фагов X и <¡>80 по отношению к антисывороткам различных фагов выявило серологическое родство фазмиды N15 и лямбдоидного фага ф80.

2. Продемонстрирована функциональная гомология продуктов ' поздних генов бактериофага N15 и лямбдоидного фага ф80. Показано, что в

области генов репликации лямбдоидных фагов гомология между N15 и ф80 отсутствует, что указывает на особый механизм репликации фазмиды N15, ) отличный от лямбдоидных шагов.

3. На основании сравнительного изучения свойств условно-летальных мутантов фазмиды N15 выделена группа из шести мутантов, которые охарактеризованы как мутанты по репликации. Физическое картирование соответствующих мутаций и анализ нуклеотидной последовательности rep-области показал, что все шесть мутаций расположены в одной и той же протяженной открытой рамке считывания (в гене герА), которой соответствует белок размером 1324 аминокислотных остатка (белок RepA). Показано, что у всех картированных мутантов нарушена как литическая, так и плазмидная репликация, что свидетельствует о многофункциональности продукта ге^А-гена.

4. С помощью транспозонов, кодирующих устойчивость к хлорамфениколу или канамицину получены 18 инсерционных мутантов фазмиды N15 и 24 инсерции "mini-kan" транспозона в линейную мини-плазмиду ртВОб. По результатам рестрикционного анализа установлены координаты сайтов посадки транспозонов, локализованы области генома N15, существенные и несущественные для вегетативного развития фага, физически картирован ген лизогенной конверсии.

5. Для определения возможной емкости головки фага N15 получены рекомбинанты, содержащие два транспозона. Показано, что увеличение длины упаковываемой ДНК, по крайней мере, на 16% не влияет на способность фага N15 к вегетативному развитию.

" 6. Показано, что бактериофаг N15 и его производные с увеличенным геномом, в отличие от фага X, устойчивы к нагреванию и действию хелатирующего агента (ЭДТА). На основании эгих результатов сделан вывод о неплотной упаковке ДНК в фаговом капсиде, что дает возможность прогнозировать создание на базе N15 болынеобъемного фагового вектора.

7. В качестве модели линейного плазмидного вектора сконструированы линейные мультикопийные плазмиды увеличенного (до 18%) размера на основе дефектной по репликации фазмиды N15 со встроенным чужеродным рспликоном.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Санькова Т.П., Сварчевский А.Н., Рыбчин В.Н. Получение, характеристика и картирование инсерционных мутаций фазмиды N15 //Генетика, 1992, 28, 7: 66-76.

2. Svarchevskaya О.О., Vostrov А.А., Sankova Т.Р., Svarchevsky A.N. Linear and circular mini-N15 plasmids: Construction and properties //Abstracts of papers presented at the 1993 meeting on Molecular Genetics of Bacteria and Phages, Cold Spring Harbor, New York, p. 103.

3. Svarchevsky A.N., Sankova T.P., Rybchin V.N. Bacteriophage N15 with a linear plasmid prophage is a member of the lambda phage family //Abstracts of papers presented at the 1995 meeting on Molecular genetics of bacteria and phages. Cold Spring Harbor, New York, p. 234.

4." Rybchin V., Sankova Т., Zuzenkova E., Svarchevskaya O., Svarchevsky A. Characterization of the linear plasmid prophage N15 with covalently closed ends //Plasmid, 1999,41,1: 165-166.

5. Санькова Т.П. Картирование и характеристика гена репликации бактериофага N15 //Тезисы докладов II съезда ВОГиС, СПб, 2000, т.2, с. 89.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (№ 97-04-48770), МО РФ (97-0170.0.99 и JNTASN96-1492.

1 I

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97.

Подписано в печать УЗ, 05* АХЮЗ.. Объем в п.л.

Тираж ^ОО, Заказ ¡ЯбЯ

-----г

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства СПбГПУ 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29.

Отпечатано на ризографе 1Ш-2000 ЕР Поставщик оборудования — фирма "Р-ПРИНТ" Телефон: (812) 110-65-09 Факс: (812) 315-23-04

usât

M i 1 5 2 1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Санькова, Татьяна Петровна

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Плазмиды и фаги.

1.1. Основные свойства природных плазмид.

1.2. Свойства бактериофагов.

2. Векторы для клонирования в бактериях.

2.1. Общие свойства векторов.

2.2. Фаговые векторы.

2.3. Векторы рис.

3. Свойства фазмиды N15.

3.1. Свойства фазмиды N15 и структура ее генома.

3.1.1. Лизогенная конверсия фазмиды N15.

3.1.2. Физическая структура плазмидной и фаговой ДНК.

3.1.3. Структура теломер и их образование.

3.1.4. Генетическая организация плазмидного генома N15.

3.1.5. Сравнение последовательностей протеломеразы и интеграз.

3.2. Репликация линейной плазмиды N15.

3.2.1. Модели репликации линейных ДНК.

3.2.2. Механизмы образования теломер.

3.2.3. Репликация фазмиды N15.

И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Штаммы бактерий и бактериофагов.

2. Плазмиды.

3. Среды.

4. Общие методы работы с бактериями и бактериофагами.

5. Транспозонный мутагенез фазмиды N15сЗ.

6. Транспозонный мутагенез фазмиды N1 51б52.

7. Транспозонный мутагенез мини-плазмиды ртВОб.

8. Получение вариантов фазмиды N15 0 маркером устойчивости к хлорамфениколу.

9. Стабильность плазмидного состояния мутантов фазмиды N15.

10. Определение частоты лизогенизации клеток.

11. Выделение плазмидной ДНК.

12. Трансформация клеток Е. соН.

13. Рестрикционный анализ плазмид.

14. Компьютерный анализ последовательностей.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Изучение свойств фазмиды N15 как лямбдоидного фага.

1.1. Сравнительное изучение антигенной активности фазмиды N15 и лямбдоидных фагов X и ф80.

1.2. Получение рекомбинантов фазмиды N15 и лямбдоидного фага ф80.

2. Изучение условно-летальных мутантов фазмиды N15, дефектных по репликации.

2.1. Частота образования Би" лизогенов аш-мутантами фага N15.

2.2. Стабильность плазмидного состояния 1з-мутантов фазмиды N15 при непермиссивной температуре.

2.3. Урожай фаговых частиц условно-летальных мутантов фазмиды N15 на гесА" штаммах при пермиссивных условиях.

2.4. Картирование условно-летальных мутаций по репликации.

2.5. Компьютерный анализ продукта г ер А гена фазмиды N15.

3. Получение, характеристика и картирование инсерционных мутаций фазмиды N15.

3.1. Транспозонный мутагенез фазмиды N1503.

3.2. Физическое картирование транспозонных мутаций.

3.3. Транспозонный мутагенез температурочувствительного мутанта N151852.

3.4. Получение вариантов фазмиды N15 с маркером устойчивости к хлорамфениколу.

3.5. Транспозонный мутагенез линейной мини-плазмиды N15.

3.6. Конструирование линейного плазмидного вектора.

4. Изучение возможности увеличения размера генома N15 при сохранении инфекционности фага.

4.1. Получение варианта фазмиды N15, несущего два маркера устойчивости к антибиотикам.

4.2. Оценка плотности упаковки генетического материала в фаговом капсиде.

4.3. Получение и свойства рекомбинантной плазмиды N15Сш 1 -рНикМ.

5. Получение свойства и картирование рекомбинантных линейных плазмид N15 с чужеродным репликоном.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение некоторых свойств фазмиды N15 как потенциального фагового вектора"

Актуальность проблемы. Развитие современной молекулярной биологии и генетики, успешное секвенирование геномов различных организмов, внедрение методов генной инженерии в разные отрасли биотехнологии и медицины во многом определены созданием многоцелевых векторов для переноса чужеродной генетической информации. На основе ДНК бактериальных плазмид, фагов, вирусов и хромосом микроорганизмов создано большое число кольцевых векторов, в том числе и челночных, различного назначения. Тем не менее, для решения практически каждой новой конкретной фундаментальной или прикладной задачи создаются новые или модифицированные векторы. Однако оказалось, что существующие векторы принципиально не подходят для клонирования некоторых участков геномной ДНК высших эукариотов, для обеспечения безопасного генотерапевтического лечения и получения рекомбинантных фармакопрепаратов высокой чистоты. В связи с этим, актуальным является изучение линейных природных форм ДНК для создания на их основе векторов нового типа. Особый интерес представляет исследование свойств генома уникальной природной фазмиды N15, сочетающей свойства плазмиды и фага (Равин, 1967). Геном профага N15 представлен плазмидной линейной молекулой ДНК с ковалентно замкнутыми теломероподобными концами (Рыбчин и Сварчевский, 1984). Эти свойства фазмиды N15 позволяют рассматривать ее как объект для создания на его основе фагового и линейного плазмидного вектора. Решение этой актуальной проблемы предусматривает исследование генома фазмиды

N15, экспрессии генов, контролирующих развитие фага, структурных особенностей фаговых частиц, определение допустимого объема вносимой генетической информации, возможности совмещать полезные свойства фазмиды N15 и других фаговых и плазмидных векторов путем создания их гибридов. Настоящая работа посвящена изучению фага N15 в качестве потенциального вектора.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении роли различных участков генома фазмиды N15, существенных для литического развития фага N15 и поддержания состояния профага в виде линейной плазмиды.

Для достижения поставленной цели были намечены следующие задачи:

1 - определить области функциональной гомологии фазмиды N15 и лямбдоидных бактериофагов;

5 - на основе фазмиды N15 создать модель линейного плазмидного вектора, несущего чужеродный репликон.

Научная новизна.

Чужеродный мультикопийный репликон Со1Е1 в составе ДНК фазмиды N15 с инактивированным геном г ер К обеспечивает репликацию линейной плазмиды.

Научно-практическое значение. Результаты, полученные в работе:

2 - демонстрация возможности значительно увеличивать длину ДНК, упаковываемую в головку фага, и

3 -замена собственного низкокопийного репликона линейной плазмиды N15 на чужеродный мультикопийный репликон, позволяют рассматривать фазмиду N15 в качестве основы для создания: а) фагового вектора большой емкости, пригодного для клонирования хромосомной ДНК с протяженными участками аномальной структуры (палиндромами), б) вектора, не содержащего потенциально опасных для здоровья человека последовательностей, и, следовательно, перспективного для использования в генотерапии, в) челночного линейного вектора.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Фаг N15 относится к группе лямбдоидных бактериофагов.

2. itepA-область генома фазмиды N15 контролирует репликацию

ДНК как в лизогенном состоянии (в линейной форме), так и при литическом развитии (в кольцевой форме).

3. Области генома фага N15 с координатами на линейной плазмидной карте 11,0-15,2 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов) и 41,2-41,4 г т.п.н. (ген лизогенной конверсии) являются несущественными ни для плазмидных, ни для фаговых свойств фазмиды.

7. Чужеродный мультикопийный репликон кольцевых плазмидных векторов в составе ДНК дефектной фазмиды N15 осуществляет

I репликацию линейной ДНК с ковалентно замкнутыми теломероподобными концами.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на симпозиумах по г молекулярной генетики бактерий и бактериофагов, "Cold Spring Harbor",

Нью-Йорк, 1993 и 1995 гг., а также на II Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, февраль 2000 г.). Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (№ 97-04-48770), МО РФ (97-01-70.0.99 и INTASN96-1492.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Плазмиды и фаги

Успехи генетической инженерии при решении прикладных задач дали толчок зарождению молекулярной биотехнологии. Уже с первых лет ее развития основными объектами генно-инженерных экспериментов стали клетки Escherichia coli К-12, ее плазмиды и бактериофаги, которые используются организмами в качестве природных векторов при горизонтальном переносе генетического материала, способствующего эволюции. К тому же, именно они были и наиболее полно изучены генетически. Это позволило целенаправленно использовать их для конструирования новых типов векторных молекул, осуществления селекции реципиентных клеток, прогнозирования свойств рекомбинантных молекул ДНК и проведения их анализа.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Санькова, Татьяна Петровна

ВЫВОДЫ

1. Сравнительное изучение антигенной активности бактериофага N15 и лямбдоидных фагов А, и ф80 по отношению к антисывороткам различных фагов выявило серологическое родство фазмиды N15 и лямбдоидного фага ф80.

2. Продемонстрирована функциональная гомология продуктов поздних генов бактериофага N15 и лямбдоидного фага ф80. Показано, что в области генов репликации лямбдоидных фагов гомология между N15 и ф80 отсутствует, что указывает на особый механизм репликации фазмиды N15, отличный от лямбдоидных фагов.

3. На основании сравнительного изучения свойств условно-летальных мутантов фазмиды N15 выделена группа из шести мутантов, которые охарактеризованы как мутанты по репликации. Физическое картирование соответствующих мутаций и анализ нуклеотидной последовательности rep-области показал, что все шесть мутаций расположены в одной и той же протяженной открытой рамке считывания (в гене герА), которой соответствует белок размером 1324 аминокислотных остатка (белок Rep А). Показано, что у всех картированных мутантов нарушена как литическая, так и плазмидная репликация, что свидетельствует о многофункциональности продукта герА-гена.

6. Показано, что бактериофаг N15 и его производные с увеличенным геномом, в отличие от фага X, устойчивы к нагреванию и действию хелатирующего агента (ЭДТА). На основании этих результатов сделан вывод о неплотной упаковке ДНК в фаговом капсиде, что дает возможность прогнозировать создание на базе N15 болынеобъемного фагового вектора.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

2. Svarchevskaya О.О., Vostrov A.A., Sankova Т.Р., Svarchevsky A.N. Linear and circular mini-N15 plasmids: Construction and properties //Abstracts of papers presented at the 1993 meeting on Molecular Genetics of Bacteria and Phages, Cold Spring Harbor, New York, p. 103.

4. Rybchin V., Sankova Т., Zuzenkova E., Svarchevskaya O., Svarchevsky A. Characterization of the linear plasmid prophage N15 with covalently closed ends//Plasmid, 1999,41, 1: 165-166.

5. Санькова Т.П. Картирование и характеристика гена репликации бактериофага N15 //Тезисы докладов II съезда ВОГиС, СПб, 2000, т.2, с. 89. г

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Санькова, Татьяна Петровна, Санкт-Петербург

1. Адаме М. Бактериофаги. //М., ИЛ, 1961, 527 с.

2. Востров A.A., Малинин А.Ю., Рыбчин В.Н., Сварчевский А.Н. Конструирование линейных плазмидных векторов для клонирования в клетках Echerichia coli. //Генетика, 1992, 28. 186-188.

3. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. //М.: Мир, 2002, 590 с.

4. Гловер Д.(ред.) Клонирование ДНК. Методы. //М.: Мир, 1988, 540 с.

5. Данилевич В.Н., Дужий Д.Е., Качеровская НА., Миркин С.М. Первичная структура двух природных IS 1-фланкированных транспозонов Тп9 и Тп9*, кодирующих устойчивость к хлорамфениколу //Молекулярная биология, 1991, 25 (1), 205-211.

6. Девис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Методы генетической инженерии: Генетика бактерий. //М.: Мир, 1984, 176 с.

7. Клаус Р., Хейс У. Сборник методик по генетике микроорганизмов. //М.: Медицина, 1970,. 248 с.

8. Козырев Д.П., Сварчевский А.Н., Зайцев E.H., Рыбчин В.Н. Лизогенная конверсия, вызванная фагом ф80. Описание явления и клонирование гена конверсии. //Генетика, 1982, 33, 555-560.

9. Льюин Б. Гены. //М: Мир, 1987, 544 с.

10. Малинин А.Ю., Востров A.A., Васильев A.JL, Рыбчин А.Н. Хактеристика гена лизогенной конверсии фага N15 и идентификация его продукта. //Генетика, 1993, 29, 257-265.

11. Малинин А.Ю., Востров A.A., Рыбчин В.Н., Сварчевский А.Н. Структура концов линейной плаамиды N15. //Мол. Генет. Микроб. Вирусол., 1992, 5-6, 19-22.

12. Маниатис Т., Фрич Э., СэмбрукДж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. //М.: Мир, 1984, 480 с.

13. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. //М.: Мир, 1976. 436с.

14. Мищенко Б.С., Рыбчин В.Н., Санькова Т.П. Функции поздних генов 13, 17, 18 и 19 фага ф80. //Генетика, 1977, 13, 1093-1102.

15. Равин В.К. Отсутствие профага в хромосоме Е. coli К-12. //Генетика, 1972, 8, 189-190.

16. Равин В.К., Голуб Е.И. Изучение фаговой конверсии у Е. coli. Сообщение I. Приобретение резистентности к бактериофагу Т1 в результате лизогении II Генетика. 1967, 33, 113-121.

17. Равин Н.В., Дорошенко О.И., Равин B.K. Cos — район умеренного бактериофага N15. //Мол. Генет. Микроб. Вирусол., 1998, 2, 17-20.

18. Равин Н.В., Равин В.К. Клонирование больших неидеальных палиндромов в кольцевых и линейных векторах. //Генетика, 1998, 33, 38-44.

19. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. //СПб, Изд. СПбГТУ, 1999, 521 е.

20. Сварчевский А.Н. Фазмида N15: особенности генетики и структуры ДНК. //Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, 1986, Ленинград.

21. Сварчевский А.Н., Рыбчин В.Н. Физическое картирование ДНК фазмиды N15. //Мол. Генет. Микроб. Вирусол., 1984,10,16-34.

22. Сварчевский А.Н., Рыбчин В.Н. Характеристика плазмидных свойств бактериофагаN15. //Мол. Генет. Микроб. Вирусол. 1984, 10, 34-43.

23. Уотсон Дж., Туэ Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК: Краткий курс. //№: Мир, 1986,480 с.

24. Харди К. (ред.) Плазмиды. Методы. //М.: Мир, 1990, 268 с.

25. Херши А.Д. (ред.) Фаг лямбда. /Мл Мир, 1975, 424 с.

26. Хиггинс И., Бест Д., Джонс Дж. (ред.) Биотехнология. //М.: Мир, 1988, 479 с.

27. Altshul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W. and Lipman D.J. Basic local alignment search tool. //J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410.

28. Altshul S.F., Madden A.A., Shaffer T.L., Zhang J., Zhang Z., Miller W. and Lipman A.A. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein datebase search programs. //Nucleic Acids Res, 1997, 25, 3389-3402.

29. Amann E., Brosius J., Ptashne M. Vectors bearing a hybrid trp-lac promoter useful for regulated expression of cloned genes in Escherichia coli. // Gene, 1983,25, 167-180.

30. Argos, P., Landy, A., Abremski, K., Egan, J.B., Haggard-Ljungquist, E., Hoess, R. The integrase family of site-specific recombinases: regional similarities and global diversity. //EMBO, 1986, 33, 433-440.

31. Austin S., and Nordstrom K. Partition-mediated incompatibiliti of bacterial plasmids. //Cell, 1990, 60, 261-272.

32. Baldwin R. 1., Barrand P„Frttsch A., Goldthwait D. A., Jacob F., Cohe- sive sites on the deoxyribonucleic acids from several temperate coliphages. //J. Mol. Biol., 1966, 17, 343-349.

33. Barbour, A.G. and Garon, C.F. Linear plasmids of the Borrelia burgdorferi have covalently closed ends. //Science, 1987, 33, 409-411.

34. Bateman, A. Simplification of palindromic telomere theory. //Nature, 1975, 33, 379-389.

35. Boyd A.C., Archer J.A.K., Sherratt D.J. Replication of ColEl plasmid. //Mol. Gen. Genetics, 1989, 217, 488-498.

36. Campbel A. and Botstein D. Evolution of lambdoid phages. In Lambda II. Hendrix W et al., (ed.) //Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1983, 365380.

37. Campbel A. In: Evolution of lambdoid phages. The bacteriophages, Calendar R. (ed.). //NY: Plenum, 1988, 1-14.

38. Casjens, S., Murphy, M., DeLange, M., Sampson, L., van Vugt, R., Huang, W.M. Telomeres of the linear chromosomes of Lyme disease spirochaetes: nucleotide sequence and possible exchange with linear plasmid telomeres. //Mol Microbiol, 1997, 33, 581-596.

39. Casjens S: Evolution of the linear DNA replicons of the Borrelia spirochetes. //Curr Opin Microbiol 1999, 2, 529-534.

40. Cavalier-Smith, T. Palindromic base sequences and replication of eukaryotic chromosomes ends. //Nature, 1974, 33, 467-470.

41. Chaconas G, Stewart PE, Tilly K, Bono JL, Rosa P: Telomere resolution in the Lyme disease spirochete. //EMBO J, 2001, 20, 3229-3237.

42. Cohen S. N., Hurrvitz J. Transcription of complementary strands of phage DNA in vivo and in vitro. //Proc. Nat. Acad. Sei., 1973, 70, 3240-3244.

43. Collins J. Instability of palindromic DNA in Echerichia coli. //Cold Spring Harbor Symph Quant Biol., 1980, 45, 409.1.l

44. Collins,J., Hohn,B. Cosmids: A type of plasmid gene- cloning vector that is packageable in vitro in bacteriophage lambda heads. //Proc. Nat. Acad. Sci., 1978, USA 75, 4242-4234.

45. Cotmore, S. and Tattersall, P. Parvovirus DNA replication. In DNA Replication in Eukaryotic Cells. DePamphilis, M. (ed.). //Cold Spring Harbor NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996, 799-813.

46. DeLange AM, Reddy M, Scraba D, Upton C, McFadden G: Replication and resolution of cloned poxvirus telomeres in vivo generates linear minichromosomes with intact viral hairpin termini. //J Virol, 1986, 59, 249259.

47. DeLange AM, McFadden G: The role of telomeres in poxvirus DNA replication. //Curr Top Microbiol Immunol 1990, 163, 71-92.

48. Deneke J, Ziegelin G, Lurz R, Lanka E: The protelomerase of ootemperate Escherichia coli phage N15 has cleaving-joining activity. //Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97, 7721-7726.

49. Deneke.J, Ziegelin G, Lurz R„ Lanka E: Phage N15 Telomere Resolution. Target requirements for recognition and processing by the protelomerase. //J. Biol. Chem., 2002, 277, 10410-10419.

50. Donaghue, D.J., Sharp P.A. Construction of hybrid phage-plasmid recombinant DNA vectors. //J. Bacterid., 1978, 136, 1192-1196.

51. Dove W. F., The genetics of the lambdoid phages. //Ann, Rev. Genet., 1968, 2, 305-316

52. Du S, Traktman P: Vaccinia virus DNA replication: two hundred base pairs of telomeric sequence confer optimal replication efficiency on minichromosome templates. //Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93, 96939698.

53. Espisito, D. and Scocca, J.J. The integrase family of tyrosine recombinases: evolution of a conserved active site domain. //Nucleic Acids Res, 1997, 33, 3605-3614.

54. Geshelin, P. and Berns, K.I. Characterization and localization of the naturally occurring cross-links in vaccinia virus DNA. //J Mol Biol, 1974, 33, 785-796.

55. Grigoriev P. S., Lobocka M. B. Determinants of segregational stability of the linear plasmid-prophage N15 of Escherichia coli. //Molecular Microbiology, 2001, 42, 2, 355-368.

56. Gopaul DN, Duyne GD: Structure and mechanism in site-specific recombination. //Curr Opin Struct Biol, 1999, 9, 14-20.

57. Grainge I, Jayaram M: The integrase family of recombinaserorganization and function of the active site. Mol Microbiol 1999,33, 449-456.

58. Hallet B, Sherratt DJ: Transposition and site-specific recombination: adapting DNA cut-and-paste mechanisms to a variety of genetic rearrangements. //FEMS Microbiol Rev 1997, 21, 157-178.

59. Hardy, K. (ed.) Plasmids. //Oxford Univ. press, 1993, 260 p.

60. Heinrich J., Schultz J., Bosse M., Ziegelin G., Lanka E., Moelling K. Linear closed mini DNA generated by the prokaryotic cleaving-joining enzyme TelN is functional in mammalian cells. //J. Mol. Med., 2002, 80, 648-654.

61. Heisig A., Riedel H.D., Dobrinski B., Lurz B. and Schuster H. Organization of the immunity region imml of bacteriophage PI and synthesis of PI antirepressor. //J. Mol. Biol., 1989, 209, 525-538.

62. Hendrix, J.W. Roberts, F.W. Stahl, R.A. Weisberg, R.W. (eds.). Lambda II //Cold Spring Harbor, NY. Cold Spring Harbor Lab., 1983, 792 p.

63. Heusterspreute M., Thi V.H., Emery S. Vectors with restriction site banks. IV. pJRD184 a 3793-bp plasmid vector having 43 unique cloning sites. //Gene, 1985,39, 229-304.

64. Hickman, A.B., Waninger, S., Scocca, J.J., Dyda, F. Molecular organization in site-specific recombination: the catalytic domain of bacteriophage HP1 integrase .//Cell, 1997, 33, 227-237.

65. Hinnebusch J, Tilly K: Linear plasmids and chromosomes in bacteria. //Mol Microbiol, 1993, 10, 917-936.

66. Hinnebusch, J. and Barbour, A.G. Linear plasmids of Borrelia burgdorferi * have a telomeric structure and sequence similar to those of a eukaryoticvirus. //J Bacteriol, 1991, 33, 7233-7239.

67. Hinnebusch, J., Bergstrom, S., Barbour, A.G. Cloning and sequence analysis of linear plasmid telomeres of the bacterium Borrelia burgdorferi. //Mol Microbiol, 1990, 33, 811-820.

68. Igarashi K, Hiraga S., Yura T. A deoxythymidine kinase deficient mutant of Escherichia coll II. Mapping and transduction studies with phage 4>80. //Genetics, 1967, 57, 643-648.r

69. Jacob F., Wollrnan E. L., Sexuality and the genetics of bacteria. //Academic pryss, New York, 1961, 374 p.

70. Kaiser A. D. On the internal structure of bacteriophage lambda. //J. Gen. Physiol., 1973,49, suppl., 171-178.

71. Kellenberger G., Zichichi M., Weigle J. A mutation affecting the DNA content of bacteriophage X and its lysogenizing properties, //J. Mol. Biol., 1961,3, 399-406.

72. Kim, Y.G., Kim, P.S., Herbert, A., Rich, A. Construction of a Z-DNA-specific restriction endonuclease. //Proc Natl Acad Sei USA, 1997, 33, 12875-12879.

73. Kobryn K. and Chaconas G. The circle is broken: telomere resolution in linear replicons. // Curr Opin Microbiol, 2001, 4, 558-564.

74. Kobryn K. and Chaconas G. ResT, a telomere resolvase encoded by the Lyme desease Spirochete. //Mol Cell, 2002, 9, 195-201.

75. Kornberg A., Baker T. DNA replication //Freeman and Company, NY, 1992, 376 p.

76. Landschultz, W.H., Johnson, P.F., McKnight, S.L. The leucine zipper: a hypothetical structure common to a new class of DNA binding proteins. //Science, 1988,33, 1759-1764.

77. Lilley D. and White M. Resolving the relationships of the resolving enzymes. //Proc. Nat. Acad. Sei., 2000, 97, 9351-9353.

78. Lindqvist, B.H., Deho, G., Calendar, R. Mechanisms of genome propagation and helper exploitation by satellite phage P4. //Microbiol Rev, 1993, 33, 683-702.

79. Lobocka, M., Svarchevsky, A.N., Rybchin, V.N., Yarmolinsky, M. Characterization of the primary immunity region of the Escherichia coli linear plasmid prophage N15. //J Bacteriol, 1996, 33, 2902-2910.

80. Marconi, R.T., Casjens, S., Munderloh, U.G., Samuels, D.S. Analysis of linear plasmid dimers in Borrelia burgdorferi sensu lato isolates:implications concerning the potential mechanism of linear plasmid replication. //J Bacterid, 1996, 33, 3357-3361.

81. Marians, K. J. Prokaryotic DNA replication. //Annu. Rev. Biochem., 1992, 61,673-719.

82. Matsushiro A., Specialized transduction of tryptophan markers in Escherichia coli Kl2 by bacteriophage $80. //Virology, 1963, 19, 475-482.

83. McFadden G, Morgan AR: DNA cruciform structures: implications for telomere replication in eukaryotes and instability of long palindromic DNA sequences in prokaryotes. //J Theor Biol 1982, 97, 343-349.

84. Meinhardt F, Schaffrath R, Larsen M: Microbial linear plasmids. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997, 47, 329-336.

85. Merchlinsky M, Moss B: Resolution of linear minichromosomes with hairpin ends from circular plasmids containing vaccinia virus concatemer junctions. //Cell, 1986, 45, 879-884.

86. Mizuuchi K. Polinucleotidyl transfer reactions in cite-specific DNA recombination. //Genes Cells, 1997, 2, 1-12.

87. Morse M. L., Lederberg E. M., Lederberg J., Transduction in Escherichia coli Kl2. //Genetics, 1956, 41, 142-149.

88. Nash, H.A. and Robertson, C.A. Heteroduplex substrates for bacteriophage lambda site-specific recombination: cleavage and strand transfer products. //EMBO J., 1989, 33, 3523-3533.

89. Nosek J, Tomaska L, Fukuhara H, Suyama Y, Kovac L: Linear mitochondrial genomes: 30 years down the line. //Trends Genet., 1998, 14, 184-188.

90. Nunes-Duby, S.E., Kwon, H.J., Tirumalai, R.S., Ellenberger, T., Landy, A. Similarities and differences among 105 members of the Int family of site-specific recombinases. //Nucleic Acids Res., 1998, 33, 391-406.

91. Oka A., Sugisaki H., Takanami M. Nucleotide sequence of the kanamicin resistensce transposon Tn903. //J. Mol. Biol., 1981, 147, 217-226.

92. Parkinson J. S., Huskey R. J., Deletion mutants of bacteriophage lambda. I. Isolation and initial characterization. //J. Mol. Biol., 1971, 56, 369-375.

93. Picardeau M, Lobry JR, Hinnebusch BJ: Physical mapping of an origin of bidirectional replication at the centre of the Borrelia burgdorferi linear chromosome. //Mol Microbiol, 1999, 32, 437-445.

94. Picardeau M, Lobry JR, Hinnebusch BJ: Analyzing DNA strand compositional asymmetry to identify candidate replication origins of Borrelia burgdorferi linear and circular plasmids. //Genome Res., 2000, 10, 1594-1604.

95. Poteete A.R., Hehir K., and Sauer R.T. Bacteriophage P22 Cro protein: sequence, purification, and properties. //Biochemistry, 1986, 25, 251-256.

96. Ravin N., and Lane D. Partition of the linear plasmid N15: interaction of N15 partition functions with the sop locus of the F plasmid. //J. Bacteriol., 1999, 181, 6898-6906.

97. Ravin V.and Ravin N. Use of a linear multicopy vector based on the mini-replicon of temperate coliphage N15 for cloning DNA with abnormal secondary structures. //Nucl. Acids Res., 1999, 27, 13.

98. Ravin V., Ravin N., Casjens S., Ford M.E., Hatfull G.F. and Hendrix R.W. Genomic sequence and analysis of the atypical temperate bacteriophage N15. //J. Mol. Biol., 2000, 299, 53-73.

99. Ravin, V.K. and Shulga, M.G. The evidence of extrachromosomal location of prophage N15. //Virology, 1970, 33, 800-807.

100. Ravin N., Strakhova T., Kuprianov V. The protelomerase of the phage -plasmid N15 is responsible for its maintenance in linear form. //J. Mol. Biol., 2001,312, 899-906.

101. Ravin N., Svarchevsky A. and Deho G. The anti-immunity system of phage-plasmid N15: identification of antirepressor gene and its control by a small processed RNA. //Mol Microbiol, 1999, 34, 980-994.

102. Rybchin V. Svarchevsky A. The plasmid prophage N15: a linear DNA with covalently closed ends. //Mol Microbiol, 1999, 33, 895-903.

103. Rybchin, V.N. and Svarchevsky, A.N. On the role of the telomerase in linear plasmid N15 replication.//Plasmid, 1999,33, 158.

104. Sambrookl., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY. //Cold Spring Harbor Lab., 1989, Vol. 1,2,3.

105. Sauer R.T. and Andregg R. Primary structure of the lambda repressor. //Biochemistry, 1978, 17, 1092-1100.

106. Scherzinger, E., Haring, V., Lurz, R. and Otto, S. Plasmid RSF1010 DNA replication in vitro promoted by purifed RSF1010 RepA, RepB and RepC proteins. //Nucl. Acids Res., 1991, 19, 1203-1211.

107. Schroth G.R. and Ho P.S. Occurrence of potential cruiciform and H-DNA forming sequences in genome DNA. //Nucl. Acid. Rec., 1995, 23, 19771983.

108. Sternberg N., Hoess R. The molecular genetics of bacteroiphage PI // Ann. Rev. Genet., 1983, 17, 123-136.

109. Stewart PE, Thalken R, Bono JL, Rosa P. Isolation of a circular oplasmid region sufficient for autonomous replication and transformation of infectious Borrelia burgdorferi. //Mol Microbiol, 2001, 39, 714-721.

110. Takeda Y., Morishita T., Yura T., Specialized transduction of the galactose genes of Escherichia coli by phage 4>81. //Virology, 1970, 41, 348-353.

111. Taylor A. L., Current linkage map of Escherichia coli, //Bacteriol. Rev., 1970, 34, 155-168.

112. Tilly, K. Independence of bacteriophage N15 lytic and linear plasmid replication from the heat shock proteins DnaJ, DnaK, and GrpE. J //Bacteriol, 1991, 33, 6639-6642.

113. Tomizawa J., Som T. Replication of ColEl plasmids. //Cell, 1984, 38, 871890.

114. Traktman P: Poxvirus DNA replication. In DNA Replication in Eukaryotic //Cells. Edited by De Pamphlis ML. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996, 775-798.

115. Volff JN, Altenbuchner J: A new beginning with new ends: linearisation of circular hromosomes during bacterial evolution. //FEMS Microbiol. Lett., 2000, 186, 143-150.

116. Vostrov, A.A., Vostrukhina, O.A., Svarchevsky, A.N., Rybchin, V.N. Proteins responsible for lysogenic conversion caused by coliphages N15 and <J>80 are highly homologous. //J Bacteriol., 1996, 33, 1484-1486.

117. Way J.C., Davis M.A., Moritsato D., Roberts D.E. and Kleckner N. New TnlO derivatives for tzansposon mutagenesis and for construction of lacZ operon fusion by transposition. //Gene, 1984, 32, 369-379.

118. Wickner S.H. and Chattoraj D.K. Replication of mini-Pi plasmid DNA in vitro requires two initiation proteins, encoded by the repA gene of phage P1 and the dnaA gene of Escherichia coli. //Proc. Natl Acad. Sei. USA, 1987, 84, 3668-3672.

119. Williams, B.G. and Blattner F.R. Bacteriophage lambda vectors for DNA cloning. In Genetic engineering: Principles and methods (ed. J.K.Setlow and A.Hollaender) // Plenum Publishing, New York, 1980, 2, 201-219.

120. Yagil, E., Dolev, S., Oberto, J., Weisberg, R. Determinants of site-specific recombination in the lambdoid coliphage HK022. An evolutionary change in specificity. //J. Mol. Biol., 1989, 33, 695-717.

121. Yamagishi H., Nakamura K., OrekiH., Cohesion occurring between DNA .molecules of temperate phages (.)80 and lambda or 4>81. //Biochem. Biophys. Res. Commun., 1965, 20, 727-732.

122. Yanish-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains, nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. //Gene, 1985, 33, 103-119.

123. Yankovski N., Fonstein M., Debabov V. Monomer circular plasmid DNA molecules can be effectively packed in vitro and used as vector DNA molecules. //Biotech' 85 Europe, 1985, Geneva, 709-714.

124. Yankovski N., Fonstein M., Lashina S., Bukanov N., Yakubovich N., Ermakova L., Rebentish B., Janulaitis A., Debabov V. Plasmids as affective and simple tools for construction and analisis of gene libraries. //Gene, 1989, 81,203-210.

125. Yarmolinsky M., Shernberg N. The Bacteriophages. Ed. Calendar R. //N.Y., 1988, 1,291.

126. Ziegelin, G. and Lanka, E. Bacteriophage P4 DNA replication. //FEMS Microbiol Rev, 1995, 33, 99-107.

127. Zuckert, W. and Meyer, J. Circular and linear plasmids of Lyme disease spirochetes have extensive homology: characterization of a repeated DNA element. //J. Bacteriol., 1996, 33, 2287-2298.

Информация о работе

Санькова, Татьяна Петровна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2003
ВАК 03.00.23

Диссертация

Изучение некоторых свойств фазмиды N15 как потенциального фагового вектора - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы