Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот YddG Escherichia Coli
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот YddG Escherichia Coli"
eü'te.iot'-'-
ЦЫРЕНЖАПОВА ИРИНА СЕРГЕЕВНА
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПОРТЕРА АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОКИСЛОТ YddG ESCHERICHIA COLI
03.01.03. - Молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
- 3 ЛЕ[{ 2010
Москва - 2010
004616281
Работа выполнена в лаборатории №4 Закрытого Акционерного Общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»)
Научный руководитель:
кандидат биологических наук, доцент ЗАО «АГРИ»
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор ФГУП «ГосНИИгенетика»
доктор биологических наук, доцент Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
Ведущая организация: Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева
Защита диссертации состоится « и » декабря 2010 г. в 14— на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».
Автореферат диссертации разослан « » ноября 2010 г.
Дорошенко Вера Георгиевна
Вейко Владимир Петрович
Голденкова-Павлова Ирина Васильевна
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук
Т. Л. Воюшина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Значительные успехи последних десятилетий в производстве аминокислот связаны, прежде всего, с конструированием микроорганизмов-продуцентов методами метаболической инженерии. Такой способ конструирования включает в себя последовательное целенаправленное изменение метаболизма клетки для раскрытия ее возможностей к сверхсиптезу конкретной аминокислоты и должен быть основан на молекулярно-генетической характеристике участвующих в нем элементов.
Escherichia coli, в силу ее генетической и биохимической изученности и из-за разработанности методов манипулирования с ее геномом, является удобным микрорганизмом для рационального конструирования на ее основе штаммов-продуцентов различных биологически активных соединений и, прежде всего, аминокислот. Для последних можно не изобретать новый путь биосинтеза: клетка Е. coli синтезирует для своих нужд все 20 аминокислот. Для получения суперпродукции конкретной аминокислоты ликвидируют контролирующие элементы ее синтеза и перестраивают общий метаболизм клетки для увеличения синтеза ее предшественников. При достижении определенного уровня продукции аминокислоты актуальной проблемой становится ее транспорт из клетки. Усиление активного экспорта аминокислоты из клетки в настоящее время достигается за счет увеличения экспрессии гена аминокислотного экспортера. Несмотря на то, что в последние два десятилетия идентифицированы десятки генов, кодирующих экспортеры аминокислот у промышленно значимых бактерий Е. coli и Corynebacterium glutamicum, их детальное исследование только начинается.
В частности, объектом исследования данной работы является экспортер ароматических аминокислот YddG Е. coli. На момент начала исследования было показано, что амплификация гена yddG придает клеткам Е. coli устойчивость к ароматическим аминокислотам и их аналогам, а также увеличивает накопление ароматических аминокислот в культуральной жидкости продуцирующих их штаммов (Doroshenko et al., 2007).
Идентификация регуляторных элементов гена yddG и возможных факторов, влияющих на его экспрессию, представляла интерес и могла иметь практическое применение для оптимизации экспрессии гена yddG в штаммах-продуцентах ароматических аминокислот.
Экспортеры аминокислот относятся к интегральным мембранным белкам. Они высокогидрофобны, состоят из нескольких «-спиральных структур, которые образуют трансмембранные (ТМ) сегменты. Такие особенности мембранных белков затрудняют экспериментальный анализ их трехмерных структур, поэтому построение топологических моделей, т.е. определение количества ТМ сегментов и их ориентации в мембране является важным этапом исследования интегральных мембранных белков. К началу данной работы отсутствовали экспериментально подтвержденные топологические модели известных экспортеров аминокислот Е. coli. Таким образом, несомненный интерес представляло экспериментальное определение топологии экспортера ароматических аминокислот YddG. Полученные результаты могли быть
использованы для разработки новых стратегий оптимизации аминокислотных экспортеров в цитоплазматической мембране штаммов-продуцентов аминокислот.
Цели н задачи исследования. Таким образом, целью настоящей диссертационной работы было изучение регуляции генаyddG и характеристика YddG как интегрального мембранного белка.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Провести идентификацию промотора гена yddG-,
2. Разработать систему и исследовать регуляцию vcnzyddG in vivo',
3. Исследовать локализацию YddG в клетке;
4. Построить топологическую модель YddG.
Научная новизна и практическая ценность работы. Картирован промотор гена yddG, исследована экспрессия этого гена in vivo в различных условиях культивирования. Ген yddG экспрессируется в клетках Е. coli MG1655 на низком уровне, что следует как из анализа его регуляторной области, так и из тестирования активности LacZ для гибридного гена yddC-lacZ. Увеличение экспрессии гена yddG наблюдалось в условиях, приводящих к замедлению роста клеток Е. coli. Неблагоприятные или стрессовые условия, замедляющие рост культуры, индуцировались такими факторами, как ингибирующие концентрации фенилаланина, NaCl или сахарозы в среде. Экспрессия yddG в этих условиях не зависела от as-PHK полимеразы.
С помощью сконструированных гибридных белков YddG-LacZ и YddG-ZsGreen экспериментально доказана локализация YddG в цитоплазматической мембране Е. coli. Построена топологическая модель YddG. Экспериментально показано наличие у YddG 10 TM и расположение N- и С-концов в цитоплазме. С помощью флуоресцентной микроскопии установлено, что YddG локализуется на полюсах клетки.
В результате замены природной регуляторной области yddG на эффективную регуляторную область оптимизирована экспрессия гена yddG в клетках продуцентов фенилаланина. Генетические конструкции с повышенной экспрессией гена yddG введены в штаммы-продуценты ароматических аминокислот, которые используются в биотехнологическом производстве.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК, и 1 патентная заявка.
Материалы диссертации докладывались на конкурсе работ сотрудников ЗАО «АГРИ» (июнь 2007), были представлены на IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008) и Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008).
Диссертация апробирована на совместном заседании секций «Молекулярная биология» и «Генетика микроорганизмов» Ученого совета
ФГУП «ГосНИИгенетика» и Научно-технического совета НИИ «Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ») 5 октября 2010 г.
Благодарности. Автор искренне признателен к.б.н. Айрих Л.Г. за сотрудничество и практическую помощь в методологии исследования YddG. Автор благодарит д.б.н., проф. Миронова A.C. (ФГУП «ГосНИИгенетика») за оказанное содействие в постановке экспериментов по определению стартовой точки транскрипции; д.б.н., доцента Феофанова A.B. и Воронцову О.В. (Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова) за помощь при проведении флуоресцентной микроскопии клеток Е. coli. Автор признателен также к.б.н. Казаковой С.М. и Кулагиной Ю.В. (ЗАО «АГРИ») за содействие в проведении культивирований штаммов-продуцентов в ферментерах.
Особую благодарность автор выражает своему руководителю к.б.н., доценту Дорошенко В.Г., а также д.б.н., проф. Машко C.B., способствовавшему выполнению данной диссертационной работы.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на -iOf страницах, включая Я рисунков и /¿ таблиц. Список литературы содержит 240 цитируемых источников, в том числе 9 на русском языке.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальные штаммы и среды. Все штаммы Е. coli, использованные в работе, были получены на основе MG1655 (F", X, rph-\) или BW25113 (tact1 ггпВт\4 lacZv/ue hsdR514 AaraBA-DAUiJ ArhaBADum). Штаммы выращивали lia средах известного состава {Sambrook and Russell, 2001): LB, SOB или минимальной среде М9 с глюкозой (0.4%) или глицерином (0.8%) в качестве источников углерода и добавлением при необходимости L-аминокислот (5 мМ). Для плотных сред использовали агар (1.5%). Антибиотики добавляли в концентрациях (мкг/мл): хлорамфеникол (Cm) - 25, ампициллин (Ар) - 100, тетрациклин (Тс) -12.5.
Конструирование штаммов. Все модификации (делеции, инсерции, замены) хромосомы были выполнены прецизионно с помощью Red системы фага X (Datsenko and Wanner, 2000) и удаляемого in vivo маркера CmR (ген cat), находящегося в составе фрагмента XattL-cat-XattR (Doroshenko et al., 2007). При делетировании генов сохраняли рамку считывания.
Этапы получения гибридного гена yddG '-lacZ схематично представлены на Рис. 1. В клетки MG1655A/acZ \\-yddG интегрировали ¡acZ таким образом, что в полученной конструкции гибридного гена yddG'-lacZ к первым 15 нуклеотидам yddG была присоединена последовательность lacZ без ATG-кодона. Для отбора клонов, содержащих интегрированные в хромосому фрагменты, использовали как маркер CmR, так и ген левансахаразы Bacillus
subtilis sacB. Последний маркер, ген которого находился под контролем промотора лактозного оперона Е. coli (Р/ас), позволял отбирать замещающие его целевые фрагменты ДНК на среде с сахарозой (20%).
yddj yddL
narU yddK yddG IdnG tdnH fdnl
——I <X и^1-✓O"
Хромасома MG1655i/acZ г*""
| yddG Pi attL cal attRj
Э '
./ \
i \ yddG'-lacZ \
б ,*<Z Фк
/' attB
,/ \
yddG'-lacZ sacB caf"'...
В <..............I-
narüyddJ yddK yddL) yddG4acZ | IdnG fdnH fdnl
Хромосома MG1655AlacZ yddG'-lacZ
Рис. 1. Схема получения гена гибридного белка YddG-LacZ в хромосоме Е. coli: а. Замещение регуляторной области гашyddG на Pl-RBS/„cz; б. Замещение гена yddG на yddG'-lacZ; в. Интеграция cat-sacB вместо QttB'Р^, селекция колоний CmR; г. Замещение cat-sacB на исходную регуляторную область yddG, отбор колоний на среде с сахарозой.
Условия культивирования и определение фенилаланина в культуралышй жидкости. Аэробное культивирование штаммов-продуцентов фенилаланина проводили в ферментерах Biostat Q (1 л, BBI, Германия) в 0.3 л среды: 50 г/л глюкозы, 0.6 г/л (NH4)2S04, 0.6 г/л КН2Р04, 10 мг/л FeS04, 10 мг/л MnS04, 2 г/л дрожжевого экстракта и 125 мг/л тирозина. Клетки культивировали при 37°С, уровень рН 6.7 поддерживали добавлением NH4OH. Посевные культуры (0.03 л) выращивали в 0.75 л колбах в среде LB с перемешиванием (240 об/мин). Концентрацию фенилаланина в культуральной жидкости определяли с помощью ВЭЖХ.
Культивирование в пробирках штаммов-продуцентов фенилаланина проводили аэробно (240 об/мин) при 34°С в течение ~26 ч (до истощения глюкозы) в среде следующего состава: 40 г/л глюкозы, 2 г/л дрожжевого экстракта, 16 г/л (NH4)2S04, 0.6 г/л КН2Р04, 10 мг/л FeS04, 8 мг/л MnS04, 30 г/л СаСОз и 125 мг/л тирозина. Концентрация фенилаланина в среде определялась с помощью тонкослойной хроматографии.
Конструирование рекомбинантных плазмид. Для определения стартовой точки транскрипции ген yddG с собственной регуляторной областью (280 п.н.) клонировали в многокопийной плазмиде pMDV3 (репликон pUC). Фрагмент ДНК для клонирования получали с помощью ПЦР, используя в
качестве матрицы хромосомную ДНК штамма MG1655 и специально сконструированные праймеры. Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды, были устойчивы к L-фенилаланину (30 мг/мл).
Для получения плазмиды pMWI 18-tyrR (репликон pSCIOl) ген lyrR с собственной регуляторной областью (150 п.н.) амплифицировали с помощью ПЦР с хромосомной ДНК штамма MG1655.
Для получения плазмиды pBRyddG-bfaM ген гибридного белка Р¡ac-yddG-ЫаМ клонировали в pBR322. Предварительно фрагмент ДНК Рhc-yddG-blaM был сконструирован с помощью перекрывающейся ПЦР. Фрагменты ДНК, содержащие полноразмерный ген yddG или промотор Р/ао амплифицировали с хромосомной ДНК штамма MG1655. Фрагмент ДНК, содержащий ген ЫаМ, а также ген ZsGreen (см. ниже) амплифицировали с ДНК плазмиды pZsGreen (Clontech).
Для конструирования плазмид pBRyddG'-ЫаМ, содержащих укороченные варианты гена yddG, между генами yddG и ЫаМ на плазмиде pBRyddG-blaM были предусмотрены сайты рестрикции Nco\ и Sacl. Для получения таких плазмид ДНК pBRyddG-blaM обрабатывали рестриктазами Nco\ и Sacl, в результате чего между генами yddG и ЫаМ образовывался разрыв с 5'- и 3'-выступающими концами ДНК. Далее использовали эндонуклеазу 111, которая гидролизовала одну цепь ДНК только с 5'-выступающего конца. Чтобы получить различные делеционные варианты, отбирали аликвоты с интервалом 45 сек (при 30°С), обрабатывали S1 нуклеазой и проводили достройку выступающих концов ДНК с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli и лигирование.
Для конструирования плазмид pBRyddG-ZsGreen, в которых варианты кодирующей области yddG заданной длины были соединены с полноразмерным ZsGreen, фрагменты ДНК Р ¡aç-yddG'-ZsGreen получали с помощью перекрывающейся ПЦР.
Структуры всех полученных плазмид были подтверждены с помощью секвенирования.
Манипуляции с ДНК и РНК, включая определение стартовой точки транскрипции (primer extension) проводили согласно руководству (Sambrook and Russell, 2001). Концентрацию РНК определяли, измеряя отношение абсорбции при 260/280 нм.
Определение активности ß-галактозндазы проводили с использованием О-нитрофенил-р-О-галактопиранозида (Sigma) в качестве субстрата (Миллер, 1976). Измеренная активность клеточных экстрактов приведена в единицах Миллера (ЕМ).
Определение устойчивости клеток TGI (pBRyddG'-blaM) к ампициллину. Клетки выращивали в среде LB до середины логарифмической фазы (Зх108 кл/мл), затем отмывали свежей средой и высевали на агаризованную среду LB, содержащую 0, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 мкг/мл Ар и 1 мМ ИПТГ (100-400 клеток на чашку).
Измерение флуоресценции. Флуоресценцию клеток штамма Е, coli TGI (pBRyddG'-ZsGreen) определяли, выращивая клетки в среде LB до середины логарифмической фазы (3x108 кл/мл) в присутствии 1 мМ ИПТГ. Измерение
флуоресценции белка ZsGreen проводили с помощью спектрофлуорофотометра Synergy 2 (BioTek Instruments, Inc., USA).
Выделение фракции мембранных белков. Мембранные фракции выделяли согласно протоколу Rouanet & Nasser (2001). Для растворения полученных мембранных белков добавляли Triton Х-100 до концентрации 2% и инкубировали 1 ч при 4°С. Концентрацию белка определяли по Bradford (1976).
Иммуноблоттинг. Белки разделяли в 0.1% ДСН - 12% ПААГ и переносили на PVDF-мембрану с помощью Trans-Blot SD semidry transfer cell (Bio-Rad). В качестве первичных антител использовали мышиные анти-ß-лактамазные (Abeam) и анти-RCFP (Clontech) антитела. В качестве вторичных антител использовали анти-мышиные и анти-кроличьи коньюгаты с щелочной фосфатазой (Sigma) соответственно.
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Микрофотографии клеток штамма Е. coli TGI были получены с помощью микроскопа LSM510 МЕТА (Carl Zeiss) с водно-иммерсионным объективом бЗх/1.2 NA C-Apochromat. Флуоресценция детектировалась с помощью оптического ответвителя HFT UV/488/543/633 через фильтр LP505.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Изучение регуляции генаyddG
1.1. Картирование промотора гена yddG
Картирование промотора и определение старта транскрипции yddG было проведено методом «удлинения олигонуклеотидной затравки» (primer extension). Синтезированную в клетках РНК выделяли из логарифмически растущих бактерий штамма TGI (pMDV3-^cWG) и использовали ее для определения старта транскрипции. В соответствии с полученными экспериментальными данными (Рис. 2 а) старту транскрипции (+1) соответствовал Т в положении «-36» относительно предполагаемого ATG-кодона yddG. Относительно точки «+1» были обнаружены близкие к каноническим области «extended-!0» и «-35» с расстоянием между этими участками 18 нуклеотидов.
Анализ регуляторной области yddG позволил предположить низкую эффективность экспрессии этого гена и накопление небольших количеств соответствующего белкового продукта в клетке. Действительно, 1) в районе старта расположено два нуклеотида Т подряд, что могло приводить к снижению эффективности инициации и появлению транскриптов, несущих дополнительную гомополимерную структуру случайной длины на 5'-конце молекулы мРНК («слиппадж-эффект») (Xiong and Reznikoff, 1993). Этот эффект, действительно, наблюдался экспериментально. На электрофореграмме выше зоны основного транскрипта были видны дополнительные минорные зоны (Рис. 2 б). 2) Перед инициирующим кодоном yddG на допустимом расстоянии присутствовал лишь динуклеотид AG, способный выполнять функцию SD-последовательности (для генов К coli более характерна SD длиной от 3 до 9 нуклеотидов (Lewin, 2004)), что позволяло предполагать низкую эффективность инициации трансляции yddG.
Румо ::attB cgctcaagttagtataaaaaagcaggcttca
(-35 -ID ')
gcggtagaaaaacgcaccactgccrGACAggccagttaaaaaaafgc ТА TAAaattca SD
gcTtaatttttaacggcaagagagacaaaacagcgagcATGacacgacaaaaagcaacgc
С T A G / J 4
Рис. 2 а. Регуляторная область remyddG. Жирным шрифтом обозначены: «-10» и «-35» участки, старт транскрипции, SD-последовательность, ATG-кодон. Над последовательностью показана область, замещенная на attB, при делегировании промотора Р^ио-; б. Определение сайта инициации транскрипции методом «удлинения олигонуклеотидной затравки». кДНК синтезирована на основе препарата РНК, взятого в концентрации 1, 2, 3, 4 мкг/мкл (дорожки 1, 2, 3, 4 соответственно).
1.2. Получение гена гибридного белка YddG-LacZ в хромосоме Е. coli
Для исследования экспрессии гена yddG in vivo в месте его природной локализации в хромосоме Е. coli осуществили конструирование гена гибридного белка - YddG-LacZ. Первоначально предполагалось интегрировать lacZ вместо дистальной части гена yddG (после 15 нуклеотида) непосредственно в клетках MG1655A/acZ с последующим отбором колоний, растущих на минимальной среде с лактозой в качестве единственного источника углерода. Однако, селективно отобрать такие колонии не удалось. Предполагая, что они могли не образоваться из-за низкого уровня экспрессии yddG'-lacZ под контролем промотора интеграцию повторили в штамме MG1655A/úrcZ Pl-RBS/acZ-yddG. Требуемая конструкция была отобрана и получен штамм MG1655Д/acZ PL-~RBSiacryddG '-lacZ (Рис. 1 а, б).
Далее регуляторная область PL-RBS/acz была замещена на фрагмент ДНК, содержащий гены caí (CmR) и sacB, кодирующий левансахаразу Bacillus subtilis (Рис. 1 в). В этом случае устойчивость к хлорамфениколу, кодируемая первым геном, использовалась для селекции интеграции фрагмента, а второй ген - для последующего удаления фрагмента в результате контрселекции клеток, сохраняющих ген sacB в хромосоме при росте на среде с 20% сахарозой. В
результате последующей интеграции фрагмента ДНК, содержащего Ру,ис„ был сконструирован штамм М01655Д 1а& ус1сЮ'-1ас2, содержащий ген гибридного белка на месте ус1сЮ дикого типа (Рис. 1 г). Штамм М01655Л/<яс2 ус1сЮ '-1ас2, несмотря на тестируемую активность р-галактозидазы ~100 ЕМ (см. ниже), не рос на среде с лактозой в качестве единственного источника углерода.
1.3. Активность промотора yddG in vivo при росте штамма MG1655 älacZ yddG'-lacZ на лабораторных средах LB и М9
Экспрессия yddG '-lacZ была проанализирована с помощью определения активности ß-галактозидазы при росте клеток MG1655AlacZ yddG'-lacZ в LB и М9 с добавлением глюкозы и глицерина. В качестве контрольного штамма в этих экспериментах использовали MG1655A/ac/ Р¡acrlacZ, в котором в результате делеции гена lacl и регуляторной области гена lacZ кодирующая область lacZ была подставлена под конститутивный промотор гена lacl, активность которого зависела только от уровня РНК-полимеразы в клетке (Lewin, 2004). Штаммы по ростовым характеристикам не отличались друг от друга (Рис. 3 а).
Активность ß-галактозидазы не зависела от фазы роста (Рис. 3 б). Исследованные штаммы отличались соотношениями этих активностей на разных средах. Тем не менее, различия в активностях для обоих штаммов на разных средах составляли не более 40%, поэтому можно было сделать вывод о конститутивной экспрессии yddG в тестированных условиях.
а.
б.
МО 1655Д lacZ yddG'-lacZ
MG1655A/acI P,,„,-lacZ
-а л 100
н о о f> СЗ 3 80
S S го С и 60
н * « 40
< с; я и 20
ca. о
120 100 80 60 40 20 0
Время, ч
Время, ч
Рис. 3. Активность Р-галактозидазы при росте клеток ЫG\в55MacZyddG'-lacZ и М01б55Д/ас/ Рк,сГ1ас2 на средах ЬВ (♦), М9 с глюкозой (■) или глицерином (ж): а. Оптическая плотность; б. Относительная активность р-галактозидазы (%). 100% активности для ЫGШ'Ьb,lacZ yddG'-lacZ и МС1655Д/ас/ Р,асГ1асг соответствует 120 ЕМ и 500 ЕМ. Здесь и далее приведены средние результаты трех опытов, доверительные интервалы не превышают 5%.
Для подтверждения того, что экспрессия yddG'-lacZ происходит с идентифицированного промотора Рyjja, он был прецизионно делетирован в штамме MG1655A/acZ yddG'-lacZ (Рис. 2 а). В клетках нового штамма MG1655AlacZ APyjjG-yddG'-lacZ, выращенных на средах LB, М9 с глюкозой или глицерином, активность ß-галактозидазы была ниже порога регистрации (<10 ЕМ).
1.4. Изучение влияния транскрипционного регулятора CRP на экспрессию yddG'-lacZ
Как было установлено выше, экпрессия yddG'-lacZ, выраженная в активности ß-галактозидазы, была выше на среде с глюкозой (Рис. 3), следовательно, комплекс cAMP-CRP мог участвовать в регуляции экспрессии гена yddG. Для проверки этого предположения мы сравнили активности ß-галактозидазы в штамме MG1655A/acZ yddG'-lacZ и его Асгр и Дсуя/1-вариантах (Рис. 4). В обоих мутантах наблюдалось небольшое снижение активности LacZ (-20%). Кроме того, при добавлении в среду культивирования штамма MG1655AlacZ yddG'-lacZ АсуаА (не способного образовывать сАМР) 10 мМ сАМР активность LacZ не изменялась. Следовательно, был сделай вывод, что ген yddG не находится под контролем глобального регулятора CRP.
Рис. 4. Активность ß-галактозидазы (ЕМ) при роете MG1655AlacZ yddG'-lacZ (к) и его Асгр и ДсуоЛ-производпых на среде LB.
к Асгр АсуаА АсуаА+сАМР
1.5. Изучение влияния глобального регулятора Lrp на экспрессию
yddG'-lacZ
Для генов rhtB, rhtC, lenE, кодирующих другие известные экспортеры аминокислот Е. coli, была показана зависимость их экспрессии от глобального регулятора Lrp (Закатаева и др., 2006). Для исследования влияния Lrp на экспрессию yddG мы сравнили активности (3-галактозидазы в штамме MGX655 AlacZ yddG '-lacZ и его Д/гр-вариаптс (Рис. 5).
Известно, что экспрессия ранее исследованных генов, кодирующих экспортеры аминокислот, снижалась или увеличивалась в //-//-мутантах в несколько раз (Кутукова и др., 2005; Kutukova е! а!., 2005). Активность р-галактозидазы в наших lrp+ и lrp' штаммах существенно не изменилась (Д ~ 5%). Добавление в среду лейцина - эффектора Lrp, который мог бы усилить или ослабить эффект Lrp, не оказало влияния на активность репортерного белка. Следовательно, белок Lrp не участвует в регуляции гена yddG.
5 ш 100
Л н о 3 м ез 80
о X S 60
m ?>
S о
Ё 40
< га
§ 20
и
cL п
к + 5мМ Leu
ДIrp + 5мМ Leu
Рис. 5. Активность р-галактозидазы (ЕМ) при росте М01655Д/яс2 уйсЮ '-1ас2 (к) и его Д//-/>-производного на среде М9 с глюкозой без Ь-лейцина и в его присутствии. Черные, серые и белые столбцы -3,6, 8 часов.
1.6. Экспрессияу(ШС при росте Маб55А1ас2у(1(1С-1асЯв присутствии некоторых аминокислот
С целью выявления индуктора экспрессии гена ус1сЮ анализировали влияние добавления аминокислот в среду М9, использованную для роста клеток М01655Д/яс2 ус1сЮ'-1ас2, на активность р-галактозидазы. В качестве контроля использовали штамм М01655Д/яс/ Р 1асг1ас2 с конститутивным синтезом Ьасг (Рис. 6).
5? 140
ci
Л
В
120 100 80 60 40 20
Й-1 лД
«ñí й
< М9 Phe Met Туг Trp Ala Ser Glu Leu
Рис. 6. Активность р-галактозидазы клеток MG1655A/acZ yddG'-lacZ и MG1655A/ac/ РiacrlacZ (серые и белые столбцы соответственно) при культивировании в среде М9 с глюкозой в присутствии L-аминокислот (5мМ). 100% активности для MG1655A/acZ yddG'-lacZ и MG1655A/ac/ РhcrlacZ соответствует 120 и 260 ЕМ.
Активность Р-галактозидазы для yddG'-lacZ увеличивалась только в присутствии фенилаланина на -15%, и метионина - на -10%. Для уточнения этих результатов активность р-галактозидазы была проанализирована в динамике при росте клеток обоих штаммов на среде М9 с фенилаланином или метионином и без них. (Рис. 7, 8).
Время, ч Время, ч
Рис. 7. Активность р-галактозидазы (%) при росте МО\655Мас7ус!с10'-!ас2 (а) и М01б55Д/ас/ ?1асГ1ас2 (б) на среде М9 с глюкозой. Светлые символы -оптическая плотность, черные символы - активность (3-галактозидазы: (■) - без добавок, (а) - в присутствии 5мМ Ь-фенилаланина. 100% активности для МО\655А1асгус1сЮ'-1ас2нМО\655Ыас1?,асг1асгсоответстует 120 и 260 ЕМ.
Как видно из Рис. 7, добавление фенилаланина в среду замедляло рост (ц) обоих штаммов с 0.4 ч'1 до 0.3 ч'1. На этом фоне активность р-галактозидазы М01655Д/ас/ Р¡асг1ас1 оставалась практически неизменной, в то время как для УГС1655Д/ас2 ус1с1С '-¡ас2 она была достоверно выше в присутствии фенилаланина на этапе поздней логарифмической фазы роста клеток. Добавление метионина увеличивало активность р-галактозидазы как в штамме ¡\iG\655AlacZус1сЮ'-1ас2, так и в контрольном штамме М01655Д/ас/ Р 1асГ1ас2, но на меньшую величину ~10%. Возможно, эффект добавления метионина был вызван глобальным перераспределением молекул РНК-полимеразы в клетке.
а. 4,5
4
3,5
о 3
о ю 2,5
D 2
О 1.5
0,5
0
4 8 12 16
Время, ч
МО
120 '
100 ¡2 О
80 О
JS
< 5
"•4.5 4 3,5 О з g 2.5
8 2 ° 1,5 1
0.5 0
Время, ч
140 120
12 16 20 24
£ 2 b и
i я < 2
Рис. 8. Относительная активность ß-галактозидазы (%) при росте MGl655A/acZ yddG'-lacZ (а) и MG1655A/ac/ ?klcrlacZ (б) на среде М9 с глюкозой. Светлые символы - оптическая плотность, черные символы - активность ß-галактозидазы: (ш) - без добавок, (ж) - в присутствии 5 мМ L-метионина. 100% активности для MG1655A/acZ yddG'-lacZ и М01655Д/ас/ ?кюГ1ас2 соответствует 120 и 260 ЕМ.
1.7. Изучение влияния TyrR на экспрессиюyddG'-lacZ
Посредником влияния фенилаланина на экспрессию гена yddG мог быть регулятор синтеза ароматических аминокислот - TyrR. Для выяснения роли TyrR в регуляции экспрессии гена yddG сравнили активности [3-галактозидазы в штамме MG1655A/acZyddG'-lacZ и его ДГугЛ-варианте (Рис. 9 а, б). Активность была одинаковой (-120 ± 5 ЕМ), но только в штамме MG1655AlacZ yddG'-lacZ она увеличивалась в присутствии 5 мМ фенилаланина (145 ± 5 ЕМ). Отсутствие эффекта добавления фенилаланина в штамме ДtyrR могло указывать на прямое участие TyrR в регуляции транскрипции yddG. Предполагая, что это влияние может быть усилено за счет амплификации гена tyrR, специально сконструированную плазмиду pMWl\8-tyrR, трансформировали в штамм MG1655AlacZ yddG'-lacZ. Однако, активность р-галактозидазы практически не изменилась (-150 ЕМ) (Рис. 9 в), тогда как трансформация плазмидой pMWl 18-tyrR штамма MG\655&!acZyddG '-lacZ AtyrR привела к повышению активности Р-галактозидазы по сравнению со штаммом, содержащим pMW118.
Как видно из Рис. 9, добавление фенилаланина замедляло рост штаммов TyrR , но не TyrR". Возможно, влияние добавления фенилаланина на экспрессию yddG могло быть обусловлено возникновением общей стрессовой ситуации в клетке, приводящей к замедлению скорости роста.
Рис. 9. Относительная активность Р-галактозидазы (%) при росте М01655Д/яс7 yddG'-lacZ (а), МО\655Масг yddG'-lacZ Д¡угИ (б) и М01655А1асг yddG'-lacZ (рМ\У118-/угД) (в) на среде М9 с глюкозой. Светлые символы - оптическая плотность, черные символы - активность р-галактозидазы: (■) - без добавок, (ж) - в присутствии 5мМ Ь-фенилаланина. 100% активности соответствует 120 ЕМ.
1.8. Влияние скорости роста клеток на экспрессию уй<Ю
Предположение о влиянии ингибирования роста, обусловленного стрессовым воздействием, на экспрессию ус!сЮ было проверено путем добавления в среду культивирования высоких концентраций КтаС1. Действительно, в среде ЬВ + 0.6 М ЫаС1 (ц = 0.42 ч"1) наблюдалась повышенная ~ в 2 раза, по сравнению со средой ЬВ (ц = 0.8 ч'1), экспрессия ус1сЮ '-¡ас! в штамме MG1655Д/acZ_^>fiWG '-1ас2 (Рис. 10 а). В то же время добавление ЫаС1 в среду М9 увеличивало уровень экспрессии ускЮ'-Ьс! в этом же штамме всего на 20% (Рис. 10 б). Влияние стресса, приводящего к снижению скорости роста, на экспрессию уйсЮ было исследовано на среде с высоким содержанием сахарозы. При выращивании штаммов \\G\655L\lcicZyddG '-1асгА и МС1б55Д/«с/ Р¡асг1ас2 на среде ЬВ в присутствии 30% сахарозы скорости роста обоих штаммов одинаково снижались по сравнению с ростом на среде ЬВ, с 0.8 ч"1 до 0.24 ч'1. При этом активность Р-галактозидазы в клетках МС1655Д !acZ yddG'-
lacZ увеличивалась в ~5 раз, а в штамме МС1655Д/ас/ РillcrlacZ -(Рис. 11).
в -2.5 раза
w 160
140 Й 120 § 100 Д 80 2 ет
га 40
Sä' 20 * 0
б.
4,5 180
4 W 160
3.5 3 § л н и 3 я 140 120
2,5 ^О о ч 100
2 S in 80
о 3 о
1.5 ё £ 60
1 0,5 < 03 U. 40 20
0 со. 0
NaCl
WI
' с о
Время, ч Время, ч
Рис. 10. Влияние добавления №С1 на уровень экспрессии гена yddG при росте М01655ДIacZ yddG'-lacZ на средах ЬВ (а) и М9 с глюкозой (б). Столбцы -активность Р-галактозидазы (ЕМ): белые - без добавок, серые - в присутствии 0.6 М №С1; линии - оптическая плотность: (■) - без добавок, (а) - в присутствии 0.6 М ЫаС1.
4 6
ьремя, ч
Рис. 11. Влияние добавления 30% сахарозы на уровень экспрессии гена yddG при росте штаммов MG1655A/acZyddG'-lacZ (а) и MG1655A/ac/ Pklcr!acZ (б) на среде ЬВ. Столбцы - активность р-галактозидазы (%): белые - без добавок, серые — в присутствии 30% сахарозы; линии - оптическая плотность: (■) - без добавок, (а.) - в присутствии 30% сахарозы. 100% активности для MG1655A/acZ yddG'-lacZ и MGI 655Д/ас/ VlacrlacZ соответствует 70 и 560 ЕМ.
Таким образом, при снижении скорости роста клеток, обусловленном стрессовым воздействием, наблюдалось возрастание активности репортера.
1.10. Экспрессия yddG'-lacZ в штаммах RpoS+ и RpoS"
Известно, что при снижении скорости роста в клетках Е. coli накапливается as (Lange and Hengge-Aronis, 1991). Возможно, возрастание уровня экспрессии гена yddG при снижении скорости роста связано с тем, что в этих условиях транскрипция осуществляется комплексом РНК полимеразы с as. Для проверки этого предположения был сконструирован штамм MG1655AlacZ yddG'-lacZ ArpoS. Однако, кинетика активности ß-галактозидазы в обоих штаммах при замедлении скорости роста, обусловленном стрессовым воздействием, а именно добавлением в среду L-фенилаланина или 0.6 М NaCl не отличалась друг от друга. Вероятно, повышение уровня экспрессии при снижении скорости роста не связано с участием а8-субъединицы РНК-полимеразы.
2. Структурные исследования YddG как интегрального мембранного
белка
2.1. Топологическая модель YddG, предлагаемая в экспериментах in
silico
Первичной характеристикой мембранного белка является его гидрофобный профиль, определяемый, в частности, с помощью алгоритма Kyte & Doolittle (1982) (Рис. 12).
Номер аминокислотного остатка
Рнс. 12. Профиль гидрофобности белка YddG «с окном в 9 а.о.».
Топологическая модель YddG, рассчитанная на основе доступных через Интернет компьютерных программ (TopPredlI (Claros and von Heijne, 1994), TMHMM 2.0 (Krogh et al., 2001), TM Finder (Deber et al., 2001), TMpred СHoffman and Stoffel, 1993), SOSUI (Hirokawa et al., 1998), TOPCONS (Bernsei et al., 2009)), состояла из 9 или 10 TM сегментов (Рис. 13).
Различия в предсказании количества ТМ сегментов касались С-концевой части белка (после 240 а.о.). Таким образом, по предсказаниям in silico YddG состоял из 9 или 10 ТМ сегментов.
[Val21|-> |Gly30|—> | Tyr411—>
Номер AO 1 10
TopPredll MTRgKÄTi.ICH.TAtVI.WÜTMl'ÜI.TBGVKF.ir.ni-vrUÄAAr
TM FINDER
TOPCONS -----Ш
Номер ТМ сегмента
|Туг85[—> [Glu94|
50 60 70 80
SI,SGLLLifTVGFFRIR9IPKGXLLAGSLbE'VS;YEICLftl,SI.G-
AATHHQAI] .VGMVN7 LWPS LT IL FAIL
f;sig&||Pro6il->
____-
|Gly142|-»|Asp146|-> | llel48 [->
Номер АО
TopPredll
TMPRED
TM FINDER
SOSUI
TMHMM
TOPCONS
----------------
[Glu94|-» IV |ZsGreen| |Gln206|—>|Lys218|—>f Bla |
120 130 Х«о
Номер TM cer |gpt7]_>
}ZsGfeen|
Номер AO
TopPredll
TMPRED
TM FINDER
SOSUI
TMHMM
TOPCONS
ri/;:- AYAAWm'GI ¡APLSF: iSfgALMVCGGSLLCWLATRRlj
ШмИКШ
[l^eu238j-> [Tyr2SQ|j->
VIII 1ЯШ-»[Р№2531-» J
¡в1у2ЭЗ|—> ¡гэвгееп |
Номер ТМ сег
Рис. 13. Предсказание топологии YddG с использованием компьютерных программ. Серые прямоугольники соответствуют ТМ сегментам, места «слияния» с репортерными белками В1аМ и 2$Сгееп обозначены сплошной и пунктирной линиями соответственно.
2.2. Конструирование и анализyddG'-blaM гибридов
Картирование сегментов YddG, локализующихся в периплазме, проводили с помощью получения гибридов YddG с ß-лактамазой, кодируемой геном ЫаМ. ß-лактамаза придает клеткам высокую устойчивость к ампициллину только при локализации в периплазме.
Для конструирования, так называемых, «случайных» гибридов yddG'-bla, первоначально получили плазмиду pBRyddG-blaM. С этой целью в вектор pBR322 под контролем Р/ас промотора клонировали ген yddG (без стоп-кодона) таким образом, чтобы он образовал трансляционный гибрид с геном ЫаМ (без лидерной последовательности). В присутствии ИПТГ в среде культивирования (от 0.1 до 1 мМ), эта рекомбинантная плазмида сообщала штамму Е. coli TGI устойчивость к Ар (до -10 мкг/мл) и к фенилаланину (до 20 мг/мл). Повышенная устойчивость к фенилаланину свидетельствовала о функциональной активности YddG, как экспортера ароматических аминокислот {Dowshenko et al., 2007). В то же время наблюдавшийся низкий уровень устойчивости клеток к Ар мог свидетельствовать о цитоплазматической локализации BlaM, прикрепленного к С-концу полноразмерного белка YddG. Таким образом, эти результаты согласовывались с полученными ранее данными о цитоплазматической локализации С'-конца YddG (Rapp et al., 2004).
Структурную часть гена yddG укорачивали на плазмиде pBRyddG-blaM случайным образом, как описано в Материалах и Методах. Полученные in vitro рекомбинантные плазмиды были трансформированы в клетки Е. coli TGI и отобраны независимые клоны на среде с Тс. В результате из 500 TcR клонов, выросших на агаризованной среде LB, содержащей 1 мМ ИПТГ и 50 мкг/мл Ар, было отобрано около 100 ApR клонов. Известно, что клетки, содержащие функциональную ß-лактамазу в периплазме растут при 50 мкг/мл Ар (Rouanet and Nasser, 2001). Рекомбинантные плазмиды из 12 клонов были секвенированы в области «слияния» генов yddG и BlaM.
Области соединения YddG с BlaM располагались по всей длине исходного YddG и группировались в пяти участках, соответствующих периплазматическим областям YddG или прилегающим к ним районам согласно топологической модели с 10 ТМ сегментами. Ни один из укороченных гибридов YddG-BlaM не придавал клеткам Е. coli устойчивости к фенилаланину.
Уровень устойчивости к Ар для полученных 12 гибридов находился в пределах от 75 до 200 мкг/мл (Рис. 14). Более низкая устойчивость к Ар, 75 мкг/мл, соответствовала гибридам Val21, Туг85 и Lys218, с точками присоединения BlaM в ТМ сегментах I, III и VIII. Более высокая устойчивость, 200 и 150 мкг/мл, соответствовала гибридам Gly30 и Ser265, где BlaM локализовался в периплазматических петлях между ТМ сегментами I и II, а также IX и X. Таким образом, были подтверждены экспериментально наличие этих периплазматических петель и, соответственно, локализация N- и С-концов белка YddG в цитоплазме. Полученная топологическая модель YddG согласовывалась с «правилом положительного заряда» (von Heijne, 1988) (рис. 14).
rlGlu94-4| \
Флуоресценция
Периплазма
,_к \ HGIy142-1oj?> \ _
j НТуг41-125> \ |Н01и94-100>КГ-^ \
Ар устойчивость
r!Ser265-150>
HSer271-125> \ "1 I..............-.......f
Цитоплазма
Флуоресценция
4Gly293-1ÔÔ|
Рис. 14. Модель топологии YddG в мембране, построенная на основе свойств YddG-BlaM гибридов, профиля гидрофобности, с учетом «правила положительного заряда». Места присоединения репортерных белков BlaM и ZsGreen к N-концевым фрагментам YddG обозначены стрелками и прямоугольниками соответственно. Цифры внутри стрелок означают номер аминокислотного остатка и уровень устойчивости к Ар (мкг/мл), цифры внутри прямоугольников - уровень флуоресценции (%). Расположение заряженных аминокислотных остатков Asp, Glu обозначено «-», Arg, Lys - «+».
2.3. Иммунодетекция YddG-BlaM гибридов
Для подтверждения того, что различие в уровне экспрессии ускЮ '-ЫаМ гибридов не исказило интерпретацию результатов топологического анализа, нами был проведен количественный анализ содержания YddG-BlaM в экстрактах мембранных фракций с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител к (3-лактамазе (Рис.15).
: . 45 кДа
— 35 кДл - i — 35кДа
30 "Да BlaM ^MJSfliBlaM
Т 8 9 10 11 12 к
Рис. 15. Вестерн блоты YddG-BlaM гибридов.
1 - Ser271; 2 - Ser265; 3 - Lys218; 4 - Gln206; 5 - Ilel48; 6 - Aspl46; 7 - Glyl42; 8 - Glu94; 9 - Tyr85; 10 - Tyr41; 11 - Gly30; 12 - Val21; к (контроль) -клеточный экстракт TGI (pBR322). Растворимые белки мембранных фракций (100 мкг) были разделены с помощью ДСН-электрофореза в 12% ПААГ. Гибридные белки визуализированы с помощью иммуноблоттинга с моноклональными антителами к р-лактамазе.
В отличие от растворимого белка (в данном случае р-лактамазы), гибриды YddG-BlaM, как гидрофобные белки, обладали большей электрофоретической подвижностью в ДСН-электрофорезе в 12% ЛААГ. Тем не менее, относительные размеры созданных в работе гибридов соответствовали ожидаемым структурам.
Как видно из рис. 15, все исследуемые гибриды синтезировались примерно с одинаковой эффективностью. Таким образом, различия в устойчивости к Ар у клеток, содержащих разные гибриды (Рис.14), могли быть обусловлены различной локализацией соответствующих белков в бактериальной мембране.
2.4. Конструирование и анализ YddG'-ZsGreen гибридов
Для подтвреждения топологии YddG, установленной с помощью гибридов YddG-BlaM, провели картирование сегментов YddG, локализующихся в цитоплазме с помощью репортерного белка ZsGreen. Все конструкции генов гибридных белков yddG'-ZsGreen, включая конструкцию, кодирующую полноразмерный YddG, были получены с помощью перекрывающейся ПЦР. Точки присоединения ZsGreen к фрагментам укороченного белка YddG были выбраны с целью подтверждения наличия у YddG четырех цитоплазматических петель (согласно модели с 10 ТМ сегментами). Две точки (G!n59 и Proól) были выбраны между ТМ сегментами II и III, точка Lysl 17 - между ТМ сегментами IV и V, точка Argl81 - между ТМ сегментами VI и VII и точка Leu238 - между ТМ сегментами VIII и IX. Три точки Val247, Туг250 и Рго253, расположенные в ТМ сегменте IX, были спланированы для подтверждения сложного профиля гидрофобности в этой части белка (Рис. 14). Гибриды с точками присоединения ZsGreen к Glu94 и Gln206 YddG соотвествовали двум ранее полученным гибридам YddG-BlaM с установленной периплазматической локализацией С-концевого домена были отрицательными контролями. В результате получили 11 конструкций yddG'-ZsGreen, включая и конструкцию с полноразмерным YddG.
Наиболее интенсивный сигнал флуоресценции, принятый за 100%, наблюдали для гибрида Gly293, содержащего полноразмерный YddG (Рис. 14). Плазмида, содержащая этот ген гибридного белка, придавала клеткам Е. coli устойчивость к фенилаланину до 20 мг/мл в присутствии 1 мМ ИПТГ в отличие от плазмид, содержащих гены гибридов с укороченным YddG.
Низкий уровень флуоресценции (-3%) наблюдался у клеток, синтезировавших гибриды с локализацией ZsGreen в периплазме (Glu94 и Gln206), являвшихся отрицательными контролями. Остальные YddG-ZsGreen гибриды обеспечивали флуоресценцию клеток с интенсивностью ~20—30%, что в 10 раз превосходило уровень отрицательного контроля. Следовательно, ZsGreen в этих гибридах имел цитоплазматическую локализацию.
Гибриды Va!247, Туг250 и Рго253 обеспечивали флуоресценцию с большим разбросом в значении величин (17, 37 и 27%, соответственно). Поэтому нельзя было исключить сложный характер топологии YddG в IX ТМ сегменте. Однако, разброс в уровне флуоресценции в 10% был зарегистрирован и для гибридов Gln59, Proól, где ZsGreen присоединялся к YddG в двух
близкорасположенных точках первой цитоплазматической петли (см. Рис. 14). На основании этих результатов мы сделали вывод, что «тонкую» топологию отдельных участков Ус1сЮ, вероятно, следует определять более совершенными способами, чем использованный в работе метод конструирования генов гибридных белков.
2.5. Иммунодетекция УсМС-гзСгееп гибридов
Гибриды Ус1сЮ-250гееп тестировали в экстрактах белков из мембранных фракций с помощью вестерн-блоттинга с антителами к флуоресцентным белкам рифовых кораллов. Как видно из рис. 16, подвижности всех исследуемых гибридов относительно друг друга соответствовали ожидаемым размерам полипептидов. Причем, гибриды У<1сЮ-280гееп, с локализацией репортерного белка в цитоплазме, детектировались примерно с одинаковой интенсивностью, тогда как гибриды С1и94 и С1п206, в которых /БСгееп предположительно экспортировался в периплазму, обнаруживались в следовых количествах. По-видимому, вследствие неправильного фолдинга 2зОгееп в периплазме большая часть гибридного белка подвергалась действию протеолитических ферментов (/Г'еНтегег е! а/., 2000).
— 45 кДа - 45 кДа
35 кДа ЩЩ ^^ кДз
п ШШ _
; т iMj&zsGreen Ш ф - 30«Д3 ZsGreen
* »ч* с»,
12345к 6789 10 11 к
Рис. 16. Вестерн блоты гибридных белков YddG-ZsGreen. 1 - Gly293; 2 - Pro253; 3 - Tyr250; 4 - Val247; 5 - Leu238; 6 - Gln206; 7 -Argl81; 8 - Lysl 17; 9 - Glu94; 10 - Pro61; 11 - Gln59; к (контроль) - клеточный экстракт TGI (pZsGreen). Белки мембранных фракций клеток TGI (pBRyddG-ZsGreen), нанесенные по 50 мкг на дорожки 1-5 и по 100 мкг - на дорожки 6-11, были разделены с помощью ДСН-электрофореза в 12% ПААГ. Гибриды визуализировали с помощью иммуноблоттинга с поликлональными антителами к флуоресцентным белкам рифовых кораллов (anti-RCFP).
На основании совокупного анализа гибридов YddG-BlaM и YddG-ZsGreen показана мембранная локализация YddG и построена топологическая модель YddG с 10 ТМ сегментами.
2.6. Определение внутриклеточной локализации YddG-ZsGreen
гибридов
Использование ZsGreen в качестве белка-репортера позволило исследовать внутриклеточную локализацию гибридов YddG-ZsGreen с помощью флуоресцентной микроскопии. Несколько плазмид, кодирующих гибриды YddG-ZsGreen (Lys 117, Argl81, Gln206, Leu238), а также вариант с полноразмерным YddG (Gly293), трансформировали в клетки TGI. В качестве контролен использовали клетки TG1, содержащие pZsGreen и pBR322. Клетки всех плазмидных штаммов выращивали в LB-среде в присутствии ИПТГ для индукции синтеза гибридных белков и использовали для флуоресцентной микроскопии. Как видно из представленных результатов (Рис. 17), флуоресцентные сигналы детектировали на полюсах клеток, синтезирующих гибридные белки Gly293, Lysll7, Argl81 и Leu238. При этом, как правило, флуоресценция была ярче на старом полюсе клетки (Рис. 17 а). В популяции присутствовали также клетки с практически одинаковой интенсивностью флуоресценции на обоих полюсах (Рис. 17 г). Флуоресценция не наблюдалась в клетках, содержащих гибрид Gln206, с картированной периплазматической локализацией ZsGreen-домена (Рис. 17 д). Клетки контрольных штаммов имели ожидаемый характер флуоресценции: TGI (pBR322) не давали флуоресцентного сигнала (Рис. 17 в), а в TGI (pZsGreen) свечение было равномерным по объему клетки (Рис. 17 б).
а * ... ... .. _ * » * , , б 0 --- IliliillliSilll
в г ■ % «, * шшяш, ■жнивя
д шшт
Рис. 17. Локализация YddG-ZsGreen гибридов в клетках Е. coli TGI: pBR-YddG(Gly293)-ZsGreen (a); pZsGreen (6); pBR322 (в); pBR-YddG(Arg] 81)-ZsGreen (r); pBR-YddG(Gln206)-ZsGreen (д). Шкала 5 мкм. Конфокальные флуоресцентные микрофотографии (левая панель) и микрофотографии в проходящем свете (правая панель).
3. Влияние сверхэкспрессии ускЮ на продукцию фенилаланина
3.1. Замена регуляторной области гена учкЮ
С целью оптимизации экспрессии ус1сЮ мы провели замену области природной регуляции этого гена на две искусственные, интегрированные независимо. Это были комбинации сильного промотора фага X или его ослабленного варианта, обозначенного Рь««, с участком связывания рибосом гена 1ас2(ИВ8/ай). Штаммы В\У25113, В\У25113 и В\¥25ПЗ
имели различающиеся в сторону увеличения уровни устойчивости к фенилаланину (Рис. 18 а). Препараты тотальной РНК, выделенные из клеток штаммов В\У25113, В\У25113 Р^.^й и В\У25113 Рь-у(1сЮ, тестировали с помощью ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), на присутствие мРНК^йИО. Препарат РНК из В\У25113 Р\ryddG образовал более интенсивную полосу в агарозном геле после ОТ-ПЦР, чем препарат РНК из В\У25113 Р\tt-yddG. При этом, наличие мРНК yddG в штамме с интактным геном визуально не регистрировалось (Рис. 18 б). Таким образом, различие в устойчивости к фенилаланину коррелировало с разными уровнями тестируемой мРНК.
о -I-1-%-*-,-,-,-,
о 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14
Концентрация Ь-фенилаланина, М ■ ♦ А М
Рис. 18 Характеристика штаммов В\¥25113 (.), В\¥25ПЗ ?L.,-yddG (♦) и В\У25113 Р (а) по уровню устойчивости к Ь-фенилаланину (а) и ОТ-ПЦР
нaмPHKyddG(б).
Введение РL»-yddG или Р^-yddG в штамм М01655Дгул4 ЫугЯ привело к увеличению конверсии глюкозы в Ь-фенилаланин (~ 1.5 раза) только в случае Р 1гу(Ш (Табл. 1).
Таблица 1. Влияние уровня экспрессии гена yddG на накопление Ь-фенилаланина в культуральной жидкости при культивировании в ферментерах.
Штамм Аллель yddG Конверсия глюкозы в Ь-фенилаланин, %
Мй1655 МугА МугЯ ген yddG дик. типа 1.6
Мв1655 МугА А/уг И Р^оЖ Р \-yddG 2.4
3.2. Эффект сверхэкспресспи yddG в штаммах-продуцентах на
продукцию фенилаланина
При первоначальной характеристике YddG как экспортера ароматических аминокислот было показано, что повышение экспрессии YddG увеличивает продукцию фенилаланина, тирозина и триптофана для продуцентов с небольшой активностью (Dowshenko et al., 2007). Эти продуценты были сконструированы на основе MG1655 по единому принципу: у каждого из них на фоне дерепрессии общего ароматического пути (Д tyrR) были инактивированы пути образования альтернативных ароматических аминокислот. Очевидно, что в таких продуцентах снижение внутриклеточной концентрации аминокислоты могло активировать соответствующий фермент биосинтеза, ингибируемый этой аминокислотой. Так, в биосинтезе фенилаланина такими ферментами являлись ДАГФ-синтаза (AroG) и хоризмат мутаза-префенат дегидратаза (PheA). Мы проверили эффект сверхэкспрессии yddG для продуцента фенилаланина DV269 (MG1655 AtyrA), содержащего гены aroG4 и phe.4li, интегрированные в хромосому с помощью mini-Mu, которые кодировали устойчивые к фенилапанину ферменты. Были получены изогенные производные этого штамма, различающиеся как по количеству копий гена aroG4, так и аллелями гена yddG. К исходной копии гена aroG4m¡„¡.Mu, находящейся под контролем собственного промотора добавляли копию aroG4 под контролем промотора РЬо-регулона, В отличие от собственного
промотора этого гена, проявлявшего максимальную активность во время роста клеток, промотор Р;мд активировался в условиях лимитации по фосфору. Действительно, в условиях лимитации по фосфору штаммы 3 и 4, содержащие Рpsts-aroG4, синтезировали больше фенилаланина, чем их изогенные варианты 1 и 2, не содержащие ?ps,s-aroG4 (Табл. 2). С другой стороны, штаммы 1 и 3, 2 и 4 отличались наличием «молчащего» и активированного гена yddG: htrE::(Рт7-yddG) и htrE::(?i-yddG). В обоих случаях дополнительная копия теш yddG была интегрирована в несущественный для продукции фенилаланина ген htrE, но в первом случае перед геном был «молчащий» в отсутствии полимеразы бактериофага Т7 промотор, а во втором случае - промотор Pl фага X.
Таблица 2. Влияние аллельного состояния гена yddG на продукцию фенилаланина изогенными производными штамма РУ269_
№ штамма aroG4 yddG OD540 L-Phe, г /л
1 aroGwt aroG4m ¡n-,.Mv, yddGw, htrE::(?rryddG) 21±1 2.7±0.1
2 aroGwt aroG4 mini.Mu yddG„ htrE::(?h-yddG) 18±1 3.8±0.2
3 aroGv.1::(Ppui-aroG4) aroG4 mini-Mu yddGк htrE::(?T1-yddG) 17±1 5.8±0.3
4 aroG^::(?,KLS-aroG4) aroG4 mini.Mu yddGw htrE::(?L-yddG) 17±1 6.7±0.1
Как видно из Табл. 2, продукция фенилаланина у исходного штамма с одной копией агоС4 была выше на -30% в присутствии [\-yddG. У более активного штамма ОУ269 (Д(угА Рр^~агоС4) продукция была выше на -15% в присутствии ?1,-ус1сЮ. Очевидно, что вторая копия агоС4 под контролем промотора Р^ стабилизировала продукцию фенилаланина, но даже на фоне этого активный экспорт фенилаланина из клетки повышал активность штамма.
ВЫВОДЫ
1. Локализован промотор и определена точка инициации транскрипции yddG в клетках Е. coli К-12. С использованием LacZ в качестве репортера показано, что yddG экспрессируется на низком уровне, который увеличивается при снижении скорости роста бактерий, индуцированном стрессовыми воздействиями (уровень активации в 1.2-5 раз при изменениях ц-1.2-3 ч'1). Эта активация экспрессии не зависит от активности известных регуляторов (CRP, Lrp, TyrR) и комплекса РНК полимеразы с os, а, возможно, обусловлена общим изменением спектра транскрибируемых генов в неблагоприятных для роста бактерий условиях.
2. С использованием репортерных белков избирательно активных в периплазме или цитоплазме (ß-лактамазы и ZsGreen) экспериментально доказана локализация YddG в цитоплазматической мембране К coli. Определена топология YddG: показаны наличие 10 ТМ сегментов и локализация его N и С-концов в цитоплазме. Для бактериальных экспортеров аминокислот Е. coli экспериментально подтвержденная топология получена впервые. С помощью флуоресцентной микроскопии с использованием гибридных белков YddG-ZsGreen определена локализация YddG на полюсах клетки Е. coli.
3. Обеспечено увеличение экспрессии гена yddG в результате замены его нативной регуляторной области на более сильный промотор A.PL, и участок связывания рибосом RBSfacZ. Показано, что повышение уровня экспрессии yddG приводит к увеличению накопления фенилаланина штаммами-продуцентами. Конструкции, повышающие экспрессию yddG, введены в штаммы-продуценты аминокислот, которые используются в биотехнологическом производстве.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации
1. Имаизуми А., Айрих Л.Г., Дорошенко В.Г., Цыренжапова КС. Способ получения L-аминокислоты // Патентная заявка РФ №2008133840,2008.
2. Цыренжапова КС., Дорошенко В.Г., Айрих Л.Г., Миронов A.C., Машко С.В. Ген yddG Escherichia coli, кодирующий потенциальный экспортер ароматических аминокислот: конститутивная транскрипция и зависимость уровня экспрессии от скорости роста клеток // Генетика.
2009. Т. 45. №5. C.60I-609.
3. Air ich L.G., Tsyrenzhapova I.S., Vorontsova O.V., Feofanov A.V., Doroshenko V.G., Mashko S.V. Membrane topology analysis of the Escherichia coli aromatic amino acid efflux protein YddG // J. Mol. Microbiol. Biotechnol.
2010. V.18. P.189-197.
4. Doroshenko V.G., Tsyrenzhapova LS., Krylov A.A., Kiseleva E.M., Ermishev V.Y., Kccakova S.M., Biryukova I.V., Mashko S.V. Pho regulon promotermediated transcription of the key pathway gene aroG (Fbr) improves the performance of an L-phenylalanine-producing Escherichia coli strain // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V.88. P.1287-1295.
Подписано в печать: 17.11.2010
Заказ № 4572 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Цыренжапова, Ирина Сергеевна
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.,.
Актуальность проблемы.
Цель и задачи исследования.
Научная новизна и практическая ценность работы.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.:.
1. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПОРТЕРОВ АМИНОКИСЛОТ Escherichia coli И Corynebacterium glutamicum.
1.1. Обзор известных экспортеров аминокислот.
1.2. Гены экспортеров аминокислот и их регуляция.
1.2.1. Экспортеры аминокислот Corynebacterium glutamicum.
1.2.1.1. Экспортер лизина и аргинина LysE.
1.2.1.2. Экспортер треонина и серина ThrE.
1.2.1.3. Экспортер гидрофобных аминокислот BrnFE.
1.2.2. Экспортеры аминокислот Escherichia coli.
1.2.2.1. Экспортеры гомосерина и треонина RhtB, RhtC и RhtA.
1.2.2.2. Экспортеры О-ацетилсерина и L-цистеина YdeD и YfiK.
1.2.2.3. Экспортер L-аргинина ArgO.
1.2.2.4. Экспортер L-лейцина LeuE.
1.2.2.5. Экспортер L-валина YgaZII.
1.2.2.6. Экспортер ароматических аминокислот YddG.
2. ЭКСПОРТЕРЫ АМИНОКИСЛОТ - ИНТЕГРАЛЬНЫЕ МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ.
2.1. Классификация интегральных мембранных белков.
2.2. Биогенез мембранных белков.
2.2.1. Интеграция мембранных белков с помощью See-системы зависит от SRP частицы.
2.2.2. Sec-транслокон.
2.2.3. YidC- зависимая интеграция мембранных белков.
2.3. Исследования интегральных мембранных белков.
2.3.1. Предсказание интегральных мембранных белков на основании анализа аминокислотной последовательности.
2.3.2. Экспериментальные подходы к определению топологии интегральных мембранных белков.
2.3.2.1. Использование гибридов с репортерными белками.
2.3.2.2. Использование специфических последовательностей в качестве репортерных.
2.3.2.3. Метод сайт-специфического мечения остатков цистеина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Бактериальные штаммы, среды и условия культивирования.
2. Определение устойчивости клеток TG1 (pBRj't/c/GЫаМ) к ампициллину.
3. Условия культивирования и определение фенилаланина в культуральной жидкости
4. Проведение ПЦР.
5. Генно-инженерные методики.
6. Конструирование штаммов.
7. Конструирование рекомбинантных плазмид.
8. Получение рекомбинантных плазмид pBRyddG'-ЫаМ, содержащих укороченный ген yddG, с помощью экзонуклеазы III.
9. Выделение РНК.
10. Определение стартовой точки транскрипции.
11. ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
12. Определение ферментативных активностей.
12.1. Определение активности ß-галактозидазы.
12.2. Определение активности щелочной фосфатазы.
12.3. Определение активности ДАГФ-синтазы.
13. Измерение флуоресценции.
14. Выделение мембранных белков.
15. Иммуноблоттинг.
16. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. ИЗУЧЕНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ГЕНА yddG.
1.1. Картирование промотора гена yddG.
1.2. Получение гена гибридного белка YddG-LacZ в хромосоме Е. coli.
1.3. Активность промотора yddG in vivo при росте штамма MG 1655AlacZ yddG '-lacZ на лабораторных средах LB и М9.
1.4. Экспрессия yddG при росте MG1655 tÚacZ yddG'-lacZ в присутствии метилвиологена.
1.5. Изучение влияния глобального регулятора Lrp на экспрессию yddG '-lacZ.
1.6. Изучение влияния «катаболитной активации» на экспрессию yddG '-lacZ.
1.7. Экспрессия yddG при роете MG1655 ¡SlacZyddG '-lacZ в присутствии некоторых аминокислот.
1.8. Изучение влияния TyrR на экспрессиюyddG'-lacZ.
1.9. Влияние скорости роста клеток на активность промотора yddG.
1.10. Экспрессия yddG '-lacZ в штаммах RpoS+ и RpoS".
2. СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ YddG КАК ИНТЕГРАЛЬНОГО МЕМБРАННОГО БЕЛКА.
2.1. Топологическая модель YddG, предлагаемая в экспериментах in silico.
2.2. Конструирование и анализyddG'-ЫаМгибридов.
2.3. Иммунодетекция YddG-BlaM гибридов.
2.4. Конструирование и анализ YddG'-ZsGreen гибридов.
2.5. Иммунодетекция YddG-ZsGreen гибридов.
2.6. Определение внутриклеточной локализации YddG-ZsGreen гибридов.
2.7 Сравнительный анализ YddG и транспортеров DME семейства.
3. ВЛИЯНИЕ СВЕРХЭКСПРЕССИИ yddG НА ПРОДУКЦИЮ ФЕНИЛАЛАНИНА.
3.1. Замена регуляторной области гена yddG.
3.2. Эффект сверхэкспрессии yddG в штаммах-продуцентах на продукцию фенилаланина.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот YddG Escherichia Coli"
Актуальность проблемы
Значительные успехи последних десятилетий в производстве аминокислот связаны, прежде всего, с конструированием микроорганизмов-продуцентов методами > метаболической инженерии. Такой способ конструирования* включает в себя последовательное целенаправленное изменение метаболизма клетки для- раскрытия ее возможностей к сверхсинтезу конкретной аминокислоты и должен быть основан на молекулярно-генетической характеристике участвующих в нем элементов.
Escherichia coli, в силу ее генетической' и биохимической изученности и из-за разработанности методов манипулирования с ее геномом,- является удобным микроорганизмом для рационального конструирования на ее основе штаммов-продуцентов различных биологически активных соединений и, прежде всего, аминокислот. Для последних можно не изобретать новый путь биосинтеза: клетка Е. coli синтезирует для своих нужд все 20 аминокислот. Для получения сверхпродукции конкретной аминокислоты делетируют контролирующие элементы ее синтеза и перестраивают общий метаболизм клетки-для увеличения синтеза ее предшественников. При достижении определенного уровня продукции аминокислоты актуальной проблемой1 становится ее транспорт из клетки. Усиление активного экспорта аминокислоты в настоящее время достигается за счет увеличения экспрессии гена аминокислотного экспортера. Несмотря на то, что в последние два десятилетия идентифицированы десятки генов, кодирующих экспортеры аминокислот у промышленно значимых бактерий Е. coli и Corynebacterium glutamicum, их детальное исследование только начинается.
В частности, объектом исследования данной работы является экспортер-ароматических аминокислот YddG Е. coli. На момент начала исследования было показано, что амплификация гена ydclG придает клеткам Е. coli устойчивость к ароматическим аминокислотам и их аналогам, а также увеличивает накопление ароматических аминокислот в культуральной жидкости продуцирующих их штаммов (Doroshenko et al., 2007). Идентификация регуляторных элементов гена yddG и возможных факторов, влияющих на его экспрессию, представляла интерес и могла иметь практическое применение для оптимизации экспрессии гена yddG в штаммах-продуцентах ароматических аминокислот.
Экспортеры аминокислот относятся к интегральным мембранным белкам (ИМБ). Они высокогидрофобны, состоят из нескольких а-спиральных структур, которые образуют трансмембранные (ТМ) сегменты. Такие • особенности мембранных белков затрудняют экспериментальный анализ их трехмерных структур, поэтому построение топологических моделей, т.е. определение количества ТМ сегментов и*их ориентации в мембране является важным этапом исследования ИМБ. К началу данной работы отсутствовали экспериментально подтвержденные топологические модели известных экспортеров аминокислот Е. coli. Таким образом, несомненный интерес представляло i экспериментальное определение топологии экспортера ароматических аминокислот YddG. Полученные результаты могли быть использованы для разработки» новых стратегий оптимизации аминокислотных экспортеров* в цитоплазматической мембране штаммов-продуцентов аминокислот.
Цель и задачи исследования
Таким образом, целыо настоящей диссертационной ' работы было изучение регуляции генаyddG и характеристика YddG как интегрального мембранного белка.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Провести идентификацию промотора гена yddG',
2. Разработать систему и исследовать регуляцию гена yddG in vivo;
3. Исследовать локализацию YddG в клетке; 4 Построить топологическую модель YddG.
Научная новизна и практическая ценность работы
Картирован промотор гена yddG, исследована экспрессия этого гена* in vivo в различных условиях* культивирования. Ген yddG экспрессируется в клетках Е. coli MGI655 на низком уровне, что следует как из анализа его регуляторной области, так и из тестирования активности LacZ для гибридного гена yddC-lacZ. Увеличение экспрессии гена yddG наблюдалось в условиях, приводящих к замедлению роста клеток Е. coli. Неблагоприятные или стрессовые условия, замедляющие рост культуры, индуцировались такими факторами, как ингибирующие концентрации фенилаланина, NaCl или сахарозы в с среде. Экспрессия yddG в этих условиях не зависела от а -РНК-полимеразы.
С помощью сконструированных гибридных белков YddG-BlaM и YddG-ZsGreen экспериментально доказана локализация YddG в цитоплазматической мембране Е. coli. Построена топологическая модель YddG. Экспериментально показано наличие у YddG 10 TM и расположение N- и С-концов в цитоплазме. С помощью флуоресцентной микроскопии установлено, что YddG локализуется на полюсах клетки.
В результате замены природной регуляторной области уйсЮ на эффективную регуляторную область оптимизирована экспрессия гена \dciG в клетках продуцентов фенилаланина. Генетические конструкции с повышенной экспрессией гена ус1сЮ введены в штаммы-продуценты ароматических аминокислот, которые используются в биотехнологическом производстве.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Цыренжапова, Ирина Сергеевна
выводы
1. Локализован промотор и определена точка инициации транскрипции yddG в клетках Е. coli К-12. С использованием LacZ в качестве репортера показано, что yddG экспрессируется на низком уровне, который увеличивается при снижении скорости роста бактерий, индуцированном стрессовыми воздействиями (уровень активации в 1.2-5 раз при изменениях ju—1.2-3 ч"1). Эта активация экспрессии не зависит от активности известных регуляторов (CRP, Lrp, TyrR) и комплекса РНКс полимеразы с а , а, возможно, обусловлена общим изменением спекгра транскрибируемых генов в неблагоприятных для роста бактерий условиях. .
2. С использованием репортерных белков избирательно активных в периплазме и цитоплазме (ß-лактамазы и ZsGreen) экспериментально доказана локализация YddG в цитоплазматической мембране Е. coli. Определена топология YddG: показаны наличие 10 ТМ сегментов и локализация его N и С-концов в цитоплазме. Для бактериальных экспортеров аминокислот Е. coli экспериментально подтвержденная топология получена впервые. С помощью флуоресцентной микроскопии с использованием гибридных белков YddG-ZsGreen определена локализация YddG на полюсах клетки Е. coli.
3. Обеспечено увеличение экспрессии гена yddG в результате замены его нативной регуляторной области на более сильный промотор А,Рь и участок связывания рибосом 11В8/аСг. Показано, что повышение уровня экспрессии yddG приводит к увеличению накопления фенилаланина штаммами-продуцентами. Конструкции, повышающие экспрессию yddG, введены в штаммы-продуценты аминокислот, которые используются в биотехнологическом производстве.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цыренжапова, Ирина Сергеевна, Москва
1. Abramson J., Smirnova I., Kasho V., Verner G., Kaback H.R., Iwata S. (2003) Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Science 301: 610-615.
2. Akabas M.H., Stauffer D.A., Xu M., Karlin A. (1992) Acetylcholine receptor channel structure probed in cysteine-substitution mutants. Science. 258: 307-310.
3. AkiyamaY., Ito K. (1993) Folding and assembly of bacterial'alkaline phosphatase in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 268: 8146-8150.
4. Aleshin V.V., Zakataeva N.P:, Livshits V.A. (1999) A new family of amino-acid-efflux proteins. Trends Biochem. Sci. 24: 133-135.
5. Alexeyev M.F., Winkler H.H. (1999) Membrane topology of the Rickettsia prowazekii ATP/ADP translocase revealed by novel dual pho-lac reporters. J.Mol.Biol. 285:1503-13.
6. Andersson H., von Heijne G. (1993) Sec dependent and sec independent assembly of E. coli inner membrane proteins: the topological rules depend on chain length. EMBO J. 12: 683-91.
7. Belitsky B.R., Gustafsson M.C., Sonenshein A.L., von Wachenfeldt C. (1997) An Lrp-like gene of Bacillus subtilis involved in branched-chain amino acid transport. J. Bacteriol. 179: 5548-5557.
8. Bellmann A., Vrljic M., Patek M., Sahm H., Kramer R., Eggeling L. (2001) Expression control and specificity of the basic amino acid exporter LysE of Corynebacterium glutamicum. Microbiology. 147: 1765-1774.
9. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Hcijne G., Brunak S. (2004) Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol. 340: 783-795.
10. Benoit S., Abaibou H., Mandrand-Berthelot M.A. (1998) Topological analysis of the aerobic membrane-bound formate dehydrogenase of Escherichia coli. J. Bacteriol. 180: 6625-34.
11. Bernsel A., Viklund II., Hennerdal A., Elofsson A. (2009) TOPCONS: Consensus prediction of membrane protein topology. Nucl. Acids Res. 37: W465-468.
12. Blobel G. (1980) Intracellular protein topogenesis. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 77: 14961500.
13. Bogdanov M., Heacock P.N., Dowhan W. (2002) A polytopic membrane protein displays a reversible topology dependent on membrane lipid composition. EMBO J. 21: 2107-16.
14. Bogdanov M., Zhang W., Xie J., Dowhan W. (2005) Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM™): application to lipid-specific membrane protein topogenesis. Methods. 36: 148-171.
15. Booth I.R., Louis P." (1999) Managing hypoosmotic stress: Aquaporins and mechanosensitive channels in Escherichia coli. Curr. Opin. Microbiol. 2: 166-169.
16. Bomemann T., Jockel J., Rodnina M.V., Wintermeyer W. (2008) Signal sequence-independent membrane targeting of ribosomes containing short nascent peptides within the exit tunnel. Nat. Struct. Mol. Biol. 15: 494-499.
17. Bowers C.W., Lau F., Silhavy T.J. (2003) Secretion of LamB-LacZ by the signal recognition particle pathway of Escherichia coli. J. Bacteriol. 185: 5697-5705.
18. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72:248-54.
19. Bröer S., Krämer R. (1991a) Lysine excretion by Corynebacterium glutamicum. 1. Identification of a specific secretion carrier system. Eur. J. Biochem. 202: 131-135.
20. Bröer S., Krämer R. (1991b) Lysine excretion by Corynebacterium glutamicum. 2. Energetics and mechanism of the transport system. Eur. J. Biochem. 202: 137-143.
21. Broome-Smith J.K., Tadayyon M., Zhang Y. (1990) ß-Lactamase as a probe of membrane protein assembly and protein export. Mol, Microbiol. 4: 1637-1644.
22. Bulaj G., Kortemme T., Goldenberg D.P. (1998) Ionization-reactivity relationships for cysteine thiols in polypeptides. Biochemistry. 37: 8965-8972.
23. Busby S., Ebright R.H. (1999) Transcription activation by catabolite activator protein (CAP). J.Mol.Biol. 293: 199-213.
24. Calvo J.M., Matthews R.G. (1994) The leucine-responsive regulatory protein, a global regulator of metabolism in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 58: 466-490.
25. Celebi N., Yi L., Facey S.J., Kuhn A., Dalbey R.E. (2006) Membrane biogenesis of subunit II cytochrome bo'oxidase: contrasting requirements for insertion of N-terminal and C-terminal domains. J. Mol. Biol. 357: 1428-1436.
26. Chalfie M. (1995) Green fluorescent protein. Photochem. Photobiol. 4: 651-6.
27. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263: 802-5.
28. Chang C.N., Kuang W.J., Chen E.Y. (1986) Nucleotide sequence of the alkaline phosphatase gene of Escherichia coli. Gene. 44: 121-125.
29. Chang X.B., Hou Y.X., Jensen T.J., Riordan J.R. (1994) Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion. J. Biol. Chem. 269: 18572-18575.
30. Charbit A., Ronco J., Michel V., Werts C., Hofnung -M. (1991) Permissive sites and, topology of an outer membrane protein with a reporter epitope. J. Bacteriol. 173: 262-75.
31. Chen M., Samuelson J.C., Jiang F., Muller M., Kuhn A., Dalbey R.E. (2002) Direct interaction of YidC with the Sec independent Pf3 coat protein during its membrane protein insertion. J. Biol. Chem. 277: 7670-7675.
32. Chen M., Xie K., Yuan J., Yi L., Facey S.J., Pradel N., Wu L.F., Kuhn A., Dalbey R.E. (2005) Involvement of SecDF and YidC in the membrane insertion of M13 procoat mutants. Biochemistry. 44: 10741-10749.
33. Claros M.G., von Heijne G. (1994) TopPredll: an improved software for membrane protein structure predictions. Comput. Appl. Biosci. 10: 685-686.
34. Csonka L.N., Epstein W. (1996) Osmoregulation. In: Escherichia coli'and Salmonella. Cellular and molecular biology / Eds. F.C. Neidhardt, R. Curtiss III, J.L. Ingraham. Washington: ASM Press, 1996. P.1210-1224.
35. Cui Y., Wang Q., Stormo G.D., Calvo J.M. (1995) A consensus sequence for binding of Lrp to DNA. J. Bacteriol. 177: 4872-4880.
36. Daßler T., Maier T., Winterhalter C., Böck A. (2000) Identification of a major facilitator protein from Escherichia coli involved in efflux of metabolites of the cystein pathway. Mol. Microbiol. 36: 1101-1112.
37. Dalbey R.E., Chen M. (2004) Sec-translocase mediated membrane protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1694: 37-53.
38. Deitermann S., Sprie G.S., Koch H.-G. (2005) A dual function for SecA in the assembly of single spanning membrane proteins in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 280: 39077-85.
39. DeLisa M.P., Wu C.-F., Wang L., Valdes J.J., Bentley W.E. (2001) DNA microarray-based identification of genes controlled by autoinducer 2-stimulated quorum sensing in Escherichia coli. J. Bacteriol. 183: 5239-5247.
40. Derman A.I., Prinz W.A., Belin D., Beckwith J. (1993) Mutations that allow disulfide bond formation in the cytoplasm of Escherichia coli. Science. 262: 1744—1747.
41. Diaz-Mejia J.J., Babu M., Emili A. (2009) Computational and experimental approaches to chart the Escherichia coli cell envelope-associated proteome and interactome. FEMS Microbiol. Rev. 33: 66-97.
42. Donahue J.L., Okpodu C.M., Cramer C.L. (1997) Responses of antioxidants to paraquat in pea leaves. Plants physiol. 113: 249-257.
43. Doroshenko V., Airich L., Vitushkina M., Kolokolova A., Livshits V., Mashko S. (2007) YddG from Escherichia coli promotes export of aromatic amino acids. FEMS Lett. 275: 312-318.
44. Duong F., Wickner W. (1997) Distinct catalytic roles of the SecYE, SecG and SecDFyaiC subunits of preprotein translocase holoenzyme. EMBO J. 16: 2756-68.
45. Duquesne K., Sturgis J.N. (2010) Membrane protein solubilization. Methods Mol. Biol. 601:205-17.
46. Ebbighausen H., Weil B., Krämer R. (1989) Transport of branched-chain amino acids in Corynebacterium glutamicum. Arch. Microbiol. 151: 238-244.
47. Eggeling L., Sahm H. (2003) New ubiquitous translocators: amino acid export by Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli. Arch. Microbiol. 180: 155-160.
48. Eisenberg D., Weiss R.M., Terwilliger T.C. (1982) The helical hydrophobic moment: a measure of the amphiphilicity of a helix. Nature. 299: 371-374.
49. Elsliger M.A., Wächter R.M., Hanson G.T., Kallio K., Remington S.J. (1999) Structural and spectral response of green fluorescent protein variants to changes in pH. Biochemistry. 38: 5296-5301.
50. Erdmann A., Weil B., Krämer R. (1993) Lysine secretion by wild-type Corynebacterium glutamicum triggered by dipeptide uptake. J. Gen. Microbiol. 139: 3115-3122.
51. Facey S.J., Kulm A. (2010) Biogenesis of bacterial inner membrane proteins. Cell. Mol. Life Sei. 67: 2343-62.
52. Facey S.J., Neugebauer S.A., Krauss S., Kuhn A. (2007) The mechanosensitive channel protein MscL is targeted by the SRP to the novel YidC membrane insertion pathway of Escherichia coli. J. Mol. Biol. 365: 995-1004.
53. Feilmeier B.J., Iseminger G., Schroeder D., Webber H., Phillips G.J. (2000) Green fruorescent protein functions as a reporter for protein localization in Escherichia coli. J. Bacteriol. 182: 4068-4076.
54. Franke I., Resch A., Daßler T., Maier T., Böck A. (2003) YfiK from Escherichia coli promotes export of O-acetylserine and cysteine. J. Bacteriol. 2003. 185: 1161-1166.
55. Frillingos S., Sahin-Toth M., Wu J., Kaback H.R. (1998) Cys-scanning mutagenesis: a novel approach to structure-function relationships in polytopic membrane proteins. FASEBJ. 12: 1281-1299.
56. Fröderberg L., Houben E., Samuelson J.C., Chen M., Park S.-K., Phillips G.J., Dalbey R., Luirink J., de Gier J.-W.L. (2003) Versatility of inner membrane protein biogenesis in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 47: 1015-1027.
57. Geller B.L., Wickner W. (1985) M13 procoat inserts into liposomes in the absence of other membrane proteins. J. Biol. Chem. 260: 13281-13285.
58. Gollub E., Zalkin H., Sprinson D.B. (1970) Assay for 3-deoxy-D-arabino-heptulosonic acid 7-phosphate synthase. Methods Enzymol. 17: 349-350.
59. Gurskaya N.G., Savitsky A.P., Yanushevich Y.G., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A. (2001) Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis. BMC Biochemistry. 2: 6.
60. Gurskaya N.G., Fradkov A.F., Terskikh A., Matz M.V., Labas Y.A., Martynov V.l., Yanushevich Y.G., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A. (2001a) GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. FEBS Lett. 507: 16-20.
61. Gyaneshwar P., Paliy O., McAuliffe J., J ones A., Jordan M.I., Kustu S. (2005) Lessons from Escherichia coli genes similarly regulated in response to nitrogen and sulfur limitation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102: 3453-3458.
62. Haney S.A., Platko J., Oxender D.L., Calvo J.M. (1992) Lrp, a leucine-responsive protein, regulates branched-chain amino acid transport genes in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174: 108-115.
63. Hatzixanthis K., Palmer T., Sargent F. (2003) A subset of bacterial inner membrane proteins integrated by the twin-arginine translocase. Mol. Microbiol. 49: 1377-1390.
64. Heddle C., Mazaleyrat S.L. (2007) Development of a screening platform for directed evolution using the reef coral fluorescent protein ZsGreen as a solubility reporter. Prot. Engin. Design Selection. 20: 327-337.
65. Heim R., Cubitt A.B., Tsien R.Y. (1995) Improved green fluorescence. Nature. 373: 663664.
66. Heim R., Prasher D.C., Tsien R.Y. (1994) Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 12501-12504.
67. Hermann T., Kramer R. (1996) Mechanism and regulation of isoleucine excretion in Coiynebacterium glutamicum. Appl. Environ. Microbiol. 62: 3238-3244.
68. Herskovits A.A., Bochkareva E.S., Bibi E. (2000) New prospects in studying the bacterial signal recognition particle pathway. Mol. Microbiol. 38: 927-939.
69. Hirokawa T., Boon-Chieng S., Mitaku'S. (1998) SOSUI: classification and secondary structure prediction system for membrane proteins. Bioinformatics. 14: 378-379.
70. Hoffman C.S., Wright A. (1985) Fusions of secreted proteins to alkaline phosphatase: an approach for studying protein secretion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 5107-5111.
71. Hofmann K., Stoffel W. (1993) Tmbase a database of membrane spanning proteins segments. Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 347: 166.
72. Hopp T.P., Woods K.R. (1981) Prediction of protein1 antigenic determinants from amino acid sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78: 3824-3828.
73. Houben E.N., ten Hagen-Jongman C.M., Brunner J., Oudega B., Luirink J. (2004) The two membrane segments of leader peptidase partition one by one into the lipid bilayer via a Sec/YidC interface. EMBO Rep. 5: 970-975.
74. Ikeda M., Arai M., Lao D., Shimizu T. (2001) Transmembrane topology prediction methods: a re-assessment and improvement by a consensus method using a dataset of experimentally-characterized transmembrane topologies. In Silico Biol. 2: 1-15:
75. Jager H„ Birkenhager R., Stalz W.-D., Altendorf K., Deckers-IIebestreit G. (1998) Topology of subunit a of the Escherichia coli ATP synthase. Eur.J.Biochem. 251:122-32.I
76. Jewell J.E., Orwiek J., Liu J., Miller K.W. (1999) Functional importance and local1 environments of the cysteines in the tetracycline resistance protein encoded by plasmid pBR322. J. Bacteriol. 181: 1689-1693.
77. Jones D.T. (1998) Do transmembrane protein superfolds exist? FEBS. Lett. 423:281-285.
78. Jones D.T. (2007) Improving the accuracy of transmembrane protein topology prediction using evolutionary information. Bioinformatics. 23: 538-544.
79. Kali L., Krogh A., Sonnhammer E.L. (2004)A combined transmembrane topology and signal peptide prediction method. J. Mol: Biol. 338: 1027-1036.
80. Kail L., Krogh A., Sonnhammer E.L. (2005) An HMM posterior decoder for sequence feature prediction that includes homology information. Bioinformatics 21. Suppl.l: i251— 1257.
81. Kali L., Krogh A., Sonnhammer E.L. (2007) Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction the Phobius web server. Nucleic Acids Res. 35: W429-32.
82. Karlin A., Akabas M.H. (1998) Substituted-cysteine accessibility method. Methods Enzymol. 293: 123-145.
83. Keenan R.J., Freymann D.M., Stroud R.M., Walter P. (2001) The signal recognition particle. Annu. Rev. Biochem. 70: 755-775.
84. Kennerknecht N., Sahm H., Yen M-R., Patek M., Saier M.H. Jr., Eggeling L. (2002) Export of L-isoleucine from Corynebacterium glutamicum: a two-gene-encoded member of a new translocator family. J. Bacteriol. 184: 3947-3956.
85. Kiefer D., Kuhn A. (2007) YidC as an essential and multiiiinctional component in membrane protein assembly. Int. Rev. Cytol. 259: 113-138.
86. Kimura T., Ohnuma M., Sawai T., Yamaguchi A. (1997) Membrane topology of the transposon 10-encoded metal-tetracycline/H+ antiporter as studied by site-directed chemical labeling. J. Biol. Chem. 272: 580-585.
87. Klenner C., Yuan J., Dalbey R.E., Kuhn A. (2008) The Pf3 coat protein contacts TM1 and TM3 of YidC during membrane biogenesis. FEBS Lett. 582: 3967-3972.
88. Koch H.G., Moser M., Schimz K.L., and Muller M. (2002) The integration of YidC into the cytoplasmic membrane of Escherichia coli requires the signal recognition, particle, SecA and SecYEG. J. Biol. Chem. 277: 5715-5718.
89. Koch H.G., Muller M. (2000) Dissecting the translocase and'integrase functions of the Escherichia coli SecYEG translocon. J. Cell. Biol. 150: 689-94.
90. Kohler R., Boehringer D., Greber B., Bingel-Erlenmeyer R., Collinson I., Schaffitzel C.", Ban N. (2009) YidC and Oxal form dimeric insertion pores on the translating ribosome. Mol. Cell. 34: 344-353.
91. Kol S., Majczak W., Heerlien R., van der Berg J.P., Nouwen N., Driessen A.J.M. (2009) Subunit a of the FiF0 ATP synthase requires YidC and SecYEG for membrane insertion. J. Mol. Biol. 390: 893-901.
92. Krämer R. (1994) Secretion of amino acids by bacteria: physiology and mechanism. FEMS Microbiol. Rev. 13: 75-94.
93. Krebs M.P., Noorwez S.M., Malhotra R., Kaushal S. (2004) Quality control of integral membrane proteins. Trends Biochem. Sei. 29: 648-55.
94. Krogh A., Larsson B., von Heijne G., Sonnhammer E.L.L. (2001) Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 305: 567-580.
95. Kuhn A. (2009) From the Sec complex to the membrane insertase YidC. Biol. Chem. 390: 701-706.
96. Kummer A.D., Wiehler J., Rehaber H., Kompa C., Steipe B., Michel-Beyerle M.E. (2000) Effects of threonine 203 replacements on excited-state dynamics and fluorescence properties of the green fluorescent protein (GFP). J. Phys. Chem. 104: 4791-4798.
97. Kyte J., Doolittle R.F. (1982) A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157: 105-132.
98. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.
99. Laishram R.S., Gowrishankar J. (2007) Environmental regulation operating at the promoter clearance step of bacterial transcription. Genes Dev. 21: 1258-72.
100. Lange R., Hengge-Aronis R. (1991) Identification of a central regulator of stationary-phase gene expression in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 5: 49-59.
101. Lee C., Li P., Inouye H., Brickman E.R., Beckwith J. (1989) Genetic studies on the inability of ß-galactosidase to be translocated across the Escherichia coli cytoplasmic membrane. J. Bacteriol. 171: 4609-4616.
102. Lee P.A., Tullman-Ercek D., Georgiou G. (2006) The bacterial twin-arginine translocation pathway. Annu. Rev. Microbiol. 60: 373-395.
103. Lewin B. Genes VIII. Upper Saddler River, NJ 07458: Pearson Education, 2004. P.283.
104. Link A.J., Dereth P., Church G.M. (1997) Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. J. Bacteriol. 179: 6228-6237.
105. Liu X.Y., Matherly L.H. (2002) Analysis of membrane topology of the human reduced folate carrier protein by hemagglutinin epitope insertion and scanning glycosylation insertion mutagenesis. Biochim. Biophys. Acta. 31: 333-342.
106. Livshits V.A., Zakataeva N.P., Aleshin V.V., Vitushkina M.V. (2003) Identification and characterization of the new gene rhtA involved in threonine and homoserine efflux in Escherichia coli. Res. Microbiol. 154: 123-135.
107. Loo T.W., Clarke D.M. (1995) Membrane topology of a cysteine-less mutant of human P-glycoprotein. J. Biol. Chem. 270: 843-848.
108. Luirink J., von Heijne G., Houben E., de Gier J.-W. (2005) Biogenesis of inner membrane proteins in Escherichia coli. Annu. Rev. Microbiol. 59: 329-355.
109. Ma J., Katsonouri A., Gennis R.B. (1997) Subunit II of the cytochrome bo3 ubiquinol oxidase from Escherichia coli is a lipoprotein. Biochemistry. 36: 11298-303.
110. Macfarlane J., Muller M. (1995) The functional integration of a polytopic membrane protein of Escherichia coli is dependent on the bacterial signal-recognition particle. Eur. J. Biochem. 233: 766-771.
111. Manoil C. (1991) Analysis of membrane protein topology using alkaline phosphatase and P-galactosidase gene fusions. Methods Cell Biol. 34: 61-75.
112. Manoil C., Mekalanos J.J., Beckwith J. (1985) TnphoA: a transposon probe for protein export signals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 8129-8133.
113. Matsumoto G., Mori H., Ito K. (1998) Roles of SecG in ATP- and SecA-dependent protein translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 13567-72.
114. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. (1999) Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat. Biotechnol. 17: 969-973.
115. McGuffin L.J., Bryson K., Jones D.T. (2000) The PSIPRED protein structure prediction server. Bioinformatics. 16: 404-405.
116. Miller J.D., Bernstein H.D., Walter P. (1994) Interaction of E. coli Ffh/4.5S ribonucleoprotein and FtsY mimics that of mammalian signal recognition particle and its receptor. Nature. 367: 657-659.
117. Môller S., Croning M.D.R., Apweiler R. (2001) Evaluation of methods for the prediction of membrane spanning regions. Bioinformatics. 17: 646-653.
118. Mori H., lto K. (2001) The Sec protein-translocation pathway. Trends Microbiol. 9: 494-500.
119. Muller M., Klosgen R.B. (2005) The Tat pathway in bacteria and chloroplasts. Mol. Membr. Biol. 22: 113-121.
120. Murphy C.K., Kalve V.I., Klebba P.E. (1990) Surface topology of the Escherichia coli K-12 ferric enterobactin receptor. J. Bacteriol. 172: 2736-746.
121. Nagamori S., Smirnova I.N., Kaback H.R. (2004) Role of YidC in folding of polytopic membrane proteins. J. Cell Biol. 165: 53-62.
122. Nandineni M.R., Gowrishankar J. (2004) Evidence for an arginine exporter encoded by yggA (argO) that is regulated by the LysR-Type Transcriptional Regulator ArgP in Escherichia coli. J. Bacteriol. 186: 3539-3546.
123. Nilsson I.M., von Heijne G. J. (1993) Determination of the distance between the oligosaccharyltransferase active site and the endoplasmic reticulum membrane. Biol. Chcm. 268:5798-5801.
124. Nishiyama K.I., Suzuki T., Tokuda H. (1996) Inversion of the membrane topology of SecG coupled with SecA-dependent preprotein translocation. Cell. 85: 71-81.
125. Ogawa W., Kim Y-M., Mizushima T., Tsuchiya T. (1998) Cloning and expression of the gene for the Na+-coupled serine transporter from Escherichia coli and characteristics of the transporter. J. Bacteriol. 180: 6749-6752.
126. Oliver D.C., Paetzel M. (2008) Crystal structure of the major periplasmic domain of the bacterial membrane protein assembly facilitator YidC. J. Biol. Chem. 283: 52085216.
127. Ormo M. B., Cubitt A., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., Remington S.J. (1996) Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science. 273:13921395.
128. Palmieri L., Berns D., Kramer R., Eikmanns M. (1996) Threonine diffusion and threonine transport in Corynebacterium glutamicum and their role in threonine production. Arch. Microbiol. 165:48-54.
129. Park J.H., Lee K.H., Kim T.Y., Lee S.Y. (2007) Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of L-valine based on transcriptome analysis and in silico gene knockout simulation. PNAS. 104: 7797-7802.
130. Peeters E., Le Minh P.N., Foulquie-Moreno M., Charlier D. (2009) Competitive activation of the Escherichia coli ArgO gene coding for an arginine exporter by the transcriptional regulators Lrp and ArgP. Mol. Microbiol: 74: 1513-1526.
131. Peterson J.H., Woolhead C.A., Bernstein H.D. (2003) Basic amino acids in a distinct subset of signal peptides promote interaction with the signal recognition particle. J. Biol. Chem. 278: 46155-46162.
132. Pittard J., Camakaris H., Yang J. (2005) The TyrR regulon. Mol. Microbiol. 55: 16-26.
133. Pohlschroder M., Hartmann E., Hand N.J., Dilks K., Haddad A. (2005) Diversity and evolution of protein translocation. Annu. Rev. Microbiol. 59: 91-111.
134. Polen T., Kramer M., Bongaerts J., Wubbolts M., Wendisch V.F. (2005) The global gene expression response of Escherichia coli to L-phenylalanine. J. Biotech. 115: 221-237.
135. Pop O.I., Soprova Z., Koningstein G., Scheffers D.-J., van Ulsen P., Wickstrom
136. D., de Gier J.-W., Luirink J. (2009) YidC is required for the assembly of the MscL homopentameric pore. FEBS J. 276: 4891-4899.
137. Popov M., Tam L.Y., Li J., Reithmeier R.A. (1997) Mapping the ends of transmembrane segments in a polytopic membrane protein. Scanning N-glycosylation mutagenesis of extracytosolic loops in the anion exchanger, band 3. J. Biol. Chem. 272: 18325-18332.
138. Poritz M.A., Bernstein H.D., Strub K., Zopf D., Wilhelm H., Walter P. (1990) An
139. E. coli ribonucleoprotein containing 4.5S RNA resembles mammalian signal recognition particle. Science. 250: 1111-7.
140. Pradel N., Decorps A.,'Ye C., Santini C.L., Wu L.F. (2005) YidC-dependent translocation of green fluorescence protein fused to the FliP cleavable signal peptide. Biochimie. 87: 191-6.
141. Pradel N., Ye C., Wu L.F. (2004) A cleavable signal peptide is required for the full function of the polytopic inner membrane protein FliP of Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319: 1276-80.
142. Price C.E., Driessen A.J.M. (2010) Conserved negative charges in the transmembrane segments of subunit K of the NADH:ubiquinone oxidoreductasedetermine its dependence on YidC for membrane insertion. J. Biol. Chem. 285: 35753581.
143. Prinz W.A., Boyd D.H. Ehrmann M., Beckwith J. (1998) The protein translocation apparatus contributes to determining the topology of an integral membrane protein in Escherichia coli. 273: 8419-8424.
144. Raine A., Uliers R., Pavlov M., Luirink J., Wikberg J.E., Ehrenberg M. (2003) Targeting and insertion of heterologous membrane proteins in E. coli. Biochimie. 85: 659-668.
145. Rapoport T.A., Jungnickel B., Kutay U. (1996) Protein transport across the eukaryotic endoplasmic reticulum and bacterial inner membranes. Annu. Rev. Biochem. 65:271-303.
146. Rapp M., Drew D., Daley D.O., Nilsson J., Carvalho T., Melén K., de Gier J.-W., von Heijne G. (2004) Experimentally based topology models for E. coli inner membrane proteins. Prot. Sei. 13: 937-945.
147. Ravaud S., Stjepanovic G., Wild K., Sinning I. (2008) The crystal structure of the periplasmic domain of the Escherichia coli membrane protein insertase YidC contains a substrate binding cleft. J. Biol. Chem. 283: 9350-9358.
148. Ribes V., Römisch K., Giner A., Dobberstein B., Tollervey D. (1990) E. coli 4.5S RNA is part of a ribonucleoprotein particle that has properties related to signal recognition particle. Cell. 63: 591-600.
149. Rost B., Casadio R., Fariselli P., Sander C. (1995) Transmembrane helices predicted at 95% accuracy. Protein Sei. 4: 521-533.
150. Rouanet C., Nasser W. (2001) The PecM protein of the phytopathogenic bacterium Erwinia chrysanthemi, membrane topology and possible involvement in the efflux of the blue pigment indigoidine. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 309-318.
151. Saier M.H. (1997) Multiple mechanisms controlling carbon metabolism in bacteria. Biotechnol. Bioeng. 58: 170-174.
152. Sambrook J., Russell D.W. (2001) Molecular Cloning: Laboratory Mannual, 3rd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
153. Samuelson J.C., Chen M., Jiang F., Möller I., Wiedmann M., Kuhn A., Phillips G.J., Dalbey R.E. (2000) YidC mediates both Sec-dependent and Sec-independent membrane protein insertion. Nature. 406: 637-641.
154. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 74: 5463-7.
155. Schell M.A. (1993) Molecular biology of the LysR family of transcriptional regulators. Annu. Rev. Microbiol. 47: 597-626.
156. Schoner R., Herrmann K.M. (1976) 3-Deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase. Purification, properties, and kinetics of the tyrosine-sensitive isoenzyme from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 252: 5440-5447.
157. Scotti P.A., Urbanus M.L., Brunner J., de Gier J.W., von Heijne G., van der Does C., Driessen A.J., Oudega B., Luirink J. (2000) YidC, the Escherichia coli homologue of mitochondrial Oxalp, is a component of the Sec translocase. EMBO J. 19: 542-549.
158. Serek J., Bauer-Manz G., Struhalla G., van den Berg L., Kiefer D., Dalbey R., Kuhn A. (2004) Escherichia coli YidC is a membrane insertase for Sec-independent proteins. EMBO J. 23: 294-301.
159. Shimomura O. (1979) Structure of the chromophore of Aequorea green fluorescent protein. FEBS Lett. 104: 220-222.
160. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. (1962) Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 59: 223-239.
161. Silhavy T.J., Benson S.A., Emr S.D. (1983) Mechanisms of protein localization. Microbiol. Rev. 47: 313-344.
162. Simic P., Sahm H., Eggeling L. (2001) L-Threonine export: use of peptides to identify a new translocator from Corynebacterium glutamicum. J. Bacteriol. 183: 53175324.
163. Snyder W.B., Silhavy T.J. (1995) (3-Galactosidase is inactivated by intermolecular disulfide bonds and is toxic when secreted to the periplasm of Escherichia coli. J. Bacteriol. 177: 953-963.
164. Spira B., Silberstein N., Yagil E. (1995) Guanosine 3', 5'-bispyrophosphate (ppGpp) synthesis in cells of Escherichia coli starved for Pi. J. Bacteriol. 177: 40534058.
165. Sumantran V.N., Schweizer H.P., Datta P.A. (1990) A membrane associated threonine permease encoded by the IcicC gene of Escherichia coli. J. Bacteriol. 172: 4288-4294.
166. Tani T.H., Khodursky A., Blumenthal R.M., Brown P.O., Matthews R.G. (2002) Adaptation to famine: a family of stationary-phase genes revealed by microarray analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 13471-13476.
167. Thornton J., Blakey D., Scanlon E., Merrick M. (2006) The ammonia channel protein AmtB from Escherichia coli is a polytopic membrane protein with a cleavable signal peptide. FEMS Microbiol. Lett. 258: 114-120.
168. TrOtschel C., Deutenberg D„ Bathe B., Burkovski A., Kramer R. (2005) Characterization of methionine export in Corynebacterium glutamicum. J. Bacteriol. 187: 3786-3794.
169. Tsien R.Y. (1998) The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67: 509544.
170. Tusnady G.E., Simon I. (2001) The HMMTOP transmembrane topology prediction server. Bioinformatics. 17: 849-850.
171. Typas A., Hengge R. (2006) Role of the spacer between the -35 and -10 regions in os promoter selectivity in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 59: 1037-1051.
172. Ubarretxena-Belandia I., Baldwin J.M., Schuldiner S., Tate C.G. (2003) Three-dimensional structure of the bacterial multidrug transporter EmrE shows it is an asymmetric homodimcr. EMBO J. 22: 6175-6181.
173. Ulbrandt N.D., Newitt J.A., Bernstein H.D. (1997) The E. coli signal recognition particle is required for the insertion of a subset of inner membrane proteins. Cell. 88: 187-196.
174. Urbanus M.L., Froderberg L., Drew D., Bjork P., de Gier J.-W., Brunner J., Oudega B., Luirink J. (2002) Targeting, insertion, and localization of Escherichia coli YidC. J. Biol. Chem. 277: 12718-12723.
175. Valent Q.A., Kendall D.A., High S., Küsters R., Oudega B. and Luirink J. (1995) Early events in preprotein recognition in E. coli: interactions of SRP and trigger factoi with nascent polypeptides. EMBO J. 14: 5494-5505.
176. Vrljic M., Kronemeyer W., Sahm H., Eggeling L. (1995) Unbalance of L-lysine flux in Corynebacteriurn glutamicum and its use for the isolation of excretion-defective mutants. J. Bacteriol. 177: 4021-4027.
177. Vrljic M., Sahm H., Eggeling L. (1996) A new type of transporter with a new type of cellular function: L-lysine export from Corynebacteriurn glutamicum. Mol. Microbiol. 22: 815-826.
178. Vrontou E., Economou A. (2004) Structure and function of SecA, the preprotein translocase nanomotor. Biochim. Biophys. Acta 1694: 67-80.
179. Wagner S., Bader M.L., Drew D., de Gier J.-W. (2006) Rationalizing membrane protein overexpression. Trends Biotechnol. 24: 364-371.
180. Wagner S., Pop O.I., Haan G.J., Baars L., Koningstein G., Klepsch M.M., Genevaux P., Luirink J., de Gier J.W. (2008) Biogenesis of MalF and the MalFGK(2) maltose transport complex in Escherichia coli requires YidC. J. Biol. Chem. 283: 1788190.
181. Wang X., Bogdanov M., Dowhan W. (2002) Topology of polytopic membrane protein subdomains is dictated by membrane phospholipid composition. EMBO J. 21: 5673-5681.
182. Ward W.W., Cormier M.J. (1979) An energy transfer protein in coelenterate bioluminescence. Characterization of the Renilla green-fluorescent protein. J. Biol. Chem. 254: 781-788.
183. Weber W., Helms V., McCammon J., Langhoff P. (1999) Shedding light on the dark and weakly fluorescent states of green fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:6177-6182.
184. Weiner J.H., Shaw G., Turner R.J., Trieber C.A. (1993) The topology of the anchor subunit of dimethyl sulfoxide reductase of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268: 3238-44.
185. Xie K., Dalbey R.E. (2008) Inserting proteins into the bacterial' cytoplasmic membrane using the Sec and YidC translocases. Nat. Rev. Microbiol: 6: 234-244.
186. Xie K., Kiefer D., Nagler G., Dalbey R.E., Kuhn A. (2006) Different regions of the nonconserved large periplasmic domain of Escherichia coli YidC are involved in the SecF interaction and membrane insertase activity. Biochemistry. 45: 13401-13408.
187. Xiong X.F., Reznikoff W.S. (1993) Transcriptional slippage during the transcription initiation process at a mutant lac promoter in vivo. J.Mol. Biol. 231: 569-80.
188. Yang F., Moss L.G., Phillips G.N. Jr. (1996) The molecular structure of green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 14: 1246-1251.
189. Yang J., Ogawa Y., Camakaris H., Shimada T., Ishihama A., Pittard A.J. (2007) folA, a new member of the TyrR regulon in E. coli K-12. J. Bacteriol. 189: 6080-84.
190. Yanushevich Y.G., Staroverov D.B., Savitsky A.P., Fradkov A.F., Gurskaya N.G., Bulina M.E., Lukyanov K.A. Lukyanov S.A. (2002) A strategy for the generation of non-aggregating mutants of Anthozoa fluorescent proteins. FEBS Lett. 511: 11-14.
191. Yi L., Celebi N., Chen M., Dalbey R.E. (2004) Sec/SRP requirements and energetics of membrane insertion of subunits a, b, and c of the Escherichia coli FiFo ATP synthase. J. Biol. Chem. 279: 39260-67.
192. Yi L., Dalbey R.E. (2005) Oxal/Alb3/YidC system for insertion of membrane proteins in mitochondria, chloroplasts and bacteria. Mol. Membr. Biol. 22: 101-111.
193. Yu Z., Koningstein G., Pop A., Luirink J. (2008) The conserved third transmembrane segment of YidC contacts nascent Escherichia coli inner membrane proteins. J. Biol. Chem. 283: 34635-34642.
194. Yuan J., Zweers J.C., van Dijl J.M., Dalbey R.E. (2010) Protein transport across and into cell membranes in bacteria and archaea. Cell. Mol. Life Sci. 67: 179-199.
195. Zakataeva N.P., Aleshin V.V., Tokmakova I.L., Troshin P.V., Livshits V.A. (1999) The novel transmembrane Escherichia coli proteins involved in the amino acid efflux. FEBS Lett. 452: 228-232.
196. Zelazny A., Bibi E. (1996) Biogenesis and topology of integral membrane proteins: characterization of lactose permease-chloramphenicol acetyltransferase hybrids. Biochemistry. 35. 10872-10878.
197. Zhang W., Bogdanov M., Pi J., Pittard A.J., Dowhan W. (2003) Reversible topological organization within a polytopic membrane protein is governed by a change in membrane phospholipid composition. J. Biol. Chem. 278: 50128-50135.
198. Zittrich S., Kramer R. (1994) Quantitative discrimination of carrier-mediated excretion of isoleucine from uptake and diffusion in Corynebacteruim glutarnicum. J. Bacteriol. 176: 6892-6899.
199. Закатаева Н.П., Кутукова Е.А., Гронский С.В., Трошин П.В., Лившиц В.А., Алешин В.В. (2006) Экспорт метаболитов белками семейства DMT и RhtB и их возможная роль в межклеточной коммуникации. Микробиология, Т.75, №4, 509-20.
200. Зубова Н.Н., Будавина А.Ю., Савицкий А.П. (2003) Спектральные и физико-химические свойства зеленого (GFP) и красного (drFP583) флуоресцирующих белков. Успехи биологической химии, Т.43, С.163-224.
201. Каташкина Ж.И., Скороходова А.Ю., Зименков Д.В., Гулевич А.Ю., Минаева Н.И., Дорошенко В.Г., Бирюкова И.В., Машко С.В. (2005) НаправленноеIизменение уровня экспрессии генов в бактериальной хромосоме. Молекулярная биология, Т.39, С.823-831.
202. Ковальская О.Н., Сергиев П.В., Богданов А.А., Донцова О.А. (2007) Структурно-функциональная анатомия сигналузнающей частицы: от бактерий до млекопитающих. Успехи биологической химии, Т.47, С. 129-188.
203. Кутукова Е.А., Закатаева Н.П., Лившиц В.А. (2005) Экспрессия генов, кодирующих белки семейства RhtB, зависит от глобального регулятора Lrp. Молекулярная биология, Т.39, №3, С. 374-378.
204. Миллер Дж. (1976) Эксперименты в молекулярной генетике. Изд-во: Мир, -436с.
205. Овчарова И.В., Еремина С.Ю., Миронов А.С. (2003) Определение функциональной значимости нуклеотидного состава в области старта транскрипции гена udp Escherichia coli. Генетика, Т.39, №1, С. 1-9.
-
Цыренжапова, Ирина Сергеевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2010
-
ВАК 03.01.03
- Транспорт аминокислот из клеток Escherichia coli: генетический контроль, регуляция и применение при конструировании штаммов-продуцентов
- Идентификация и изучение генов Escherichia coli, участвующих в экскреции гомосерина и треонина
- Клонирование и функциональная характеристика гена ygjG из Escherichia coli K12
- Изучение роли первичной структуры щелочной фосфатазы и ее секреция через цитоплазматическую мембрану Escherichia coli
- Частота обменов при конъюгационной рекомбинации у escherichia coli К-12 и структура белка reca
