Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка системы вектор-хозяин для коринебактерий и изучение экспрессии клонированных генов в клетках коринебактерий

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Разработка системы вектор-хозяин для коринебактерий и изучение экспрессии клонированных генов в клетках коринебактерий"

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ВЕКТОР - ХОЗЯИН ДЛЯ КОРИНЕБАКТЕРИЙ И ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ КЛОНИРОВАННЫХ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ КОРИНЕБАКТЕРИЙ

03.00.15 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

И СЕЛЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

на правах рукописи

ОКОРОКОВ Андрей Львович

УДК 577.214.622:579.871.1:579.842.11

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов. *

ааучный руководитель:

проф., д.б.н. Н.К. Янковский

Официальные оппоненты: ■

проф., д.б.н. Н.Д. Ломовская . д.б.н. В.А. Прокулевич

в часов на заседании Специализированного совета Д 025.01.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адрессу: 113545, Москва, 1-й Дорожный пр.,д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке " ВНИИ Генетика"

Защита диссертации состоится

Автореферат ' разослан

п

22„

1990 Г

Ученый секретарь Специализированного совета к.б.н.

В.И. Щербакова

- 3 -

Общая характеристика работы.

Актуальность темы:

В настоящее время генетическая инженерия из комплекса методов, применяемых в молекулярно-биологических и генетических исс- • ледованиях, становится средством развития промышленной биотехнологии. На основе различных микроорганизмов созданы эффективные генно-инженерные штаммы-продуценты биологически активных соединений.

Значительную долю продукции биотехнологии составляют аминокислоты аспарагинового семейства -лизин и треонин. Традиционными продуцентами этих аминокислот являются глутаматпродуцирущие ко-ринебактерии. Штаммы коринебактерий, используемые в промышленности, получены традиционными селекционными методами.

Развитие систем клонирования для глутаматпродуцирупцих кори-небактерий, клонирование и изучение экспрессии генов непосредственно в клетках коринебактерий позволит ускорить процесс создания новых и улучшенных суперпродуцирувдих промышленных штаммов используемых в производстве аминокислот.

Амплификация в клетках коринебактерий генов, кодирующих ферменты лимитирующих этапов биосинтеза аминокислот, может приводить к перераспределению аминокислотной продукции в пользу необходимого продукта и является путем к созданию суперпродуцентов аминокислот.

Из выше сказанного очевидна необходимость развития систем вектор-хозяин для коринебактерий и изучения экспрессии клонированных генов биосинтеза аминокислот. Цели работы:

- поиск и характеристика маркеров и репликонов пригодных,1 для генно-инженерных работ в системе Е. ооН/с. glutaпlioum I

- разработка системы вектор-хозяин для лабораторных и промышленных штаммов корте бактерий

- конструирование бирепликонных челночных векторов Е. оо11/ С. glutamioшl, отработка метода введения их в клетки корилебакте-

рий

- клонирование на полученных векторах генов биосинтеза треонина коринебактерий и Е. coli изучение экспрессии клонированных генов непосредственно в клетках коринебактерий.

- определение стабильности вектора в клетках коринебактерий и рекомбинантных ДНК на его основе

- создание методами генной инженерии коринебактериального штамма продуцента с характеристиками превосходящими таковые у используемых в промышленности

Научная новизна работы:

В работе сконструированы бирепликонные плазмиды Е. ooil/ с. glutamioum, использованные в качестве векторов для коринебактерий. Разработана система трансформации клеток коринебактерий с использованием ДНК-нагруженных липосом. На бирепликонных плазми-дах клонированы гены thrA Е. ooli и thrA2 С.glutamioum АТСС13032, ген а-амилазы Baoillus amyloliquefaoiene, гены thrA2* и thrB в. fiavum 61-5 и изучена их экспрессия в клетках коринебактерий. Разработан метод массового экспресс анализа продуктов клонированных генов в миниклетках инфицированных рекомбинантными фазмидами.

Практическая ценность:

Разработан метод трансформации клеток коринебактерий с помощью ДНК-нагруженных липосом, который может быть применена для различных микроорганизмов.

- Рекомбинантные ДНК на основе сконструированного вектора стабильно поддерживаются в с. glutamioum без селекции по антибиотику.

Введение гена thrA2* В. flävum 61-5 в составе сконструированных векторных плазмид в клетки штаммов коринебактерий с мутацией по гену thrB приводило к увеличению уровня продукции гомосе-рина до 26 г/л на мелассных средах.

Структура работы. Рукопись диссертации состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов,выводов, списка литературы. Работа содержит *36 страниц ма-шшописного текста, 10 рисунков,- II таблиц. Библиография включает НО литературных источников.

Апробация. Результаты работы докладывались на Всесоюзной'ков!е-

ренции "Новые направления биотехнологии"(г. Лущино,1988), Всесоюзной конференции "Аминокислоты для сельского хозяйства, пищевой промышленности, медицины инаучных исследований", на семинаре отдела гентики ВНИИгенетика,1990 г.

Материалы и методы.

Среды. Для выращивания бактериальных культур использовали среду ЬВ. В качестве минимальной среды использовали среду М9. При фер-ментациях использовали мелассные и ацетатные среды. Твердые среды содержали 1,5Ж агара, верхний слой содержал 0,7% минимального агара.

Плазмиды. Плазмиды хрОВТ7ЛрОВРЗ,ровтз и рОВА43 получены от Бескровной О.Ю.(ВНИИгенетика), рТСЗ от Сорокина А.(ВНИИгенетика) Конструирование других плазмид описано в разделе "Результаты и обсуждение".

Выделение плазмидной ДНК. Препаративные количества плазмидной ДНК выделяли щелочным методом [В1гпЪо1т, ВоИ,19791. Аналитическое выделение плазмидной ДНК проводили согласно методике, описанной Маниатисом с соавт.,1984.. При выделении плазмидной ДНК из клеток коринебактерий использовали щелочной метод со следующими модификациями: клетки инкубировали 30 минут при 37°С в растворе А с лизоцимом в концентрации 10 мг/мл. Лизис проводили в течение 30 минут при 0°С.

Ферменты нуклеотидного обмена. Использовали полинуклеотидлигазу. фага Т4 и рестрикционные зндонуклеазы производства НПО "Фермент" (Вильнюс). Ферменты использовали в условиях,- рекомендованных изготовителем.

Электрофорез образцов ДНК проводили в 0,7-1,5* агарозных гелях в трис-ацетатном буфере ( МоВопеИ е! а1.,1977) Элюция фрагментов ДНК из агарозы проводили согласно методике,' описанной Маниатисом (Нап1аив вt а!., 1982) Введение радиоактивной метки в ДНК проводили при помощи реакции ник-трансляции (М^Ьу вt а1.,1977). Гибридизацию бактериальных колоний с меченной ДНК осуществляли в модификации Груштейна и Хогнесса (Сгигш1;в1п, Но©1евв,1975).

Трансформацию клеток Е. ooli плазмидной ДНК проводили по методу Моррисона (Morrison,1977).

Трансформацию плазмидной ДНК в протопласты коринебактерий проводили по методу Иошихамы (Yosohihama et al.,1985) с . модификациями описанными в разделе "Результаты и обсуждение". Липидный.экстракт из клеток коринебактерий получали последовательной экстракцией смесью хлороформ-метанол (1:2) и хлороформ-вода (1:1). Хлороформную фракцию отделяли, упаривали и хранили при -70°С.

Получение ДНК-нагрукенных липосом проводили следующим образом: липидный экстракт растворяли в диэтиловом эфире, добавляли забу-ференный фосфатом солевой раствор, содержащий плазмидную ДНК. Полученную суспензию обрабатывали ультразвуком, после чего полученную гомогенную эмульсию упаривали под вакуумом для удаления эфира.

Трансформация с помощью ДНК-нагруженных липосом. проводили следу- ' ющим образом: препарат липосом смешивали с протопластами коринебактерий в присутствии FEG-a, инкубировали и высевали регенерационную селективную среду.

Получете препарата фага проводили согласно методике (Arber et al.,1983) •

Анализ белков, синтезированных-in vivo в системе миниклеток' : Е. ooli, содержащих плазмидную ДНК проводили по методу '. (Frazer, Curtió., 1975).

Электрофорез белков. Образцы белков анализировали при помощи . диск электрофореза в 15% SDS-ПААГ с использованием концентрирующего и разделяидего гелей по методу 'T,aemmli,l976) Определение удельной активности гомосериндогидрогеназы проводили по методу Патте (Patte et al.,1963)

Активность а-амилазы определяли спектрофотометрически как изменение OD при длине волны 600 нм. В качестве субстрата использо- • вали амилопектиназура.

«Юрментацию коринебактериалышх штаммов проводилл в пробирках и в лабораторных ферментерах " Marubiei "

Концентрацию аминокислот после ферментации в пробирках определяли хроыатогра£ически при разделении аминокислот культуральной

жидкости на бумаге FN-11 в системе бутанол:уксусная кислота:вода (4:1:1) [Елисеева.,1974], после выращивании бактерий в ферментере в системе 2-пропанол:ацетон:вода (50:50:12:8)1Кихнор.,1981]. Экстракцию с бумаги проводили в 50% раствора этанола. Оптическую плотность измеряли на КФК-2 при х.=560 км.

Результаты и обсуждение.

/

I. Разработка система вектор-хозяин для коринебактерий.

При разработке системы вектор-хозяин, первыми этапами являются поиск подходящих низкомолекулярных плазмид и маркеров. К началу данной работы нам не были доступны сведения о мультико-пийных плазмидах коринебактерий, поэтому для поиска плазмиды', пригодной для конструирования бирешшконного вектора, наш был проанализирован плазмидный состав 69 коринебактериалышх штаммов. В штамме Brevibaoterium sp. была идентифицирование критическая шгазмида, обозначенная pBOI, размером 4,4 тпн, представленная в количестве.8-10 копий на клетку.

Полученная рестрикционная карта плазмиды рВ01 (рис.1), при сравнении с литературными данными, совпала с картами крштичес-ких плазмид pBL1 [Santamaria et al.,1984] И рАМЭЗО (Miwa et al., 1984].

Необходимо было маркировать критическую плазмиду рВ01 какими-либо генами устойчивости к антибиотикам, выражающимися в коринебактериях. Предполагая вести генноинхенерную работу по конструированию гибридных плазмид в в. ooli, мы решили.пойти по традиционному пути - созданию биреликонного челночного вектора.

В качестве вектора обеспечивающего репликацию бирепликонной плазмиды в е. ooli был выбран решшкон рАСУС184 (Тог, стг). На основании данных lozaki et al., 1984], следовало ожидать экспрессии выбранного нами гена oat в коринебактериях. i

Для конструирования гибридной, бирепликонной плазмиды проводили линеаризацию плазмиды рВ01 рестриктазой Sau ЗА. Фрагмент размером 4,4 тпн, соответствующий линейной полноразмерной плаз-мидной ДНК. литеровали с обработанной рестриктазой BamHi ДНК

-г-

Рисунок Конструирование бирс п/гакон кого вектора Е. coli - С. fhiUmioum

ншиг ЗшлЛЛ

Рисуис* 1 Субклоюрошиш* I4U»

гшюс»ркнлегидроген*аи В. coli на биреолнхомно* »ектор« рКЛН

(лазмпда pACYCi84. Лигированной смесью трансформировали клетки »амма ТО-1 E.ooli. Среда трансформантов было отобрано 80 клонов ! генотипом То0, Сшг. Плазмидная ДНК из этих клонов была одно-ъ и того же размера, соответствовавшего сумме размеров роди-'ельскшс плазмид, что указывает на отсутствие делеций в корине-¡актериальной части плазмида. Плазмида объединяли в группы и ис-гользовали для трансформации протопластов штамма B.iaotofer-lentum АТ0С14067. На регенерационной селективной среде с хлорам- . )эниколом были отобраны рекомбинантные клоны, содержащие плаз-пздше ДНК, рострикцпопный анализ которых по крупнощепящим рест-шктозам дал одинаковую электрофорограмму для всех полученных глазмзд. Из этого следует, что рАСУС184 присутствует во всех вариантах 'В одной и той ко области плазмида рВ01. Размер гибридных глазмид составил 8,4 тпн. Для дальнейшего анализа использовали ибридиуп плазгэду рШ разбором 8,4 тпн .и представляющую собой >ектор PACY01Q4, содержащий .линеаризованную ДНК рВ01.. Полученной ¡цропликонной плазмэдой рКА1 трансформировали' штаммы различных »ршоОактэрий. Шло показано, что бирепликонный вектор pKAI ¡гасйиыга подаригааотся в кготках B.flavua, В. laotofermentua, !.ßlutaü)ioum, 2.coli в количестве 8-10 копий пДНК на клетку. На ¡скове глпзнгды pKAI (8,4 тпп) обработкой рестриктазами Hind hi i sph I с последующим лигировашем были получены делециониыо ва-галятц рТСШ (7,8 -тпп) и рКШ (7,8 тпн) соответственно (рис.1), :пособш:в реплицироваться в клетках E.ooli и'различных видах, ко-ишобакторнй придавая пм устойчивость к хлорамфениколу.' [amnio о полученных нами векторных плазмида* приведены в таблице 1.

Таблица it 1.

I I ректор I I Уникальные сайты рестрикции (размер ! I »-применимое для клонирования! тпн 1 ! 1 1 1 Маркер i i ; i

! рКА1 ! Sal GI*,BalI,HpaI, I 8.4 ! ! Сшг

I рКА12 : SalGI*,SphT*,BalI,HpaI 1 7.8 ! ! Стг

! рКА11 I 1 SalCI*,!UndIII*,ßalI,HpaI 1 7.8 ! 1 ! ! C.nr ! : i i

-Ю -

1.1 .Отработка системы трансформации протопластов корицебактерий

Основной стадией при разработке системы вектор-хозяин для новых генноинкенерных объектов является отработка методов введения рекомбинантных ДНК в клетки данного микроорганизма. Нашей задачей являлась отработка методов трансформации, позволяющих вводить плазмидную ДНК в клетки коринебактерий с достаточно высокой степенью эффективности для последующего прямого клонирования в коринебактериях.

Почти все опубликованные процедуры трансформации коринебактерий [Yoehiohama et al.,1985; Katoumata et al.,1984; Hiwa et al.,1985; Santamaría et al.,1985;] основываются на получении протопластов и сферопластов.

Предстояло отработать ключевые стадии трансформации, характерных для грамположительных бактерий: ■ .

- протопластирование. '

- ПЭГ-опосредованная трансформация.

Ключевым моментом для получения протопластов является чувствительность клеточной стенки бактерий к лизоциму.' Так как по литературным данным коринебактерии сильно различаются по чувс- . твитольности к лизоциму, необходимо было получить достаточно воспроизводимую процедуру. За основу была взята методика, разработанная Иошихамой с соавторами [YoBhiohama et al.,1985].

Условия трансформации отрабатывались на штамме o.glutamioum Т2, эгот штамм предполагалось использовать в качестве реципиента ДмЛ получения штамма-продуцента гомосерина, при пробных опытах он давал уровень частоты трансформации равный 10-10*2 трансформантов /I мкг пДНК).

При отработке метода мы варьировали такие параметры как: кон. центрация и длительность обработки лизоцимом. использование PEGa различного мол.веса и в различных конечных концентрациях й реак-

ционной смеси при этом наибольшая частота трансформации коринебактерий достигалась после короткой - 3 часа инкубации с лизоци-мом в концентрации 2,5- 3 мг/мл (% образовавшихся протопластов при этом был равен 20-30%). и конечной концентрации РЕО'абООО в смеси 25%. В результате была отработана методика трансформации протопластов коринебактерий со стабильной частотой I03 на I мкг плазмидной ДНК.

Для увеличения частоты ТФО мы применили метод ДНК-нагруженных липосои, являющимся в настоящее время, в случае трансформации протопластов эукариот, одним из широко применяемых методов [Fraley et al.,1980; Wong et al.,1980]. В литературе нет данных о применении к коринебактериям метода слияния протопластов с ли-посомами нагруженными ДНК. Мы проверяли возможность использования данного метода, с некоторыми модификациями, на коринебакте-риях. Мы полагали, что' взаимодествие липосом с протопластами, будет происходить наименее трамвирующим образом, если липиды будут получены из самих коринебактериальных.клеток.

Липидный экстракт получали из коринебактериальных клеток. ДНК в лштосомы включали, обработкой ультразвуком и смешивали с протопластами коринебактерий

Смесь протопластов с липосомами, нагруженными ДНК, после обработки РЕО-ом инкубировали 3-3.5 часа' при 30°С, затем высевали на селективную регенерационную среду. При этом частота трансформации штамма Т2 составляла 10* трансформантов/I мкг плазмидной ДНК, выделенной из с. glutamiouo, что выше, чем при использовании стандартной поцедуры.

При обсуждении механизма трансформации протопласт. ДНК-нагру-женными липосомами нам представляется наиболее вероятной модель слияния протопластов с липосомами. Это подтверждается тем, что при трансформации протопластов смесью липосом с ДНК ( в тех же пропорциях, что и в случае ДНК-нагруженных липосом ) эффект трансформации был ниже на три порядка.

I..". Исследование векторных свойств бирепликонной илазмиды рКА1

- 1Z -

Для выполнения генноинженерных работ на полученном бирепли-конном векторе необходимо было проверить стабильность его поддержания в культуре клеток и структурную стабильность вектора и рекомбинантшх плазмид на его основе. В качестве модели для проверке векторных свойств рКА1 нами был взят фрагмент ген о-амила--зы Baoilluß amyloliquofaoiene, присутствие которого в клетках выявляется на индикаторной среде с амилопектиназуром.

Клонирование гена а-амилазы в клетках коринебактерий представляет собой самостаятельный практический интерес для промышленной биотехнологии. Наличие а- амилазы необходимо бактериальным клеткам для использования крахмала в качестве источника углерода. Придание таких свойств промышленным коринебактериальным штаммам представляется весьма желательным и достижимо с применением генно -инженерных методов.

Bglll-фрагмонт ДНК pTG23,(предоставлена Сорокиным ВНИИгене-тика), размером 3.6 тпн содержащий ген ату был субклонирован в Hindin сайт вектора рКА11. Лигированной смесью трансформировали клетки E.ooli. Гибридные, плазмиды, соответствовали двум ориента-циям фрагмента на векторе.

При перепечатке трансформантов на чашки с индикатором амилопектиназуром вокруг клонов, обладающих а-омилазной активностью, образовывались зоны просг?тления индикатора.

Плазмиду рКМ1 вводили в клетки коринебактерий . Все. проанализированные Стг клоны обладали а-амилазной активностью. Рест-рикциошшй анализ плазмидных ДНК, выделенных из ряда клонов трансформантов, показал, что все плазмиды соответствуют исходной, из к. coli, т.е. отсутствует структурная нестабильность, при этом уменьшения копийности не наб.лдали.

Полученные клоны проверяли на наличие плазмидной ДНК и на стабильность наследования маркеров. Клетки несущие плазмиду рКЫ1 .растили с пересевами (5 пассажей), что в сумме соответствовало 40 генерациям, без селекции по антибиотику, после чего 75% клонов проявляли устойчивость к Cm, вокруг этих же колоний образовывались зоны просветления индикатора.

Для введения плазмиды рКЫ1 в клетки штамма Brevibaoterium ер. 531 использовали липосомы нагруженные ДНК. Клоны, отобранные

ка регенерационной среде с хлорамфениколом (5 мкг/мл), перепеча-щвали на L-агар с вмилопектиназуром. Все 288 проанализированных клонов в тесте in eitu образовывали зоны просветления индикатора, а,е. обладали а-амилазной активностью. Рестрикционный анализ щгазмидных ДНК, выделенных из 24 колоний трансформантов, пвказал, Что все плазмида соответствуют исходной, из в. ooii, т.е. отсутствует структурная нестабильность, при этом уменьшения копийности -не наблюдали.

Для сравнения экспрессии гена а-амилазы в В. ooii и коргае-бактериях был проведен количественный анализ а-амилазной активности в штаммах Е. ooii и Brevibaoterium ер., трансформированных 'плазмидой рКМ1. Полученные данные представлены в таблице # 2.

Таблица # 2. Анализ а-амилазвой активности штаммов в. ooii и Brevibaoterium вр., трансформированных плазмидой рКЫ1.

штамм культуральная жидкость клетка

Brevibaoterium sp. <0.0001 <0.0001

Brevibaoteriua sp.(pXM1) О.ООЗЗ 0.0035

Escherichia coli 701 <0.0001 <0.0001

Esoheriohia ooii (pXHI ) 0.0038 0.043

Уровень а— амилазной активности в случае клеток коринебакте-рпй, по крайней мере на порядок нзгэ, чем в клетках в. ooii, данный уровень во позволяет использовать крахмал в качестве единственного источника углерода для роста трансформированных клеток. Тем не менее созданный нами вектор в клонированный на нем ген о-амалаза позволяет продавят, работу по созданию хоринебактери- . альних втадаов, утилизирующих крашал. j

Таким образом на модельном объекте бола показана возможность применения полученной бирешшконной плазмида pKAi кос челночного вектора для в. ooii а коршеОактернй. Полученные гибридные плаз-юды со вставкой 3,6 тпн стабйлыю поддерживались в к. ooii п Brevibaoterium ер. т.е. вектор рКА11 может быть использован для

клонирования фрагментов ДНК по крайней мере до 3,6 тпн, уникальный сайт H In diu может быть использован для клонирования. Реком-бинантные плазмида со вставкой в этом сайте не элиминируются при росте в неселективных условиях. Рекомбинантные молекулы полученные на основе вектора рКА11 структурно стабильны.

2. Клонирование гена thrA E.ooli на бирешшконном векторе рКА11 в клетках с. glutamioum.

Одной из практически важных задач, решаемых методами генной инженерии на коринебактериях, являеется получение штамма-продуцента гомосерина, используемого в крупнотонажном производстве лизина. При этом коринебактериальные штаммы продуценты имеют ряд преимуществ над существующими продуцентами на базе Е. ooli, например для коринебактерий не столь распространено такое явление как фаголизис на производстве, Е. coli являются условно патогенными бактериями в отличие от коринебактерий и т.д.

При планировании работы мы исходили из того, что для ■ создания штамма-продуцента гомосерина необходим ген гомосеринде-гидрогеназы. Наиболее удобным для этого геном мы считали ген го-мосериндегидрогеназы Е. ooli, у которого достаточно хорошо изучены' структура и регуляция. Поэтому нам представлялось целесообразным использование этого гена в нашей работе.

Для клонирования гена ГД e.ooli использовали плазмиду pYNi101, содержащую гены гомосериндегидрогеназы (ГД), и гомосе-ршшшазы (ГК) из Е. ooli. Pvull, HindIII-фрагмент ДНК размером 2.85 тпн, содержащий ген ГД, встраивали в вектор рКА11 по Hindin сайту (рис.2). Лигированной смесью ДНК трансфоргтровали клетки Е. coli. Гибридные плазмида, обозначенные рКАЕП и рКАЕ21 ".омшюментировали мутацию в гене ГД штамма Gif 102 E.ooli. Однако введение перечисленных плазмид в штамм С.glutamioum T-7(thrA2) но приводило.к комплементации данной мутации.

3. Использование фагово-плазмидного вектора для изучения экспрессии генов биосинтеза троонина С. glutamioum в системе миник-

JiOTOK E.ooli.

Одним из этапов при характеристике генов, контролирующих биосинтез аминокислот, является определение размера гена по последовательности 'нуклеотидов и размера белка,, кодируемого этим геном. Совпадение размеров белка предсказованного и экспериментального указывает на правильность литературных данных о положении и структуре гена. Размеры белков, кодируемых клонированными • генами, определяется в системе миниклеток Е. coli. Нами был разработан модифицированный метод, позволяющий значительно снизить трудоемкость этой работы, особенно при необходимости исследования большого числа клонов рекомбинантных ДНК. При этом используется рекомбинантние ДНК на основе фазмидпых векторов.

. Рекомбинантная фазмида в фаговой форме является посуществу рекомбинантным фагом, который содержит дополнительно плазмидную часть. Методически работа с рекомбинантяыми фазмидами проводится также как в случае рекомбинантного фага.

Синтез фаговых белков подавляется в .присутствии реггроссора - продукта гена el, поэтому для инфекции гибридными фазмидами в штамм Х934, образующий миниклетки, ввели многокопийную плазмиду pDS3 [Steege et al.,1983J с генами oí и гех. Анализ показал, что гены сГ и гех плазмиды pDS3 эффективно экспрессируются в миник-летках штамма Х934. Необходимо отметить, что присутствие в ми-никлетках резидентной плазмиды pDS3 не мешает последующей идентификации кодируемых гибридной фазмидой полипептидов, т.к. плазмида pDS3 кодирует те se белки, что и вектор xpSL5,'a именно -лактамазу и белки el и гех.

Для того чтобы продемонстрировать возможность анализа белков рекомбинантных фазмид в сконструированном нага штамме, продуцирующим миниклетки с резидентной плазмидой pDS3 использовали гибридную фазмиду хрОВТ7, содержащую фрагмент хромосомной ДНК (7,0. тпн) с. glutamioum с генами биосинтеза треонина, получешую рт Бескровной О.Ю. Í

Гибридную фазмиду \pOBT7, содержащую эти гены, использовали подобно трансдуцирущему фагу для введения в миниклетки клонированных генов путем инфекции. В процессе поддержания in vivo гибридной фазмиды в форме плазмиды фаговые гены, за исключением га-

I . <ят - цъооо С г-ь)

. ^ Ь 2.100

... —II «имО — - Ъ5ооО

I—- »••- ^ * -•■<. г

*.»• »V '•' ' -'Г.'

• У ' > . •..;

- - — «4

1 г- ь ч 5 6 ч-

Рисунок Ъ Экспрессия генов миниклетках штамма Е. оо11 Х984 (рШЗ)» инъецированных гибридной фазмидой хрОВТ7 1- неинфецированные миниклетки

2,3- 30 минут инкубации дс внесения [Э5Б]-Ме1 и 60 мин инкубации после мечения (при 30 и 37°С соответственно) 4,5- 60 минут инкубации до внесения [Э5S]-Met и 60 мин инкубвции после мечения (при 30 и 37°С соответственно)

6- 2 часа инкубации.до внесения и 60 мин .инкубвции после мечения при 30°С

7- 1 час инкубации до внесения (^Б]-^ и 120 мин инкубвции после мечения при 30°С

нов oí и rex, не экспрессируются. При этой эффективно экспрессируются ген Ыа плазмида ри019 и гены, локализованные на клонированном фрагменте ДНК.

Миниялетки штамма X984(pDS3) инфицировали гибридной фазми-дой хрОВТ7 и анализировали белки, синтезированные при температуре 30°и 37°0. Плазмида pDS3 и фазмида \pSL5 содержат гон ci857, кодирующий твмпэратурочувотвительный ропресоор. Поэтому следовало ожидать, что при непермиссивной температуре (37°0) репрессор нефункционален и будут акспрессироватьоя все фаговые белки, т.е. гибридная фазмида будет развиваться как фаг по литическому пути. Анализ радиоавтограммы белков, синтезированных в инфицированных миниклетках, показал, что при увеличении температуры инкубации с 30°до 37°0 экспрессируются не только гоны клонированного фрагмента ДНК, но и фаговые гены. При этом количество фаговых белков увеличивалось с увеличением времени инкубации миниклеток (рис.э ). Как показал эксперимент экспрессия фаговых генов проявляется и при температуре инкубации 30°С, если общее время инкубации превышает 60 мин.

Из анализа радиоавтограммы (рис.3) следует, что фон фаговых белков практически отсутствует, если инкубация миниклеток осуществляется при 30 С и общее время инкубации не превышает 60 мин. При этом фрагмент ДНК, содержащий гены биосинтеза треонина 0. glutamioum определяет синтез 3 белков с Мг = 43000, 38500 и 35000. Полученные данные согласуются с расчетными значениями молекулярных масс продуктов генов гомосериндегидрогеназы (43000) и гомосеринкиназы (35000), вычисленными на основе анализа нуклео-тидной последовательности фрагментов ДНК С.glutamioum (Katsum£.ta et al., 1986) и данными [ Follettie et al.,1988]. Таким образом, в составе гибридной фазмида, по-видимому, содержатся полные последовательности клонированных генов, ГД и ГК, которые били использованы для дальнейшего анализа. .

4. Субклонирование гена thrA2 С.glutamioum.

Продолжая работу по получению штамма-продуцента гомосер;п!я • мы использовали ген гомосериндегидрогеназы из с. giutar¡icum атсс .

J3032. Для субклонирования гена thrA2 из O.glutamioum была использована полученная от Бескровной О.Ю. плазмида рОВА4Э [Бескровная и др.,1383], несущая ген гомосериндегидрогеназы (ГД) с. glutamicum. Комплементационный анализ плазмиды рОВА43 в штаммах Е. coli CSOO(thrB) и Gif102 (thrA2) подтвердил наличие в составе этой плазмиды гена thrA2.

Фрагмент ДНК плазмида рОВА4Э размером 1,5 тпн, содержащий ген thrA2 встраивали в HindlII сайт вектора рКА11. Гибридную шшзмиду, обозначили как рКН1(рис 5). Параллельно с этим, фра-■ гмент ДНК плазмиды рОВА43 размером 2,1 тпн, содержащий ген thrA2 с доползытельной 5'-концевой последовательностью встраивали в SphI сайт вектора рКА12. Липфованной смесью трансформировали клетки E.coli. Гибридную плазмиду обозначили как pKAG8 (рис. 5). Полу-чэклые рекомбинантныо плазмиды комплементировали мутацию в гене ГД штаммоз Gif 102 E.coli и С.glutamicum Г-7.

Для более детального изучения экспрессии гена определяли активность гомосериндегидрогеназы в штаммах O.glutamioum Г-7 (thrA2) и с.glutamicum Т-2 (thrB) содержащих плазмиды pKAGS и рКН1, в отсутствии и присутствии треонина, ингибирувдего гомосе-рищегадрогеназпую активность. Результаты измерений представлены в таблице # 2. .

Измерения показали, что уровень активности гомосериндегидрогеназы, кодируемой геном thrA2 с. glutsmioum в составе плазмиды рКАСЗ и рЮГО1 в штамме C.glutaaioum Г-7(thrA2) равен уровню. активности ГД в бесплазмидном штамме T-2(thrB). В штамме Т-2 ( thrB ) гфи введении плазмид placa и рКН1 активность ГД увеличивалась всего на 502 по отношению к активности бесплазмидаого штамма. В присуствии треонина активность гомосериндегидрогеназы, кодафуемой геном thrA2 в клетках коринабактерий полностью инги-бируется (табл #3).

Для оценки уровня аминокислотной продукции гомосерина клета-ми коринебактерий, содержащих полученные в ходе работы плазмида, культуральную жидкость штаммов C.glutamioun Г-7 и C.glutaraioum Т2 содержащих плазмиды рКН1, pKAGS изучали методом ТСХ. В случае ита'лла Т2, содержащего плазмиды pKAG8 и рКН1 наблюдалось 10-15Ж превышение продукции гомосерина над уровнем бесплазмидаого штам-

A b

ЦЬООО ...___ ....... _ цьооо

35 ООО

\ г. ъ \ г. ъ

Рисунок Ц Авторадиограмма белков,. синтезнровсжшх in vivo в миникдетках штамма Е. ooli Х934 на Д1СС плазизд

А 1. рОВТЭ

2. рОВА43-5

3. pUC19 ■

В 1 . рКА1 ■ 2. pKAG8 3. рКН1

- ю -

ма. При &тож 70^75% клеток сохранили шгазмида после роста в неселективной ферментационной среде в течение 72 часов.

Для 1фоворки нативности белков кодируемых клонированными генами в составе полученных плазмид использовали анализ белков в системе митшоток е. coli. Штамм E.ooli Х984, образующий миник-летки, трансформировали олазмидами ровтз. рОВА43, рис18,рКА1, рКАса и pKHi. Авторадиограмма белков, синтезированных в миник-летках, предстовлена на рис 4 .

В минихлеткех, содержащих плазмиду ровтз с генами ГД и ГК, ■кроме белков, кодируемых вектором pUCio, синтезируются два до- . полнителышх полипептида с молекулярными массами 43000 и 35000. Плазмида р0ВА43 с геном ГД в миниклетках определяет синтез одного дополнительного полипептида с молекулярной масой 43000. В миниклетках, содержащих плазмиды рКА08 и ркш, несущие ген thrA2 c.glutainioum, кроме белков, кодируемых вектором рКА1, присуству-ет полилоптид с молекулярной массой 43000, что соответствует молекулярной массе ГД. Таким образом, в системе миниклеток Е. ooli гены ГД и ГК O.glutamioum определяют синтез белков с молекулярными масса)«: 43000 и 35000, соответственно. Полученные данные согласовываются с полученными раиео данными при изучении экс. пресс™ этих генов в составе гибридной фазмиды хровтг.

Полученные дшшые позволяют заключить, что экспрессия клонированного на бирешщконном векторе гена ГД в не нарушена. Низкая активность белка по всей видимости связана с присуствием в экстракте клеток коркнобактерий эндогенного треонина, который продуцируется, в клетках штамма O.glutamioum Г-7, и ингибирует активность гомосарадегндрогеназы в составе плазмид рШ и pkagö. . В штамме c.glutaraiouw Т-2 треонин присуствует в ростовой среде так как этот штамм является дефектным по гену thrß. Однако при проверке было показано» что и без добавления в минимальную среду треонина наблюдается слабый рост штамма Т-2. что говорит о неполном блоке по гену thrß. Следовательно в экстракте клеток этого штамма, выращенного яа ростовой среде б. з треонина также присуствует эндогенный треонин, что может объяснить ингибирование активности акшифодфОБштго гена ГД.

5.Субклонирование гена thr А2*. нечуствительного к ретроингиби-ровашпо треонином, и thrB B.flavum'B клетках коринебактерий.

В виду того,что получешше нами конструкции ркн1 и рклса не обеспечивали существенного повышения уроня продукции гомосерина в силу ингибирования гомосериндегидрогеназы треонином, для создания штамма продуцента гомосерина работа была продолжена с клонированным ранее Бескровной О.ЮЛБескровная и др.,I990J, геном thrA2* из B.ilavum, нечувствительным к ретроингибированию. Полученные данные о высокой активности ГД в клетках Е. coli, содержащих гибридную фазмиду \pOBF3 с клонированным генсм thrA2* [Бескровная и др.,1990], указывают на перспективность его использования при конструировании коринебактериального штамма продуцента гомосерина.

EooRI-фрагмент ДНК фазмиды хрОВРЗ размером 4,1 тпн субкло-нировали на векторе pUCi9. Рекомбинантная плазмида pBi'2 (ю,9 тпн), представляла собой плазмиду риС19, содержащую два последовательно расположенных EooRI фрагмента ДНК фазмидо рОВРЗ рис 5). Плазмида рВР2 комплементировала мутацию в генах thrA и thrB сооответствукхцих штаммов Е. coli.

ГибридиЗационный анализ по Саузерну показал гомолога» EooRl-фрагментов гибридных фазмид \pOBT7 и хроврз, поэтому мы ожидали, что ген ГД находится на одном и том фрагменте ДНК. Xpnl - фрагмент ДНК плазмиды рВР2 размером 1,5 тпн, содержащий ген thrA2», встраивали в HindlH сайт вектора рКА11 Гибридную плаз-миду обозначили pKHDi2 (9.3 тпн)(рис. 5). Параллельно Saii-фрагмент ДНК плазмиды pBF2 размером 4,1 тпн, содержащий гоны thrA2* и thrB, лигировали с линеаризованной по Saii-сэйту ДНК плазмиды.рКА11. Гибридные плазмиды pKAS2 и pKAS7 (11,9 тпн) (рис.5) отличались ориентацией-клонированного'фрагмента. Полученные рекомбинантные плазмиды комплементировали мутацию в гене ГД штаммов E.ooli и коринебактерий.

На стадии комплементационного анализа конструкций рИ!1 и PKHD12 в клетках E.ooli и C.glutamiouni было показано, что клетки, содержащие плазмиды pKHDia и pKAS7, несущие ген .гомоооринде-

Рко.5 клонирование генов оиосинтеаа ХЬг С.д1и1атЛсит и В./1атт на бирепшисоннок векторе рКА

Н Нр X В Зр Зр Е В И

I __ I 1„ 1 ......I......I........

рКА1

рВО!

1 тпн

рКА12 Г

"рВОГ

' Бр Б1 К ц

¡Кг/иг

рКАП

рКМНЭ

1КгЛ2 шшшШ Р^Н 1

гьгАг^вттш рКНБ12

Р КР11КЕ

рвг*

р11С19 ШИ

ЕЕШ - С. /Шатичт • В. /1оглшг

Н - Н1п(1га Эр - БрЫ В - Вс11 Нр - Нра! ЯГ - Бй! К - Крц! X - ХЪй К - ЕсоМ Р - Ра£Г

Н

Пуп биооштм •мкхоыго/юг »сшфагккоаого е*ь»ас*м у нормятйшкыркЛ

0"

аспартаг

о-

| гшзин] - -

[йети

Ш-Д/

♦спартатиинам

|оспартилфосфат|

д»гядрог»нма

аяЛ

асиартат

по л у а го, я« гид

1КЫ2 теЦ. ЬкгВ

| гомосерчн |

| ромре*рияктша

гоиосерикфосфат

I .

трротаогеинтг-.

1кгС

треонин

| ИиА

0< - кетовутираг

_|______

иаолсйцйн |

гвдрогеназы в.Патит, нечуствительной к ретроингибированию треонином, комплемэнтируют мутацию в гене «1гА2 штамма с.в1и1ая1ош> Г-7 лучше, чем клетки получившие ген гомосериндегидрогеназы 0.^1^аш1оит в составе плазмвд рКН1 и рКАС8 ( 24-32 часа в случае плазмид рПШ12 и рюи57 и 36-48 часов дль плазмид ркн1 и рКАса ). Для более детального изучения экспрессии этих генов определяли активность гомосериндегидрогеназы в штаммах с.§1и1;ат1оит Г-7 (гьгА2) и О.в1^ат1оит Т-2 (^в), содержащих шшзмиды рКАБ7 и рКНВ12, в отсутствии и присутствии треонина, ингибируюцего гомо-сериндегидрогеназную активность. Результаты измерений представлены в таблице # э.

Таблица # э. Удельная активность гомосериндегидрогеназы в клетках О.в1и1ат1ош1 Г-7 ( 1;1ггА2 ) и С.в1а1ат1оит Т-2 (Ш?В), содержащих гибридные плазмиды.

1 1 Штамм 1 Плазмида I генотип Удельная (в условных активность I единицах ) I

в отсуствии в присуствие!

треонина * треонина I

|0^1лИ;ал)1оит Г-7.1 — < 0.05 н.о. I

1 аЪгЛ2) I I

рКН1 I «и*А2 0.205 н.о. I

рКАС8 1 thгA2 0.217 н.о. |

рШП)12 1 «1ГА2» 1.57 н.о. I

рКАБ7 1 ^А2» 1 «1гВ 1.59 н.о. I I

|С.в11иал11дит Т-21 ". ' " ■ 0.213 < 0.05 I

1. («ггв) 1 I

1 « . 1 рКН1 . 1 1ЫА2 0.317 < 0.05 I

рКАС8 1 ЬЪгА2 0.325 < 0.05 I

1 ♦ : 1 рИШ12 Г «1гА2» 2.031 1.68 I

' ....... - т-'-- 1 рКАБ7 1 «1гА2» 1 №гВ 2.12 1.57 I ' I

- гц-

Измерения показали, что удельная активность гомосериндегид-рогеназы в.Пати в составе плазмиды рКНБ12 в штамме Т-2(Ш?В) на порядок вышэ, чем активность этого фермента в бесплазмидном штамме. Кроме того, указанная активность значительно превышает активность гомосориндэгщфогенази, кодируемой геном 1;11гА2 с.б1^ат!ош1 в составе плазмиды рКН1, аналогично и в штамме Г-7. При измерении ферментативной активности в присуствии треонина ■ активность гомосоршуюгидрогокэзы, кодируемой геном 1;ЬгА2 в.Пауиш б составе плазмад ркншг и рлЛ57,г>клБг падает но 17-16%, тогда кпк активность гокосар-лтдогидрогонозы, кодируемой геном ШгА2 с.у1ииип1оип полностью ингабпруотся.

При оценка урогш продукция гойосьркио и лиаика клетками ко-ршюбактерий содорхздах гакшвду ршиг и ¡ат;л*лю Г-7 (рЮШчг) наблюдали практически полное исчозновонкя продукции лизина, по сравнению с бесплсямидкьм штаммом. В итг&тсо Т-2 (рККС12) также наблюдал»! уменшоипо дота лизина и уво.'г.пет'.е доли гомосорина на 30^ по сравнению с босплпзмидным п№гу.см. Однако при проверке продуктивности отакма поело формонтецпи в ферментерах па наблюдалось заметного провымошя продукции по сравнению с оасплазкид-шм штаммом. При проверке стабильности плазмиды было показано, что к ко-щу фврмбнииг««: в два раза снизилась доля клеток, содержащих пДНК по отношша к их доло в посевном материале.

6. Конструирование и оптимизация плазмидаых коршюбактериальта штампов, продуцирующих гомосорин.

Дальнейшей задачей работы являлась оптимизация экспрессии клонированного гена Шглг* в коршюбактериальшх штаммах. Для . этого представлялось целесообразным проверить эффект замены маркера устойчивости к антибиотику на увеличен!") стабильности вводимой в рецгагаентные штаммы пДНК. Учитывая то, что основным результатом присутствия гибридной плазмиды является перераспределение мэтаболитного потока от биосинтеза лизина к биосинтезу го мссерина, представлялось необходимым увеличение общего метабо-

литного потока перед метаболитной вилкой за счет расширения узких мест метаболизма предшественников путем введения мутаций в ключевые ферменты.

В качестве альтернативной селекции плазмидсодерзсащих клеток в гибридную плазмиду ркш>12 ввели ген устойчивости к канамицину из транспозона ТпЭОЗ Е. ooli. Для этого ДНК плазмида pUC4K [Oka et ai.,1984], расщепляли рестриктазой Pstl, Pstl- фрагмент размером 1,5 тпн, несущий ген Km- устойчивости, элюировали и дотировали с линеаризованной по Pstl ДНК плазмида pKHDi2. Литерованной смесью трансформировали штамм Е. coli TG-1 и высевали на селективную среду с канамицином (20 мкг/мл). Из Кт-устойчивых клонов выделяли пДНК. Анализ выделенных плазмид показал, что все они содержат дополнительный, по отношению к исходной плазмида PKHD12, Bs«фрагмент размером 1,5 тпн, придающий клеткам Km устойчивость.. Для дальнейшей работы использовали рекомбинантную плазмиду названную рКМНЭ (рис.5).

При анализе аминокислотной продукции, в результате ферментации в пробирках, продукция гомосерина штамма С. glutamioum 49-7 рКМН9 превышала уровень продукции бесплазмидного штамма, на 30% как при росте с добавлением Km, так и на неселективной среде. При этом 95% клеток сохраняли Кш-устойчивость. Для дальнейшей работы были отобраны субшюны штамма с. glutamicum 49-7 ркшэ #18 И #29.

Для того чтобы подтвердить влияниеплазмида рКМН9 на уровень продуктивности полученного штамма-продуцента гомосерина. проводили ферментации штамма С. glutamioum 49-7 и с. glutaraicira 49-7 рКМН9 #29.

Проверку осуществляли в лабораторных, ферментерах "Маруби-си" Результаты опытов суммировании в таблице #4. Наличие плазмида в клетках не влияет на.общее количество гомосерина и лизина, синтезируемых продуцентами. Эф1окт плазмида проявляется в изменении соотношения между синтезируемыми аминокислотами (в данном случае - гомосерином и лизином). За счет 2-х - 4-х кратного снижения количества лизина, что в абсолютных величинах соответствует его уменьшению на 2-6 г/л, происходит соответстьую-щое возрастание количества гомосерина. На ацетатных средах лл^я-

мидный штам превышает исходный по продуктивности на 10—15 %. Уровень накопления гомосерина на ацетатных средах у штамма с плазмидой рКМНЭ превышает 30 г/л.

7. Подбор оптимального штамма-реципиента.

Анализируя полученные данные о продуктивности штамма с. б1^ап)1оит 49-7 рКМНЭ, можно отметить, что повышение продукции ■ происходит за счет перераспределения метаболитного потока с биосинтеза лизина на биосинтез гомосерина, т.е. логично было бы предположить что увеличение(расширение) общего метаболитного потока предшественников лизина, привело бы, при наличии в штамме плазмиды рКМН9, к увеличению продукции гомосерина. В лаборатории М.М.Гусятинзра были получены мутанты штаммов 49-7 с. glutamioum, И 103-10 В. Пауит соответственно #77 и #90, устойчивые к Б-(2 -сминоотил)-Б,ь цистеину (АЭЦ). Бесплазмидные штаммы 77 и 90 продуцируют при ферментации в пробирках 13 г/л гомосерина,12 г/л лизина и 29 г/л гомосерина, 6-8 г/л лизина, соответственно.

При введении плазмиды ркмнэ в штамм-продуцент гомосерина в. _'Пауш1 90, после ферментации в ферментерах уровень продукции лизина "резко уменьшился, однако это не дало существенную прибавку в продукции гомосерина в виду того, что в отличии от штамма с. glutamioum 77 в штамме в. Пауит 90 направление метаболитного потока уже сильно смещено в сторону гомосерина и в бесплазмидном штамме (табл.# 4).

• Анализ аминокислотной продукции штамма с. £1и1ат1оит 77, содержащего плазмиду ркмнэ^ после .ферментации в в ферментерах показал, что уровень продукции гомосэрина плазмидсодержащего штам- • ма с. в]л^ат1сш> 77 р$0£Н9 превысил уровень бесплазмидного штамма на 502 (денные представлении в таблице 4). При этом как и следовало ожидать уровень продукции лизина упал также на 50Ж.

Таблица # 4 Показатели ферментации штаммов C.glutamioum 49-7 (рКМНЭ), C.glutamioum 77(рКМН9) И В. flavum 90(рКМН9).

схема культиви- штамм гомосерин лизин

рования г/л

ацетат C.glutamioum 49-7 33.0 7.8

C.glutamioum 49-7(pKMH9) 38.2 3.3

меласса C.glutamioum 49-7 7.1 9.0

C.glutamioum 49-7(pJfflH9) 12.1 2.3

меласса с подпит- C. glutamioum 77 16,8 15.7

кой ' биотином C. glutamioum 77 (pKMH9) 25,9 7,84

> B. flavum 90 22.3 4.07

! B. flavum 90 (pKMH9) 25,9 1,02

! ■ ■■ . • -\ Вывода.

1. Сконструрован бирепликонный вектор рюи е. ооИ/коринебакте-рии и получены его делеционные производныерКА11 и рКА12, имеющие ряд уникальных сайтов клонирования. Рекомбинантные ДНК на основе этих векторов стабильно поддерживаются в в. ooli и разлзгшых видах коринебактерий, при вставках фрагментов ДНК размером до 4,1 тпн в уникальные сайты Hindin, Sali, Sphl.

2. Разработана система трансформации коринебактерий с применением ДНК-нагруженных липосом, с частотой IQ4 трансформантов на I

мкг плазмидной ДНК.

3. На бирепликонаом векторе субклонирован ген а-амилазы Bacillus

amyloliqueXaoiens и показана его экспрессия в коринебактериях. •4. Показано, что ген thrA2 треонинового оперона е. ooli, в коринебактериях не экспрессируется.

5. Разработана система анализа белков, кодируемых гибридными фазмидами путем инфекции миниклеток Е. ooli.

- га -

6. На векторах рКА11 и рКА12 субклонированы гены thrA2 с. giutamioum и thrA2*, thrB в. flavum. Проведен сравнительный анализ экспрессии генов гомосеривдегидрогеназы мутантного и дикого типов в клетках коринебактериях.

7. Показано, что введение в клетки коринебактерий гибридной плаз-миды, содержащей ген мутантной ГД приводит к 10 кратному повышению уровня гомосериндегидрогеназной активности

8. Показано, что амплификация гена thrA2* B.ilavum в клетках коринебактерий приводит к перераспределению аминокислотной продукции в сторону гомосерина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

I Окороков А.Л., Буканов Н.О.,Бескровная О.Ю., Ворошилова Э.Б.,Гу-сятинер М.М., Гриценко В.В., Янковский Н.К., Дебабов В.Г. "Разработка системы вэктор-хозяин;у коринебактерий. Клонирование и изучение экспрессии генов гомосериндегилрогеназы и гомосеринкиназы в клетках Корине бактерий ".Гене тика.,1990,т.XXVI-4 с.648-658

Z Бескровная О.Ю..Буканов И.О.,Окороков А.Л.,4онштейн М.Ю., Янковский Н.К. "Клонирование и изучение генов с. giutamioum, комшюмен-тирующих мутации ilvA, thrA2 E.ooli". Генетика, 1989, t.xxy-1 с.49-57

3 Бескровная О.Ю. .Буканов И.О..Окороков А.Л..Фонштейн М.Ю., Янковский Н.К. "Клонирование и структурно-функциональный анализ 9 клетках е. ooli генов г'лутаметггродущгруюидах коринебактерий, контролирующих биосинтез аминокислот аспарагинового семейства".,Генетика, 1990, T.XXVI-З, с.412-417

4 Окороков А.Л..Буканов И.О., Бескровная О.Ю..Гриценко В.В., Янковский Н.К. "Конструирование бирепликонного вектора на.основе криптической плазмида Brovibaoterium вр." тезисы докл. IV Всвсо-«юзной конф." Амшшокислоты для сельского хозяйства, пищевой промышленности, медицины и научных исследований"EpeasH_..(I988j!

J*--.

5 Окороков А.JI., Буканов И.О., Бескровная О.Ю..Гриценко В.В., Панов К.И., Янковский Н.К., Дебабов В.Г. " Разработка системы вектор-хозяин для Коринебактерий - промышленных продуцентов аминокислот" тезисы докл. Всесоюзной конф. " Новые направления биотехнологии", Пущино (1988)

Ч Бескровная О.Ю., Фонштейн М.Ю., Окороков А.Л., Янковский Н.К., Дебабов В.Г. " Клонирование и характеристика генов аминокислотных оперонов коринебактерий - промышленных продуцентов аминокислот" тезисы докл. Всесоюзной конф. " Новые направления биотехнологии", Пущино (1988)