Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ключевые этапы биосинтеза аминокислот аспартатного семейства у грамположительных бактерий (Streptococcus bovis, Enterococcus faecium, Bacillus subtilus)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ключевые этапы биосинтеза аминокислот аспартатного семейства у грамположительных бактерий (Streptococcus bovis, Enterococcus faecium, Bacillus subtilus)"

^А^Т-п1тЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

1 6 якв

На правах рукописи

КАЛ ЬЧ ЕВА

Елена Олеговна

КЛЮЧЕВЫЕ ЭТАПЫ БИОСИНТЕЗА

АМИНОКИСЛОТ АСПАРТАТНОГО СЕМЕЙСТВА

У ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ

(STREPTOCOCCUS BOVIS, ENTEROCOCCUS FAECIUM, BACILLUS SUBTILIS)

03.00.04 — биохимия 03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Ьанкт-Петербург 1994

Работа выполнена в Институте вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова АМН России и Институте молекулярной биологии и генетики HAH Украины

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Рагозкин В. А.

доктор биологических наук, профессор Тотолян А. А.

доктор биологических наук . ■ Харченко Е. П.

Ведущее учреждение — Российский государственный • медицинский университет нм. Н. И. Пирогова

Защита состоится «_» _]_1994 г. в часов

на заседании специализированного совета Д.063.57.19 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете (199034. Санкт-Петербург, Университетская набережная, 7/9).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан * >_ 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета

Н. Д. Ещенко

ОБЩАЯ_ ХАРАКТЕРИСТИКА-РАБОТЫ--------------------------

Актуальность проблемы. Аминокислоты аспартатного семейства, прежде всего лизин и треонин, играют исключительно важную роль в формировании полноценных животных белков, тем не менее биосинтетическими аппаратами меток млекопитающих они не синтезируются.

Проблема аминокислотного питания сельскохозяйственных животных традиционно решается внесением необходимых аминокислот в рационы кормления. йвачные животные могут удовлетворить свою потребность в аминокислотах благодаря естественной ферментации микрофлоры желудочно-кишечного тракта, хюс!;ольку получают основное количество ам:шок:;слот ::з белков, аырабачываешх бактериями рубца, а не непосредственно из кормовых растений.

Увеличение производства лизина и треонина Рубцовыми микроорганизмами требует глубокого и всестороннего изучения путей синтеза этих аминокислот, а также механизмов, регулирующих данный процесс. Ыежду тем, к моменту начала проведения наших исследований информация о метаболизме аспартата у рубцовых бактерий практически отсутствовала, .а .для почвенной бактерии, классического объекта молекулярной биологии Bacillus subtilis носила неполный характер. Ни ферменты, вовлеченные в синтез аминокислот аспартат-зого семейства; ни гены, кодирующие соответствующие ферментативные активности,у рубцовых микроорганизмов исследованы не были. Данное обстоятельство определило необходимость систематического энализа молекулярно-генетической и биохимической организации ас-мртатного биосинтетического пути у вышеназванных организмов.

Цель и задачи исследования. Работа посвящена изучению клю-ювых этапов пути биосинтеза аминокислот аспартатного семейства I механизмов их регуляции у грамположительных бактерий. Обьекта-и исследования служили рубцоЕые микроорганизмы Streptococcus >ovisиEnterococcus faecium и почвенная бактерия Bacillus subtilis.

В соответствия с целью исследования были сформулированы ледующие основные задачи:

- выделение и изучение сеойств ферментов, катализирующих лючевые этапы метаболизма аспартата у S.bovis , е.faecium В. subtilis;

с

аед

«г»««.

яооЙНтеза Вправе «с ад ел о гя А г •

сериллвг» ^генга> ^Г0с0ссц3 гаес1, а 7 ^овщс за/. Определено телатЛокаобо,,Парта*™наза „

Дри изучен! Ракте^зоваНа этого ш«» Вас*

ностей обняп,! ЕПе^е. т**ооргат

Несмотря ня лвд <, " аТРйЕае^ феоМРО

синтеза ^ ^

Тейаег с ;,а и Е н°Лислоты

^а/ого ¿¡д гена ^оодеднего Г Гулят<№ л

ГеНегйческог ' 'бо;сс!;лазойуь с^'езэ ^

лшкгоопгагкзьй Bacillus subtilis а баксерпй рубца гзгачвых__._____

__ ЖИВОТНЫХ — Streptococcus Ъоvis"Enterococcus faeciua.B. subtilis

являете.-! перспективы ыч обьехстоц крупномасштабных ироцессоа микробиологического синтеза. S.bovis ег E.faecium' , как составляющие шкрофкори кедудочиэ-ккшечного тракта жвачных кпвотних, игра "¡от исключительно вакнуи роль в вопросе решения аминокислотного питания последних. ¡лодв^кацин Рубцовых сЗактеряи с целью увеличения синтеза незаменимых аминокислот мояет существенно снизить или устранить потребность животного в аминокислотных кормовых добавках.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались или были представлены на отечественных и международных съездах, симпозиумах, конференциях.

Цубликации. По материалам диссертации опубликовано 43 работы.

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы ( 5 глав ), экспериментальной части ( 7 глав),

заключения и синодов. Работа изложена на 1^0 страницах машинописного текста, содержит - 13 рисунков, 31 таблиц, 1^0 литературных источников, в том числе . 153 иностранных.

объект и метода иссшовашг/.

Штаммы микроорганизмов, использованные в настояце работе, представлены в таблице I.

Клетки Bacillus subtilis культивировали е средах богатого (аыинопептидный бульон) я бедного (среда Spizizen (1966)) составов. Рост штамг.ЮЕ Escherichia coli V. Bacillus sphaericus также осуществляли в среде Spizizen •

Среда Spizizen содержит (г/л) : IC-IIP0., 14; КН-РО,, 5; глюкоза, 5; (KH^^SO^, 2; цитрат натрия, I; MgSO,,. УН^, O.I; гкдролизат казеина, 0.1.

Необходимые ,цля роста аминокислоты добавляли до конечной концентрации 50 ыкг/ш, витамины - I мкг/мл. Концентрация эритромицина ( Em ) составляла 15 мкг/мл, эыгшцшшна (Ац) - 50 f.iiirAv;, концентрация хлораыфеникола (Сш ) варпровала от 25 мкг/ш до 200 мкг/ш е зависимости от у слова ii. эксперимента.

Клетки Streptococcus bovis и Enterococcus faecium куль-тиЕироЕали е богато!! (штзтедький бульон J.1 2 ("imuna "» Слова-

кия)) и минимальной средах. В качестве минимальной среды исполь-зоЕзлась модифицированная наел: среда Henderson end.Snell (1948), содержащая (г/л): глюкоза, 20; цитрат натрия, 'К2НР04, 5; ын^С1,3; ацетат натрия, I; Msso^i71^0,0.-I; 'гидролязат казеина, 0.1. Культивирование осуществляли при 37°С.

Таблица I

Штаммы микроорганизмов и плазмиды, использованные в работе

•af.ii.it;

reüöv:,:i соответствующая Xii-isKve'OiJCTii'Ka

Escherichia coli ВШИ 04-

Bacillus sphaericus W1

Bacillus subtilis SHgW CHP43 АГ25

Streptococcus bovis A024/85 прототрос:)

Enterococcus Taecium

Д1£ прототпоф

Плазшды ' pUC-18 '

araD-139 (lacIP0ZrA)Ul69 strA* thiA lysA

прототроф

прототрос lysA-2 гесЁ sec"25 lyslOO Cm*

pIIV-14 lysA ген Bacillus subtilis

рМСЗ рЬР1

Ap* lac' ( ПОл1|Лр;якер)1асй решшкон ColEi Ар* Em" lys rib(OGBFATDH) Ap* lys

■ П_;о;.'с::о;лцен1Ю

Патте Дк.-К

Уайт Р.да.

Коллекция Инстит та молекулярной биологии и генет Киев,Украина Данная., работа

Коллекция Инсти физиологии живо Кошице,Словакия

Виера дж. " * Чнкиндас Ы.л.

¿энная работа

¡'.{утантиые пт2[.;[.:ы в.subtilis получали in vivo действием' N -ыетил-N -нитро- н -нитрозогуанидина по методике Mandel and

Adelberg (1965).

Выделение хромосомной да в. subtilis осуществляли феноль-

Hfciivi методом, а плазмидной - по методу Guerry et al • (1973). Плазшдную ДНК из клеток е.coli изолировали согласно рекомендациям Birnboim and Doly (1979). Полная очистка препаратов плаз-шдной ДНК достигалась центрифугированием в градиенте', плотности

.ористого цезия. Клетки B.subtiiis препаратами хромосомной и :азмидной ДНК трансформировали методом Spizizen et al. (1966),

Обработку дНК рестриктазами, лигировзнке, электрофоретнче-ое.разделение фрагментов ДНК в агарозном геле осуществляли, к описано у Манватиса п др. (19о4). Нзк-т£.авслиро«Еш:е ¿Jfii сводили по методу Higby et al.(I977) с помощью ДНК-полпыера-I. Перенос ДНК с агарозных гелей на 1штроца»ля«озвые фильтры гибридизацию на фильтрах осуществляли согласно рекомендациям uthern (1975).

Бактериальные клетк;: разрушали ультразвуком. Клеточные енки получали методом Schleifer and Kandier (I97i).

Концентрацию белка определяли согласно рекомендациям rburg 311(1 Christian (1941) И Bradford (1976).

Очистку ферментативных препаратов проводили преципитацией льфатом аммония, гель-фильтрацией на сефадексе G- -200 и поношенной хроматографией на колонке Ыоно Q HR 5/5. Молекулярную зсу исследуемых ферментов определяли методом гель-фильтрации методом электрофореза, исходя из зависимости lgM от r

Электрофорез белкдз и денатурирующих условиях проводили метода Laemmli (1970).

14,-и определении аспартаткиназной активности пользовались цгаксаиатным и щруааткиназным методами. Активность двашно-лелатдекарбэксплазк тестировали по методу Work (1957), диа-юпимелзтдегидрогенэьы - методом ^isono et al. (1979), а го-зериндегпдсогеназн - согласно рекомендациям Patte et al. ¿63). Высоковольтный электрофорез на бумаге, радиозвтографию :цкнтилляцпоннь;й подсчет использовали для определения двагано-■юлатли га зной активности. Активность W-сукцинпл-диашшопи-1ат деацплазк. устанавливали методом Kindler and Gilvarg 360), активность N -ацетил-диамикошмелзт деацилазы - мето-1 Sundharadas and Gilvarg (ID67).

Аминокислотный анализ образцов ироьодолз ьа зшнояпслотноы ¡лизаторе "Biotronik" катяонвтом НТО-¿710 в натрпй-цдтратном ;ере.

РЕЗУЛЬТАТА ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Аспапта псина за - фермент первого этапа аспаитатног биосинтетического пути.

Величину аспартатного метаболитного потока изначально деляет аспартаткиназэ (Рис.1). Закономерно, что с характери ки этого фермента начинается анализ пути синтеза омииокисло аспартатного семейства.

в Аспартаткиназная система Bacillus subtilis изучена дос точно полно (Paulus , I9Ü4). Она определяется тремя изоферм тами, несущими различную функциональную нагрузку (Graves an Switzer , 1990). Организация аспартаткиназной системы, так как и других ферментативных систем аспартатного метаболизма Streptococcus bovis й"Enterococcus faecium к моменту начала ведения наших исследований была неизвестна.

Выделение и очистку аспартаткиназ S.bovis и E.faeciu проводили по общей схеме (получение бесглеточных экстрактов фракционирование белков сульфатом аммония, гель-фильтрация i сефадексе G -200, ионообменная хроматография на Mono Q коло! из которой следует,что гель-фильтрация на сефадексе G- -200 i обоих анализируемых бактерий демонстрирует кал:;ч;:е двух асш татх;кназн!:х исофермеитов (табл.^ г: 3). Первая аспартаткиназi активность обнарукивалась в пике белкз, элюируемого с колош ранее каталазы. Его молекулярная масса, таким образом, превь ет 250 кДа (Рис.2). Второй пик аспартаткиназноК активности г ировался после альдолазы, в положении, соответствущем Мг125 кДа (Рис.2).

Известно, что аминокислота аспартатного семейства вли* на аспарта'па;назу, изменяя ее активность (Cohen and Saint-G: ISo7). Результаты аминокислотного воздействия на аспартаткии ную активность s.bovis и Е.faecium , представленные в Табл свидетельствуют об мнгибирующеы влиянии лизина и мезо-диашн пямеляновой кислоты (мезо-ДАИ). Максимальный подавляющий эфф достигается при концентрации аминокислот ~ то Ш. Общее инги рущее влияние, наблюдаемое при одновременном внесении в pea циокную с с еду лизинг и ыеэо-Д/Ш, соответствует сумме независ мых воздействий кадий из аминокислот. Этот факт независимо? и аддитивного ингпбированил лиз::ком и мезо-ДДП подтверждает

1,-аспартат

I

г-

I

аспартил- —1- полуальдегид фосфат • аспарагиновой

кислоты

дшшколпно- — дигидродшшколи-кислота новая кислота

тетрагидродашь ко ли новая икс-лота

И-ацетил- е-оксо-X,- .с -аминогшмелат

I

Й-ацетил-ы, -дааи-ношмелат

I

ЬЬ-диаминошмелат .

I

мезо-диаминопкмелат

I

Ь-лизин

гоиосерин -

I

О-СуКЦПНИл гомосерин

I

цнстатио-ннн

гомосерии фосфат

гомоцистеин

ь-метионпн

ь-треонин

I

■¿-оксойутпрат

I.

ацетогидрокси-бутврат

I

дигидрокси-изолей

I

.с-оксоизолейцин

I

Ь-изолейции

Рис.1 Биосинтез аминокислот аспартатного семейства (на примере ВасШиБ зиЪ-ЫИэ )

Таблица 2

Очистita аспарташшазных изоферментов, гомосериндегядсогеназы я дтшчногшмелатдекардоксилази S. bovís

Этапы очистки

Белок Чмг)

Удельная активность

МП-чувствительная асааататкя-наза

Us-чувствительная Гокосеранде- Диаминопимел' d аспартаткиназа гидсогеназа декарбоксило!

Бесклеточний

экстракт 27.02

Осазденяе сульфатом аммония " 0.41

Сефадекс G- -200

фракции 14-Iü I.Ü5

Фракции 20-22 0.63

«ракции-'30-35 I.I2

фракции 31-36 I.I5

Ионо Gt

«típaicnuíj I4-IU 0.30 Яраодш 20-22 • 0.14

Фракции 30-35 0.20

фракции 31-36 0.22

O.OOÜ4 0.0212.

0.0672 О О О

0.4032 О О О

0.0293 0.0717 О

О '

0.236В

0.2173

О О

1.4203 I.043I

0.45 0.70

О

4.10

О

О

О

10.10 О О

20. G 37.3

О О

' 97.1 106.4

О О

433.5 530.0

йееб

"a ta ta ta а аш o

&

ЕС O

is a

со юн н ноа^ iiii wcoK-н CD Ol с:

О ОО О • • • •

го го м со кн-с^

о

е. <§. е. ее

ta ta ta ta S и ¡a ы ti h " Й Й К S

SêëÛ

к a a s со со м

i 1 ri ю в м who о сл н сто

*зо

ОО

ад

2 CD

Si gt»_

ко

<с

WW

Î4CD ОО

•öS

Сзсо pï

но

— л-

ы M О г\5 • . • •

И СО СО О oí Í: н

СО

to со

о

03

О ОО о

СГ>

со о

о о о о

0

01

to

о to со

О О СО

сз

м мо о

M CD СО CD СС M M rfu

О О О О • •

to to сл с

СЛ ip. сл со

о се о: со

о со

CD

i_i

о ом о

to м

о> ш

CD О' MiüOO

О О to о сл

to

м i—i со fc

со M о о

сл

to CD

<15

Ig

I с I

tiC 1Л О I

о ^

B«<

03 и

ta о и и а

4 а

5 ^ й§ 03

M Я

ш из Si

.So

•по ОО hlCD

esta щ is Ca a: сод Оэ о I

SI?

Я сз ag tai o. te

o S S3

ara Obi

Ш £0 И КЗ I

03 в

03

ё

о

^

а о

¡r

а

O .с а о

►3

ö о

S

ta >-э a

0 £3

a со a X

1 S

сз a ►з ш " S

CD >P<

g s

*R §

O. CD

о a К и о о

s

Ca

CJ 1-3

E O

g

ГП О •_о

"Ia CD

Р ta a» a га р:

ÏÏ га - g

g

о о

s

со

в

23 О.

ь

Ê ta

СО

наличие как в клетках S.bovis , так и Е.Гаесшш Д2-^ аспаР-таткдназных изоферментоЕ, один из которых чуЕстЕптелен к лкз! ну, а ,другой - к мезо-ДАП.

Ингибирувдее воздействие мезо-ДАП оказывает на аспартатх назу, молекулярная масса которой более ¿50 кДа (Рис.2). Этот изофермент не чувствителен к лизину. Нагревание изофермента i течение 10 мин при 60°С вызывает 50',ö потерю его активности. Присутствие в ферментативном растворе аминокислот аспартатно] семейства - лизина, треонина, метионина, изолейцина, в конце! рации 10 мМ не защищает аспартаткиназу от тепловой инактиЕаш Следовательно, изофермент не имеет сайтов связывания с этими аминокислотами.

Рис. 2. Гель-фильтрация из сефэдексе G- -1.00 ge±'uea?aw£nw препаратов B.subtilis (I) :i s.bovisU), прецииш роЕанншс сульфатом ал.ган;ш.

Второй аспартатклнззнкл лзолсомент, обладал^:::: лолекуллр-

ко» i^ccoi: кД?, 1е^ьной1'ь--^олько--к--однок--------------

----------амлпоклслМ^^аалартатного селелстлз (Таб..-,).

л гз „..з гулькал: ob .....цлл :. .V,aKTi;, чю другие

окккоуусло'.е лсларлат.хло еслл'л^л; :; . слл ,ccöj, :.;' „ i.c:

блкац:л: с c.cliv-v у. з '„л "¿лu.; олз„_залт .........дл;

асдартаткиназную активность S,bovis n E.faecium (Табл.4), представляется маловероятным наллчле у аналлзвруельце стрептококков третьего асйартаткйвазного ызо^ерыента, как это имеет ь:есто у Б.coli л B.subtilis.

а• Т,п£?ь.ч зеакцп* путл бпоелнтеза аминокислот аспаштатного семейства л собственно первая реакция треонпново/метло-ниновол ветвл отого путл катализируется гомосериндегндсогеказой

Б лутк биосинтеза ашноккс&от аспартатного семейства после ствдкй ¿¿ясСоралЕройанкй асиарапшозой кислота, осуеестЕЛле-шй аспартаткиназой, образовавшяйся ^-аспарт1щ0ос£ат претер-иевает - зависюдуу редукцию, переходя в ^-пелуалвдеглд

азлараглнолол клелотк. ^-Цолуальдеглд асларагл новой кислоты занимает особое лололенле ере,и. л;-;1ормедлатов аспартатного лутл, находись л точке er и разгетв лен:..-: (ллс.1). Он одновременно являете« субстратом дл-ух -Т-еркентагиаикх реакций, одна лз которых каталлзпруетсл хомосерлндегдкогеназол - первкм ферментом трео-вгнозо/иетионкновой ветви аспартатного метаболизма.

Выделение л очистку гомосерлндегндрогеназ B.subtilis , S.bovis л E.faecium iiposo^Äi по схеме, результаты которой представлены в Тзбл.5. Дел гель-Йлляьтрацил на селздексе G -200 препаратов s.bovis я E.faecium пик, лролвл^лодлл гомосерлнде-глдсогеназную актлвнооть;олылсовался с колонки позднее каталэзы; молекулярная масса составляющих его белков у s.bovis 215 кда,у B.feecium ¿^'0 кДа. Гомосер:дд:дглдрогензза B.subtilis , полученная в тех г.е условллх, обладала несколько менылел Ы 205 кДа. Ь юи случае, когда на коленку с селадексом S- -'¿00 износили не 0,о мг ферментативного препарата, а 0,05 иг белка, обнаруклва-лось два ппка гокосеряндсгпдрогепааноИ активности, соответству-кцлх белке:-,; с молекулярной массой 2£0-205 кДа и 50 кда. Возможно, что гомосерлндегяцрогеназа исследуемых бактерий является тетраыерньа. ферментом, способным при низких концентрациях белка диссоциировать на 4 субьединиш.

Таблица 4

Влияние аминокислот аспартатного семейства на аспартаткинэзную активность s.bovis ÍJ E.faecium

Аминокислота СЮ мШ Общая. ■S.bovis Е .£aecium Относительная активность ДАП-чувстЕительная ■ bys-чувствительная S.bovis E.faecium S.bovis E.faecium

Контроль (без аминокислот) 100 100 100 100 . 100 100

Диаминопимелат 70 65 64 58 100 100

Лизин SU 29 99 100 36 25

Треонин 100 99 100 100 9Ь 97

Метяонин 100 100 100 100 100 100

Изолейцин 100 100 100 100 100 100

Лизин + треонин + метионин 38 24 99 100 36 23

Лизин + диаминопимелат 9 7 64 57 36 25

Общая аспартаткиназная активность определялась в бесклеточных экстрактах. ДАЛ- и лизин-чувствительные активности были разделены ионообменной хроматографией. Ферментативные активности выражены в процентах от удельных активностей, полученных в отсутствии аминокислот в реакционной среде.

- 13 -

I

Таблица 5

Очистка гомосериндегидрогеназ S.bovis;- E.faeciunril B^subtilis

Удельная активность гомосерин-зпы очистки __дегидсогеназы_

-____S.bovis E.faecium В. mibtil i я

жлеточный экстракт 0.45 0.23 0.23

звдение сульфатом аммония 0-70 0.44 0.36

Ьадекс О-200 4.10 2.54 2.09

10 а . 18.10 11.21 9.25

Анализ белковых фракций В.зиЪИНз, S.Ъovisl Е.Гаесйш, 1а,дающих гомосериндегидрогеназной активностью, на предмет и-чия аспартаткиназной активности дал отрицательный ответ збл.2 а 3). Проведение данного исследования было продпктовэ-те.м обстоятельством, что в клетках е.соП го:.ю с ее:; нде г:: дро -наза и аспартаткииаза образует единый мультпферментный ком— зкс. В силу этого закономерным явилось тестирование .чзучае-с бактерий на предает, ассоциирования уерглеп-х-ЕТивных активнос-й.

Соотношение уровней аспартаткиназной и гоыосериндвгидроге-зной активностей у изучаемых микроорганизмов на различных эдиях очистки меняется. Относительное уменьшение активности досериндегидрогеназы обусловлено ее меньшей, по сревнении с зартаткиназной, стабильностью. Нестабильностью гомосериндегид геназы определяются потери ее активности 2 промежутках х^-зме-т мезду этапами очистки.

Контроль гомосериндегидрогеназной активности в.зиЪЪШа л .Ьоуаэ осуществляется по механизму ретроингио'провгн^'я, а ко-юм отрицательными эффекторами являются треонин и метионян.-(Юсериндегидрогеназа Е.гаес1ит ингибируется только треони-л; к воздействию метионина она не чувствительна.

3. Биохимическая идентификация Ферментативных активное биосинтеза ЛИЗИНО ry Streptococcus bovis и Enterococcue faec

Как уже отмечалось, за ß-полуальдегид аспарагиповой кис ты конкурируют две вствн синтеза аминокислот асиортатиого cct. стаз - трсопипоЕо/мстпониновая и лизкноиая. Образование ли;зш е прока ристической /клетке мок st ;;дт;; t_:c..l; Известны i

называемые сукцинилазный; оцстнлнлный а дегидрогеназный иорж ты (Рис.о). Дегидрогеназный, или сокращенны!:, путь синтеза короче двух первых вариантов образования лизина на три этапа благодаря способности даашноыимелатдегидрогеназы деашнировг тетрагидродипиколннат непосредственно в мезо-дпаминопимелат. Диашнопиые:;этдегидрогеназная активность, как правило, обнарз живаетсл у бактерий, в состав улеточной стенки которых входит лизин. Проведенный намл анализ содержания аьшокислот в пепт! догликане меточной стены! s.bovis vPkc.4), так ке как к E.faecium , ползал присутствие лизина и отсутствие дчамино! мелата. Тем не менее диал>;шоишелатдеп1дрогеназнуа активност! в бесклеточиьос экстрактах исследуемых микроорганизмов 'тестирс вать не удалось (Табл.6)-.' Таким образом, "s.bovis я E.faecium являатсл первым обнаруженным наш исключением из правило, koj лизин содерштся в неточной стенке микроорганизмов, не обладающих дизмипойимелатдеглдрогеназной актяаностьн. --

G-кеюпимслог

Рис.З. Три .пути синтеза у б акт е-

а-через сукшпш-льньё лнтепмеди-а.ты ( Bs.chori.th-ха coli): i Е-через ацетильные .интермедаз- •

Tsubt?i£&V"us б-меэду тетраги-

ДрОДИПИКОЛПНОВОЙ ^A^hJk^kjt

н ыезо-диэминопл ^

мелиионой кислотами интермедиа-.ты отадтсТЕуат ( Bacillus sphaericus>

L - аспоргат 1

„ТотрасидроЗигкт&хялтг*, 'Мезо-Аоиинопимелаг

L-/K/3vft

ffuaMUf^m/Kesior ' Моэо-3иоминрлимс/кгг L- лизин

l-Af-txienjn-Z-o*. $-коапиыепаг

//-auerwii-

Рис. 4. Разделение аминокислот кислотного гидролизата пептидогликана клеточной стенки S. bovis на аминокислотном анализаторе " BiotzoaLfc Для того, чтобы определить сукцинилопые или ацетилоЕые ин-термедиаты участвуют е биосинтезе лизина, в бесклеточных экстрактах s.bovis и E.faeoium тестировали су кци нилди ами по пимела т-десукцинилазную и ацетилдиамшюшшелатдеэцетилазную активности. Так же, как в случае определения дегидрогеназной активности, экстракты е. coli >В.subtilis и Bacillus sphaericus использовались в качестве положительных и отрицательных контролей.Ферментативные активности, обнаруженные у S.bovis-и E.faecium , указывают на существование исключительно сукцинилазного варианта синтеза лизина у этих бактерий (Табл.6).

isдат

i

- 16 -

Таблица 6

Удельные активности ферментов в б'есклеточных экстрактах S.bovis, E.faecium,' E.coli, В. subtilis, В.sphaericus. ■ •

Микроорганизм

Удельные активности

Дегидрогеназы Десукцинилазы Деацетилаз

S.bovis о 0.021 0

E.faecium 0 0.018 О

E.coli 0 0.038 О

В. sub til is 0 0 3

В.sphaericus 0.27 О О

4. Диаминолшелатлекарбоксилаза - йермент последнего э па образования лизина.

В силу.своей значимости этот ключевой фермент аспартатн метаболизма исследовался у целого ряда микроорганизмов. Вле в 1975 г. он был изолирован а частично оч:;и;ег; из клеток В.subtilis . в исследовании, проведенном наш, были получены охарактеризованы гомогенно чистые ферментативные препараты в. subtilis , s.bovis и E.faecium . Цри гель-фильтрации прея ратов указанных бактерий, прошедших частичную очистку, обнар живался единственный белковый пик, обладающий ДШ-декарбокси ной активностью, с Мг 120 кДа (Рис.2). Электрофорез очищении ионообменной хромотографией ферментов выявил белковую зону т кой лее молекулярной массы. Найденная величина М 120 кДа явл ется достаточно большой, позволяющей предположить субьеда ни ч строение ДАП-декарбоаксилаз.

Электрофорез ферментов, изолированных из клеток B.subtj и S.bovis » Е присутствии додецилсульфата натрия показал налд одной полосы, соответствующей белку с молекулярной массой 5S (рис. 5 и 6). Сопоставление М,. нэтппкого и денатурированного белков свидетельствует е пользу того, что молекула ДАЛ-деках силазы как в. subtilis, так и S.bovis , состоит из двух субъе ниц, молекулярная касса которых 59 кДа. Злектрофоретическое разделение субьедпш-щ после обработки препарата меркаптоэтsu

•— 94 - 67

— 43

эо

204

Рис. 6.

Определение

>.5.

молекулярной массы ЛАП-декарбокси-лазн по данным алектро{ореаа в денатурирующих условиях: 1 - ингибитор трипсина: 2 - карбоангипраза: 3 - яичкыЛ альбумин; 4 - ДАП-декарбоксилаза; 5 - бычий сывороточный альбумин; 6 - фэс^срилаэа В. Ось абсцисс - относительная подвижность белков СЯ^); ось ординат - молекулярная

мпсса белков

связей

1лектро<(орез ДАП-декарбоксилаз S. bovis (1) и l.subtllls (2) в iOZ-нои полиакриламидном геле с ЛТ.-нуы аодецилсульфатоы На в присутствии маркерах бельков С молекулярная масса Селкоз приведена кЛа). ' _ _________________

и без него идентично, что указывает на отсутствие s-s мел;цу субьединицами ферментов.

Установленная наш экспериментальным путем величина Мг двухсубьединичной ДАП-декзсбоксилозы В.subtilis соответствует молекулярной массе белка, который должен кодировать 1узл ген ДАП-декарбоксклазы, исходя из его нуклеотидной последовательности (. УвтваоЬо et al.; 1920). ДЛП-декарбоксилазэ S.bovie имеет ■идентичную с ДДП-декзсбоксилазой в.subtilis молекулярную массу и субъединичное строение. Логично предположить, что размеры гена, кодирующего ДАП-декарбоксилазу s.bovis , близки к таковым у гена lysA В.subtilis .

Изучение кинетики взаимодействия ДАП-дскарбоксилаз в. sub -tilis и s.bovis с мезо-ДДП указало на достаточно еысокос совпадение Кт этих ферментов, что свидетельствует о сходстве строения их субстратсЕязыЕагсшх центров.

ДАП-декарбоксилазы s.bovis и в.subtilis проявляют максимальную активность е 0.15 М фосфатном буфере при pH 7.8. Раст- ' ворение ферментативных препаратов в катионных буферных системах (.например, Tris-HCi ) приео.дит к значительной потере ДАП-

- id -

д екарЗ<?к сила зной активности. Специфическим ингибитором является;, лизин, физиологические концентрации которого подавляют декарбок-сялирсувание мезо-ДАП. Другие аминокислоты аспартатног.о семейства не оказывают отрицательного воздействия на ДАП-декарбоксилаз-

ную зктиеность изучаемых бактерий, •ii-

5. Регуляция синтеза ключевых йеоментов эспэртзтного метаболизма.

Песэйи этап аспартатного метаболизма, хсатализкруепый у В. subtilis тремя аспзртаткиназными изоферментами, описан в литературе достаточно полно. В качестве СЕоеп задачи мы рассматривали изучение аспартаткиназных систем S.bovis ¿: E.faecium и сопоставление полученных данных с таковыми у в.subtilis.

Анализ 3S22Cäi.wovi. ахсшзаостд!. ûCiispa-a-riiûCûîii:: пзофермен-тоЕ s.bovis ü E.faecium от условий роста продемонстрировал максимальную активность ферментов в период ранней экспоненциальной фазы, которая значительно уменьшается в стационарной фазе роста. S быстро растущей культуре вклад ДАЛ-чувствительной аспартэткиназы е общую аспартаткиназную активность составляет ~ 20%, тогда как в стационарной фазе уровень ДАП-чувстЕЯтелько-го изофермента увеличивается - в 3 раза. С .другой стороны, уровень Lys -чувствительной аспартаткийазы уменьшается более чем б 10 раз но мере перехода от экспоненциальной фазы в стационарную. Рост стрептококков в среде богатого состава тэюхе значительно подавляет аспартаткиназную активность на ßCfc), прячем эти изменения затрагивают главным образом Lys -чувствительную аспартаткиназу. ДАП-чувствпте-'.ьнзя эк-х^пность гораздо стабильнее при различных условиях выращивания, что указывает на некоорднкярованнкй характер синтеза аспартаткпнззннх ;;зофер-ментов.

По-разному реагируют эспартаткпназике изсферменть :: на присутствие в ростовой среде аминокислот. Синтез ДАП-чувствптель-ной аспзртаткпнззы не регулируется аминокислотами асглрагино-вои группы, тогда как образование Lys -чувствительного фермента подавляется лпзпком. Треонин и метионни оказывают некоторое стимулирующее воздействие на синтез Lys-чувствительной аспзр-таткиназы s.bovis- , увенчивая ее, соответственно, на £8$ и 17/5.

Треокин и метпонин являются вакными регуллторкым:: эффекто-рэш другого фермента стратегически гаяного этапа пути биосинтеза аминокислот аспартатного семейства - гомосерикдегэдогена-

- 19 -

зы.синтез гомосершгдсгидрогенззы s.bovis более чувствителен. к рспрессиру:спсь;у глияшт мстионинэ, в то время как образование гомоссриндегедюгонози E.rnccium сильнее контролируется треонином iToü.) ;-7).

Таблица 7

Сияние присутствия. в ростовой среде аминокислот .аснарагипоЕой группы на гомосериндегидрогснззнув активность s.bovis, E.rnccium, В.зиЬ«.11з

Относительная активность гомосерин-дегидрогеназн

& .л

А

VI мы) S.bovis E.faecium В.subtilia

Контроль.(без аминокислот) ТОО ТОО ТОО .

лизин 100 . 100 ТОО

Треонин 40 0 1X2

Метпонин 0 25 22

1Изолейцип ТОО ■ 100 100

Активности (рорментви выражены в процентах от соответствую иих удельных активностей в экстрактах клеток, выросших, в минимальной срсдо до ссреданы экспоненциальной фазы.

Наглядны;,! подтссрвдонисм регуляции гомоссриндсгидрогспоз-ного синтеза у в.гиЫ^Иэ метлонином явилось получение наш мутантных и-.таммов этого микроорганизма, рост которых иол ноет г, п прекращаете/! в'среде, содержащей 0.7 мГЛ ыстиопина. Уровень го-ыосер»шдеп'..црогенэзноИ активности у таких мутантов на порядок шике, чем у шташоа дикого тина, а подавление синтеза мутантно-го фермента наступает при более низкой, чей е норме, концентрации эффектора. Рост Ые1;3 мутантов в метпонин - содержащей среде восстанавливается в присутствии гокосеряна или треонина.

Регуляция синтеза диаминопимелатдекарбоксилазы во многих отношениях напоминает таковую у Ьуз-чувствительного аспартат-киназного изофермеята. Удельные активности обоих ферментов демонстрируют наибольшие, значения в экспоненциальной фазе роста. Однахсо синтез зспартаткппззы достигает максид^ума в ранней экспоненциальной фазе роста, а диамннопимелзтдекзрбоксилззы - е средней экспоненциальной фазе. Синтез ДАП-декарСоксклазы

детерминирован л составом среды выращивания. В среде богатого состава образование диаминопимелатдекарбоксилазы полностьи npef ращаетсл. Репрессия синтеза -.фермента обусловлена, вероятнее все гс, наличием в ростовой среде лизина, который в концентрации I ;,:;.! подавляет длзмпнсппмелатдекарбоксилазный синтез ~ на 95$. Некоторый стимулирующий эффект на синтез фермента оказывает мезо-диаминопимелиновая кислота, причем к ее воздействию более чувствительна диампнопилелатдекэрбоксилаза B.subtilis (активность увеличивается на 31Н), чем S.bovis и Е.Гаес1иш(фермен-тативнея активность возрастает на 7-SS3).

5.1. Модель пегулящ-ui синтеза .циамтюш-шелатдекарбоксяла; Bacillus -тшив ча транскрипционном уровне.

Изученность B.subtilis Е генетическом отношении позволил! установить механизм регуляции образования ДАП-декарбоксплазы этого микроорганизма на этапе считывания генетической кнформац!

С этой целью путем обработки N -метил-N -нитро-N -нитроз^'-гуанидином была получена серия мутантов, утративших ДАП-декар-боксилазную активность. Одна группа мутантов восстанавливала ферментативную активность, когда содержание кофактора ДАД-дека; боксилазы - пиридо кс а л ьфо сфа та в реакционной среде в 8 раз npi Еышало обычно используемое. Данное обстоятельство свидетельствовало в пользу предположения о том, что у анализируемых мутантов нарушено сродство фермента к кофактору. Картирование мутац вызвавшей это нарушение, локализовало ее на 210 °хромосош B.subtilis , где, как известно, находится структурный ген ДАЛ декарбоксилазы. У мутантоЕ .другой группы повреаденной оказалас ¿50° область хромосомы, удаленная от основного кластера генов биосинтеза лизина. В этом локусе, вероятно, располагается регу ляторный элемент, вовлеченный е синтез ДАП-декарбоксилазы. Он строго специфичен в отношении указанного синтеза. Его нэрушени не сказывается на синтезе других ферментов аспартатного глетабо лизма, в частности аспартаткиназы к го мо с ер и нде гпдро ге н азы.

Дальнейшее выяснение механизма образования ДАЛ-декарбокси

лазы требовало, проведения зонирования гена lysA , кодирующей

эту ферментативную активность. Нами была сконструирована реком

бинактная шшзыада рьр^ путей обзйдлнения ¿НС висо!:окоил-й-:ог

вектора ,puci8с Pstl-ii'arMeKvo;.; хрсмосо:-.к B.subtilis, содержащим 1узАген (Рис.?). Уровень экспрессии lysA , соотнесенный

Ряс. 1 . Схематическое язоврззгняе рекоыаинантяой глазия.гк pIPI.

числом копий клонированного гена, в гетерологичном хозяине В.coli составлял от такового, наблюдаемого в клетках B.sub-tilis дикого типа (Табл.8). Несоответствие величины ДАП-декар-боксилазной активности, тестируемой у плазмидосодеряацего штамма в.coli >. числу клонированного на рЬР1 1уоАгена B.subtilis мояет быть обусловлено условиями экспрессии в чужеродной системе. 3 связи с этим представлялось интересным' рассмотреть экспрессию находящегося на плазшде lysArena в естественном окружении (система B.subtilis этого была использована рекомбинант-

нэя плазмнда рмСЗ, способная резецироваться в клетках B.subtilis и содержащая 1узА ген этой бактерии.. Введение трехкопий-ной плазывды рЫСЗ в B.subtilis Ензызало увеличение ДАП-декар-боксилазной активноcsiä в 1,5 раза, что тзкке не коррелировало с числом копий клонированного гена (Табл.8). Кроме того, синтез ДАП-декарбоксилазы переставал регулироваться лизином. Конститутивный синтез ДАП-декарбоксилазы отмечался и в клетках E.coli , трансформированных плазшдой pLPi (Табл.8).

у АТ25 активность и синтез фермента регулируются лизином, тогда как синтез ДЛП-декарбокс;:лазк з метках SHgW , со,дерущих плзз-м:;,цу р:.'С5, пр:. тех лее условиях косит конс-итутпвный'хзрэктер.

Полученные результаты могут являться следствие;.; действия различных регуллторных механизмов транскрипционного и/зли трансляционного уровней. Однако определяющая роль трапс-акткзных элементов в данном случае мало вероятна в силу тоге, что он:; воздействуют из гомологичнее последовательности независимо, от их присутствия в составе одной и той ке или разных молекул По всей ;ост;:, здесь имеет место функционирование некоего щс-домикантного фактора.

• Изучаемый на мл характер экспрессии ХузА^ена B.subtilis подобен механизмам регуляции с участием дополнительных операторных последовательностей, удаленных от своих промоторов, так'называемых "upstream activating sequences"(UAS). Способ проявления предполагаемой регуляторной последовательности lysA гена близок к UAS- -элементу, определяющему экспрессию Leu2 гена Saccharomyces cerevisiae ( 'Tu and Casadaban , 1990). ТандемнаЯ амплифика-

цая иas Leu2 гена в цис-полокенин усиливает экспрессию и регуляцию контролируемого геыэ, з в транс- подавляет ее.

Этот же механизм будет определять транскрипцию иlysA гена, если допустить участие в нем шс-до^лгаптаэ!. последовательности, которая была клонирована в составе плазмид с;,ЮЗ iipLPi , а затем интегрировала е хромосому. Находясь на плазмадах, дополнительный оператор угнетал экспрессию lysA , а перейдя в состав хромосомы, стал оказывать на нее активирующее воздействие.

Предложенная нами модель регуляции транскрипции lysA гена впервые для B.subtilis включает понятие UAS — подобного элемента .

Сформулированная гипотеза контроля экспрессии lysA гена содержит следующие регуляторные факторы: I) регуляторная последовательность, локализованная на 2500 хромосомы B.subtilis , в силу своей значительной удаленности от гена lysA скорее всего кодирует белок-регулятор, наличие которого абсолютно необходимо дая считывания lysA -последовательности; 2) два оператора, один из которых непосредственно прилегает к lysA гену, а .другой отстоит от него на некотором расстоянии (предпо-

лагаемый uas -подобный элемент).

Возможно, б ел о к-ре гуля торвзаимодействуя- с - этими рёгуля-торными-зонами'"по" механизму "петель", благоприятно изменяет конформацию ДЦПС, улучшая ее связывание о РНК-полимеразой, тем самым индуцирует инициацию транскрипции.

заключение

Систематическое исследование процессов биосинтеза аминокислот аспартатного семейства бактериальной клеткой было начато более сО лет назад. Тем не менее в этом вопросе даse у наиболее хорошо изученных микроорганизмов до сих пор остается много невыясненных моментов. Прежде гсего это относится к механизмам синтеза такой аминокислоты аспарагиновой группы, как лизин". У прокариот обнаружены три возможных пути образования лизина, которые отличаются промерточными этапами. Начальная и конечная стадии являются общими для всех вариантов синтеза и катализируются, соответственно, аспартаткиназой и диаминопимелатдекарбок-силазой. Видимо, это обстоятельство определяет довольно высокую степень консервативности строения и способов регуляции этих ферментов у различных бактерий. К такому выводу мы пришли на основании данных сравнительною анализа аспартаткиназ и диами-ношшелатдекарбоксилаз Bacillus sub tili s, Strepto coccus bovisи Enterococcus faecium.

Аспартаткиназная система в. subtilis описана в литературе юстаточно полно. Первые сведен*:.-: об аспартаткиназной активности У s.bovis к Е.faecium получены в результате проведенных ^следований, продемонстрировавших наличке в :у:етках ксккое и-ух аспартаткиназшлх изофермеитов (их свойства суммированы ! табл.9).

Особый акцент следует сделать на тестировании в метках микроорганизмов, не относящихся к роду Bacillus . ЛАП-чувствительной аспартаткиназной активности, так как до настоящего времени чувствительность к даамянопшелату обнаруживали исключительно бациллярные аспартаткиназы. Кнгибирование н репрессия Lys-чувствительной аспартаткиназы лизином свидетельствует о значимости этого изофермента для образования лизина. Концентрация диаминопимелиноЕой кислоты, необходимая для ингибирогания . НАП-чувствительной аспартаткиназы значительно превышает физио-

Таблица 9

Сравнительный анализ аспартаткиназных нзоферментов

Аспартаткиназа

ДАП-чуЕСТвительнэя Lys-чувствительная

Молекулярная масса

Ингибитор

Репресеор

Актиеность в течение ростового цикла

250000

мезо-Диаминошшелат не известен

Слабо уменьшается

Сильно уменьшается

лизин

Jiil3HH

125000

Активность е богатой

среде 7 О/о Ш

а

Активности выражены в процентах от удельных активностей экспоненциальных культур в минимальной среде.

логические уровни, указывая на то, что данный изофермент не осуществляет специфический контроль синтеза диаминопимелата при росте е минимальной среде. Основное значение ингябирова-ния ДАП-чувстЕительного изофермента диаминопимеляноЕОЙ кислотой проявляется во время роста в среде богатого состава или в ли-зиносодержащей среде, где уровень ДАП-чувстЕительнок аспартат-киназы составляет 70$ от общей аспартаткиназной активности. В остальных отношениях аспартаткиназные изофермекты кокков прослеживают значительное сходство с аслартаткиназой I я II B.subtiiis . ДАП-чуЕстнительный изофермент и аспартаткиназа I имеют одинаковый молекулярный ьес; условия роста (среды различного состава, различные фазы жизненного цикла) слабо сказываются на их активности, определяя первостепенное значение этих изоферментов в условиях, когда синтез Lys -чувствительных аспартаткиназ подавляется. Ьув-чуЕствителькый изофермент кокков и аспартаткиназа II также демонстрируют целый ряд общих свойств: идентичный молекулярный Еес, регуляция активности и синтеза лизином, значительна зависимость от условий выращивания. Аспартаткпназная система в. subtilis помимо названных

изофермснтоп включает в себя аспартаткиназу'111, сии тез котот рой подавляется трсоиглкж, а активность - совместным действием' лизина и треоплиа. Треонин ни сам по себе, ли в комбинации с лизином'не оказывает негативного воздействия на аснартаткяназ-ную активность s.bovio « E.rhccium . Поэтому присутствие в метках рубцошх кокков аспартаткиназного кзо^ерментп, аналогичного аспартаткиназс III, представляется маловероятным.

Основная функция оснартаткшшэк III заклочзетсл в контроле трсонинового синтеза. Отсутствие подобного изоссрмсцта у s.bo-vis и E.jracciun отводит глзпснстпу шу:о роль в регуляции трео-ниново/метиошлювой ветви аспартатного пути гомосериндегидроге-назе. Этот фермент направляет поток зспартатних метаболитов в сторону формирования трех аминокислот аспарагиновой группы -треонина, метиоияна и изолейцина. Треонин и метиошш регулируют активность и синтез гоиосермндегидрогенази у изучаемых грам-положительных бактерий. В клетках B.subtilis s.bovi3 и Б.Гвос1ша гомосериндегидрогеназная активность принадлежит одному белку и не ассоциируется с аспзртаткиназной активностью, кок это имеет место у е. coli. '

Изучение последней стадии формирования лизина, катализируемой дишшюшмелатдекарбоксилазой, у в.3ubtili3 , s.bovin и E.jCocciuia и сопоставление полученных данных с имеющимися для E.coli и c.Eiutomicuia выявило ряд закономерностей и регуляции диаминопиыелатдекарбоксилазного синтеза у перечисленных бактерий. Диамииошшелатдекарбоксилаза кавдого микроорганизма в большей или меньшей степени чувствительна к репрессии лизином. Отсутствие синтеза диоминопимелатдекарбокенлазы мокст быть обусловлено повреждением двух независимых локусов: lysA, структурного гена дпажног^мслатдекарбоксилазы, и регуляторного элемента, активиругасго транскрипции 1узл. Интересно отметить, что размеры кодирующих .щшминопиыелатдекарбоксилазу последовательностей у анализируемых микроорганизмов очень близки. У E.coli такая последовательность предполагает 420- аминокислотный пептид, у B.subtilis - 440-ашнокислотный, у C.glutamicum -445-аминокислотиый пептид. Универсальность механизма регуляции экспрессии 1узлгена у B.subtilis и c.giutomicum подтверждается участием uas-подобных элементов, контролирующих уровень и характер транскрипции lysA . Хотя действие uas -элементов в

регуляции экспрессии lysA гена е.coli в настоящее гремя не по-■ ; казано, присутствие uas в регуляции других биосинтетических путей этой бактерии представлено достаточно широко. .

Сопоставление характера экспрессии lysA генов в.coli , C.glutamicum и B.subtilis свидетельствует о схожести транс и цис регуляторных механизмов, контролирующих синтез диамикопиме-летдекарбоксялазы этих микроорганизмов. Идентификация lysA ге- ;

S.bovis- и Е.faecium и их после,дующий анализ, еозможно, Ене- | сут свой екдзд е создание модели регуляции синтеза бактериаль- | ной дазминопимелатдекарбоксилазы. j

ВЫВОДи

1. У Рубцовых бактерий Streptococcus bovis и Enterococ-cus faecium впервые изолированы и охарактеризованы ключевые ферменты биосинтеза аминокислот аспарагиновой группы: аспартат-киназа, гомосерикдегидрогеназа и диаминогшмелатдекарбоксилаза.

2. Показано, что инициация конверсии аспартатз у s.bovis и Е.faecium осуществляется аспартаткиназной системой, представленной двумя изоферменташ, принципиально различными в функциональном отношении. Изучены механизмы регуляции аспартатки-наз, выявлен некоординированный характер их синтеза.

3. Проведен сравнительный анализ аспартаткыназных систем s.bovis , Е.faecium nB.subtilis . Обнаружено значительное сходство аспартаткиназных изоферментов Рубцовых кокков и аспар-таткиназ I и II B.subtilis . Впервые у микроорганизмов, не ! относящихся к роду Bacillus , тестирована ДАЛ-чувствятельная аспэртаткиназная активность.

'4. Первая реакция треониново/метиониновой ветви биосинтеза аминокислот аспартатного семейства катализируется гомосерин-дегидрогеназой. Этот фермент Еыделен и охарактеризован (молекулярная масса, стабильность, механизм регуляции) у B.subtilis, S.bovis и Е.faecium.

5. Проведена очистка фермента последнего этапа синтеза лпз:-:ка - ,гла;,шош!ыелатдекарбоксилззы B.subtilis , S.bovis

Е,faecium п изучены его основные сеойстеэ (молекулярная масса, субьединичное строение, оптимальные условия функционирования, к для субстрата, механизм регуляции).

.6. Показано, что отсутствие синтеза диаминопимелатдекар-боксилазы у B.subtiiis может бить обусловлено нарушением двух несцепленных локусов: структурного гена lysA и регуляторного элемента, участвующего в его транскрипции.

7. Осуществлено клонирование 1у.зА гена B.subtiiis ц его последующая интеграция в хромосому этого микроорганизма. Выявлен различный уровень синтеза дааминошплелатдекарбоксплазы в зависимост;: от положения lysA гена (на ллазмиде или г составе хромосомы).

8. Экспрессия [зонированного lysA гона как и гомологичной (клетки B.subtiiis ), так и гстерологичной (клетки е.coli ) системах носит нерегулируемый характер, что определяет значи- . мость плс-действующих факторов в управлении-ее контролем« Предложена гипотеза участия в регуляции, транскрипции lysA uas-подобных элементов, функционирующих в прокариотичеекпх и эука-риотических организмах.

По теме диссертация опубликовано 43 работы, из них основные:

1. Шевченко Т.Н., Тимашова (Кальчева) Е.О., Алексиева З.М. Регуляция биосинтеза лизина у Bacillus subtilis // Тезисы iy симпозиума социалистических стран по биотехнологии.-Варна,- I9dS.- С.4.

2. Aleksieva Ъ M , Shevchenko T.N , Timashova (Kalcheva) E.O. Increasing the output of lysine in strains of Bacillus sub tilis through the use of a structural analogue,aminoethyl-cysteine // Abstracts of Seminar on Biotechnology in the Chemical Industry. - 1986. -Varna.-P. 1-11.

3. Шевченко Т.Н., Тпмэпова (Кальчева) E-0., ТелегееЕ Г.Д. Рекомбинация плазмиды рР1251 с хромосомой Bacillus subti= lis // тезисы У1 Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов".- Москва.- 1937.- C.Ï03.

4. Шевченко Т.Н., Тимашова (Кальчева) Е-0. Ыутанты Bacillus subtilis с повышенным уровнем биосинтеза лизина // В сб.: "Методы получения и анализа биохимических препаратов".-Юрмала.- 1957G. 151.

j 5. Shevchenko T.N , Timashova(Kalcheva) E.O. Organization and i regulation of Bacillus subtilis lys-operon // Abstracts of

the 4 International Conference on Genetics and Biotecnology of Bacilli.- San Diego. -1987. -P.43

6. lysine genes organization and regulation in Bacillus subtilis / Shevchenko T.N,, Timashova(Kalcheva) E.O., Shaaskaya, biendeleva N.N. // Genome. - 1988,- Vol.30.- Suppl.1.- P.58.

7. Shevchenko I.N,, Timashova(Kalcheva) E.O. Gene amplification in Bacillus subtilis chromosome.// Genome.- 1988-- Vol.30 Suppl 1.- P.94

8. Shevchenko , Timashova(Kalcheva) E.O., Aleksieva Z.M. Control of lysine biosynthesis and lvsine overproduction by Bacillus subtilis S-(2-aminoethyl)-cysteine resistant mutants.// Abstracts of the 2 International Symposium on Overproduction of Microbial Products,- Ceske Budeejovice-1988.- P.145,

9. Штаммы Bacillus subtilis как продуценты ферменто:: бнослнте-зз лдззнв / Шевченко Т.Н., Тиматэва (Еэльчева) S.O., -зайзи-ев М.1Л., Ыэдата С.С. 11 В сб.: "Биосинтез ферментов у микроорганизмов". - Ташкент. - 1988. -С.262.

•10.Анализ мутантов Bacillus subtilis ауксотрофных по лизину / Шевченко Т.Н., Тимашова (Кальчева) Е.О., Алексиева З.М. и др. Л Молекул, генетика, микробиология и вирусология. -1980. - 1} 6. - С.£3-37.

11.Тимашова (КальчеЕа) Е.О., Шанская В.О. Клонапованзе и экс-пресс::ь генов ..пзакового блос:::-|'теза Bacillus subtilis в клетках E.coli и в.subtilis ¡1 В сб.: "Структура и функции биополимеров". - Львов. - 1959. - С.87.

12.Интеграция и амплификация шазмидной ДНК в хромосоме Bacil- • lus subtilis у £еьченко Т.Н., Тимашова (Кальчева) Е.О., бомин В.В., Телегеев Г.Д. // Цитология и генетика. - 1989.-Т.23. - Ji 2. - С.53-58.

13.1ПеЕченкЬ Т.Н., Тимашова (Кальчева) E.Q., Алексиева З.Ы. Мутанты Bacillus subtilis , устойчивые к аналогу лизина s -(г-ашкоэтил)-ь -цистеину // Генетика. - 1989. - Т.25.-И II. - С.1937-1945.

14.КальчеЕа Е.О., Ыалюта С.С., Кметь В. Повышение продукции лизина штаммами Streptococcus bovis и Streptococcus faecium// В сб.: "Микробиологические к бнотехнологические осноеы интенсификации растениеЕОдстЕа и кормопроизводства". - Алма-Ата.-1990. - С.38.

t - 29 -

i 15.Генетическая иихенерил стрептококков для увеличения продук-----------------

!--------типности^се11ьс1ю:созяГют1;с1и;ь;х кивотних / Кальчева Е.О., Фай- -

I зиев М.Ы., Шанская B.C., налито G.G. // 13 об.:"Современные i методы исследования в свиноводстве. - Полтава. - 1990. - С.102. I К.Кэльчевз Е.О., »¡штате С.С., Иметь В. Получение и анализ устои-| ЧИЕЫХ К s -(¿-аминоэтил)-L -цлетешу lETSM.DB . Streptococcus • faecium и Streptococcus bovis. // ¡.¡олекул. генетика, микро-| биология и вирусология. - 1931. - I. - С.28-30. j ГЛДиамкнопйыелпнозыЙ путь синтеза лизина у Escherichia coli и . бацилл / Кальчева Е.О., Шанская В.О., Файз::ев Гл".:.;., валюта С.С. // Молекул, генетика, микробиология и вирусология. -

1991. - И 2.- С.3-6.

Ib.&alcheva Е О., Eaiziev 11.М , Maljuta S.S. Иге isolation-and comparative analysis of diaminopimelate decarboxylases from Streptococcus bovi3 and Bacillus subtilis // -Russian Biochem Biotechnol. Ехргезз - 1991 - Vol.1 - P.217-222.

19. Effect of dimethyl sulfoxide on lysine production by mutants of Bacillus subtilis with low homoserine dehydrogenase acti-

I vity / Kalcheva E.O., Shonskaya V.O., Maljuta S.S., Smutny J// Folia Microbiol.- 1991.- Vol.36.- P.447-450.

20. Kolchova E.O., Faiziev ll.M.i Maljuta S.S. Isolation and'characterization of some enzymes of lysine biosynthesis in Streptococcus bovi3 apd Bacillus subtilis // Abstracts the

( 15 International Congress of Biochemistry.- Jerusalem.- 1991-P. 40.

. 21.DAP-decorboxylase activity and lysine production by rumen i bacteria / Styriak I., Timashova-Kalcheva E.O., Kmet V., Ma-| ljuta S.S. // Arch. Anim. Wutr.- 1992.- Vol.42.- P.71-77-

; 22.Скрининг различию: streptococcus bovis HS предмет

j потенциальной пригодности к суперпро,цукции лизина / Кальче-| ва Е. 0., ФаЙзлев Ы.М., Штыряк И., Ыалгота С.С. // Биополимеры ! и клетка. - 1992. - т.о. - ü 3.- С.43-46. j 23.Кальчева Е.О., Шанская В.О., Малюта С.С. Клонирование и регуляция экспрессии 1узА гена Bacillus subtilis // Генетика.-

1992. - t.2Ü.- ¡s 5.- С.5-10.

24.Кальчева Е.О., Шанская В.О., Малюта С.С. Интеграция клонированного на плазмиде lysA гена Bacillus subtilis в хромосо-j му этого микроорганизма // Генетихса.- 1992.- т.2и. - й-6.-С. 29-34.

25.Регуляция ферментов первой и последней стадий биосинтеза' лизина у Streptococcus bovis И Enterococcus hirae / Кальчева E.O., ФайзяеЕ ¡¿.¡А., Шанская D.O., Малюта'С>С. / Молекул. генетика, микробиология и вирусология. - 1993. Jä 5.-G.13-16.

26.1£альчеЕа Е.О., Шанская В.О., Малюта С.С. Некоторые особенности регуляции биосинтеза лизина у Streptococcus bovis // Прикл.биохимия и микробиология. - 1993. - т.29. - $ 2. -С.266-270.

27-Kalcheva Е.О., Shanskaya V.O., Maljuta S.S. Lysine biosyn-thetic pathway in Streptococcus bovis and Enterococcus fae-cium // Abstracts the 12 Lancefield International Simposium on Streptococci and Streptococcal Diseases.- St.Petersburg. 1993-- P.86.

28.Kalcheva E.O., Maljuta S.S. Key enzymes of aspartate family amino acid biosynthesis in rumen streptococci // Abstracts of the Joint Workshop on "Molecular Genetics in Modern Biotechnology" 'Palme.- 1993.- P.27.

29.Regulation of two aspartokinase isozymes in Streptococcus bovis / Kalcheva E.O., Faiziev М.Ы., Shanskaya V.O., Maljuta S.S. // Can.J.Microbiol.- 1994.- Vol.40.- P. 224-227

30.Kalcheva E.O., Shanskaya V.O., Maljuta S.S. Activities and regulation of enzymes involved in the first and the third steps of the aspartate biosynthetic pathway in Enterococcus faecium // Arch.Microbiol.- 1994.- Vol.i&J- P.359-362.

31.Кальчева E.O., Шанская B.O., Ыалюта С.С. Анализ ключевых ферментативных активностей биосинтеза аминокислот аспартат-ного семейства Streptococcus bovis // Биохимия.- 1994.-т.59.- !i I.- С.96-101.

32. Кальчева Е.О., Шанская В.О., ФайзиеЕ М.М., Ыалюта С.С. Как чэвые ферментативные активности пути биосинтеза лизина у Streptococcus bovis // ¡.Х'кробпол.;::урпЗЛ.-1994.- T.56.-ii 2.

с. eo-ei.