Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование систем гомологичной и сайт-специфической рекомбинации фага λ для целенаправленной модификации хромосомы Pantoea ananatis

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Использование систем гомологичной и сайт-специфической рекомбинации фага λ для целенаправленной модификации хромосомы Pantoea ananatis"

На правах рукописи

004602332

ГОЛУБЕВА ЛЮБОВЬ ИГОРЕВНА

Использование систем гомологичной и сайт-специфической рекомбинации фага X для целенаправленной модификации хромосомы РаШоеа апапаИя.

03.01.03-Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О МДП 20*0

Москва 2010

004602332

Работа выполнена в Лаборатории №3 Закрытого Акционерного Общества «научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, ЗАО «АГРИ» Ж.И. Каташкина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, ФГУП "ГосНИИ генетика"

доктор биологических наук, доцент, Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова

Ведущая организация:

Институт молекулярной генетики РАН.

Защита диссертации состоится «25» мая 2010 года в 14— на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01. при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1.

А.С. Миронов

И.В. Голденкова-Павлова

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

Автореферат диссертации разослан апреля 2010 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, Кандидат химический наук

Т.Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Использование бактерий в промышленном производстве биологически активных веществ (витаминов, антибиотиков, гормонов, аминокислот), органических кислот и биокатализаторов насчитывает более чем 50-ти летнюю историю, и в настоящее время объем микробных биотехнологических производств продолжает расти (Demain A.L., Adrio J.L., 2008). При этом, перед современной биотехнологией стоят такие задачи как расширение спектра производимых веществ и используемых субстратов, создание более рентабельных и экологичных технологий производства. Решение этих задач требует не только улучшения свойств существующих продуцентов, но и поиск новых микроорганизмов, обладающих определенными преимуществами и биотехнологическим потенциалом. Более того, относительная доступность секвенирования бактериального генома и наличие целого пакета компьютерных программ, позволяющих реконструировать метаболические пути, опираясь только на нуклеотидную последовательность генома, обеспечивает достаточно большой объем начальной информации о метаболизме вновь отобранного организма. С другой стороны, накопленный опыт, а также данные, полученные на базе современных экспериментальных и аналитических методов исследования метаболизма (анализ распределения и контроля потоков, анализ уровня экспрессии генов, компьютерное моделирование и т.д.) однозначно указывают на необходимость тонкой настройки метаболизма для обеспечения высокоэффективного синтеза интересующего продукта бактериальными клетками. Успех в создании высокоэффективного штамма зависит не только от физиологических особенностей организма, но и от возможности быстро конструировать необходимые генетические модификации. Для решения этой задачи необходим удобный генно-инженерный инструментарий, позволяющий создавать бесплазмидные, безмаркерные штаммы, штаммы, несущие множественные мутации, модулировать уровень экспрессии целевого гена и интегрировать протяженные фрагменты ДНК в хромосому. Наиболее подробно подходы для подобных генетических манипуляций ранее были разработаны для Escherichia coli (Peredelchuk M.Y., Bennett G.N., 1997; Каташкина Ж. И., 2003; Meynial-Salles I. et al, 2005; Каташкина Ж.И. и dp, 2005; MinaevaN.I. et al, 2008). Основу этих методов составляет использование систем гомологичной (Red) и сайт-специфической рекомбинации фага L Однако, несмотря на кажущуюся простоту Red-системы, включающей всего 3 фаговых гена, и подробное изучение механизма Red-зависимой рекомбинации, до сих пор этот чрезвычайно эффективный метод генной инженерии, первоначально разработанный для Е. coli К12, удавалось использовать только в ряде патогенных штаммах Е. coli и некоторых штаммах Salmonella, Erwinia, Yersinia и Pseudomonas. Поэтому расширение

рамок применимости известных методов генной инженерии для манипулирования геномами новых потенциальных продуцентов является актуальной и практически значимой задачей.

Цели и задачи работы.

Целью данной диссертационной работы является адаптация высокоэффективного генно-инженерного инструментария, разработанного в настоящее время для Е. coli, для использования в клетках близкородственного организма Pantoea ananatis. В ходе работы решались следующие задачи:

• адаптация Red-зависимой системы гомологичной рекомбинации фага X для создания целенаправленных модификаций (делеций, замен регуляторных областей, точечных мутаций) в хромосоме Р. ananatis;

• разработка инструментария для конструирования штаммов Р. ananatis, содержащих множественные модификации хромосомы;

• создание охарактеризованной библиотеки промоторов для обеспечения плавного изменения уровня экспрессии целевых генов в Р. ananatis',

Научная новизна и практическая значимость работы.

В ходе адаптации X Red-зависимой системы рекомбинации фага X Е. coli для целенаправленной модификации хромосомы близко родственного организма Р. ananatis была выявлена токсичность одновременной экспрессии X Red-генов для клеток данной бактерии. В ходе работы был отобран мутантный штамм Р. ananatis, устойчивых к экспрессии генов X Red-системы. Использование данного штамма в качестве реципиента позволяет интегрировать линейные двуцепочечныые фрагменты ДНК в хромосому Р. ananatis с частотой не меньшей, чем в Е. coli К12. Было показано, что одновременная экспрессия X gam и bet генов не приводит к токсическому эффекту, что позволяет использовать данные гены для модификации хромосомы штамма дикого типа с помощью олигонуклеотидов.

Для P. ananatis были адаптированы процедура переноса маркированных мутаций с помощью электропорации геномной ДНК и X Int/Xis-зависимая система сайт-специфицеской рекомбинации для вырезания селективного маркера после его использования, что позволяет конструировать штаммы со множественными модификациями. Была разработана двухстадийная методика создания целенаправленных точечных мутаций в хромосоме P. ananatis с использованием гена sac В Bacillus subtilis в качестве контр-селективного маркера. Данная методика находит применение в решение задач белковой инженерии. Была получена и охарактеризована библиотека Рис-подобных промоторов узнаваемых РНКП P. ananatis для плавного варьирования уровня экспрессии целевых генов в данном организме.

Совокупность разработанных методов активно применяется в работе НИИ «Аджиномото-Генетика» и позволяет быстро и эффективно решать как прикладные задачи по конструированию штаммов-продуцентов на базе Р. апапаИя, так и задачи по изучению метаболизма данной бактерии.

Публикации и апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК, 1 патентная заявка и 1 материалы научной конференции. Материалы диссертации докладывались на конкурсе работ сотрудников ЗАО «АГРИ» (июнь 2006).

Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП ГосНИИгенетика и НТС ЗАО «АГРИ» 9 марта 2010 года.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждения», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на_ /йЗ .страницах, включая ^ <рисунков и 0 таблиц. Список цитируемой литературы содержит источника, в том числе 3~на русском языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Объектом данной работы является бактерия вида Р. ananaíis, принадлежащая к семейству Enterobacteriacea. Природный штамм данной бактерии AJ13355 был селектирован из почвы Iwata-sh¡ (Сизуока, Япония) как штамм, способный расти при низких значениях рН и устойчивый к высоким концентрациям глутаминовой кислоты (I:ui Н. et al, 2003). Данная физиологическая особенность делает этот организм перспективным объектом биотехнологии, в частности, для продукции глутаминовой кислоты в условиях ферментации при кислых значениях рН, сопровождающейся кристаллизацией продукта (Izui Н. et al, 2003). Штамм AJ13355 прошел тест на биобезопасность.

Штамм AJ13355 выделяет большое количество экзополисахарида при росте в лабораторных условиях, что значительно затрудняет работу с ним. С помощью УФ-зависимого мутагенеза исходного штамма AJ13355 был отобран штамм, SC17, со сниженной способность к образованию экзополисахарида (Izui Н. et al, 2003). Именно этот штамм является объектом дальнейших исследований.

К началу данной работы было известно, что:

■ в клетках P. ananatis реплицируются плазмиды - pUC19 (ColEI репликон), pMW218/219 (pSClOl репликон) и плазмида RSF1010;

■ клетки Р. ananatis не заражаются известными трансдуцирующими фагами Е. coir,

■ клетки P. ananatis не трансформируются с помощью Са2+-зависимой трансформации;

■ возможна эффективная интеграция генетического материала в геном P. ananatis с использованием mini-Mu системы;

■ последовательность генома Р. ananatis.

1. Трансформация клеток Р. апапаНз методом электропорации.

Для введения ДНК в клетки Р. апапаИ5 был разработан протокол электротрансформации данной бактерии. Для этого изучалась зависимость

частоты электротрансформации клеток Р. апапаШ плазмидной ДНК от таких

факторов как: фаза роста культуры клеток, процедура приготовления электрокомпетентных клеток, напряженность электрического поля и длительность электрического импульса. В результате для клеток Р. апапа№

был разработан простой протокол, обеспечивающий частоту плазмидной электротрансформации до 106 трансформантов на 108 клеток, выживших

после электропорации. Электропорация проводилась при следующих

значениях параметров электрического импульса: Е=20 кВ/см и т=5 мкс

(Я=200£2, С=25цР). Разработанный протокол обеспечивал эффективное введение в клетки Р. апапаШ плазмид, несущих Со1Е1, рБСЮ! и И^ПОЮ

репликоны. Размер вводимых плазмид варьировался от 4 до 15 т.п.н. Данный протокол также был использован для введения линейных фрагментов ДНК и олигонуклеотидов в клетки Р. апапайз.

Рисунок 1. Структура плазмиды рКШ-ЫзН-БсеКт-ЫзЬ, содержащей

области хромосомы Р. апапаНэ, располагающиеся левее и правее сайта 5яга/ гена /¡кО. Внизу схематично изображен участок хромосомы Р. апапаЧв, несущий ген.

В клетках Е. coli линейные двухцепочечные молекулы ДНК быстро деградируют за счет АТФ-зависимой экзонуклеазной активности RecBCD белка (Cosloy S.D., Oishi M, 1973). Поэтому для интеграции в хромосому Е. coli линейных двухцепочечных фрагментов ДНК либо используют специальные штаммы-реципиенты, в которых данная активность отсутствует (Cosloy S.D., Oishi M, 1973; Russell C.B. et al, 1989), либо используют фрагменты ДНК, защищенные специальным образом ориентированными Chi-последовательностями (Dabert P., Smith G.R., 1997). Процедура электропорации также приводит к значительному снижению АТФ-зависимой экзонуклеазной активности, что позволяет интегрировать линейные двухцепочечные фрагменты ДНК с протяженными областями гомологии в хромосому штамма Е. coli дикого типа (El Karoui M. Et al, 1999). Для P. ananatis была продемонстрирована возможность конструирования хромосомных модификаций с помощью электропорации штамма SC 17 линейным двухцепочечным фрагментом ДНК с протяженными областями гомологии к заданному месту хромосомы. Для этого была сконструирована плазмида pMW-hisR-SceKm-hisL (Рис. 1), несущая ген устойчивости к канамицину (кап), фланкированный областями хромосомы Р. ananatis, располагающимися левее и правее сайта Smal гена hisD. Плазмида pMW-hisR-SceKm-hisL была использована в качестве матрицы для получения с помощью ПЦР интегративной кассеты, содержащей области гомологии к целевому месту хромосомы Р. ananatis длиной 500 н.п. Штамм SC17 Р. ananatis был электротрансформирован полученной интегративной кассетой в

соответствии с вышеописанным протоколом. В результате гомологичной рекомбинации между интегративной кассетой и хромосомой P. ananatis происходила инактивация гена hisD гистидинового оперона. После электропорации на селективной среде, содержащей канамицин, было получено 20-30 колоний. Все отобранные KmR колонии имели His" фенотип. Для нескольких KmRHis" колоний структура хромосомы была подтверждена с помощью ПЦР. Полученный штамм был назван SC 17hisD::kan. Необходимо отметить, что при увеличении длины участков, гомологичных целевому месту хромосомы P. ananatis, выход интегрантов увеличивался.

Метод общей трансдукции является наиболее эффективным и распространенным методом переноса мутаций между бактериальными штаммами. К сожалению, ни один из трансдуцирующих фагов Е. coli не заражает клетки Р. ananatis. Поэтому было необходимо разработать удобный метод для переноса маркированных мутаций между штаммами Р. ananatis.

В некоторых работах для переноса генетических маркеров между различными штаммами Е. coli и Pseudomonas была использована электропорация геномной ДНК (Mylroie J.R. et al, 1978; Kilbane J.J. 2nd, Bielaga B.A., 1991). Возможность использования такого подхода для переноса маркированных мутаций между штаммами Р. ananatis была проверена экспериментально.

Известно, что для эффективного введения крупных плазмид (длинной от нескольких десятков т.п.н и выше) в бактериальную клетку необходимо использовать специальные параметры электрического импульса - более длительное время импульса и меньшую напряженность электрического поля (Sheng Yu.L. et al, 1995). Влияние именно этих параметров на частоту переноса маркера между штаммами Р. ananatis с помощью электропорации геномной ДНК было исследовано в первую очередь. Штамм SC17hisDv.kan был использован в качестве донора маркера устойчивости к канамицину. Штамм SC 17 был использован в качестве реципиента. В ходе работы было обнаружено, что способ выделения геномной ДНК может оказывать сильное влияние на частоту трансформации. В результате был разработан протокол, обеспечивающий максимальный выход трансформантов - 100 KmR His" колоний в расчете на 108 клеток, выживших после электропорации. Эффективное введение геномной ДНК в клетки P. ananatis обеспечивалось следующими условиями элетропорации: напряженностью электрического поля 12,5 kB/см и временем импульса 10 мкс (R=400i2, C=25|iF). Вся процедура, включая выделение геномной ДНК, может быть проведена в течение одного дня. Необходимо отметить, что метод электропорации геномной ДНК в отличие от трансдукции позволяет предотвратить одновременный перенос близкорасположенных мутаций. Для этого, препарат хромосомы перед электропорацией необходимо обработать рестриктазой/рестриктазами, чьи сайты узнавания располагаются между мутациями и не содержатся в целевом фрагменте.

2. Адаптация Red-зависимой системы гомологичной рекомбинации фага /. для создания целенаправленных модификаций в хромосоме Р. ananatis.

Red-зависимая система гомологичной рекомбинации фага X обеспечивает эффективную интеграцию линейных фрагментов ДНК с короткими областями гомологии (обычно 36-40 п.н.) в заданную точку молекулы-мишени. X, Red-система активно используется в клетках Е. coli для целенаправленной модификации хромосомы этого организма, искусственных бактериальных хромосом и плазмид. К настоящему времени X Red-система также была использована для модификации хромосомы ограниченного числа близкородственных Е. coli организмов (Salmonella, Erwinia, Yersinia, Shigella) и бактерий рода Pseudomonas. Однако только при использовании в клетках бактерии Salmonella enterica Serovar Typhimurium удалось получить эффективности интеграции, сравнимые с таковыми в Е. coli.

2.1. Конструирование плазмиды-помощника, обеспечивающей регулируемую экспрессию генов Red-системы фага X.

Для обеспечения экспрессии генов Red-системы в клетках Р. ananatis была сконструирована плазмида-помощник pRSFRedTER (Рис. 2). Данная плазмида сконструирована на базе репликона широкого круга хозяев RSF1010. Транскрипция генов Red-системы осуществляется с промотора P&CUV5- Экспрессия генов Red-системы находится под контролем авторегулируемого элемента P¡ac\jyS-lacI, обеспечивающего низкий базальный уровень экспрессии генов (Скороходова А.Ю. и др, 2004). Дополнительное снижение базального уровня экспрессии генов X Red-системы было обеспечено терминатором транскрипции ггпВ оперона Е. coli, предотвращающим сквозную транскрипцию с области плазмиды, располагающейся левее. В состав плазмиды был введен ген левансахаразы В. subtilis (ген sacB), обеспечивающий эффективную элиминацию плазмиды из клеточной популяции при росте на сахарозе.

Для проверки функциональности сконструированной плазмиды была проведена интеграция двухцепочечного фрагмента ДНК, содержащего ген устойчивости к канамицину, фланкированный сайтами XattL и XattR ((XattL-kan-XattR)-Kaccera), в структурную часть гена galK Е. coli в присутствии плазмиды pRSFRedTer. Выход трансформантов составил около 300 KmR колоний на 108 колоний, выживших после электропорации. Структура хромосомы 10 независимых KmR колоний была подтверждена ПЦР анализом. Достигнутая частота интеграции сравнима с частотой интеграции двухцепочечных фрагментов ДНК в хромосому Е. coli, обеспечиваемой плазмидой pKD46 (Datsenko К.А., Wanner B.L., 2000).

Так как основные, функционально-значимые элементы плазмиды pRSFRedter являются активными в ряде других бактерий, то, потенциально,

данная плазмида может быть использована для обеспечения экспрессии генов X Яес1-системы в этих микроорганизмах.

Рисунок 2. Структура плазмиды-помощника pRSFRedTER, обеспечивающей регулируемую экспрессию генов А Red-системы.

2.2. Одновременная экспрессия генов Red-системы фага к является токсичной для клеток P. ananatis.

При электротрансформации штамма SC17 P. ananatis плазмидой pRSFRedTER колонии, полученные на селективной среде с хлорамфениколом, были меньшего размера, чем трансформанты, полученные на идентичной селективной среде после электропорации штамма SC17 контрольной плазмидой pRSFsacB, не несущей гены X Red-системы. При этом трансформанты, несущие плазмиду pRSFRedTER, росли значительно медленнее на LB среде с хлорамфениколом по сравнению с трансформантами, несущими плазмиду pRSFsacB. Добавление же ИПТГ в среду культивирования для индукции экспрессии генов X Red-системы полностью останавливало рост культуры клеток, несущих плазмиду pRSFRedTER, но не влияло на рост культуры клеток, несущих контрольную плазмиду pRSFsacB. Ранее было показано, что авторегулируемый элемент Pfacuv5-foc/ обеспечивает эффективную репрессию (минимум 100-кратную) и низкий базальный уровень экспрессии целевых генов (Скороходова А.Ю. и др, 2004). Тем не менее, даже базальный уровень экспрессии генов Red-системы был токсичен для клеток штамма SC17 P. ananatis и приводил к значительному снижению скорости роста.

Для того чтобы выявить, экспрессия какого из компонентов X Red-системы является токсичной, была сконструирована плазмида pRSFGamBet (Рис. 3), не содержащая в своем составе ген ехо, кодирующий 5'—>3' экзонуклеазу фага X.

TERrrnB ! PlacUV5

Рисунок 3. Структура плазмиды-помощника: pRSFGamBet, обеспечивающей регулируемую экспрессию генов X gam и X bet.

pRSFGamBet

lad

11640 bp

PlacUV5

Известно, что активность 5'—>3' экзонуклеазы Red-системы фага Я. необходима для осуществления интеграции двухценочечных фрагментов ДНК. Однако для интеграции одноцепочечных фрагментов, таких как химически синтезированные олигонуклеотиды, необходима экспрессия только гена bet фага X. Плазмида pRSFGamBet была использована для осуществления рекомбинации между олигонуклеотидом длинной 72 н.п. и хромосомой ранее полученного штамма MG\655galK::(XattL-kan-XattR). В результате рекомбинации происходило восстановление структурной части гена galK Е. coli и способности штамма расти на галактозе как единственном источнике углерода. В трех независимых экспериментах выход трансформантов составил от 1,5*104 до 2,5*104 Gal+ клонов в расчете на 108 клеток, выживших после электропорации. Таким образом была доказана функциональность полученной плазмиды pRSFGamBet.

Введение плазмиды pRSFGamBet в штамм SC 17 не приводило к ингибированию роста клеток даже в присутствии ИПТГ в среде культивирования. Таким образом, выявленный ранее токсический эффект от присутствия плазмиды pRSFRedTER в клетках P. ananatis был обусловлен либо экспрессией гена ехо, либо одновременной экспрессией всех трех генов X Red-системы - gam, bet, ехо.

2.3. Селекция штамма-реципиента для осуществления X Red-зависимой интеграции двухцепочечных фрагментов ДНК в хромосому P. ananatis.

По современным представлениям мишенью при X Red-зависимой интеграции служат одноцепочечные участки ДНК, образующиеся между фрагментами Оказаки при репликации. Поэтому для осуществления высокоэффективной X Red-зависимой интеграции необходима активная репликация хромосомы, и, следовательно, хороший рост клеток. Поэтому значительное замедление роста штамма SC 17 Р. ananatis в результате экспрессии генов X Red-системы являлось серьезным препятствием при

решении задачи об адаптации метода X Яескзависимой рекомбинации для использования в клетках Р. апапаИя. Возможным решением данной проблемы являлся отбор специального штамма, устойчивого к экспрессии генов X 11ес1-системы.

Рисунок 4. Расщепление колоний штамма P. ananatis SC17 по размеру после электротрансформации плазмидой pRSFRedTER, обеспечивающей регулируемую экспрессию генов X. Red-системы.

Мутантньш штамм, устойчивый к экспрессии генов X Red-системы, был отобран следующим образом. При трансформации штамма SC17 плазмидой pRSFRedTER среди трансформантов, выросших на LB среде с хлорамфениколом, было отобрано около 10 колоний большего размера (Рис. 4). Клетки из отобранных колоний росли в жидкой LB среде с хлорамфениколом так же хорошо, как клетки штамма SC 17, несущие контрольную плазмиду pRSFsacB. Более того, добавление ИПТГ в среду культивирования лишь незначительно замедляло рост отобранных «крупных» колоний. Резкое отличие свойств «крупных» колоний от ранее описанного поведения может быть объяснено двумя возможными причинами: во-первых, эти колонии могли нести мутантную плазмиду pRSFRedTER, не обеспечивающую экспрессию генов X Red-системы; во-вторых, «крупные» колонии могли быть мутантами, устойчивыми к экспрессии генов X Red-системы.

Для проверки первого предположения плазмидная ДНК, выделенная из трех независимых «крупных» колоний, была перетрансформирована в штамм Е. coli MG1655. В качестве контроля штамм Е. coli MG1655 был трансформирован исходным препаратом плазмиды pRSFRedTER. Полученные трансформанты были использованы в качестве реципиентов для X Red-зависимой инактивации гена galK Е. coli путем интеграции линейного фрагмента ДНК, содержащего (XattL-kan-XattR) кассету в структурную часть

гена. Во всех случаях выход трансформантов был высоким и составил от 200 до 300 KmR колоний в расчете на 108 клеток, выживших после электропорации. Таким образом, плазмиды pRSFRedTER, выделенные из «крупных» колоний, обеспечивают такой же уровень экспрессии всех трех генов X Red-системы, как и исходно полученная плазмида.

Три «крупных» колонии, являвшиеся донорами плазмиды pRSFRedTER в предыдущем опыте, были излечены от данной плазмиды и вновь трансформированы исходным препаратом pRSFRedTER. Во всех трех случаях все полученные колонии были большого размера и имели те же свойства, что и родительские клоны. Один независимый трансформант для каждой родительской «крупной» колонии был использован в качестве реципиента для X Red-зависимой интеграции линейного фрагмента ДНК, несущего (XattL-kan-XattR) кассету, фланкированную областями гомологии к гену hisD P. ananatis длиной 40 н.п. В результате было получено от 100 до 150 KmR колоний в расчете на 108 клеток, выживших после электропорации. Факт интеграции линейного фрагмента ДНК в соответствующую точку хромосомы P. ananatis был подтвержден для 10 независимых KmRHis~ колоний для каждого реципиента. Один из реципиентов, использованный в вышеописанных экспериментах и излеченный от плазмиды pRSFRedTER, был назван SC 17(0). При использовании данного штамма в качестве реципиента для X Red-зависимой интеграции линейных фрагментов ДНК с короткими плечами гомологии в хромосому Р. ananatis достигнутая частота интеграции сравнима с частотой, получаемой в аналогичных экспериментах в Е. coli (Datsenko К.А., Wanner B.L., 2000). Штамм, несущий в хромосоме ген hisD, инактивированный (XattL-kan-XattR) кассетой, был назван SC17(0)hisD:: (:XattL-kan-XattR).

В настоящее время метод X Red-зависимой интеграции линейных фрагментов ДНК был использован для создания в хромосоме штамма SC17(0) делеций, различных модификаций регуляторных областей и интеграции гетерологичных генов. При этом мишенями для генетических манипуляций служили: гены центрального метаболизма (гликолиза, пентозо-фосфатного пути, ТСА); гены дыхательной цепи; гены, кодирующие транспортные белки; гены, кодирующие белки-регуляторы. Частота интеграции варьировалась в зависимости от конкретной модификации от нескольких сотен до нескольких десятков интегрантов в расчете на 108 клеток, выживших после электропорации.

3. Введение множественных модификаций в хромосому Р. ananatis с использованием комбинированной системы X Red-Int/Xis.

Создание штаммов, содержащих несколько различных модификаций в хромосоме, является необходимым этапом как при конструировании современных штаммов-продуцентов, так и при изучении сложных биологических процессов, происходящих в бактериальной клетке. При

решении такой задачи исследователи сталкиваются с проблемой ограниченного набора селективных маркеров, используемых в целевом организме. Немаловажным является также существование законодательных ограничений на присутствие селективных маркеров в промышленных штаммах продуцентах. В настоящее время разработан и активно применяется инструментарий, позволяющий удалять селективный маркер из хромосомы после его использования. Разработанные подходы базируются на различных системах сайт-специфической рекомбинации: Сге/1ох фага PI (Dale Е.С., Ow D.W., 1991), Flp/FRT 2 мкм дрожжевой плазмиды (Cherepanov P.P., Wackernagel W., 1995), система mrs плазмиды RP4 (Kristensen С. S. et al, 1995) и системы фага X (Peredelchuk M. Y., Bennett G.N., 1997).

Ранее в нашей лаборатории была разработана система, позволяющая удалять селективный маркер из хромосомы Е. coli после его использования (Каташкина Ж. И., 2003). Данная система, основанная на сайт-специфической рекомбинации фага X, аналогична системе, представленной в работе Peredelchuk и Bennet (Peredelchuk M.Y., Bennett G.N., 1997), но имеет ряд преимуществ. Плазмида-помощник pMW-intxis-ts создана на базе термочувствительного репликона pSC101-ts, что позволяет легко элиминиравать ее из популяции после использования. Гены X xis-int экспрессируются в составе плазмиды под контролем X Pr промотора, регулируемого термочувствительным репрессором X CIts857. Также был сконструирован набор вырезаемых маркеров, содержащих эффективно экспрессирующиеся гены антибиотической устойчивости к канамицину, хлорамфениколу и тетрациклину, фланкированные областями XattL/XattR. Было показано, что созданная система эффективно функционирует при температуре +37 °С, соответствующей неполной инактивации X CIts857 репрессора. Этот факт является очень важным, так как P. ananatis имеет более низкую оптимальную температуру для роста (+34°С) и не растет при +42°С - стандартной температуре инактивации X CIts857 репрессора.

Известно, что в процессе сайт-специфической рекомбинации фага X принимают участие не только фаговые белки Int и Xis, но и белки Е. coli Fis и IHF. Компьютерный анализ выявил присутствие в геноме P. ananatis открытых рамок считывания, кодирующих гомологи белка Fis Е. coli (степень идентичности АК последовательностей 99%) и а и ß субъединиц белка IHF Е. coli (степень идентичности АК последовательностей 97% и 94% соответственно). Поэтому можно было ожидать, что гомологи из Р. ananatis смогут заменить белки Fis и IHF Е. coli, необходимые для эффективного X Int/Xis зависимого удаления маркера из хромосомы.

Р. ananatis имеет природную устойчивость к ампициллину, поэтому исходная плазмида pMW-intxis-ts, несущая ген Ыа в качестве селективного маркера, не может быть использована в клетках данного организма. Ген Ыа был заменен в составе плазмиды pMW-intxis-ts на ген устойчивости к хлорамфениколу. Полученная в результате плазмида была названа pMW-intxis-cat (Рис. 5). Штамм SC 17(0 )hisD::(XattL-kan-XattR) был

трансформирован плазмидой pMW-intxis-cat с помощью электропорации. Клетки после электропорации высевались на LB среду с хлорамфениколом и инкубировались при +37°С в течении 16 часов. В результате около 30% трансформантов имели Kms фенотип. Вырезание маркера устойчивости к канамицину из хромосомы этих клонов было подтверждено ПЦР анализом. Далее несколько Kms колоний были рассеянны до отдельных клонов на среде без хлорамфеникола и инкубировались в течении 16 часов при +37°С для излечивания от плазмиды-помощника. Эффективность излечивания составила (10-20)%.

В настоящее время разработанные системы X Red-зависимой интеграции линейных фрагментов ДНК, X Int/Xis зависимого удаления маркера из хромосомы Р. ananatis и метод электропорации геномной ДНК позволили совместить в хромосоме штаммов SC17(0) и SC17 до 10 модификаций различного рода. При этом присутствие большого количества сайтов X attB в хромосоме не влияло ни на стабильность полученных штаммов, ни на частоту X Red-зависимой интеграции линейных фрагментов ДНК, имеющих в своем составе последовательности XaííL и XatíR.

4. Введение точечных мутаций в хромосому штамма SC17(0) Р. ananatis.

Для введения точечных замен в искусственные бактериальные хромосомы или хромосому Е. coli несколькими исследовательскими группами был использован подход, основанный на использовании X Red-зависимой или ReeET-зависимой рекомбинации и двойного маркера - для прямой и контр-селекции. В качестве маркера для прямой селекции чаще всего используют гены антибиотической устойчивости. Контрселективный маркер представляет собой последовательность ДНК, присутствие которой в хромосоме приводит к гибели клеток в определенных условиях. Введение точечных замен в молекулу-мишень осуществляется в два последовательных этапа. На первом этапе в интересующую точку молекулы-мишени с

repA is

Рисунок 5. Структура плазмиды-помощника pMW-intxis-cat, имеющей термочувствительный репликон и обеспечивающей термоинДуцибельную экспрессию X int и Xxis генов.

Рпп xis

помощью X Red/RecET-зависимой рекомбинации вводится кассета, содержащая двойной маркер и целевую мутацию. На данном этапе отбор интегрантов проводится с помощью прямой селекции. На втором этапе в результате X Red/RecET-зависимой рекомбинации между двухцепочечным фрагментом ДНК или олигонуклеотидом, также содержащим необходимую мутацию, и целевым местом молекулы-мишени происходит удаление ранее интегрированной кассеты. На данном этапе селекция обеспечивается маркером для контрселекции. Полученный таким образом штамм не несет в своей хромосоме никаких дополнительных модификаций, кроме целевой. В качестве контрселективного маркера часто используют ген левансахаразы Bacillus subtilis, чья экспрессия приводит к гибели клеток при росте на сахарозе из-за синтеза полимера р-2,6-фруктана (левана). Для Е. coli при использовании гена sacB частота отбора целевой модификации составляла от 10% до 25% (Zhang Y. et al, 1998; Muyrers J.J.P. et al, 2000).

Для проверки возможности использования вышеописанной методики для конструирования точечных замен в хромосоме P. ananatis была произведена замена двух нуклеотидов в структурной части гена hisD данной бактерии, приводящая к исчезновению сайта рестрикции Smal и возникновению в этой точке сайта рестрикции Xhol. При этом вводимые замены не изменяли аминокислотной последовательности белкового продукта. Была сконструирована плазмида pRSFPlacsacB, содержащая в своем составе кассету (P!acW5-sacB-cat), несущую селективный (ген cat) и контрселективный (ген sacB) маркеры. Ген левансахаразы в данной конструкции экспрессируется под контролем Р/асцу5 промотора. На базе плазмиды pRSFRedter была сконструирована плазмида pRSFRedkan. В составе данной плазмиды гены sacB и cat были заменены на ген устойчивости к канамицину. Плазмида pRSFRedkan была использована в качестве плазмиды-помощника для обеспечения X Red-зависимой интеграции кассеты (FiacWS-sacB-cat) в ген hisD штамма SC 17(0) Р. ananatis. Отбор интегрантов производился на LB среде с хлорамфениколом. В полученных интегрантах был подтвержден His"Sucs фенотип (Рис. 6Б). Далее с помощью ПЦР был сконструирован линейный двухцепочечных фрагмент длиной 170 н.п., содержащий необходимую мутацию, фланкированную областями гомологии к гену hisD Р. ananatis (Рис. 6А). Полученный фрагмент был интегрирован в хромосому ранее сконструированного штамма SCn(0)hisD::V,acv\5-sacB-cat с помощь X Red-зависимой рекомбинации, обеспечиваемой генами X Red системы в составе плазмиды-помощника pRSFRedkan. В результате рекомбинации в ген hisD вводились необходимые нуклеотидные замены, и одновременно происходила элиминация (P/ucuvr sacB-cat) кассеты из хромосомы (Рис. 6Б). Около 300 трансформантов было полученно на LB среде с добавлением 30% сахарозы и 1мМ ИПТГ для индукции P/acuv5 промотора. Необходимо отметить, что P. ananatis хорошо растет на сахарозе как единственном источнике углерода, а в геноме данной бактерии были найдены гены утилизации сахарозы (scrK, scrYABR). Поэтому

в данном опыте для отбора интегрантов были использованы более высокие концентрации сахарозы по сравнению с аналогичными опытами для Е. coli (обычно используют (5-10)%). Из 100 проанализированных трансформантов 25 имели His+Cms фенотип. Для 15 из SucRHis+Cms клонов была подтверждена замена сайта рестрикции Smal на сайт Xhol в hisD гене путем обработки соответствующих ПЦР-фрагментов рестриктазами Smal или Xhol.

Таким образом, был разработан метод введения точечных замен в хромосому штамма SC 17(0) Р. ananatis. Эффективность введения точечной мутации составила 25%.

А) his-Xhol-1 + Б) cat sacB PtedJV5

ф his-Xhol-2 Xhnt s_u , ■»■,;,■,;,„■,■„, -\

his-SL SucsCmRHis" \Smap/

hisD "Y , X "

Ф Xhol his-SR Xhol 0

SucRCmsHiV

I

82 bp 82 bp hisD —-1-✓ Xhol

Рисунок 6. Схема конструирования немаркированных точечных замен в гене hisD P. ananatis. А) Конструирование двухцепочечного фрагмента ДНК, несущего необходимую мутацию. На первом этапе два комплементарных олтгонуклеотида HisD-Xhol-l и HisD-Xho-2 были гибридизированы друг с другом. Оба олиглнуклеотида содержат в своей последовательности целевые нуклеотидные замены (обозначены звездочками), приводящие при отжиге к образованию сайта узнавания рестриктазы Xhol. Далее полученный двухцепочечный фрагмент ДНК был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов his-SL/his-SR. В результате был получен двухцепочечный фрагмент ДНК, содержащий целевые нуклеодидные замены, фланкированные областями гомологии к гену hisD P. ananatis длиной 82 п.н. Б) Схема конструирования замены двух нуклеотидов в структурной части гена hisD P. ananatis с помощью двухстадийной методики, основанной на использовании X Red-зависимой рекомбинации и кассеты с двойным селективным/контрселективным маркером.

5. Целенаправленная модификация хромосомы штамма SC17 Р. ananatis с помощью X Bet-зависимой интеграции олигонуклеотидов.

Разработанной в данной работе метод элекгропорации геномной ДНК позволяет переносить маркированные мутации, полученные в хромосоме штамма SC17(0) с помощью X Red-зависимой системы рекомбинации, в штамм дикого типа SC17. Перенос точечных мутаций в штамм SC17 представляется более сложным процессом, включающим дополнительные стадии. Во-первых, необходимо маркировать целевую точечную мутацию; во-вторых, удалить аллель дикого типа из хромосомы штамма SC17 и только после этого переносить в штамм целевую модификацию. При этом в результирующем штамме помимо необходимой модификации будет

присутствовать селективный маркер или X attB в случае использования вырезаемого маркера. На втором этапе эксперимента, описанного в предыдущем разделе, вместо линейного двухцепочечного фрагмента ДНК может быть использован олигонуклеотид, содержащий необходимую замену. Для интеграции одноцепочечной ДНК необходима только Bet активность фага X. Ранее было установлено, что совместная экспрессия белков X Gam и X Bet не является токсичной для клеток штамма SC17 (см. Раздел №2.2). Используя эти факты и метод переноса маркированных мутаций между штаммами P. ananatis была показана принципиальная возможность создавать нуклеотидные замены непосредственно в хромосоме штамма SC17 с использованием олигонуклеотидов.

Замена двух нуклеотидов в последовательности гена hisD штамма SC17, приводящая к исчезновению сайта рестрикции Smaln возникновению в этой точке сайта рестрикции Xhol, были сконструирована следующим образом. Сначала маркированная хромосомная модификация hisD::PiacUVi-sacB-cat была перенесена в штамм SC17 с помощью электропорации геномной ДНК, выделенной из штамма SC1 l(0)hisD::?iacuvs-sacB-cat. Полученный штамм, SC17hisD::PiacVys-sacB-cat, был далее трансформирован плазмидой pRSFGamBetkan. Плазмида pRSFGamBetkan была получена из плазмиды pRSFGamBet (Рис. 3) путем замены генов sacB и cat на ген устойчивости к канамицину. Известно, что эффективность интеграции олигонуклеотидов зависит от направления репликации в сайте рекомбинации. Направление репликации хромосомы P. ananatis в области hisD гена неизвестно. Поэтому штамм SCYlhisD'.'FiacwrsacB-ca//pRSFGamBetkan был трансформирован олигонуклеотидами HisD-XhoI-1 и HisD-Xho-2, комплементарными друг другу и несущими необходимые нуклеотидные замены. Клетки после электропорации высевались на LB среду с добавлением 30% сахарозы и 1мМ ИПТГ. После 24 часов инкубации ни одного клона не выросло в случае, когда для электропорации был использован олигонуклеотид HisD-Xho-2. Около 200 клонов выросло на селективной среде при использовании олигонуклеотида HisD-XhoI-1 для электропорации. Только 7 из 100 проверенных клонов имели His+Cms фенотип. В этих клонах также была подтверждена замена природного сайта рестрикции Smal на сайт Xhol. Таким образом, описанный метод позволяет вводить точечные модификации в хромосому штамма SC17 P. ananatis. Снижение частоты отбора интегрантов на втором этапе данного эксперимента, вероятно, связано с меньшим размером областей гомологии, чем в опыте с двухцепочечным фрагментом (34 п.н. и 82 п.н. соответственно).

6. Ген ß-галактозидазы - природный репортер, локализованный в хромосоме P. ananatis.

Для изучения свойств регуляторных элементов широко применяют подход, заключающейся в клонировании целевых фрагментов и экспрессии под их контролем гена-репортера в составе плазмид. Однако копийность плазмид может существенно зависеть от свойств клонированного фрагмента, поэтому при сравнении свойств различных регуляторных элементов предпочтительнее интегрировать исследуемые элементы в состав бактериальной хромосомы. Одним из часто используемых репортерных генов является ген lacZE. coli, кодирующий ß-галактозидазу. Активность ß-галактозидазы легко измеряется с помощью высокоспецифичной хромогенной реакции.

Клетки Р. ananatis могут использовать лактозу как единственный источник углерода. При анализе генома Р. ananatis в хромосоме данного организма были найдены открытые рамки считывания (ORF), кодирующие гомологи ß-галактозидазы LacZ (степень идентичности АК последовательностей 78,8%) и пермеазы LacY (степень идентичности АК последовательностей 94,2%) и участвующие в утилизации лактозы в Е. coli. Присутствие ß-галактозидазы в клетках Р. ananatis подтверждалось появлением у колоний голубой окраски при росте на среде с добавлением красителя X-gal. С меньшей степенью гомологии в хромосоме Р. ananatis были обнаружены ORF, кодирующие гомологи тиогалактозид ацетилтрансферазы LacA и репрессора лактозного оперона LacI Е. coli -степень идентичности АК последовательностей 52,5% и 50,1%, соответственно. Гены lacZYA Е. coli транскрибируются в виде полицистронной мРНК под контролем репрессора LacI. Ген репрессора конвергентно транскрибируется с собственного промотора. В хромосоме Р. ananatis только гены lacZ и lacY находятся в одном локусе и предположительно образуют оперон. Гены lacl и lac А, напротив, не сцеплены ни с генами lacZY, ни друг с другом.

Сравнение аминокислотных последовательностей Lacl репрессора Е. coli и белка-гомолога, найденного в хромосоме Р. ananatis показало высокую степень гомологии N-концевых ДНК-узнающих участков белков. При этом кластеры высокой степени гомологии располагаются в областях, образующих Н-Т-Н узнающую структуру Lacl репрессора Е. coli (Рис. 7). Аминокислотные остатки (Asn12S, Asp149, Ser191, Ser193, Arg197, Asn246, Asp ), непосредственно связывающиеся с индуктором, также идентичны в обоих белках. Более того, в регуляторной области lacZY генов P. ananatis можно выделить участки ДНК (далее 01' и 02'), похожие на сайты связывания репрессора Lacl Е. coli по нуклеотидной последовательности и расположенные аналогично соответствующим операторным участкам лактозного промотора Е. coli. Непосредственное измерение активности ß-галактозидазы в грубых экстрактах клеток штамма SC 17(0) (Таблицах® 1)

показало, что данная активность увеличивается в несколько десятков раз в присутствии ИГГТГ - неметаболизируемого индуктора Lacl репрессора. Для подтверждения действительно ли найденный белок-гомолог является Lacl репрессором в Р. ananatis, ген, кодирующий данный белок, был инактивирован в хромосоме штамма SC17(0) с помощью адаптированной системы X Red-зависимой интеграции. Инактивация этого гена действительно привела к независимости уровня активности ß-галактозидазы от присутствия ИПТГ в среде культивирования.

P.a. 4 SVTLDDVAQLAGVSYQTVSRVLNRSEQVSPRTREKVESAMQQLNYVPNRVAQQLAGKATR 64

VTL DVA+ AGVSYQTVSRV+N++ VS +TREKVEAAM +LNY+PNRVAQQLAGK + Е . С . 2 PVTLYDVAEYAGVSYQTVSRVVNQASIIVSAKTREKVEAAMAELNYIPNRVAQQLAGKQSL 62 а-спираль 1 «-спираль 2 а-спираль 3 а-спираль 4

Рисунок 7. Сравнение аминокислотных последовательностей N-концевых участков Lacl репрессоров Е. coli и Р. ananatis. Аминокислоты, образующие а-спирали ДНК-узнающего домена Lacl репрессора Е. coli, отмечены подчеркиванием. Для Lacl репрессора Е. coli цветом выделены функционально-значимые аминокислоты: синим - аминокислоты, участвующие во взаимодействии Lacl репрессора с ДНК, зеленым - аминокислоты, участвующие в стабилизации НТН мотива Lacl репрессора. Аминокислоты, не чувствительные к заменам, закрашены желтым цветом.

Таблица №1. Зависимость экспрессии гена lacZP. ananatis от присутствия в клетках репрессора Lacl и/или ИПТГ в среде культивирования. Штамм SC17(0)Ыас1 предварительно был излечен от плазмиды pRSFRedTER, несущей в своем составе ген lacl Е. coli.

Strain IPTG concentration, мМ

0 1

SC17(0) 6±2 500±10

SC17(0)A/ac/ 530±20 550±20

Идентифицированный в хромосоме Р. апапаИв ген Р-галактозидазы может быть использован в качестве репортера для исследования свойств природных и искусственных регуляторных элементов в клетках данного организма.

7. Создание охарактеризованной библиотеки промоторов для оптимизации экспрессии генов Р. апапайБ.

Перед исследователями, занимающимися метаболической инженерией, нередко возникает проблема оптимизации экспрессии того или иного гена, когда есть основания полагать, что низкий уровень экспрессии не обеспечивает достаточного выхода целевого продукта, а слишком высокий уровень может явиться токсичным для клетки. Возможность плавно и в широких пределах варьировать уровень экспрессии интересующих генов

важна и при проведении фундаментальных исследований клеточного метаболизма, таких как изучение перераспределения потоков углерода при изменении уровней ключевых ферментативных активностей.

Ранее в нашей лаборатории был разработан метод, позволяющий путем одноактной X Red-интеграции созданного in vitro набора фрагментов ДНК, получать представительные выборки клонов К coli с широким спектром уровней экспрессии интересующего цистрона/оперона (Каташкина Ж. К, 2003; Каташкина Ж. И. и др, 2005). Изменение уровня экспрессии целевого гена обеспечивалось рандомизацией четырех внутренних нуклеотидов области «-35» канонического Р1ас промотора. Преимущество рандомизации именно области «-35» состоит в том, что замены в ней, вероятно, не приводят к изменению старта транскрипции, по крайней мере, для промоторов с канонической областью «-10». В этом случае мРНК, транскрибируемые с разных промоторов библиотеки, имеют идентичные последовательности и уровень активности репортерного белка прямо пропорционален «силе» промотора.

Данный подход был применен для получения коллекции Р,ас-подобных промоторов, обеспечивающих разные уровни инициации транскрипции в Р. ananatis. За узнавание областей «-10» и «-35» промотора отвечают о-субъединицы РНК-полимеразы. Сравнение аминокислотных последовательностей а70-субъединиц К coli и Р. ananatis выявило высокий уровень гомологии между этими белками (степень идентичности АК последовательностей 91%). При этом участки белков, непосредственно взаимодействующие с областями «-10» и «-35» промотора, в этих организмах не различаются. Поэтому мы предположили, что гибридный канонический для Е. coli промотор PtaC будет достаточно сильным и в клетках P. ananatis. Это предположение было подтверждено в результате эксперимента по замене природной промоторной области lacZ в хромосоме P. ananatis на Рвс промотор. В результате гибридный промотор Рис обеспечивал уровень активности ß-галактозидазы как минимум в 15 раз превышающий уровень, обеспечиваемый природным промотором (Таблицах» 2).

Таблица №2. Сравнение уровней экспрессии гена lacZP. ananatis, обеспечиваемых природным промотором и гибридным промотором Puc. Для измерения активности ß-

Штамм Активность ß-галактозидазы, ед. Миллера

SC17(0) 500±10

SC17(0) PtJacZ 8300±460

Первым этапом создания библиотеки было конструирование in vitro набора специальных интегративных кассет, включающих промотор с

мутантной областью «-35», вырезаемый маркер устойчивости к канамицину (ген кап, фланкированный attL/attR сайтами фага К) и участки гомологии (40 п.н.) с планируемым местом интеграции. Полученная in vitro смесь интегративных кассет была интегрирована в хромосому штамма SC17(0) в присутствии плазмиды-помощника pRSFRedTER. В результате X Red-зависимой рекомбинации происходила замена области, исходно находящейся левее гена lacZ и содержащей возможные участки инициации транскрипции, на промоторы библиотеки (Рис. 8). При этом после интеграции в полученных конструкциях имеются два возможных участка связывания лактозного репрессора: Ol Е. coli, входящий в состав промоторов, и 02 P. ananatis, локализованный в структурной части гена lacZ. Поэтому экспрессия гена lacZ в полученных клонах могла быть подвержена репрессии как со стороны LacI репрессора Е. coli, чей ген локализован в составе плазмиды-помощника pRSFRedTER, так и со стороны идентифицированного LacI репрессора Р. ananatis. Для предварительного отбора вариантов, обеспечивающих различные уровни транскрипции репортерного гена, отобранные интегранты были излечены от плазмиды-помощника pRSFRedTER и перепечатаны на индикаторную среду с добавлением X-gal и ИПТГ. В качестве контроля был использован штамм, несущий в хромосоме ген lacZ под контролем Рвс промотора.

промотор или Рис-подобные промоторы с рандомизированной областью «-35».

Для 30 колоний, имевших различную интенсивность окрашивания на среде с Х-§а1 и ИПТГ и контрольного Р,ас промотора, была измерена удельная активность р-галактозидазы. Для 14 из 30 промоторов, давших различающиеся уровни активности, были определены нуклеотидные последовательности. Результаты измерения активности р-галактозидазы и нуклеотидные последовательности области «-35» соответствующих промоторов представлены в Таблице №3.

Таблица №3. Зависимость уровня активности р-галаюшидазы Р. апапаИи от последовательности области «-35» Рцс-подобных промоторов библиотеки.

Нуклеотидная Активность

последовательность области ß-галактозидазы,

«-35» ед. Миллера

Промотор ИПТГ, 1мМ

Ptac TTGACA 6000

PtaC52 TTGCTA 2800

Pt«84 TTTGCA 2000

P„t65 TTGTGA 1250

P.ac49 TTGTAA 1200

Ptac47 TTGAGA 1000

Ptac60 TTTCAA 770

P..c27 TTGGAA 730

Pt.cll TTGGAA (спенсер 15 п.н.) 590

P„c61 TTTATA 380

P.,c22 TAGTGA 160

Ptac8 TGAAGA 150

Pt.c82 TCGCGA 100

Ptac25 TCCGGA 80

P,ac21 TCTCGA 70

Полученный набор промоторов обеспечивает плавное изменение уровня активности ß-галактозидазы от нескольких десятков ед. Миллера до 6000 ед. Миллера (Рис. 8). Промотор Ptoc является самым «сильным» промотором библиотеки. Интересно отметить, что у большинства промоторов, обеспечивающих достаточно высокий уровень активности ß-галактозидазы (не менее 10% от уровня, обеспечиваемого Р,ас промотором) вторая и третья позиции области «-35» оказываются гораздо менее вариабельными, чем остальные рандомизированные нуклеотиды: в этих позициях, как правило, расположены тимин и гуанин соответственно. Ранее в аналогичных экспериментах с Е. coli такая закономерность не наблюдалась (Каташкина Ж. Я, 2003; Каташкина Ж.И. u др, 2005).

■ -

П П п

I J П п П «—1 _

52 84 65 49 47 60 27 11 61 22 8 82 25 21 Промотор Ptac - 6000 ед. Миллера

Рисунок 8. Диаграмма, иллюстрирующая плавное изменение активности Р-галактозидазы Р. апапаИз, обеспеченное использованием промоторов библиотеки.

Измерение активности репортерного гена является косвенным методом оценки «силы» промоторов библиотеки. Поэтому для трех штаммов, несущих разные промоторы, методом ПЦР в реальном времени было определено относительное количество мРНК гена 1ас2, присутствующей в клетках. В качестве реперного гена был использован ген гесВ Р. апапаНв. Одновременно в этих же культурах клеток была измерена активность р-галактозидазы. Из Таблицы №4 видно, что соотношения сил промоторов библиотеки, определенные разными методами, хорошо коррелируют между собой. Таким образом, активность р-галактозидазы действительно отражает уровень мРНК гена 1ас2 в клетках Р. апапаНя в широком диапазоне изменения его величины.

Таблица№4. Описание свойств промоторов библиотеки с помощью двух различных методов: измерение активности репортерного белка р-галакгозидазы и определение относительного количества мРНК репортерного гена 1ас2 методом ПЦР в реальном

Промотор ИПТГ, 0 мМ

Активность Отношение сил Относительное Отношение сил

|}-галактозидазы, промоторов, количество промоторов,

ед. Миллера Аыс/А!,^ мРНК,асг мРНК/ас2(Рвс)/

мРНК/<иг (Р,асм)

Р,»С 6700 1 53900 1

Р«ас52 550 12 3500 15

Р„с65 160 42 940 57

Полученная библиотека Р,а(:-подобных промоторов, узнаваемых Еа70 Р. апапаШ, была использована для оптимизации экспрессии генов в штамме-продуценте глутаминовой кислоты, созданном на базе Р. апапайз, что помогло существенно улучшить его свойства.

выводы.

1. Выявлен токсический эффект от экспрессии генов X Red-системы в клетках P. ananatis, выражающийся в остановке роста бактерий. Отобран штамм SC17(0), способный к росту в условиях индукции экспрессии генов X Red-системы. Показано, что при использовании штамма SC 17(0) в качестве реципиента частота X Red-зависимой интеграции линейных фрагментов ДНК с короткими плечами гомологии в хромосому Р. ananatis сопоставима с частотой, получаемой в аналогичных экспериментах с К coli К12.

2. Разработан эффективный генетический инструментарий, позволяющий последовательно вводить множественные модификации в геном Р. ananatis, получая штаммы, не содержащие в геноме маркеров устойчивости к антибиотикам. Его основными элементами являются:

• метод введения маркированных мутаций в геном штамма SC 17(0) с помощью Red-системы фага X;

• метод переноса маркированных мутаций между штаммами Р. ananatis с помощью электропорации геномной ДНК;

• X Xis/Int-зависимое удаление использованных селективных маркеров.

3. Разработана двухстадийная процедура получения немаркированных точечных замен в хромосоме Р. ananatis, основанная на использовании двойного селективного/контрселективного маркера и метода X Red-зависимой интеграции двухцепочечных фрагментов ДНК или X Bet-зависимой интеграции олигонуклеотидов. Эффективность проведения такой модификации в модельных экспериментах достигала 25%.

4. Осуществлено конструирование библиотеки искусственных Рас-подобных промоторов, обеспечивающих различающиеся в диапазоне двух порядков величины уровни транскрипции целевого гена Р. ananatis.

Основное содержание диссертации отражено в следующих печатных работах:

1. Голубева Л.И., Куваева Т.М., Каташкина Ж.И. Использование Red-зависимой системы рекомбинации фага X для получения библиотек промоторов в Enterobacteriaceae. Материалы международной школы-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» в рамках международного симпозиума «ЕС-Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной Программе». Санкт-Петербург, 2006.

2. Joanna I Katashkina, Tatiana М Kuvaeva, Irina G Andreeva, Alexandra Yu Skorokhodova, Irina V Biryukova, Irina L Tokmakova, Lubov I Golubeva and Sergey V Mashko.Construction of stably maintained non-mobilizable derivatives of RSF1010 lacking all known elements essential for mobilization. BMC Biotechnology, 2007, 7:80.

3. Каташкина Ж.И., Голубева Л.И., Куваева T.M., Гайденко Т.А., Гак Е.Р., Машко С.В. Способ конструирования рекомбинантных бактерий, принадлежащих к роду Pantoea, и способ продукции L-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду Pantoea. Заявка на изобретение RU 2006134574,2008.

4. Joanna I Katashkina, Yoshihiko Нага, Lyubov I Golubeva, Irina G Andreeva, Tatiana M Kuvaeva and Sergey V Mashko. Use of the X Red-recombineering method for genetic engineering of Pantoea ananatis. BMC Molecular Biology, 2009, 10:34.

Подписано в печать: 19.04.2010

Заказ № 3578 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Голубева, Любовь Игоревна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ. 6 Актуальность проблемы.

Цели и задачи работы.

Научная новизна и практическая значимость работы. 8 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Использование микроорганизмов для получения веществ, применяющихся в различных сферах деятельности человека.

1.1. Основные этапы становления микробиологической промышленности.

1.2. Микроорганизмы, традиционно используемые в микробиологической промышленности.

1.2.1. Дрожжи.

1.2.2. Corynebacterium glutamicum.

1.2.3. Род Bacillus. 18 1.2.4 .E.coli.

1.3. Современные задачи микробиологической промышленности требуют расширения базы используемых микроорганизмов.

2. Использование сайт-специфической рекомбинации и гомологичной рекомбинации фагов — новый высокоэффективный подход к целенаправленному конструированию мутаций.

2. 1. «Recombineering» - генетическая инженерия бактерий с использованием фаговых систем гомологичной рекомбинации.

2.1.1. Основные элементы X Red и RecET систем гомологичной рекомбинации.

2.1.2. Интеграция линейных двухцепочечных и одноцепочечных фрагментов ДНК с использованием к Red и RecET систем гомологичной рекомбинации.

2.2. Совместное использование X Red или RecET и систем сайт-специфической рекомбинации.

2.3. Получение мутаций с удалением всех «следовых» последовательностей.

2.4. Использование X Red-системы в гетерологичных хозяевах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Штаммы.

2. Плазмиды.

3. Среды.

4. Проведение полимеразной цепной реакции.

5. Генно-инженерные методики.

6. Конструирование рекомбинантных плазмид.

7. Трансформация клеток P. ananatis плазмидной ДНК с помощью процедуры электропорации.

8. Трансформация клеток P. ananatis геномной ДНК с помощью процедуры электропорации.

9. X Red-зависимая интеграция двухцепочечных и одноцепочечных фрагментов ДНК в хромосому P. ananatis.

10. Конструирование интегративных кассет.

11. Секвенирование ДНК.

12. Измерение активности Р-галактозидазы.

13. Определение относительного количества мРНК гена lacZ P. ananatis методом ПЦР в реальном времени.

14. Олигонуклеодтиды. 58 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

1. Трансформация клеток P. ananatis методом электропорации.

2. Адаптация Red-зависимой системы гомологичной рекомбинации фага X для создания целенаправленных модификаций в хромосоме P. ananatis.

2.1. Конструирование плазмиды-помощника, обеспечивающей регулируемую экспрессию генов Red-системы фага X.

2.2. Одновременная экспрессия генов Red-системы фага X является токсичной для клеток P. ananatis.

2.3. Селекция штамма-реципиента для осуществления X Red-зависимой интеграции двухцепочечных фрагментов ДНК в хромосому P. ananatis.

3. Введение множественных модификаций в хромосому P. ananatis с использованием комбинированной системы X Red-Int/Xis.

4. Введение точечных мутаций в хромосому штамма SC17(0) 77 P. ananatis.

5. Целенаправленная модификация хромосомы штамма SC17 P. ananatis с помощью X Bet-зависимой интеграции олигонуклеотидов.

6. Ген р-галактозидазы - природный репортер, локализованный в хромосоме P. ananatis.

7. Создание охарактеризованной библиотеки промоторов для оптимизации экспрессии генов P. ananatis.

8. Идентификация гена аланин рацемазы P. ananatis и его использование в качестве репортера.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование систем гомологичной и сайт-специфической рекомбинации фага λ для целенаправленной модификации хромосомы Pantoea ananatis"

Актуальность проблемы.

Использование бактерий в промышленном производстве биологически активных веществ (витаминов, антибиотиков, гормонов, аминокислот), органических кислот и биокатализаторов насчитывает более чем 50-ти летнюю историю, и в настоящее время объем микробных биотехнологических производств продолжает расти (Demain A.L., Adrio J.L., 2008). При этом, перед современной биотехнологией стоят такие задачи как расширение спектра производимых веществ и используемых субстратов, создание более рентабельных и экологичных технологий производства. Решение этих задач требует не только улучшения свойств существующих продуцентов, . но и поиск новых микроорганизмов, обладающих определенными преимуществами и биотехнологическим потенциалом. Более того, относительная доступность секвенирования бактериального генома и наличие целого пакета компьютерных программ, позволяющих реконструировать метаболические пути, опираясь только на нуклеотидную последовательность генома, обеспечивает достаточно большой объем начальной информации о метаболизме вновь отобранного организма. С другой стороны, накопленный опыт, а также данные, полученные на базе современных экспериментальных и аналитических методов исследования метаболизма (анализ распределения и контроля потоков, анализ уровня экспрессии генов, компьютерное моделирование и т.д.) однозначно указывают на необходимость тонкой настройки метаболизма для обеспечения высокоэффективного синтеза интересующего продукта бактериальными клетками. Успех в создании высокоэффективного штамма зависит не только от физиологических особенностей организма, но и от возможности быстро конструировать необходимые генетические модификации. Для решения этой задачи необходим удобный генно-инженерный инструментарий, позволяющий создавать бесплазмидные, безмаркерные штаммы, штаммы, несущие множественные мутации, модулировать уровень экспрессии целевого гена и интегрировать протяженные фрагменты ДНК в хромосому. Наиболее подробно подходы для подобных генетических манипуляций ранее были разработаны для Escherichia coli (Peredelchuk M.Y., Bennett G.N., 1997; Каташкина Ж. И., 2003; Meynial-Salles I. et al, 2005; Каташкина Ж.И. и dp, 2005; Minaeva N.I. et al, 2008). Основу этих методов составляет использование систем гомологичной (Red) и сайт-специфической рекомбинации фага X. Однако, несмотря на кажущуюся простоту Red-системы, включающей всего 3 фаговых гена, и подробное изучение механизма Red-зависимой рекомбинации, до сих пор этот чрезвычайно эффективный метод генной инженерии, первоначально разработанный для Е. coli К12, удавалось использовать только в ряде патогенных штаммах Е. coli и некоторых штаммах Salmonella, Erwinia, Yersinia и Pseudomonas. Поэтому расширение рамок применимости известных методов генной инженерии для манипулирования геномами новых потенциальных продуцентов является актуальной и практически значимой задачей.

Цели и задачи работы.

Целью данной диссертационной работы является адаптация высокоэффективного генно-инженерного инструментария, разработанного в настоящее время для Е. coli, для использования в клетках близкородственного организма Pantoea ananatis.

В ходе работы решались следующие задачи:

• адаптация Red-зависимой системы гомологичной рекомбинации фага X для создания целенаправленных модификаций (делеций, замен регуляторных областей, точечных мутаций) в хромосоме P. ananatis;

• разработка инструментария для конструирования штаммов Р. ananatis, содержащих множественные модификации хромосомы;

• создание охарактеризованной библиотеки промоторов для обеспечения плавного изменения уровня экспрессии целевых генов в Р. ananatis;

Научная новизна и практическая значимость работы.

В ходе адаптации X Red-зависимой системы рекомбинации фага X Е. coli для целенаправленной модификации хромосомы близко родственного организма P. ananatis была выявлена токсичность одновременной экспрессии X Red-генов для клеток данной бактерии. В ходе работы был отобран мутантный штамм P. ananatis, устойчивых к экспрессии генов X Red-системы. Использование данного штамма в качестве реципиента позволяет интегрировать линейные двуцепочечныые фрагменты ДНК в хромосому Р. ananatis с частотой не меньшей, чем в Е. coli К12. Было показано, что одновременная экспрессия X gam и bet генов не приводит к токсическому эффекту, что позволяет использовать данные гены для модификации хромосомы штамма дикого типа с помощью олигонуклеотидов.

Для P. ananatis были адаптированы процедура переноса маркированных мутаций с помощью электропорации геномной ДНК и X Int/Xis-зависимая система сайт-специфицеской рекомбинации для вырезания селективного маркера после его использования, что позволяет конструировать штаммы со множественными модификациями. Была разработана двухстадийная методика создания целенаправленных точечных мутаций в хромосоме P. ananatis с использованием гена sacB Bacillus subtilis в качестве контр-селективного маркера. Данная методика находит применение в решение задач белковой инженерии. Была получена и охарактеризована библиотека РШс-подобных промоторов узнаваемых РНКП

P. ananatis для плавного варьирования уровня экспрессии целевых генов в данном организме.

Совокупность разработанных методов активно применяется в работе НИИ «Аджиномото-Генетика» и позволяет быстро и эффективно решать как прикладные задачи по конструированию штаммов-продуцентов на базе Р. ananatis, так и задачи по изучению метаболизма данной бактерии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

С середины прошлого века человек начинает активно использовать микроорганизмы для производства различных веществ. В настоящее время изучение генетики и физиологии микроорганизмов определяется не только научным, но и практическим интересом. Поэтому первая часть Обзора литературы посвящена описанию основных этапов развития микробиологической промышленности, описанию практического применения микроорганизмов, традиционно использующихся в этой области, а также современным тенденциям, направленным на создание новых штаммов-продуцентов, как с помощью метаболической инженерии, так и путем расширения спектра используемых видов.

Достигнутые успехи в изучении генетики и физиологии микроорганизмов во многом были определены развитием подходов для манипуляции их геномом. Вторая часть Обзора литературы посвящена подходу, первоначально разработанному для Е. coli и обеспечившему значительный прогресс в генной инженерии этой бактерии, и в настоящее время активно разрабатывающемуся для ряда других бактерий.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Голубева, Любовь Игоревна

выводы.

1. Выявлен токсический эффект от экспрессии генов X Red-системы в клетках P. ananatis, выражающийся в остановке роста бактерий. Отобран штамм SC17(0), способный к росту в условиях индукции экспрессии генов X Red-системы. Показано, что при использовании штамма SC17(0) в качестве реципиента частота X Red-зависимой интеграции линейных фрагментов ДНК с короткими плечами гомологии в хромосому P. ananatis сопоставима с частотой, получаемой в аналогичных экспериментах с Е. coli К12.

2. Разработан эффективный генетический инструментарий, позволяющий последовательно вводить множественные модификации в геном P. ananatis, получая штаммы, не содержащие в геноме маркеров устойчивости к антибиотикам. Его основными элементами являются:

• метод введения маркированных мутаций в геном штамма SC17(0) с помощью Red-системы фага X;

• метод переноса маркированных мутаций между штаммами Р. ananatis с помощью электропорации геномной ДНК;

• X Xis/Int-зависимое удаление использованных селективных маркеров.

3. Разработана двухстадийная процедура получения немаркированных точечных замен в хромосоме P. ananatis, основанная на использовании двойного селективного/контрселективного маркера и метода X Red-зависимой интеграции двухцепочечных фрагментов ДНК или X Bet-зависимой интеграции олигонуклеотидов. Эффективность проведения такой модификации в модельных экспериментах достигала 25%.

4. Осуществлено конструирование библиотеки искусственных Ptac-подобных промоторов, обеспечивающих различающиеся в диапазоне двух порядков величины уровни транскрипции целевого гена P. ananatis.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Голубева, Любовь Игоревна, Москва

1. Abalakina Е. G. et al. 2008. Phage Ми-driven two-plasmid system for integration of recombinant DNA in the Methylophilus methylotrophus genome. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81(1), 191-200.

2. Abbott D. A. et al. 2009. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of carboxylic acids: current status and challenges. FENS Yeast Res. 9(8), 1123-1136.

3. Albert H. et al. 1995. Site-specific integration of DNA into wild-type and mutant lox sites placed in the plant genome. Plant J. 7(4), 649-659.

4. Atsumi S., Liao J. C. 2008. Metabolic Engineering for Advanced Biofuels Production from Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 19(5), 414-419.

5. Baily J. E. 1991. Toward a science of metabolic engineering. Science. 252(5013), 1668-1675.

6. Barrett E. et al. 2004. Heterologous expression of lactose- and galactose-utilizing pathways from lactic acid bacteria in Corynebacterium glutamicum for production of lysine in whey. Appl. Environ. Microbiol. 70, 2861-2866.

7. Baudin A. et al. 1993. Simple and efficient method for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 21(14), 3329-3330.

8. Becker D. M., Guarente L. 1991. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Methods Enzymol. 194, 182-7.

9. Belanger L. et al. 2004. Production of heterologous protein by Methylobacterium extorquens in high cell density fermentation. FEMS Microbiol Lett. 231, 197-204.

10. Bennett G. N., San K. Y. 2001. Microbial formation, biotechnological production and applications of 1,2-propanediol. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55, 1-9.

11. Bhosale S. H., Rao M. В., Deshpande V. V. 1996. Molecular and Industrial Aspects of Glucose Isomerase. Microbiol. Rev. 60(2), 280-300.

12. Bi C. et al. 2009. Genetic Engineering of Enterobacter asburiae Strain JDR-1 for Efficient Production of Ethanol from Hemicellulose Hydrolysates. Appl Environ Microbiol. 75(18), 5743-5749.

13. Billman-Jacobe H. et al. 1994. Expression of ovine gamma interferon in Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1641-1645.

14. Brady C. et al. 2008. Phylogeny and identification of Pantoea species associated with plants, humans, and the natural invironment base on multilocus analysis (MLSA). Syst and Appl Microbiol. 31, 447-460.

15. Brautaset T. et al. 2007. Bacillus methanolicus: a candidate for industrial production of amino acids from methanol at 50 degrees C. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74(1), 22-34.

16. Bron P. A. 2004. Selection and characterization of conditionally active promoters in Lactobacillus plantarum, using alanine racemase as a promoter probe. Appl Environ Microbiol. 70(1), 310-317.

17. Bron P. A. et al. 2002. Use of the air gene as a food-grade selection marker in lactic acid bacteria. Appl Environ Microbiol. 68(11), 5663-5670.

18. Brunschwig E., Darzins A. 1992. A two-component T7 system for the overexpression of genes in Pseudomonas aeruginosa. Gene. 111(1), 35-41.

19. Burchhardt G., Ingram L. O. 1992. Conversion of xylan to ethanol by ethanologenic strains of Escherichia coli and Klebsiella oxytoca. Appl. Environ. Microbiol. 58, 1128-1133.

20. Byrom D., Carver M. 1991. Process for the production of acylamide amidohydrolase by Methylophilus methylotrophus. US patent 5077212.

21. Cassuto E. et al. 1971. Role of exonuclease and protein of phage lambda in genetic recombination. V. Recombination of lambda DNA invitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 68(7), 1639-43.

22. Cassuto E., RaddingC. M. 1971. Mechanism for the action of lambda exonuclease in genetic recombination. Nat. New. Biol. 229(1), 13-6.

23. Causey Т. B. et al. 2003. Engineering the metabolism of Escherichia coli W3110 for the conversion of sugar to redox-neutral and oxidized products: homoacetate production. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 825-832.

24. Chen J. et al. 2009. Optimization of metabolic pathways for bioconversion of lignocellulose to ethanol through genetic engineering. Biotechnol. Adv. 27(5), 593-598.

25. Chen J. et al. 2009. Optimization of metabolic pathways for bioconversion of lignocellulose to ethanol through genetic engineering. Biotechnol. Adv. 27(5), 593-598.

26. Chen S. et al. 2005. Enhancement of inosine production by Bacillus subtilis through suppression of carbon overflow by sodium citrate. Biotechnol. Lett. 27(10), 689-692.

27. Cherepanov P. P., Wackernagel W. 1995. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of exision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, 9-14.

28. Chistoserdova L. et al. 2000. Analysis of two formaldehyde oxidation pathways in Methylobacillus flagellatus KT, a ribulose monophosphate cycle methylotroph. Microbiology. 146, 233-238.

29. Chitoserdova L. et al. 2007. Genome of Methylobacillus flagellatus, molecular basis for obligate methylotrophy, and polyphyletic origin of methylotrophy. J. Bacteriol. 189(11), 4020-4027.

30. Choi J. H., Lee S. Y. 2004. Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 64(5), 625-635.

31. Choi Y.J. et al. 2006. Multicopy integration and expression of heterologous genes in Methylobacterium extorquens ATCC 55366. Appl. Environ. Microbiol. 72, 753-759.

32. Christiansen Т., Christensen В., Nielsen. J. 2002. Metabolic network analysis of Bacillus clausii on minimal and semirich medium using 13C-labeled glucose. Metab. Eng. 4, 159-169.

33. Cohen S. N. et al. 1973. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 70(11), 3240-3244.

34. Cordier H. et al. 2007. A metabolic and genomic study of engineered Saccharomyces cerevisiae strains for high glycerol production. Metab. Eng. 9, 364-378.

35. Cosloy S. D., Oishi M. 1973. Genetic transformation in Escherichia coli K12. Proc. Natl. Acad. Sci. 70: 84-87.

36. Costantino N., Court D. L. 2003. Enhanced levels of A. Red-mediated recombinants in mismatch repair mutants. PNAS. 100(26), 15748-15753.

37. Court D. L., Sawitzke J. A., Thomason L. C. 2002. Genetic engineering using homologous recombination. Annu. Rev. Genet. 36, 361-88.

38. Court R. et al. 2007. The crystal structure of lambda-Gam protein suggests a model for RecBCD inhibition. J. Mol. Bio. 371(1), 25-33.

39. Cox M. M. et al. 2007. Scarless and site-directed utagenesis in Salmonella enteritidis chromosome. BMC Biotechnology. 7, 59.

40. Cregg J. M., Vedvick T. S., Raschke W. C. 1993. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. Biotechnology. 11(8), 905-910.

41. Crowther G. J., Kosaly G., Lidstrom M. E. 2008. Formate as the main branchpoint for methylotrophic metabolism in Methylobacterium extorquens AMI. J. Bacteriol. 190, 5057-5062.

42. Dabert P., Smith G. R. 1997. Gene replacement with linear DNA fragments in wild-type Escherichia coli: enhancement by Chi sites. Genetics. 145, 877889.

43. Dale E. C., Ow D. W. 1991. Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 10558-62.

44. Das A. et al. 2007. An update on microbial carotenoid production: application of recent metabolic engineering tools. Appl. Microbiol. Biotechnol. 77, 505-512.

45. Dassler T. et al. 2000. Identification of a major facilitator protein from E. coli involved in efflux of metabolites of the cysteine pathway. Mol. Microbiol. 36, 1101-1112.

46. Date, H. Itaya, H. Matsui and Y. Kikuchi. 2006. Secretion of human epidermal growth factor by Corynebacterium glutamicum M. Lett. Appl. Microbiol. 42(1), 66-70.

47. Datsenko K. A., Wanner B. L. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 6640-6645.

48. Datta S. et al. 2008. Identification and analysis of recombineering functions from Gram-negative and Gram-positive bacteria and their phages. PNAS. 105(5), 1626-1631.

49. Dauner M. et al. 2002. Intracellular carbon fluxes in riboflavin-producing Bacillus subtilis during growth on two-carbon substrate mixtures. Appl. Environ. Microbiol. 68, 1760-1771.

50. Dauner M., Bailey J. E., Sauer U. 2001. Metabolic flux analysis with a comprehensive isotopomer model in Bacillus subtilis. Biotechnol Bioeng. 76, 144-156.

51. Dehio M. et al. 1998. Construction of versatile high-level expression vectors for Bartonella henselae and to use of green fluorescent protein as a new expression marker. Gene. 215(2), 223-229.

52. Dejong J. M. et al. 2006. Genetic engineering of taxol biosynthetic genes in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Bioeng. 93, 212—224.

53. Demain A. L., Adrio J. L. 2008. Contributions of Microorganisms to Industrial Biology. Mol Biotechnol. 38, 41-55.

54. Derbise A. et al. 2003. A rapid and simple method for inactivating chromosomal genes in Yersinia. FEMSImmunol. Med. Microbiol. 38, 113-116.

55. DeVito J. 2007. Recombineering with tolC as a selectible/counter-selectible marker: remodeling the rRNA operons in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 36(1), E4.

56. Dien B. S., Nichols N. N., Bothast R. J. 2002. Fermentation of sugar mixtures using Escherichia coli catabolite repression mutants engineered for production of L-lactic acid. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 29, 221-227.

57. Dower J. W., Miller J. F., Ragsdale C. W. 1988. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 16(13), 6127-6145.

58. Dumas B. et al. 2006. Hydrocortisone made in yeast: metabolic engineering turns a unicellular microorganism into a drug-synthesizing factory. Biotechnol. J. 1(3), 299-307.

59. Durot M., Bourguignon P.-Y., Schachter V. 2009. Genome-scalemodels of bacterialmetabolism: reconstructionand applications. FEMS Microbiol Rev. 33, 164—190.

60. El Karoui M. et al. 1999. Gene replacement with linear DNA in electroporated wild-type Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 27, 1296-1299.

61. Ellis H. M. et al. 2001. High efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal DNA using single-stranded oligonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6742-6746.

62. Eppelmann K., Doekel S., Marahel M. A. 2001. Engineered biosynthesis of the peptide antibiotic bacitracin in the surrogate host Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 276, 34 824-34 831.

63. Fox S. L., Bala G. A. 2000. Production of surfactant from Bacillus subtilis ATCC 21332 using potato substrates. Bioresour. Technol. 75, 235-240.

64. Fromm M. E., Taylor L. P., Walbot V. 1986. Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation. Nature. 319(6056), 791-793.

65. Furch T. et al. 2007. Comparative study on central metabolic fluxes of1

66. Bacillus megaterium strains in continuous culture using С labeled substrates. Bioprocess Biosyst. Eng. 30, 47—59.

67. Gerigk M. R. et al. 2002a. Process control for enhanced L-phenylalanine production using different recombinant E. coli strains. Biotechnol. Bioeng. 80, 746-754.

68. Gerigk M. R. et al. 2002b. Enhanced pilot-scale fed-batch L-phenylalanine production using recombinant E. coli by fully integrated reactive extraction. Bioprocess. Biosyst. Eng. 25, 43-52.

69. Gerlach R. G. et al. 2009. Rapid oligonucleotide-based recombineering of the chromosome of Salmonella enterica. Appl. Environ. Microbiol. 75(6), 15751580.

70. Gillen J. R. et al. 1977. Characterization of the deoxyribonuclease determined by lambda reverse as exonuclease VIII of Escherichia coli. J. Mol. Biol. 113(1), 27-41.

71. Goffeau A. et al. 1996. Life with 6000 genes. Science. 274 (5287): 546, 563-567.

72. Gormley E. P., Davies J. 1991. Transfer of plasmid RSF1010 by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobacterium smegmatis. JBacteriol. 173, 6705-6708.

73. Gupta R. et al. 2002. An overview on fermentation, downstream processing and properties of microbial alkaline proteases. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 381-395.

74. Gutierrez J. et al. 2005. Heterologous extracellular production of enterocin P from Enterococcus faecium P13 in the methylotrophic bacterium Methylobacterium extorquens. FEMS Microbiol. Lett. 248, 125-131.

75. Hall S. D., Kane M. F., Kolodner R. D. 1993. Identification and characterization of the Escherichia coli RecT protein, a protein encoded by the recE region that promotes renaturation of homologous single-stranded DNA. J. Bacteriol. 175, 277-287

76. Hall S. D., Kane M. F., Kolodner R. D. 1993. Identification and characterization of the Escherichia coli RecT protein, a protein encoded by the recE region that promotes renaturation of homologous single-stranded DNA. J. Bacteriol. 175(1), 277-87.

77. Hall S.D., Kolodner R. D. 1994. Homologous pairing and strand exchange promoted by the Escherichia coli RecT protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91(8), 3205-9.

78. Hautefort I., Proenca M. J., Hinton J. C. 2003. Single-copy green fluorescent protein gene fusions allow accurate measurement of Salmonella gene expression in vitro and during infection of mammalian cells. Appl. Environ. Microbiol. 69, 7480-7491.

79. Hermann T. 2003. Industrial production of amino acids by coryneform bacteria. Journal of Biotechnology. 104, 155- 172.

80. Hill S. A., Stahl M. M., Stahl W. F. 1997. Single-strand DNA intermediates in phage lambda's Red recombination pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94(7), 2951-6.

81. Horinouchi S. 2009. Combinatorial biosynthesis of plant medicinal polyketides by microorganisms. Curr. Opin. Chem. Biol. 13(2), 197-204.

82. Huser A. T. et al. 2005. Rational design of a Corynebacterium glutamicum pantothenate production strain and its characterization by metabolic flux analysis and genome-wide transcriptional profiling. Appl. Environ. Microbiol. 71(6), 3255-3268.

83. Husseiny M. I., Hensel M. 2005. Rapid method for the construction of Salmonella enterica serovar Typhimurium vaccine carrier strains. Infection and Immunity. 73(3), 1598-1605.

84. Hwang E. I. et al. 2003. Production of plant-specific flavanones by Escherichia coli containing an artificial gene cluster. Appl. Environ. Microbiol. 69 (5), 2699-2706.

85. Ikeda M., Nakagawa S. 2003. The Corynebacterium glutamicum genome: features and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 62, 99-109.

86. Ingram L. O. et al. 1987. Genetic Engineering of Ethanol Production in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 53(10), 2420-2425.

87. Ingram L. O. et al. 1987. Genetic Engineering of Ethanol Production in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 53(10), 2420-2425.

88. Inui M. et al. 2004. Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7, 182-196.

89. Inui M. et al. 2004. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for fuel ethanol production under oxygen-deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8, 243-254.

90. Izui H. et al. 2003. Method for producing L-glutamic acid. US partent 6596517.

91. Jahic M. et al. 2006. Process technology for production and recovery of heterologous proteins with Pichia pastoris. Biotechnol. Prog. 22(6), 1465-1473.

92. Jeffries T. W., Jin Y. S. 2007. Metabolic engineering for improved fermentation of pentoses by yeasts. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63(5), 495509.

93. Joseph J. W., Kolodner R. 1983a. Exonuclease VIII of Escherichia coli. I. Purification and physical properties. J. Biol. Chem. 258(17), 10411-7.

94. Joseph J. W., Kolodner R. 1983b. Exonuclease VIII of Escherichia coli. II. Mechanism of action. J. Biol. Chem. 258(17), 10418-24.

95. Kalinowski J. et al. 2003. The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome sequence and its impact on the production of L-aspartate derived amino acids and vitamins. J. Biotechnol. 104, 5-25.

96. Karakousis G. et al. 1998. The beta proteinof phage lambda binds preferentially to an intermediate in DNA renaturation. J. Mol. Biol. 276(4), 72131.

97. Karu A. E. et al. 1975. The gamma protein specified by bacteriophage gamma. Structure and inhibitory activity for the recBC enzyme of Escherichia coli. J Biol Chem. 250(18), 7377-87.

98. Katashkina J. I. et al. 2009. Use of the X Red-recombineering method for genetic engineering of Pantoea ananatis. BMC Molecular Biology. 10, 34.

99. Kealey J. T. et al. 1998. Production of a polyketide natural product in nonpolyketideproducing prokaryotic and eukaryotic hosts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 505-509.

100. Kilbane J. J. 2nd, Bielaga B. A. 1991. Instantaneous gene transfer from donor to recipient microorganism via electroporation. Biotechniques. 10(3), 354-365.

101. Kim H. S. et al. 1997. Production and properties of a lipopeptide biosurfactant from Bacillus subtilis C9. J. Ferment. Bioeng. 84, 41-46.

102. Kim S.W. et al. 2006. Over-production of beta-carotene from metabolically engineered Escherichia coli. Biotehnol. Lett. 28(12), 897-904.

103. Kinoshita S., Udaka S., Shimono M. 1957. Studies on the amino acid fermentation. Part I. Production of L-glutamic acid by various microorganisms. J. Gen. Appl. Microbiol. 3, 193-205.

104. Kirchner O., Tauch A., 2003. Tools for genetic engineering in the amino acid-producing bacterium Corynebacterium glutamicum. J. Biotechnol. 104, 287- 299.

105. Kishimoto K., Kinataka K., Ochiyama N. 1990. Production of D-ribose. US Patent 4904587.

106. Klrijn R. J. et al. 2010. Metabolic fluxes during strong carbon catabolite repression by malate in Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 285 (3), 1587-1596.

107. Kmiec E., Holloman W. K. 1981. Beta protein of bacteriophage lambda promotes renaturation of DNA. J. Biol. Chem. 256(24), 12636-9.

108. Koizumi S. et al. 2000. Production of riboflavin by metabolically engineered Corynebacterium ammoniagenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 674—679.

109. Komeda T. et al. 2002. Production of active bovine cathepsin С (dipeptidyl aminopeptidase I) in the methylotrophic yeast Candida boidinii. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59(2-3), 252-258.

110. Kovall R., Matthews B. W. 1997. Toroidal structure of lambda-exonuclease. Science. 277(5333), 1824-7.

111. Kramer M. et al. 2003. Metabolic engineering for microbial production of shikimic acid. Metab. Eng. 5, 277—283.

112. Kristensen C. S. et al. 1995. Site- pecific deletions of chromosomally located DNA segments with the multimer resolution system of broad-host-range plasmid RP4. J. Bacteriol. 177, 52-58.

113. Kulkarni S. K., Stahl W. F. 1989. Interaction between the sbcC gene of Escherichia coli and the gam gene of phage lambda. Genetics. 123(2), 249-53.

114. Kurusu Y. et al. 1990. Electroporation-transformation system for coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54(2), 443-7.

115. Kushner S. R., Nagaishi h., Clark A. J. 1974. Isolation of exonuclease VIII: the enzyme associated with sbcA indirect suppressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71(9), 3593-7.

116. Kwon S. et al. 1997. Phylogenetic analysis of Erwinia species based on 16S rRNA gene sequence. Int JSyst Bacteriology. 47(3), 1061-1067

117. Lafontaine D., Tollervev D. 1996. One-step PCR mediated strategy for the construction of conditionally expressed and epitope tagged yeast proteins. Nucleic Acids res. 24(17), 3469-3471.

118. Lambert J. M., Bongers R. S., Kleerebezem M. 2007. Cre-/ox-based system for multiple gene deletions and selectable-marker removal in Lactobacillus plantarum. Appl. Environ. Microbiol. 73(4), 1126-1135.

119. Lee D. J. et al. 2009. Gene doctoring: a method for recombineering in laboratory and pathogenic Escherichia coli strains. BMC Microbiology. 9, 252.

120. Lee W., DaSilva N. A. 2006. Application of sequential integration for metabolic engineering of 1,2-propanediol production in yeast. Metab. Eng. 8, 58-65.

121. Lesic В., Rahme L. G. 2008. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Molecular Biology. 9:20.

122. Li W., Zhou X., Lu P. 2004. Bottlenecks in the expression and secretion of heterologous proteins in Bacillus subtilis. Res. Microbiol. 155, 605-610.

123. Li X-T. et al. 2003. Identification of factors infiiencing strand bias in oligonucleotide-mediated recombination in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 31(22), 6674-6687.

124. Li Z. et al. 1998. The beta protein of phage lambda promotes strand exchange. J. Mol. Biol. 276(4), 733-44.

125. Lieb M. 1979. Heat-sensitive lambda repressors retain partial activity during bacteriophage induction. J. Virology. 32(1), 162-166.

126. Liebl W., Sinskey A. J., Schleifer K.-H. 1992. Expression, secretion, and processing of staphylococcal nuclease by Corynebacterium glutamicum. J. Bacteriol. 174, 1854-1861.

127. Lilley P. E. et al. 1993. The 92-min region of the Escherichia coli chromosome: location and cloning of the ubiA and air genes. Gene. 129(1), 916.

128. Lin H., Bennett G. N, San K. Y. 2005. Metabolic engineering of aerobic succinate production systems in Escherichia coli to improve process productivity and achieve the maximum theoretical succinate yield. Metab. Eng. 7, 116-127.

129. Little J. W. 1967. An exonuclease induced by bacteriophage lambda. II. Nature of the enzymatic reaction. J. Biol. Chem 242(4), 679-86.

130. Lobocka M. et al. 1994. Organization and expression of the Escherichia coli K-12 dad operon encoding the smaller subunit of D-amino aciddehydrogenase and the catabolic alanine racemase. J Bacteriol. 176(5), 15001510.

131. Lynd L. R. et al. 2005. Consolidated bioprocessing of cellulosic biomass: an update. Curr. Opin. Biotechnol. 16(5), 577-83.

132. Margeot A. et al. 2009. New improvements for lignocellulosic ethanol. Curr. Opin. Biotechnol. 20(3), 372-80.

133. Marsic N. et al. 1993. In vivo studies on the interaction of RecBCD enzyme and lambda Gam protein. J. Bacteriol. 175(15), 4738-43.

134. Marx C. J., Lidstrom, M. E. 2002. Broad-host-range cre-lox system for antibiotic marker recycling in Gram-negative bacteria. Biotechniques. 33, 1062-1067.

135. Marx C.J. 2008. Development of a broad-host-range sacB-based vector for unmarked allelic exchange. BMC Res. Notes. 1,1.

136. Matsuura S. et al. 2001. Real-time observation of a single DNA digestion by lambda exonuclease under a fluorescence microscope field. Nucleic. Acids. Res. 29(16), E79.

137. Meynial-Salles I., Cervin M. A., Soucaille P. 2005. New tool for metabolic pathway engineering in Escherichia coli: One-step method to modulate expression of chromosomal genes. Appl Environ Microbiol. 11 (4), 2140-2144.

138. Miller J.H. 1972. Experiments in Molecular Genetics, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.

139. Miller J. F., Dower J. W., Tompkins L. S. 1988. High-voltage electroporation of bacteria: Genetic transformation of Campylobacter jejuni with plasmid DNA. Proc. Nati. Acad. Sci. 85, 856-860.

140. Miyagawa K., Miyazaki J., Kanazaki N. 1992. Method of producing D-ribose. European patent 0501765A1.

141. Miyahisa I. et al. 2005. Efficient production of (2S)-flavanones by Escherichia coli containing an artificial biosynthetic gene cluster. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68(4), 498-504.

142. Modig T. et al. 2008. Variability of the response of Saccharomyces cerevisiae strains to lignocellulose hydrolysate. Biotechnol Bioeng. 100(3), 423-9.

143. Modrich P. 1991. Mechanisms and biological effects of mismatch repair. Annu. Rev. Genet. 25, 229-253.

144. Muniyappa K., Radding С. M. 1986. The homologous recombination system of phage lambda. Pairing activities of beta protein. J. Biol. Chem. 261(16), 7472-8.

145. Murli S. et al. 2003. Metabolic engineering of Escherichia coli for improved 6-deoxyerythronolide В roduction. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30(8), 500-503.

146. Murphy К. C. 1991. Lambda Gam protein inhibits the helicase and chi-stimulated recombination activities of Escherichia coli RecBCD enzyme. J. Bacteriol. 173(18), 5808-21.

147. Murphy К. C. 1998. Use of bacteriophage X recombination functions to promote gene replacement in Escherichia coli. J Bacteriol. 180, 2063-2071.

148. Murphy К. C., Campellone K. G. 2003. Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli. BMCMol. Biol. 13, 4:11.

149. Murphy К. C., Campellone K. G., Poteete A. R. 2000. PCR-mediated gene replacement in Escherichia coli. Gene. 246(1-2), 321-330.

150. Muyrers J. P. 2000. RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners. Genes Dev. 14(15), 1971-82.

151. Muyrers J. P. et al. 2000. Point mutation of bacterial artificial chromosomes by ET recombination. EMBO Reports. 3, 239-243.

152. Mylroie J. R., Friello D. A., Chakrabarty A. M. 1978. Transformation of Pseudomonas putida with chromosomal DNA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 82(1), 281-288.

153. Nakayama K., Kitada S., Kinoshita S. 1961. Studies on lysine fermentation I. The control mechanism on lysine accumulation by homoserine and threonine. J. Gen. Appl. Microbiol. 7, 145-154.

154. Nefedov M., Williamson R., Laonnou P. A. 2000. Insertion of disease-causing mutations in BACs by homologous recombination in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 28(17), E79.

155. Nesvera J. et al. 1994. Transfer of the broad-host-range plasmid RSF1010 and other plasmid vectors to the gram-positive methylotroph Brevibacterium methylicum by electro transformation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 864— 866.

156. Neumann E. et al. 1982. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBOJ. 1(7), 841-845.

157. Ni Y., Chen R. 2009. Extracellular recombinant protein production from Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 31(11), 1661-1670.

158. Nishizaki T. et al. 2007. Metabolic Engineering of Carotenoid Biosynthesis in Escherichia coli by Ordered Gene Assembly in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 73(4), 1355-1361.

159. Noirot P., Kolodner R. D. 1998. DNA strand invasion promoted by Escherichia coli RecT protein. J. Biol. Chem. 273(20), 12274-80.

160. Oberhardt M. A., Palsson В., Papin J. A. 2009. Applications of genome-scale metabolic reconstructions. Molecular Systems Biology. 5, 320.

161. Ogawa Y. et al. 1997. Efficient production of poly-(y-glutamic acid) by Bacillus subtilis (natto) in jar fermenters. Biosci. Biotechnol. Biochem. 61, 1684-1687.

162. Okino S., Inui M., Yukawa H. 2005. Production of organic acids by Corynebacterium glutamicum under oxygen deprivation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68 (4), 475-480.

163. Olempska-Beer Z. S. et al. 2006. Food-processing enzymes from recombinant microorganisms a review. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 45, 144-158.

164. Oswald M. et al. 2007. Monoterpenoid biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 7, 413-421.

165. Overkamp К. M. et al. 2002. Metabolic engineering of glycerol production in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2814—2821.

166. Pandey A. et al. 2000. Advances in microbial amylases. Biotechnol. Appl. Biochem. 31, 135-152.

167. Paradis F. W. et al. 1987. The expression of Cellulomonas jimi cellulase genes in Brevibacterium lactofermentum. Gene. 61, 199-206.

168. Park J. H. et al. 2007. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of L-valine based on transcriptome analysis and in silico gene knockout simulation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104(19), 7797-809.

169. Peredelchuk M. Y., Bennett G. N. 1997. A method for construction of E.coli strains with multiple DNA insertion in the chromosome. Gene. 187, 231238.

170. Peredelchuk MY, Bennett GN. 1997. A method for construction of E. coli strains with multiple DNAinsertions in the chromosome. Gene. 187: 231-8.

171. Perkins J. B. et al. 1999. Genetic engineering of Bacillus subtilis for the commercial production of riboflavin. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 8-18.

172. Pfeifer B. A. et al. 2001. Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. Science. 291,1790-1792.

173. Popovych N. et al. 2009. Structural basis for cAMP-mediated allosteric control of the catabolite activator protein. PNAS. 106(17), 6927-6932.

174. Posfai G. et al. 1999. Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in chromosome. Nucleic. Acids. Res. 27, 4409-4415.

175. Poteete A. R., Fenton A. C. 2000. Genetic requirements of phage lambda red-mediated gene replacement in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 182(8), 2336-40.

176. Poteete A. R., Fenton A. C., Murphy К. C. 1988. Modulation of Escherichia coli RecBCD activity by the bacteriophage lambda Gam and P22 Abe functions. J. Bacteriol. 170(5), 2012-21.

177. Priefer U. В., Simon R., Puhler A. 1985. Extension of the host range of Escherichia coli vectors by incorporation of RSF1010 replication and mobilization functions. J. Bacteriology. 163(1), 324-330.

178. Ranallo R. T. et al. 2006. Developing live Shigella vaccines using lambda Red recombineering. FEMS Immunol Med Microbiol. 47(3), 462-9.

179. Rao M. B. et al. 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 597-635.

180. Rasmussen M. L. et al. 2010. Sequential saccharification of corn fiber and ethanol production by the brown rot fungus Gloeophyllum trabeum. Bioresour Technol. 101(10), 3526-33.

181. Rawlings D. E., Tietze E. 2001. Comparative Biology of IncQ and IncQ-Like Plasmids. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65(4), 481-496.

182. Ro D. K. et al. 2006. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature. 440, 940-943.

183. Rodriguez E., Menzella H. G., Gramajo H. 2009. Heterologous production of polyketides in bacteria. Methods. Enzymol. 459, 339-365.

184. Ruhl M., Zamboni N., Sauer U. 2010. Dynamic flux responses in riboflavin overproducing Bacillus subtilis to increasing glucose limitation in fed-batch culture. Biotechnol. Bioeng. 105(4), 795-804.

185. Russel С. В., Dahlquist F. W. 1989. Exchange of chromosomal and plasmid alleles in Escherichia coli by selection for loss of a dominant antibiotic sensitivity marker. J. Bacteriol. 171, 2614-2618.

186. Rybalchenko N. et al. 2004. Strand invasion promoted by recombination protein beta of coliphage lambda. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101(49), 1705660.

187. Sadowski P. 1986. Site-specific recombinases: changing partners and doing the twist. J. Bacteriol. 165(2), 341-347.

188. Sahdev S., Khattar S. K., Saini K. S. 2008. Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies. Mol. Cell. Biochem. 307, 249-264.

189. Sakaki Y. 1974. Inactivation of the ATP-dependent DNase of Escherichia coli after infection with double-stranded DNA phages. J. Virol. 14(6), 1611-2.

190. Sambrook J., Fitsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Press.

191. Sanchez A. M., Bennett G. N., San K. Y. 2005. Efficient succinic acid production from glucose through overexpression of pyruvate carboxylase in an Escherichia coli alcohol dehydrogenase and lactate dehydrogenase mutant. Biotechnol. Prog. 21, 358-365.

192. Sauer U. et al. 1996. Physiology and metabolic fluxes of wild-type and riboflavin-producing Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 62(10), 36873696.

193. Sauer U., Bailey J.E. 1999. Estimation of P- to -O ratio in Bacillus subtilis and its influence on maximum riboflavin yield. Biotechnol. Bioeng. 64, 750754.

194. Schallmey M., Singh A., Ward O. P. 2004. Developments in the use of Bacillus species for industrial production. Can. J. Microbiol. 50, 1-17.

195. Schrader J. et al. 2008. Methanol-based industrial biotechnology: current status and future perspectives of methylotrophic bacteria. Trends in Biotechnology. 27(2), 107-115.

196. Schumann W. 2007. Production of recombinant proteins in Bacillus subtilis. Adv. Appl. Microbiol. 62, 137-189.

197. Seibold G. et al. 2006. Utilization of soluble starch by a recombinant Corynebacterium glutamicum strain: growth and lysine production. J Biotechnol. 124(2), 381-391.

198. Senecoff J. F., Rossmeissl P. J., Cox M. M. 1988. DNA recognition by the FLP recombinase of the yeast 2 mu plasmid. A mutational analysis of the FLP binding site. J. Mol Biol 201(2), 405-421.

199. Sharan S. K. et al. 2009. Recombineering: A homologous recombination-based method of genetic engineering. Nat. Protoc. 4(2), 206-223.

200. Sheng Yu., Mancino V., Birren B. 1995. Transformation of Escherichia coli with large DNA molecules by electroporation. Nucleic Acids Research. 23(11), 1990-1996.

201. Skotnicki M. L. et al. 1983. High-productivity alcohol fermentations using Zymomonas mobilis. Biochem. Soc. Symp. 48, 53—86.

202. Smith M. D. et al. 1986. Protoplast transformation in coryneform bacteria and introduction of an a-amylase gene from Bacillus amyloliquifaciens into Brevibacterium lactofermentum. Appl Environ. Microbiol 51, 634-639.

203. Spencer J. F. Т., Ragout de Spencer A. L., Laluce C. 2002. Non-conventional yeasts. Appl Microbiol Biotechnol 58, 147-156.

204. Stephenson K., Harwood C. R. 1998. Influence of cell-wall-associated protease on production of a-amylase by Bacillus subtilis. Appl Environ. Microbiol 64, 2875-2881.

205. Sun W., Wang S., Curtiss R. III. 2008. Highly efficient method for introducing successive multiple scarless gene deletions and markerless gene insertions into the Yersinia pestis Chromosome. Appl Environ. Microbiol 74(13), 4241-4245.

206. Sung-Jin J. et al. 2006. Production system for biodegradable polyester polyhydroxybutyrate by Corynebacterium glutamicum. J. Bioscience and Bioengineering. 102, 233-236.

207. Suzuki N. et al. 2005. New multiple-deletion method for the Corynebacterium glutamicum genome, using a mutant lox sequence. Appl Environ. Microbiol. 71(12), 8472-8480.

208. Szczebara F. M. et al. 2003. Total biosynthesis of hydrocortisone from a simple carbon source in yeast. Nat. Biotechnol. 21(2), 143-149.

209. Tauch A et al. 2002. Strategy to sequence the genome of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032: use of a cosmid and a bacterial artificial chromosome library. J Biotechnol. 95, 25-38.

210. Taylor M. P. et al. 2009. Thermophilic ethanologenesis: future prospects for second-generation bioethanol production. Trends Biotechnol. 27(7), 398-405.

211. Thompson J. R. et al. 1998. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast. 14(6), 565-71.

212. Thresher R. J. et al. 1995. Electron microscopic visualization of RecT protein and its complexes with DNA. J. Mol. Biol. 254(3), 364-71.

213. Toivari M. H. et al. 2007. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for conversion of D-glucose to xylitol and other five-carbon sugars and sugar alcohols. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5471-5476.

214. Tsuge K., Matsui K., Itaya M. 2003. One step assembly of multiple DNA fragments with a designed order and orientation in Bacillus subtilis plasmid. Nucleic. Acids. Research. 31(21), el33.

215. Udaka S. 1960. Screening method for microorganisms accumulating metabolites and its use in the isolation of Micrococcus glutamicus. J. Bacteriol. 79, 754-755.

216. Underwood S. A. et al. 2002. Flux through citrate synthase limits the growth of ethanologenic Escherichia coli КО 11 during xylose fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 68(3), 1071-1081.

217. Uzzau S. et al. 2001. Epitope tagging of chromosomal genes in Salmonella. PNAS. 98(26), 15264-15269.

218. Vary P. S. et al. 2007. Bacillus megaterium from simple soil bacterium to industrial protein production host. Appl. Microbiol. Biotechnol. 76, 957-967.

219. Vertes A. A., Inui M., Yukawa H. 2005. Manipulating Corynebacteria, from individual genes to chromosomes. Appl. Environ. Microbiol. 71(12), 7633-7642.

220. Verwaal R. et al. 2007. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Appl. Environ. Microbiol. 73, 4342-4350.

221. Vorholt J.A. 2002. Cofactor-dependent pathways of formaldehyde oxidation in methylotrophic bacteria. Arch. Microbiol. 178, 239-249.

222. Vuilleumier S. et al. 2009. Methylobacterium genome sequences: a reference blueprint to investigate microbial metabolism of CI compounds from natural and industrial sources. PLos. One. 4(5), e5584.

223. Wang J. et al. 2006. An improved recombineering approach by adding RecA to lambda Red recombination. Mol. Biotechnol. 32(1), 43-53.

224. Warming S. et al. 2005. Simple and highly efficient ВАС recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33(4), E36.

225. Watanabe K., Oikawa H. 2007. Robust platform for de novo production of heterologous polyketides and nonribosomal peptides in Escherichia coli. Org. Biomol Chem. 5, 593-602.

226. Weidner M., Taupp M., Hallam S. J. 2010. Expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. JVis. Exp. 36, 1862.

227. Westers L., Westers H., Quax W. J. 2004. Bacillus subtilis as cell factory for pharmaceutical proteins: a biotechnological approach to optimize the host organism. Biochim. Biophys. Acta. 1694 (1-3), 299-310.

228. Wild J. et al. 1985. Identification of the dadX gene coding for the predominant isozyme of alanine racemase in Escherichia coli K12. Mol Gen Genet. 198(2), 315-22.

229. Wong Q. N. Y. et al. 2005. Efficient and seamless DNA recombineering using a thymidylate synthase A selection system in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 33(6), E59.

230. Wu X.-C. et al. 1991. Engineering a Bacillus subtilis expressionsecretion system with a strain deficient in six extracellular proteases. J. Bacteriol. 173, 4952-4958.

231. Yamamoto S. et al. 2009. Application of lambda Red recombination system to Vibrio cholerae genetics: simple methods for inactivation and modification of chromosomal genes. Gene. 438(1-2), 57-64.

232. Yan X., Yu H-J., Hong Q., Li S-P. 2008. Cre/lox System and PCR-Based Genome Engineering in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 74(17), 5556-5562.

233. Yoon S. H. et al. 2000. Production of poly-(y-glutamic acid) by fed-batch culture of Bacillus licheniformis. Biotechnol. Lett. 22, 585—588.

234. Yoon S. H. et al. 2009. Combinatorial expression of bacterial whole mevalonate pathway for the production of beta-carotene in E. coli. J. Biotechnol. 140(3-4), 218-226.

235. Yu D. et al. 2000. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 5978-5983.

236. Yukawa H et al. 2007. Comparative analysis of the Corynebacterium glutamicum group and complete genome sequence of strain R. Microbiology. 153, 1042-1058.

237. Yul R. J. et al. 2007. Bacillus thuringiensis as a specific, safe, and effective tool for insect pest control. J. Microbiol. Biotechnol. 17(4), 547-559.

238. Zamboni N. et al. 2005. Transient expression and flux changes during a shift from high to low riboflavin production in continuous cultures of Bacillus subtilis. Biotechnol. Bioeng. 89(2), 219-232.

239. Zelic B. et al. 2003. Fed-batch process for pyruvate production by recombinant Escherichia coli YYC202 strain. Eng. Life Sci. 3, 299-305.

240. Zerbs S., Frank A. M., Collart F. R. 2009. Bacterial Systems for Production of Heterologous Proteins. Methods in Enzymology. 463, 149-168.

241. Zhang H., Boghigian B.A., Pfeifer B. A. 2010. Investigating the role of native propionyl-CoA and methylmalonyl-CoA metabolism on heterologous polyketide production in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 105(3), 567-573.

242. Zhang Y. et al. 1998. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nature Genetics 1998, 20:123-128.

243. Zhang Y. et al. 2003. Phage annealing proteins promote oligonucleotide-directed mutagenesis in Escherichia coli and mouse ES cells. BMC Molecular Biology. 4:1

244. Zhou S. et al. 2005. Fermentation of 10% (w/v) sugar to D: (S)-lactate by engineered Escherichia coli B. Biotechnol. Lett. 27, 1891-1896.

245. Каташкина Ж. И. Москва 2003. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Разработка и использование методов направленной модификации целевых генетических локусов хромосомы Е. coli при конструировании штаммов-продуцентов.

246. Каташкина Ж. И. и др. 2005. Направленное изменеие уровня экспрессии генов в бактериальной хромосоме. Молекулярная биология.Ъ9(5), 823-831.

247. Каташкина Ж. И. и др. 2008. Способ конструирования рекомбинантных бактерий, принадлежащих к роду Pantoea, и способ продукции L-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду Pantoea. Заявка на изобретение RU 2006134574.

248. Скороходова А. Ю. и др. 2004. Создание и исследование свойств авторегулируемого и плавнорегулируемого генетического элемента 0з/Р/асцу5/0/ас—Биотехнология. 5, 3-21.1. БЛАГОДАРНОСТИ.

249. Автор хотел бы выразить признательность: