Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генов орнитинацетилтрансферазы Corynebacterium glutamicum и леваназы Bacillus subtilus и их применение для конструирования продуцентов аргинина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение генов орнитинацетилтрансферазы Corynebacterium glutamicum и леваназы Bacillus subtilus и их применение для конструирования продуцентов аргинина"

о U-

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК АРМЕНИИ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

ПЕТРОСЯН Павел Кимикович

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОВ ОРНИТИНАЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM ■ И ЛЕВАНАЗЫ BACILLUS SUBTILIS И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ АРГИНИНА

Специальность — Биотехнология Ч-. 00. 14

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соисканиа ученой степени кандидата биологических наук

Абовян— 1995

Работа выполнена в НИИ Биотехнологии Министерства промышленности РА

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор в. а. Саканян

член-корреспондент ИА Армении, доктор биологических наук, профессор Ж. И. Акопян

. кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник ■ М. Б. Читчян

Ведущая орган'ц

Ереванский государственный университет, кафедра физиологии растений и микробиологии биологического факультета

Ü¿/cúfp^

j Защита дисертации состоится ———f1995 г. efS^iacoB на заседании Специализированного Совета 018 в здании Президиума НАН Армении (Отделение естественных наук)-по адресу: 375019, Армения, г. Ереван, пр. Баграмяна, 24

: С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института микробиологии НАН Армении.

Афторефератразослан /Т м. iggs г.

■Илмб^с

Ученый секретарь Специализированно Совета, кандидат биологичэских наук

Л. А. Пивазян

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современной биотехнологии исполь-звание генно-инженерных штаммов-продуцентов биологически актив-. JX соединений, в том числе аминокислот,- требует фундаментальных ¡следований клонируемых генов - особенностей их структуры и рефляции.

Аминокислота аргинин широко используется в Фармакологии, плевой промышленности и сельском хозяйстве. Крупнотоннажное поучение L-аргинша преимущественно основано на микробиологиче-сом способе производства. В нашей стране и на территории СНГ ргинш в промышленных масштабах не производится вводу отсут-гвия технологичных шташов-продуцентов. Поэтому важное значение леет проведение исследований, направленных на создание высоко-зхнологичных штаммов, продуцирующих L-аргинин.

К началу работы гены биосинтеза аргинина Oorynebaoterluni lutamlcijuii-не были исследованы на молекулярно-гекетическом уров-з. Между тем интерес представляет орнитинацетилтрансфераза .glutamícum, которая выполняет ключевую стадию биосинтеза арги-ша и, в отличие от аналогичных ферментов Escherichia coll, не визируется конечным продуктом пути биосинтеза (Шака. 1966). х предположили, что экспрессия гена оршиинацетилтрансферазы .glu ta га 1с им в клетках E.coll может обеспечить в них сверхсинтез ргинина. Исследования в этой области способствовали бы лучшему эниманию организации и регуляции пути биосинтеза аргинина у ко-янеформных бактерий, молекулярная генетика которых, несмотря на í интенсивное использование в промышленных производствах, изу-эна недостаточно.

Технологичность продуцентов определяется способностью син-ээировать продукт на дешевых средах. Для придания штаммам .coll, продуцирующим биологически активные вещества, способно-ги синтезировать целевой продукт на средах со сравшгтельно де-гвой сахарозой в качестве источника углерода возможно введение клетки продуцента гетерологичных генов, контролирующее утиди-зцш сахарозы. Известно, что леваназа Bacillus subtlU3 являет-' я секреторным ферментом, гидролизирующем сахарозу до утилизиру-иых клетками В.coi i моносахаридов iKunst et al., 1977). к нача-/ работы, однако, отсутствовали сведения о выделении гена лева-1зы на молекулярном уровне и о его экспрессии в клетках F.eoll.

В связи с этим представляется актуальным выделение генов

биосинтеза аргшина C.glutamlcura и леваназы B.subtills к изучение их организации и гетерологичной экспрессии в клетках E.coll. а также, изучение возможности их использования для создания высокотехнологичных штаммов E.coll - продуцентов L-аргинина.

Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение возможности использования генов орнитинацетилтрансферазы argJ C.glutaiiilcLuii и гена леианазы sacC B.su)itiiis для конструирования рекомбинантных продуцентов L-аргинина и разработка подходов к созданию штаммов-продуцентов с улучшенными технологическими характеристиками. В соответствие с этим были поставлены следующие задачи:

- молекулярное клонирование гена argJ О.glutamlcum:

- структурный и функциональный анализ рекомЗшантных плазмвд, содержащих ген argJ:

' - изучение экспрессии выделенных генов биосинтеза аргшина C.glutamieiuii а клетках Б.co.ll:

- молекулярное клонирование гена saсО В.sübt Ills;

- структурный и функциональный анализ рекомбшантных плазмид несущих ген sacO:

- изучение экспрессии гена леваназы в клетках E.coll;-

- конструирование на основе генов saco и argJ штаммов E.coll-продуцентов L-аргинина.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые осуществлено молекулярное клонирование генов биосинтеза аргинина C.glutamlcun argß. argD и argJ. Определены полные нуклео.тидные последовательности этих генов и показано, что они образуют кластер с другими arg генами, располагаясь на хромосоме O.glutaral-eiuii в порядке argC-J-B-D-F. Установлено, что продуктом гена argJ является неингибируемая аргинином монофункциональная орни-тинацетилтрансфераза, не имеющая N-ацетилглутаматсинтазной активности. Установлено наличие у гена argB функционального в клетках E.coll вторичного промотора. Осуществлено молекулярное клоьирование гена леваназы sacC B.subtilis. Показано, что экспрессия гена леваназы в клетках E.coll обеспечивает нормальный рост рекомбинантных штаммов на средах с сахарозой в качестве единственного источника углерода. Показана возможность существования у гена sacC промоторной последовательности, с которой осуществляется транскрипция гена в клетках E.coll. Предложен эффективный способ стабилизации поддержания рекомбинантных плазмид в

итаммах E.eoll. Показана возможность использования гена argJ glutamieum для конструирования продуцентов аргинина. Сконструированы рекомбинантные плазмиды, объединяшие в своем составе ген леваназы и ключевые гены биосинтеза аргинина из различных источников. С использованием этих плазмид получены стабильные высокоактивные штаммы E.ooll - продуценты аргинина. На основе сконструированного штамма-продуцента Е.соН AVl92(pAPG2S) разра-Зотан микробиологический способ получения L-аргинина.

На основе полученных данных в НИИБиотехнологии МП РА разработаны лабораторный и опытно-промышленный регламенты на получение высокоочишенного L-аргинина, ддадие возможность развернуть крупном.-, г-";:'" ■ • ; г¡ходом целевого продукта 35 г/л

на уровне развитых стран. Опытно-промышленный регламент используется для организации производства L-аргинина на Воронежском заводе кровезаменителей.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Выделены гены биосинтеза аргинина O.glutamiсим argJ, argВ И argD, и определены их нуклеотидные последовательности;

- ген argJ C.glutamlciim .кодирует синтез монофункциональной Нг-1,-орк;1тин : L-глутамат-П-ацетилтранеферазы, не ингибируемой аргинином:

- выделен ген леваназы sacC B.subtllla;

- транскрипция гетерологичных генов argß и аасС в клетках ß.coll осуществляется с собственных промоторов:

- экспрессия гена леваназы B.subtilis в клетках E.eoll обеспечивает нормальный рост рекомбинантных штаммов и синтез целевого продукта на средах с сахарозой в качестве единственного источника углерода :

'- введение гена леваназы в состав плазмид стабилизирует их поддержание в клетках Е.соН при росте рекомбинантных штаммов на средах с сахарозой:

- ген arg J C.glutairiioum обеспечивает в рекомбинантных штаммах E.eoll с дерепрессированной транскрипцией arg-генов повышенный синтез аргинина;

- генно-инженерный штамм E.eoll AV192ipAF:G2S) (LGE-28, ВКПМ В-4119) является высокотехнологичным продуцентом L-аргинина, обеспечивающим в оптимальных условиях выход целевого продукта на уровне 35 г/л.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения,

обзора литературы, методической части, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. .Обзор литературы состоит та трех глав, касающихся анализа данных о<3 организации и регуляции генов утилизации сахарозы у бактерий, биосинтезе аргинина и улучшении технологических характеристик продуцентов аминокислот. Экспериментальная часть также состоит из трех глав, которые посвящены исследованиям гена леванаэы В.япМ, 1Т 1я, генов биосинтеза аргинина о.йТ^япНппт и их использованию для конструирования продуцентов аргинина. Работа изложена на юг стр. маимнотшсного текста, включая в таблиц и 14 рисунков. Библиография включает 11В наименования.

Публикация и апробация работы. Основное содержание работы опубликовано р шести печатных трудах. Материалы работы докладывались на Т Научной конференции молодых ученых НИТИА, (Ереван, '1987), УТТ Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Прага, 1094) и на Научном семинаре ВДЙБиотехноло-гии (Ереван, 1995).

№ГОДО ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе, приведены в табл.1.

Для выращивания бактерий использовали среды Т,в,. Т,-агар, М9 с необходимыми добавками антибиотиков и ростовых факторов (Миллер, 1976). Состав ферментационных сред для продукции аргинина в колбах и процедура описаны -ранее (Овсепян и др., 1987). При наработке аргинина в ферментаторе среда содержала сахапозы-65, концентрата рыбного гидролизата-5, сульфита аммония -15 г/л. Процесс велся при 30°С в условиях интенсивной аэрации с подпиткой среды сахарозой до ее содержания ?% и рН-статйрованием аммиаком (рН6,5-75).

Концентрацию аргинина в к.уяьтуральной чадноети определяли бумажной уроматеграфией и с помощью аминокислотного анализатора.

Процедуры выделения, клонирования и электрофореза . ДНК описаны у Мяп1аМя р* я1. (19Я2).

Для клонирования гена леваназы был использован банк генов В.япЪННя в штамме К.ог>11 НВ1П1, сконструированный на векторе р№79.1,по сайту ГлпН! (получен от И.Рапопорта, Франция). Клонирование гена ррнитинацетмлтрансфераяы проведали из банка генов ,0,.д1чГяп11^пт, сконструированного на векторе ркИЯ27 в штамме К.ппИ ХЯ1Г>?..

Таблица 1.

Характернотика использованных штаммов и плазмид

.Штамм Генотип Источник

E.eoli К-12 Дикий тип ЛаО.коллекция

Р4Х Ufr metB relA Н.Глансдорф.

Р1ХВ2 Ufr metВ reíA argR Н.Глансдорф

ХА4 argA nalA LiadR С.Баумберг

ХВ25 argB nal A LisdR

ХСЗЗ argP- nal A rpuB hsdíí

РТ2 argD his Uva metB pro AB rp3L

XS1D2 Д1С1 ippj-argE) nalA rpoB tedR _ « _

XF AX111(proAß-argF-lac) argl

XG31 argG his rpoB rpsL hsdR

AV192 Hfr met thr reí A recA argR aec А.Х.Чахалян

E.coll НВ101 F leu В proA thl JaeZ supE recA rpsL hsUM lisdP. Лаб.коллекции

C.glutaiiilouni Дикий тип АТСС 13032

Елазмиды

рВКЗ"7 Lila tet Лаб.коллекция

pGA46 ea t

pUC 7 fila lacZ _ м_

р1Ю9 bla lacZ _ «1 _

pUC 18 bla lacZ _ г» _

pBF;327-kan pAF¡G2 kan tet argA E.coll Настоящая работа Лаб.коллекция

pRSA34 argA B.subtllls Лаб.коллекция

Секвенирование ДНК проводили по методу Сэнгера (Sanger, 977 ).

Сахаразную и инулиназную активности определяли в клеточных кстрактах по образованию восстанавливающих Сахаров методом омодьи-Нельсона t'Somogyl, 1952). Продукты гидролиза сахарозы и нулина аналияировали Методом ТСХ (Azharl et al., 1989). Реакции роводшш в основном как описано у Fouet et al. (1982) , с езначительными модификациями.

Активности орнитинацетилтрансферази (ОАТ) и 11-ацетилглута-атсинтазы (N-АГС) определяли как описано у Denes (1970) и Van ? Oasteele (1990К Активность Н-ацетшглутаматцюсфотрансферазы

(U-AKT) определяли методом с использованием Per, 13 (tuaka, .1966), а ацетшгарнктиназы- по методу Фогеля-НакЛеллана, как описано у Какяпуап et. я1. (1993), и методу т*>пея (1970), в опытах по ингибировангоо грубые клеточные ¡экстракты предварительно пропускали через колонку с Сефадексом с-25, уравновешенную экстракционным буфером.

Очистку клонированной леваназы проводили из грубого клеточного экстракта К.<чи1 Хл4([<чш ) обычными методами фракционирования сульфатом аммония, ионообменной хроматографией на 1Ж-32 с элшцией ступенчатым градиентом концентраций чатрий-фосфптного буфера о pH 7.1 (П-г»,г м) и хроматографией на Сефадексе о-ЮО. Электрофор er» белка проводши в Ю% полкакриламидном геле по Лем-МЛИ (Тя-тм I 1, 1970).

Стаби.ш ног ть наследования плазмид определяли путем подсчета количества ^.пот.ж, сохранивших гглазмидныЯ маркер при выраашвашш в течении очределенного числа генераций в жидких средах с различными источниками углерода.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЗДеНИЕ 1. Клонирование и экспрессия в клетках R.or»]i гена леванаэн R.fuiht П1я.

Для клонирования генов, способных придать клеткам К.coli сахарозопололсительный генотип, мы воспользовались банком генов B.Riilit 111« на космиде 1>0Н79.1, сконструированным в F.öoH НВ101 (Aulvrt et al., 19Я2). Клонирование велос'ь по прямому отбору , ре-комбинантов НВ101 на средах с сахарозой в качестве .единственного источника углерода. В результате был выделен клон, содержаний плаэмиду, обозначенную наш р2И. Мы установили, что при трансФормации р211 не утилизирующих сахарозу известнчх штаммов fi.ooll ХЛ4, гкоо, HRtot и др. рексмбингшты с высокой частотой приобретали способность расти на сахарозе. Таким образом было показано, что откло!гированкнй Фрагмент ДНК хромосомы B.suhU 1>,я содержит функциональный ген, определяющий синтез фермента, гидролизующего сахарозу. Рекомбинантный характер р211 бьиг установлен рестрикци-онным анализом (рис.1). Для локализации сахаролитического гена на отклонированном фрагменте ДНК были получены варианты с деле-циями различных час/ей вставки р?М . При получении этих делециЯ отбор трансформднтов каждый раз проводился селекцией на средах с сахарозой в качестве единственного источника углерода. На первом

Р1.А4 Р1Р3101

р40

ЕВ^НР Хта( £ВЕ

Ь13 1 уга*

• Е Р

Ыа

8 ВН Р Хш1 Е

И н н

1

Н Р £

" а...........-л... ВНЕ- Р.........

рВП327-кал I Ь| ПП к*п

И н н 0211 Ь=±===±=

Н ^ ИГ: Р........

ППВ79.1 |__И" I

НР ЕЕ ..... "

85

рБА824

НР

не ({01)

са!

1 2 кЬ

1С. 1. Рестривдионныэ карта ллазмид о геном леваиазы В.зиЫШз. Двойной линией отмечена ДНК В.зиЫШа; фрагмент ДНК с геном аасО затемнен. Ыа - ген р-лактамазы; кап - ген устойчивости к канамшину: ае! »-нефункциональный ген устойчивости к тетрациклину. Отмечены сайты рестрикции: В-ВатНГ; /¡-/1Ик1Г1Г: Е-ЕеоМ; Р-РвШ Б-йаН.

этапе была получена плазмида р40, содержащая на векторе рВП327-• kan EcoRI/HlndlII- фрагмент клонированной ДНК размером 6,1 т.п.о., (рис.1). Минимальный EouRI/HimiIir-фрагмент размером 2,7 у.п.о. вставки плазмиды р40 был затем переклонирован на pBR327, и из выросших трансформантов была выделена плазмида, обозначенная нами pSlll. Дальнейшая деления вставки была получена клонированием PstI/EcoM-фрагмента psui на pUC7 (плазмида pLA4): для этого сначала в:оПТ/Н1»Ш1-фрагмент [fiUl был переклонирован по тупым концам в сайт Hindi p!JC7 и получена рекомбинантная плазмида pIPSlOl. Плазмида- pLA4, содержит минимальный фрагмент Pstl/EcoRI размером 2,4 г.п.о. с функциональным сахаролитическим геном. Рестржционные карты делецшнных производных р211 представлены ьа Г-;1С. 1.

Для идентификации отклонированного гена были исследованы ферментолкьиие активности в экстрактах клеток E.coli ХА4, содертших рекомбинантную плазмиду ï<SUI . Было установлено, что экстракты XA4(pSUl), в отличие от экстрактов бесплазмидного штамма, наряду с сахарозой гидролизуют таюке инулин: образование при этом фруктозы прослеживается тонкослойной хроматографией. Поскольку из трех ферментов B.subtllls. гидролиз уших сахарозу, только леваназа обладает инулиназной активностью (Kuiist et al.. 1977), эти данные позволяют идентифицировать отклонированный ген как ген леваназы sacO (прежнее название sacL). йнулиназная активность, измеренная у XA4(pSUi), дает величину 4,25 мкмоль фруктозы в мин/мг белка. При этом клетки E.coli, содержащие, ген леваназы, не способны расти на инулине. Это можно объяснить тем,

Таблица 2.

Сахаразная активность в штаммах E.coli К-12. несущих ген леваназы В.subtil ь

Штамм

Углевод в ростовой среде

Удельная активность, мкмоль/мин/мг белка -ОТО-

XÂ4 <рОВ79.'П

глюкоза

ХА4 (р211) ХЛ4 ' (р40) ХЛ4 (pSUl) ХА4 <pSUl)

сахароза

0.55

сахароза

1,40

сахароза

3.54

глюкоза

3,42

-tino инулин не поступает в периплазматическое пространство кле-рок, куда секретируется леваназа (РП^Ъя al., I9fifi).

Экспрессия гена яягг, в клетках к.ооп была оценена по :аха разной активности, измеренной в штаммах ХА4, несущих иазмиды р211, р40 и pRtn , и представленной в табл.2.

Как видно из таблицы, глюкоза не оказывает катаболитной рецессии на ген - по крайней мере в составе многокопийной мазмидн. Показательно, что активность леваназы коррелирует с [иолом копий ячос-рекомбинантннх плазмид.

Для того, чтобы выяснить, экспрессируется ли ген яаос, с иазмидных промоторов или его транскрипция в клетках К.col 1 происходит с собственного промотора, PstT/RamHT-фрагмент pTPRIOl, ¡клтаиций целиком структурную часть гена яжч1., был переклониро->ан по сайтам l+¡tT и ИишН7 на вектор pf!A4fi, не содержащий в этой области сквозных промоторов (An arirt Fri^,sf>n, 1979). В результате шла получена конструкция, обозначенная нами (рис.1). При

фансформации [><;лн?.4 штаммов Е.ооц кпетки приобретают способ-!ость утилизировать сахарозу. Сахаразная активность в экстрактах [А4(pfiAS24) составляет примерно 1,0 мкмоль/мин/мг белка. Эти [анные лозволяот считать, что транскрипция гена яяof! осущестч-[яется с собственных промогорннх ' структур, расположенных в гределах 100 нуклеотидов от сайта Рягг до вероятного участка ■вязнвания рибосом, выявляемого на отсеквенировянном HInriTTT/ :таТ-фрагменте яасС. К настоящему времени, в т.ч. в параллельной >аботе (Mart.in-Vprstraet« et al., 1990) не удалось пока выявить юзможных промоторннх последовательностей saof. и работа в этом управлении продолжается.

Продаст гена etanc-, экспрессируемый в клетках R.ool 1, был вделен и очищен из экстракта XA4(psnt) в виде гомогенного белка ю свойственной леваназе инулиназной и сахаразной активностями. !ыделенная леваназа имеет мол. вес около 75 кДа, что хорошо согласуется с секвенсными данными. Очищенная леваназа стабильна [ри хранении (в суспензии с насыщенным сульфатом аммония сохра-(яет почти 100% активности в течении 5 лет при 10-14° С) и может >ыть использована в технологиях по получению фруктозы из расти-'ельного инулина. Высокая активность леваназы в клетках E.ooit гозволила депонировать штамм ХА4 (ркш) в качестве продуцента ле-аназы (Коллекция промышленных микроорганизмов, Москва, ВКПМ В-1822).

Z. Клонирование, анализ и экспрессия в к.ппн генов оиосинтеза аргинина o.giutamlmmi.

Первоначальное клонирование генов биосинтеза аргинина r4.giut.am1oimi Рыло проведено по сайту Нплиг в рВГ;327 по комплементации мутац'ги argF, (ацетилорнитичаза) в штамме Г.noli хяиг>2. Из выросшего ггрототрскЦюго по аргинину клона была выделена ре-комбиначткая плазмида, обозначенная нами рТА2, содержащая вставку примерно в 4,3 т.п.о. Рестрикционная карта рТА2 приведена на рис. ?. Чтобы определись, какие еще аргининовме гены присутствуют на отклонированном (фрагменте ДНК, плазмидой рТА2 трансформировали штамм! '''.па11, мутантные по одному из генов argA, В, О, V.r, и Н (см.табл. 1). При отборе трансформантов на средах без аргинина рТА? 1-г)идавала прототрофность по аргинину только штамму ХВ25, кокта «"нтируя мутацию argR (N-ацетилглутаматфосфотрансфе-раза). Комплементация мутации argfi (N-ацетшюрнитинаминотрансфе-раза) определялась в РТ2 по восстановление ауксотргхцюсти по пролину (Hikann «t al., 19rtfi). этот способ позволил установить наличие на рлазмиде рТА? также гена argt). в соответствие с принятой номенклатурой выделенный на рТА2 ген г:.glutamic™, компле-ментирулций мутацию argR, обозначен arg.i, поскольку .его продукт является ОАТ, что будет покачяно ниже.

Чтобы локализовать гены arg.i и argR на отклонированном Фрагменте, были получены различные делеционные производные вставки рТА2. Плазмида рХЕ1 была получена клонированием большего XhoT/RcnRT-фрпгмента вставки рТА2 на pir.lfi по сайтам SalT-F,ooRT; в рЕХ4 тот же Фрагмент клонирован на рнсл в обратной ориентации по отношению к lan-промотору вектора. Плазмида рНХЗ была получена клонированием минимального Н1ЫТТТ/Х(юТ-фрагмента размером 1,9 т.п.о. на рчпя по сайтам Н1тк1ТТТ—Кя 1 т. Клонированием этого 'же фрагмента на p<iA46 по сайтам HlnrtTTT-SalT получена плазмида pf5AR4. Делецией участка в рТА2 между сайтами FonRV получена плазмида роге: плазмида рг>нв получена делецией участка вставки между сайтами Hindi тт. Делеционные производные предствленн на рис. 2. При трансформации этими плазмидами XS1D2 прототрофные клоны получаются только в случае рХЕ1 при индукции -промотора изопропил-р-тиогалактозидом (ИПТГ). В то i;¡e время все плазмиды кроме pDRfi комплементирушт мутацию argR в ХВ?5. Таким образом мы установили, что ген argR находится в пределах HlnrtTTT-XhoT-фрагмента размером -1,9 т.п.о., а ген arg.i - вне меньшего фраг-

РХЕ1

pUC9

3 E.

LL_

•Pl«e

pucta

mm* X . ■• EV EV " н "- E

pEX4 b^m^mmmiWasiiai

Plao ■

SE

EX X EV H EV E

ронв ¡в^шква^^^а!

E HEV H E

pDES

EX X EV HEV H E

pTA2

РЭАВ4

Ыа

Р«Й '*■ EH BffnHI _I_Il_!_I

3

P0R327.

(S/XI H

кттттшмйятшшят!

(Htl

CEI

(bit) <

2kb

J

Рис.2. Рестрикционныв карты плазмид с генами биосинтеза аргинина C.glutamicum.

Направление транскрипции с Jас-промотора отмечено стрелкой. Ыа - ген р-лактамазы: tet - ген устойчивости к тетрациклину;-cat - ген устойчивости к хлорамфениколу. Отмечены сайты рестрикции: E-EeoRI: EV-EcoRV; H-HindIII; S-Sall; X-Xhol. ДНК С.glutamicuni затемнена.

мента EnoRT/XhoT/XImT (см.рис.2).

Была определена также полная нуклеотидная последовательность выделенного фрагмента ДНК хромосомы г:.glutamic™. Исходя из этих данных и по гомологии с известными последовательностями, на отклонированном фрагменте мовдо установить также наличие 3•- . концевой час?ти гена argo и S-концевой части гена argF и располо жить гены в порядке artJi-arg.l-argR-argn-argF; направление транскрипции от ;wg.T KQargn. Отсутствие комплементации мутации argE в случае рЕХ4 (в присутствие ИПТГ) можно объяснить обратной ориентацией гена arg.l по отношению к Ian-промотору. Следовательно, ферментативная активность, определяемая рТА2, в штаммах Fï.ooll является следствием транскрипции arg.7 с промотора, расположенного на самом векторе pRR327.

Наибольший интерес представляет характер активности гена arg.T fi.glutamlonm. Для определения ферментативных активностей,-отвечапцих за комплементацию мутации argE в XRirtë, в штаммах ХА4 и XS1P?.. несущих плазмиду Х>ТА2, были измерены активности N-ATC, ОАТ и йцетклорнитинстзы (АО). Результаты представлены в табл.3.

Таблица 3.

Ферментативные активности, определяемые геном arg.T о.glutamlnnm в клетках Е.ооП

Удельная активность, Штамм , гамолъ/мин/мг белка

М-АТС ОАТ . АО'

ХА4 • 0,001 <0,01 - .

ХА4(рТА2) 0,001 0,36

xsir)2(pTA2) - о,за <0,01

ХЯ1Г)2 - <0.01 <0,01

Из таблицы -видно, что в отличие от хозяйских штаммов, лишенных активности ОАТ, экстракты плазмидных производных ХА4(рТА2) и XSlD2(pTA2) осуществляют реакцию переноса ацетильной группы с ацетилорнитина на глутаминовую кислоту. При этом рТАй не определяет -ни активности ацетилорнитиназы, ни N-АГС. Таким образом, выделенный нами ген arg.) n.gint.amlnim кодирует синтез монофункциональной ОАТ (^-ацетил-Т.-орнитин: Т.-глутамат-И-ацетилтрансфе-раза, Е.С.2.3.1.35) - в отличие от аналогичных ферментов из П.янЬМИя и Н..чt<=>aгоthermoph 11ия. способных ацетилировать глу-

таминовую кислоту также за счет ац^тил-СоА (Язкяпуяп »1., 1993).

Таблица 4,

Ингибирование активности орнитинацетилтрансферазы

Условия реакции ' Удельная активность

мкмоль/иин/мг белка

контроль ! | 0,39

[,-орнитин (? мМ) | | 0,18

Ь-орнитин (100 мМ) 1 ! 0,0?,

Т.-аргинин (100 мМ)

Мы определили, что добавление аргинина в ростовую среду не репрессирует образование одт в рекомбйнянтных штаммах. Ингибиро-вание активности этого фермента метаболитами биосинтетического пути представлено в табл.4. Как видно из таблицы, орнитинацетил-трансфераза почти не чувствительна к аргинину, однако ингибиру-ется конечным продуктом реакции:- орнитином. „

Экспрессию гена ягдВ .ц!и|ят1оит в клетках Е.соИ опреде-^ ляли по активности М-АГФГ (Е.С.2.7.?,.8) в различных условиях роста (табл.5). Из приведенных данных(ридн0, что ген ягеВ (\g1ii-

I Таблица 5.

Активность н-ацетипгдутямат[£осфотраноферазы Г1.£1пг.яп11гч1т в клетках Е.опи

Штамм Условия роста* 1 Удельная активность мкмоль/час/мг белка

ХВ25 1,-аргинин <0,005

ХИ?Я(рТА?) без добавок 2,1 .

ХН25(рТЛ?) Г,-аргинип 2,1

ХВ25(пПЛН4) . без добавок 0,8

1 .-аргинин <0,005

'Примечание: конечная концентрация аргинина в среде - 5 мМ

Гят1'Ч11п обеспечивает в клетках К.спн значительную активность М-АГФГ (активность собственного гена Е.опН, измеренная в Р4Х, оценивается в 1,3 мкмоль/час/мг белкя - Сяканян и др., 1993). Более низкяч активность в хиг.ч^яАРМ > отражает, очевидно, низкую копкПн^сть вектора ¡|<;л4К. Поскольку в области Н1гн1ТТ"Г—Кя1Т вектора !1(;а4й. пнутрь кпт"ро?1 клонирован ген яг/;В в случае рПАГ<4,

но происходит транскрияшгл с плазмшших промоторов (An ami Frle-sea. 1979). следует полагать,, что транскрипция argB в клетках E.coli может инициироваться с собственного вторичного промотора. Ранее наличие вторичного промотора было показано для argB ¡'„ste-arothemophllus (Sakanyan et al., 1993). В то же время аргинин, но не opHinini, ингиблрует активность Н-АГФТ G.glutamleiMi (см. табл.6).

Таблица 6.

» «

0 Мотивирование активности К-ацетилглутаматфюсфотраьсфэразы С .glutamlciun

Удельная активность, Штамм . мкмоль/час/мг балка

В присутствие

контроль L-орнигин L-аргинин (100 мМ) '(10 мМ)

ХВ25(рТА2) 2,1 .2,1 ' 0,6 ХВ25(р!1ХЗ) ' 2,3 2,7 1,0 ..........XB25(pGAB-i) ...... 0,8 0,2

.Полученные результаты указывает на реальные предпосылки создания выеокомагианых продуцентов аргинима на основа генов ле-ванази и ОЛГ. Наш исследования были направлены на конструирование штаммов В.coli, сштазирушак аргинин на средах с сахарозой; m стабилизацию наследования рекомбинантных плазмид и продуцентах; на повышение синтеза аргинина в клетках.

• 3. Создание продуцентов аргинина с использованием генов леванаэы и орштшацетилтрансферазы.

Способность гена argJ обеспечивать повышенный синтез ар-ринша определяли в штрммах Р4ХВ2(рТА2) и AVi92(pTAZ). Оба ко-еяйсщк штамма из-за мутации argR икают дерепрассированный синтез всех формантов пути биосинтеза аргининакроме того, штамм AV192 синтезирует до 10 г/л глутаминовой кислоты, что снимает лимитацию по предшественнику аргинина. В колбочной ферментации Р4ХВ£(рТА2) продуцирует за 66 часов 8,8 г/л аргинина (все данные Приводятся с учетом выпаривания). Продукция аргинина штаммом ■ AV192(pTA2) составляет 16,6 г/л, что близко к максимально возможной в среде, содержащей в качестье источника азота Z,B% сульфата * аммония. В качество источника углерода в ферментационной

среде была использована глюкоза. В'аналогичных опытах штаммы, содертащие плазмиду рГ>Н6 с генами гм-gB й argD, но Сеэ argJ, практически не продуцируют аргинин.

Таким образом, показана возмошость использования гена ОАТ для создания активных продуцентов аргинина.

Известно, что сахароза является более дешевым источником углерода, чем глюкоза. Мевду тем хозяйские ■ штаммы E.coli, используемые при получении продуцентов! не утилизируют сахарозу, что снижает рентабельность производства. Высокий уровень экспрессии леваназы в клетках Е.ооЛ был использован нами для конструирования штаммов, продуцирующих аргинин в ферментационных средах, содержащих сахарозу. С этой цель был получен ряд плаз-тещ, объединяют« в своем составе ген «аг-0 и ген argJ или argA. Плазмида pBSA34S получека клонированием Фрагмента pßSA34 с геном argA В.subtiles по сайтам Hlmllll-BaitiHI pSIJl: плазмиды pSBJl и pSBJ2 полнены клонированием &шН1-фрагмента pTPSlOl (рис.1) с геном saeC B.subtllls по сайту ВашНГ рТА2 и отличаются ориентацией фрагмента. Плазмида pAHG2S получена клонированием фрагмента PamHI/SaJI pAHG2 с геном argA Eicoli по сайтам BamHI-Sall плаз--' миды р40 (рис.1). Полученные плазмиды представлены на рис.3. Для определения продукции аргинина- на средах с сахарозой плазгздцц были перенесены в штамм E.coli AV192, ;0т5ор трансформантоп велся на минимальной среде МЭ с 0,1% сахаророй и канамицином в случав PARG2S и ампициллином в случае pßSA345 и pßBJ. Данные по продук-

Таблица 7.

Продукшга аргинина рекомбинантными производными штамма E.coli AVI92 в ' эмочтациоиных средах с различными источниками углерода

Плазмида Продукция аргинина, г/л

6% глюкозы 6% сахарозы Меласса*

pBSA34 16,9 . - -

pBSA34S 16,1 17,2 ; 15,7-

рТА2 16,6 - ■ -

pSBJl - 16.2 17.0 15,3

pSBJ2 15.8 16,9 15,5

OARG2S 15,5 16.8 15,8

'Примечание: 6% сахара в пересчете на глюкозу.

■pSBJ2

pSBJI

"T" 10

bU

P E Xhol

argj C.qI

aacC ВНР X ЕВ

IbÉakms'si "

sacC

H НЕНВЕ X РНВ

kb

PBSA34S

Ыа Е Р

а

argA B.aub S В P

I Yrf-

' aacC HP X E

PARQ2S

arg A E.coll

kan

E PH P S PBH

aacC

HPX

0

u

2

Рис.3, Рестрикщганные карты плазмид pAF¡G2S, pBSA34S, pSBJl и 2.

цш аргинина трансформированными штаммами в условиях колбочной ферментации представлены в табл.7. Результаты показывают, что ллазмиды, содержащие ген леваназы в сочетании с ключевыми генами биосинтеза аргинина, на среде с 6% сахарозой обеспечивает выход аргинина на уровне не меньшем, чем на среде с глюкозой. При этом выход продукта у рекомбинантных штаммов составляет около 17 г/л-уровень, лимитируемый содержанием усвояемого источника азота. Следует отметить, что использование в ферментационной среде мелассы, являющейся наиболее приемлемым промышленным сырьем, содержашим сахарозу, несколько снимает выход аргинина - вероятно, из-за наличия в ней неучтенных пока факторов, ингибирующих биосинтез продукта. Эта проблема, однако, может быть устранена в результате специального исследования.

Способы стабилизации плазмид направлены главным образом на поддержание в популяции доли клеток, содержащих интактные плаз-миды. Мы исследовали эффективность стабилизации наследования рекомбинантных плазмид в штаммах р.еоЦ К-12 путем включения в состав плазмиды гена леваназы и вырашивания клеток на среде с сахарозой в качестве единственного источника углерода. Количественно стабильность рекомбинантных плазмид оценивалась в штаммах Р4Х и Р4ХВ2. содержащих р5Ш, или рВ5А345, а также

Ш92(рАЕС2Б) по доли клеток, сохранивших плазмидные маркеры устойчивости к антибиотикам при выращивании в минимальной среде ; глшозой или сахарозой. Реультаты представлены ц табл.8. Как видно из таблицы, в популяции штаммов, выращенных в среде с са-сарозой, по 'прошествии 40-60 генераций присутствует значительно 5ольше содержащих плазмиду .клет. ., "ем в популяции тех же штампов, выращенных на глюкозе. Повышение стабильности поддержания эекомбинантных плазмид отмечг-ется независимо от хозяйских штампов и тем более примечательно на гее* фоне Р4Х и Р4ХВ2. Особенно шлено 100д>-е сохранение плазмияного маркера на среде с сахарозой г штамме А7192 (рЛГ;г;зз) в условиях сверхсинтеза аргинина, когда юддержание плазмиды невыгодно для клеток. Различие в. стабиль-юсти наследования рКШ и рК5А34Я и рАРС28 молено объяснить гомо-югичной рекомбинацией мелду нлазмидными и хромосомными ^-генами в Р4Х л Р4ХБ2.

Использование гена леыназы для стабильного поддержания ре-•омЗкнантних виазккд и уде«шленйя гматольных сред представляйся перспективными при сози-'иглк продуцентов биологически актив-

Таблица 8,

Стабильность поддержания плазмпа, содержащих ген лаваназы, в клетках E.coll К-12

Штамм Плазмида о Источник углерода , в среде. Число генераций Процент клеток, сохранивши плазмидные маркеры

Дикий тип pSüi Глюкоза 40 , 15 "

о Сахароза " 50 100

Р4Х pSUl Глмсоза за 10

Сахароза 58 100

pi3SA34S Глюкоза 37 4

Сахароза 42 70 "

pARG2S: ■ Глюкоза 37 51

Сахароза 39 98

Р4ХВ2 pSUl Глюкоза 58 0

Сахароза 58 100

pBSA34S Глюкоза 39 0

" Сахароза 42 """ . 26

pARGSS Глюкоза 40 8

Сахароза 40 30

А VI92 pARG2S Глюкоза 40 70

Сахароза 40 100

pBSA34 Глюкоза 40 э78

ных веществ.

Высокая продуктивность и стабильность штамма AVl92(pARG2S) Б условиях длительного культивирования легли в основу разработанной в институте технологии получения L-аргинина с использованием ферментационной среды с сахарозой в качестве основного источника углерода. В .соответствие с ней в ходе рН-статируемого аммиаком процесса проводится подпитка среды сахарозой до конечной концентрации 2%. В этих условиях за 88ч A?192(pARG2S) синтезирует 35 г/л аргинина. Штамм E.ooll AVI92<pARG2S) депонирован в качестве продуцента аргинина под номером ВКПМ В-4118 в Коллекции промйшенных микроорганизмов (Москва).

Таким образом, проведенные в настоящей работе структурный и функциональный анализ и изучение гетерологичной экспрессии генов биосинтеза аргинина С .glutamLoum и гена левэназы В.subUlis позволили понять некоторые стороны их организации и регуляции и

легли в основу их практического применения. Эти результаты наметши подходы для создания на основе в.<л.«1 i высокоактивных техно- . логичных продуцентов аргинина и были использованы в НИИБиотехно-логии для разработки лабораторного и опытно-промышленного регламентов на получение L-аргинина.

быводы

i

■ 1. Осуществлено молекулярное клонирование генов биосинтеза аргинина C.glutamieum argB. argD и 'arg.J и определена полная нуклеотидная последовательность -этих .генов: установлен порядок их расположения на хромосоме С ¿glutamic uw в составе кластера argC—J-B-D-F. ,'

2. Показано, что продуктом гена arg J является неингибируе-мая аргинином монофункциональная | орнитинацетилтранссрераза (Н"-Ь-орнитин: L-глутамзт-Н-ацетилтрансфераза), которая не имеет N-ацетилглутаматсинтазной активности.

3. Осуществлено молекулярное клонирование гена леваназы засС B.suDtllls. :' |

4. Экспрессия гена леваназы в клетках E.ooll обеспечивает.; их нормальный рост в средах с сахарозой в качестве источника углерода: транскрипция гена в клетках E.coli осуществляется с собственного промотора. I

5. Разработан эффективный способ' стабилизации рекомбинант-lux плазиид в штаммах E.coli. '

6. Показана возможность использования гека argJ для создали высокоактивных продуцентов аргинина. Сконструированы плазми-цы, содержащие ген argJ, которые обеспечивают продукции около 17 г/я аргинина, лимитируемую содер.,. лтл усвояемого источника азота в ферментационной, среле.

7. Показана возможность использования гена леваназы для :оздания штаммов E.coli, и пользуших для синтеза целевого про-хукта сахарозу. Сконструирован рекомбинантный штамм E.ooll, со-хержаший ген леваназы, продуцирующий на среде с сахарозой 35 г/л фгинина при подпитке среды источником азота. На основе получен-юго штамма разработаны лабораторный и опытно-промышленный рег-имент получения высокоочишенного L-аргинина.

' ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДОЕНИЯ

Для практического применения на .¡редприятиях, связанных с шкробиологическим произзодством, предлагаются:

• - генно-исквнерный штакм E.coli БШ1 В-4И8, продуцирующий L-аргиннн на уровне 35 г/л;

- способ стабилизации рекомбинантцых плазмид.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Петросян П.К-, Саканян В.А., Нерсисян A.A. 1986. Рекомбинант-ная ДНК рбЩ. {солирующая синтез сахаразы, способ ее конструирования yl щтамм бактерий Escherichia coli - продуцент сахаразы. -A.C. Jfi SU 1440032.

2. Петросян П.К., Овеепян A.C., Саканян Б.А. 1987. Способ стабилизации наследования рекомбинантных ДНК в бактериях. - A.c. SU Ю 1524483. -

3. Лабораторный регламент на производство высокоочищеннсго I-аргинина моногидрохлорища (рук. разработки Саканян В.А. и Аса-трян Л.С., исполнители Овеепян A.C., Петросян П.К. и др.) Ji 641761-03-88, Ереван, НИТИА, утв. 29.06.1988.

4. Опытно-промышленный регламент на производство L-аргинина гидрохлорида высокоочгсденного (рук. разработки Севоян Г.Г., исп. Свсепян A.C., Петросян П.К. и др.) № 23-93, Ереван, НИТИА, утв. 10.12.1993.

5. Sakanyan У., Petroayan P.K., Lecocq М., Legrain С.г Воуеп А., Glgot D., Hallet J.-N., arid ßlaiutedorff К, 1994. Comparlson oi the arginlne blosinthesis aeetyl cycle of the mesophile Coryiie-bacterliun glutamlcum and the thermoplrlle Bacillus ütearöüiermo-phllus.- Abatr. 7th Int. Congr. Bacteriol. Applied Mlcroblol., BS-2/34, p.43'.

6. Петросян П.К., Овеепян A.C., Зурабян A.C., Товмасян Г.Г., Севоян Г.Г., Саканян В.А., Брутян P.A. 1994. Рекомбинантная плазмидная ДНК pARG2S, кодирующая синтез Н-ацтилглутаматсинтазы, способ -ее конструирования и штамм Escherichia coli - продуцент 1-аргинина. - A.c. AM й 000192.,

<<|iif(il((i "Itiuifinujiuli ШТсОПФПЧМР

Corynebacterluill glUtailllOUJji-|i onU|i|a|iU wgbui|n mpurtju^lipiunti Ii Bacillus SUbt Iiis-|i ^liuUuii{(i i|btibp[i ni unLi/l^n|ifinLifLi

Ii bptubg 1||фпотгн l/p L-eipqtiVijili иршшсцищ ¡uauflili(i|i usiuigiiurtj liuii/iup

•lünnpno puinbp. L-iupn|iliji\i, l|tj\iuu>u|i\iphii, qb\jbp(i Ц^пЬшфарпиГ, antiji-pJiU тдЬвф^триЛифЬрщц, lUiubujq, t|iииц|(/u|iiu, |ilih|ip|icj|iui, ицтц^ЬцЪЬр))

ijlujnLiilugn» tf, тфшрпц[1 jiupuHjrn if, 141ir.tuj(/ |i £ ¡mmiibb/i, Сйгуш1<асte-