Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и изучение генов биосинтеза фенилаланина у CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и изучение генов биосинтеза фенилаланина у CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM"

1 3 нон

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-КССЛЕДОВАТЕЛЬСЮ'Ш ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

РОСТОВА ЮЛИЯ ГЕОРГИЕВНА

КЛОНИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОВ БИОСИНТЕЗА■ФЕНИЛАЛАНМНА У СОМИЕВАСТШИШ СШТАМГСШ

( 03.00.15 - генетика )

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1Э95

Работа выполнена в лаборатории генетики и селекции продуцентов аминокислот Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук ГУСЯТИНЕР М.М.

Официальные оппоненты:.

доктор биологических наук, профессор ЗАХАРЬЕВ В.М. кандидат биологических наук ХУРГЕС Е.М.

Ведущая организация:

Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится 28 ноября 1995 г. в 1400 час. на заседании диссертационного совета Д 098.12.01 при ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, I.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке ГНИМгенетика.

Автореферат разослан 27 октября 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ЩЕРБАКОВА В. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации.

Производство аминокислот - одна из перспективных отраслей микробиологической промышленности. Микробиологический способ производства аминокислот дает возможность получения биологически активных L-изомеров на основе дешевого и доступного сырья. Фенил-алашш относится к незаменимым аминокислотам и используется во многих областях промышленности и медицины, в частности, для получения дипептидного заменителя сахара - аспартама.

В настоящее время большая часть аминокислот, получаемых мик-робологическим способом, производится с помощью мутантных штаммов глутаматпродуцирующих коринебактерий (Corynebacterim glutamicum, Brevlbacterlum llavum и Brevlbacterlum lactoiermentum). Методы генной инженерии, которые' с успехом используются при создании высокоэффективных продуцентов на основе таких микроорганизмов, как кишечная и сенная палочки (E.coli и Bac.subtllis), пока не нашли должного применения для выведения продуцентов аминокислот на основе коринебактерий. В частности, до.сих пор нет ни одного коринебактериального продуцента аминокислот, созданного с использованием методов генной инженерии, который нашел бы применение в промышленности.

Развитие систем клонирования для глутаматпродуцирующих коринебактерий и изучение экспрессии генов в клетках коринебактерий позволит ускорить процесс создания новых и улучшению уже имеющихся штаммов-продуцентов аминокислот. Амплификация в клетках коринебактерий генов, кодирующих ферменты лимитирующих этапов биосинтеза аминокислот, может приводить к усилению метаболитического потока в направлении необходимого продукта и'является путем к созданию эффективных продуцентов аминокислот. Отсюда вытекает необходимость клонирования и изучения коринебакгериальных генов, детерминирующих ключевые ферменты аминокислотных биосинтетических путей, а также дальнейшее развитие системы молекулярного клонирования для коринебактерий.

Цель работы.

Целью настоящей работы было клонирование двух генов ароматического биосинтеза из аналогорезистентного продуцента фенилалани-на Corynebacterium glutamicum, которые кодируют ключевые ферменты биосинтеза фенилаланина - З-дезокси-й-арабиногептулозонат-7--фзсфат-синтетазу (ДАШ-синтегаза, КФ 4.1.2.15) и префенатдегидра-

тазу (ПД, КФ 4.2Л.51), для их дальнейшего использования при конструировании продуцентов фенилаланина.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие экспериментальные задачи: получение рекомбинантных штаммов Cor.gluta-micum с повышенной экспрессией гена pheA, кодирующего ПД; определение нуклеотидной последовательности мутантного гена pheA; локализация и характеристика мутации в клонированном гене pheA; клонирование гена, кодирующего ДАГФ-синтетазу, используя метод ПЦР; изучение экспрессии клонированого гена в клетках E.coli и корине-Сактерий, а также возможности использования его для конструирования продуцентов ароматических аминокислот; получение челночного вектора для бактериальной,системы E.coli коринебактерии, совместимого с уже имеющимися; определение стабильности полученного вектора в клетках коринебактерий и рекомбинантных ДНК на его основе .

Научная новизна работы.

В работе сконструировано семейство векторов для клонирования ДНК в промышленно-важных коринебактериях, совместимое с имеющимися и обладающее рядом преимуществ по сравнению с полученными ранее. Клонирован мутантный ген pheA, определена его нуклеотидная последовательность-, локализована и охарактеризована мутация, приводящая к устойчивости префенатдегидратазы к ретроингибированию. Клонирован ген из аналогорезистентного мутанта Cor.glutamicum, кодирующий ДАГФ-синтетазу. Показано увеличение активности ДА№-синтетазы в клетках E.coli и Cor.glutamicum, содержащих плазмида с клонированным геном. Совокупность генетических и биохимических данных позволяет утверждать, что в клетках Cor.glutamicum существуют по крайней мере две изоферментные формы ДАГФ-синтетаз. Ген aroA, кодирующий одну из них, клонирован в настоящей работе.

Практическая ценность работы.

Осуществленное в данной работе клонирование ключевого гена биосинтеза фенилаланина C.glutamlcum на многокопийных векторах, результаты по изучению нуклеотидной последовательности и характеристике мутации гена pheA могут быть использованы при конструировании генно-инженерных продуцентов фенилаланина. Амплификация гена, кодирующего ДА№-синтетазу, может использоваться при получении продуцентов других ароматических аминокислот. Высказанное заключение о существовании двух изоферментных форм ДАга-синтетаз

y Cor.glutamlcum открывает новые возможности в конструировании продуцентов ароматических аминокислот. Полученные векторы могут быть использованы при клонировании других генов в этом промышлен-но-важном объекте.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения собственных исследований и выводов. Материал изложен на стр. машинописного текста, включает 16-рисунков и 10 таблиц. Список цитированной литературы содержит наименования. Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на IV Республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых, Ташкент 1989; Международном симпозиуме GIM-9Ó, Страсбург 1990; V конференции га " Новые направления биотехнологии", Пущино 1992; 2-й научной конференции ВНИИгенетики, Москва 1994.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Бактериальные шташш, плазыида и фагиида

В работе использованы штаммы Cor.glutamlcum: ATCCI3032 - дикий тип; IH - phe~; 2 - phe~ tyr~; 6-27 - tyr'roM1'; Brevlbacterlum sp. дикий тип; E.coli: B1420 - pheA F+mutT1; JM109 - recA1 lacZAMI5 endA1 gyrA96 thi1 hsdR17 (гк~тк+) supE44 relA1 IF-traD36 proAB+ lacIqZAM15l. Хэлперный бактериофаг MI3 - R408 '(Promega). В работе использованы плазмида: pUC19, pUC4K (Yanish- Perron et al., 1985), pHY41б (Britz et al., 1986), pBOl (Окороков и др., 1990), pTZ19RJl1 (Ferroentas), pBluescrlprll KS+, pBluescrlprll SK+ (Stratagene), pGEM-5Zi+ (Promega).

Среды. Как правило все бактериальные штаммы выращивали на жидком или агаризованном L-бульоне. В качестве минимальной для коринеба-ктерий использовали среды Канеко и Гловера, для E.coli.- среду Адамса.Ферментационная среда содержала мелассу, гидролизаг БВК и неорганические соли.

Выделение плазыидной ДНК из E.coli и Коринебактерий проводили щелочным, методом (Blmbolm, Doll, 1979).

Выделение одноцепочечной фагешадной ДНК проводилось по методу Viera, Messing (1987).

Выделение тотальной ДНК из Cor.glutamlcum осуществляли методом,

описанным для стрептомицетов (Chatler, Hoopwood,-1982) с некоторыми модификациями.

Манипуляции с ДНК. Обработку ДНК рестриктазами, лигирование, электрофорез, ДНК-ДНК-гибридизацию проводили стандартными методами, описанными в руководствах (Маниатис и др., 1984, Rlgby et al. 1977, Southern, 1975).

Трансформацию клеток E.coli плазцидной ДНК осуществляли, как описано Morrison (1977).

Трансформацию протопластов коринебактерий проводили методом Kats-umata et al.(1984) и Santamaría et al.,(1985) с некоторыми модификациями: инкубацию с 2,5 мг/мл лизоцима проводили в течение з часов, в качестве регенерационной среды использовали 1% L-arap с 0,5М сукцината натрия. ' 1

Секвенирование ДНК проводили по методу Sanger et al.(1977). Амплификацию фрагментов ДНК с использованием■полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили на аппарате "Perkln-Elmer 480" с использованием стандартного набора фирмы "Blolabs", как описано в руководстве фирмы "Promega".

Определение активности ДАГФ-синтетазы проводили'по методу Shilo et al.(1974), префенатдегидратазы и хоризматмутазы на основе метода Cotton, Glbson,(1965), аспартокиназы - по методу Black (1962).

Способность штаммов выделять аминокислоты оценивали в условиях глубинной ферментации. Ферментацию проводили в пробирках или колбах на качалке при 32°С в течение V2 часов.

Количественное определение фенилаланина проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинках Sllulol UV254 в системе растворителей изопропанол:аммиак 7:3.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУХДЕНИЕ.

Улучшение аналогорезистентных продуцентов фенилаланина Сог.-glutamlcum возможно путем увеличения активности ключевых ферментов биосинтеза общего ароматического пути (ЖГО-синтаза) и ферментов, расположенных в точках ветвления фениланинового биосинтетического пути (хоризматмутаза (ХМ) и префенатдегидратаза (ПД)) за счет амплификации соответсвующих генов (рис1.).

I. Клонирование гена pheA, кодирующего нечувствительную к инги-бированию фенилаланином префенатдегидратазу Cor. glutamicum.

В качестве донора хромосомной ДНК нами был взят ауксотрофный по тирозину аналогорезистентный мутант Сог^Шат1сш 6-27, полученный ранее в нашей лаборатории в результате многоступенчатой селекции'от штамма Сог^1аЬат1сит АТСС13032 дикого типа. Для получения банка генов использовали БаиЗА- фрагменты хромосомной ДНК размером 6-10 тпн, фракционированные в градиенте сахарозы. В качестве вектора использовали плазмиду рНУ416 (8,7 тпн), линеаризованную рестриктазой ВашН1.

ФОСФОЕНОЛПИРУВАТ + ЭРИТРОЗО-4-ФОСФАТ

| ДАГФ-синтетаза

ДАГФ ♦

+ -

ХОРИЗМАТ —>-----* ТРИПТОФАН

хоризматмутаза ^ . '

ПРЕФЕНАТ -АРОГЕНАТ —:-» ТИРОЗИН

I префект.1- арогенат-

префенатдегидратаза I ажиногарансфераза дегиЭрогеназа

ФЕНИЛПИРУВАТ

I тирозтсикинотрансфераза

ФЕНШШ1АНИН

Рис.1 Схема биосинтеза ароматических аминокислот у глутамат-продуцирующих коринебактерий.

Поиск рекомбинантных клонов, содержащих мутантные гены ароматического биосинтеза, обусловливающие устойчивость к аналогу фенилаланина ш-фторфенилаланину (гаФФ), среди полученных Кшг трансформантов проводили на минимальной среде Гловера, содержащей 100 мкг/мл тФФ. Был обнаружен один клон, устойчивый к этому аналогу. Из клеток полученного трансформанта была выделена гибридная плаз-мида, размером 17,5 тпн, названная рМ627, несущая вставку хромосомной ДНК величиной 8,8 тпн ( рис.2).

Плазмида р!М627 вводилась в протопласты штаммов Сог.в1и1ат1-сит АТСС -13032 дикого типа и его мутантов по ароматическому биосинтезу, указанных в таблице I. Введение плазмиды в ауксотрофный по фенилаланину мутант 1Н, с Олокированнной ПД, восстанавливало прототрофность. В то же время плазмида не комплементировала мута-

цш в генах, кодирующих ХМ (штамм 2) и арогенатдегидрогеназу (штамм гугб). Одновременно с передачей признака прототрофности по фенилаланину плазмида сообщала устойчивость к аналогу фенилалани-

Рис.2 Рестрикционная карта плазмиды гШ627 тонкая линия - ДНК плазмиды рНУ416 широкая линия - хромосомная ДНК Сог^1и1аш1сиш 6-27

на. Эти результаты указывают на присутствие в составе гибридной плазмиды мутантного гена р!юА, кодирующего десенсибилизированную к ингибированию фенилаланином форму НД. Исследование ферментативных активностей ДА№-синтетазы, ХМ и ПД в клетках с плазмидой ррЦ627 подтвердило этот вывод (табл.1).

Активность ПД в клетках всех штаммов, трансформированных плазмидой рЕиб27, в 3 - 6 раз выше чем в клетках штамма дикого типа (табл.1). Следует также отметить, что ПД в клетках с плазмидой нечувствительна к ингибированию фенилаланином до концентрации его в реакционной смеси 10шМ, как и ПД в клетках штамма Сог^1и-1аш1сит 6-27, донора хромосомной ДНК. Штаммы с немутантной чувствительной к ретроингибированию ДЦ после введения плазмиды рЫ627 приобретают способность накапливать фенилаланин в ферментационной среде (2-4 г/л).

Таблица I. Влияние плазмида рМ627 на некоторые свойства реципиентных штаммов Сог^1Ш;ат1сш1.

Штамм Сог^Шат1сш Потребность в аминокислотах Устойчивость к тФФ* Активность ферментов** Накопление фенилаланина, г/л

ПД ХМ ДА1Ф-синтаза

13032 нет нет" 1 1 1 0,0

13032/рШ627 нет есть 6 I I 3,1

1Н рЬе ■ - 0 н.о. I 0,0

1Н/рГиб27 • нет. есть 4 н.о. I 2,8

2 phe+tyг - 0,6 0 I 0,0

2/р1Ш27 р!ге+1;уг - 3 0 I 0,0

гугб 1;уг . нет I I I 1,2

1;уг6/р1иб27 гут есть 3 I I 3,1

6-27 1;уг есть н.о. н.о. н.о. . 6,0

6-27/р1иб27 гут есть н.о. н.о. Н..0. 6,0

*Устойчивость к шФФ определяли на агаре Гло-вера, содержащем пгёФ (100 мкг/мл) и необходимые аминокислоты ( 50 мкг/мл).

** За единицу активности принята активность ПД, ХМ или ДАга-синтаза штамма дикого типа Cor.glutami.cum АТСС13032.

В то же время, присутсвие плазмида рЫ627 в клетках продуцента фенилаланина 6-27, ауксотрофного по тирозину и уже обладающего десенсибилизированной ПД, не приводило к увеличению продукции фенилаланина. Это указывает на то, что ПД не является "узким местом" в биосинтезе фенилаланина у штамма 6-27, и означает, что для улучшения продукции необходимо усиление синтеза субстрата для ПД - префеновой кислоты.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о наличии гена р1геА в составе гибридной плазмида рМ627, кодирующего десенсибилизированную ПД из хромосомы штамма донора Сог^1и1ат1сиш 6-27, продуцирующего фенилаланин. Амплификация этого гена приводит к сверхпродукции фенилаланина у штамма дикого типа и полученного от него тирозинового ауксотрофа.

Ниже мутантный ген обозначен рЬеА*.

Выл получен делеционный вариант плазмида р1иб27, названный

ApRJ627, содержащий в своем составе BamHI-фрагмент хромосомной ДНК размером 5,0 тпн, несущий ген pheA*.

Гибридизация хромосомной ДНК Cor.glutanilcum 6-27, расщепленной рестриктазой BamHI с BamHI-фрагментом, содержащим ген pheA* в качестве зонда, выделенного из плазмиды ApfiJ627, позволила идентифицировать в составе хромосомы этого штамма фрагмент такого же размера, дающий положительный сигнал. Это подтверждает принадлежность клонированного гена pheA* геному Cor.glutamicum 6-27.

I.I. Клонирование гена pheA* на бирепликонном векторе pNS2

Для дальнейшего изучения в клетках Коринебактерий клонированного нами мутантного гена pheA* фрагмент ДНК, содержащий данный ген был минимизирован в составе сконструированного челночного вектора, (см. раздел 4) имеющего уникальные сайты узнавания для ряда рестриктаз.

Известно (Slnskey et al.,1986), что ген pheA расположен на NcoI-NcoI-фрагменте хромосомы Cor.glutamicum , размером 1,1 тпн. Мы также выделили аналогичный фрагмент из 'плазмиды дрЯЛ627 и путем 2-х ступенчатого переклонирования ввели его в состав вектора pNS2. Результирующая плазмида была названа рСРН1 (рис.3) и имела размер 9,3 тпн.

EcoRI Sacl/Snal

Hind

Hind SphI

■Ncol

Kpnl

Smal

BamHI

Xbal

Sail

PstI

Рис. 3 Гибридная плазмида pCPH1.

Трансформация плазмидой рСРН1 штамма Cor.glutamlcum АТСС13032 дикого типа приводила к его устойчивости к тФФ, а штамма Cor.glutamlcum 1Н, нуждающегося в фенилаланине - к его прототрофности и устойчивости к тФФ. Активность ПД в клетках,- содержащих эту плаз-миду была в 7-9 раз выше, чем в бесплазмидаых. Количества фенила-ланина, выделяемые в ферментационную среду штаммами, содержащими

плазмиды рСРН1 и pRJ627, были практически одинаковыми.

*

2. Локализация в гене pheA цутации, вызывающей десенсибилизацию ПД.

Клонирование и определение нуклеотидной последовательности гена pfieA, кодирующего ПД дикого типа из Cor.glutamlcumATCCI3032, было проведено группой Slnskey (1986).

В ходе работы с клонированным нами мутантным геном pheA* было замечено, что у штамма дикого типа Cor. glutamlcum, содержащего плазмиду со вставкой гена' pheA, после 3-х последовательных пересевов только 0,5 % клеток утрачивали признаки антибиотико- и ана-логорезистентности. Вектор без вставки в тех же условиях терялся с частотой около 15%. Эти данные можно объяснить гомологичной рекомбинацией, происходящей между геном pheA дикого типа, находящимся на хромосоме и мутантным геном, входящим в состав плазмиды. Обнаруженное явление давало возможность провести делеционное картирование клонированого гена pheA* и локализовать возможную мутацию, которая нарушает ингибирование ПД фенилаланином.

На рис.4 показан фрагмент хромосомы Cor.glutamlcum, содержащий ген pheA*, который был расщеплен соответсвующими рестриктаза-ми, и полученные рестрикты были клонированы в полилинкере челночной плазмиды pNS2 .Результирующие плазмиды были введены в протопласты штамма Cor.glutamlcum дикого типа. Полученные Ктг трансформанты рассевали-газоном на минимальном агаре, содержащем аналог фенилаланина тФФ (100 мкг/мл). Как оказалось, трансформанты с плазмидами pD53 и pD54 образовывали на чашках устойчивые к тМ> колонии с частотой, на 2-3 порядка превышающей частоту'спонтанных мутаций устойчивости к аналогу фенилаланина.

Очевидно, что фрагмент хромосомной ДНК, включающий в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую С-концевой участок ПД, несет мутацию, приводящую- при рекомбинации с хромосомой к устойчивости к пгёФ.

Pstl ,NcoI Sali

EcoRI Ncol BamHI

pheA

gg Плаз-мида

pD51 pD52 -J pD53 ■J pD54

Уст-ть к шФФ

Рис.4 Делеционное картирование мутации в гене рЪеА .

2.1. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, содержащего ген р1шА* Сог^1и1ага1сш 6-27.

Определение нуклеотидной последовательности клонированного гена рЬеА* проводилось по модифицированному методу Сенгера с использованием ДНК-полимеразы фага Т7.

Стратегия секвенирования гена рЛе4*приведбна на рис.5. 95£ первичной нуклеотидной последовательности исходного фрагмента ДНК хромосомы Сог^1и1ат1сиш 6-27 были определены по обеим цепям ДНК.

EcoRI,Ncol

-130

Sali Kpnl

200

400

EcoRI Ncol.BamHI

600 800

pheA

Рис.5. Стратегия секвенирования гена рЪеА Сог.£1Ш;ат1сит 6-27 в составе фрагмента ДНК плазмиды рЕ15. Заштрихованной линией показан ген рЛеЛ С.б1и1аш1сиш. Стрелками показаны направление и длина секвенированных фрагментов.

Анализ нуклеотидной последовательности мутантного гена ркеА* выявил единственную значимую замену в положении тимин 704 на ци-тозин относительно гена ркеА дикого типа. Это привело к изменению

О

Ser235 на Pro. Данная мутация находится в пределах фрагмента, локализованного нами с помощью делеционного анализа.

Компьютерный анализ известных аминокислотных последовательностей префенатдегидратаз показывает, что Ser235 расположен в высоко консервативной области ( рис.6). Это'может говорить о принадлежности данной аминокислоты какому-либо функциональному центру фермента.

В.subUlis 224 SWRNLNLSKIESRPTKTGLG Ps.stutzerl 303 HSNGIDLTRIETRPSRSGKW E.coll 319RNHNLIMTRLESRPIHGNPW

Cor.glutamlcum _223 GIRGYDLTRIESRPTRKVFG

-к-

P

Рис.6 Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей ПД Cor.glutamlcum в области аминокислотных остатков 223-243 с последовательностями ПД E.coll, Ps.stutzerl, B.subtllls. Выделена гомологичная область и указана выявленная в ходе работы замена.

3. Клонирование гена агоА, кодирующего ДАГФ-синтетазу из анало-горезистентного мутанта Cor.glutamlcum 6-27/

На основании анализа литературных данных мы высказали предположение о существовании двух форм коринебактриальных ДА1Ф-синтетаз и соответсвенно двух кодирующих их генов.

Учитывая тот факт, что одна из форм ДАГФ-синтетазы не экспре-ссируется в E.coll, а нуклеотиднар последовательность гена, предположительно кодирующего вторую, была опубликована во время проведения наших экспериментов, были использованы два метода клонирования:

-прямое клонирование в клетках коринебактерий вызывающих резистентность к тФФ генетических детерминантов;

-амплификация методом ПЦР фрагментов хромосомы шФФ-резистент-ного мутанта, используя синтетические олигонуклеотиды, фланкирующие структурную часть гена ДАШ-синтетазы, клонированного Chen et al.(1993).

В качестве донора хромосомной ДНК использовали тот же тФФ резистентный мутант Cor.glutamlcum 6-27, который использовался при клонировании гена pheA, крдируюцего ПД, так как ДАГФ-синте-таза этого штамма била десенсибилизирована к ретроингибировашто.

Как оказалось, при использовании метода прямого клонирования ни в одном из тФФ-резистентных трансформантов, содержащих гибридные плазмиды, генов, кодирующих ДАГО>-синтетазу, обнаружено не было.

При клонировании с помощью ПНР на основании данных о нуклео-тидной последовательности гена аго (Chen et al.,1993), кодирующего фермент, обладающий ДАГО-синтетазной активностью, были синтезированы два олигонуклеотида, фланкирующие структурную часть гена: DS-5 и DS-3, которые были использованы в качестве праймеров в ПЦР. Лмплифицированные фрагменты ДНК, размером 1,53 тпн, были клонированы в EcoRV- сайт вектора pGEM-5ZI(+)• Плазмиды рАР629 и рЛ1'6210, несущие амплифицированше фрагменты из Cor.glutamlcum 6-27, имели размер 4,53 тпн и различались ориентацией фрагмента хромосомы по отношению к векторной части.

Рестрикционный анализ показал идентичность клонированных фрагментов между собой и с геном, клонированным Chen et al. (1993). Гибридизация хромосомной ДНК Cor.glutamlcum 6-27, расщепленной рестриктазой BamHI и фракционированной по длине в агароз-ном геле, с радиоактивно меченными амплифицированными фрагментами ДНК ( DS-5 - DS-3 ) из этого же штамма, показала, что клонированный фрагмент располагается в пределах ВатН1-ВатН1-фрагмента хромосомы размером около 9 тпн. Следует отметить, что ген pheA, кодирующий ПД штамма 6-27, расположен на другом BamHI-фрагменте хромосомы, который имеет размер 5 тпн (раздел I). Анализ нуклео-тидной последовательности N- и С-Концов клонированного, фрагмента не показал ни одной замены в последовательности структурной части гена и регуляторной области. Следует отметить, что не определена нуклеотидная последовательность центральной части этого гена протяженностью 0,7 тпн.

3.1. Субклонировакие гена агоА в клетках Cor.glutamicum.

Синтетические олигонуклеотида, использованные для клонирования, включали в себя сайты узнавания для рестриктазы BamHI. Поэтому для субклонирования на полученном нами бирепликонном векторе pNS2 плазмиды серии pAF гидролизовали данной рестриктазой. Фрагменты размером 1,5 тпн использовали для клонирования в BamHI-сайты вектора pNS2 (раздел 4)'. Были получены две плазмиды pCAro9 и рСАго27, различающиеся ориентацией клонированного фрагмента

относительно векторной части.

Для. дальнейшей работа использовали плазмиду рСЛго9 (рис.7), поскольку плазмида рСАго27 проявляла структурную нестабильность в клетках коринебактерий.

3.2. Свойства трансформантов Cor.glutamicm и E.coli, содержащих плазмида с генои агоЛ.

Плазмида рСЛго9 била введена трансформацией в клетки штамма E.coli JM109 и штаммов Cor.glutamlcm ЛТСС13032 дикого типа и аналогорезистентного продуцента фенилаланина 6-27. В клетках полученных трансформантов определяли активность не только ДАГФ-синтетази, но и активность-второго регулируемого фермента ХМ. Как показали измерения (Таблица 2), в клетках как двух штаммов коринебактерий, так и кишечной палочки, содержащих плазмиду рСАго9, активность ДАР£-синтетазы была в два раза выше, чем в клетках, содержащих вектор (pNS2). При этом активность ХМ оставалась неизменной .

SphI

Рис. 7. Гибридная плазмида рСЛго9

ТаОлицз 2. Влияние рекомбилатной плазмиды рСАгоЭ на активность ДАГО-синтетазы и хоризматмутазы (ХМ) в клетках E.coll и Cor. glu-tarnicum.

Штамм/плазмида ДАГФ-синтетаза, 'хм

удел.акт. удел.акт.*

Е .coll

JM109/pNS2 (вектор) 10,3 24,2

JM109/pCAro9 17,1 29,2

Cor.glutamlcum

АТСС 13032/pNS2(вектор) 1,7 6,7

АТСС 13032/pCAro9 . 3,4 6,9

6-27/pNS2 (вектор) 1,0 н.о

6-27/рСАгоЭ 2,0 н.о.

удельная активность в клетках E.coll выражена в нмолях продуктов реакции, образующихся в мин на мг белка ферментного препарата; в Cor.glutamlcum - в нмолях продуктов реакций в мин на единицу мутности (А.540) суспензии клеток в реакционной смеси.

Как оказалось (таблица 3), введение плазмиды рСАго9 в клетки штамма дикого типа Cor.glutamlcum АТСС 13032 не приводит к появлению устойчивости ДА1Ф-синтетазы к ее ингибиторам (фенилаланин й смесь фенилалашша и тирозина). Тот факт, что из штамма, у которого ДАГФ-синтетаза устойчива к ретроингибированию, нами был клонирован ген, кодирующий чувствительную форму этого фермента, свидетельствует о существовании в донорном штамме 6-27 не менее двух генов, кодирующих ДЛГО-синтетазы.

Таблица 3. Ингибирование активности ДЛГФ-синтетазы в плазмидных штаммах Cor.glutamlcum АТСС 13032.

Аминокислота (I мМ) Относительная активность, %

pNS2 рСАгоЭ

контроль IDO 100

phe 57 67

tyr 100 100

pho+tyr 27 25

Полученные данные указывают на то, что клонированный наш ген,обозначенный в настоящей работе агоА, кодирует белок, который не обладает свойствами изученного Shllo et al. (1981) компонента а бифункционального фермента ДАГФ-сингетаза-ХМ, так он, во-первых, не проявляет активность ХМ ln víyo, во-вторых, молекулярная масса его субъединицы, рассчитанная на основании последовательности нуклеотидов этого гена (39 тыс) значительно ниже, определенной Shllo et al.(55 тыс). Кроме того, судя по увеличению ДАГФ-синтетазной активности при амплификации гена агоА в клетках Е.coll, он экспрессируется в клетках этого микроорганизма, чего не наблюдали Ito et al.(1990) и Ikeda et al.(1992), которые по всей видимости клонировали ген, кодирующий субъединицу а ДАГО-синтетазы. .

Таким образом, как полученные нами данные, так и имеющиеся в литературе, даюг основания утверждать, что в клетках коринебакте-рий имеется по меньшей мере две формы ДА1Ф-синтетаз. Первая, главная, обладающая по нашим расчетам не менее 90% от суммарной активности ДАШ-синтетаз, является бифункциойальным ферментом, построенным из двух субъединиц. Гены-, кодирующие одну из них (субъединицу а по Shllo), клонированы в работах Ito et al.(1990) и Ikeda et al.(1992). Вторая, минорная форма ДАГО-синтетазы, представляющая не более 10% суммарной ДАГФ-синтетазной активности, не проявляет ХМ активности. Как показано в настоящей работе, обе формы фермента обладают чувствительностью к ингибированию смесью тирозина и фенилаланина и полностью нечувствительны к ингибированию одним тирозином.

При введении плазмида рСАго9 в клетки штамма дикого типа Cor.glutamlcum АТСС13032 активность ДАГО-синтетазы увеличивалась в 2 раза (см.таблицу 2), но это не приводило к продукции фенилаланина (таблица .4). Очевидно, это связано с высокой чувствительностью фермента, кодируемого геном агоА, к мультивалентному ингибированию фенилаланином и тирозином (таблица 3). С другой стороны, наличие этой плазмиды в клетках тирозинового ауксот'рофа 6-27, продуцирующего фенилаланин и голодающего по тирозину, приводило к повышению продукции этой аминокислоты на 30-80% ( таблица 4).

Таблица 4 Влияние плазмиды с геном агоА на продукцию фенипаланина штамми С.е1игат1сшп ЛТСС13032 и 6-27.

Штамм/ плазмида Продукция фенилаланина

пробирки колбы

г/л % г/л %

13032/р№2 0 0 н.о н.о

13032/рСАго9 0 0 н.о н.о

6-27/рИ32 5,92 100 6,55 100

6-27/рСАГ09 8,22 . 139 9,90 155

Очевидно, использование клонированного гена агоА для улучшения продуцентов фенилаланина было бы более эффективным после десенсибилизации ДАГФ-синтетазы. Кроме того, амплификация клонированного гена агоА может также оказаться полезной при получении продуцентов триптофана на основе коринебактерийи с двойной потребностью в тирозине и фенилаланине, у которых деффектна ХМ ((3-субъединица бифункционального комплекса ДАГО-синтетаза-ХМ) и, следовательно, снижена активность ДАГО-синтетазы.

Ген агоА, инактивированный на плазмиде, можно использовать при получении мутантов коринебактерий по ДАГФ-синтетазе, которые никогда ранее получены не были. Для этого инактивированный ген вводится в хромосому путем гомологичной рекомбинации и замещает дикий ген агоА. После химического мутагенеза клеток можно будет отобрать мутанты, у которых блокирована главная форма ДАГФ-синтетазы. Получение таких мутантов значительно упростит клонирование гена, кодирующего главную форму ДАШ-синтетазы.

4. Конструирование бирепликонного вектора для систеиы Е. со11-СогупеЬас1;ег1ш.

Для генноинженерной работы, описанной в-предыдущих разделах, нам был необходим плазмидный бирепликонный вектор, способный реплицироваться как в кишечной палочке, так и в коринебактериях, содержащий в своем составе полилинкерный участок с уникальными сайтами рестрикции.

Рис.8. Схема конструирования векторов рНБ2 и р№71

НПпсШ!

Ктг га транслсвона ТпЭОЗ, 1,3 ни

НМШ

БрЪ!

БрЫ

В качестве составной части, обеспечивающей репликацию плазмида в E.coll, использовали вектор pUC19, а в качестве селективного маркера был выбран ген резистентности к канамицину ( neo ) из транспозона Тп903. В качестве коринебактериального репликона была взята криптическая плазмида рВ01 семейства рВЫ, совместимая с плазмидами двух других известных семейств (pSR1 и pCCI).

Плазмиду pUC19 линеаризовали рестриктазой PstI и лигировали с Pstl-PstI- фрагментом плазмида pUC4K размером 1,3 тпн, несущим ген тгео (рис.8). Полученную плазмиду рКЕ1 (4,0 тпн), линеаризованную SphI, лигировали с Коринебактериальной плазмидой рВ01, линеаризованной той же рестриктазой. Выли получены две плазмида, различающиеся ориентацией репликонов друг относительно друга, одна из которых отличалась структурной нестабильностью в клетках E.coll.Структурно стабильная плазмида рШ2размером 8,2 тпн придавала клеткам E.coll устойчивость к ампициллину и канамицину, а клеткам коринебактерий - только к канамицину.

Полученной бирепликонной плазмидой pNS2 трансформировали штаммы различных коринебактерий. Частоту потери полученной плазмида определяли после трех последовательных пересевов клеток при культивировании в L-бульоне без добавления антибиотика. Клетки, утратившие устойчивость к антибиотикам, составляли 15-20% популяции в случае Cor.glutamlcum и около 40% в случае E.coll. Плазмида pNS2 присутствовала в клетках Cor.glutamlcum и E.coll в 8-10 копиях.

i

Таблица 5 . Характеристика векторных плазмид, полученных в данной работе.

Вектор Бактериальная Сайты для Размер Маркер

система клонирования тпн для C.glu-

tamlcum

pNS2 E.coll/ EcoRI.SacI, 8,2 Km .

Cor.glutamlcum BamHI.KprxI,

Salí

pNV1 Cor.glutamlcum PvuII,EcoRI, 5,7 Km

SacI.BamHI,

Kpnl.SalI

Кроме того, был получен делеционный вариант плазмиды pNS2 путем удаления PvuII-фрагмента размером 2,5 тпн, включащего гены, ответственные за репликацию в E.coli и устойчивость к ампициллину. Результирующая плазмида pNV1 размером 5,7 тпн была способна реплицироваться только в клетках коринебактерий, придавая им устойчивость к канамицину.

Данные о сконструированных нами плазмидах приведены в-табл.5

4.1 Векторные свойства плазииды pNS2.

В качестве модели для проверки векторных свойств pNS2 нами был взят ген lysC, кодирующий фермент аспартокиназу (АК) из штамма Cor.glutamlcum ATCC13Q32 дикого типа и его мутантный аналог, клонированные М.Ю.Передельчуком, на фазмидном векторе xpSL5 (Переде льчук и др.1992). Полученные плазмиды на основе вектора pNS2 с диким (pWTE3) и мутантным • (pMUE1) генами lysC были введены в клетки Cor.glutamlcum, в которых активность АК повысилась в 6 - 12 раз по сравнению с бесплазмидными штаммами'(таблица 6).

Таблица 6. Удельная активность аспартокиназы.

Штамм, плазмида Удельная активность нмоль/ мин'мг белка Активность, в присутствии лизина 10мМ+треонина 10мМ

нмоль/ мин'мг бежа 1 %

C.glutamicum

13032 21,4 4,1 19

13032/pNS2 15,3 2,4 16

13032/pWTE3 140,4 16,8 12

13032/pMUE1 . 319,0 389,2 122

Полученные результаты показали, что сконструированный нами новый бирепликонный вектор не только способен реплицироваться в клетках коринебактерий, но и поддерживать эффективную экспрессию клонированного на нем гена.

ВЫВОДЫ

1. Клонирован мутантный ген pheA*, кодирующий нечувститель-ную к ретроигибированию префенатдегидратазу из аналогорезистент-ного мутанта C.glutamicum. Показано, что введение в клетки кори-небактерий гибридных плазмид с геном pheA*, приводит к повышению уровня не ингибируемой фенилаланином префенатдегидратазной активности в 6-9 раз.

2. Определена нуклеотидная последовательность мутантного гена pheA* и локализована мутация, приводящая к замене Ser235 на Pro, которая обусловливает устойчивость префенатдегидратазы к ретроингибированию и устойчивость клеток к аналогу фенилаланина ш-фторфенилаланину.

3. Показано, что клонирование С-концевого фрагмента гена pheA*, содержащего найденную мутацию, приводит к устойчивости клеток к m-фторфенилаланину путем включения мутации в соответствующий хромосомный ген за счет гомологичной рекомбинации.

4. Из аналогорезистентного штамма,.продуцирующего фенилала-нин, с десенсибилизированной к ретроингибированию ДАШ-синтетазой с помощью метода ПЦР клонирован ген, обозначенный нами агоА, кодирующий ДАГО-синтетазу.

5. Показано, что ген агоА экспрессируется в E.coll и Cor. glutamicum, а кодируемый им фермент чувствителен к ретроингибированию и не обладает хоризматмутазной активностью, что указывает на наличие в клетках Cor.glutamicum не менее двух форм изоферме-нтных ДАГФ-синтетаз.

6. Амплификация гена агоА в клетках продуцирующих фенилала-нин ауксотрофных по тирозину мутантах Cor.glutamicum приводило к повышению активности ДАГФ-синтетазы в 2 раза и увеличению продукции фенилаланина. на 30 - 80%.

7. Сконструирован челночный вектор pNS2 для бактериальной системы E.coll - коринебактерии, а также вектор pNV1 для клонирования генов коринебактерий в гомологичной системе. Показано, что вектор pNS2, способен обеспечивать эффективную экспрессию клонированных на нем генов.

Список работ, опубликованных по теые диссертации.

1. Ростова Ю.Г., Ворошилова Э.Б., Якубович Н.В., Гусятинер М.М. Клонирование гена pheA, кодирущего нечувствительную к ингибированию фенилаланином префенатдегидратазу Corynebacte-rium glutamicum. Биотехнология, 1990, N1, с. 9-1I.

2. Передельчук М.Ю., Буканов Н.О., Смирнов Ю.В., Ростова

Ю.Г., Федорова Н.Д., Окороков А.Л., Гусятинер М.М., Янковский Н.К. Клонирование генов asd и lysC Corynebacterlum glutamicum. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1992, N5-6, С.25-27.

3. Ростова Ю.Г., Передельчук М.Ю., Окороков А.Л., Гусятинер М.М., Дебабов В.Г. Конструирование челночного вектора для коринебактерий и E.coll. Клонирование и изучение экспрессии гена lysC. Биотехнология, 1993, N4, с. 14-17.

4. Ростова Ю.Г., Ворошилова Э.Б.Якубович.Н.В., Гусятинер М.М. Клонирование гена, кодирующего мутантную префенатдегидратазу аналогорезистентного мутанта Cor. glutamicum ATCC13Q32. Тезисы докл. IV научно-теоретическая конференция

" Биология культивирования и биотехнология микроорганизмов", Ташкент (1989).

5. Voroshilova Е.В., Rostova Y.G., Gusjatlner М.М., Zhdanova N.I. Overproduction of phenllalanlne by tyrosine-auxotrophic analog resistant mutants ol Corynebacterlum glutamicum. 6-th International symposium on the genetic of Industrial microorganisms. Strasbourg (1990).

6. Ростова Ю.Г. Клонирование гена aroA(aroG) из Bacillus subtills в клетках глутаматпродуцирующих коринебактерий. Тезисы докл. V конф. Российской Федерации "Новые направления биотехнологии", Пущино (1992).