Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ регуляции генов метаболизма и транспорта метионина и лейцина методами сравнительной геномики

ВАК РФ 03.00.28, Биоинформатика

Автореферат диссертации по теме "Анализ регуляции генов метаболизма и транспорта метионина и лейцина методами сравнительной геномики"

На права^рукшиси

Ковалева Галина Юрьевна

АНАЛИЗ РЕГУЛЯЦИИ ГЕНОВ МЕТАБОЛИЗМА И ТРАНСПОРТА МЕТИОНИНА И ЛЕЙЦИНА МЕТОДАМИ СРАВНИТЕЛЬНОЙ ГЕНОМИКИ

03.00.28 - биоинформатика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1"'' ~ т

Москва-2008

003448922

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени М В Ломоносова и в Учебно-научном центре „Биоинформатика" Учреждения Российской академии наук Института проблем передачи информации им. A.A. Харкевича РАН.

Научный руководитель кандидат физико-математических наук,

доктор биологических наук, профессор Гельфанд Михаил Сергеевич

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Поройков Владимир Васильевич

Государственное Учреждение Научно-Исследовательский институт биомедицинской химии имени В Н. Ореховича РАМН;

кандидат физико-математических наук Демин Олег Владимирович

Институт физико-химической биологии им. А Н. Белозерского МГУ

Ведущая организация Учреждение Российской академии наук

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита диссертации состоится^О Q'^SjL^jb^ 2008 года в часов на заседании диссертационного совета Д 002.077.02 при Учреждении Российской академии наук Институте проблем передачи информации им. A.A. Харкевича РАН по адресу: 127994, г. Москва, ГСП-4, Большой Каретный переулок, д. 19, стр 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института проблем передачи информации им А.А Харкевича РАН

Автореферат разослан С£МТлЛ~/иЯ— 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Рожкова Г И

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Аминокислоты являются структурным компонентом всех белков, и, таким образом, представляют собой важнейшие компоненты каждой живой клетки. Способностью к биосинтезу всех аминокислот, входящих в полипептидные цепи, обладают только некоторые микроорганизмы и растения, тогда как человек и животные вынуждены часть необходимых аминокислот получать с пищей, — это так называемые незаменимые аминокислоты, в которым относятся изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан и валин. Для производства пищевых и кормовых добавок, содержащих незаменимые аминокислоты, необходимо создание систем биосинтеза этих аминокислот в промышленных масштабах, что, в свою очередь, требует детального и тщательного исследования устройства и регуляции метаболических путей, обеспечивающих биосинтез незаменимых аминокислот в различных микроорганизмах-продуцентах этих аминокислот.

Анализ транскрипционной регуляции экспрессии генов является важным разделом компьютерной генетики и системной биологии. Это связано с тем, что в настоящее время сравнительно легко производится определение последовательностей геномов, и темпы секвенирования значительно опережают темпы получения данных из биологических экспериментов. В настоящий момент уже более 700 геномных последовательностей определены полностью, и более 2000 геномов —частично С ростом количества секвенированных геномных последовательностей появлялись все новые способы компьютерного анализа геномов, которые произвели переворот в области функциональной аннотации генов. Если ранее предсказание потенциальной функции белка производилось переносом экспериментально установленной функции белка и основывалось исключительно на сходстве аминокислотных последовательностей, то в настоящее время в сравнительной геномике большое значение имеют анализ сцепления генов на хромосоме, случаев слияния генов, профилей встречаемости генов в полных геномах, а также анализ общих регуляторных сигналов. Одновременное использование всех этих методик позволяет обнаружить функциональную связь между белками, участвующими в одном метаболическом пути. Метаболическая реконструкция позволяет как обнаружить новые аспекты исследуемого пути в хорошо изученных организмах, так и описать метаболический потенциал ранее не охарактеризованных организмов.

В данной работе новейшие методы сравнительной геномики были использованы для анализа регуляции транскрипции генов метаболизма и транспорта двух незаменимых аминокислот, метионина и лейцина, а также цистеина, в различных микроорганизмах.

Цель исследования

Целью исследования являлось изучение генов биосинтеза и транспорта лейцина, метионина и цистеина в геномах дрожжей и бактерий методами сравнительной геномики.

Задачи исследования

1. Оценить уровень консервативности сайтов связывания регуляторов транскрипции, контролирующих биосинтез метионина и лейцина, в геномах дрожжей и сравнить его с уровнем консервативности прилегающих некодирующих областей.

2. Выявить ген, отвечающий за транспорт промежуточного продукта пути биосинтеза лейцина, альфа-изопропилмалата, из матрикса митохондрий в цитозоль у дрожжей.

3. Описать структуру всех генетических локусов, содержащих гены метаболизма и транспорта метионина в геномах коринебактерий.

4. Выявить в геномах коринебактерий новые гены, участвующие в метаболизме и транспорте метионина.

5. Описать структуру всех генетических локусов, содержащих гены биосинтеза метионина и цистеина в геномах стрептококков.

6. Идентифицировать потенциальные регуляторные сайты связывания транскрипционных регуляторов, контролирующих путь биосинтеза метионина и цистеина.

7. С использованием методов сравнительной геномики выявить в геномах стрептококков новые гены, участвующие в биосинтезе и транспорте метионина и цистеина.

Научная новизна и практическое значение

В представленной работе впервые получены следующие результаты:

1 Впервые был проведен детальный анализ уровней консервативности некодирующих областей геномов дрожжей и уровней консервативности сайтов связывания транскрипционных регуляторов и прилегающих к ним областей

2 Проведен систематический анализ экспрессионных данных и данных сравнительной геномики, которые вместе позволили предсказать транспортер альфа-изопропилмалата, промежуточного продукта биосинтеза лейцина

3. В геномах коринебактерий описан регулон МсЬЯ, включающий в себя гены метаболизма и транспорта метионина, предсказано несколько новых потенциальных членов данного регулона.

4. В геномах стрептококков проведено описание структурных генов, ответственных за биосинтез аминокислот метионина и цистеина

5. Проведен систематический анализ регуляторных областей структурных генов пути биосинтеза метионина и цистеина в стрептококках, позволивший предсказать потенциальные сайты связывания двух транскрипционных регуляторов, и установить соответствие выявленных сигналов каждому из регуляторов.

Апробация работы

Материалы исследований по теме диссертации были представлены па международных конференциях: XI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2004" (Москва), BGRS'2004 (Bioinformatics of Genome Regulation and Structure, Новосибирск), BITS'2005 (Bioinformatics Italian Society, Милан, Италия), XII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2005" (Москва), МССМВ'2005 (2nd Moscow Conference on Computational Molecular Biology, Москва), ECCB'2005 (4th European Conference on Computational Biology, Мадрид, Испания), BGRS'2006 (Bioinformatics of Genome Regulation and Structure, Новосибирск), ECCB'2006 (5th European Conference on Computational Biology, Эйлат, Израиль), ISMB/ECCB'07 (15Ul International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology and 6th European Conference on Computational Biology, Вена, Австрия), MCCMB'2007 (3rd Moscow Conference on Computational Molecular Biology, Москва), а также на конференции молодых ученых ИППИ РАН ИТиС'2007 (Информационные Технологии и Системы, Звенигород), межлабораторном семинаре ИППИ РАН, на научных семинарах в Учебно-научном центре «Биоинформатика» ИППИ РАН.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения и трех разделов. Первый раздел включает обзор литературы по теме диссертации. Второй раздел содержит описание использованных в работе программ и алгоритмов Третий раздел содержит описание проведенных в работе исследований и состоит из трех частей, каждая из которых включает изложение полученных в работе результатов и их обсуждение.

• Первая часть посвящена сравнительному анализу некодирующих последовательностей геномов дрожжей и анализу консервативности регуляторных сайтов связывания факторов транскрипции, обеспечивающих контроль уровня экспрессии генов метаболизма метионина и лейцина.

• Вторая часть посвящена применению методов сравнительной геномики при анализе регуляции генов метаболизма и транспорта метионина в геномах коринебактерий

• Третья часть посвящена исследованию регуляции генов метаболизма и транспорта метионина и цистеина в геномах стрептококков

Список цитируемой литературы, приведенный в конце диссертации, содержит 156 наименований. Работа содержит 41 рисунок и 5 таблиц.

Содержание работы

Первый раздел. Обзор литературы.

Содержит обзор литературных данных по рассмотренным в диссертации проблемам. В данной главе вводятся основные понятия и определения, использующиеся в сравнительной геномике, а также приводятся описания

метаболических путей, исследовавшихся в диссертационной работе, и известных данных о регуляции этих метаболических путей

Второй раздел. Материалы и методы.

Данный раздел содержит описание основных методов, алгоритмов и программ, использованных в работе.

В начале раздела описывается процедура определения принадлежности гена регулону методом проверки соответствия, согласно которому ген считается членом регулона, если в его регуляторной области обнаружен потенциальный сайт, который сохраняется перед ортологичными генами в родственных геномах. Поиск потенциальных сайтов связывания транскрипционных регуляторов проводился с использованием метода построения матриц позиционных весов

Третий раздел. Результаты и обсуждение.

Исследование консервативности сайтов связывания факторов транскрипции, контролирующих биосинтез метионина и лейцина в дрожжах.

В данном разделе описано применение методов сравнительной геномики при работе с геномами дрожжей. Основным подходом, использованным в данной части работы, был метод филогенетического футпринтинга, согласно которому функционально значимые области генома эволюционируют медленнее остальных и, соответственно, более консервативны.

На первом этапе работы с использованием программы MLAGAN были построены множественные полногеномные выравнивания 5 геномов рода Saccharomyces: S.cerevisiae, Sparadoxus, S mikatae, Sbayanus и S.kudriavzevii. Анализ 5'-нетранслируемых областей генов в данных выравниваниях выявил непосредственно перед стартовым кодоном область относительно высокой консервативности, которая уже была описана ранее1, и, вероятнее всего, объясняется накоплением в этом районе сайтов связывания факторов инициации трансляции. Кроме того, на большем удалении от точки старта трансляции (в 5'-направлении) была обнаружена область более высокой консервативности, начинающаяся на расстоянии 70 п н., достигающая максимальных значений на расстоянии около 120 п н. и возвращающаяся к фоновому уровню на расстоянии 220 п.н относительно точки старта трансляции. Наблюдаемая область повышенной консервативности (-220 -70 п н.), вероятнее всего, связана с расположением промоторов в этом районе.

Результаты, полученные при анализе З'-некодирующих областей полученных множественных выравниваний, частично противоречат более ранним наблюдениям1. Показанное ранее падение уровня консервативности, как выяснилось, сопровождается последующим заметным подъемом консервативности в районе 25-155 п.н. после стоп-кодона. Предположительно, обнаруженная область повышенной консервативности связана с обеспечением стабильности молекулы мРНК и расположением сайтов внутриклеточной локализации, сконцентрированных на расстоянии 50-100 п н после стоп-кодона.

1 ShabalinaSA, OgurtsovA Y, Rogozm IB, Koonin E V. Lipman D J Comparative analysis of orthologous eukaryotic mRNAs potential hidden functional signals // Nucleic Acids Res —2004 — vol 32, no 5 —Pp 17741782

На следующем этапе работы проводился анализ уровней консервативности сайтов связывания факторов транскрипции в геномах дрожжей. Анализ проводился на множественных полногеномных выравниваниях пяти геномов дрожжей, сконструированных при помощи программы \1LAGAN. В работу были включены сайты связывания факторов транскрипции, представленные в базе данных БСРБ, длиной не менее 5 п.н.

Как и ожидалось, уровень консервативности сайтов связывания был заметно выше уровня консервативности прилегающих нефункциональных участков нетранслируемых областей. Кроме того, уровень консервативности был максимален для центральных позиций сайтов связывания факторов транскрипции и постепенно снижался по мере удаления от центра сайта. Однако, уровень консервативности остается повышенным в сравнении с фоновым не только в пределах области, описанной как функциональный сайт, но и далеко за пределами сайта связывания. В целом, область повышенной консервативности, включающая в себя сайт связывания фактора транскрипции, занимает область протяженностью около 100 п.н.

Для геномов эукариот характерны очень короткие сайты связывания факторов транскрипции, и одним из механизмов обеспечения специфичной регуляции экспрессии генов является кластеризация сайтов, которая обеспечивает кооперативное связывание белков-регуляторов с цепью ДНК. Согласно наиболее вероятной гипотезе, повышенная консервативность областей, прилегающих к сайту связывания, может быть связана с наличием рядом с исследуемым сайтом других регуляторных последовательностей —сайтов связывания факторов транскрипции или промоторов.

Обнаруженная повышенная консервативность областей, прилегающих к сайтам связывания факторов транскрипции, может объяснять наличие расхождений в наборах сигналов, предсказанных разными алгоритмами на множественных выравниваниях геномов дрожжей. Для проверки данной гипотезы на следующем этапе работы был проведен детальный анализ уровней консервативности сайтов связывания транскрипционных активаторов путей биосинтеза двух аминокислот — метионина и лейцина.

Исследование проводилось на множественных выравниваниях ортологичных регуляторных последовательностей структурных генов пути биосинтеза метионина и лейцина. Сайт связывания считался консервативным, если он выравнивался с потенциальными сайтами связывания перед ортологичными генами. Высокая степень родства последовательностей позволила применить упрощенную количественную оценку при оценке уровней консервативности сигналов. При абсолютной консервативности сайта уровень его консервативности принимался равным единице. Если же потенциальный сайт не абсолютно консервативен, но тем не менее выравнивается с сайтом в геноме 5. сегеушае, консервативность данного сайта принималась равной 0,5. Для неконсервативных сайтов консервативность считалась равной нулю

Для каждого из исследуемых геномов оценочные уровни консервативности были просуммированы отдельно для каждого регулятора Пути биосинтеза

метионина и лейцина в дрожжах находятся под контролем следующих регуляторов/регуляторных комплексов: Осп4р — глобальный регулятор биосинтеза аминокислот в дрожжах, в контроле биосинтеза метионина также принимают участие регуляторные комплексы Ме131/МеС2 и СЪА/Ме14/Ме128, а в контроле биосинтеза лейцина — ЬеиЗр2. Для каждого из регуляторов была сконструирована матрица позиционных весов с использованием экспериментально известных последовательностей сайтов связывания данного регулятора. Все предсказанные сайты разделялись на три группы: «известные» (экспериментально определенные сайты), «сильные потенциальные» (сайты, вес которых превышает вес большинства экспериментально определенных сайтов) и «слабые потенциальные» (сайты с весом выше порогового, но ниже, чем в предыдущей группе).

Уровни консервативности всех факторов транскрипции в исследуемых геномах показаны на рис. 1.

ill

(в) (г)

Рис. 1. Усредненные уровни консервативности сайтов связывания четырех регуляторов. Уровни консервативности показаны независимо для каждой группы сайтов для каждого регулятора. А. Сайты связывания Ссп4р. Б. Сайты связывания СЬП-комплекса. В. Сайты связывания регулятора(ов) Ме131/Ме132. Г. Сайты связывания ЬеиЗр.

1 Thomas D., Surdin-Kerjan Y. Metabolism of sulfur amino acids in Saccharomyces cerevisiae // Microbiol. Mol. Biol. Rev., — 1997 — vol. 61, no. 4. — Pp.503-532.

Видно, что в большинстве случаев уровни консервативности для групп «известных» и «сильных потенциальных» сайтов сходны для каждого регулятора Однако следует заметить, что даже сайты с максимальным весом не всегда консервативны во всех исследуемых геномах.

Таким образом, сайты связывания эукариотических факторов транскрипции не строго консервативны и при работе с геномами дрожжей стандартные методы филогенетического футпринтинга требуют введения дополнительных поправок. Несмотря на то, что уровни консервативности известных и сильных предсказанных сайтов сходны, даже сайты с наибольшим весом (включая и экспериментально показанные) могут быть неконсервативными даже в ближайших геномах.

В метаболическом пути биосинтеза лейцина в дрожжах были известны все структурные гены пути, за исключением переносчика альфа-изопропилмалата из матрикса митохондрий в цитозоль3 В данной работе использование метода матриц позиционных весов позволило определить продукт гена У(Ж271с как потенциальный переносчик альфа-изопропилмалата, промежуточного продукта биосинтеза лейцина Предсказание функции белка основывалось на следующих наблюдениях.

• для соответствующего белка ранее была показана митохондриальная локализация4;

• белок УОЯ271ср содержит несколько предсказанных трансмембранных сегментов и, следовательно, скорее всего является транспортером;

• потенциальный сайт связывания регулятора биосинтеза лейцина, ЬеиЗр, строго консервативен во всех исследованных геномах и, кроме этого, полностью идентичен консенсусу сайта связывания;

• в эксперименте по иммунопреципитации хроматина было показано, что регулятор пути биосинтеза лейцина, ЬеиЗр, связывается с промоторной областью гена УОВ271(?, и, следовательно, вероятно контролирует экспрессию данного гена;

• филогененетическое дерево потенциального транспортера свидетельствует о том, что его ближайшими гомологами с известной функцией являются сидерофлексины и транспортер трикарбоксилатов из ЯаШБ norvegicus.

Таким образом, сравнительно-геномный анализ показал, что продукт гена УОЯ271с, по всей видимости, принимает участие в пути биосинтеза лейцина, является трансмембранным белком, заякоренным в мембране митохондрий Эти факты позволяют приписать белку УОЯ271с функцию потенциального

J Kohlhaw G B Leucine biosynthesis in fungi entering metabolism through the back door // Microbiol Mol Biol Rev. — 2003 —vol 67, no 1 —Pp 1-15.

4 Huh WK.FalvoJV, GerkeL C, Carroll A S, Howson R W, WeissmanJS, O'SheaEK Global analysis of protein localization in budding yeast // Nature — 2003 — vol 425, no 6959 — Pp 686-691

5 LeeTl, RmaldiNJ, Robert F, OdomDT, Bar-Joseph Z, GerberGK, Hannett N M. Harbison C T, Thompson C M, Simon /, Zeitlinger J, Jennings E G, Murray H L . Gordon D B , Ren B , WyriekJJ, TagneJB, VolkertTL, Fraenkel E, GijfordD K, Young R A Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae // Science — 2002 — vol 298, no 5594 — Pp 799-804

переносчика альфа-изопропилмалата, промежуточного продукта биосинтеза лейцина.

В целом, проведенный в данной части работы детальный анализ регуляторных областей генов и индивидуальных сайтов связывания факторов транскрипции выявил повышенные уровни консервативности некодирующих областей ДНК, принимающих участие в регуляции экспрессии генов. Как и ожидалось, степень консервативности всех областей генома падает с увеличением филогенетических расстояний между исследуемыми видами. Филогенетический футпринтинг сайтов связывания факторов транскрипции был наиболее наглядным на промежуточных филогенетических расстояниях. Было также показано, что повышенная консервативность характерна не только непосредственно для сайта связывания регуляторного белка, но характеризует и области, прилегающие к сайту связывания. Такое распространение области повышенной консервативности сайтов связывания регуляторов за пределы границ сайтов связывания может указывать на возможную кластеризацию функциональных регуляторных последовательностей, характерную для эукариот. Кроме того, был идентифицирован ген, кодирующий потенциальный митохондриальный переносчик альфа-изопропилмалата, промежуточного продукта биосинтеза лейцина.

Исследование транскрипционной регуляции генов биосинтеза метионина в коринебактериях.

В этом разделе описано применение методов современной сравнительной геномики при исследовании пути биосинтеза метионина в геномах коринебактерий.

В геноме С %1и1аткит был известен транскрипционный регулятор пути биосинтеза метионина, МсЬЯ6. Сконструированное филогенетическое дерево ортологов МсЬЫ свидетельствует о том, что его ортологи имеются в геномах рода СогупеЬас/егшт (С. %1и1агтсит, С (¡¡рШИепае, С. е[Ааеп$ и С. ]е1кешт), а также в других геномах порядка А^тотусеЫеБ, таких как ЫосаЫш /агсМса, Ьефота хук и 81гер1отусе$ соексоЬг. Последующие этапы работы проводились только на этих геномах.

Гены метаболического пути и их организация в опероны у С. ¿Шагтсит были изучены ранее6, и на первом этапе работы был предпринят поиск ортологов структурных генов биосинтеза метионина в остальных исследуемых геномах. Несмотря на филогенетическую близость анализируемых геномов, анализ предсказанных оперонных структур выявил значительное количество различных эволюционных событий, которые можно разделить на следующие типы:

• неортологичные замещения — ген треонинсинтазы, МгС, в геномах С. glutamicum, С. сИрШИепае и С еДгаепв',

6 Rey D A , Nentwich SS .Koch D J, Ruckert C. Puhler A , Touch A , Kalmowsh J The McbR repressor modulated by the effector substance S-adenosylhomocysteine controls directly the transcription of a regulon involved in sulphur metabolism of Corynebactenum glutamicum ATCC 13032 //Mol Microbiol — 2005 — vol 56,no 4 —Pp 871-887

• оперопные перестройки — описаны для большей части оперонов структурных генов пути биосинтеза метионина, например, для оперонов thrABC, metXYи оперона cg0735-cg0737 С. glutamicum;

• паралоги и дупликации — дупликация гена алкансульфопат-монооксигеназы, ssuD, в геноме С. glutamicum; дупликация гена сульфатредуктазы, в геномах С. glutamicum и С. efficiens;

• горизонтальный перенос — появление двух пар гомологов для пары генов cysN-cysD в геноме Nocardia farcinica в результате горизонтального переноса от других бактерий порядка Actinomycetales (вероятнее всего, от бактерий рода Mycobacterium) и в результате горизонтального переноса из геномов протеобактерий;

• утрата ортологов во всех исследованных организмах была описана для следующих генов С. glutamicum: для регулятора генов утилизации сульфонатов и сульфатных эфиров, ssuR, для гена флавин-редуктазы ssul, для генов seuBC и ssuABC, отвечающих за утилизацию сульфатных эфиров и сульфонатов, соответственно, а также для гена, кодирующего белок с неизвестной функцией, cg3372; кроме того, описаны случаи утраты ортологов генов С. glutamicum в более филогенетически далеких геномах и более частные случаи утраты ортологов лишь в некоторых из исследованных геномов;

• полная консервативность оперона во всех изученных геномах была показана только для двух моноцистронных оперонов.

На следующем этапе работы было подтверждено известное предсказание потенциального мотива связывания регулятора McbR6. На основании предсказанных и экспериментально подтвержденных сигналов была составлена обучающая выборка и построена позиционная весовая матрица для поиска новых сайтов связывания регулятора McbR. Лого всех найденных сайтов McbR в геномах рода Corynebacterium представлено на рис. 2.

„л___.. Е - Т !Г

Рис. 2. Лого всех потенциальных сайтов связывания регулятора \1chR.

Исследование регуляторных сигналов связывания McbR позволило предсказать потенциальные сайты связывания перед ортологами большей части регулируемых генов С. glutamicum в геномах рода СогупеЬаМегшт. Так, в частности, сайт сохраняется перед всеми найденными в этих геномах ортологами генов те1К, теШ, т^Е, те1В, суяК, cg3132 и перед генами дивергона cg2674-cg2680. Однако иногда даже в близких геномах рода СогупеЪас1епит регуляторные сигналы отсутствовали перед ортологичными генами. Были также описаны ситуации разделения единого регулируемого оперона на два независимо регулирующихся

ортологичных оперона (оперон metXY в геноме С glutamicum и дивергон утилизации сульфата cysJIXHDNZY в геноме С jeikeium).

В геноме С glutamicum, помимо уже известных сигналов, был описан новый потенциальный сайт связывания McbR перед геном cgi 739, кодирующим белок с консервативным доменом глутамин-амидотрансферазы. Ортологи данного белка представлены во всех геномах рода Corynebacterium и отсутствуют в филогенетически более далеких организмах. Перед всеми ортологами этого белка имеется потенциальный сайт связывания McbR. Таким образом, согласно методу процедуры проверки соответствия, ген cgl739 является новым потенциальным членом регулона McbR. Косвенным экспериментальным подтверждением этого предсказания является то, что в делеционном мутанте С. glutamicum по гену mcbR происходит активация экспрессии гена cgl7396.

В целом, исследование потенциальных сигналов связывания McbR в геномах рода Corynebacterium позволило заключить, что большинство генов регулона McbR сохраняет регуляцию со стороны этого репрессора Применение современных методов сравнительной геномики позволило выявить два новых потенциальных члена регулона McbR. Одним из них является ген cgi 739 С glutamicum, роль и потенциальную функцию которого в пути биосинтеза метионина достоверно предсказать было невозможно. Вторым новым потенциальным членом регулона McbR является ген СЕ2636р С. efficiens и его ортологи в С. glutamicum и С. diphtheriae. Кодируемый им белок имеет значительную степень сходства с 5'-метилтиоаденозин-нуклеозидазами, которые обеспечивают восстановление пула метионина из побочного продукта биосинтеза полиаминов Таким образом, в геномах рода Corynebacterium увеличение пула метионина за счет расщепления 5 '-метилтиоаденозина также регулируется фактором McbR, по крайней мере, в геномах С diphtheriae и С efficiens

Исследование транскрипционной регуляции биосинтеза метионина в стрептококках.

Филогенетическое дерево регуляторов LysR семейства (рис 3) свидетельствует о том, что ортологи обоих регуляторов, MtaR и CmbR, принимающих участие в регуляции биосинтеза метионина и цистеина в геномах стрептококков, формируют две независимые ветви, каждая из которых содержит белки из всех доступных геномов стрептококков.

На первом этапе работы для всех генов, принимающих участие в биосинтезе метионина и цистеина, были определены ортологи во всех геномах стрептококков. В большинстве исследованных геномов сохраняется большая часть основных генов биосинтеза метионина и остается консервативной оперонная структура генов биосинтеза метионина и цистеина, что объясняется филогенетической близостью этих геномов. Отдельного внимания заслуживает только оперон metEF, детальное исследование которого показало, что, вероятнее всего, оперон metEF в геномах S agalactiae, S. mutans и S sobrinus появился в результате неортологичного замещения

При поиске потенциальных сигналов связывания регуляторов пути биосинтеза метионина и цистеина использовались следующие известные характеристики сайтов связывания LysR семейства7:

• общий мотив связывания вида Т-Ыц-А;

• центр сайта связывания располагается на расстоянии -65 п.н. относительно точки старта транскрипции

Так как точка старта транскрипции определяется расположением промотора в регуляторной области, на основании известных последовательностей промоторов Bacillus subtilis была сконструирована матрица позиционных весов для предсказания потенциальных промоторов в регуляторных областях генов пути биосинтеза метионина и цистеина в стрептококках.

Предсказанные промоторы в большей части случаев имели стандартную структуру в виде двух боксов (ТАТААТ и TTGACA), разделенных спейсером длиной 17 п.н. В более редких случаях наблюдалась частичная, а иногда и полная утрата -35 бокса, который в таких случаях всегда был скомпенсирован так называемым удлиненным -10 боксом (TG-TATAAT).

Сайты связывания факторов транскрипции являются функционально значимыми последовательностями и, следовательно, консервативны. По этой причине выявление потенциальных сайтов связывания транскрипционных регуляторов проводилось посредством анализа множественных выравниваний ортологичных регуляторных областей структурных генов биосинтеза метионина.

CmbR

Выравнивания регуляторных областей позволили идентифицировать перед большей частью ортологичных генов несколько областей повышенной консервативности, одна из которых соответствует предсказанному промотору.

1SchellMA Molecular biology of the LysR family of transcriptional regulators // Armu Rev Microbiol — 1993 — vol 47 — Pp 597-626

Помимо потенциального промотора, в выравниваниях часто обнаруживался второй островок консервативности, вероятнее всего соответствующий сайту связывания транскрипционного регулятора семейства ЬузЛ, так как в большинстве случаев эти островки консервативности располагались на расстоянии -65 п.н. от точки старта транскрипции и имели структуру вида Т-Т^ц-А.

В целом такой анализ, проведенный на множественных выравниваниях регуляторных областей генов биосинтеза метионина и цистеина, позволил выявить два различных потенциальных мотива связывания регуляторов семейства ЬувЯ. Консенсусные записи обнаруженных мотивов выглядят как ТАТАС-(п)7-СТАТА и ТОАТА-Ы9-ТАТСА-Ы2-4-ТСАТА. Лого найденных мотивов представлено на рис. 4. Нужно отметить, что в некоторых случаях сигнал располагался не на характерном для сигналов регуляторов ЬуэЯ семейства расстоянии от точки старта транскрипции, однако во всех случаях смещение сигнала всегда происходило на расстояние, кратное шагу спирали ДНК. Таким образом, молекула регулятора, связанная с регуляторным сигналом, остается на той же стороне спирали ДНК относительно комплекса РНК-полимеразы, который формируется в промоторной области.

Рис. 4. Лого потенциальных сайтов связывания регуляторов MtaR (а) и CmbR (б) в геномах стрептококков.

Сигнал вида ТАТАС-(п)7-СТАТА был найден перед большей частью генов метаболического пути биосинтеза метионина и цистеина, тогда как сигнал структуры ТСАТА-Кт9-ТАТСА-Н2_4-ТОАТА был найден перед генами, непосредственно связанными с метаболизмом цистеина. На этом основании было сделано предположение о том, что сигнал структуры ТОАТА-Кд-ТАТСА-Ыг^-ТСАТА является сайтом связывания ортологов регулятора СтЫ1, который чувствителен к концентрации цистеина и контролирует его биосинтез в Ь. Ьасйз8. Соответственно, сигнал вида ТАТАС-(п)7-СТАТА является сайтом связывания

Sperandio B.. PolardP., Ehrlich D.S., Renault P., Guedon E. Sulfur amino acid metabolism and its control in Lactococcus lactis IL1403 //J. Bacteriol. — 2005 — vol.187, no. 11— Pp. 3762-3778.

ортологов регулятора MtaR, контролирующего гены метаболизма и транспорта метионина9'10 В дальнейшем, сигнал вида TATAG-(n)7-CTATA будет называться потенциальным сигналом связывания MtaR, а мотив структуры TGATA-N9-TATCA-N2-4-TGATA будет называться мотивом связывания регулятора CmbR.

На основании выборки сайтов связывания CmbR была сконструирована матрица позиционных весов для предсказания новых потенциальных сигналов связывания данного регулятора. При обнаружении потенциальных предсказанных сайтов CmbR перед несколькими ортологичными генами, для соответствующих регуляторных областей предсказывались потенциальные промоторы и строилось множественное выравнивание. Если сайт связывания перед ортологичными генами был консервативен, то, согласно методу проверки соответствия, эти гены являются членами исследуемого регулона. Такой анализ позволил выявить несколько новых потенциальных членов регулона CmbR:

• ген, кодирующий пермеазу аминокислот неизвестной специфичности Этому гену было предложено тривиальное имя cctY (от Candidate Cysteine Transporter Y). Этот ген, по всей видимости, является первым геном бицистронного оперона, включающего также ген ттиМ, кодирующий гомоцистеин S-метилтрансферазу, также принимающую участие в биосинтезе метионина и цистеина. Гены cctY и ттиМ образуют единый оперон, поскольку длина межгенного расстояния между ними во всех геномах не превышает 13 п н.

• ген, потенциально кодирующий лиганд-связывающий компонент ABC транспортера аминокислот неизвестной специфичности. Этому гену было предложено тривиальное имя cctW {от Candidate Cysteine Transporter W). Этот ген расположен перед опероном ABC транспортера metNPQ, отвечающего за транспорт метионина внутрь клетки, но, по всей видимости, транскрибируется моноцистронно, так как межгенное расстояние между cctW и metNPQ во всех геномах превышает 140 п.н. Нужно отметить, что в геноме S suis перед опероном metNPQ располагается не ортолог cctW, а ген, потенциально кодирующий глутамин амидотрансферазу. Тем не менее, перед этим геном был идентифицирован сигнал связывания CmbR, расположенный на правильном расстоянии относительно точки старта транскрипции.

Кроме того, во время детального анализа множественных выравниваний регуляторных областей было отмечено, что в некоторых случаях предсказанные потенциальные сайты связывания регуляторов MtaR и CmbR могут пересекаться (это, в частности, наблюдается в случае генов metY и metQ2). Такие случаи, когда потенциальные сайты связывания обоих регуляторов накладываются друг на друга, вероятно отражают ситуации потенциальной смены регулятора, контролирующего экспрессию данного гена.

9 Rodionov D A . Vnreschak A G. Mironov A A , GelfandMS Comparative genomics of the methionine metabolism in Gram-positive bacteria a variety of regulatory systems // Nucleic Acids Res — 2004 — vol 32 no 11 — Pp 33403353

10 Shelver D. Rajagopal L . Harris T O. Rubens C E MtaR, a regulator of methionine transport, is critical for survival of group B streptococcus m vivo //J Bactenol. — 2003—vol 185, no 22 —Pp 6592-6599

Таким образом, в данной части работы было показано, что структурные гены метаболического пути биосинтеза метионина и цистеина в геномах стрептококков контролируются двумя транскрипционными регуляторами семейства ЬувЯ. Для каждого из регуляторов был обнаружен потенциальный сигнал связывания. Были предсказаны новые члены регулона СшЫ1, принимающие участие в метаболизме цистеина в стрептококках. Кроме того, были обнаружены и случаи потенциальной смены транскрипционного регулятора ортологичных генов.

По всей видимости, в предковых геномах Грам-положительных бактерий регуляция пути биосинтеза метионина осуществлялась при помощи 8-боксов, регуляторных вторичных структур РНК9'11. Затем, в процессе эволюции, Б-боксы были утрачены в последнем общем предковом геноме для групп Ьас1оЬасШа1ея и БкерЮсоссЫез. В лактобациллах произошла экспансия регулона Т-боксов9, в то время как у стрептококков регуляция осуществляется на этапе инициации транскрипции. Эта регуляция осуществляется двумя гомологичными транскрипционными регуляторами, которые были найдены во всех исследованных полных геномах стрептококков. Мотивы связывания и потенциальные сайты предсказаны для обоих регуляторов, а их распределение позволило приписать определенную функцию каждому из регуляторов. Таким образом, СтЬЯ был определен как регулятор метаболизма цистеина, а М1аЯ— как регулятор метаболизма метионина.

Выводы

1. Детальный анализ уровней консервативности нетранслируемых областей геномов дрожжей выявил заметное повышение уровня консервативности некодирующих областей после стоп-кодона, что, вероятнее всего, связано с обеспечением стабильности молекулы мРНК.

2. Анализ уровней консервативности сайтов связывания регуляторов транскрипции дрожжей выявил неабсолютную консервативность сайтов связывания регуляторных белков даже в пределах близкородственных геномов; кроме того, область повышенной консервативности включает не только непосредственно сайт связывания регулятора, но и простирается дальше за его пределы.

3. В дрожжах предсказан потенциальный митохондриапьный транспортер альфа-изопропилмалата, промежуточного продукта пути биосинтеза лейцина, потенциально кодируемый геном УОК271с.

4. Предсказаны новые потенциальные члены регулона МсЬЯ, регулятора метаболизма метионина, в коринебактериях: ортологи гена с%1139 С. glutamlcum, функция которого не ясна, и ортологи гена СЕ2636 С. е^гсгет, принимающие участие в увеличении пула метионина за счет расщепления 5'-метилтиоаденозина;

5. Показано разделение генов биосинтеза метионина и цистеина в стрептококках на два независимых регулона, и каждому из двух регуляторов,

1' Grundy FJ. Henkin T M The S box regulon a new global transcription termination control system for methionine and cysteine biosynthesis genes in gram-positive bacteria // Mol Microbiol — 1998 — vol 30, no 4 —Pp 737-749

MtaR и CmbR, приписана определенная функция в регуляции путей биосинтеза метионина и цистеина;

6. Для регулятора биосинтеза метионина, MtaR, в стрептококках были обнаружены новые потенциальные сайты связывания перед генами метаболического пути биосинтеза метионина.

7. Для регулятора биосинтеза цистеина, CmbR, в стрептококках был впервые идентифицирован мотив связывания и предсказаны новые потенциальные члены регулона CmbR, которым были присвоены тривиальные имена cctW и cctY. Белки CctW и CctY, по-видимому, принимают участие в транспорте цистеина и/или его предшественников внутрь клетки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых научных журналах

[1] Kovaleva GYu, Makeev V.Yu, Gelfand MS Computer analysis of the GCN4 regulon of yeast Saccharomyces cerevisiae // Biophysics (Moscow). 2003. V. 48. Suppl. 1. P. S26-S29 (Номер издан только по-английски).

[2] Kovaleva G, Bazykin G., Brudno M, Gelfand M. Comparative genomics of transcriptional regulation in yeasts and its application to identification of a candidate alpha-isopropylmalate transporter // Journal of Bioinfomatics and Computational Biology 2006. V. 4. P. 981-998

[3] Ковалева Г.Ю, Гельфанд M.C. Регуляция биосинтеза метионина/цистеина в Corynebacterium glutamicum и родственных организмах // Молекулярная биология. 2007. V. 41. Р. 139-150.

[4] Kovaleva G Y., Gelfand M.S Transcriptional regulation of the methionine and cysteine transport and metabolism in streptococci // FEMS Microbiol. Lett 2007. V. 76. P. 207-215.

Тезисы международных конференций

[1] Ковалева Г Ю, Макеев В.Ю, Гельфанд М С. Компьютерный анализ CGN4-регулона дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans // XI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2004". Москва, Россия, 2004.

[2] Kovaleva G Yu, Mironov А А , Gelfand MS The conservation of transcription factor-binding sites in Saccharomyces genomes // The 4th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure Novosibirsk, Russia, 2004.

[3] Kovaleva G., Bazykin G., Brudno M., Gelfand M Conservation rate of transcription factor binding sites in Saccharomyces genomes // Bioinformatics Italian Society. Milan, Italy, 2005.

[4] Ковалева Г.Ю., Базыкин EA, Брудно M, Гельфанд М Исследование дрожжевых геномов с использованием множественных геномных выравниваний // XII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2005". Москва, Россия, 2005.

[5] Kovaleva G., Gelfand M Conservation of transcription factor binding sites in fungal genomes // The Moscow Conference on Computational Molecular Biology. Moscow, Russia, 2005

[6] Kovaleva G, Gelfand M Identification of a candidate alpha-isopropylmalate transporter // The IVth European Conference on Computational Biology. Madrid, Spain, 2005.

[7] Kovaleva G, Gelfand M Transcriptional regulation of the methionine biosynthesis in actinobacteria and streptococci // The 5th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. Novosibirsk, Russia, 2006.

[8] Kovaleva G, Gelfand M Evolution of the methionine biosynthesis in streptococci // The Vth European Conference on Computational biology. Eilat, Israel, 2007.

[9] Kovaleva G, Gelfand M Regulation of methionine and cysteine biosynthesis in Streptococci // The 15th International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology and 6th European Conference on Computational Biology Vienna, Austria, 2007.

[10] Kovaleva G. Yu. Regulation of the methionine and cysteine biosynthesis in streptococci // The Moscow conference on Computational Molecular biology. Moscow, Russia, 2007.

Патент

Гельфанд MC, Ковалева Г.Ю. Способ исследования и прогнозирования пути биосинтеза метионина в родственных геномах коринебактерий // Регистрационный № 2006127265, 2006.

Ковалева Галина Юрьевна

АНАЛИЗ РЕГУЛЯЦИИ ГЕНОВ МЕТАБОЛИЗМА И ТРАНСПОРТА МЕТИОНИНА И ЛЕЙЦИНА МЕТОДАМИ СРАВНИТЕЛЬНОЙ ГЕНОМИКИ

Транскрипционная регуляция генов метаболизма и транспорта метионина и лейцина была исследована в трех таксономических группах. Анализ, проведенный на геномах дрожжей, выявил заметное повышение уровня консервативности нетранскрибирующихся областей геномов после стоп-кодона, что связано с обеспечением стабильности молекулы РНК. В регуляторных областях геномов дрожжей обнаружены неабсолютная консервативность сайтов связывания регуляторов транскрипции и распространение области повышенной консервативности значительно за пределы сайта связывания регулятора. Применение методов сравнительной геномики позволило предсказать ген транспортера альфа-изопропилмалата, промежуточного продукта биосинтеза лейцина в геномах дрожжей, и идентифицировать два новых потенциальных члена пути метаболизма метионина в геномах коринебактерий, один из которых обеспечивает увеличение пула метионина за счет побочного продукта пути биосинтеза полиаминов. Анализ, проведенный на геномах стрептококков, выявил разделение генов пути биосинтеза метионина на два независимых регулона. Для каждого из двух регуляторов предсказан мотив связывания и приписана определенная функция в метаболическом пути Кроме того, предсказаны два новых потенциальных члена регулона CmbR, принимающих участие в транспорте цистеина и/или его предшественников внутрь клетки.

Kovaleva Galina Yurjevna

ANALYSIS OF METHIONINE AND LEUCINE METABOLISM AND TRANSPORT GENES BY COMPARATIVE GENOMICS METHODS

Regulation of the methionine and leucine metabolism and transport genes was studied for three taxonomic groups. Analysis of yeast genomes described a long-tailed conservation peak in the downstream intergenic regions, linked to mRNA stability. Analysis of conservation of individual transcription factor binding sites revealed that the region of increased conservation is not limited to individual binding sites, but extends much further into the surrounding region. The analysis of individual binding sites demonstrated that regulatory motives are not absolutely conserved even in closest genomes. The comparative genomic techniques allowed for the identification of a candidate alpha-isopropylmalate transporter, an intermediate of the leucine biosynthesis, in the yeast genomes. Two new potential members of the methionine metabolism pathway of corynebacteria were identified, one of them maintaining the methionine pool maintenance at the expense of a polyamine biosynthesis by-product. Investigation of the methionine metabolism pathway in the streptococcal genomes revealed subdivision of all structural genes into two independent regulons. For each regulator, the binding motive was predicted and the potential function was ascribed The comparative genomics methods allowed for the identification of two new members of CmbR regulon, both of them are predicted to transport cysteine and/or its precursors into the cell

щ

Заказ № 225/09/08 Подписано в печать 26 09 2008 Тираж 100 экз. Уел пл 1,25

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 уГ^уу www.cfr.ru ; e-mail-info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковалева, Галина Юрьевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Сравнительная геномика.

2.1.1 Сравнение геномных последовательностей.

2.1.2 Гомологичные последовательности.

2.1.3 Основные механизмы эволюции геномов.

2.1.4 Первичный анализ, или аннотация, геномов.

2.1.4.1 Распознавание генов.

2.1.4.2 Функциональная аннотация генов (белков).

2.1.4.3 Сравнительный анализ транскрипционной регуляции.

2.2 Путь биосинтеза метионина и его транскрипционная регуляция.

2.2.1 Метионин.

2.2.2 Путь биосинтеза метионина.

2.2.2.1 Путь биосинтеза метионина.

2.2.2.2 Путь ассимиляции серы.

2.2.3 Транскрипционная регуляция биосинтеза метионина.

2.2.3.1 Транскрипционная регуляция биосинтеза метионина в дрожжах.

2.2.3.2 Транскрипционная регуляция биосинтеза метионина в коринебактериях.

2.2.3.3 Транскрипционная регуляция биосинтеза метионина в стрептококках.

2.3 Путь биосинтеза лейцина и его транскрипционная регуляция в Saccharomyces cerevisiae.

2.3.1 Лейцин.

2.3.2 Путь биосинтеза лейцина в S. cerevisiae.

2.3.3 Транскрипционная регуляция биосинтеза лейцина в S.cerevisiae.

2.4 Глобальный регулятор биосинтеза аминокислот в S.cerevisiae.

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Определение членов регулона.

3.2 Программное обеспечение.

3.3 Исследованные геномы.

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Исследование консервативности сайтов связывания факторов транскрипции, контролирующих биосинтез метионина и лейцина, в дрожжах.

4.1.1 Определение уровней консервативности нетранслируемых областей дрожжевых геномов.

4.1.1.1 Исследование уровня консервативности 5'-нетранслируемых областей.

4.1.1.2 Исследование уровня консервативности 3'-нетранслируемых областей.

4.1.2 Определение уровней консервативности сайтов связывания факторов транскрипции.

4.1.3 Исследование уровней консервативности сайтов связывания факторов транскрипции, контролирующих биосинтез метионина и лейцина.

4.1.4 Предсказание потенциального переносчика альфа-изопропилмалата.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ регуляции генов метаболизма и транспорта метионина и лейцина методами сравнительной геномики"

Аминокислоты являются структурным компонентом всех белков, и, таким образом, представляют собой важнейшие компоненты каждой живой клетки. Однако способностью к биосинтезу всех аминокислот, входящих в полипептидные цепи, обладают только микроорганизмы и некоторые растения, тогда как человек и животные вынуждены часть необходимых аминокислот получать пищей с диетой, — это так называемые незаменимые аминокислоты. Незаменимые аминокислоты не могут синтезироваться в организме млекопитающих и должны поставляться организму вместе с продуктами питания или со специальными пищевыми добавками, содержащими незаменимые аминокислоты.

Разработка и производство таких пищевых добавок требует создания систем биосинтеза незаменимых аминокислот в промышленных масштабах, что, в свою очередь, требует детального и тщательного исследования устройства и регуляции метаболических путей, обеспечивающих биосинтез незаменимых аминокислот в различных микроорганизмах — продуцентах этих аминокислот. К незаменимым аминокислотам относятся изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан и валин.

Ранее работы по исследованию разнообразных метаболических систем проводились только путем постановки длительных по времени и дорогостоящих экспериментов. В настоящее же время у исследователей появилась новая возможность компьютерного анализа геномов, связанная со значительным ростом количества полностью определенных геномных последовательностей. Рост количества определенных последовательностей геномов позволяет проводить сравнительный анализ различных геномов, что открывает уникальные возможности в области функциональной аннотации генов. Если ранее для определения вероятной функции белка использовался только перенос экспериментально установленных функций белков одного вида на белки другого вида, основанный на сходстве аминокислотных последовательностей, то впоследствии для выполнения этих задач были разработаны сравнительно-геномные подходы, широко используемые исследователями всего мира.

Методы, основанные только на сходстве аминокислотных последовательностей, не способны определить функции многих гипотетических генов. Более того, выяснилось, что они могут даже приводить к неточным или неправильным аннотациям генов. Функциональное описание большинства из этих гипотетических белков потребовало бы огромного количества экспериментов, которое, в настоящее время, существенно уменьшается за счет применения методов сравнительного анализа геномов. Наиболее распространенными подходами сравнительной геномики являются анализ ко-локализации на хромосомах генов [105], случаев слияния генов [30], профилей встречаемости генов в полных геномах [112] и анализ общих регуляторных сайтов [45]. Одновременное использование всех этих геномных методик позволяет обнаружить функциональную связь между белками, участвующими в одном метаболическом пути [90, 157]. Таким образом, метаболическая реконструкция помогает обнаружить как новые аспекты данного метаболического пути в хорошо изученных организмах (таких как Е. coli и В. subtilis), так и описать de novo метаболический потенциал ^охарактеризованных организмов.

Другой, не менее важный, раздел сравнительной геномики — предсказание регуляции экспрессии генов. В ряде работ было показано, что регуляторные сайты в бактериальных геномах могут быть предсказаны наиболее эффективно при одновременном анализе нескольких родственных геномов. Так, в частности, были описаны регулоны, отвечающие за биосинтез пуринов и аргинина [97], ароматических аминокислот [107], транспорт и метаболизм железа [108], утилизацию различных Сахаров [83, 121, 122], утилизацию хитина [159], метаболизм биотина [125, 126], а также SOS-ответ [113].

В данной работе с использованием методов сравнительной геномики был проведен детальный анализ метаболических путей, обеспечивающих биосинтез незаменимой аминокислоты метионина в трех различных таксономических группах, а также метаболический путь, обеспечивающий биосинтез незаменимой аминокислоты лейцина, в геномах дрожжей.

Заключение Диссертация по теме "Биоинформатика", Ковалева, Галина Юрьевна

5 ВЫВОДЫ

1. Детальный анализ уровней консервативности нетранслируемых областей геномов дрожжей выявил заметное повышение уровня консервативности некодирующих областей после стоп-кодона, что, вероятнее всего, связано с обеспечением стабильности молекулы мРНК.

2. Анализ уровней консервативности сайтов связывания регуляторов транскрипции дрожжей обнаружил неабсолютную консервативность сайтов связывания регуляторных белков даже в пределах близкородственных геномов; кроме того, область повышенной консервативности включает не только непосредственно сайт связывания регулятора, но простирается дальше за его пределы.

3. В дрожжах предсказан потенциальный митохондриальный транспортер альфа-изопропилмалата, промежуточного продукта пути биосинтеза лейцина, потенциально кодируемый геном YOR271c.

4. Предсказаны новые потенциальные члены регулона McbR, регулятора метаболизма метионина, в коринебактериях: ортологи гена cgl739 С. glutamicum, функция которого не ясна, и ортологи гена СЕ2636 С. efficiens, принимающие участие в увеличении пула метионина за счет расщепления 5'-метилтиоаденозина.

5. Показано разделение генов биосинтеза метионина и цистеина в стрептококках на два независимых регулона, и каждому из двух регуляторов приписана определенная функция в регуляции путей биосинтеза метионина и цистеина;

6. Для регулятора биосинтеза метионина, MtaR, в стрептококках были обнаружены новые потенциальные сайты связывания перед генами метаболического пути биосинтеза метионина.

7. Для регулятора биосинтеза цистеина, CmbR, в стрептококках был впервые идентифицирован мотив связывания и предсказаны новые потенциальныен члены регулона CmbR, которым были присвоены тривиальные имена cctW и cctY. Белки CctW и CctY, по-видимому, принимают участие в транспорте цистеина и/или его предшественников внутрь клетки.

6 БЛАГОДАРНОСТИ

Я благодарна Михаилу Сергеевичу Гельфанду за руководство, постоянную поддержку и помощь в работе, Андрею Александровичу Миронову за предоставленные программы, без которых было бы невозможно проведение данной работы, моим коллегам Георгию Базыкину, принимавшему участие в работе по оценке уровней консервативности нетранслируемых областей дрожжевых геномов, Михаилу Брудно за предоставленные множественные выравнивания дрожжевых геномов, Дмитрию Родионову за полезное обсуждение и помощь, оказанную мне в работе, а также всем сотрудникам лаборатории, за доброе отношение и творческую обстановку в коллективе.

7 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kovaleva G.Yu., Makeev V.Yu., Gelfand M.S. Computer analysis of the GCN4 regulon of yeast Saccharomyces cerevisiae // Biophysics (Moscow). — 2003. — Vol. 48, Suppl.l. — P. S26-S29.

2. Kovaleva G., Bazykin G., Brudno M., Gelfand M. Comparative genomics of transcriptional regulation in yeasts and its application to identification of a candidate alpha-isopropylmalate transporter // JBCB. — 2006. — Vol. 4. — P. 981-998.

3. Ковалева Г.Ю., Гельфанд M.C. Регуляция биосинтеза метионина/цистеина в Corynebacterium glutamicum и родственных организмах // Молекулярная биология. — 2007, —Т. 41. —С. 139-150.

4. Kovaleva GY, Gelfand MS. Transcriptional regulation of the methionine and cysteine transport and metabolism in streptococci // FEMS Microbiol. Lett. — 2007. — Vol. 276. — P. 207-215.

Тезисы конференций

1. Ковалева Г.Ю., Макеев В.Ю., Гельфанд M.C. Компьютерный анализ CGN4-регулона дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans // XI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2004". — Москва, Россия, 2004.

2. Kovaleva G.Yu, Mironov А.А., Gelfand M.S. The conservation of transcription factor-binding sites in Saccharomyces genomes // The Fourth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. — Novosibirsk, Russia, 2004.

3. Kovaleva G., Bazykin G., Brudno M., Gelfand M. Conservation rate of transcription factor binding sites in Saccharomyces genomes // Bioinformatics Italian society. — Milan, Italy, 2005.

4. Ковалева Г.Ю., Базыкин E.A., Брудно M., Гельфанд М. Исследование дрожжевых геномов с использованием множественных геномных выравниваний // XII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2005". — Москва, Россия, 2005.

5. Kovaleva G., Gelfand М. Conservation of transcription factor binding sites in fungal genomes // Moscow conference on Computational Molecular biology. — Moscow, Russia, 2005.

6. Kovaleva G., Gelfand M. Identification of a candidate alpha-isopropylmalate transporter // The IVth European Conference on Computational molecular biology. — Madrid, Spain, 2005.

7. Kovaleva G., Gelfand M. Transcriptional regulation of the methionine biosynthesis in actinobacteria and streptococci 11 The Vth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. — Novosibirsk, Russia, 2006.

8. Kovaleva G., Gelfand M. Evolution of the methionine biosynthesis in streptococci // The Vth European Conference on Computational molecular biology. — Eilat, Israel, 2007.

9. Kovaleva G. Yu. Regulation of the methionine and cysteine biosynthesis in streptococci // Moscow conference on Computational Molecular biology. — Moscow, Russia, 2007.

10. Kovaleva G. Yu., Gelfand M.S. Comparative genomics of the methionine biosynthesis regulation in streptococci 11 Информационные Технологии и Системы (ИТиС). — Звенигород, Россия, 2007.

Патент

Гельфанд М.С., Ковалева Г.Ю. Способ исследования и прогнозирования пути биосинтеза метионина в родственных геномах коринебактерий // Регистрационный № 2006127265. — 2006.

4.1.5 Заключение

Проведенный в данной части работы детальный анализ регуляторных областей генов и индивидуальных сайтов связывания факторов транскрипции выявил повышенные уровни консервативности некодирующих областей ДНК, принимающих участие в регуляции экспрессии генов. Как и ожидалось, степень консервативности всех областей генома падает с увеличением филогенетических расстояний между исследуемыми видами. Филогенетический футпринтинг сайтов связывания факторов транскрипции был наиболее наглядным на промежуточных филогенетических расстояниях. Было также показано, что повышенная консервативность характерна не только непосредственно для сайта связывания регуляторного белка, что было известно из работ [43, 88, 99], но характеризует и области, прилегающие к сайту связывания. Такое распространение области повышенной консервативности сайтов связывания регуляторов за пределы границ сайтов связывания может указывать на возможную кластеризацию функциональных регуляторных последовательностей, характерную для эукриот.

Исследование индивидуальных сайтов связывания регуляторов пути биосинтеза метионина и лейцина также выявило падение степени консервативности сайтов в более филогенетически далеких геномах и заметные отличия в уровнях консервативности сайтов связывания различных транскрипционных регуляторов. Было показано, что более длинные сайты, по всей видимости, являются более консервативными, чем короткие скластеризованные сайты связывания.

Наконец, был идентифицирован ген, кодирующий потенциальный митохондриальный переносчик альфа-изопропилмалата, промежуточного продукта биосинтеза лейцина.

4.2 ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСКРИПЦИОННОЙ РЕГУЛЯЦИИ БИОСИНТЕЗА МЕТИОНИНА В КОРИНЕБАКТЕРИЯХ

Филогенетическое дерево регулятора McbR (рис. 17) свидетельствует о том, что его ортологи имеются в геномах рода Corynebacterium (С. glutamicum, С. diphtheriae, С. efficiens и С. jeikeium), а также в других геномах порядка Actinomycetales, таких как Nocardia farcinica, Leifsonia xyli и Slreptomyces coelicolor. Последующие этапы работы проводились только на этих геномах.

Рисунок 17 Филогенетическое дерево гомологов белка McbR. Выделена ветвь, на которой находится McbR С. glutamicum и его ортологи.

4.2.1 Определение ортологов структурных генов пути биосинтеза метионина

Гены метаболического пути и их организация в опероны у С. glutamicum были изучены ранее (рис. 4) [119]. В данной работе был предпринят поиск ортологов генов биосинтеза метионина в остальных коринебактерях, геномы которых содержат McbR, и предсказана их организация в опероны (рис. 18). Несмотря на филогенетическую близость исследуемых геномов, анализ предсказанных оперонных структур выявил значительное количество различных эволюционных событий, которые можно разделить на следующие типы:

Burkholderia fungorum Burkholderia ambifaria \ J Burkholderia cepacia

Burkholderia cepacia ' 1 Ralstonia eutropha Burkholderia mallei cysJ/fpr2

МТА нуалюидш

ТГ термин:!горна* шпидыи Прсдемшн* " "Р

I сайт сигмами McbR. Экспериментально полпсрясяси н работе (Rey ttaf. 2005). сайт сшшннн! McbR Прилепам а работе (Rcy tt at, 2005) сайт сдомминя McbR Прслскаин *

СТ)сайг сипыплиик McbR с канл и

-П~ 'мнже порогового

Ц- »гены рлнссены по гешцу Г j* — ноортологнчнос 111ШЦСНЙС

Рисунок 18 Структура пяти оперонов регулона McbR, претерпевших наибольшие эволюционные перестройки. Тривиальные имена генов приведены для C.glutamicunr, для ортологов, имеющих в GenBank другие названия, имена генов приведены в скобках над соответствующим геном. Ортологичные гены каждого оперона одинаково окрашены. Сокращения названий геномов: Cgl— C.glutamicum, Cdp—- C.diphtheriae, Cef— C.effiiciens, Cjk— CJeikeium, Nfa— Nocardia faricnica, Lxl— Leifsonia xyli и See— Streptomyces coelicolor.

1. Неортологичные замещения

1.1) Бактерии С. jeikeium, N. farcinica, L. xyli и S. coelicolor используют трсонинсинтетазу (ген thrC), характерную для большинства актиномицет. Ген треонинсинтстазы входит в состав оперона с генами гомосериндегидрогеназы (hom или thrA) и гомосеринкиназы (thrB'). Последовательность генов в опероне может изменяться, и в геноме С. jeikeium и N. farcinica гены оперона расположены в порядке hom-thrB-thrC, а в геноме L. xyli и S. coelicolor — hom-thrC-thrB (рис. 18г)).

В то же время, в геномах С. glutamicum, С. diphtheriae и С. efficiens функции трсопинсинтетазы выполняет белок, не ортологичный продукту гена thrC актиномицет. Его картирование и функциональность известны из экперимента [55], хотя точное происхождение этого белка не ясно. Характерно, что ген этой треонинсинтетазы не входит в состав оперона и, таким образом, образуется два независимых оперона— Иот-thrB и нерегулируемый моноцистронный оперон //ггС*(звездочка введена для отличия от ортологичного гена thrC), расположенные в разных частях генома [55] (рис. 18с>).

1.2) Для всех почвенных бактерий одними из основных источников серы являются сульфатные эфиры и сульфонаты. Сульфатные эфиры утилизируются с помощью сульфатаз, которые присутствуют практически в каждом микроорганизме [73]. Тем не менее, в геноме С. glutamicum для утилизации сульфатных эфиров имеется отдельный оперон, seuABC, кодирующий три потенциальных фермента десульфуризации [119]. Для утилизации же сульфонатов необходимы специфические ферменты, гены которых во всех известных к настоящему времени случаях формируют один оперон, содержащий гены ABC-транспортера и НАДФ-зависимой монооксигеназы [26]. В геноме С. glutamicum этот оперон, ssuABC-Dl (ssu — от sulfonate-sulfur utilization), уже описан [74]. Интересно, что во всех исследованных родственных геномах актиномицет оба оперона (утилизации сульфатных эфиров и утилизации сульфонатов) практически полностью утрачены.

В то же время, в геноме С. efficiens в опероне утилизации сульфата (cysIXHDNYZ, рис. 18а) появляется новый потенциальный член - ген белка СЕ2637р, ближайшими ортологами которого являются члены белкового семейства люцифераз из геномов протеобактерий. Сравнение с консервативными белковыми доменами базы данных GenBank [11, 12], позволило более точно охарактеризовать белок СЕ2637р как алкансульфонат-монооксигеназу, которая, по всей видимости, появилась в геноме С. efficiens вследствие неортологичного замещения. Таким образом, С. efficiens, вероятно, может использовать алкан-сульфонаты в качестве источника серы. Необходимого ABC транспортера не обнаружено в опероне, содержащем алкансульфонат-монооксигеназу, однако, субстрат для нее, возможно, поставляется одним из двух АВС-транспортеров (гены cg0735-cg0737 и cg2675-cg2678 в геноме С. glutamicum) с неизвестной специфичностью. Оба транспортера и регуляторные сигналы перед кодирующими их оперонами (см. ниже) сохраняются в геноме С. efficiens (рис. 18а).

2. Оперонные перестройки

2.1) Выше уже упоминалось, что в опероне thrABC происходит перестановка генов. Аналогичные случаи характерны и для других оперонов. Так, гены гомосерин-ацетилтрансферазы (metX) и ацетилгомосерин-лиазы (metY) в разных геномах по-разному расположены друг относительно друга (рис. 18г). В геноме С. glutamicum они находятся рядом, транскрибируются в одном направлении, расстояние между генами относительно невелико — 144 п.н., и, тем не менее, гены разделены потенциальным терминатором транскрипции [119]. В геномах С. diphtheriae и N. farcinica эти гены также транскрибируются в одном направлении, однако еще более разнесены по геному. Для геномов С. efficiens и С. jeikeium характерно формирование единого оперона metXY. Кроме того, известны и случаи дивергентного расположения этих генов в геноме L. xyli (рис. 18г), когда metY (в геноме L. xyli имеющий обозначение cysD) расположен конвергентно с геном потенциальной дегидрогеназы, а дивергентно к ним расположен ген metX{в геноме L. xyli имеющий обозначение metA).

2.2) Внутриоперонные перестановки генов характерны также для оперона cg0735-cg0737, кодирующего ABC-переносчик неизвестного субстрата (рис. 18в). В геномах рода Corynebacterium (кроме С. diphtheriae) так же, как и в геномах N. farcinica и L. xyli, структура оперона сохраняется, тогда как в геноме S. coelicolor он изменен на cg0737-cg0735-cg0736. В геноме С. diphtheriae оперон удлинен за счет появления гена cg0737 перед опероном. Возможно, удлинение оперона наблюдается и в случае гена регулятора McbR (см. ниже).

2.3) В уже упоминавшемся выше опероне утилизации сульфата в геноме S. coelicolor внутри оперона cysIXHCDN появился новый ген, cysC, предположительно кодирующий аденилилсульфаткиназу (рис. 18а). Происхождение этого гена не ясно, поскольку его ортологи были найдены только в геномах рода Streptomyces. В ортологичном опероне cysIXHDNYZ из С. efficiens, помимо гена алкансульфонат-монооксигеназы (см. выше), появляется еще один новый потенциальный член регулона (рис. 18а), кодирующий метилтиоаденозин нуклеозидазу. Ортологи этого гена обнаружены также в С. glutamicum и С. diphtheriae, где транскрибируются моноцистронно.

2.4) Ген cg2679 С. glutamicum, расположенный дивергентно к оперону cg2674~ cg2678 [119], по всей видимости, контранскрибируется с геном cg2680 (кодирующим аминотрансферазу), поскольку межгенное расстояние составляет всего 52 п.н. и потенциальный Rho-независимый терминатор между этими генами выявлен не был [119]. Дивергон cg2574-cg2680 консервативен только в геноме С. efficiens и полностью отсутствует во всех остальных геномах. Только для гена cg2680 имеется ортолог в геноме С. jeikeium, где он входит в состав другого регулируемого оперона (рис. 186), включающего в себя ген aecD (цистатионин-р-лиазы) и ywjA (ген АТФазы АВС-транспортера). В геномах С. glutamicum и С. efficiens ортологи гена ywjA образуют моноцистронные нерегулируемые опероны, а ортологи гена aecD входят в состав нерегулируемого оперона, также включающего в себя ген ЬтО (переносчик аминокислот с разветвленной цепью) и алканалмонооксигеназу, кодируемую геном cg2538 (рис. 186). В геноме С. diphtheriae ортолог гена ywjA входит в состав нерегулируемого оперона aecD-brnQ-DIP1738 {DIP1738 кодирует алканалмонооксигеназу). В геноме С. jeikeium ортологичные гены алканалмонооксигеназы и транспортера аминокислот с разветвленной цепью образуют нерегулируемые моноцистронные опероны (рис. 186).

3. Паралоги и дупликации

3.1 Выше была описана ситуация, когда в геноме С. diphtheriae появляется паралог гена cg0737 в опероне, ортологичном оперону cg0735-cg0737 С. glutamicum (рис. 18в). Кроме того, в геноме С. glutamicum произошла дупликация ортолога гена ssuD из N. farcinica, кодирующего алкансульфонат-монооксигеназу, с образованием паралогов ssuDl и ssuD2, выполняющих, вероятно, ту же функцию. Ген ssuDl входит в состав оперона ssuABC-Dl, отвечающего за утилизацию сульфонатов. Ген ssuD2 включен в оперон утилизации сульфатных эфиров seuABC-ssuD2. Оба оперона отсутствуют в других исследованных геномах, кроме N. farcinica, где, помимо белка гена ssuD, сохраняется и ортолог гена seuA, кодирующего фермент десульфуризации. Оба гена формируют оперон, в состав которого, вероятно, входит и ген fadE14, кодирующий потенциальную ацил-СоА-дегидрогеназу.

3.2) Дивергентно к оперону утилизации сульфата (cysIXHDNYZ) расположен ген cysJ/fpr2 (сульфатредуктазы), консервативный во всех исследованных геномах, несмотря на то, что основной оперон может быть полностью утрачен (рис. 18а). Необходимо отметить, что на эволюционном дереве (рис. 19) все белки, ортологичные белку CysJ, расположены на одной ветви, за исключением продукта гена fpr из L. xyli, который расположен ближе к гомологам из геномов Arthrobacter и Brevibacterium. В каждом из исследованных геномов белок Fpr представлен в виде одной копии, тогда как в геномах С. efficiens и С. glutamicum — в виде двух паралогов, fprl и frp2 (рис. 19). В каждом из двух геномов один из паралогов входит в состав дивергона утилизации сульфата, а второй формирует моноцистронный нерегулируемый оперон.

4. Горизонтальный перенос

Для уже упоминавшегося оперона утилизации сульфата (cysIHDNY) в разных частях генома N. farcinica имеются две дополнительные пары генов, ортологичных генам cysDN, кодирующим АТФ—сульфурилазу, а именно, гены cysD2-N2 и nfa33930-nfa33920. На филогенетических деревьях белков CysN (рис. 20) и CysD (рис. 21) видно, что ближайшими гомологами белков CysD2 и CysN2 у N. farcinica являются белки бактерий рода Mycobacterium; и, по всей видимости, пара генов cysD2-N2 в геноме N. farcinica появилась вследствие горизонтального переноса от других бактерий порядка Actinomycetales (вероятнее всего, от бактерий рода Mycobacterium). Аналогично, для белков, кодируемых генами nfa33930-nfa33920, ближайшими гомологами являются белки протеобактерий (рис. 20 и 21), и, скорее всего, пара генов nfa33930-nfa33920 в геноме N. farcinica также появилась в результате горизонтального переноса, но, в данном случае, из геномов протеобактерий. В обоих случаях (\cysD2-N2 и nfa33930-nfa33920) гены, по-видимому, формируют опероны. Функциональное значение существования трех копий АТФ-сульфурилазы в геноме патогенной бактерии не ясно.

Bifidobacterium longum

Rhodop seudomona s palustris

Mycobacterium tuberculosis

Frankia sp

Nocardioides sp. Mycobacterium leprae

Leifsonia xyli

Mhrobacter sp.

Streptomyces coelicolor Nocardia farcinica

Corynebacterium jeikeium

Corynebacterium diphtheriae

Corynebacterium effidens

Deinococcus radiodurans

Corynebacterium efficiens4 Corynebacterium glutamicui Cofynebaaenum glutamicum Fpr1

Fp г и его ортологи

Streptomyces avermitilis Thermobifida fusca

Рисунок 19 Филогенетическое дерево белка Fpr. Выделена ветвь, на которой находятся Fpr и его ортологи.

5. Утрата ортологов

В данной работе было показано полное отсутствие ортологов для ряда генов С. glutamicum среди близкородственных организмов:

5.1) ssuR (регулятор генов утилизации сульфонатов и сульфатных эфиров [75]),

5.2) cg3372 (белок с неизвестной функцией),

5.3) ssul(флавин-редуктаза),

5.4) гены seuBC и ssuABC, описанные выше.

Кроме того, многие ортологи были утрачены только в филогенетически более далеких геномах. Так, в геномах N. farcinica, L. xyli и S. coelicolor отсутствуют ортологи генов cysK (ацетилсеринлиаза), cysE (серинацетилтрансфераза), aecD (см. выше) и brnQ (см. выше) С. glutamicum, а также ортологи гена ywjA С. jeikeium. В далеких геномах также отсутствует ортолог гена cgl739 (см. ниже). Некоторые ортологи утрачены не только в более далеких геномах, но также в геномах С. diphtheriae и С. jeikeium— это почти все гены оперона, ортологичного оперону cg2674-2680 С. glutamicum (см. выше), и ортологи гена cg3132 с неизвестной функцией. В геномах всех далеких организмов и в С. jeikeium отсутствуют ортологи гена потенциального транскрипционного регулятора cg0156.

CysN2

Brevibaclerium linens

CysN

Nocardia farcinica Rhodococcus erythropolis Corynebacterium efficiens

Corynebacterium glutamicum

Corynebacterium jeikeium

Streptomyces coelicolor

Streptomyces avermitilis,

Shewanella putrefaciens

Vibrio choierae

Erwinia carotovora

E.coli

Rhodospiriilum rubrum ' Pseudomonas

Paracoccus denitrificans j]UOrescens Chromobactenum ^ — violaceum

Альфа-протеобактерии

Рисунок 20 Филогенетическое дерево белка CysN. Выделены ветви ортологов белков CysN и CysN2, белок Nfa33920 и его ближайшие гомологи из группы альфа-протеобактерий.

CysD

Rhodococcus erythropoSs Nocardia farcinica^

Streptomyces coeScdor Streptomyces avermibSs\

Corynebacterium glutamicum Corynebacterium effic/ens^

Co ryne ba cten um jeket urn

Brevibacterium Arthrobacter sp. linens

Bordetella pertussis Burkhddena mallei • Ralstonia eutropha

Nitrosa oceani

Franha sp ■Mycobactenum avium

Nocardioses sp. Mtrosomonas europaea -Nitmsospira multiformis f Nocardia farctnic^ Nfa33930 ePseudomonas pubda Yersinia pestis - Klebsiella emgenes

Vibno vulnificus ysD2 ч Vibrio fischen гамма-протеобактерии

Рисунок 21 Филогенетическое дерево белка CysD. Выделены ветви ортологов белков CysN и CysN2, белок Nfa33930 и его ближайшие гомологи из группы гамма-протеобактерий.

Среди более частных случаев можно упомянуть утрату ортологов генов seuA и ssuD (см. выше) во всех изученных геномах, кроме N. farcinica. Также не найдены ортологи генов metX и metY в геноме S. coelicolor, гена metB (цистатионин-у-синтаза) в геноме С. diphtheriae, гена metH (гомоцистеин-метилтрансфераза) в геномах С. jeikeium и L. xyli, генов etfAB (флавопротеин) в геноме L. xyli.

Ортологи гена metE (гомоцистеинметилтрансфераза) и оперон утилизации сульфата cysIXHDNYZ (рис. 18а) полностью утрачены в геномах С. diphtheriae и L. xyli. В состав оперона cysIXHDNYZ С. glutamicum входит ген короткого белка cysX (потенциально участвует в переносе электронов [129]), ортологи которого сохраняются в геномах С. efficiens, С. jeikeium и S. coelicolor (рис. 18а). Из геномов, сохранивших оперон утилизации сульфата, в геноме S. coelicolor отсутствуют ортологи генов cysYZ {cysY принимает участие в биосинтезе кофактора, cysZ — потенциальная сульфатпермеаза [129]), а в геноме N. farcinica отсутствуют ортологи генов cysX и cysZ.

Необходимо отметить, что утрата ортологов генов пути биосинтеза метионина в большинстве описанных случаев, по всей видимости, связана с особенностями паразитического образа жизни исследованных микроорганизмов (см. ниже).

6. Полная консервативность структуры оперона во всех изученных геномах наблюдается только в случае гена metK (аденозилметионинсинтаза), и, возможно, гена mcbR (см. ниже).

4.2.2 Исследование регуляторных сигналов

Ранее были предсказаны регуляторные мотивы перед практически всеми членами регулона McbR в С. glutamicum, и некоторые их них были подтверждены экспериментально [119]. В той же работе был определен консенсус палиндромного сайта связывания регулятора, имеющий вид TAGAC-N6-GTCTA. В настоящей работе с использованием поиска по консенсусу было подтверждено предсказание регуляторных сигналов перед ферментами, участвующими в биосинтезе метионина, а затем, на основании предсказанных и подтвержденных экспериментально сигналов, была составлена обучающая выборка и построена позиционная весовая матрица для поиска новых сайтов связывания McbR. 4.2.2.1 Исследование регуляторных сигналов в геномах рода Corynebacterium.

В геномах рода Corynebacterium проводился поиск потенциальных сайтов с весом выше порогового значения, которое было принято равным 4.1. Все найденные потенциальные сайты связывания McbR представлены в табл. 2. Лого всех потенциальных сайтов связывания регулятора McbR представлено на рис. 22.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковалева, Галина Юрьевна, Москва

1. Altschul S.F., Boguski M.S., Gish W., Wootton J.C. Issues in searching molecular sequence databases //Nat. Genet. — 1994. — Vol. 6. — P. 119-129.

2. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. — 1997. — Vol. 25. — P. 3389-3402.

3. Aravind L., Watanabe H., Lipman D.J., Koonin E.V. Lineage-specific loss and divergence of functionally linked genes in eukaryotes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2000. — Vol. 97. —P. 11319-11324.

4. Arndt K., Fink G.R. GCN4 protein, a positive transcription factor in yeast, binds general control promoters at all 5' TGACTC 3' sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.— 1986. — Vol. 83, —P. 8516-8520.

5. Azzi A., Glerum M., Koller R., Mertens W., Spycher S. The mitochondrial tricarboxylate carrier // J. Bioenerg. Biomembr. — 1993. — Vol. 25. — P. 515-524.

6. Bailey T.L., Williams N., Misleh C., Li W.W. MEME: discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs // Nucleic Acids Res. — 2006. — Vol. 34. — P. W369-W373.

7. Barne K.A., Bown J.A., Busby S.J., Minchin S.D. Region 2.5 of the Escherichia coli RNA polymerase sigma70 subunit is responsible for the recognition of the 'extended-10' motif at promoters // EMBO J. — 1997. — Vol. 16. — P. 4034-4040.

8. Beltzer J.P., Chang L.F., Hinkkanen A.E., Kohlhaw G.B. Structure of yeast LEU4. The 5' flanking region contains features that predict two modes of control and two productive translation starts//J. Biol. Chem. — 1986.— Vol. 261. —P. 5160-5167.

9. Beltzer J.P., Morris S.R., Kohlhaw G.B. Yeast LEU4 encodes mitochondrial and nonmitochondrial forms of alpha-isopropylmalate synthase // J. Biol. Chem. — 1988. — Vol. 263. —P. 368-374.

10. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Wheeler D.L. GenBank // Nucleic Acids Res. — 2003. — Vol. 31. — P. 23-27.

11. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Wheeler D.L. GenBank: update // Nucleic Acids Res. — 2004. — Vol. 32. — P. D23-D26.

12. Blaiseau P.L., Isnard A.D., Surdin-Kerjan Y., Thomas D. Met31p and Met32p, two related zinc finger proteins, are involved in transcriptional regulation of yeast sulfur amino acid metabolism // Mol. Cell. Biol. — 1997. — Vol. 17. — P. 3640-3648.

13. Blanchette M., Tompa M. FootPrinter: A program designed for phylogenetic footprinting //Nucleic Acids Res. — 2003. — Vol. 31. —P. 3840-3842.

14. Bork P., Hofmann K., Bucher P., Neuwald A.F., Altschul S.F., Koonin E.V. A superfamily of conserved domains in DNA damage-responsive cell cycle checkpoint proteins// FASEB J. — 1997. — Vol. 11. — P. 68-76.

15. Brudno M., Do C.B., Cooper G.M., Kim M.F., Davydov E., Green E.D., Sidow A., Batzoglou S. LAGAN and Multi-LAGAN: efficient tools for large-scale multiple alignment of genomic DNA//Genome Res. — 2003.—-Vol. 13. —P. 721-731.

16. Scott J.L., Geoghagen N.S., Venter J.C. Complete genome sequence of the methanogenic archaeon, Methanococcus jannaschii // Science. — 1996. — Vol. 273 — P. 1058-1073.

17. Burr Т., Mitchell J., Kolb A., Minchin S., Busby S. DNA sequence elements located immediately upstream of the -10 hexamer in Escherichia coli promoters: a systematic study // Nucleic Acids Res. — 2000. — Vol. 28. — P. 1864-1870.

18. Cerdeno-Tarraga A.M., Efstratiou A., Dover L.G. et al. The complete genome sequence and analysis of Corynebacterium diphtheriae NCTC 13129 // Nucleic Acids Res. — 2003. — Vol.31. —P. 6516-6523.

19. Chang L.F., Cunningham T.S., Gatzek P.R., Chen W.J., Kohlhaw G.B. Cloning and characterization of yeast Leu4, one of two genes responsible for alpha-isopropylmalate synthesis //Genetics. — 1984, —Vol. 108, —P. 91-106.

20. Cliften P., Sudarsanam P., Desikan A., Fulton L., Fulton В., Majors J., Waterston R., Cohen B.A., Johnston M. Finding functional features in Saccharomyces genomes by phylogenetic footprinting// Science. — 2003. — Vol. 301. —P. 71-76.

21. Cook A.M., Laue H., Junker F. Microbial desulfonation // FEMS Microbiol. Rev. — 1998. — Vol. 22. — P. 399-419.

22. Crooks G.E., Hon G., Chandonia J.M., Brenner S.E. WebLogo: a sequence logo generator//Genome Res. — 2004. — Vol. 14. —P. 1188-1190.

23. Dandekar Т., Snel В., et al. Conservation of gene order: a fingerprint of proteins that physically interact // Trends Biochem. Sci. — 1998. — Vol. 23 — P. 324-328.

24. Emanuelsson O., Brunak S., von Heijne G., Nielsen H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools // Nat. Protoc. — 2007. — Vol. 2. — P. 953-971.

25. Enright A.J., Iliopoulos I., Kyrpides N.C., Ouzounis C.A. Protein interaction maps for complete genomes based on gene fusion events // Nature. — 1999. — Vol. 402. — P. 86-90.

26. Even S., Burguiere P., Auger S., Soutourina O., Danchin A., Martin-Verstraete I. Global control of cysteine metabolism by CymR in Bacillus subtilis // J. Bacterid. — 2006. — Vol. 188, —P. 2184-2197.

27. Falco S.C., Dumas K.S., Livak K.J. Nucleotide sequence of the yeast ILV2 gene which encodes acetolactate synthase //Nucleic Acids Res. — 1985. — Vol. 13. — P. 4011-4027.

28. Felsenstein J. Inferring phylogenies from protein sequences by parsimony, distance, and likelihood methods // Methods Enzymol. — 1996. — Vol. 266. — P. 418-427.

29. Fitch W.M. Distinguishing homologous from analogous proteins // Syst. Zool. — 1970.1. Vol. 19. —P. 99-113.

30. Funke G., von Graevenitz A., Clarridge J.E. 3rd, Bernard K.A. Clinical microbiology of coryneform bacteria // Clin. Microbiol. Rev. — 1997. — Vol. 10. — P. 125-159.

31. Fuchs R.T., Grundy F.J., Henkin T.M. S-adenosylmethionine directly inhibits binding of 30S ribosomal subunits to the SMK box translational riboswitch RNA 11 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. — 2007. — Vol. 104. — P. 4876-4880.

32. Gasch A.P., Moses A.M., Chiang D.Y., Fraser H.B., Berardini M., Eisen M.B. Conservation and evolution of cis-regulatory systems in ascomycete fungi // PLoS Biol. — 2004.1. Vol.2.—P. e398.

33. Gattiker A., Gasteiger E., Bairoch A. ScanProsite: a reference implementation of a PROSITE scanning tool // Appl. Bioinformatics. — 2002. — Vol. 1. — P. 107-108.

34. Gelfand M.S., Koonin E.V., Mironov A.A. Prediction of transcription regulatory sites in Archaea by a comparative genomic approach // Nucleic Acids Res. — 2000. — Vol. 28. — P. 695-705.

35. Gerasimova A.V., Gelfand M.S. Evolution of the NadR regulon in Enterobacteriaceae // J. Bioinform. Comput. Biol. — 2005. — Vol. 3. — P. 1007-1019.

36. Graber J.H. Variations in yeasts 3'-processing cis-elements correlate with transcript stability // Trends Genet. — 2003. — Vol. 19. — P. 473-476.

37. Greene R.C. Biosynthesis of methionine // In Neidhardt F.C.(ed.) Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology. -— American Society for Microbiology. — Washington, DC, 1994. — P. 542-561.

38. Grundy F.J, Henkin T.M. The S box regulon: a new global transcription termination control system for methionine and cysteine biosynthesis genes in gram-positive bacteria // Mol. Microbiol. — 1998. — Vol. 30. — P. 737-749.

39. Grundy F.J, Henkin T.M. The T box and S box transcription termination control systems // Front. Biosci. — 2003. — Vol. 8. — P. d20-d31.

40. Hellauer K., Rochon M.H., Turcotte B. A novel DNA binding motif for yeast zinc cluster proteins: the Leu3p and Pdr3p transcriptional activators recognize everted repeats // Mol. Cell. Biol. — 1996. — Vol. 16. — P. 6096-6102.

41. Helmann J.D. Compilation and analysis of Bacillus subtilis sigma A-dependent promoter sequences: evidence for extended contact between RNA polymerase and upstream promoter DNA // Nucleic Acids Res. — 1995. — Vol. 23. — P. 2351 -2360.

42. Hinnebusch A.G.,Mechanisms of gene regulation in the general control of amino acid biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae // Microbiol. Rev. — 1988. — Vol. 52. — P. 248-273.

43. Hinnebusch A.G., Natarajan K. Gcn4p, a master regulator of gene expression, is controlled at multiple levels by diverse signals of starvation and stress // Eukaryot. Cell. — 2002.1. Vol. 1, —P. 22-32.

44. Hinnebusch A.G. Translational regulation of GCN4 and the general amino acid control of yeast // Annu. Rev. Microbiol. — 2005. — Vol. 59. — P. 407-450.

45. Hsu Y.P., Schimmel P. Yeast LEU1. Repression of mRNA levels by leucine and relationship of 5-noncoding region to that of LEU2 // J. Biol. Chem. — 1984. — Vol. 259. — P. 3714-3719.

46. Hu Y., Kohlhaw G.B. Additive activation of yeast LEU4 transcription by multiple cis elements // J. Biol. Chem. — 1995. — Vol. 270. — P. 5270-5275.

47. Hu Y., Cooper T.G., Kohlhaw G.B. The Saccharomyces cerevisiae Leu3 protein activates expression of GDH1, a key gene in nitrogen assimilation // Mol. Cell. Biol. — 1995. — Vol. 15.1. P. 52-57.

48. Huh W.K., Falvo J.V., Gerke L.C., Carroll A.S., Howson R.W., Weissman J.S., O'Shea E.K. Global analysis of protein localization in budding yeast // Nature. — 2003. — Vol. 425. — P. 686-691.

49. Hwang B.J., Yeom H.J., Kim Y., Lee H.S. Corynebacterium glutamicum utilizes both transsulfuration and direct sulfhydrylation pathways for methionine biosynthesis // J. Bacteriol.2002. —Vol. 184. —P. 1277-1286.

50. Ishikawa J., Yamashita A., Mikami Y., Hoshino Y., Kurita H., Hotta K., Shiba Т., Hattori M. The complete genomic sequence of Nocardia farcinica IFM 10152 // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. —2004. —Vol. 101. —P. 14925-14930.

51. Jacob F., Mono J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins // J. Mol. Biol. — 1961. —Vol. 3, —P. 318-356.

52. Jukes Т.Н., Kimura M. Evolutionary constraints and the neutral theory // J. Mol. Evol. — 1984. —Vol.21. —P. 90-92.

53. Kalinowski J., Bathe В., Bartels D. et al. The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome sequence and its impact on the production of L-aspartate-derived amino acids and vitamins //J. Biotechnol. — 2003. — Vol. 104. — P. 5-25

54. Kellis M., Patterson N., Endrizzi M., Birren В., Lander E.S. Sequencing and comparison of yeast species to identify genes and regulatory elements // Nature. — 2003. — Vol. 423. — P. 241-254.

55. Kertesz M.A. Riding the sulfur cycle—metabolism of sulfonates and sulfate esters in gram-negative bacteria // FEMS Microbiol. Rev. — 2000. — Vol. 24. — P. 135-175.

56. Kohlhaw G.B. Leucine biosynthesis in fungi: entering metabolism through the back door // Microbiol. Mol. Biol. Rev. — 2003. — Vol. 67. — P. 1-15.

57. Koonin E.V., Galperin M.Y. Prokaryotic genomes: the emerging paradigm of genome-based microbiology // Curr. Opin. Genet. Dev. — 1997. — Vol. 7. — P. 757-763.

58. Koonin E.V., Galperin M.Y. Sequence-Evolution-Function. Computational approaches in comparative genomics // Kluwer Academic Publishers. — Boston/Dordrecht/London, 2002.

59. Kredich N.M. Biosynthesis of cysteine // In Neidhardt F.C.(ed.) Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology. — American Society for Microbiology. — Washington, DC, 1994. — P. 514-524.

60. Krogh A., Larsson В., von Heijne G., Sonnhammer E.L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes // J. Mol. Biol. — 2001, —Vol. 305. —P. 567-580.

61. S.K., Codani J.J., Connerton I.F., Danchin A. The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis // Nature. — 1997. — Vol. 390. — P. 249-256.

62. Kyrpides N.C. Genomes OnLine Database (GOLD 1.0): a monitor of complete and ongoing genome projects world-wide // Bioinformatics. — 1999. — Vol. 15. — P. 773-774.

63. Laikova O.N., Mironov A.A., Gelfand M.S. Computational analysis of the transcriptional regulation of pentose utilization systems in the gamma subdivision of Proteobacteria // FEMS Microbiol. Lett. — 2001. — Vol. 205. — P. 315-322.

64. Lawrence C.E., Altschul S.F., Boguski M.S., Liu J.S., Neuwald A.F., Wootton J.C. Detecting subtle sequence signals: a Gibbs sampling strategy for multiple alignment // Science.1993. — Vol. 262. — P. 208-214.

65. Lawrence J.G., Roth J.R. Selfish operons: horizontal transfer may drive the evolution of gene clusters//Genetics. — 1996. —Vol. 143. —P. 1843-1860.

66. Lee H.S., Hwang B.J. Methionine biosynthesis and its regulation in Corynebacterium glutamicum: parallel pathways of transsulfuration and direct sulfhydrylation // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2003. — Vol. 62. — P. 459-467.

67. Liu Y., Liu X.S., Wei L., Altman R.B., Batzoglou S. Eukaryotic regulatory element conservation analysis and identification using comparative genomics // Genome Res. — 2004.1. Vol. 14. —P. 451-458.

68. Lupas A., Van Dyke M., Stock J. Predicting coiled coils from protein sequences // Science. — 1991. — Vol. 252. — P. 1162-1164.

69. Makarova K.S., Mironov A.A., Gelfand M.S. Conservation of the binding site for the arginine repressor in all bacterial lineages // Genome Biol. —- 2001. — Vol. 2. — RESEARCH0013.

70. Mantsala P., Zalkin H. Cloning and sequence of Bacillus subtilis purA and guaA, involved in the conversion of IMP to AMP and GMP // J. Bacteriol. — 1992. — Vol. 174. — P. 1883-1890.

71. Mattos-Guaraldi A.L., Moreira L.O., Damasco P.V., Hirata Junior R. Diphtheria remains a threat to health in the developing world — an overview // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. — 2003.1. Vol. 98. —P. 987-993.

72. Marcotte E.M., Pellegrini M., Thompson M.J., Yeates Т.О., Eisenberg D. A combined algorithm for genome-wide prediction of protein function // Nature. — 1999. — Vol. 402. — P. 83-86.

73. Marzluf G.A. Molecular genetics of sulfur assimilation in filamentous fungi and yeast // Annu. Rev. Microbiol. — 1997. — Vol. 51. — P. 73-96.

74. Mironov A.A., Koonin E.V., Roytberg M.A., Gelfand M.S. Computer analysis of transcription regulatory patterns in completely sequenced bacterial genomes // Nucleic Acids Res. — 1999. —Vol. 27.— P. 2981-2989.

75. Monteiro-Vitorello C.B., Camargo L.E., Van Sluys M.A.et al. The genome sequence of the gram-positive sugarcane pathogen Leifsonia xyli subsp. Xyli // Mol. Plant. Microb. Interact.2004. — Vol. 17. — P. 827-836.

76. Moses A.M., Chiang D.Y., Kellis M., Lander E.S., Eisen M.B. Position specific variation in the rate of evolution in transcription factor, binding sites // BMC Evol. Biol. — 2003. — Vol. 3. —P. 19.

77. Nakamura Y., Nishio Y„ Ikeo K„ Gojobori T. The genome stability in Corynebacterium species due to lack of the recombinational repair system // Gene. — 2003. — Vol. 317. — P. 149-155.

78. Oliver S.G., van der Aart Q.J., Agostoni-Carbone M.L., Aigle M., Alberghina L., Alexandraki D., Antoine G., Anwar R., Ballesta J.P., Benit P. The complete DNA sequence of yeast chromosome III // Nature. — 1992. — Vol. 357. — P. 38-46.

79. Overbeek R., Fonstein M., D'Souza M., Pusch G., Maltsev N. Use of contiguity on the chromosome to predict functional coupling // In Silico Biol. — 1999. — Vol. 1. — P. 93-108.

80. Overbeek R., Fonstein M., D'Souza M., Pusch G., Maltsev N. The use of gene clusters to infer functional coupling // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. — 1999. — Vol. 96. — P. 2896-2901.

81. Panina E.M., Vitreschak A.G., Mironov A.A., Gelfand M.S. Regulation of aromatic amino acid biosynthesis in gamma-proteobacteria // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. — 2001. — Vol.3. —P. 529-543.

82. Panina E.M., Mironov A.A., Gelfand M.S. Comparative analysis of FUR regulons in gamma-proteobacteria // Nucleic Acids Res. — 2001. — Vol. 29. — P. 5195-5206.

83. Panina E.M., Mironov A.A., Gelfand M.S. Comparative genomics of bacterial zinc regulons: enhanced ion transport, pathogenesis, and rearrangement of ribosomal proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2003. — Vol. 100. — P. 9912-9917.

84. Park S.D., Lee J.Y., Kim Y., Kim J.H., Lee H.S. Isolation and analysis of metA, a methionine biosynthetic gene encoding homoserine acetyltransferase in Corynebacterium glutamicum // Mol. Cells. — 1998. — Vol. 8. — P. 286-294.

85. Pearson W.R. Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA // Methods Enzymol.— 1990. — Vol. 183. —P. 63-98.

86. Pellegrini M., Marcotte E.M., Thompson M.J., Eisenberg D., Yeates Т.О. Assigning protein functions by comparative genome analysis: protein phylogenetic profiles // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. — 1999. — Vol. 96. — P. 4285-4288.

87. Permina E.A., Mironov A.A., Gelfand M.S. Damage-repair error-prone polymerases of eubacteria: association with mobile genome elements // Gene. — 2002. — Vol. 293. — P. 133140.

88. Petersen J.G., Holmberg S.,The ILV5 gene of Saccharomyces cerevisiae is highly expressed//Nucleic Acids Res.— 1986. —Vol. 14. —P. 9631-9651.

89. Putzer H., Condon C., Brechemier-Baey D., Brito R., Grunberg-Manago M. Transfer RNA-mediated antitermination in vitro // Nucleic Acids Res. — 2002. — Vol. 30. — P. 30263033.

90. Raushel F.M., Thoden J.B., Holden H.M. The amidotransferase family of enzymes: molecular machines for the production and delivery of ammonia // Biochemistry. — 1999. — Vol.38. —P. 7891-7819.

91. Riley M., Sanderson K.E. The bacterial chromosome // Am. Soc. Microbiol. — 1990. — P.85-95.

92. Rodionov D.A., Mironov A.A., Rakhmaninova A.B., Gelfand M.S. Transcriptional regulation of transport and utilization systems for hexuronides, hexuronates and hexonates in gamma purple bacteria // Mol. Microbiol. — 2000. — Vol. 38. — P. 673-683.

93. Rodionov D.A., Mironov A.A., Gelfand M.S. Transcriptional regulation of pentose utilisation systems in the Bacillus/Clostridium group of bacteria // FEMS Microbiol. Lett. — 2001. —Vol. 205. —P. 305-314.

94. Rodionov D.A., Vitreschak A.G., Mironov A.A., Gelfand M.S. Comparative genomics of the vitamin B12 metabolism and regulation in prokaryotes // J. Biol. Chem. — 2003. — Vol. 278. —P. 41148-41159.

95. Rodionov D.A., Vitreschak A.G., Mironov A.A., Gelfand M.S. Comparative genomics of the methionine metabolism in Gram-positive bacteria: a variety of regulatory systems // Nucleic Acids Res. — 2004. — Vol. 32. — P. 3340-3353.

96. Rodionov D.A., Gelfand M.S. Computational identification of BioR, a transcriptional regulator of biotin metabolism in Alphaproteobacteria, and of its binding signal // FEMS Microbiol. Lett. — 2006. — Vol. 255. — P. 102-107.

97. Rodionov D.A. Comparative genomic reconstruction of transcriptional regulatory networks in bacteria // Chem. Rev. — 2007. — Vol. 107. — P. 3467-3497.

98. Rost В., Yachdav G., Liu J. The PredictProtein server // Nucleic Acids Res. — 2004. — Vol. 32. —P. W321-W326.

99. Roy C.N., Andrews N.C. Recent advances in disorders of iron metabolism: mutations, mechanisms and modifiers // Hum. Mol. Genet. — 2001. — Vol. 10. — P. 2181-2186.

100. Ryan E.D., Tracy J.W., Kohlhaw G.B. Subcellular localization of the leucine biosynthetic enzymes in yeast // J. Bacteriol. — 1973. — Vol. 116. — P. 222-225

101. Ryan E.D., Kohlhaw G.B. Subcellular localization of isoleucine-valine biosynthetic enzymes in yeast // J. Bacteriol. — 1974. — Vol. 120. — P. 631-637.

102. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. — 1987. — Vol. 4. — P. 406-425.

103. Sanger F., Coulson A.R., Friedmann Т., Air G.M., Barrell B.G., Brown N.L., Fiddes J.C., Hutchison C.A. 3rd, Slocombe P.M., Smith M. The nucleotide sequence of bacteriophage cpX174 // J. Mol. Biol. — 1978. — Vol. 125. — P. 225-246.

104. Sanger F., Coulson A.R., Hong G.F., Hill D.F., Petersen G.B. Nucleotide sequence of bacteriophage lambda DNA // J. Mol. Biol. — 1982. — Vol. 162. — P. 729-773.

105. Saubolle M.A., Sussland D. Nocardiosis: review of clinical and laboratory experience // J. Clin. Microbiol. —2003. —Vol. 41. —P. 4497-4501.

106. Schell M.A. Molecular biology of the LysR family of transcriptional regulators // Annu. Rev. Microbiol. — 1993. — Vol. 47. — P. 597-626.

107. Schuler G.D., Altschul S.F., Lipman D.J. A workbench for multiple alignment construction and analysis // Proteins.— 1991. — Vol.9. — P. 180-190.

108. Sekowska A., Denervaud V., Ashida H., Michoud K., Haas D., Yokota A., Danchin A. Bacterial variations on the methionine salvage pathway // BMC Microbiol. — 2004. — Vol. 4. — P. 9.

109. Shabalina S.A., Ogurtsov A.Y., Rogozin I.B., Koonin E.V., Lipman D.J. Comparative analysis of orthologous eukaryotic mRNAs: potential hidden functional signals // Nucleic Acids Res. — 2004. — Vol. 32. — P. 1774-1782.

110. Shalgi R., Lapidot M., Shamir R., Pilpel Y. A catalog of stability-associated sequence elements in 3' UTRs of yeast mRNAs // Genome Biol. — 2005. — Vol. 6. — P. R86.

111. Shelver D., Rajagopal L., Harris Т.О., Rubens C.E. MtaR, a regulator of methionine transport, is critical for survival of group В streptococcus in vivo // J. Bacteriol. — 2003. — Vol. 185. —P. 6592-6599.

112. Sperandio В., Polard P., Ehrlich D.S., Renault P., Gu6don E. Sulfur amino acid metabolism and its control in Lactococcus lactis IL1403 // J. Bacteriol. — 2005. — Vol. 187. — P. 3762-3778.

113. Spirin V., Gelfand M.S., Mironov A.A., Mirny L.A. A metabolic network in the evolutionary context: multiscale structure and modularity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. —2006. —Vol. 103. —P. 8774-8779.

114. Sufrin J.R., Meshnick S.R., Spiess A.J., Garofalo-Hannan J., Pan X.Q., Bacchi C.J. Methionine recycling pathways and antimalarial drug design // Antimicrob. Agents Chemother. — 1995, —Vol. 39, —P. 2511-2515.

115. Tauch A., Kaiser O., Hain T. et al. Complete genome sequence and analysis of the multiresistant nosocomial pathogen Corynebacterium jeikeium K411, a lipid-requiring bacterium of the human skin flora // J. Bacteriol. — 2005. — Vol. 187. — P. 4671-4682.

116. Thomas D., Surdin-Kerjan Y. Metabolism of sulfur amino acids in Saccharomyces cerevisiae // Microbiol. Mol. Biol. Rev. — 1997. — Vol. 61. — P. 503-532.

117. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools //Nucleic Acids Res. — 1997. —Vol. 25. — P. 4876-4882.

118. Tu H., Casadaban M.J. The upstream activating sequence for L-leucine gene regulation in Saccharomyces cerevisiae //Nucleic Acids Res. — 1990. — Vol. 18. — P. 3923-39310.

119. Venter J.C., Smith H.O., Hood L. A new strategy for genome sequencing // Nature. — 1996. — Vol. 381. — P. 364-366.

120. Vickerman M.M., lobst S., Jesionowski A.M., Gill S.R. Genome-wide transcriptional changes in Streptococcus gordonii in response to competence signaling peptide // J. Bacteriol. —2007. — Vol. 189. — P. 7799-77807.

121. Wang D., Hu Y., Zheng F., Zhou K., Kohlhaw G.B. Evidence that intramolecular interactions are involved in masking the activation domain of transcriptional activator Leu3p // J. Biol. Chem. — 1997. — Vol. 272. — P. 19383-19392.

122. Watanabe H., Mori H., Itoh Т., Gojobori Т. Genome plasticity as a paradigm of eubacteria evolution // J. Mol. Evol. — 1997. — Vol. 44. — P. S57-S64.

123. Weng M.L., Zalkin H. Structural role for a conserved region in the CTP synthetase glutamine amide transfer domain // J. Bacteriol. — 1987. — Vol. 169. — P. 3023-3028.

124. Wolf Y.I., Rogozin 1.В., Kondrashov A.S., Koonin E.V. Genome alignment, evolution of prokaryotic genome organization, and prediction of gene function using genomic context // Genome Res. — 2001. — Vol. 11. — P. 356-372.

125. Zhou K., Brisco P.R., Hinkkanen A.E., Kohlhaw G.B. Structure of yeast regulatory gene LEU3 and evidence that LEU3 itself is under general amino acid control // Nucleic Acids Res. — 1987, — Vol. 15. —P. 5261-5273.

126. Zhu J., Zhang M.Q. SCPD: A Promoter Database of Yeast Saccharomyces cerevisiae // Bioinformatics. — 1999. — Vol. 15. —P. 607-611.

127. Гельфанд M.C. Цис-регуляторные структуры РНК бактерий // Молекуляр. биология. — 2006, — Т. 40. — С. 609-619.

128. Миронов А.А., Винокурова Н.П., Гельфанд М.С. Програмное обеспечение анализа бактериальных геномов // Молекуляр. биология. — 2000. — Т. 34. — С. 253-262.

129. Равчеев Д.А., Гельфанд М.С., Миронов А.А, Рахманинова А.Б. Пуриновый регулон гамма-протеобактерий. Детальное описание // Генетика. — 2002. — Т. 38. — С. 1203-1214.